JP2017502000A - α−MSHのClpBタンパク質模倣体を介した宿主の食行動および感情に対する細菌の影響 - Google Patents
α−MSHのClpBタンパク質模倣体を介した宿主の食行動および感情に対する細菌の影響 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、細菌ClpBタンパク質およびClpB発現細菌、ならびに食欲の低下、食欲の増大および/または不安に関連する疾患または障害に及ぼすそれらの影響に関する。さらに本発明は、細菌ClpBタンパク質に関連する組成物、ならびに食欲の低下および/または不安に関連する障害に対する免疫における組成物の使用に関する。【選択図】図3
Description
本発明は、細菌ClpBタンパク質およびClpB発現細菌、ならびに食欲の低下、食欲の増進、および/または不安に関連する疾患または障害に及ぼすこれらの影響に関する。さらに本発明は、細菌ClpBタンパク質を含む組成物、ならびに食欲の低下および/または不安に関連する障害に対する免疫における当該組成物の使用に関する。
摂食障害は、過去50年のあいだに男性および女性を問わず全世界中で増加した。特に、西欧諸国の特定の人々が摂食障害を発症するリスクが最も高く、西洋化の度合いがこのリスクを高めていることを示唆する証拠がある。近年の進歩に伴い、科学者らは、食欲の中心プロセスの理解を深めている。動機づけ、ホメオスタシス、および自己調節制御のプロセス間の相互作用が、摂食行動に関与しており、これらが摂食障害の鍵となる構成要素であることが知られている。
近年の科学において、さらなる調節因子であるヒトのマイクロバイオームが発見された。ハイスループットDNAシークエンシング技術の進歩により、ヒトのマイクロバイオームが探索され、これにより宿主とその細菌叢との間の分子的な関係の理解は大きく進歩した。この「第2のゲノム」である、マイクロバイオームは、4〜500万超の重複していない微生物の推定上の遺伝子、および1〜2,000種の一般的に認められる細菌種の一覧である。各個体は、少なくとも160の共通の種と、個体の群を定義する多くの良好につり合いのとれた宿主‐微生物の分子的関係を有する。
微生物の共同体と、それらのヒト宿主との間の共生関係の本質的な特性を理解することにより、常在性の共同体の特定の特性から、健康状態などの宿主の表現型を予測することが可能であり得ると考えられる。
たとえば腸内細菌叢の組成は、肥満および糖尿病ならびに精神神経障害を含む宿主の代謝表現型に関連しており、腸内細菌が、脳により制御される機能および活動に影響を及ぼし得ることが示唆されている。
よって本明細書の文脈において、細菌叢を宿主の行動と関連づける分子的機構を決定することが、宿主の生理機能における特定の微生物の役割を定義するために必要なステップと考えられる。
近年の本発明者らの研究により、細菌タンパク質と、動機づけ行動および感情の調節におけるその役割が知られているペプチドホルモンとの間の分子的模倣性を介した新規の分子機構が明らかとなった。これにより分子的模倣性を介したこの新規分子機構は、腸内細菌叢を宿主の行動と関連づけ、摂食障害および肥満における新規の有望な治療上の標的の同定を可能にした。
本発明者らは、プロテオミクスを使用して、共生腸内細菌大腸菌K12のClpBシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン(α−MSH)の立体構造模倣体であることを発見した。
さらに本発明者らは、ClpB免疫マウスが、食物摂取および体重の増加、不安の減少を伴って抗ClpBおよび抗α―MSH抗体の両方の産生の増大を示すことを明らかにした。さらに、ラットに強制経口投与により大腸菌K12を提供することで、ClpBおよびα−MSH反応性免疫グロブリンの血漿中レベルが上昇した。
よって、ClpBおよび/または抗ClpB抗体の存在は、食欲の調節障害に関連し得る。
他方で、ClpBタンパク質および/または抗ClpB抗体の存在は、食欲の増進と相関する場合があり、よって、ClpBタンパク質および/または抗ClpB抗体のレベルを減少させることにより、食欲を減少させることができ、よって肥満の治療に使用することができる。
よって、本発明は、肥満の治療または予防に使用するための少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物に関する。
特に、上記組成物は、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物であって、上記少なくとも1つの抗生剤が、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
肥満の治療または予防に使用するための
組成物に関する。
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
肥満の治療または予防に使用するための
組成物に関する。
一実施形態では、肥満は、むちゃ食い障害または多食症の結果である。
さらに本発明は、過体重の対象の食欲を低下させる非治療的方法であって、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。
特に、少なくとも1つの抗生剤は、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する。
さらに本発明者らは、抗ClpB抗体のレベルを、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対する免疫と相関させた。
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する。
さらに本発明者らは、抗ClpB抗体のレベルを、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対する免疫と相関させた。
よって本発明はまた、ワクチンまたは免疫原性組成物として使用するための細菌ClpBタンパク質を含む組成物に関する。
特に、上記組成物は、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対する免疫に使用するためのものである。
より具体的には、上記組成物は、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療および/または予防に使用するためのものである。
食欲の低下に関連する疾患または障害は、神経性食欲不振症(AN)、神経性過食症(BN)、カヘキシーおよび消耗性疾患からなる群から選択され得る。
また本発明は、対象の食欲を増進させる非治療的方法であって、抗ClpB抗体を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。
発明の詳細な説明
ClpB発現細菌
本明細書中で使用される「ClpB発現細菌」は、シャペロンタンパク質ClpBを発現する細菌を指す。
ClpB発現細菌
本明細書中で使用される「ClpB発現細菌」は、シャペロンタンパク質ClpBを発現する細菌を指す。
「タンパク質脱凝集シャペロン」、「シャペロンタンパク質ClpB」、「ClpBタンパク質」、または「ClpB」は、ヒートショックタンパク質F84.1としても知られており、六量体AAA+−ATPアーゼのHsp100/ClpBファミリーのメンバーである。このファミリーは、細菌、真菌、および植物のHsp100 ATPアーゼを含み、ClpBは、代表的な細菌ATPアーゼである。ストレス誘導性マルチシャペロンシステムの一部として、ClpBは、ストレス条件下で細胞が生存するための重大なプロセスであるタンパク質の脱凝集においてHsp70システム(DnaK、DnaJ、およびGrpE)と協調して熱誘導性損傷からの細胞の回復に関与している。
感染プロセスの際に、細菌病原体は、病原体を除去するために宿主防御により生成されたストレス状態に晒され、熱ショックタンパク質および他のストレスタンパク質の合成を増加させることにより、その宿主防御に応答する。本発明の文脈において、ClpBは、熱耐性の獲得にとって必須の因子として、ならびに黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella turalensis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびネズミチフス菌(Salmonella thyphimurium)などのいくつかのグラム陰性およびグラム陽性の病原性細菌のビルレンスおよび感染性にとって必須の因子として説明されている。
大腸菌K12では、シャペロンタンパク質ClpBは熱ショックタンパク質F84.1またはhtpMとしても知られている、アミノ酸857個のタンパク質である。
典型的に、シャペロンタンパク質ClpBは、配列番号:1(NCBIの参照番号:NP_417083.1(2013年11月16日時点で利用可能)および/またはUniProtKB/Swiss−Prot番号:P63284(2013年11月16日時点で利用可能))を有する大腸菌K12由来のシャペロンタンパク質ClpBのアミノ酸配列を含む、またはからなる。好ましくは、シャペロンタンパク質ClpBのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と80〜100%同一のアミノ酸配列を含む、またはからなる。好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号1と90〜100%同一、より好ましくは95〜100%、最も好ましくは95、96、97、98、99、または100%同一である。
よって、ClpB発現細菌は、上記に定義されているシャペロンタンパク質ClpB、または配列番号1のアミノ酸配列と80〜100%同一、より好ましくは配列番号1のアミノ酸配列と95〜100%、最も好ましくは95、96、97、98、99、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含む、もしくはからなるポリペプチドを発現、または過剰発現する細菌を指す。
本発明のクエリーアミノ酸配列とたとえば少なくとも95%「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは、対象ポリペプチド配列が、クエリーアミノ酸配列のアミノ酸各100個あたり最大5個のアミノ酸変化を含み得ることを除き、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であると意図される。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中のアミノ酸残基のうち最大5%(100個のうち5個)が、別のアミノ酸を挿入、欠失、または置換され得る。
本出願の文脈において、同一性のパーセンテージは、グローバルアライメントを使用して計算される。(すなわち2つの配列を、それらの全長にわたって比較される)。2つ以上の配列の同一性を比較する方法は、当業者によく知られている。たとえば「needle」プログラムを使用してもよく、これは、長さ全体を考慮する場合、2つの配列の最適なアライメント(ギャップを含む)を見つけ出すためにNeedleman‐Wunschのグローバルアライメントアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443−453)を使用する。needleプログラムは、たとえば、ebi.ac.ukワールドワイドウェブサイトで入手可能である。本発者に係る同一性のパーセンテージは、好ましくは、10.0に等しい「ギャップ開始」パラメータ、0.5に等しい「ギャップ伸長」パラメータ、およびBlosum62行列を用いてEMBOSS::needle(グローバル)プログラムを使用して計算する。
参照配列と「少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である」アミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して、欠失、挿入、および/または置換などの変異を含み得る。置換の場合、参照配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは異なる種由来の相同配列に対応し得る。
アミノ酸の置換は、保存的または非保存的であり得る。好ましくは、置換は保存的置換であり、ここでは1つのアミノ酸が、類似の構造および/または化学的な特性を有する別のアミノ酸に置換されている。好ましくは、置換は、以下の表に記載される保存的置換に対応する。
ClpB発現細菌は、当業者によく知られており、従来のいずれかの技術により同定され得る。
一実施形態では、ClpB発現細菌は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)属、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella turalensis)属、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)属、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)属、ネズミチフス菌(Salmonella thyphimurium)属、大腸菌、腸内細菌科、ソンネ赤痢菌(Shigella sonnei)属、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)属、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)属、ボイド赤痢菌(Shigella boydii)属、シトロバクター ヤンガエ(Citrobacter youngae)属、サルモネラ・ボンゴール(Salmonella bongori)属、およびサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)属で構成される群から選択される。
ClpBタンパク質は、2つのヌクレオチド結合ドメイン(ATP1およびATP2)と、2つのオリゴマー形成ドメイン(NBD1およびNBD2)とを含む。N末端ドメインは、基質識別ドメインとして機能し、凝集したタンパク質をClpB六量体に動員し、かつ/または結合したタンパク質を安定化させる。NBD2ドメインは、オリゴマー形成の原因であり、一方NBD1ドメインは、おそらくはATP依存的に六量体を安定化させる。コイルドコイルドメインの運動は、おそらくは、機能的な六量体において隣接するClpBサブユニットのコイルドコイルモチーフ間で結合されている大きな凝集したタンパク質を引き離すことにより、ClpBがタンパク質を凝集状態から救出する能力にとって必須である。
本発明者らは、共生腸内細菌大腸菌K12のClpBシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン(α−MSH)の立体構造模倣体であることを同定した。
「α−MSH」は、「α−メラニン細胞刺激細胞ホルモン」、「アルファ−MSH」「α−MSH」、「α―メラノトロピン」、「α―メラノコルチン」、または「α−インターメジン」としても知られており、トリデカペプチド構造を有するメラノコルチンファミリーの天然に存在する内在性ペプチドホルモンである。好ましくは、α−MSHのアミノ酸配列は、アミノ酸配列SYSMEHFRWGKPV(配列番号:3)(Gen Pept Sequence ID, PRF:223274(2013年12月2日時点で利用可能))を含む、またはからなる。しかしながら、そのアセチル状態が異なる3種類のα―メラニン細胞刺激ホルモンが存在し、このうちデスアセチルα−MSHは、アセチル基を欠損しており;モノアセチルα−MSHでは、配列番号3のSer−1のアミノ基がアセチル化されており;ジアセチルα−MSHでは、配列番号3のSer−1のアミノ基およびヒドロキシル基の両方がアセチル化されている。本明細書において使用されるα−MSHは、デスアセチルαMSHおよび/またはモノアセチル化および/またはジアセチル化の形態を指し、
特にモノアセチル化α−MSHを指す。
特にモノアセチル化α−MSHを指す。
α−MSHは、中枢および末梢の両方で作用して、メラノコルチン受容体4型(MC4R)の活性化を介して、食物摂取の減少およびエネルギー消費の増大によるエネルギー収支の調節に大いに関与する。実際に、ヒトおよびマウスのいずれにおいても、α−MSHの産生およびMC4Rの発現の原因となる遺伝子の変異が過食および肥満をもたらすが、血漿中のα−MSHレベルは体重の変化に関連する。さらにα−MSHは、不安を増大させることにより、気分および感情を調節する。
「模倣体」は、別のタンパク質を模倣するタンパク質を指す。タンパク質が、それが模倣するタンパク質と特定の特徴を共有する場合、このような模倣が可能である。
「立体構造模倣体」は、別のタンパク質と少なくとも部分的に同じ立体構造を共有するタンパク質を指す。
本発明者らは、ClpBタンパク質が、α−MSHと配列番号1由来の542〜548番目のアミノ酸のあいだにアミノ酸配列「RWTGIPV」(配列番号:2として引用)の不連続な配列相同性を共有することを証明した。理論に拘束されるものではないが。このClpBの立体構造は、ClpBおよびα−MSHの両方に対する抗体の産生を刺激することができる。
よって、本明細書中の「立体構造模倣体」は、ClpBに対する抗体の産生およびα−MSHに対する自己抗体の刺激能を指す。
対象
本発明の文脈において、「対象」は、ヒト、またはげっ歯類(ラット、マウス、ウサギ)、霊長類(チンパンジー)、ネコ科(ネコ)、もしくはイヌ科(イヌ)などの非ヒト哺乳類を指す。好ましくは、対象はヒトである。本発明に係る対象は、具体的には、雄性または雌性であり得る。
本発明の文脈において、「対象」は、ヒト、またはげっ歯類(ラット、マウス、ウサギ)、霊長類(チンパンジー)、ネコ科(ネコ)、もしくはイヌ科(イヌ)などの非ヒト哺乳類を指す。好ましくは、対象はヒトである。本発明に係る対象は、具体的には、雄性または雌性であり得る。
好ましくは、本発明に係る対象は、13歳超である。
好ましくは、対象は雌性である。
好ましくは、対象は食欲調節障害を罹患している。
「食欲」は、空腹として感じられる、食物を摂食する欲望を意味する。食欲は、すべての高等生物に存在し、代謝のニーズを維持するために適切なエネルギー摂取を調節するために役立つ。食欲は、消化管と、脂肪組織および脳の間の密接な相互作用により調節される。食欲は、摂取する食物の量を測定すること、および対象の摂食欲求を評価することにより対象において評価される。
「食欲の調節障害」は、持続して存在するかまたは1週間に数回再発する食欲の増進および食欲の減少を含み、それにより神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、消耗性疾患、過食、むちゃ食い障害、および多食症に関与する異常な食欲を指す。
「食欲の増大」は、対象が、身体が必要とするよりも多くの食物を摂取する食欲を指す。これは、体重の増加をもたらしても、もたらさなくてもよい。
よって、「正常な食欲」は、対象が、身体が必要とする食物の量に対応する食物を摂取することを指す。
「食欲の減少」および/または「食欲の低下」は、身体が必要とするよりも少ない食物を対象が摂取する食欲を指す。これは、体重の減少をもたらしても、もたらさなくてもよい。
1つの特定の実施形態では、対象は過体重を罹患している。
同一の実施形態では、対象は食欲の増大を有し得る。
「過体重の対象」は、本明細書中、好ましくは25〜30のBMIを有する対象を指す。一実施形態では、対象は肥満を罹患している。
「肥満」は、好ましくは対象が30超のBMIを有する医学的状態を指す。
一実施形態では、過体重および/または肥満を有する対象は、むちゃ食い障害および/または多食症を罹患し得る。「BMI」または「肥満度指数」は、対象の身長の2乗により対象の体重を除算することにより定義される。医療において一般的に使用される式は、kg/m2の測定単位を生じる。
「むちゃ食い障害」または「BED」は、別々の期間(たとえば任意の2時間以内)で、大部分の人々が同様の期間および同様の環境で摂食する量よりも多い食物の摂食、からなるむちゃ食いを特徴とする摂食障害を指し、制御不能の感覚を伴う。このむちゃ食いは、平均して、6か月間に少なくとも1週間に2回起こる。過食症とは反対に、むちゃ食いは、不適切な代償行動の繰り返しに関連していない。BEDを罹患している対象は、むちゃ食いを深刻に心配している。さらに、BEDを罹患している対象は、身体的も不快となるまで、消費した食物量により吐き気がするまで摂食し、および/または倦怠感または不安がある場合に摂食し、および/または現実に空腹ではない場合であっても大量の食物を摂食し、および/または食物に対する困惑した感情および/またはむちゃ食い後の嫌悪感、消沈、または罪悪感により摂食が正常な期間でも1人で摂食する。むちゃ食い障害を有する対象は、衝動的に行動し、摂食に関する制御が欠如していると感じる。さらに、むちゃ食い障害を罹患している対象は、ストレス、不安、怒り、悲しみ、倦怠、および心配に対処する問題を有している。
本発明では、BEDを罹患している対象は、好ましくは肥満であり、30超のBMIを有する。
「多食症」は、「過食症」としても知られており、過剰な空腹(強迫性)または食欲の増進を指す。一実施形態では、多食症は、糖尿病、クライネ・レヴィン症候群、遺伝障害のプラダー・ウィリー症候群およびバルデ・ビードル症候群などの障害により引き起こされ得る。
一実施形態では、対象は食欲の低下および/または不安を有する。
別の実施形態では、対象は体重減少を有する。
さらに対象は、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に罹患し得る。
一実施形態では、上記対象は、食欲の低下および/または食欲の喪失を有し得る。
本明細書中で使用される「不安」および/または「不安障害」、または「不安に関連する疾患もしくは障害」は、主な特徴が異常または不適切な不安である多くの障害を指す。
一実施形態では、不安および/または不安障害は、不適切な不安に関連する。不適切な不安は、任意の認識可能な刺激、またそのような反応を正当化しない刺激がない状態での心拍数の増加、筋肉の緊張、呼吸の増加などの不安の症状の発現を指す。一実施形態では、これら症状は、不安‐回避性、強迫性、および完璧主義のタイプの気質に関連している。医学的原因が除外されると、不安障害が理由であり得る。
一実施形態では、不安に関連する疾患または障害は、急性ストレス障害、広場恐怖症(パニック障害の病歴を伴うまたは伴わない)、全般性不安障害(GAD)、強迫性障害(OCD)、パニック障害(広場恐怖症を伴うまたは伴わない)、恐怖症(社会恐怖症を含む)および外傷後ストレス障害(PTSD)からなる群から選択される。
別の実施形態では、さらに不安は、神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、または消耗性疾患、特に神経性食欲不振症または神経性過食症に関連する不適切な不安に関連し得る。
よって、不安は、たとえば、体重増加の不合理な恐れ、および/または完ぺきではないことの不合理な恐れに関連し得る。
「食欲の低下に関連する疾患または障害」は、一般的に、おもな特性が、食物摂取量の低下および/または体重減少である疾患または障害を指す。本明細書において用語「食欲の低下に関連する疾患または障害」は、特に、神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、または消耗性疾患、特に神経性食欲不振症、および/または神経性過食症などの疾患および/または障害を指す。
「食欲不振」は、食欲を感じることが低下することにより、食欲が低下することを指す。多くの場合、非科学的刊行物でこの用語は、神経性食欲不振症と互換的に使用されているが、食欲の減少には多くの潜在的原因が存在しており、このうちの一部は無害であり得るが、その他は重篤な臨床病態を示し、または顕著なリスクをもたらす。
「神経性食欲不振症」(AN)は、本発明では、正常な体重の少なくとも85%の体重を維持することができない極端な食物の制限を特徴とする摂食障害を指す。さらに、神経性食欲不振症を罹患している対象は、体重の増加に関する極度の恐れならびに歪んだ自己認識を有し、対象は、確かな反証があるにも関わらず彼自身/彼女自身を過体重であると考えている。
よって、神経性食欲不振症を罹患している人は、好ましくは、身体の不満、痩せ願望、完全主義、無力感、対人不信、社会的不安定、および快感消失からなる群から選択される心理学的な特徴のうちの少なくとも1つを有する。好ましくは、神経性食欲不振症を罹患している人は、身体の不満、痩せ願望、および完全主義からなる群から選択される心理学的な特徴のうち少なくとも1つを有する。さらに好ましくは、神経性食欲不振症を罹患している人は、無力感、対人不信、社会的な不安感、および快感消失からなる群から選択される心理学的な特徴のうち少なくとも1つを有する。
さらなる実施形態では、神経性食欲不振症を罹患している対象は、17未満のBMIを有する。
「過食症」または「神経性過食症」は、むちゃ食いと排出、または短時間での大量の食物の消費後の、典型的に嘔吐、下剤または利尿剤の摂取、および/または過剰な運動により消費した食物を自身から取り除こうとする努力(排出)を特徴とする摂食障害である。一部の対象は、神経性過食症と神経性食欲不振症とを交互に有する傾向があり得る。過食症を罹患している対象は、通常25未満の正常なBMIの範囲を特徴としてもよい。
「カヘキシー」は、体重減少、および/または筋萎縮症、および/または疲労、脱力、および食欲の顕著な喪失に関連する消耗性の症候群であり、癌、AIDS、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、うっ血性心不全、結核、家族性アミロイドポリニューロパチー、水銀中毒(肢端疼痛症)、およびホルモンの欠損により引き起こされ得る。カヘキシーはまた消耗とも呼んでよく、AIDS、癌、後股関節骨折(post hip fracture)、慢性心不全、慢性閉塞性肺疾患(COLD)および/または慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの慢性肺疾患、肝硬変、腎不全、ならびに関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、敗血症、ならびに重篤な感染症などのいくつかの疾患に伴って見られる。さらに、消耗は老化に伴い見られる。
一部の実施形態では、カヘキシーは癌により引き起こされる。
カヘキシーの主要な兆候は、脂肪組織の損失のみならず、筋肉組織、さらには骨の重量の損失である。この非脂肪性の組織は、「除脂肪体重」としても知られている。
さらに、食欲の喪失、脱力(無力症)、およびヘモグロビンレベルの低下(貧血)が存在する。
カヘキシーは、癌、感染症、AIDS、うっ血性心不全、関節リウマチ、結核、後股関節骨折(post hip fracture)、嚢胞性線維症、およびクローン病などの多くの異なる臨床病態の末期的な状態として、または慢性疾患において見出される。またカヘキシーは、疾患のいかなる明らかな症状も有さない高齢者でも起こり得る。
一実施形態では、本発明に係る対象は、感染症を罹患せず、菌血症を有していない。よって、本発明に係る対象は、好ましくは、10mg/l未満、特に5mg/l未満の血漿中フィブリノーゲン濃度を示し、かつ/または大量の白血球尿を示さず、かつ/または抗ウイルス療法を受けておらず、かつ/または30mg/l未満のベースラインC反応性タンパク質の血漿中濃度を示す。
本明細書中使用される用語「C反応性タンパク質」または「CRP」は、そのレベルが身体で発症する炎症プロセスの間に顕著に上昇することから、急性期反応体のクラスのメンバーであるタンパク質を指す。当業者に知られているように、CRPは、モノマーのモル質量25106Daを有する224残基のタンパク質であって、CRP遺伝子によりコードされる。
本明細書中で使用される用語「フィブリノーゲン」は、血液凝固カスケードの最終段階の最中にトロンビンによりフィブリンに切断される340000Daの血漿糖たんぱく質を指す。
本明細書中に使用される用語「白血球尿」は、対象の尿中の白血球の存在を指す。特に、大量の白血球尿は、尿における、分あたり100,000個の白血球の存在に対応する。
肥満の治療
本発明者らは、プロテオミクスを使用して、共生腸内細菌 大腸菌K12のClpBシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドであるα−メラニン細胞刺激ホルモン(α―MSH)の立体構造上の模倣物であることを発見した。
本発明者らは、プロテオミクスを使用して、共生腸内細菌 大腸菌K12のClpBシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドであるα−メラニン細胞刺激ホルモン(α―MSH)の立体構造上の模倣物であることを発見した。
さらに本発明者らは、ClpB免疫マウスが、高い抗ClpB IgGの血漿中レベルを有し、抗α―MSH反応性IgGの血漿中レベルの増加を有することを発見した。
さらに、ClpB免疫マウスは、過食に起因する食欲の増大により体重が増加した。
本発明の文脈では、本発明者らは、大腸菌K12発現ClpBを強制経口投与したラットが抗ClpB IgGおよび抗α―MSH IgMの量の増加を有することを示した。
よって、ClpB発現細菌の存在は、食欲の増大をもたらし、これが過食の一因となる。
よって、本発明は、肥満および/または過体重の治療または予防に使用するための、「ClpB発現細菌」の章で上記に定義した、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物を指す。
特に、本発明は、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物であって、上記少なくとも1つの抗生剤が、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
肥満の治療または予防に使用するための
組成物に関する。
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
肥満の治療または予防に使用するための
組成物に関する。
本発明の文脈において、本明細書中で使用される用語「治療する」または「治療」は、当該用語が適用される当該障害または病態、または当該障害若しくは病態の1つ以上の症状の進行を反転、軽減、阻害することを意味する。
「予防する」は、当該用語が適用される障害または病態が発症するのを防止する、または疾患もしくは障害の初期状態で発症を防止するために取られる手段を指す。さらに予防は、当該用語が適用される障害または病態のさらなる進行の阻害を指す。
肥満の治療または予防は、好ましくは、本明細書において、治療される対象におけるClpB発現細菌の量または濃度を減少させることを指す。
一部の実施形態では、本組成物は、過体重および/または肥満に関連する疾患または障害の治療または予防に使用するためのものである。
同様に、対象の肥満および/または過体重を治療するまたは発症の機会を低下させる方法であって、上記方法が、以下に定義される少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、特に、上記少なくとも1つの抗生剤が、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
方法を提供する。
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
方法を提供する。
それを必要とする対象は、特にはむちゃ食い障害または多食症の結果としての肥満および/または過体重を有する対象である。
同様に、肥満および/または過体重の治療または予防のために意図される薬剤の製造のための、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物の使用であって、特に上記少なくとも1つの抗生剤が、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
使用を提供する。
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
使用を提供する。
本発明者らは、食欲の増大は、ClpBタンパク質および/または抗ClpB抗体の存在、ならびに抗α―MSH反応性抗体、好ましくは抗ClpB IgGおよび/またはIgM、および抗α―MSH反応性IgGおよび/またはIgMの血漿中レベルの増加に関連することを発見した。
一実施形態では、対象のClpB発現細菌の量または濃度の低下が、上記対象の食欲の低下および/または正常化をもたらす。
理論に拘束されるものではないが、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物は、ClpB発現細菌の量を減少させ、よって、抗ClpB抗体のレベルまたは濃度を減少させ、および/または抗α―MSH反応性抗体のレベルを減少させ、よって、食欲の正常化および/または低下をもたらす。
「食欲」、「食欲の増大」、および「食欲の正常化」は、上記の「対象」節で定義されている。
「食欲の低下」は、本明細書中、以前の食欲の増大と比較して減少した正常化された食欲を指す。
「食物摂取量」は、たとえば、日記またはアンケートを使用した自己の記録、摂取前の食物の重量を使用した、ビュッフェ料理からのカロリー摂取の測定、またはペアにした食物の量の重量測定および分析を含む多数の技術を使用して測定することができる。食物摂取量は、食事ごとに、1日ごとに、週ごとに、または月ごとに測定してもよい。
本発明の好ましい実施形態では、治療により、治療開始前の食物摂取量の平均値の2%の減少、より好ましくは3%または5%または7%の減少、さらにより好ましくは10%未満の減少などの少なくとも1%の食物摂取量の減少がもたらされる。
別の実施形態では、脂肪、炭水化物、およびタンパク質などの様々な食品が、食品量あたり異なる量のカロリーを含むことから、摂取した食物量が摂取したカロリー摂取量に直接関連しない場合があるため、本治療は、食物摂取量の変化に関係なくカロリー摂取量の減少をもたらす。
本発明の好ましい実施形態では、本治療は、治療開始前のカロリー摂取量の平均値の2%の減少、より好ましくは3%、または5%または7%の減少、さらにより好ましくは10%の減少などの少なくとも1%のカロリー摂取量の減少をもたらす。
本発明の一態様では、本発明の治療または発症の機会を低下させる方法が、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物を投与することにより、体重を減少させ、または安定した体重を維持することができ、特に、上記少なくとも1つの抗生剤は、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する。
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する。
また過体重は、特定の文化ではあまり魅力的ではないと考えられる容貌と考えられ得る。
よって一実施形態では、本発明は、過体重の対象の食欲を低下させる、かつ/または食欲を正常化させる非治療的方法であって、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法を指す。
一実施形態では、上記非治療的な法は美容上の方法である。
「少なくとも1つのClpB発現細菌に対する抗生剤」は、本明細書中で、ClpB発現細菌の増殖を阻害し、および/またはClpB発現細菌の量を減少させ、および「/またはClpB発現細菌を破壊する抗菌化合物を指す。
ClpB発現細菌は、上記の「ClpB発現細菌」の節で定義されている。
少なくとも1つのClpB発現細菌に対する抗生剤は、好ましくは選択的または優先的にCLPB発現細菌の増殖を阻害し、量を減少させ、かつ/または破壊する。上記抗生剤は、好ましくは、真核細胞に負の影響を与えるものではない。
ClpB発現細胞を特異的に標的とする抗生剤は、当業者によく知られており、さらにはMartin, I et al.(Journal of Medicinal Chemistry, 2013, 56: 7177−7189)に記載されている。
少なくとも1つのClpB発現細菌に対する抗生剤は、ClpBに結合し、その活性を調節することができる。
特に、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する抗生剤は、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する。
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する。
一実施形態では、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する抗生剤は、ベンジルベンゼンをスキャフォールドとするサリチルアルデヒド誘導体であり、詳しくは5−(2−クロロベンジル)−2−ヒドロキシ−3−ニトロベンズアルデヒド(CAS Number 292644−32−7, Sigma Aldrich)または(2−{[(3,4−ジクロロフェニル)アミノ]チオキソメチルチオ}エトキシ)−N−ベンズアミド(Supplier Number ST034398,TimTec)である。
一実施形態では、本発明の文脈で使用される組成物は医薬組成物であり得る。
本発明の文脈で使用される組成物は、本明細書中以下の「組成物」の章で記載されるように対象に処方および投与され得る。
一実施形態では、本発明の文脈で使用される、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物は、経口投与され得る。
本発明の少なくとも1つのClpB発現細菌に対する抗生剤の典型的な用量は、たとえば、約0.01mg/kg〜約30mg/kgの範囲であり得るが、特に上述の要因を考慮して、この例示的な範囲より下、またはこの範囲より上の用量が、想像される。経口1日量の投与計画は、約0.01mg/kg全体重〜約30mg/kg全体重、特には、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30mg/kg体重であり得る。患者の進捗を、定期的な評価によりモニターして、用量をそれに応じて調節することができる。
食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療および予防
本発明者らは、ClpB免疫化マウスが、抗ClpB抗体の高い血漿中レベルを有し、驚くべきことに、抗α―MSH自己抗体、特にα―MSHと交差反応する抗ClpB IgGの血漿中レベルの増加を有することを発見した。さらに本発明者らは、ClpB免疫化マウスが、α−MSHの食欲不振誘発性作用に対して良好な保護を有し、およびαMSH媒介型不安の低減を有することを発見した。
本発明者らは、ClpB免疫化マウスが、抗ClpB抗体の高い血漿中レベルを有し、驚くべきことに、抗α―MSH自己抗体、特にα―MSHと交差反応する抗ClpB IgGの血漿中レベルの増加を有することを発見した。さらに本発明者らは、ClpB免疫化マウスが、α−MSHの食欲不振誘発性作用に対して良好な保護を有し、およびαMSH媒介型不安の低減を有することを発見した。
よって、本発明は、ワクチンまたは免疫原性組成物として使用するための、細菌性ClpBタンパク質を含む組成物を指す。
「免疫原性組成物」は、本発明の文脈において、個体に投与する場合に免疫応答を誘発または免疫調節(すなわち免疫抑制もしくは免疫刺激)する、または個体に投与する際に抗体の産生を誘導する細菌性ClpBタンパク質を含む組成物を意味する。
「ワクチン」は、特にその作用剤により、疾病から個体を保護または治療する、免疫応答を免疫調節するために投与される本明細書中に記載される免疫原性組成物などの組成物を意味する。本発明のワクチンは、治療用ワクチン(治療ワクチン)、すなわち、疾患の進行を低減もしくは停止させることを意図して、疾患の発症の後に個体に投与するためのワクチン、または疾患の発症前に個体に投与するための予防用ワクチン(予防ワクチン)の両方の使用が意図される。
特に、上記組成物は、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対する免疫での使用のためのものである。
より具体的には、上記組成物は、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療および/または予防に使用するためのものである。
理論に拘束されるものではないが、一実施形態では、細菌性ClpBタンパク質を含む組成物は、抗ClpB抗体の血漿中レベルの増加および/または抗α−MSH反応性抗体の血中漿レベル、特に抗ClpB IgGの血漿中レベル、および/または抗α―MSH反応性IgGの血漿中レベルを増加させることができる。
抗ClpB抗体の血漿中レベルおよび/または抗α―MSH反応性抗体の血漿中レベルを増加させる能力を保持するClpBの誘導体、フラグメント、または変異体もまた本発明の範囲内にある。
ClpBタンパク質の「変異体」は、スプライシング、変異、アレル、およびアイソフォームなどの天然に存在する変異体であってもよく、またはこれらは組み換え手段により産生されてもよい。アミノ酸配列における変異は、タンパク質をコードする核酸配列内での1つまたは複数のコドンの置換、欠失、または挿入により導入されてもよく、それによってタンパク質のアミノ酸配列の変化が起こる。任意に、この変異は、タンパク質中他のいずれかのアミノ酸による、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上のアミノ酸の置換によるものである。さらにまたは代替的に、変異は、タンパク質中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、40、または50個またはそれ以上のアミノ酸の付加または欠失によるものであってもよい。
ClpBタンパク質の「フラグメント」は、たとえば完全長タンパク質と比較する場合に、N末端またはC末端で切断されてもよく、または、内部残基を欠失していてもよい。特定のフラグメントは、酵素活性に必須ではないアミノ酸残基を欠失している。好ましくは、上記フラグメントは、ClpBタンパク質と比較して少なくともアミノ酸約10、20、30、40、50、60、70個、またはそれ以上短い。さらに、「誘導体」は、ClpBタンパク質のC末端もしくはN末端がタグ付けされたフラグメントまたは変異体を含む。
ClpBタンパク質の変異体は、本明細書中に開示されるポリペプチド配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含み得る。好ましくは、変異タンパク質は、本明細書中に開示される完全長のポリペプチド配列またはポリペプチド配列のフラグメントと、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%のアミノ酸配列同一性を有する。
「同一性」は、上記の「ClpB発現細菌」の節で定義されている。
本発明者らは、配列番号1の542〜548番目のアミノ酸が抗α―MSH反応性抗体の血漿中レベルを増加させる能力に関連することを配列アライメントにより示した。
よって、一実施形態では、本発明に係る誘導体、フラグメント、または変異体は、アミノ酸配列「RWTGIPV」(SEQ ID NO:2の下参照)を有する配列番号1の542〜548番目のアミノ酸を含み、好ましくは、当該配列と80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%のアミノ酸配列同一性を有する。
「抗ClpB抗体」は、本発明の文脈において、本明細書中上述したClpBタンパク質に結合する抗体を指す。
好ましくは、抗ClpB抗体は、上記に定義されるようにα−MSHと交差反応する。
よって一実施形態では、抗ClpB抗体は、抗α―MSH抗体でもある。
「抗体」または「免疫グロブリン」(Ig)は、2つの重鎖がジスルフィド結合により互いに結合し、各重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に結合する天然または通常の抗体であり得る。ラムダ(λ)およびカッパ(κ)の2種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能的な活性を決定する5つの主な重鎖の分類(または同位体):IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEが存在する。各鎖は、別々の配列ドメインを含む。軽鎖は、2つのドメインまたは領域、すなわち可変ドメイン(VL)および定常ドメイン(CL)を含む。重鎖は、4つのドメイン、すなわち可変ドメイン(VH)と3つの定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3、集合的にCHと呼ばれる)を含む。軽鎖(VL)および重鎖(VH)の両方の可変領域は、抗原に対する結合の認識および特異性を決定する。軽鎖(CL)および重鎖(CH)の定常領域のドメインは、抗体の鎖の会合、分泌、胎盤通過性、補体結合、およびFc受容体(FcR)に対する結合などの重要な生物学的特性を有する。Fvフラグメントは、免疫グロブリンのFabフラグメントのN末端部であり、1つの軽鎖および1つの重鎖の可変部からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原性決定基との間の構造上の相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域(CDR)に由来する残基で構成される。特に、非超可変領域またはフレームワーク領域(FR)の残基が、ドメイン全体の構造に影響を与え、それにより結合部位に影響を与える。相補性決定領域あるいはCDRは、本来の免疫グロブリン結合部位の天然のFv領域の結合親和性および特異性を共に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、CDR1−L、CDR2−L、CDR3−LおよびCDR1−H、CDR2−H、CDR3−Hと呼ばれる3つのCDRを有する。よって、通常の抗体の抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のV領域のそれぞれからのCDRセットを含む6つのCDRを含む。
「フレームワーク領域」(FR)は、CDRの間に介在するアミノ酸配列、すなわち、単一の種において異なる免疫グロブリン間に比較的保存されている免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域の一部を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、FR1−L、FR2−L、FR3−L、FR4−L、およびFR1−H、FR2−H、FR3−H、FR4−Hと呼ばれる4つのFRを有する。
本明細書中で使用される「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒトの抗体のフレームワーク領域と実質的に同一(約85%以上、特に90%、95%、97%、99%、または100%同一)であるフレームワーク領域である。
本明細書中で使用されるように、用語「抗体」は、通常の抗体およびそのフラグメント、ならびに単一ドメイン抗体およびそのフラグメント、特に単一ドメイン抗体の可変重鎖、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性または多重特異性抗体を指す。
本明細書中で使用されるように、抗体または免疫グロブリンは、最近説明されており、抗体または免疫グロブリンの相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である「単一ドメイン抗体」をも含む。単一ドメイン抗体の例として、重鎖抗体、軽鎖を天然で欠いている抗体、通常の4つの鎖の抗体に由来する単一ドメイン抗体、遺伝子操作した単一ドメイン抗体が挙げられる。単一ドメイン抗体は、限定するものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含む任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠いた重鎖抗体として知られている天然に存在する単一ドメイン抗体であってよい。特に、たとえばラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、およびグアナコなどのラクダ科は、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体を産生する。ラクダ科の重鎖抗体はまた、CH1ドメインを欠いている。
軽鎖を欠いたこれら単一ドメイン抗体の可変重鎖は、「VHH」または「ナノボディ」として当技術分野で知られている。通常のVHドメインと同様に、VHHは、4つのFRおよび3つのCDRを含む。ナノボディは、通常の抗体に対して利点を有する。これらナノボディは、IgG分子よりも約10倍小さく、結果として適切にフォールディングされた機能的ナノボディを、高い収率を達成しつつin vitroでの発現により産生することができる。さらにナノボディは非常に安定であり、プロテアーゼの作用に抵抗性である。ナノボディの特性および産生は、Harmsen and De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov; 77(1): 13−22)に概説されている。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、特に、肥満の個体から単離されたポリクローナル抗体、またモノクローナル抗体であり得る。好ましくは、抗体はヒト抗体またはウサギ抗体、より好ましくはヒト抗体である。
抗体は、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgE抗体、特にIgGまたはIgM抗体、より具体的にはIgG抗体であってもよい。
抗体はモノクローナル抗体であってもよい。上記モノクローナル抗体はヒト化されていてもよい。別の例では、抗体は、Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、二重特異性抗体およびVHHからなる群から選択されるフラグメントであってもよい。
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」または「mAb」は、特異的抗原に対する1つのアミノ酸組成の抗体分子であり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。モノクローナル抗体は、B細胞またはハイブリドーマの単一クローンにより産生され得るが、組み換え型、すなわちタンパク質工学により産生されてもよい。
用語「キメラ抗体」は、その最も広い意味において、1つの抗体由来の1つまたは複数の領域、および1つまたは複数の他の抗体由来の1つまたは複数の領域を含む人工的な抗体を指す。特にキメラ抗体は、別の抗体、特にヒト抗体のCHドメインおよびCLドメインに会合した、非ヒト動物由来の抗体のVHドメインおよびVLドメインを含む。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物を使用することができる。またキメラ抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に特異性を有する多重特異性抗体を指すこともできる。一実施形態では、キメラ抗体は、マウス由来の可変ドメインとヒト由来の定常ドメインとを有する。
用語「ヒト化抗体」は、ヒトの免疫応答を回避または最小限にするために、最初は全体的または部分的に非ヒト起源であり、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域中の特定のアミノ酸を置換するよう修飾されている抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、たいていの場合、ヒトのCHおよびCLドメインである。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト起源の定常ドメインを有する。
(通常の)抗体の「フラグメント」は、インタクト抗体の一部、特にインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、二重特異性抗体、抗体フラグメントから形成される二重特異性および多重特異性抗体が挙げられる。また、通常の抗体のフラグメントは、重鎖抗体またはVHHなどの単一ドメイン抗体であり得る。
用語「Fab」は、約50,000の分子量および抗原結合活性を有する抗体のフラグメントであり、プロテアーゼ、パパインでIgGを処理することにより得られるフラグメントのうち、H鎖および全L鎖のN末端側の約半分が、ジスルフィド結合を介して共に結合されている。
用語「F(ab’)2」は、約100,000の分子量を有し、およびプロテアーゼ、ペプシンでIgGを処理することにより入手したフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したFabよりもわずかに大きい抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指す。
用語「Fab’」は、約50,000の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、F(ab’)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。
1本鎖Fv(「scFv」)ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーにより結合したVHおよびVLコード遺伝子を含む遺伝子融合体から通常発現される、共有結合したVH::VLヘテロダイマーである。本発明のヒトscFvフラグメントは、特に遺伝子組み換え技術を使用することにより、適切な立体構造で保持されているCDRを含む。二価および多価抗体フラグメントは、一価scFvsの会合により自然に形成できるか、または二価sc(Fv)2などのペプチドリンカーにより一価scFvsを結合することにより作製できる。「dsFv」は、ジスルフィド結合により安定化されたVH::VLヘテロダイマーである。「(dsFv)2」は、ペプチドリンカーにより結合した2つのdsFvを指す。
用語「二重特異性抗体」または「BsAb」は、1つの分子内に2つの抗体の抗原結合部位を組み合わせる抗体を指す。よって、BsAbは、同時に2つの異なる抗原に結合することができる。遺伝子工学は、たとえば欧州特許第2050764号に記載される望ましい一連の結合特性およびエフェクター機能を有する抗体または抗原誘導体を設計、修飾、かつ産生するためにますます使用されている。
用語「多重特異性抗体」は、1つの分子の中で2つ以上の抗体の抗原結合部位を組み合わせる抗体を指す。
用語「二重特異性抗体(diabody)」は、2つの抗原結合部位を含む小分子抗体フラグメントであって、同じポリペプチド鎖(VH−VL)中に軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含むフラグメントである。同じ鎖の2つのドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーを使用して、ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、2つの抗原結合部位を作製する。
一実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、対象の体重増加を増大させるためのものである。
本発明の文脈では、体重増加は、細菌タンパク質ClpBタンパク質を含む組成物の第1の投与から少なくとも16日後、たとえば16、17、18、19、または20日後、好ましくは20日後の体重増加を指す。
さらに体重増加は、細菌ClpBタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物の第1の投与前の体重と比較して少なくとも2%の体重の増加、好ましくは3%の増加、より好ましくは5%の体重の増加を指す。
用語「治療する」、「治療」、および「予防する」は、上記の「肥満の治療」の節で定義されている。
食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害は、神経性食欲不振症(AN)、神経性過食症(BN)、カヘキシーおよび消耗性疾患からなる群、好ましくは神経性食欲不振症(AN)および神経性過食症(BN)からなる群から選択される。
「不安」および/または「不安障害」は、上記の「対象」の節で定義されている。
同様に、対象の免疫またはワクチン接種の方法であって、細菌ClpBタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
特に、上記方法は、対象の食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害を治療または発症の機会を低下させるためのものである。
それを必要とする対照は、食欲の低下および/もしくは不安、および/もしくは食欲の低下および/もしくは不安に関連する疾患または障害を罹患している対象であるか、または食欲の低下および/もしくは不安、および/もしくは食欲の低下および/もしくは不安に関連する疾患または障害を罹患しやすい対象である。
同様に、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対する免疫のためのワクチンまたは免疫原性組成物を製造するための、細菌ClpBタンパク質を含む組成物の使用を提供する。
特に、上記組成物は、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療または予防のためのものである。
ワクチンまたは免疫原性組成物は、たとえば食欲を刺激するために使用してもよく、この食欲の低下は、食欲不振、神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、または消耗性疾患、特に食欲不振、神経性食欲不振症、または神経性過食症によるものである。
一実施形態では、細菌ClpBタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、食欲刺激機能を有する。
さらなる実施形態では、細菌ClpBタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、上記対象の食欲を増進させるためのものである。
化合物は、上記化合物を投与した対象が、食物摂取および/またはカロリー摂取の刺激を示すことにより、食物摂取の増加をもたらす場合、「食欲刺激機能」を有する。
本発明の文脈でのワクチンまたは免疫原性組成物の食欲刺激機能は、自由に摂食しているラットに組成物を腹腔内注射することによる投与実験で試験され得る。組成物または化合物の投与後、動物の食物摂取量を測定する。食物摂取量は、たとえば、少なくとも1日から30日、特に、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30日目に測定できる。
食物摂取量は、食事の回数および/または食事の量を測定することにより測定され得る。
食欲の刺激は、たとえば、食欲を測定し、空腹感または満腹感のレベルを測定するための視覚的なアナログのスケールを使用して測定してもよい。本発明の好ましい実施形態では、刺激は、治療前と比較して少なくとも2%高い、たとえば3%高い、より好ましくは5%高い、またはさらにより好ましくは治療前と比較して6%、7%、8%、9%、または10%高い。
細菌ClpBタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、好ましくは、食欲刺激機能を有し、食物摂取を刺激する。この機能により、本組成物は、一実施形態では、対象の食欲を増進させる食欲促進剤または食欲刺激薬と互換的に呼ぶことができる。
「食物摂取」は、上記の「肥満」の節に定義されている。
細菌ClpBタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、不安をさらに低減させ得る。
一態様では、本発明は、抗ClpB抗体を含む組成物を投与することにより、体重増加を刺激するか、または安定した体重を維持することに関する。
低体重は、特定の文化ではあまり魅力的ではないと考えられる容貌と考えられ得る。
よって、本発明はまた、対象の食欲を増大させる非治療的方法であって、抗ClpB抗体を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。
さらに本発明は、対象の食物摂取および/または体重を変化させる非治療的方法であって、抗ClpB抗体を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法を提供する。
一実施形態では、本発明によると、本組成物は、体重減少、食欲の低下、またはさらには食欲の喪失を有する任意の対象に投与することができると予想される。
さらなる実施形態では、上記対象は17未満のBMIを特徴とし得る。
細菌ClpBタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物を使用する、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対する免疫は、以下の「組成物」の節に記載されるように、当技術分野で公知のいずれかの投与方法を使用して達成され得る。
好ましくは、細菌ClpBタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物に関して、投与は、本明細書中に記載される投与方法のいずれかを使用して、より好ましくは、静脈内投与または皮下投与を使用して、最も好ましくは皮下投与方法を使用して行われ得る。
一実施形態では、本発明は、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療または予防に使用するための、細菌ClpBタンパク質を含む組成物であって、上記食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療または予防が、上記組成物を使用して対象を免疫することにより達成される、組成物に関する。
また本発明は同様に、対象の食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療または発症の機会を低下させる対応する方法であって、細菌ClpBタンパク質を含む組成物でそれを必要とする対象を免疫することを含む、方法に関する。
それを必要とする対象は、上記に定義される通りである。
同様に、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療または予防のためのワクチンまたは免疫原性組成物を製造するための、細菌ClpBタンパク質を含む組成物の使用であって、上記食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療または予防は、上記組成物を使用して対象を免疫することにより達成される、使用に関する。
一実施形態では、食欲の低下および/または不安の治療または予防は、抗ClpB抗体を直接投与することにより達成され得る。
別の実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物はまた、本明細書中に開示される細菌性ClpBタンパク質の組み合わせを含むことができる。
ワクチン組成物または免疫原性組成物を得る方法は、当技術分野で周知である。一般的に、当該方法は、超音波処理、タンパク質消化、熱処理、凍結融解処理、浸透圧ショック処理などの技術を使用して細菌調製物からタンパク質を抽出することを含む。人工的な細菌調製物の例として、合成法または組み換え法により一部または全体が得られたタンパク質調製物を含む。
細菌ClpBを含むワクチンまたは免疫原性組成物の典型的な用量は、たとえば約0.01nmol/kg〜約1000nmol/kgの範囲であり得るが、この例示的な範囲より下、または上の用量が、特に上述の要因を考慮して想定される。特に、上記用量は、特に、上記用量は、約0.1nmol/kg全体重〜約100nmol/kg全体重、好ましくは約0.1nmol/kg〜約20nmol/kg、より具体的には、0.1nmol/kg〜約10nmol/kg、特に0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10nmol/kg体重である。
さらに当該組成物の調製を、「組成物」の節で以下にさらに説明する。
組成物
好ましくは、肥満の治療のために本発明の文脈で使用される組成物は、医薬組成物である。
好ましくは、肥満の治療のために本発明の文脈で使用される組成物は、医薬組成物である。
本発明の文脈での医薬組成物は、本発明の組成物の「有効量」または「治療的有効量」または予防的有効量」を含む。
「有効量」または「治療的有効量」は、望ましい治療上の結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を指す。本発明の文脈で使用される組成物の有効量または治療上有効量は、対象の疾患の状態、年齢、性別、体重などの要因により変動し得る。有効量または治療的有効量はまた、組成物の治療上有益な作用が、組成物の毒性作用または有害作用を上回る量である。
「予防的有効量」は、望ましい予防上の結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を指す。典型的に、予防的用量は、疾患の前または疾患の初期段階の対象に使用されるため、予防的有効量は、治療的有効量よりも低い。
有効量または治療的有効量は、対象に治療上の利益を与えるために必要である活性成分の少なくとも最小用量ではあるが、毒性用量よりも少ない。言い換えると、過体重および/または肥満を治療するためのそのような量は、たとえば食物摂取量を減少させるといった対象の状態の改善を誘導、軽減、またはそうでなければ引き起こす量である。本発明に係る医薬組成物は、適切な医薬的単位投与剤形の形態で経口投与され得る。本発明の医薬組成物は、錠剤、硬ゼラチンまたは軟ゼラチンカプセル、水溶剤、懸濁剤、およびリポソーム、および成形ポリマーゲルなどの他の徐放製剤を含む多くの剤形に調製され得る。
投与様式および剤形は、所定の治療用途にとって望ましく有効な治療剤または組成物の特性と密接に関連する。適切な投与剤形は、限定するものではないが、経口投与、静脈内投与、直腸投与、舌下投与、粘膜投与、経鼻投与、点眼投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、脊髄投与、髄腔内投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与、およびリンパ管投与、ならびに活性成分の全身性送達用の他の投与剤形が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経皮(パッチ、ゲル、クリーム、軟膏、またはイオン導入を介して受動的に)、静脈内(ボーラス、点滴);皮下(点滴、デポー);経粘膜的(頬側および舌下、たとえば口腔内分散錠、ウェーハ、フィルム、および発泡製剤;結膜(点眼液);直腸(坐剤、浣腸);または皮内(ボーラス、点滴、デポー)を含む当業者に知られたいずれかの技術により投与され得る。
経口の液体医薬組成物は、たとえば、水性または油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であり得るか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提示され得る。当該液体医薬組成物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル(食用油を含み得る)、または保存剤などの従来の添加剤を含んでもよい。
本発明の医薬組成物はまた、非経口投与(たとえば注射、たとえばボーラス注射または持続点滴による投与)用に製剤化されてもよく、アンプル、充填済シリンジ、少量の注入容器、または添加保存剤を含む多回用量容器中に単位投与剤形で存在してもよい。本医薬組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、溶剤、または乳剤などの剤形をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および/もしくは分散剤などの処方用薬剤を含んでもよい。あるいは、本発明の医薬組成物は、使用前に、適切なビヒクル、たとえば滅菌水、パイロジェンフリー水で構成するための、滅菌固体の無菌的単離、または溶液からの凍結乾燥によって得た粉末剤形であってもよい。
キャリアーが固体である直腸投与に適した医薬組成物は、最も好ましくは単位用量の坐剤として示される。適切なキャリアーは、ココアバターおよび当技術分野において一般的に使用される他の物質を含み、坐剤は、医薬組成物を軟化または融解するキャリアーと混合後、冷却し成型することにより、従来通り形成され得る。
吸入による投与では、本発明に係る医薬組成物は、吹送器、ネブライザー、または加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の簡便な手段から、従来通り送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体などの適切な推進剤を含み得る。加圧エアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより投与単位を決定してもよい。あるいは、吸入または吹送による投与では、本発明の医薬組成物は、医薬組成物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物といった、乾燥粉末組成物の形態をとってもよい。粉末組成物は、たとえば、カプセルまたはカートリッジ、またはたとえば粉末が吸入器または吹送器を用いて投与され得るゼラチンまたはブリスターパックの単位投与剤形として示されてもよい。
鼻腔内投与では、本発明の医薬組成物は、プラスチックボトルのアトマイザを介するなど、液体の噴霧を介して投与され得る。これらの典型的な例は、Mistometerg(イソプロテレノール吸入器‐ウィントロープ)およびMedihaler(登録商標)(イソプロテレノール吸入器‐ライカー)がある。
また、本発明の医薬組成物は、芳香剤、着色剤、抗菌剤、または保存剤などの賦形剤も含んでもよい。
投与計画は、たとえば少なくとも2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100日の期間であってもよい。
投与範囲は、投与される組成物に依存し、上記に定義されている。
医学の技術分野においてよく知られているように、任意の1人の対象の用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身健康状態、ならびに同時投与される他の薬剤を含む多くの要因に依存する。
ワクチンおよび免疫原性組成物に関して、注射可能な用途に適した剤形は、滅菌性の水溶液または分散液と、滅菌性の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末とを含む。すべての場合、剤形は無菌的でなければならず、容易に注射針を通過する程度の流体でなければならない。剤形は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。キャリアーは、たとえば、水、エタノール、ポリオール(たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、および/または植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。たとえば、適切な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールによりもたらすことができる。多くの場合、たとえば糖または塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが好ましい。注射可能組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえばステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによりもたらすことができる。
水溶液の非経口投与では、たとえば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝されているべきであり、液体の希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースでまず等張にしなければならない。これら特定の水溶液は、特に、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与、および腹腔内投与に適している。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者によく知られている。たとえば、1つの用量を、1mlの等張性NaCl溶液に溶解してもよく、これを1000mlの皮下点滴療法の流体に添加、または提案される点滴部位に注射してもよい(たとえば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition, Lippincot and Williams, 2005参照)。治療する対象の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こる。さらに、ヒトの投与では、調製物は、FDAの生物学的製剤基準部により必要とされる無菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならない。
滅菌注射可能な溶液は、ろ過滅菌により適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込むことにより調製される。
本明細書中に使用される「キャリアー」は、限定するものではないが、溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、キャリアー溶液、懸濁剤、コロイド、リポソームおよびBomsel et al(2011)Immunity 34:269−280に記載されるものなどのビロソームが挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野においてよく知られている。
「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」との文言は、ヒトに投与した場合にアレルギーまたは類似の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製物は当技術分分野においてよく理解されている。典型的に、当該組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製されており、注射前に、液体の溶液または懸濁液にするために適した固体剤形もまた調製できる。
本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチン組成物は、1つまたは複数のアジュバントをさらに含む。
本明細書中使用される用語「アジュバント」は、免疫原性組成物、特にワクチンの内容物に添加されている生成物を指し、上記組成物を投与する宿主に誘導される免疫反応の強さを増大させる。アジュバントは、特に、上記哺乳類が、上記組成物の投与後に産生できる特異的抗体の量を増加させ、よって免疫の有効性を増大させることができる。
好ましくは、アジュバントは、ヒト宿主において副作用を示さない。
アジュバントは、保護的免疫応答を増大させるよう作用する任意の化合物または複数の化合物を含む。アジュバントは、たとえば、乳化剤;ムラミルジペプチド;アブリジン;水酸化アルミニウムなどの水性アジュバント;酸素含有金属塩;キトサンベースのアジュバント、および様々なサポニン、油、ならびにAmpfaigen、LPS、細菌細胞壁抽出物、細菌DNA、CpG配列、合成オリゴヌクレオチドおよびそれらの組み合わせ(Schijns et al(2000) Curr. Opin. Immunol, 12:456)、Mycohacterialplilei(phlei)細胞壁抽出物(CWE)(米国特許第4,744,984号)、M.phlei DNA(M−D A)、およびM−DNA−M phlei細胞壁複合体(MCC)、熱不安定性エンテロトキシン(LT)、コレラ毒素(CT)、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、重合化リポソーム、変異毒素、たとえばLTK63およびLTR72、マイクロカプセル、インターロイキン(たとえばIL−1β、IL−2、IL−7、IL−12、INFγ)、GM−CSF、MDF誘導体、CpGオリゴヌクレオチド、LPS、MPL、ホスファゼン(phosphophazene)、Adju−Phos(登録商標)、グルカン、抗原製剤、リポソーム、DDE、DHEA、DMPC、DMPG、DOC/ミョウバン複合体、不完全フロイントアジュバント、ISCOMs(登録商標)、LT経口アジュバント、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドA、ムラミルトリペプチド、およびホスファチジルエタノールアミン(phospatidylethanolamine)などの当技術分野において知られている他の物質のいずれかを含むことができる。乳化剤として役立ち得る化合物として、天然および合成の乳化剤、ならびに陰イオン性、陽イオン性、および非イオン性の化合物が挙げられる。酸素含有金属塩として、硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、硝酸塩、ヨウ素酸塩、臭素酸塩、炭酸塩、水和物、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、および酒石酸塩であるAl、K、Ca、Mg、Zn、Ba、Na、Li、B、Be、Fe、Si、Co、Cu、Ni、Ag、Au、およびCrの塩、ならびにその混合物が挙げられ、それらには水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、リン酸カルシウム、マーロックス(水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムの混合物)、水酸化ベリリウム、水酸化亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、および硫酸バリウムが挙げられる。合成化合物のうち、陰イオン性乳化剤は、たとえば、ラウリン酸およびオレイン酸のカリウム、ナトリウム、およびアンモニウムの塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム、およびアルミニウムの塩、ならびにラウリル硫酸ナトリウムなどの有機スルホン酸塩が挙げられる。合成陽イオン性薬剤として、たとえば、臭化セチルトリメチルアンモニウム(cetyltrhethylammonlum bromide)が挙げられ、合成非イオン性薬剤は、グリセリルエステル(たとえばモノステアリン酸グリセリル)、ポリオキシエチレングリコールのエステルおよびエーテル、ならびにソルビタン脂肪酸エステル(たとえばソルビタンモノパルミタート)、およびそれらのポリオキシエチレン誘導体(たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート)により例示される。天然の乳化剤として、アカシア、ゼラチン、レシチン、およびコレステロールが挙げられる。
他の適切なアジュバントは、単一の油、油の混合物、油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンなどの油状成分と共に形成することができる。油は、鉱油、植物油、または動物油であり得る。鉱油は、蒸留技術を介して石油から得た液体の炭化水素であり、当技術分野において流動パラフィン、流動ワセリン、または白色鉱油とも呼ばれる。適切な動物油は、たとえば、タラ肝油、ハリバ肝油、メンヘーデン油、オレンジラフィー油、およびサメ肝油が挙げられ、これらすべては市販されている。適切な植物油として、たとえば、キャノーラ油、アーモンド油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油などが挙げられる。完全フロイントアジュバント(FCA)および不完全フロイントアジュバント(FIA)は、ワクチンの調製に一般的に使用されている2つの一般的なアジュバントであり、本発明での使用にも適している。FCAおよびFIAはいずれも、鉱油中水型のエマルジョンであるが、FCAは、マイコバクテリウム種の死菌をも含む。粘膜ワクチンに特に好ましいアジュバントは、Lee et al(2011)Vaccine 29:417−425に記載されるようにガラクトシルセラミド(GalCer)を含む。
免疫調節性サイトカインもまた、たとえば、アジュバントとして、ワクチンの有効性を高めるためにワクチン組成物に使用することができる。当該サイトカインの非限定的な例として、インターフェロンα(IFN−α)、インターロイキン2(IL−2)、および顆粒球コロニー刺激因子(GM−CSF)、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
ワクチンおよび免疫原性組成物は、静脈内投与、動脈内投与、内視鏡的投与、病変内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、随腔内投与、眼窩内投与、皮内投与、腹腔内投与、経気管投与、表皮下投与、胸骨内注射、静脈内、動脈内、皮内、経皮、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮気管内、腹腔内、または鼻腔内噴霧、または気管内経路などにより投与され得る。組成物の投与は、点滴または注射(たとえば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内、十二指腸内、腹腔内など)による投与であり得る。さらに上記組成物は、「無針」送達システムにより投与することができる。
注射は、複数回の注射に分けることができ、そのような分割された接種物は、好ましくは実質的に同時に投与される。分割接種として投与する場合、免疫原の用量は、好ましくは、必ずしも必要ではないが、各分割注にと等しく配分される。アジュバントがワクチン組成物に存在する場合、アジュバントの用量は、好ましくは、必ずしも必要ではないが、各分割注射に等しく配分される。分割接種のための個別の注射は、好ましくは、患者の身体で互いに実質的に近接して投与される。一部の好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約1cm離して投与されている。一部の好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約2.5cm離して投与される。非常に好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約5cm離して投与され、一部の態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約10cm離して投与され、一部の態様では、注射は、身体で互いに10cm超離して投与されており、たとえば、身体で互いに少なくとも約12.5cm、15cm、17.5cm、20cm、またはそれ以上離して投与される。
様々な代替的な医薬送達システムを使用してもよい。当該システムの非限定的な例として、リポソームおよびエマルジョンが挙げられる。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒を使用してもよい。さらに、タンパク質を含有する固体のポリマーの半透性マトリックスなどの徐放システムを使用して、ワクチン組成物を送達してもよい。様々な徐放物質は当業者によく知られている。徐放カプセルは、その化学的性質に応じて、数日間〜数週間〜数か月間の範囲にわたりワクチン組成物を放出することができる。
予防を目的として提供する場合、本発明の組成物は、理想的には、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の証拠の前、または食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害のいずれかの症状の前に対象に投与される。免疫原性組成物の予防的投与は、食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対して対象の保護免疫を提供するために、または食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の進行を予防または軽減するために役立ち得る。治療を目的として提供する場合、免疫原性組成物は、食欲の低下および/または不安の症状を軽減かつ治療するために役立ち、可能な限り早く使用することが好ましい。
投与は、非経口経路または経口経路を介してもよい。投与経路は、たとえば静脈内、動脈内(intrarterial)、皮内、経皮、筋肉内、粘膜、皮下、経皮、気管内、腹腔内、灌流および洗浄を含む。たとえば、投与は、粘膜経路、たとえば経鼻、経口(消化管の粘膜を介した)、膣内、頬側、直腸、舌下、眼性、尿(urinal)、肺性、または耳鼻科(耳を介した)経路を介している。
免疫は、様々な「単位用量」を含み得る。
単位用量は、1回注射として投与される必要はないが、設定された期間にわたる持続点滴を含む。単位用量は、0.01nmol/kg〜約1000nmol/kgを含み得る。特に、上記用量は、約0.1nmol/kg全体重〜約100nmol/kg全体重、好ましくは約0.1nmol/kg〜約20nmol/kg、より具体的には、0.1nmol/kg〜約10nmol/kg、特に0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10nmol/kg体重である。
一実施形態では、ワクチン組成物は、1日1回用量で投与されてもよく、または総1日用量を、分割用量、たとえば1日に2、3、または4回に分けて投与してもよい。さらに、ワクチン組成物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所的な使用を介した鼻腔内剤形で、または当業者によく知られている経皮スキンパッチの剤形を使用して経皮経路を介して;埋め込み可能なポンプにより、または他のいずれかの適切な投与手段により投与することができる。経皮送達システムの剤形で投与する場合、用量の投与は、当然、投与計画全体を通して間欠的投与よりも持続的投与であろう。
ワクチンの投与は、プライムブースト法をさらに含み得る。これらの方法では、1つまたは複数のプライミング免疫の後に1回複数回の追加免疫を行う。実際の免疫原性組成物は、それぞれの免疫および免疫原性組成物の種類に関して同じまたは異なることができ、免疫原の経路および製剤もまた変化させることができる。1つの有益なプライムブースト法は、4週間離して2回のプライミング免疫後、最後のプライミング免疫から4週間後および8週間後に2回の追加免疫を提供する。
免疫スケジュール(または投与計画)は、動物(ヒトを含む)に関してよく知られており、特定の対象および組成物に関して容易に決定することができる。よって、本組成物を、対象に1回または複数回投与できる。好ましくは、免疫原性組成物の個別の投与の間には、既定の時間間隔がある。この間隔は対象ごとに変化するが、典型的に10日から数週間の範囲であり、多くの場合、2、4、6、または8週間である。ヒトでは、この間隔は、典型的に2〜6週間である。本発明の特に好ましい実施形態では、この間隔は、より長く、好ましくは約10週間、12週間、14週間、16週間、18週間、20週間、22週間、24週間、26週間、28週間、30週間、32週間、34週間、36週間、38週間、40週間、42週間、44週間、46週間、48週間、50週間、52週間、54週間、56週間、58週間、60週間、62週間、64週間、66週間、68週間または70週間である。
免疫法は、典型的に本組成物の1〜6回の投与を行うが、わずか1、2、3、4、または5回であってもよい。免疫応答を誘導する方法は、組成物と共にアジュバントの投与をも含むことができる。一部の例では、年に1回、2回、または他のより長い間隔(5〜10年)で追加免疫を行うと、最初の免疫プロトコルを補完することができる。
本発明の特定の実施形態は、本発明の組成物を対象に1回または複数回投与することにより、対象の食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対する免疫応答を誘導する方法であって、細菌ClpBタンパク質が、対象の特異的免疫応答を誘導するために十分なレベルにある、方法を提供する。当該免疫は、望ましい免疫法に従って少なくとも2、4、または6週間(またはそれ以上)の時間間隔で複数回反復することができる。
本願を通して、用語「含む」は、具体的に記載したすべての特性、ならびに任意の特性、追加的な特性、特定していない特性を含むと解釈すべきである。本明細書中で使用されるように、用語「含む」の使用はまた、具体的に言及した特性以外のいかなる特性も存在しない(すなわち「〜からなる」)実施形態を開示する。
本発明を、以下の図面および実施例を参照してより詳細に記載する。
配列
配列番号1:NCBI参照番号NP_417083.1として参照され、Uni−Prot entry P63284として参照される大腸菌K12由来のシャペロンタンパク質ClpBのアミノ酸配列を示す。
配列番号2:配列番号1の大腸菌K12由来のシャペロンタンパク質ClpBのアミノ酸配列の542〜548番目のアミノ酸を示す。
配列番号3:Gen Peptの配列ID PRF:223274として参照されるホモサピエンス由来のα−MSHのアミノ酸配列を示す。
配列番号4:大腸菌K12のorf264を増幅させるためのヌクレオチドプライマーK12−Rの核酸配列を示す。
配列番号5:大腸菌K12のorf264を増幅させるためのヌクレオチドプライマーClpBの核酸配列を示す。
配列番号1:NCBI参照番号NP_417083.1として参照され、Uni−Prot entry P63284として参照される大腸菌K12由来のシャペロンタンパク質ClpBのアミノ酸配列を示す。
配列番号2:配列番号1の大腸菌K12由来のシャペロンタンパク質ClpBのアミノ酸配列の542〜548番目のアミノ酸を示す。
配列番号3:Gen Peptの配列ID PRF:223274として参照されるホモサピエンス由来のα−MSHのアミノ酸配列を示す。
配列番号4:大腸菌K12のorf264を増幅させるためのヌクレオチドプライマーK12−Rの核酸配列を示す。
配列番号5:大腸菌K12のorf264を増幅させるためのヌクレオチドプライマーClpBの核酸配列を示す。
実施例
以下の実施例は、共生腸内細菌大腸菌K12のClpBシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン(α−MSH)の立体構造模倣体であることを例証する。
以下の実施例は、共生腸内細菌大腸菌K12のClpBシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン(α−MSH)の立体構造模倣体であることを例証する。
以下の実施例は、ClpB免疫マウスが、食物摂取量および体重の増加および不安の低減を伴って抗ClpB IgGおよび抗α―MSH IgGの産生の増加を示すことをさらに明らかにする。さらに、実施例は、ラットへ強制経口投与した大腸菌K12が、ClpBおよびα―MSH反応性免疫グロブリンの血漿レベルを増加させたことを示す。
実施例1
材料および方法
大腸菌K12培養物およびタンパク質抽出物
この試験で使用する細菌株は大腸菌K12であった。この細胞株は、フランスのルーアン大学のUMR 6270 CNRS研究室のハウスコレクションより入手可能であった。凍結したストック(−80℃)から、大腸菌K12を、ルリアブロス(LB)液体培地(MP, lllkrich, France)250mlに懸濁し、混入物質を検出するためにLB寒天に播種した。細菌を含む培地を50mlのチューブ中37℃で24時間嫌気的に培養した。大腸菌の数を推定するために、細菌培養物の吸光度(OD)を分光光度計によりλ=600nmで測定し、OD 0.1はmlあたり細胞約108個に対応した。タンパク質の抽出のため、細菌を4,000g、4℃で30分間遠心し、残渣をトリスヒドロキシメチルアミノメタン(TRIS)バッファー(pH7.4)2mlに溶解し、室温で3分間超音波処理によりホモジナイズした。溶解していない細胞のフラグメントからタンパク質を分離するために、細菌のホモジネートを、10,000g、4℃で30分間遠心した。上清を回収し、次に60,000g、4℃で45分間超遠心して、タンパク質を細胞質(上清)と膜(残渣に)の分画にさらに分離した。タンパク質の濃度を2−D Quant Kit(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を使用して測定した。
材料および方法
大腸菌K12培養物およびタンパク質抽出物
この試験で使用する細菌株は大腸菌K12であった。この細胞株は、フランスのルーアン大学のUMR 6270 CNRS研究室のハウスコレクションより入手可能であった。凍結したストック(−80℃)から、大腸菌K12を、ルリアブロス(LB)液体培地(MP, lllkrich, France)250mlに懸濁し、混入物質を検出するためにLB寒天に播種した。細菌を含む培地を50mlのチューブ中37℃で24時間嫌気的に培養した。大腸菌の数を推定するために、細菌培養物の吸光度(OD)を分光光度計によりλ=600nmで測定し、OD 0.1はmlあたり細胞約108個に対応した。タンパク質の抽出のため、細菌を4,000g、4℃で30分間遠心し、残渣をトリスヒドロキシメチルアミノメタン(TRIS)バッファー(pH7.4)2mlに溶解し、室温で3分間超音波処理によりホモジナイズした。溶解していない細胞のフラグメントからタンパク質を分離するために、細菌のホモジネートを、10,000g、4℃で30分間遠心した。上清を回収し、次に60,000g、4℃で45分間超遠心して、タンパク質を細胞質(上清)と膜(残渣に)の分画にさらに分離した。タンパク質の濃度を2−D Quant Kit(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を使用して測定した。
2次元PAGE
2次元(2D)ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)のために、大腸菌K12のタンパク質抽出物400μgを使用して、固定したpH勾配(IPG)ストリップ(pH4−7;18cm;BIO−RAD, Hercules, CA)を再水和した。次にタンパク質をIPGphor 等電点電気泳動システム(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を使用することにより合計85,000V−hでの等電点電気泳動により第1の次元で分離した。電気泳動の後、IPGストリップを平衡バッファー[6molの尿素/L、30%(vol:vol)グリセロール、2%(wt:vol)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、50mmolのTris−HCI/L(pH8.8)、および2%(wt:vol)ジチオスレイトールを含む0.25%(wt:vol)ブロモフェノールブルー]中で20分間インキュベートし、次に4%(wt:vol)のヨードアセトアミドを含む平衡バッファー中で20分間アルキル化した。次にIPGストリップをSDS−PAGEのために10%のポリアシルアミド勾配ゲル(20cm・18cm・1mm)上に付着させた。第2の次元を、25℃で12mA/ゲルのEttan Daltsix vertical electrophoresis system(GE Healthcare)で一晩行った。SDS−PAGEの後、2Dゲルを、2%(vol:vol)オルトリン酸および50%(vol:vol)のメタノール中、室温で2時間固定した。次にゲルを水ですすぎ、タンパク質のスポットを、CBB G−250(BIO−RAD)染色[34%(vol:vol)メタノール、17%(wt:vol)硫酸アンモニウム、2%(vol:vol)のオルトリン酸、および0.66gのCBBG−250/L]により可視化した。
2次元(2D)ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)のために、大腸菌K12のタンパク質抽出物400μgを使用して、固定したpH勾配(IPG)ストリップ(pH4−7;18cm;BIO−RAD, Hercules, CA)を再水和した。次にタンパク質をIPGphor 等電点電気泳動システム(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を使用することにより合計85,000V−hでの等電点電気泳動により第1の次元で分離した。電気泳動の後、IPGストリップを平衡バッファー[6molの尿素/L、30%(vol:vol)グリセロール、2%(wt:vol)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、50mmolのTris−HCI/L(pH8.8)、および2%(wt:vol)ジチオスレイトールを含む0.25%(wt:vol)ブロモフェノールブルー]中で20分間インキュベートし、次に4%(wt:vol)のヨードアセトアミドを含む平衡バッファー中で20分間アルキル化した。次にIPGストリップをSDS−PAGEのために10%のポリアシルアミド勾配ゲル(20cm・18cm・1mm)上に付着させた。第2の次元を、25℃で12mA/ゲルのEttan Daltsix vertical electrophoresis system(GE Healthcare)で一晩行った。SDS−PAGEの後、2Dゲルを、2%(vol:vol)オルトリン酸および50%(vol:vol)のメタノール中、室温で2時間固定した。次にゲルを水ですすぎ、タンパク質のスポットを、CBB G−250(BIO−RAD)染色[34%(vol:vol)メタノール、17%(wt:vol)硫酸アンモニウム、2%(vol:vol)のオルトリン酸、および0.66gのCBBG−250/L]により可視化した。
イムノブロッティング
2D−PAGEの後、大腸菌の細胞質タンパク質を、ドライ転写法(Trans Blot Cell, Bio−Rad,米国)および膜の大きさ1平方センチメートルあたり一定の電流(0.8mA.cm−2)を使用することにより、Hybond−ECL PVDFメンブレン(GE Healthcare)上に2時間転写した。転写後、膜を、リン酸緩衝食塩水(PBS;10mmol.l−1のTris(pH8);150mmol/lのNaCI)プラス0.05%(v:v)のTween 20中5%(wt:v)のミルクでブロッキングした。洗浄した後、膜を、ポリクローナルウサギ抗α−MSH抗血清(1:1000,Peninsula Laboratories, 米国カリフォルニア州 サン・カルロス)と共に4℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、次にポリクローナルブタ抗ウサギHRP結合型免疫グロブリン(1:3000;Dako,フランストラップ)と共にインキュベートした。イムノブロットを、ECL検出システム(GE He(Kodak)によって明らかにして、グレースケールマーカー(Kodak)を用いて予め較正したImageScanner II(GE Healthcare)でスキャンし、Labscan 6.00ソフトウェア(GE Healthcare)によってデジタル化した。10−6M 1−MSHペプチドによってウサギ抗α−MSH抗血清を4℃で一晩吸着させた後に、同じ技法を実施した。
2D−PAGEの後、大腸菌の細胞質タンパク質を、ドライ転写法(Trans Blot Cell, Bio−Rad,米国)および膜の大きさ1平方センチメートルあたり一定の電流(0.8mA.cm−2)を使用することにより、Hybond−ECL PVDFメンブレン(GE Healthcare)上に2時間転写した。転写後、膜を、リン酸緩衝食塩水(PBS;10mmol.l−1のTris(pH8);150mmol/lのNaCI)プラス0.05%(v:v)のTween 20中5%(wt:v)のミルクでブロッキングした。洗浄した後、膜を、ポリクローナルウサギ抗α−MSH抗血清(1:1000,Peninsula Laboratories, 米国カリフォルニア州 サン・カルロス)と共に4℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、次にポリクローナルブタ抗ウサギHRP結合型免疫グロブリン(1:3000;Dako,フランストラップ)と共にインキュベートした。イムノブロットを、ECL検出システム(GE He(Kodak)によって明らかにして、グレースケールマーカー(Kodak)を用いて予め較正したImageScanner II(GE Healthcare)でスキャンし、Labscan 6.00ソフトウェア(GE Healthcare)によってデジタル化した。10−6M 1−MSHペプチドによってウサギ抗α−MSH抗血清を4℃で一晩吸着させた後に、同じ技法を実施した。
タンパク質の同定
関心対象のタンパク質のスポットを、Ettan Spot Picker(GE Healthcare)を使用してCPPG−250染色した2Dゲルから切除し、タンパク質の自動ゲル内消化を、Ettan Digester(GE Healthcare)で実施した。次にタンパク質抽出物を、5%(vol:vol)アセトニトリル/0.1%(vol:vol)ギ酸10μLに再懸濁し、次にナノスプレー源(nanospray source)およびHPLC−チップキューブのインターフェース(Agilent Technologies, フランス、クールタブフ)を備えた6340 イオントラップ質量分析器に結合したnano−LC1200で分析した。簡潔に述べると、ペプチドを濃縮し、40nlのRPC18トラップカラムで脱塩し、Zorbax(30−nmの孔径,5−μmの粒径)C18カラム(43mm長×75μmの内径;Agilent Technologies)で分離した。9分間の直線勾配(0.1%のギ酸中3〜80%のアセトニトリル)を流速400nl.min−1)で使用し、溶離液を、イオントラップ質量分析器で分析した。タンパク質同定のため、MS/MSピークのリストを抽出し、MASCOT Daemon バージョン2.2.2(Matrix Science)検索エンジンを使用することによりタンパク質データベースと比較した。この検索を、以下の特定のパラメータ:酵素の特異性、トリプシン;残った切断部位1は許容される;固定修飾なし;可変性の修飾、メチオニン酸化、システイン、カルバミドメチル化、セリン、チロシン、およびスレオニンのリン酸化;モノアイソトピック;ペプチド電荷2+および3+;前駆体イオンの質量許容差、0.5Da;断片化に関する質量許容差、0.6Da;機器としてのESI−TRAP;分類、大腸菌;国立生物工学情報センター(NCBI)データベース(NCBInr 20120531(18280215の配列、6265275233の残基);メリーランド州ベセスダ)を用いて実施した。以下の基準:それぞれMASCOTスコア54超(p<0.01)を有する少なくとも2つの上位にランク付けされたペプチド(赤色の太字)、またはそれぞれMASCOT スコア47超(p<0.05)を有する少なくとも2つの上位にランク付けされたペプチドによる同定のうち1つを満たす場合、タンパク質のヒットが自動的に可視化された。偽陽性の比率を評価するために、すべての初回データベース検索を、MASCOTの「デコイ」を使用して実施した。偽陽性の比率が決して1%を超えなければ、結果は適切であると考えられた。
関心対象のタンパク質のスポットを、Ettan Spot Picker(GE Healthcare)を使用してCPPG−250染色した2Dゲルから切除し、タンパク質の自動ゲル内消化を、Ettan Digester(GE Healthcare)で実施した。次にタンパク質抽出物を、5%(vol:vol)アセトニトリル/0.1%(vol:vol)ギ酸10μLに再懸濁し、次にナノスプレー源(nanospray source)およびHPLC−チップキューブのインターフェース(Agilent Technologies, フランス、クールタブフ)を備えた6340 イオントラップ質量分析器に結合したnano−LC1200で分析した。簡潔に述べると、ペプチドを濃縮し、40nlのRPC18トラップカラムで脱塩し、Zorbax(30−nmの孔径,5−μmの粒径)C18カラム(43mm長×75μmの内径;Agilent Technologies)で分離した。9分間の直線勾配(0.1%のギ酸中3〜80%のアセトニトリル)を流速400nl.min−1)で使用し、溶離液を、イオントラップ質量分析器で分析した。タンパク質同定のため、MS/MSピークのリストを抽出し、MASCOT Daemon バージョン2.2.2(Matrix Science)検索エンジンを使用することによりタンパク質データベースと比較した。この検索を、以下の特定のパラメータ:酵素の特異性、トリプシン;残った切断部位1は許容される;固定修飾なし;可変性の修飾、メチオニン酸化、システイン、カルバミドメチル化、セリン、チロシン、およびスレオニンのリン酸化;モノアイソトピック;ペプチド電荷2+および3+;前駆体イオンの質量許容差、0.5Da;断片化に関する質量許容差、0.6Da;機器としてのESI−TRAP;分類、大腸菌;国立生物工学情報センター(NCBI)データベース(NCBInr 20120531(18280215の配列、6265275233の残基);メリーランド州ベセスダ)を用いて実施した。以下の基準:それぞれMASCOTスコア54超(p<0.01)を有する少なくとも2つの上位にランク付けされたペプチド(赤色の太字)、またはそれぞれMASCOT スコア47超(p<0.05)を有する少なくとも2つの上位にランク付けされたペプチドによる同定のうち1つを満たす場合、タンパク質のヒットが自動的に可視化された。偽陽性の比率を評価するために、すべての初回データベース検索を、MASCOTの「デコイ」を使用して実施した。偽陽性の比率が決して1%を超えなければ、結果は適切であると考えられた。
OFFGELからのタンパク質の同定
大腸菌K12のタンパク質の24分画への高分解能の分離を、OFFGEL pH3−10キット(Agilent Technologies)を使用して3100 OFFGEL フラクショネーターで行った。タンパク質の試料(400μg)の調製およびOFFGELシステムのすべての部品の組み立てを、Agilent Quick start Guideに記載される手順に従って行った。OFFGEL分画を、30時間後に64KVhに達するまで最大制限電流パラメータ(8000V、50μΑ、および200mW)を用いて標準的なプログラムOG24PROを使用して実施した。実験の最後に、すべての画分を、0.8mlのディープウェル(Thermofisher,フランス、イルキルシュ)に移し、−20℃で保存した。OFFGELの中心部から回収した9個のタンパク質含有分画を、ウサギ抗α−MSH ポリクローナル抗血清(Peninsula Laboratories)を使用するウェスタンブロットにより調べた後、上述のタンパク質を同定した。
大腸菌K12のタンパク質の24分画への高分解能の分離を、OFFGEL pH3−10キット(Agilent Technologies)を使用して3100 OFFGEL フラクショネーターで行った。タンパク質の試料(400μg)の調製およびOFFGELシステムのすべての部品の組み立てを、Agilent Quick start Guideに記載される手順に従って行った。OFFGEL分画を、30時間後に64KVhに達するまで最大制限電流パラメータ(8000V、50μΑ、および200mW)を用いて標準的なプログラムOG24PROを使用して実施した。実験の最後に、すべての画分を、0.8mlのディープウェル(Thermofisher,フランス、イルキルシュ)に移し、−20℃で保存した。OFFGELの中心部から回収した9個のタンパク質含有分画を、ウサギ抗α−MSH ポリクローナル抗血清(Peninsula Laboratories)を使用するウェスタンブロットにより調べた後、上述のタンパク質を同定した。
マウスにおける免疫および行動
動物のケアおよび実験は、アメリカ国立衛生研究所により確立されたガイドラインに従うものであり、フランスおよび欧州共同体の規則(欧州共同体の官報L 358, 18/12/1986))の両方にまとめられている。2ヶ月齢の雄性C57Bl6マウス(Janvier Laboratories,フランスラ・トゥーレット)を、午前7時に点灯する12時間の明暗周期で動物施設に馴化させ、標準的なマウス保持ケージ(n=8)にそれぞれ保存した。マウスに、常時入手可能である飲料水と共に標準的なげっ歯類固形飼料(RM1 diet,SDS,UK)を自由に与え、体重を測定した。馴化の最中にマウスを、ケージあたりのマウスあたりの平均体重が類似するように4つのケージに分けた。1週間馴化した後、各ケージのマウスを、4つの試験群のうちの1つに割り当て、以下の処置:((i)群1、ClpB免疫(n=8):ClpBタンパク質(Delphi Genetics)50μg/マウスを、完全フロイントアジュバント(Sigma,米国ミズーリ州セントルイス)とPBSの1:1容量の200μlを腹腔内(i.p)投与;(ii)群2、アジュバント注射対照(n=8):CFAを含むPBS(1:1(v容量、i.p.)混合物200μl中で注射;(iii)群3;PBS注射対照(n=8):200μlのPBS(i.p);および(iv)群4、未処置の対照(n=8):注射をしていない)を行い、次にすべてのマウスを保持ケージに戻した。15日後、マウスに、追加免疫を行い、以下の処置:((i)群1(n=8)、ClpBタンパク質(Delphi Genetics)50μg/マウスを含む不完全フロイントアジュバント(IFA、Sigma)とPBSの1:1混合物200μlのi.p.;(ii)群2(n=8);IFAを含むPBS200μl(1:1容量、i.p.);(iii)群3(n=8):PBS200μl(i.p.);およびiv)群4(n=8):注射なし)を行った。
動物のケアおよび実験は、アメリカ国立衛生研究所により確立されたガイドラインに従うものであり、フランスおよび欧州共同体の規則(欧州共同体の官報L 358, 18/12/1986))の両方にまとめられている。2ヶ月齢の雄性C57Bl6マウス(Janvier Laboratories,フランスラ・トゥーレット)を、午前7時に点灯する12時間の明暗周期で動物施設に馴化させ、標準的なマウス保持ケージ(n=8)にそれぞれ保存した。マウスに、常時入手可能である飲料水と共に標準的なげっ歯類固形飼料(RM1 diet,SDS,UK)を自由に与え、体重を測定した。馴化の最中にマウスを、ケージあたりのマウスあたりの平均体重が類似するように4つのケージに分けた。1週間馴化した後、各ケージのマウスを、4つの試験群のうちの1つに割り当て、以下の処置:((i)群1、ClpB免疫(n=8):ClpBタンパク質(Delphi Genetics)50μg/マウスを、完全フロイントアジュバント(Sigma,米国ミズーリ州セントルイス)とPBSの1:1容量の200μlを腹腔内(i.p)投与;(ii)群2、アジュバント注射対照(n=8):CFAを含むPBS(1:1(v容量、i.p.)混合物200μl中で注射;(iii)群3;PBS注射対照(n=8):200μlのPBS(i.p);および(iv)群4、未処置の対照(n=8):注射をしていない)を行い、次にすべてのマウスを保持ケージに戻した。15日後、マウスに、追加免疫を行い、以下の処置:((i)群1(n=8)、ClpBタンパク質(Delphi Genetics)50μg/マウスを含む不完全フロイントアジュバント(IFA、Sigma)とPBSの1:1混合物200μlのi.p.;(ii)群2(n=8);IFAを含むPBS200μl(1:1容量、i.p.);(iii)群3(n=8):PBS200μl(i.p.);およびiv)群4(n=8):注射なし)を行った。
追加免疫処置の翌日に、自動給餌モニタをそれぞれ備えるBioDAQマウスケージ(Research Diets,Inc.,ニュージャージー州ニューブランズウィック)にマウスを個々に入れた。食料(SERLAB, フランスモンタテール)および飲料水を自由に入手可能な状態にし、体重を毎日測定した。BioDAQケージに3日間馴化させた後に、マウスに以下の処置:((群1、2、および3(それぞれn=8)すなわちClpBで免疫したマウスに、アジュバントおよびPBSをそれぞれ注射し、すべてのマウスにα−MSHペプチド(Bachem AG)100μg/kg体重を含むPBS約100μl(i.p.)を、午前10時に急性的に注射した。を行った。対照のマウス(n=8)にはPBSのみ(i.p.)を投与した。給餌データを、BioDAQ データビューワー2.3.07(Research Diets)を使用して連続的にモニターして分析した。食事のパターン分析のため、食事の間隔を、300秒に設定した。
給餌試験の後、マウスを、食料および水を自由に入手可能な個々のマウス保持ケージに入れ、2日間連続して行ったO迷路試験における自発運動活性および不安について分析した。O迷路試験から2時間後に、マウスをギロチンでの頭部切断により屠殺し、体躯の血液をEDTA含有チューブに回収した。血漿を、3,500rpm(1.4g)、4℃で15分間遠心することにより分離し、アッセイするまで−80℃で保存した。
自発運動活性および不安の試験
BioDAQケージでの給餌試験の後に、マウスを、Versamax動物活性モニター(AccuScan Instruments, Inc.,米国、オハイオ州コロンバス)を使用して自発運動活性に関して分析した。自発運動活性試験の翌日に、すべてのマウスを、高架式O迷路での不安に関して試験した。高架式O迷路は、げっ歯類の不安を試験するために薬理学的に検証されたより一般的に使用される高架式十字迷路法の変形である(Crawley, J. N. and Bailey, K. R., Methods of behavior analysis in neuroscience, 77−101 (CRC Press, 2009))。O迷路の利点は、従来の十字迷路の曖昧な中心の四角がない点である。O迷路(Med Associate, Inc., St. Albans, VT)は、床から80cmの高さの円形の赤外線プラットフォームからなり、灰色のプラスチック製の2つの開口部および2つの閉鎖部を特徴とした。閉鎖部は、迷路の表面から20cm上に延びた壁により囲まれており、黒色の赤外線プレキシグラスのふたで覆われていた。各試験を、2つの閉鎖部の一方にマウスを配置することにより開始した。試験は5分間続行し、O迷路の上方に配置したビデオカメラおよびEthoVisionビデオ追跡ソフトウェア(Noldus IT、dオランダヴァーヘニンゲン)を使用して記録した。開口部および閉鎖部で費やした距離および時間の測定値を分析した。それぞれのマウスの試験のあいだに、O迷路を30%のアルコールで清潔にした。
BioDAQケージでの給餌試験の後に、マウスを、Versamax動物活性モニター(AccuScan Instruments, Inc.,米国、オハイオ州コロンバス)を使用して自発運動活性に関して分析した。自発運動活性試験の翌日に、すべてのマウスを、高架式O迷路での不安に関して試験した。高架式O迷路は、げっ歯類の不安を試験するために薬理学的に検証されたより一般的に使用される高架式十字迷路法の変形である(Crawley, J. N. and Bailey, K. R., Methods of behavior analysis in neuroscience, 77−101 (CRC Press, 2009))。O迷路の利点は、従来の十字迷路の曖昧な中心の四角がない点である。O迷路(Med Associate, Inc., St. Albans, VT)は、床から80cmの高さの円形の赤外線プラットフォームからなり、灰色のプラスチック製の2つの開口部および2つの閉鎖部を特徴とした。閉鎖部は、迷路の表面から20cm上に延びた壁により囲まれており、黒色の赤外線プレキシグラスのふたで覆われていた。各試験を、2つの閉鎖部の一方にマウスを配置することにより開始した。試験は5分間続行し、O迷路の上方に配置したビデオカメラおよびEthoVisionビデオ追跡ソフトウェア(Noldus IT、dオランダヴァーヘニンゲン)を使用して記録した。開口部および閉鎖部で費やした距離および時間の測定値を分析した。それぞれのマウスの試験のあいだに、O迷路を30%のアルコールで清潔にした。
ClpBおよびα−MSH自己抗体アッセイ
ClpB、α−MSH、およびACTHと反応する自己抗体Absの血漿中レベルを、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用して測定した。簡潔に説明すると、ClpBタンパク質(Delphi Genetics)、α−MSH、またはACTHのペプチド(Bachem AG、Bubendorf, Switzerland)を、100mMのNaHCO3バッファー中100μlおよび2μg/mlの濃度(PH9.6)で使用して、Maxisorpプレート(Nunc, ニューヨーク州ロチェスター,USA)の上に4℃で72時間コーティングした。プレートを0.05% Tween 200を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)(pH7.4)で洗浄し(5分間、3回)、次にPBSで1:200に希釈したマウスのまたはラットの血漿100μlと共に4℃で一晩インキュベートして遊離の自己抗体のレベルを決定するか、または解離性の3MのNaClおよび1.5Mのグリシンバッファー(pH8.9)で1:200に希釈して総自己抗体のレベルを決定した。プレートを洗浄し(3回)、100μlのアルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲートヤギ抗ラットIgG(1:2000)、抗ラットIgM(1:1000)、抗マウスIgG(1:2000)、または抗マウスIgM(1:1000)と共にインキュベートした。これらはすべてJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.(ペンシルベニア州ウェスト・グローブ)から入手した。洗浄(3回)を行った後、100μlのp−ニトロフェニルリン酸溶液(Sigma)を、アルカリホスファターゼの基質として添加した。室温で40分間インキュベートした後、3NのNaOHを添加することにより、反応を停止させた。ODをマイクロプレートリーダーMetertech 960(Metertech Inc., 台湾、台北市)を使用して405nmで決定した。血漿試料を添加していないプレートの読み取りから得たブランクのODの値を、試料のODの値から除算した。各決定を2回の反復実験で行った。反復実験値間の変動は、5%未満であった。同様のプロトコルを使用して、対応する抗ヒトIgGまたはIgM APコンジュゲート抗体(1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)を使用して、ヒト血漿(1:400)中の抗ClpBのIgGおよびIgM、ならびに抗α―MSH IgGを測定した。
ClpB、α−MSH、およびACTHと反応する自己抗体Absの血漿中レベルを、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用して測定した。簡潔に説明すると、ClpBタンパク質(Delphi Genetics)、α−MSH、またはACTHのペプチド(Bachem AG、Bubendorf, Switzerland)を、100mMのNaHCO3バッファー中100μlおよび2μg/mlの濃度(PH9.6)で使用して、Maxisorpプレート(Nunc, ニューヨーク州ロチェスター,USA)の上に4℃で72時間コーティングした。プレートを0.05% Tween 200を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)(pH7.4)で洗浄し(5分間、3回)、次にPBSで1:200に希釈したマウスのまたはラットの血漿100μlと共に4℃で一晩インキュベートして遊離の自己抗体のレベルを決定するか、または解離性の3MのNaClおよび1.5Mのグリシンバッファー(pH8.9)で1:200に希釈して総自己抗体のレベルを決定した。プレートを洗浄し(3回)、100μlのアルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲートヤギ抗ラットIgG(1:2000)、抗ラットIgM(1:1000)、抗マウスIgG(1:2000)、または抗マウスIgM(1:1000)と共にインキュベートした。これらはすべてJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.(ペンシルベニア州ウェスト・グローブ)から入手した。洗浄(3回)を行った後、100μlのp−ニトロフェニルリン酸溶液(Sigma)を、アルカリホスファターゼの基質として添加した。室温で40分間インキュベートした後、3NのNaOHを添加することにより、反応を停止させた。ODをマイクロプレートリーダーMetertech 960(Metertech Inc., 台湾、台北市)を使用して405nmで決定した。血漿試料を添加していないプレートの読み取りから得たブランクのODの値を、試料のODの値から除算した。各決定を2回の反復実験で行った。反復実験値間の変動は、5%未満であった。同様のプロトコルを使用して、対応する抗ヒトIgGまたはIgM APコンジュゲート抗体(1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)を使用して、ヒト血漿(1:400)中の抗ClpBのIgGおよびIgM、ならびに抗α―MSH IgGを測定した。
α−MSHによるClpB抗体の吸収
PBSで1:400に希釈したヒトの血漿試料を、4℃で一晩10−6Mのα−MSHペプチド(Bachem)と共にプレインキュベートした後、試料を、ClpBタンパク質(Delphi Genetics)でコーティングした96ウェルMaxisorpプレート(Nunc)に添加した。ClpBと反応性であるIgGおよびIgM抗体を、対応する上述の抗ヒトAPコンジュゲート抗体(Jackson)を使用するELISAにより検出した。α−MSHと交差反応性のClpB抗体のパーセンテージを、100%に等しい個々のそれぞれの血漿試料中で吸収することなく検出した抗ClpB抗体のレベルと比較して計算した。
PBSで1:400に希釈したヒトの血漿試料を、4℃で一晩10−6Mのα−MSHペプチド(Bachem)と共にプレインキュベートした後、試料を、ClpBタンパク質(Delphi Genetics)でコーティングした96ウェルMaxisorpプレート(Nunc)に添加した。ClpBと反応性であるIgGおよびIgM抗体を、対応する上述の抗ヒトAPコンジュゲート抗体(Jackson)を使用するELISAにより検出した。α−MSHと交差反応性のClpB抗体のパーセンテージを、100%に等しい個々のそれぞれの血漿試料中で吸収することなく検出した抗ClpB抗体のレベルと比較して計算した。
血漿からのIgGの精製
血漿グロブリンの抽出を、製造社の説明書にしたがいC−18SEPカラム(Phoenix Pharmaceuticals, 米国カリフォルニア州バーリンゲーム)上での血漿の酸性化および分離により行った。手短に述べるとマウスまたはラットの血漿500μlをバッファーA(1%のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液)500μlと混合した。カラムを、700rpmでの3分間の遠心により1mlのバッファーB(1%のTFA中60%のアセトニトリル)中で活性化し、バッファーA3mlで3回すすいだ。希釈した血漿(バッファーAに1:1で希釈)をカラムに添加し、溶離液(1ml)をIgGのさらなる精製のため保存した(−20℃で凍結保存)。総IgGを、製造社の説明書に従ってMelon Gelキット(Thermo Fisher Scientific,米国イリノイ州ロックフォールド)を使用してラット血漿試料の溶離液から精製した。手短に述べると、キットの精製バッファーで1:4に希釈した血漿の溶離液を、カラムに沈着させた洗浄済みのmelon gel上に添加した。カラムを6000rpmで1分間スピンさせ、IgG含有溶離液を残して−20℃で凍結保存した後、凍結乾燥した。凍結乾燥したIgGを、HBS−EPバッファー(GE Healthcare,ニュージャージー州ピスカタウェイ)で再構成した。
血漿グロブリンの抽出を、製造社の説明書にしたがいC−18SEPカラム(Phoenix Pharmaceuticals, 米国カリフォルニア州バーリンゲーム)上での血漿の酸性化および分離により行った。手短に述べるとマウスまたはラットの血漿500μlをバッファーA(1%のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液)500μlと混合した。カラムを、700rpmでの3分間の遠心により1mlのバッファーB(1%のTFA中60%のアセトニトリル)中で活性化し、バッファーA3mlで3回すすいだ。希釈した血漿(バッファーAに1:1で希釈)をカラムに添加し、溶離液(1ml)をIgGのさらなる精製のため保存した(−20℃で凍結保存)。総IgGを、製造社の説明書に従ってMelon Gelキット(Thermo Fisher Scientific,米国イリノイ州ロックフォールド)を使用してラット血漿試料の溶離液から精製した。手短に述べると、キットの精製バッファーで1:4に希釈した血漿の溶離液を、カラムに沈着させた洗浄済みのmelon gel上に添加した。カラムを6000rpmで1分間スピンさせ、IgG含有溶離液を残して−20℃で凍結保存した後、凍結乾燥した。凍結乾燥したIgGを、HBS−EPバッファー(GE Healthcare,ニュージャージー州ピスカタウェイ)で再構成した。
cAMPの実験のため、ClpB群およびアジュバント対照群の8匹のマウスから精製したIgGを、それぞれ、2つに分けた2つのプールにそれぞれ混合した。1つのパートをcAMPアッセイに直接使用し、もう一方を、活性化したUltraLinkビーズ(Pierce,米国イリノイ州ロックフォールド)にコーティングしたα−MSHに対するアフィニティクロマトグラフィーを使用することによりさらに精製した。α−MSH IgGを枯渇させたIgG溶離液を保存し、凍結乾燥し、cAMPアッセイに使用した0.5mg/mlの最終濃度にまでPBSで希釈した。
親和性動態アッセイ
ClpBおよびα−MSHに関するマウスおよびラットIgG自己抗体の親和性動態を、BIAcore 1000機器(GE Healthcare)での表面プラズモン共鳴(SPR)現象に基づく生体分子特異的相互作用分析(BIA)により決定した。α−MSH(Bachem)またはClpBタンパク質(Delphi Genetics)を、10mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)(GE Healthcare)中0.5mg/mlに希釈し、アミンカップリングキット(GE Healthcare)を使用することによりセンサーチップCM5(GE Healthcare)に共有結合させた。すべての測定を、同じα−MSHまたはClpBコーティングチップで実施した。親和性動態分析では、840nmolの2回反復実験を含む、各IgGの試料の5回連続希釈液:3360、1680、840、420、および210(nmol)ならびにブランクの試料(HBS−EPバッファーのみ)についてマルチサイクル法を実行した。各サイクルは、2分間の分析物の注射と、流速30μl/分での25℃、5分間の解離を含んだ。各試料の注射の間、結合表面を、10mMのNaOHで再生し、センサーグラムの同じベースラインレベルを得た。親和性動態のデータを、BiaEvaluation4.1.1プログラム(GE Healthcare)を使用して分析した。動態データを適合させるために、Langmurの1:1のモデルを使用し、ブランクの値を減算することにより、試料の値を補正した。
ClpBおよびα−MSHに関するマウスおよびラットIgG自己抗体の親和性動態を、BIAcore 1000機器(GE Healthcare)での表面プラズモン共鳴(SPR)現象に基づく生体分子特異的相互作用分析(BIA)により決定した。α−MSH(Bachem)またはClpBタンパク質(Delphi Genetics)を、10mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)(GE Healthcare)中0.5mg/mlに希釈し、アミンカップリングキット(GE Healthcare)を使用することによりセンサーチップCM5(GE Healthcare)に共有結合させた。すべての測定を、同じα−MSHまたはClpBコーティングチップで実施した。親和性動態分析では、840nmolの2回反復実験を含む、各IgGの試料の5回連続希釈液:3360、1680、840、420、および210(nmol)ならびにブランクの試料(HBS−EPバッファーのみ)についてマルチサイクル法を実行した。各サイクルは、2分間の分析物の注射と、流速30μl/分での25℃、5分間の解離を含んだ。各試料の注射の間、結合表面を、10mMのNaOHで再生し、センサーグラムの同じベースラインレベルを得た。親和性動態のデータを、BiaEvaluation4.1.1プログラム(GE Healthcare)を使用して分析した。動態データを適合させるために、Langmurの1:1のモデルを使用し、ブランクの値を減算することにより、試料の値を補正した。
大腸菌の強制経口投与
2か月齢の雌性Wistarラット(n=24)(体重220〜250g)(Janvier Labs)を、専用の動物施設で12時間の明暗周期で、24℃で維持した。ラットに標準的なげっ歯類固形飼料(RM1 diet, SDS, UK)を与えて、標準的な保持ケージで1週間保持した。馴化させた後に個別の代謝ケージ(Tecniplast, Lyon, France)に保存し、ここでは同一のRM1ではあるが粉砕した固形試料(SDS)を与えた。飲料水は、常に自由入手できる状態であった。体重、食物および水の摂取量を毎日測定した。大腸菌K12をLB培地中上述のように培養した。ラットを、108のE.coli K12(n=12)を含むLB培地4mlまたは細菌を含まないLB培地4ml(対照、n=12)を強制経口投与で胃内に投与した。強制経口投与の手順を、21日間、午前9:00〜10:00の間で毎日行った。強制経口投与を行った後、ラットをギロチンによる断頭により屠殺し、体躯の血液をEDTA含有チューブ内に回収した。血漿を4℃で10分間、3,500r.p.m.(1.4g)での遠心により分離し、アッセイするまで−80℃で保存した。
2か月齢の雌性Wistarラット(n=24)(体重220〜250g)(Janvier Labs)を、専用の動物施設で12時間の明暗周期で、24℃で維持した。ラットに標準的なげっ歯類固形飼料(RM1 diet, SDS, UK)を与えて、標準的な保持ケージで1週間保持した。馴化させた後に個別の代謝ケージ(Tecniplast, Lyon, France)に保存し、ここでは同一のRM1ではあるが粉砕した固形試料(SDS)を与えた。飲料水は、常に自由入手できる状態であった。体重、食物および水の摂取量を毎日測定した。大腸菌K12をLB培地中上述のように培養した。ラットを、108のE.coli K12(n=12)を含むLB培地4mlまたは細菌を含まないLB培地4ml(対照、n=12)を強制経口投与で胃内に投与した。強制経口投与の手順を、21日間、午前9:00〜10:00の間で毎日行った。強制経口投与を行った後、ラットをギロチンによる断頭により屠殺し、体躯の血液をEDTA含有チューブ内に回収した。血漿を4℃で10分間、3,500r.p.m.(1.4g)での遠心により分離し、アッセイするまで−80℃で保存した。
大腸菌K12細菌DNAアッセイ
QIAampR DNA Stool Mini Kit(QIAGEN, France)により、強制経口投与開始前に採取したラットの糞便から、DNAを抽出した。また、大腸菌K12のDNAを、細胞株の培養物から抽出し、細菌を水に溶解し、100℃で5分間温め、11,000r.p.mで1分間遠心した後、DNAを含有する上清を−20℃で保存した。
QIAampR DNA Stool Mini Kit(QIAGEN, France)により、強制経口投与開始前に採取したラットの糞便から、DNAを抽出した。また、大腸菌K12のDNAを、細胞株の培養物から抽出し、細菌を水に溶解し、100℃で5分間温め、11,000r.p.mで1分間遠心した後、DNAを含有する上清を−20℃で保存した。
公表された試験(Kuhnert, P. et al. Appl Environ Microbiol 61 , 4135−4139 (1995))に基づき、本出願人は、以下のヌクレオチドプライマー、K12−R:5’−ATCCTGCGCACCAATCAACAA−3’(SEQ ID NO: 4)およびK12−F:5’−CGCGATGGAAGATGCTCTGTA−3’(SEQ ID NO: 5)(Invitrogen Custom Primers, Cergy Pontoise, France)を使用して、大腸菌K12のマーカーとしてorf264領域を増幅した。PCRを、MicroAmpチューブ(Eppendorf, Hambourg, Germany)でサーマルサイクラーにおいて実施した。反応を、Go Taq(登録商標)Green Master Mix 2X(Promega, Madison, Wl)25μl、各プライマー1μl(20pmol)、2回蒸留水21μl、細菌性DNA1μlを含む50μlの容量で行った。PCRの条件は、以下の通りであった:94℃で3分間の後に、94℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で1.5分を35サイクル。PCR産物を、1%のアガロースゲル(Sigma, St Louis, MO)で分析し、この増幅産物の大きさは、0、97kbに対応した。
ヒトの対象
摂食障害のエストニアの女性患者由来の血漿試料をこの試験で使用した。AN、BN、およびBEDを、DSM―IV(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 第4版)に従って精神科医および臨床心理学者により診断した。健常な女性のボランティア由来の血漿試料を対照群とした。すべての試験の患者および対照が、試験への参加に関するインフォームドコンセントを提出した。患者および対照由来の血漿試料を、EDI−2試験が完了した日に採取し、直ちに凍結し−70℃で保存し、次にドライアイスと共に輸送して、再度分析するまで−80℃で保存した。
摂食障害のエストニアの女性患者由来の血漿試料をこの試験で使用した。AN、BN、およびBEDを、DSM―IV(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 第4版)に従って精神科医および臨床心理学者により診断した。健常な女性のボランティア由来の血漿試料を対照群とした。すべての試験の患者および対照が、試験への参加に関するインフォームドコンセントを提出した。患者および対照由来の血漿試料を、EDI−2試験が完了した日に採取し、直ちに凍結し−70℃で保存し、次にドライアイスと共に輸送して、再度分析するまで−80℃で保存した。
In vitroでのcAMPアッセイ
ヒトMC4Rを発現するヒト胎児腎(HEK)293細胞の安定した細胞株を、レンチウイルスの形質導入技術を使用して作製し、Amsbio(英国オクソン)から購入した。トランスフェクトした細胞中のMC4R mRNAの高い発現を、Amsbioおよび本出願人の研究室でのRTPCRによりバリデートした。各実験の前に細胞中のトランスジーンの存在を、MC4Rレンチウイルスベクターと同じ状況ではあるが、異なるプロモーターの下で遺伝子を挿入した緑色蛍光タンパク質(GFP)の蛍光顕微鏡での可視化により確認した。α−MSHペプチド(Bachem )を、誘導バッファー:PBS、500μΜのIBMX、100μΜのRO 20−1724(Sigma Aldrich)、20mMのMgCl2中で、それぞれ、0.6、3、4.5、6、15、30、45、60および120pmolのα−MSHの用量に対応する2μM、1μM、750nM、500nM、250nM、100nM、75nM、50nMおよび10nMの最終濃度に希釈した。同様に、1つのブランクの試料を含めた。
ヒトMC4Rを発現するヒト胎児腎(HEK)293細胞の安定した細胞株を、レンチウイルスの形質導入技術を使用して作製し、Amsbio(英国オクソン)から購入した。トランスフェクトした細胞中のMC4R mRNAの高い発現を、Amsbioおよび本出願人の研究室でのRTPCRによりバリデートした。各実験の前に細胞中のトランスジーンの存在を、MC4Rレンチウイルスベクターと同じ状況ではあるが、異なるプロモーターの下で遺伝子を挿入した緑色蛍光タンパク質(GFP)の蛍光顕微鏡での可視化により確認した。α−MSHペプチド(Bachem )を、誘導バッファー:PBS、500μΜのIBMX、100μΜのRO 20−1724(Sigma Aldrich)、20mMのMgCl2中で、それぞれ、0.6、3、4.5、6、15、30、45、60および120pmolのα−MSHの用量に対応する2μM、1μM、750nM、500nM、250nM、100nM、75nM、50nMおよび10nMの最終濃度に希釈した。同様に、1つのブランクの試料を含めた。
解凍した後、湿潤細胞培養インキュベーターにおいて、250mlの組織培養フラスコ(BD−Falcon、Beckton−Dickinson マサチューセッツ州ベドフォード)中に、(2mMのL−グルタミン、10%のFCS、0.1mMの非必須アミノ酸および1%のペニシリン‐ストレプトアビジン)を補充したダルベッコ変法イーグル培地4.5g/lグルコース(Eurobio,フランス、クールタブフ)で細胞を8〜10日間、37℃および5%のCO2で培養した。実験日に、培養したMC4RHEK293細胞を、0.25%のトリプシン‐EDTA(Sigma−Aldrich)で処理し、細胞のペレットをPBSに再懸濁して、無処置のバイオルミネセンス白色96マイクロウェルプレート(Nunc,デンマークロスキレ)中に、ウェル(10μl)あたり約5,000個の細胞を得た。MC4R発現HEK293細胞による環状アデノシン一リン酸(cAMP)の産生を、生物発光アッセイのcAMP−Glo(商標)Maxアッセイキット(Promega)を、製造社の説明書に従って使用して測定した。簡潔に説明すると、細胞を、異なる濃度のα−MSHペプチド単独、またはClpB免疫群もしくはアジュバント対照群からのマウスのIgGのプールとα−MSHとを共に室温で15分間インキュベートし、これらはα−MSHの直前に細胞に添加した。cAMP標準物質(キットにより提供)の連続希釈液を同じマイクロプレートでアッセイした。cAMP検出溶液を各ウェルに添加し、次に細胞を、撹拌してホモジナイズし、2分間、1,000rpmので遠心沈降させ、次に23℃で20分間インキュベートした。キナーゼ‐Glo試薬の基質を各ウェルに添加し、23℃で10分間インキュベートした後、発光を、バイオルミネセンス機器(Safas Spectrometer、モナコ)で読み取った。各希釈液の3回の試験を、別々のウェルで実施し、別の日に2回反復し、総IgGを使用する場合のcAMP活性化の曲線の各点でn=6を得た。抗α−MSH IgG画分から総IgGを枯渇させた後、同じ実験を、それぞれのα−MSH濃度について行い、3つの別々のウェルでIgGを測定した。
統計分析
データを分析し、グラフを、GraphPad Prism 5.02(GraphPad ソフトウェア Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ)を使用してプロットした。正規性を、コルモゴロフ‐スミルノフ検定により評価した。群の差異を、正規性の結果に従って、テューキーまたはダンの事後検定を用いた分散分析(ANOVA)またはノンパラメトリックのクラスカル・ワリス(K‐W)検定により分析した。体重の変化を、二元配置繰り返し測定の(RM)ANOVAおよびボンフェローニの事後検定で分析した。個々の群を、正規性の結果に従って、スチューデントのt検定またはマン・ホイットニー(M‐W)検定を使用して比較した。ピアソンまたはスピアマンの相関係数を、変数の正規性に従い計算した。cAMPの産生を、非線形回帰適合(log(α‐MSH)対正規化cAMP応答)を使用して分析し、この等式はY=100/(1+10^(LogEC50‐X※HillSlope)であった。データは、平均値±平均値の標準偏差(s.e.m)として示されており、すべての検定でp<0.05は、統計的に有意であると考えられた。
データを分析し、グラフを、GraphPad Prism 5.02(GraphPad ソフトウェア Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ)を使用してプロットした。正規性を、コルモゴロフ‐スミルノフ検定により評価した。群の差異を、正規性の結果に従って、テューキーまたはダンの事後検定を用いた分散分析(ANOVA)またはノンパラメトリックのクラスカル・ワリス(K‐W)検定により分析した。体重の変化を、二元配置繰り返し測定の(RM)ANOVAおよびボンフェローニの事後検定で分析した。個々の群を、正規性の結果に従って、スチューデントのt検定またはマン・ホイットニー(M‐W)検定を使用して比較した。ピアソンまたはスピアマンの相関係数を、変数の正規性に従い計算した。cAMPの産生を、非線形回帰適合(log(α‐MSH)対正規化cAMP応答)を使用して分析し、この等式はY=100/(1+10^(LogEC50‐X※HillSlope)であった。データは、平均値±平均値の標準偏差(s.e.m)として示されており、すべての検定でp<0.05は、統計的に有意であると考えられた。
結果
大腸菌K12のα−MSHの模倣体のプロテオミクスによる同定
総タンパク質を、培養した大腸菌K12から抽出し、細胞質および膜の分画に分離した。2次元ゲル電気泳動(2−DGE)を、両タンパク質分画について行い、α―MSH分子模倣性の試験のために、細胞質分画を分析した(図1a)。2−DGEの後、大腸菌の細胞質タンパク質をPVDFメンブレンに移し、α―MSH様タンパク質を、抗α―MSHポリクローナルウサギIgGを使用して免疫検出した。当該ポリクローナル抗血清の使用により、大腸菌タンパク質に最終的に存在する複数のα―MSH様エピトープが検出された。本発明者らは、約13のタンパク質スポットが、抗α−MSH抗血清により認識されたことを見出した(図2b)。免疫検出の前に結合の特異性を確認するために、抗α―MSH抗血清を10−6Mのα―MSHペプチドと共にプレインキュベートしたところ、免疫陽性スポット1〜4および5〜8が完全に消失した(図1a〜c)。このことは、これらスポットのみがα―MSH様エピトープを含むタンパク質を含んでいたことを示している。α―MSH吸収実験に基づき、α―MSH様特異的スポット1〜8(図1a)を、ナノスプレー源およびHPLC−チップキューブインターフェース(Agilent Technologies)を備える6340イオントラップ質量分光計に結合したナノ‐LC1200システムによるタンパク質同定のために使用した。タンパク質同定のために、MS/MSピークリストを抽出し、MASCOT Daemon version 2.2.2(Matrix Science)検索エンジンを使用してNCBIタンパク質データベースと比較した。最も強力で特異的なα―MSH様染色を示すタンパク質のスポット1、2、3、および4(図1)は、アミノ酸857個のタンパク質脱凝集シャペロンまたはClpB,MW 95526Da(SEQID NO:1;NP_417083.1)に関して、それぞれ819、721、299、および786の最高のMASCOTスコアを示した。
大腸菌K12のα−MSHの模倣体のプロテオミクスによる同定
総タンパク質を、培養した大腸菌K12から抽出し、細胞質および膜の分画に分離した。2次元ゲル電気泳動(2−DGE)を、両タンパク質分画について行い、α―MSH分子模倣性の試験のために、細胞質分画を分析した(図1a)。2−DGEの後、大腸菌の細胞質タンパク質をPVDFメンブレンに移し、α―MSH様タンパク質を、抗α―MSHポリクローナルウサギIgGを使用して免疫検出した。当該ポリクローナル抗血清の使用により、大腸菌タンパク質に最終的に存在する複数のα―MSH様エピトープが検出された。本発明者らは、約13のタンパク質スポットが、抗α−MSH抗血清により認識されたことを見出した(図2b)。免疫検出の前に結合の特異性を確認するために、抗α―MSH抗血清を10−6Mのα―MSHペプチドと共にプレインキュベートしたところ、免疫陽性スポット1〜4および5〜8が完全に消失した(図1a〜c)。このことは、これらスポットのみがα―MSH様エピトープを含むタンパク質を含んでいたことを示している。α―MSH吸収実験に基づき、α―MSH様特異的スポット1〜8(図1a)を、ナノスプレー源およびHPLC−チップキューブインターフェース(Agilent Technologies)を備える6340イオントラップ質量分光計に結合したナノ‐LC1200システムによるタンパク質同定のために使用した。タンパク質同定のために、MS/MSピークリストを抽出し、MASCOT Daemon version 2.2.2(Matrix Science)検索エンジンを使用してNCBIタンパク質データベースと比較した。最も強力で特異的なα―MSH様染色を示すタンパク質のスポット1、2、3、および4(図1)は、アミノ酸857個のタンパク質脱凝集シャペロンまたはClpB,MW 95526Da(SEQID NO:1;NP_417083.1)に関して、それぞれ819、721、299、および786の最高のMASCOTスコアを示した。
得られた結果を確認するために、本発明者らは、タンパク質の代替的な戦略であるオフゲルを使用した。この目的のため、大腸菌の細胞質タンパク質を、OFFGEL fractionator(Agilent Technologies)によりその等電点(IP)に従って分離した後に、一次元ゲル電気泳動を行って、これを、α―MSHであらかじめ吸着させた同じ抗α―MSHポリクローナルウサギIgGを使用するウェスタンブロットにより明らかにした。1つのバンドは、α―MSH抗血清により特異的に認識され、上述のタンパク質の同定のために使用した。本発明者らは、このバンドにおいて、ClpBタンパク質は、タンパク質の中で最も高いMASCOTスコア(1065)を有することを見出し、よってこのタンパク質を、α―MSHとの分子模倣性のさらなる確認のために選択した。α−MSHとClpBの間のアミノ酸配列の相同性を分析するために、両方の配列を、Needleman−Wunschアルゴリズム(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)のEmboss NeedleおよびStretcherのプログラムを使用して整列させた。このアライメントにより、Needle(図1d)およびStretcher(図1e)を使用して示されるようにα―MSHと不連続な配列相同性を示すClpBタンパク質の2つの別個の部位が存在することが明らかとなった。
組み換えClpBタンパク質は、ClpB cDNA合成および発現ベクターへのクローニングにより細菌性培養物中でDelphi Genetics SA(Gosselies, Belgium)によりカスタム産生された。ClpBの予想される96kDaの分子量を、SDS−PAGEにより確認した。抗α―MSH抗血清で明らかとなったClpBのウェスタンブロットは、単一の96kDaのバンドを示し、これにより、ClpBタンパク質がα―MSH様エピトープを含むことを確認した(図1f)。ClpBタンパク質の立体構造が、抗α―MSH抗血清によるその検出にとって重要であるかどうかを試験するために、トリプシンによるClpBの消化後に、同様にウェスタンブロットを行った。この条件ではバンドは検出されず(図1f)、これは、ClpBとα―MSHの間の分子的模倣性がClpBタンパク質の立体構造を含むはずであることを示唆している。これらの結果は、分子的模倣性の概念(Oldstone, M. B. Faseb J 12, 1255−1265(1998))により提案された少なくとも5連続アミノ酸配列の相同性が、細菌タンパク質が神経ペプチドとの分子的模倣性を示すために必須の条件ではないことを示している。さらに、α―MSHとの当該連続アミノ酸相同性を示す大腸菌K12タンパク質は、このプロテオミクスアプローチによりα―MSH模倣体として同定されてはいない。このミスマッチは、抗α―MSH抗血清による検出から逃れたこれらタンパク質中に立体構造上隠されていたα―MSH様エピトープに関連する可能性がある。
ClpBによるマウスの免疫
α―MSHと交差反応性の自己抗体を誘導する大腸菌のClpBの能力をバリデートするために、本発明者らは、2か月齢のC57Bl6マウスを組み換えClpBタンパク質で免疫した。第1に、免疫の効率を確認するために、本発明者らは、抗ClpB IgGの血漿中レベルをアッセイし、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用してClpBと血漿抽出IgGとの間の親和性動態を測定した。ClpB免疫マウスにおいて、本発明者らは、高いレベルのClpB IgG(図2aおよび図5)が、他の群(図2bおよび図5)と比較して低い親和性を有することを見出し、このことは最近のIgGの誘導とも一致する。α―MSH反応性IgGの血漿中レベルの増加もまた、ClpB免疫マウス(図2cおよび図5)で見出され、これらIgGもまた、対照と比較してα-MSHに関して低い親和性を特徴とした(図2dおよび図5)。α―MSH IgM自己抗体の血漿中レベルは、群間で有意差はなく(図5)、マウスが天然に存在するClpB抗原に暴露されていることを示している。また本発明者らは、ClpB免疫が、α―MSH配列を含むアミノ酸39個のメラノコルチンペプチドである副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)に対する自己抗体を誘導し得るか否かをも分析した。血漿中ACTH反応性IgGには群のあいだで有意差異は群間で見出されず(図5)、ClpB分子の立体構造がα―MSH反応性IgGを刺激するために特異的であることをさらに裏付けた。
α―MSHと交差反応性の自己抗体を誘導する大腸菌のClpBの能力をバリデートするために、本発明者らは、2か月齢のC57Bl6マウスを組み換えClpBタンパク質で免疫した。第1に、免疫の効率を確認するために、本発明者らは、抗ClpB IgGの血漿中レベルをアッセイし、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用してClpBと血漿抽出IgGとの間の親和性動態を測定した。ClpB免疫マウスにおいて、本発明者らは、高いレベルのClpB IgG(図2aおよび図5)が、他の群(図2bおよび図5)と比較して低い親和性を有することを見出し、このことは最近のIgGの誘導とも一致する。α―MSH反応性IgGの血漿中レベルの増加もまた、ClpB免疫マウス(図2cおよび図5)で見出され、これらIgGもまた、対照と比較してα-MSHに関して低い親和性を特徴とした(図2dおよび図5)。α―MSH IgM自己抗体の血漿中レベルは、群間で有意差はなく(図5)、マウスが天然に存在するClpB抗原に暴露されていることを示している。また本発明者らは、ClpB免疫が、α―MSH配列を含むアミノ酸39個のメラノコルチンペプチドである副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)に対する自己抗体を誘導し得るか否かをも分析した。血漿中ACTH反応性IgGには群のあいだで有意差異は群間で見出されず(図5)、ClpB分子の立体構造がα―MSH反応性IgGを刺激するために特異的であることをさらに裏付けた。
ClpBおよびCFAまたはCFAを投与したマウスは、免疫に対して予測される炎症性の応答により、注射後数日間体重が低かった(図2e)。しかしながら、実験の最後には、ClpB免疫マウスは対照と比較して体重が高かった(5%の差)(図2e)。実験の最後の10日間にBioDAQで測定した平均1日食物摂取量もまた、他の群と比較してClpB免疫化マウスで高かった(13%の差)(図2f)。食事の回数は変化しなかったため、ClpB群の食物摂取量の増加は、単に食事量の増加によるものであり(図2g)、これは、ClpB免疫が、空腹制御システムよりも満腹に干渉することを示唆するものである。これは、満腹を誘導する既知のα―MSHの役割と一致する(Azzara, A. V. et al., Physiology & Behavior 77, 411−416, (2002))。食物摂取の調節におけるα―MSH反応性自己抗体のClpB誘導型の変化の関連性をさらにバリデートするために、22日目に、ClpB、CFAおよびPBSの群にα−MSHを1回注射(100μg/kg体重、i.P.)、対照群にPBSを与えた。続く24時間の食物摂取および体重は、対照と比較して差がなかったClpB免疫マウスと比較して非免疫マウスでは少ないことが見出され、これは、ClpB群がα―MSHの食欲不振誘発性作用に対して良好な保護を有することを示した。
給餌実験の直後に、マウスの自発運動活性および不安関連行動を、オープンフィールドおよびO迷路試験で試験した。総自発運動活性およびオープン領域対境界領域で費やした時間は、群間で有意差はなかった。しかしながら、O迷路のクローズドアームでは、ClpB免疫マウスは、対照と比較してより短い距離を移動し(図2h)、他のすべての群と比較して短い時間を費やし(図2i)。これは、O迷路のオープンアームのパラメータが有意に変化しなかったことから、ClpB群における不安関連行動のわずかな減少を示している。これらのデータは、抗α―MSH IgGレベルが増加したマウスにおけるα―MSH媒介不安の減少と一致する。
MC4Rのα―MSH誘導型の活性に及ぼすマウスIgGの作用
ClpB免疫によって誘導される誘導型抗α―MSH IgGとMC4Rシグナリングとの関連性をバリデートするために、本発明者らは、α―MSHによるMC4Rの活性化に及ぼすマウスIgGのin vitroでの効果を試験した。ClpB免疫マウスおよびアジュバント対照群のマウスからプールしたIgG(0.5mg/ml)を、MC4R(Amsbio, Oxon, UK)を過剰発現するHEK293細胞に添加した後、PBS中の10個の異なる濃度のα―MSHペプチドを添加した(1nM〜2μMと、PBSのみ)。15分間インキュベートした後、cAMPの濃度を、生物発光アッセイのcAMP−GloTM Maxアッセイキット(Promega, Madison, Wl)を使用して細胞上清で測定した。本発明者らは、cAMPの濃度が、α―MSHおよびアジュバント対照由来のIgGを含むα―MSHと比較して、ClpB免疫マウス由来のIgGと共にプレインキュベートした細胞で低く、α―MSHの2つの最高濃度で10%から8%の有意な減少を伴うことを見出した(図3a)。α―MSHのクロマトグラフィーを使用してα―MSH反応性IgGからプールしたIgGの枯渇後では、ClpB群の残りのIgGは、α−MSH誘導性のcAMPの放出を低減させる作用を全く示さず(図3b)、このことは、抗α―MSH IgGが、ClpB免疫マウスにおけるcAMPの阻害の原因であることを示している。よって、MC4Rの活性化の低減は、ClpB免疫マウスにおける食物摂取の増加および不安の減少の原因であり得る。しかしながら、ClpB誘導性の抗α―MSH IgGがまた、たとえばMC3RといったMC4Rメラノコルチン受容体以外に結合するα―MSHと干渉し得ることを除外することはできない(Begriche, K. et al., Journal of Biological Chemistry 201 1 , 286, 40771‐40781)。MC4R媒介型cAMPの産生に関するClpBの直接的な影響は、ATP依存cAMP産生と干渉するClpB ATPアーゼ活性(Woo, K. M. et al., Journal of Biological Chemistry 1992, 267, 20429−20434)のために評価することができなかった。
ClpB免疫によって誘導される誘導型抗α―MSH IgGとMC4Rシグナリングとの関連性をバリデートするために、本発明者らは、α―MSHによるMC4Rの活性化に及ぼすマウスIgGのin vitroでの効果を試験した。ClpB免疫マウスおよびアジュバント対照群のマウスからプールしたIgG(0.5mg/ml)を、MC4R(Amsbio, Oxon, UK)を過剰発現するHEK293細胞に添加した後、PBS中の10個の異なる濃度のα―MSHペプチドを添加した(1nM〜2μMと、PBSのみ)。15分間インキュベートした後、cAMPの濃度を、生物発光アッセイのcAMP−GloTM Maxアッセイキット(Promega, Madison, Wl)を使用して細胞上清で測定した。本発明者らは、cAMPの濃度が、α―MSHおよびアジュバント対照由来のIgGを含むα―MSHと比較して、ClpB免疫マウス由来のIgGと共にプレインキュベートした細胞で低く、α―MSHの2つの最高濃度で10%から8%の有意な減少を伴うことを見出した(図3a)。α―MSHのクロマトグラフィーを使用してα―MSH反応性IgGからプールしたIgGの枯渇後では、ClpB群の残りのIgGは、α−MSH誘導性のcAMPの放出を低減させる作用を全く示さず(図3b)、このことは、抗α―MSH IgGが、ClpB免疫マウスにおけるcAMPの阻害の原因であることを示している。よって、MC4Rの活性化の低減は、ClpB免疫マウスにおける食物摂取の増加および不安の減少の原因であり得る。しかしながら、ClpB誘導性の抗α―MSH IgGがまた、たとえばMC3RといったMC4Rメラノコルチン受容体以外に結合するα―MSHと干渉し得ることを除外することはできない(Begriche, K. et al., Journal of Biological Chemistry 201 1 , 286, 40771‐40781)。MC4R媒介型cAMPの産生に関するClpBの直接的な影響は、ATP依存cAMP産生と干渉するClpB ATPアーゼ活性(Woo, K. M. et al., Journal of Biological Chemistry 1992, 267, 20429−20434)のために評価することができなかった。
ラットへの大腸菌K12の強制経口投与
免疫しなければ、大腸菌により天然に発現されるClpBタンパク質が免疫系により感知されて、ClpB反応性およびα―MSH反応性Igを刺激することができるか否かを試験するために、大腸菌K12を、2か月齢の雄性Wistarラットに胃内への強制経口投与を3週間の間毎日投与した。強制経口投与の最初の日に、大腸菌を投与したラットの体重および食物摂取量の減少が起こったが、その後対照のレベルと類似のレベルまで徐々に戻った(図4a、b)。しかしながら大腸菌の群では再摂食期間は存在せず、これは失った体重を再度増やすために必要な食物摂取のリバウンドが観察されなかったためである。大腸菌の強制経口投与の有効性は、強制経口投与前に低かった大腸菌K12 cDNAが強制経口投与後に豊富にラットの糞便で検出されたことにより確認された(図4c)。強制経口投与後、抗ClpB IgGの血漿中レベルは、対照と比較して大腸菌を投与したラットで増加したが(図4d)、総IgGの濃度は変化せず、これは、大腸菌抗原に対する選択的な免疫応答を示している。血漿中抗α―MSH IgM(図4d)は大腸菌によって刺激されたが、抗α―MSH IgGは、抗ACTH IgGの増加が検出されたにもかかわらず、大腸菌により刺激されなかった。α―MSH IgGの親和性動態分析(図4f−h)は、大腸菌を投与したラットの解離速度の増加を明らかにした。これらのα―MSHの自己抗体の変化は、新規抗原に対する軽度の免疫応答を反映し得る。実際に、強制経口投与前のラットの糞便中の低いK12 cDNAレベルは、この細菌種が、試験したラットにおける主要な腸内共生体ではないことを示している。大腸菌を強制経口投与したラット対ClpB免疫マウスで見出された異なるα―MSH自己抗体応答は、また、投与経路およびα―MSH様抗原の用量の両方にも関連し得る。さらに、大腸菌K12は、いくつかのα―MSH様抗原を含むため、累積免疫応答もまた、これらそれぞれの新規性および抗原性に依存し得る。重要なことに、この動物モデルは、大腸菌などのClpBタンパク質発現細菌の腸内含有量の変化が、α―MSHと交差反応性である抗ClpB IgGおよび自己抗体を産生する宿主の免疫システムにより生理学的に検知されることを確認した。よって、抗ClpB自己抗体の検出は、抗α―MSH自己抗体の存在を説明するClpB発現細菌のバイオマーカーとして使用することができる。
免疫しなければ、大腸菌により天然に発現されるClpBタンパク質が免疫系により感知されて、ClpB反応性およびα―MSH反応性Igを刺激することができるか否かを試験するために、大腸菌K12を、2か月齢の雄性Wistarラットに胃内への強制経口投与を3週間の間毎日投与した。強制経口投与の最初の日に、大腸菌を投与したラットの体重および食物摂取量の減少が起こったが、その後対照のレベルと類似のレベルまで徐々に戻った(図4a、b)。しかしながら大腸菌の群では再摂食期間は存在せず、これは失った体重を再度増やすために必要な食物摂取のリバウンドが観察されなかったためである。大腸菌の強制経口投与の有効性は、強制経口投与前に低かった大腸菌K12 cDNAが強制経口投与後に豊富にラットの糞便で検出されたことにより確認された(図4c)。強制経口投与後、抗ClpB IgGの血漿中レベルは、対照と比較して大腸菌を投与したラットで増加したが(図4d)、総IgGの濃度は変化せず、これは、大腸菌抗原に対する選択的な免疫応答を示している。血漿中抗α―MSH IgM(図4d)は大腸菌によって刺激されたが、抗α―MSH IgGは、抗ACTH IgGの増加が検出されたにもかかわらず、大腸菌により刺激されなかった。α―MSH IgGの親和性動態分析(図4f−h)は、大腸菌を投与したラットの解離速度の増加を明らかにした。これらのα―MSHの自己抗体の変化は、新規抗原に対する軽度の免疫応答を反映し得る。実際に、強制経口投与前のラットの糞便中の低いK12 cDNAレベルは、この細菌種が、試験したラットにおける主要な腸内共生体ではないことを示している。大腸菌を強制経口投与したラット対ClpB免疫マウスで見出された異なるα―MSH自己抗体応答は、また、投与経路およびα―MSH様抗原の用量の両方にも関連し得る。さらに、大腸菌K12は、いくつかのα―MSH様抗原を含むため、累積免疫応答もまた、これらそれぞれの新規性および抗原性に依存し得る。重要なことに、この動物モデルは、大腸菌などのClpBタンパク質発現細菌の腸内含有量の変化が、α―MSHと交差反応性である抗ClpB IgGおよび自己抗体を産生する宿主の免疫システムにより生理学的に検知されることを確認した。よって、抗ClpB自己抗体の検出は、抗α―MSH自己抗体の存在を説明するClpB発現細菌のバイオマーカーとして使用することができる。
ヒトの抗ClpB抗体
対照において、ClpB IgGは、いくつかの生理学的な特徴の正常範囲と負に相関し、ANの患者において、ClpB IgGは、身体の不満足および痩せ願望などの中心となる精神病理学的特徴と正に相関した(表1)。ANおよびBEDの患者では、精神病理学的特徴は、ClpB IgM自己抗体と逆相関する(表1)。これらの相関は、ANの患者が、一部のClpB含有細菌に慢性的に暴露されているが、対してBED患者は、当該細菌に伴う感染症に最近罹患したことを意味し得る。
対照において、ClpB IgGは、いくつかの生理学的な特徴の正常範囲と負に相関し、ANの患者において、ClpB IgGは、身体の不満足および痩せ願望などの中心となる精神病理学的特徴と正に相関した(表1)。ANおよびBEDの患者では、精神病理学的特徴は、ClpB IgM自己抗体と逆相関する(表1)。これらの相関は、ANの患者が、一部のClpB含有細菌に慢性的に暴露されているが、対してBED患者は、当該細菌に伴う感染症に最近罹患したことを意味し得る。
考察
これらのデータは、ClpBとα―MSHとの間の分子的模倣性を介した、ClpB発現大腸菌K12細菌とClpBおよび宿主メラノコルチン系との間分子的関連を明らかにし、エネルギー代謝、動機づけの行動および感情の宿主制御における共生腸内細菌の関与を示した。分子的模倣性の概念は、ウイルスタンパク質により主にもたらされる自己免疫疾患の発症を説明するためにすでにバリデートされた(Oldstone, M. B. Faseb J 1998, 12, 1255−1265)。この研究は、共生腸内細菌と宿主のペプチド作動性シグナリングとの間の生理学的な相互作用にそれを関係させることによりこの概念を拡張する。しかしながら、同様に、この生理的機構の変化により、細菌におけるペプチドホルモン模倣タンパク質の不十分または過剰な存在、および対応するペプチドホルモン反応性自己抗体の産生の変化からもたらされる行動異常が起こる可能性がある。ペプチドホルモン受容体にそのような模倣タンパク質が直接結合すると、ペプチド作動性のシグナリングに影響を及ぼし得るが、宿主のペプチドホルモンと交差反応性の自己抗体の産生は、宿主の表現型に寄与する長期間の調節機構として現れる(Takagi, K. et al. Nat Commun in press,2013)。抗ClpB抗体と、健康なヒトおよびANおよびBEDの患者の行動の特徴との間の有意な相関は、ClpB発現細菌が、いくつかの正常なまたは変化した行動および感情の特徴の確立に関連し得ることを示唆しており、よって、新規の治療上の標的を表し得る。将来性のある抗菌剤としてClpB阻害剤が最近同定されたこと(Martin, I. et al. Screening and Evaluation of Small Organic Molecules as CIpB Inhibitors and Potential Antimicrobials. Journal of Medicinal Chemistry 2013, 56, 7177−7189)は、摂食および感情の宿主の制御に対するClpB含有細菌の関連性を明確にするために役立ち得る。
これらのデータは、ClpBとα―MSHとの間の分子的模倣性を介した、ClpB発現大腸菌K12細菌とClpBおよび宿主メラノコルチン系との間分子的関連を明らかにし、エネルギー代謝、動機づけの行動および感情の宿主制御における共生腸内細菌の関与を示した。分子的模倣性の概念は、ウイルスタンパク質により主にもたらされる自己免疫疾患の発症を説明するためにすでにバリデートされた(Oldstone, M. B. Faseb J 1998, 12, 1255−1265)。この研究は、共生腸内細菌と宿主のペプチド作動性シグナリングとの間の生理学的な相互作用にそれを関係させることによりこの概念を拡張する。しかしながら、同様に、この生理的機構の変化により、細菌におけるペプチドホルモン模倣タンパク質の不十分または過剰な存在、および対応するペプチドホルモン反応性自己抗体の産生の変化からもたらされる行動異常が起こる可能性がある。ペプチドホルモン受容体にそのような模倣タンパク質が直接結合すると、ペプチド作動性のシグナリングに影響を及ぼし得るが、宿主のペプチドホルモンと交差反応性の自己抗体の産生は、宿主の表現型に寄与する長期間の調節機構として現れる(Takagi, K. et al. Nat Commun in press,2013)。抗ClpB抗体と、健康なヒトおよびANおよびBEDの患者の行動の特徴との間の有意な相関は、ClpB発現細菌が、いくつかの正常なまたは変化した行動および感情の特徴の確立に関連し得ることを示唆しており、よって、新規の治療上の標的を表し得る。将来性のある抗菌剤としてClpB阻害剤が最近同定されたこと(Martin, I. et al. Screening and Evaluation of Small Organic Molecules as CIpB Inhibitors and Potential Antimicrobials. Journal of Medicinal Chemistry 2013, 56, 7177−7189)は、摂食および感情の宿主の制御に対するClpB含有細菌の関連性を明確にするために役立ち得る。
ここでは、本発明者らは、α―MSH模倣物として、1つの細菌性タンパク質である、大腸菌K12のClpBを同定して検証した。ClpBは、細菌におけるその機能的な役割に関して十分に特徴付けられており(DeSantis, M. E. and Shorter, J. Molecular Cell Research 2012, 1823, 29−39)、かつ熱ショックタンパク質として細菌のストレス応答に関与しているClpBと、ストレス関連ホルモンであり、同様に強力な鎮痛剤でもあるα―MHSとの間の分子的模倣性を発見したことは特異である(Motohashi, K. et al. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 7184−7189, Charmandari, E. et al., Sci. Signal 2012, 5; Murphy, M. T. et al., Science 1983, 221, 192−193)。そのような機能的類似性は偶発的である可能性があるが、細菌および宿主における熱ストレスに対する協調された応答の発生における系統的な関連性を示唆し得る。ClpBタンパク質は、いくつかの細菌種に存在しているため、これらはすべてα―MSH自己抗体を刺激することができるはずである。
Claims (10)
- ワクチンまたは免疫原性組成物として使用するための細菌ClpBタンパク質を含む組成物。
- 食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害に対する免疫のための、請求項1に記載の使用のための組成物。
- 食欲の低下および/または不安に関連する疾患または障害の治療および/または予防のための、請求項1または2に記載の使用のための組成物。
- 前記食欲の低下に関連する疾患または障害が、神経性食欲不振症(AN)、神経性過食症(BN)、カヘキシー、および消耗性疾患からなる群から選択される、請求項2または3に記載の使用のための組成物。
- 少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物であって、前記少なくとも1つの抗生剤が、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
肥満の治療または予防に使用するための
組成物。 - 肥満が、むちゃ食い障害または多食症の結果である、請求項5に記載の使用のための組成物。
- 対象の肥満および/または過体重を治療または発症の可能性を低下させる方法であって、前記方法が、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記少なくとも1つの抗生剤が、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、およ/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
方法。 - 過体重の対象の食欲を低下させる非治療的方法であって、少なくとも1つのClpB発現細菌に対する少なくとも1つの抗生剤を含む組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記少なくとも1つの抗生剤が、
i)ClpBのATPアーゼ活性を調節し、および/または
ii)ClpBの遊離および/または基質結合型を阻害し、および/または
iii)ClpBの活性化を阻害する、
請求項8に記載の非治療的方法。 - 対象の食欲を増進させる非治療的方法であって、抗ClpB抗体を含む組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
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