JP2017501130A

JP2017501130A - 改変された高親和性ヒトｔ細胞受容体

Info

Publication number: JP2017501130A
Application number: JP2016533163A
Authority: JP
Inventors: シーナエヌ．スミス，; ダニエルティー．ハリス，; デイビッドエム．クランツ，; トーマスエム．シュミット，; フィリップディー．グリーンバーグ，
Original assignee: University of Illinois System
Current assignee: University of Illinois System
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2017-01-12
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: ZA201603116B; US20160280756A1; US20160280755A1; EP3071593A1; NZ719720A; KR102415259B1; MX383471B; AU2021202274A1; CN105899530B; JP6476182B2; NZ719707A; AU2014352834A1; PT3071593T; MX2016006625A; MX371202B; WO2015077615A1; JP6697386B2; AU2014352826A1; WO2015077607A1; RU2016124179A

Abstract

ＷＴ１抗原に対する特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供される。本ＴＣＲは、１本鎖フォーマットにおけるＴＣＲの突然変異ライブラリの発生、続いて酵母の表面における改善された安定性及び親和性に関する選択（即ち、指向性進化）を通じて改変された、より高い親和性のＴＣＲを含む。実施形態では、本ＴＣＲは、インビボでの標的とされた送達のための可溶性形態で、または養子Ｔ細胞設定においてＴ細胞内へ導入される遺伝子として使用され得る。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の規定の下、２０１３年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９０７，８８７号の利益を主張するものであり、この仮出願はその全体が参照により本明細書に援用される。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本開示は、国立衛生研究所により授与された認可番号第Ｒ０１ＧＭ５５７６７号及び第Ｔ３２ＧＭ０７０４２１号の下に米国政府支援によりなされた。米国政府は、本開示において特定の権利を有する。
配列リストに関する記載

本出願に関連付けられる配列リストは、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これによって参照により本明細書に援用される。配列リストが含まれるテキストファイルの名称は、ＩＭＭＵ＿００３＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは、１８ＫＢであり、２０１４年１１月２１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

本開示は、インビトロ技術によって改変された高親和性ＴＣＲを含む、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびに修飾されたＴＣＲ及び１本鎖ＴＣＲを生成する方法、ならびに治療的、診断的、及び撮像的方法のためのＴＣＲの対応する使用に関する。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗体は、異なる種類の抗原（リガンド）を認識するように進化した分子である（（Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．））。ＴＣＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または任意の有核細胞（例えば、赤血球を除くすべてのヒト体内細胞）の表面上に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の生成物の文脈において提示される抗原ペプチドの認識に関与する抗原特異性分子である。対照的に、抗体は典型的には、可溶性または細胞表面抗原を認識し、ＭＨＣによる抗原の提示を必要としない。このシステムは、Ｔ細胞に、短ペプチドへと細胞内で処理され、細胞内ＭＨＣ分子に結合され、ペプチド−ＭＨＣ複合体（ｐｅｐＭＨＣ）として表面に送達される、細胞（ウイルスタンパク質を含む）によって発現された細胞内抗原の全体的な配置をそれらのＴＣＲを介して認識する潜在的な能力を付与する。このシステムは、事実上、任意の外来タンパク質（例えば、変異した癌抗原またはウイルスタンパク質）または異常に発現されたタンパク質が、Ｔ細胞の標的として機能することを可能にする（（ＤａｖｉｓａｎｄＢｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，３９５−４０２；Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．（１９９８）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１６，５２３−５４４；Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．）に概観される）。

ＴＣＲとｐｅｐＭＨＣとの相互作用は、結合の親和性（または解離速度）に応じて、Ｔ細胞を種々の活性化の状態にさせ得る。ＴＣＲ認識プロセスは、Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性を刺激するための閾値を上回るＭＨＣ分子に結合した外来ペプチドに関する結合親和性を有する１つ以上のＴＣＲが存在するであろう可能性が高いＴＣＲの多様なレパートリーを提供することによって、正常な健康な細胞と、例えば、ウイルスまたは悪性腫瘍を介して形質転換されている細胞とを区別することを可能にする（ＭａｎｎｉｎｇａｎｄＫｒａｎｚ（１９９９）ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，２０，４１７−４２２）。

現在、インビトロで培養することによって特定されたヒトまたはマウスのいずれかのＴ細胞クローンから単離された野生型ＴＣＲは、比較的低い結合親和性（Ｋ_ｄ＝１〜３００μＭ）を有することが示されている（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．（１９９８）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１６，５２３−５４４）。これについての説明の一部は、胸腺内で発達するＴ細胞は自己ｐｅｐＭＨＣリガンド上で負に選択され（耐性誘導）、その結果、高過ぎる親和性を有するＴ細胞が欠失される（Ｓｔａｒｒｅｔａｌ．（２００３）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２１，１３９−７６）ということであるようである。これらの比較的低い親和性を補うために、Ｔ細胞は、細胞表面分子ＣＤ４及びＣＤ８がＭＨＣ分子（それぞれ、クラスＩＩ及びクラスＩ）に結合し、シグナル伝達活性の媒介においてＴＣＲに相乗作用をもたらす、補助受容体システムを進化させた。ＣＤ８は、このプロセスに特に有効であり、極めて低い親和性（例えば、Ｋ_ｄ＝３００μＭ）を有するＴＣＲが潜在的な抗原特異性活性を媒介することを可能にする。

インビトロで、指向性進化は、特異性ｐｅｐＭＨＣに関するより高い親和性を有するＴＣＲを発生させるために使用されている。使用されてきた３つの異なるディスプレイ方法は、酵母ディスプレイ（Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．（２００３）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ，４，５５−６２；Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，５３８７−９２）、ファージディスプレイ（Ｌｉｅｔａｌ．（２００５）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，３４９−５４）、及びＴ細胞ディスプレイ（Ｃｈｅｒｖｉｎｅｔａｌ．（２００８）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４）である。３つのすべてのアプローチにおいて、プロセスは、ＴＣＲの突然変異体の親和性が同族ｐｅｐＭＨＣ（そのＴ細胞が特異的であった元の抗原）に対して増加された親和性を有するように、野生型ＴＣＲの正常な低親和性を示すＴＣＲを改変または修飾することに関与する。したがって、野生型ＴＣＲが、ＣＤＲのうちの１つ以上における突然変異ライブラリを生成するためのテンプレートとして使用され、より高い親和性を有する突然変異体が、同族ペプチド−ＭＨＣ抗原への結合によって選択された。

本開示では、野生型Ｔ細胞受容体、及び酵母ディスプレイによって改変されたウィルムス腫瘍−１（ＷＴ１）に対して特異的な高親和性Ｔ細胞受容体が開示される。ＷＴ１は、腫瘍抑制剤及び癌遺伝子の両方として機能するように説明されている転写因子である。ＷＴ１は、白血病及び多様な固形腫瘍において高レベルで発現される（Ｓｕｇｉｙａｍａｅｔａｌ．（２０１０）ＪａｐａｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ４０（５）３７７−３８７）。これは、野生型Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞を使用したワクチン開発、及び種々の養子Ｔ細胞アプローチの標的である。
ＷＴ１は、国立癌研究所による上位７５個の癌抗原の先順位付けリストの第１位となっている（Ｃｈｅｅｖｅｒｅｔａｌ．（２００９）ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１５，５３２３−５３３７）。したがって、例えば、この癌抗原を特異的に標的とする治療剤などの薬剤を特定する必要が存在する。本発明は、例えば、インビボでの標的とされた送達のための可溶性形態で、または養子Ｔ細胞設定においてＴ細胞内へ導入される遺伝子として使用され得る、インビトロで改変された、より高い親和性のＴＣＲを提供する。

Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．

本発明は、ＷＴ１抗原に対する野生型Ｔ細胞受容体、及び改善された親和性でＷＴ１抗原に結合するインビトロで改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。より具体的には、本開示は、野生型Ｔ細胞受容体の配列、ならびに酵母、ファージ、または哺乳動物細胞の表面上のライブラリのディスプレイを通じて選択されるそれらの安定化及び親和性突然変異と、改善された親和性で抗原に結合するためのこれらのライブラリから選択されるＴＣＲタンパク質と、治療的、診断的、または撮像的用途のためのインビトロで選択されるＴＣＲ誘導体の使用と、に関する。

本発明の一態様は、Ｔ細胞クローンに由来するＶα及びＶβを含むＴ細胞受容体、またはその抗原結合断片であって、ペプチドＷＴ１及びＨＬＡ−Ａ２分子の複合体に結合し、配列番号１に記載されるＶβアミノ酸配列及び配列番号２に記載されるＶαアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞受容体に関する。一実施形態では、Ｔ細胞受容体を発現する宿主細胞。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞である。

本発明の一態様は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶα及びＶβを含む修飾されたＴ細胞受容体、またはその抗原結合断片であって、該Ｖα、Ｖβ、またはその両方は、野生型Ｔ細胞受容体に関して１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に突然変異を含み、該修飾されたＴ細胞受容体は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２として知られるペプチド／ＭＨＣ抗原（ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号６）、ＨＬＡ−Ａ２として知られるＭＨＣ生成物に結合される）に結合する、修飾されたＴ細胞受容体に関する。

一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号１に記載されるＶβアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶβを含み、該Ｔ細胞受容体は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合することによって活性を媒介する。

別の実施形態では、修飾されたＴ細胞受容体は、配列番号３に記載されるＶβアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾されたＶβを含み、該修飾されたＴ細胞受容体は、１０^６Ｍ高い親和性（Ｋ_Ａ値）でＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合する。

別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号２に記載されるＶαアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶαを含み、該Ｔ細胞受容体は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合することによって活性を媒介する。

別の実施形態では、修飾されたＴ細胞受容体は、配列番号４に記載されるＶαアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾されたＶαを含み、該修飾されたＴ細胞受容体は、１０^６Ｍ高い親和性（Ｋ_Ａ値）でＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合する。

一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む１本鎖Ｔ細胞受容体である。

一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列のＳ９５Ｔ、Ｓ９７Ｎ、Ｉ１０３Ｙ、Ｎ１０４Ｌから選択されるＣＤＲ３β内の突然変異のうちの少なくとも１つを含有する。

別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列のＶ２９Ｄ、Ｓ３０Ｌ、及びＱ３１Ｇから選択されるＣＤＲ１α内の突然変異のうちの少なくとも１つを含有する。

一実施形態では、修飾されたＴ細胞受容体は、突然変異Ｔ細胞受容体の酵母ディスプレイライブラリのインビトロ選択によって発生される。

別の実施形態では、修飾されたＴ細胞受容体は、その標的抗原に結合する可溶性タンパク質として発現される。

別の実施形態では、野生型または修飾されたＴ細胞受容体は、養子Ｔ細胞療法のためにＴ細胞内で発現される。

本発明の一態様は、ＷＴ１抗原を発現する癌細胞を標的とする治療剤であって、本明細書に説明される修飾されたＴ細胞受容体を含む、治療剤を提供する。一実施形態では、ＷＴ１抗原を発現する癌細胞を標的とする治療剤であって、本明細書に説明される修飾されたＴ細胞受容体を発現するヒトＴ細胞を含む、治療剤。一実施形態は、本明細書に説明される治療剤を投与することを含む、ＷＴ１抗原を発現する癌を有する対象を治療する方法を提供する。

本研究からの種々のＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２特異性Ｔ細胞受容体の整列されたアミノ酸配列を示す。ＷＴ１Ｐ２２は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２によって刺激されたヒトＴ細胞クローンから単離された野生型配列を表す。他のＴＣＲ配列は、より大きい表面レベル及びより高い親和性に関する酵母ディスプレイ法によって単離された。長方形でハイライトされたＣＤＲ３β及びＣＤＲ１α内のアミノ酸残基は、酵母ディスプレイによってより高い親和性に関して単離されたＴＣＲ内の突然変異である。Ｖβ鎖に関して示される配列は、上から下へ配列番号１、２１、２１、３、及び３に対応する。描写されるリンカー配列は、配列番号８である。Ｖα鎖に関して示される配列は、上から下へ配列番号２、２２、４、２、及び４に対応する。図２ＡはＴＣＲ：ｐｅｐＭＨＣ複合体（Ａ６；ＰＤＢ：１ＡＯ７）の側面図を示す３次元図である。α鎖及びβ鎖の可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域が示される。示される構造は、ＴＣＲのＣα領域を含まない。ＨＬＡ−Ａ２（α１、α２、α３、及びβ２ｍ）は灰色で示され、Ｔａｘペプチド（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ、配列番号７）は黒色で示される。本発明で実験するＡ６ＴＣＲ及びＷＴ１ＴＣＲはすべて、Ｖα２セグメント（ＩＭＧＴ命名法に基づいてＴＲＡＶ１２とも称される）を使用する。図２Ｂはペプチド−ＭＨＣ（Ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２）上のＴＣＲ（ＣＤＲ）フットプリントの上視図を示す３次元図である。本開示で使用されるＷＴ１ＴＣＲに関して結晶構造は説明されてはいないが、α２ＭＨＣらせん及びペプチドのＮ末端上に位置付けられたＶα領域と、α１ＭＨＣらせん及びペプチドのＣ末端上に位置付けられたＶβ領域とを有するこの斜結合配向は、現在すべての複合体内に観察されている。ペプチド：ＨＬＡ．Ａ２に対する改善された親和性のために１本鎖ＴＣＲを改変するための方法を示す図である。高親和性ＴＣＲを改変するために使用される一般的なプロセスが示される。１本鎖Ｔ細胞受容体断片（Ｖα−リンカーＶβまたはＶβ−リンカー−Ｖα）を改変するための酵母ディスプレイシステムの概略図である。Ｖβ３上の立体構造エピトープを認識する２つの抗体によるソート後のＷＴ１１本鎖ＴＣＲ変異性ライブラリのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＷＴ１変異性ライブラリは、ＴｈｅｒｍａｈＶｂ３．１ＦＩＴＣＩｇＧ及びＢＣｈＶｂ３．２ＦＩＴＣＩｇＭ抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ及びヤギ抗マウスＩｇＭＡＰＣの両方の１：１０の希釈物を用いて、合計３回のソートで連続的にソートされた。次に、各ソート後に酵母細胞のアリコートは、ＴｈｅｒｍａｈＶｂ３．１ＦＩＴＣＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧの１：１０希釈物と共に定温放置された。灰色は、二次抗体のみで染色された酵母細胞を示す（図５Ａ）。３回目のソート後に単離された安定したクローンＷＴ１Ｄ１３は、ＴｈｅｒｍａｈＶｂ３．１ＦＩＴＣＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧの１：１０希釈物で染色される（図５Ｂ）。ＷＴ１：ＨＬＡ．Ａ２によるソート後のＷＴ１１本鎖ＴＣＲＤ１３ＣＤＲ１αライブラリのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＷＴ１Ｄ１３ＣＤＲ１αライブラリは、１００〜２００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体を用いて合計５回のソートで連続的にソートされた。次に、各ソート後の酵母細胞のアリコートを、１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）と共に、続いてＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体と共に定温放置した。灰色は、二次抗体のみで染色された酵母細胞を示す（図６Ａ）。５回目のソート後に単離されたクローンＷＴ１Ｄ１３．１は、１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）で、続いてＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体で染色される（図６Ｂ）。ＷＴ１：ＨＬＡ．Ａ２によるソート後のＣＤＲ３ライブラリと組み合わされたＷＴ１１本鎖ＴＣＲＤ１３．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＣＤＲ３ライブラリと組み合わされたＷＴ１Ｄ１３．１は、１０〜１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体を用いて合計３回のソートで連続的にソートされた。次に、各ソート後の酵母細胞のアリコートを、１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）と共に、続いてＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体と共に定温放置した。灰色は、二次抗体のみで染色された酵母細胞を示す（図７Ａ）。３回目のソート後に単離された改善された結合クローンＷＴ１Ｄ１３．１．１は、１００ｎＭのＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー（ＤｉｍｅｒＸ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、続いてＡＰＣ−結合ヤギ抗マウス二次抗体で染色される（図７Ｂ）。ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー及びモノマーに関する高親和性ＴＣＲ、ＷＴ１Ｄ１３．１．１の結合特性を示す。図８Ａは、種々の濃度のＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２Ｉｇダイマー、続いて二次として蛍光標識抗Ｉｇ抗体で染色された高親和性ｓｃＴＣＲＷＴ１Ｄ１３．１．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図８Ｂは、種々の濃度のビオチン化ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２モノマー、続いて二次的にＳＡ−ＰＥ（１：１００）で染色された高親和性ｓｃＴＣＲＷＴ１Ｄ１３．１．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図８Ｃは、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー濃度に対してプロットされた、図７Ａのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す折れ線グラフである。図８Ｄは、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２モノマー濃度に対してプロットされた、図８Ｂのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す折れ線グラフである。ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー及びモノマーに関する高親和性ＴＣＲ、ＷＴ１Ｄ１３．１．１の結合特性を示す。図８Ａは、種々の濃度のＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２Ｉｇダイマー、続いて二次として蛍光標識抗Ｉｇ抗体で染色された高親和性ｓｃＴＣＲＷＴ１Ｄ１３．１．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図８Ｂは、種々の濃度のビオチン化ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２モノマー、続いて二次的にＳＡ−ＰＥ（１：１００）で染色された高親和性ｓｃＴＣＲＷＴ１Ｄ１３．１．１のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図８Ｃは、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２ダイマー濃度に対してプロットされた、図７Ａのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す折れ線グラフである。図８Ｄは、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２モノマー濃度に対してプロットされた、図８Ｂのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す折れ線グラフである。大腸菌内で発現された可溶性高親和性ＴＣＲＷＴ１Ｄ１３．１．１の結合を示す。図９Ａ〜Ｄは、初めに、ペプチドを伴わずに（図９Ａ）、陰性対照ペプチドＴａｘと共に（図９Ｂ）、陰性対照ペプチドＭＡＲＴ−１と共に（図９Ｃ）、またはペプチドＷＴ１と共に（図９Ｄ）定温放置され、続いてビオチン標識ＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲと共に定温放置された、ヒトＴ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）細胞のフローサイトメトリー分析を示す一連のヒストグラムである。図９Ｅは、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲは、（この範囲内の親和性の過小評価におけるフローサイトメトリーの細胞洗浄として）少なくとも２６０ｎＭの最小親和性（Ｋ_Ｄ値）を有したことを示す滴定を描写するグラフである。マウスＴ細胞における野生型Ｐ２２、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１ＴＣＲの活性を示す。単離されたマウスＣＤ８（図１０Ａ）及びＣＤ４（図１０Ｂ）Ｔ細胞は、Ｐ２２、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１ＴＣＲを形質導入された（修飾されたＴＣＲは、Ｖβ領域内のＤ１３「安定化」突然変異：Ｆ４８Ｓ及びＤ５１Ｇを含有しなかった）。形質導入されたＴ細胞は、次にＨＬＡ−Ａ２＋ＡＰＣ及び種々の濃度のＷＴ１ペプチドと共に定温放置された。２４時間の定温放置後、標準ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ濃度が測定された。ＣＤ８Ｔ細胞内の高親和性ＴＣＲＷＴ１Ｄ１３．１．１は、ＷＴ１構造的類似ヒトペプチドのパネルに対して活性を示さなかったことを示す。ＷＴ１構造的類似ペプチドは、ＷＴ１ペプチド（配列番号６）の９個の残基の各々において保存的突然変異を有するペプチドに関するヒトプロテオームの探索を通じて決定された。次に、最も高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合すると予測された１０個のペプチドが合成された。ペプチド番号１〜１０は、それぞれ配列番号２５〜３４に対応する。マウスＣＤ８Ｔ細胞は単離され、Ｄ１３．１．１ＴＣＲを形質導入され（Ｖβ領域内のＤ１３安定化突然変異、Ｆ４８Ｓ及びＤ５１Ｇを含有しなかった）、それぞれのペプチド及びＨＬＡ−Ａ２＋ＡＰＣと共に２４時間定温放置された。ＷＴ１−特異性ＴＣＲの例示的な治療的用途を例証する図である。図１２Ａは、可溶性治療用生成物としての使用のためのＴＣＲフォーマットの５つの例を描写する：１）Ｖα−Ｖβ配向またはＶβ−Ｖα配向のいずれかにおける１本鎖ＴＣＲ（変異した高親和性Ｖドメインは、アスタリスクで示される）、２）抗体の定常領域ドメインにフレーム内で融合された１本鎖ＴＣＲ、３）軽鎖または重鎖のいずれかの定常領域へのフレーム内免疫グロブリン融合体、４）薬物に直接結合された１本鎖ＴＣＲ（または２及び３に示される免疫グロブリン融合体）、及び５）二重特異性薬剤を発生させるように１本鎖Ｆｖ（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）にフレーム内で連結された１本鎖ＴＣＲ。図１２Ｂは、酵母ディスプレイによって単離された高親和性可変ドメイン（Ｖ）を使用する細胞に基づいた療法の２つの例を描写する（または、野生型ＴＣＲＶドメインもヒトＴ細胞を用いた養子Ｔ細胞療法のために使用されてもよい）。ＴＣＲは、１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）内の１本鎖受容体、ならびに２）全長α及びβ ＴＣＲとして、養子Ｔ細胞療法においてＴ細胞による発現のために哺乳動物細胞ベクター中にクローン化される。

配列表の簡単な説明
配列番号１は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合するＴＣＲ（Ｐ２２）の野生型Ｖβ領域のアミノ酸配列である。

配列番号２は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合するＴＣＲ（Ｐ２２）の野生型Ｖα領域のアミノ酸配列である。

配列番号３は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合するＴＣＲ（Ｄ１３．１．１）の修飾されたＶβ領域のアミノ酸配列である。

配列番号４は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合するＴＣＲ（Ｄ１３．１．１）の修飾されたＶα領域のアミノ酸配列である。

配列番号５は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合する１本鎖ＴＣＲ（ＷＴ１−Ｄ１３．１．１）のアミノ酸配列である。

配列番号６は、ＷＴ−１抗原のアミノ酸配列である。

配列番号７は、Ｔａｘ抗原のアミノ酸配列である。

配列番号８は、リンカーのアミノ酸配列である。

配列番号９は、プライマーＳｐｌｉｃｅ４Ｌのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号１０は、ＷＴ１−Ｄ１３ＣＤＲ１αライブラリＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号１１は、ＷＴ１−Ｄ１３ＣＤＲ１αライブラリＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号１２は、プライマーＴ７のポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号１３は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３ β１ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号１４は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３ β１ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号１５は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３ β２ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列である。

配列番号１６は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３ β２ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号１７は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３α１ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列である。

配列番号１８は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３α１ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号１９は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３α２ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃１を発生させるために使用される逆方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号２０は、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３α２ライブラリのＰｒｅＳＯＥ＃２を発生させるために使用される順方向プライマーのポリヌクレオチド配列であるである。

配列番号２１は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合するＴＣＲ（Ｄ１３）の修飾されたＶβ領域のアミノ酸配列である。

配列番号２２は、ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高い親和性で結合するＴＣＲ（Ｄ１３）の修飾されたＶα領域のアミノ酸配列である。

配列番号２３は、インフルエンザＡペプチドのアミノ酸配列である。

配列番号２４は、変異型インフルエンザＡペプチドのアミノ酸配列である。

配列番号２５〜３４は、１０個のＷＴ１変異型ペプチドのアミノ酸配列である。

以下の説明は、本開示の理解を促進するように意図されるが、限定的であるようには意図されない。

概して、本明細書で使用される用語及び語句は、それらの当該分野において認識される意味を有し、それらは当業者に既知である標準的な文章、参考論文、及び文脈を参照することによって見出すことができる。以下の定義は、本開示の文脈におけるそれらの特定の使用を明確にするために提供される。

本明細書で使用するとき、「連結された」は、２つの基の間の会合を指し、それは共有または非共有結合性会合であり得る。基は、可変長さペプチド構造的鎖、非アミノ酸化学基、または当該技術分野において既知である他の手段を使用して連結されてもよい。リンカー領域は、タンパク質またはペプチドの２つの機能的または構造的ドメインを作動可能に連結するアミノ酸配列であり得る。

本明細書で使用するとき、用語「化学療法剤」は、癌細胞、癌細胞集団、腫瘍、または他の悪性組織の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、または広がりを低減または予防することができる任意の物質を指す。この用語はまた、任意の抗腫瘍または抗癌剤を包含するようにも意図される。

本明細書で使用するとき、用語「有効量」は、薬学的有効量または治療的有効量などの文脈を包含するように意図される。例えば、特定の実施形態では、有効量は、有益な状態、有益な結果、スクリーニング分析における機能的活性、または臨床症状の改善を達成することができる。

本明細書で使用するとき、用語「癌細胞」は、当該技術分野において広範に理解される定義を包含するように意図される。一実施形態では、この用語は、ヒトまたは動物における癌の臨床症状の一因となり得る異常に調節された細胞を指す。一実施形態では、この用語は、ヒトまたは動物の身体内の、またはそれらに由来する培養された細胞株または細胞を指し得る。癌細胞は、当該技術分野において理解される通り、多様な分化した細胞、組織、または臓器種類のものであり得る。癌細胞の具体的な例としては、乳癌、結腸癌、皮膚癌、卵巣癌、白血病、肺癌、肝臓癌、精巣癌、食道癌、及び他の種類の癌が挙げられる。

本明細書で使用するとき、「治療する」または「治療」は、好ましくは臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療は、疾患もしくは状態の症状の改善か、または疾患もしくは状態の進行の遅延を指し得る。

本明細書で使用するとき、「予防」または「予防する」は、疾患または状態の発症または再発の可能性を予防、阻害、または低減するためのアプローチを指す。これはまた、疾患または状態の症状の、発生、または再発の可能性の予防、阻害、または低減も指し、また疾患または状態の発症または再発前の疾患または状態の強度、影響、症状、及び／または負担を低減することも含む。

本明細書で使用するとき、「細胞増殖（ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ）を阻害する」または「細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓ）を阻害する」は、細胞の増殖率の低減または停止を指す。例えば、腫瘍細胞の増殖を阻害することによって、腫瘍の大きさの増加速度は低下され得る。他の実施形態では、腫瘍は、同じ大きさに留まるか、または大きさが減少、即ち、退行し得る。具体的な実施形態では、細胞増殖（ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ）または細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓ）の速度は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％阻害される。

用語「野生型」及び「ｗｔ」は、本明細書において互換的に使用され、抗原に対する特異性を有する、自然に発生する、または修飾されていないＴＣＲ、例えば、起源または親Ｔ細胞クローンから単離された可変領域をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチドを有するＴＣＲに関して使用される。

アミノ酸配列を提示する図及び表内では、野生型は、「ｗｔ」と指定される場合もある。下記に提示される配列内の一番上の配列では、ダッシュ記号は、アミノ酸が整列のｗｔまたは一番上の配列に存在するものと同一であることを示す。文字は、一番上の配列からその位置に置換がなされていることを示す。

本明細書で使用するとき、用語「修飾された」、「変異型」、「突然変異体」、「変異した」、及び「由来する」Ｔ細胞受容体は、起源または野生型Ｔ細胞クローンと比較して１つ以上の突然変異を有する可変領域のＴＣＲ配列を指す。修飾されたＴＣＲの例としては、より高い親和性のＴＣＲが挙げられる。

コード配列は、タンパク質のアミノ酸配列、またはｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードする遺伝子またはｃＤＮＡの一部である。

相補または相補的配列は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対規則に従ってクレオチドの別の配列と水素結合２本鎖を形成するヌクレオチドの配列を意味する。

下流は、ＤＮＡまたはＲＮＡ内の相対位置を指し、鎖の３’末端に向かう領域である。

発現は、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写、及びタンパク質へのｍＲＮＡのその後の翻訳を指す。

２つの核酸配列は、配列が別々の有機体に由来する場合、かかる有機体が異なる種であるか否かにかかわらず、配列が同一の有機体において同一の配置に一緒に自然に発生しない限り互いに異種である。

相同性は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性の範囲を指す。

具体的に例示されるＴＣＲ配列に機能的に等価であるアミノ酸配列は、単一または複数のアミノ酸置換によって、アミノ酸の付加及び／もしくは欠失によって修飾されているか、または１つ以上のアミノ酸が化学的に修飾されているが、それにもかかわらず本開示の細胞結合もしくは可溶性ＴＣＲタンパク質の結合特異性及び高親和性結合活性を保持するアミノ酸配列である。機能に等価であるヌクレオチド配列は、具体的に例示される細胞結合または可溶性ＴＣＲタンパク質と実質的に同一の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本開示の文脈において、可溶性ＴＣＲタンパク質は、天然細胞結合ＴＣＲの部分を欠損し、溶液中で安定している（即ち、概して、タンパク質溶液の標準的な条件下で本明細書に説明されるように取り扱われるときに溶液中で凝集しない）。

用語「単離された」は、人工的に自然の状態から変更された組成物、化合物、物質、または分子を指す。例えば、自然に発生する組成物または物質は、その元の環境から変化もしくは除去されているか、またはその両方である場合、単離されている。例えば、生体動物中に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、本明細書でこの用語が用いられる通り、その自然の状態の共存材料から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。

核酸構築物は、自然に発生する遺伝子から単離されるか、またはさもなくば自然には存在しないであろう様式で組み合わせられるかもしくは並置される核酸のセグメントを含有するように修飾されている核酸分子である。

核酸分子は、３’−５’−リン酸ジエステル結合によって連結されるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかを含有する１本または２本鎖の線状ポリヌクレオチドを意味する。

２つのＤＮＡ配列は、結合の性質が互いに対して正常な機能に影響を及ぼす配列の能力に干渉しない場合、作動可能に連結される。例えば、プロモーター領域は、プロモーターがコード配列の転写を達成することができる場合、コード配列に作動可能に連結されるであろう。

ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の線状ポリマーである。

用語「プロモーター」は、概して８０〜１２０塩基対長であり、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、正しい転写を開始し得る遺伝子の開始部位の上流に位置する、シス作用ＤＮＡ配列を指す。転写のオン／オフ調節を提供する、及び／または下流コード配列の発現を強化する（増加させる）関連する追加的な転写調節配列が存在し得る。

組み換え核酸分子、例えば、組み換えＤＮＡ分子は、２つ以上の非同種ＤＮＡ分子のライゲーションを通じてインビトロで形成される新規の核酸配列（例えば、少なくとも１つのクローン化部位内にクローン化された外来ＤＮＡの１つ以上の挿入を含有する組み換えプラスミド）である。

用語「形質転換」及び「遺伝子導入」は、異なる遺伝子型の別の細胞に由来する精製された組み換えＤＮＡの外的適用による、その摂取及び対象細胞のゲノム中への統合をもたらす細胞のゲノムの指向修飾を指す。細菌においては、組み換えＤＮＡは、典型的には細菌染色体中に統合されないが、その代わりにプラスミドとして自律的に複製される。用語「形質転換された」及び「遺伝子導入された」は、本明細書において互換的に使用される。例えば、Ｔ細胞は、養子Ｔ細胞処理の前に本明細書に説明される修飾されたまたは高親和性のＴＣＲをコードするＤＮＡ配列を遺伝子導入され得る。

上流は、ＤＮＡまたはＲＮＡ内の任意の部位の５’側を意味する。

ベクターは、宿主細胞中で自律的に複製することができ、外来ＤＮＡを受け入れることができる核酸分子である。ベクターは、それ自身の複製の起源と、外来ＤＮＡの挿入のために使用され得る制限エンドヌクレアーゼのための１つ以上の固有の認識部位と、通常、例えば、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、及び多くの場合は挿入されたＤＮＡの発現のための認識配列（例えば、プロモーター）などの選択可能なマーカーとを運ぶ。一般的なベクターとしては、プラスミドベクター及びファージベクターが挙げられる。

高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、野生型ＴＣＲよりも標的リガンドへの強い結合を有する改変されたＴＣＲである。高親和性のいくつかの例としては、約１０^−６Ｍ〜１０^−１２Ｍの間、ならびにその中のすべての個々の値及び範囲の標的リガンドの平衡結合定数が挙げられる。この範囲は、野生型親和性であるように報告されるもの（１０^−４〜１０^−６Ｍ）と指向性進化によって単離されているもの（約１０^−１２Ｍ）との間の親和性を包含する。

サイトカインは、他の細胞に影響を及ぼす細胞によって作られるタンパク質、ペプチド、または糖タンパク質である。

哺乳類は、ヒト及び非ヒト哺乳類の両方を含む。

遺伝子コードの縮退のため、多数の機能的に等価なヌクレオチド配列が同一のアミノ酸配列をコードすることは、当業者によって理解されるであろう。
Ｔ細胞受容体

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面上で対をなしてヘテロダイマー受容体を形成する２つの鎖（αβまたはγδ）からなる。αβ ＴＣＲは、体内のほとんどのＴ細胞上で発現され、ＭＨＣ制限性抗原の認識に関与することが知られている。αβ ＴＣＲの分子遺伝学、構造、及び生化学は、現在十分に研究されている。各α及びβ鎖は、以下の２つのドメインからなる：タンパク質を細胞膜内に留め、ＣＤ３シグナル伝達装置の不変サブユニットに関連する定常ドメイン（Ｃ）、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる６つのループを通じて抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）。Ｖドメインの各々は、３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲは、主要組織適合性複合体によってコードされたタンパク質に結合した抗原ペプチド（ｐｅｐＭＨＣ）間で複合体と相互作用する（ＤａｖｉｓａｎｄＢｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，３９５−４０２、Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．（１９９８）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１６，５２３−５４４、Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．）。

ＴＣＲの分子遺伝学は、組み合わさってＶドメインのコード領域を形成する複数の遺伝子間での遺伝子組み換えのプロセスを明らかにしている。このプロセスは、重及び軽鎖遺伝子がＢ細胞由来抗体によって示される極めて大きい多様性を発生させるように再配置する抗体発達に類似している（Ｔｏｎｅｇａｗａ（１９８８）ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ，２４，２５３−６５）。Ｔ細胞の場合、α鎖Ｖドメインは、（ヒトでは約７５個のうちの）１つのＶ領域の（ヒトでは約６１個のうちの）１つのジョイニング（Ｊ）遺伝子セグメントへの再配置によって形成される（図５．８、Ｊａｎｅｗａｙ，８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ）。β鎖Ｖドメインは、（ヒトでは約５２個のうちの）１つのＶ領域の、（ヒトでは２つのうちの）１つの多様性（Ｄ）遺伝子、（ヒトでは１３個のうちの）１つのジョイニング（Ｊ）遺伝子セグメントへの再配置によって形成される（図５．８、（Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．））。ＶαＪα及びＶβＤβＪβ遺伝子の再配置の接合は、各鎖のＣＤＲ３ループをコードし、それらは、１０^１５を超える異なるＴＣＲの理論的限界を伴ってαβ ＴＣＲの極めて大きい多様性（ＤａｖｉｓａｎｄＢｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，３９５−４０２）に寄与し、また合計で約１０１１個のＴ細胞しか存在しないためヒトにおける達成可能な多様性を優に上回る（Ｍａｓｏｎ（１９９８）ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ，１９，３９５−４０４）。これらのループはＶ遺伝子内部でコードされ、ＴＣＲはインビボで体細胞突然変異を受けないため、各鎖の可能なＣＤＲ１及びＣＤＲ２多様性はＶ遺伝子の数によって表される。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２ループの多様性はＣＤＲ３ループと比較して相対的に限定されているが、ペプチド抗原及び／またはＭＨＣ生成物に基づく特定のＶ領域の選択が存在していることが示されるいくつかの例が存在している。

クラスＩＭＨＣ生成物は、８〜１０のアミノ酸長のペプチドに結合し、それらは体内のすべての有核細胞上で発現される（（ＲｏｃｋａｎｄＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９９９）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１７，７３９−７９）によって概観される）。抗体抗原間相互作用のすべての結合エネルギーは外来抗原に集中されるのに対して、ＴＣＲ−ペプチド：ＭＨＣの結合エネルギーの大部分は、自己ＭＨＣ分子に指向される（ＭａｎｎｉｎｇａｎｄＫｒａｎｚ（１９９９）ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，２０，４１７−４２２）。実際、より最近の研究は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２ループの特定の残基は、ＭＨＣらせん上の特定の残基と相互作用し、それによってＭＨＣ制限性のプロセスの主要因であるＭＨＣのための基礎的な親和性を提供するように進化してきたことを示唆している（Ｇａｒｃｉａｅｔａｌ．（２００９）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ，１０，１４３−７、Ｍａｒｒａｃｋｅｔａｌ．（２００８）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２６，１７１−２０３）。

１）ＣＤ４ヘルパーＴ細胞（ＣＤ８補助受容体を欠損する）の活性を駆動するため、または２）「エフェクター」分子（例えば、二重特異性タンパク質を形成するための抗体Ｆｃ領域、毒性薬物、または抗ＣＤ３抗体などの抗体ｓｃＦｖ）を付着させることによって、細胞の直接的標的のために使用され得る可溶性ＴＣＲを発達させるために、正常範囲を超えるペプチド−ＭＨＣ抗原（クラスＩ）に対する親和性を有するＴＣＲ（所謂、より高い親和性のＴＣＲ）の使用に関心が寄せられてきた（（ＡｓｈｆｉｅｌｄａｎｄＪａｋｏｂｓｅｎ（２００６）ＩＤｒｕｇｓ，９，５５４−９、ＦｏｏｔｅａｎｄＥｉｓｅｎ（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，１０６７９−８１、Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，５３８７−９２、Ｍｏｌｌｏｙｅｔａｌ．（２００５）ＣｕｒｒＯｐｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ，５，４３８−４３、ＲｉｃｈｍａｎａｎｄＫｒａｎｚ（２００７）ＢｉｏｍｏｌＥｎｇ，２４，３６１−７３）。このアプローチはまた、Ｔ細胞が（一部には耐性胸腺及び末梢プロセスにより）潜在的な腫瘍抗原に対する適切な特異性及び結合親和性を有するＴＣＲを発現しないという、一部の癌患者が直面する問題を克服することができた。例えば、３００を超えるＭＨＣ制限性のＴ細胞によって規定される腫瘍抗原が特定されている（ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ／）（ＢｏｏｎａｎｄＯｌｄ（１９９７）ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，９，６８１−３；Ｃｈｅｅｖｅｒｅｔａｌ．（２００９）ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１５，５３２３−３７）。これらの腫瘍抗原としては、変異したペプチド、分化抗原、及び過剰に発現された抗原が挙げられ、これらのすべては療法の標的として機能することができたであろう。何故なら、目下説明されている癌抗原の大部分は、ＭＨＣ分子の文脈にて細胞表面においてのみ標的とされ得る細胞内タンパク質に由来したためである。ＴＣＲは、この種類の抗原を認識するように進化しているため、治療薬の理想的な候補を作製する。

同様に、ＴＣＲは、感染細胞中で自然に処理され、細胞表面上にＭＨＣ分子によってディスプレイされているウイルスタンパク質に由来するペプチドを検出し得る。ＨＩＶ及びＨＴＬＶ中のウイルスゲノムに由来するペプチドを含む、多数のウイルス抗原標的が過去２５年間で特定されている（例えば、Ａｄｄｏｅｔａｌ．（２００７）ＰＬｏＳＯＮＥ，２，ｅ３２１、Ｔｓｏｍｉｄｅｓｅｔａｌ．（１９９４）ＪＥｘｐＭｅｄ，１８０，１２８３−９３、Ｕｔｚｅｔａｌ．（１９９６）ＪＶｉｒｏｌ，７０，８４３−５１）。しかしながら、これらの疾患を有する患者は、感染細胞の結合及び破壊のための最適なＴＣＲを欠損する場合がある。最後に、ＴＣＲが、高度に特異的であるプロセスにおいて自己免疫標的の受容体拮抗薬として、または局所免疫細胞応答を免疫抑制するための送達剤として使用され得、それによって、一般的な免疫抑制を回避した可能性がある（Ｍｏｌｌｏｙｅｔａｌ．（２００５）ＣｕｒｒＯｐｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ，５，４３８−４３、Ｓｔｏｎｅｅｔａｌ．（２０１２）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ））。
修飾されたＴ細胞受容体

指向性進化は、特異性ｐｅｐＭＨＣに関するより高い親和性を有するＴＣＲを発生させるために使用されている。使用されてきた３つの異なるディスプレイ方法は、酵母ディスプレイ（Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．（２００３）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ，４，５５−６２；Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，５３８７−９２）、ファージディスプレイ（Ｌｉｅｔａｌ．（２００５）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，３４９−５４）、及びＴ細胞ディスプレイ（Ｃｈｅｒｖｉｎｅｔａｌ．（２００８）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４）である。３つのすべてのアプローチにおいて、プロセスは、野生型ＴＣＲの正常な低親和性を示すＴＣＲの改変に関与し、その結果、ＴＣＲの突然変異体は、特異性ｐｅｐＭＨＣに対して（即ち、Ｔ細胞が特異的であった元の抗原に対して）改善された親和性を有した。したがって、野生型ＴＣＲは、ＣＤＲのうちの１つ以上における突然変異ライブラリを生成するためのテンプレートとして使用され、続いて、同族ペプチド−ＭＨＣ抗原への結合によって、より高い親和性を有する突然変異体が選択された。かかるインビトロでの指向性進化は、野生型親和性の単に数倍のみではなくそれを超える親和性を改変するために必要であることは、当該技術分野において周知である。

酵母ディスプレイは、関心のタンパク質がＡｇａ２−融合体として表面上に発現されることを可能にする（ＢｏｄｅｒａｎｄＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５，５５３−５５７、ＢｏｄｅｒａｎｄＷｉｔｔｒｕｐ（２０００）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ，３２８，４３０−４４）。このシステムは、より高い親和性のＴＣＲ、１本鎖抗体、フィブロネクチン、及び他のタンパク質の改変において成功裏に使用されている。酵母ディスプレイシステムでは、ＴＣＲは、Ｖβ−リンカー−ＶαもしくはＶα−リンカー−Ｖβ形態の安定化１本鎖タンパク質として（Ａｇｇｅｎｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４，３６１−７２、Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，５３８７−９２、Ｋｉｅｋｅｅｔａｌ．（１９９９）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９６，５６５１−６、Ｒｉｃｈｍａｎｅｔａｌ．（２００９）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，４６，９０２−１６、Ｗｅｂｅｒｅｔａｌ．（２００５）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１０２，１９０３３−８）、または２本鎖ヘテロダイマーとして（Ａｇｇｅｎｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４，３６１−７２、Ｒｉｃｈｍａｎｅｔａｌ．（２００９）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，４６，９０２−１６）ディスプレイされている。２つのマウスＴＣＲが、このシステムを使用してより高い親和性に関して改変されている：２Ｃ（ＭＨＣクラスＩ制限性）及び３．Ｌ２（ＭＨＣクラスＩＩ制限性）（Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，５３８７−９２、Ｗｅｂｅｒｅｔａｌ．（２００５）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１０２，１９０３３−８）。ヒトＴＣＲ１本鎖ＶαＶβ断片（ｓｃＴｖまたはｓｃＴＣＲと呼ばれる）もまた、Ｖα２と呼ばれ、ＩＭＧＴ命名法によりＴＣＲＡ１２としても既知であるヒトＶα領域の例外的な安定性を利用することによって、近年発達されている（Ａｇｇｅｎｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４，３６１−７２）。この場合、インビトロで改変された１本鎖フォーマットの高親和性Ｔ細胞受容体は、安定したタンパク質として酵母表面上に、かつ可溶性形態で大腸菌から発現され得るヒト安定化ｓｃＴｖ断片（Ｖβ−リンカー−Ｖα）を単離するために使用された。ＴＣＲは、ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルスＴａｘタンパク質に由来するペプチドに対して特異的なＡ６ｓｃＴｖと、ヒト免疫不全ウイルスＧａｇタンパク質に由来するペプチド（ペプチド：ＳＬ９７７−８５）に対して特異的な８６８ｓｃＴｖとの２つの安定化ヒトｓｃＴｖ断片を含んだ。これらのＴＣＲのどちらも、Ｖα２遺伝子（ＩＭＧＴ：ＴＲＡＶ１２ファミリー）を使用したが、ＴＣＲが単離された起源Ｔ細胞クローンに由来するＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３β残基を有した。したがって、これらのｓｃＴＣＲのより高い親和性の突然変異体は、それらの同族ペプチド−ＭＨＣ抗原に対してそれらの起源（親）ＴＣＲに各々由来した。

第２のシステム、ファージディスプレイでは、関心のタンパク質は、ウイルスコートタンパク質のＮ末端に融合される（ＳｃｏｔｔａｎｄＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−９０）。Ａ６、８６８、及び１Ｇ４（ＭＨＣクラスＩ制限性）と呼ばれるものを含む種々のＴＣＲが、この方法を使用してより高い親和性に関して改変されている（Ｌｉｅｔａｌ．（２００５）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，３４９−５４、Ｓａｍｉｅｔａｌ．（２００７）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ，２０，３９７−４０３、Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａｅｔａｌ．（２００８）ＮａｔＭｅｄ，１４，１３９０−５）。これらのＴＣＲのファージディスプレイは、α及びβ鎖の対作成を促進するために、２つのＣドメイン間に非天然ジスルフィド結合を導入することによって可能になった。したがって、このシステムは、それらの同族ペプチド−ＭＨＣに対して改変するために起源Ｔ細胞クローンに由来する全長（ＶαＣα／ＶβＣβ）ヘテロダイマータンパク質を使用する。

ＴＣＲを改変するために報告されている第３のシステムは、哺乳動物細胞ディスプレイである（Ｃｈｅｒｖｉｎｅｔａｌ．（２００８）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４、Ｋｅｓｓｅｌｓｅｔａｌ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，１４５７８−８３）。このシステムは、レトロウイルスベクターを使用して、ＴＣＲα及びβ鎖をＴＣＲ陰性Ｔ細胞ハイブリドーマ内へ導入する。ある研究では（Ｋｅｓｓｅｌｓｅｔａｌ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９７，１４５７８−８３）、選択された突然変異ＴＣＲは、同族ペプチド（ＡＳＮＥＮＭＤＡＭ対ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ、それぞれ配列番号２３及び２４）に構造的に極めて類似したペプチドに結合することが示された。他の研究では、突然変異ＴＣＲの親和性は、同族ｐｅｐＭＨＣに関して増加されることが示された（Ｃｈｅｒｖｉｎｅｔａｌ．（２００８）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４）。かかるより高い親和性のＴＣＲはまた、同族ペプチドの構造的に類似の変異型に対してより高い親和性を示すことも多くの研究で示されている（例えば、（Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．（２００３）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ，４，５５−６２））。哺乳動物細胞ディスプレイシステムでは、導入されたＴＣＲは、ＣＤ３サブユニットとの複合体においてその天然立体構造の表面上に発現され、完全に機能的なＴ細胞（シグナル伝達免疫適格）を可能にした。したがって、それらの天然宿主中の全長ヘテロダイマーＴＣＲは、この方法を使用して改変された。
ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に結合する高親和性ＴＣＲ

本発明は、野生型ＴＣＲ及び周知の癌抗原ＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に対する種々の高親和性ＴＣＲを提供する。特定の実施形態では、改変されたＴＣＲは、インビボでの標的とされた送達のための可溶性形態で、または養子移入方法もしくは治療においてＴ細胞によって組み換え発現されて使用され得る。具体的な実施形態では、ＴＣＲの１本鎖ＶαＶβ形態（ｓｃＴＣＲ）骨格は、エフェクター分子をＴＣＲが結合する場所（例えば、腫瘍）へ送達するために、サイトカイン、毒素、放射性同位体、化学療法剤、または（抗体−薬物結合体に類似した）薬物などのペイロードと共に調製及び使用され得る。ＴＣＲはまた、ＷＴ１を発現する癌細胞に対する応答を媒介するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の養子移入などの細胞療法においても使用され得る。本明細書に提供されるｓｃＴＣＲ骨格はまた、例えば、放射性同位体または蛍光部分などの検出可能な基への共有結合によって、例えば、ＴＣＲのアミン反応性またはスルフヒドリル反応性アミノ酸側鎖を通じて、腫瘍性またはウイルス会合細胞表面抗原の特定を通じて、例えば、悪性またはウイルス感染細胞の診断のためにも使用され得る。

一実施形態では、本明細書に説明されるｓｃＴＣＲタンパク質は、酵母、ファージ、または哺乳動物細胞の表面上にディスプレイ可能であり、ＷＴ１抗原へのさらにより高い親和性を有するＴＣＲを改変するために使用され得る。一実施形態では、本明細書に説明されるｓｃＴＣＲタンパク質は、原核細胞、例えば、大腸菌、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・フィクウム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｉｃｕｕｍ）、アワモリコウジカビ、ニホンコウジカビ、トリコデルマ・リーゼイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロミセス・ラクチス、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、バチルス・スブチリスもしくはバチルス・リケニフォルミスなど、昆虫細胞（例えば、キイロショウジョウバエ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）などの細胞株を含む哺乳動物細胞、または例えば、植物種（例えば、キャノーラ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、オオムギ、ライムギ、コムギ）、または他の当該技術分野において既知であるタンパク質発現源中で発現され、大量に生成され得る。ＴＣＲはまた、例えば、単なる例ではあるが、細胞の表面上の特異性ペプチド／ＭＨＣを検出するためにも使用され得る。一実施形態では、開示されるｓｃＴＣＲ遺伝子は、ＤＮＡ構築物中にコードされる好適なペプチド配列の使用によってシグナル伝達ドメインのための遺伝子に連結され、標的とされる細胞を取り除き得るＴ細胞内へ導入され得る。これらの構築物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれており、ｓｃＴＣＲを含有するＣＡＲの使用を含む、当該分野において現在広く使用される。

提供される１本鎖ＶαＶβ ＴＣＲタンパク質において、可変α及び可変β鎖は、抗体１本鎖Ｆｖ結合などの当該技術分野において既知であるものを含む、任意の好適なペプチドリンカーを使用して接続される（Ｂｉｒｄｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６、Ｈｏｌｌｉｇｅｒｅｔａｌ．（１９９３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９０，６４４４−８、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（２００５）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，１１０５−１６、Ｔｕｒｎｅｒｅｔａｌ．（１９９７）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，２０５，４３−５４）。一実施形態では、Ｖα−Ｌ−ＶβまたはＶβ−Ｌ−Ｖαの構造を有する可溶性ヒト１本鎖ＴＣＲであって、Ｌは、ＶβをＶαと連結するリンカーペプチドであり、Ｖβは、ＴＣＲ可変β領域であり、Ｖαは、ＴＣＲ可変α領域である、可溶性ヒト１本鎖ＴＣＲが提供される。

一実施形態では、ＶβＶα ＴＣＲは、ＷＴ１Ｄ１３．１．１と呼ばれ、Ｖβは、グループ３のＴＣＲ可変β領域であり、Ｖα２は、グループ２のＴＣＲ可変α領域である（Ｕｔｚ，Ｕ．，ｅｔａｌ．，１９９６）（Ａｇｇｅｎ，Ｄ．Ａ．，ｅｔａｌ．，２０１１）。

一実施形態では、リンカーペプチドは、５個を超えるリジン残基を含有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、５〜３０個のアミノ酸を含有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、提供されるｓｃＶβＶα ＴＣＲは、定常領域を含有しない。本明細書でｓｃＶβＶα ＴＣＲという専門用語が使用されるとき、ｓｃＶβＶα ＴＣＲはまた、当該技術分野において理解及び使用される専門用語として含まれることが理解される。したがって、Ｖβ及びＶα鎖は、リンカーを通じて任意の構成で互いに接続され得る。

本開示の態様では、本開示のＶβＶα ＴＣＲは、約１０^−６Ｍ〜１０^−１２Ｍの平衡結合定数Ｋ_Ｄでリガンドに特異的に結合する。本開示のこの態様の一実施形態では、リガンドは、ペプチド／ＭＨＣリガンドである。一実施形態では、本開示のＶβＶα ＴＣＲは、正常な野生型ＴＣＲの親和性と比較してリガンドに対して強化された親和性を有する。

生物学的に活性な基
生物学的に活性な基を含む本明細書に説明されるＶβＶα ＴＣＲタンパク質も、提供される。本明細書で使用するとき、「生物学的に活性な基」は、生物学的システムにおいて測定可能または検出可能な効果を引き起こす基である。一実施形態では、生物学的に活性な基は、以下から選択される：抗腫瘍剤、例えば、限定されるものではないが、血管形成阻害剤、酵素阻害剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ挿入剤もしくは架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤など、サイトカイン、例えば、限定されるものではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、もしくはＬＴ−α（Ｓｃｈｒａｍａｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ，５，１４７−５９、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ，２４，３７３−８３）、抗炎症基、例えば、限定されるものではないが、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３７、ＩＬ−１０（Ｎｏｌｄｅｔａｌ．（２０１０）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ，１１，１０１４−２２、Ｓｔｏｎｅｅｔａｌ．（２０１２）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、放射性同位体、例えば、限定されるものではないが、^９０Ｙもしくは^１３１Ｉなど（ＲｅｉｃｈｅｒｔａｎｄＶａｌｇｅ−Ａｒｃｈｅｒ（２００７）ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ，６，３４９−５６）、毒素、例えば、限定されるものではないが、緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素、もしくはリシンのＡ鎖（Ｐａｓｔａｎｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ，６，５５９−６５、Ｓｃｈｒａｍａｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ，５，１４７−５９）、薬物、または例えば、１本鎖Ｆｖなどの抗体。

本開示のこの態様の一実施形態では、生物学的に活性な基は、細胞毒性分子であり、薬物（例えば、用語「抗体薬物結合体」において）と称される場合もある。本明細書で使用するとき、「細胞毒性」は、細胞に対する毒性を意味する。細胞毒性分子の例としては、限定されるものではないが、ドキソルビシン、メトトレキサート、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、ズオカルマイシン、オーリスタチン、マイタンシン、カリチェアミシン、及び上述の分子の類似物が挙げられる（Ｊａｒｖｉｓ（２０１２）ＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ，９０，１２−１８、Ｌｉｔｖａｋ−ＧｒｅｅｎｆｅｌｄａｎｄＢｅｎｈａｒ（２０１２）ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ、ＲｉｃａｒｔａｎｄＴｏｌｃｈｅｒ（２００７）ＮａｔＣｌｉｎＰｒａｃｔＯｎｃｏｌ，４，２４５−５５）。細胞毒性分子は、完全な細胞死を引き起こす必要はないが、むしろ、測定可能もしくは検出可能な増殖の阻害または細胞活性の減少を引き起こす必要がある。

一実施形態では、本明細書に説明されるＴＣＲは、プロドラッグを薬物に転換することができる酵素に連結される。これは、例えば、薬物の活性形態がＴＣＲによって標的とされる場所において（例えば、腫瘍部位において）作成されることを可能にすることによって、有用である。

一実施形態では、生物学的に活性な基は、リンカーを通じて１本鎖ＴＣＲに結合され、それは、例えば、ＴＣＲの遊離アミン基またはスルフヒドリル基との、標準的な化学反応を通じて達成され得る。

別の実施形態では、ＴＣＲは、１本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）に付着されて、二重特異性薬剤を発生させる。腫瘍抗原に対する１つのｓｃＦｖと、Ｔ細胞のＣＤ３分子に対する１つのｓｃＦｖと、を含有する二重特異性抗体が、現在医院において成功裏に使用されている（Ｂａｒｇｏｕｅｔａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１，９７４−７）。加えて、ＣＤ３に対するＴＣＲ及びｓｃＦｖを含有する二重特異性薬剤も報告されている（Ｌｉｄｄｙｅｔａｌ．（２０１２）ＮａｔＭｅｄ，１８，９８０−７）。

検出可能な基を含む本明細書に説明される１本鎖ＶβＶα ＴＣＲも、提供される。一実施形態では、検出可能な基は、分光法または酵素に基づいた方法によって検出され得る基である。一実施形態では、検出可能な基は、蛍光基、例えば、限定されるものではないが、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、テキサスレッド、もしくはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）など、放射性標識基、例えば、限定されるものではないが、１２５Ｉ、３２Ｐ、９９ｍＴｃなど、吸収基、または検出可能な生成物を発生させる特性を有する酵素、例えば、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはアルカリホスファターゼなどである。

当該技術分野において既知である通り、生物学的に活性な基、検出可能な基、またはＴＣＲに付着した他の基は、可撓性ペプチドリンカーを使用してか、または化学的結合によって付着され得、ＴＣＲに共有的または非共有的に付着され得る。

治療的に有効な分子に連結された有効量の修飾されたＴＣＲを哺乳類に投与することを含む、哺乳類における癌を治療または予防する方法における使用のためのヒトＴＣＲも、本明細書に提供される。具体的な実施形態では、哺乳類は、ヒトである。別の実施形態では、哺乳類は、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、齧歯動物、ウマ）または家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ）である。

本明細書に説明される単離された１本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）、及び大腸菌中で１本鎖を生成するための方法も、提供される。本明細書に説明されるｓｃＴＣＲと、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物も提供される。

Ｔ細胞の表面上に活性ＴＣＲを生じるシグナル伝達ドメインに連結されている本明細書に説明されるｓｃＶαＶβ ＴＣＲも、提供される。一実施形態では、このｓｃＴＣＲは、ＴＣＲをベクター中にクローン化することと、ベクターを患者のＴ細胞内へ導入することと、Ｔ細胞を患者へと戻して養子移入することと、を含む、哺乳類における癌を治療する方法において使用され得る。
修飾されたＴＣＲポリペプチド及びポリヌクレオチド

本開示は、１本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）をコードする少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含むＤＮＡベクターを企図する。

当業者は、標準的な突然変異誘発技術を通じて、本明細書に説明される分析と併せて、変更されたＴＣＲ配列を得て、それらを特定の結合親和性及び／または特異性に関して試験することができる。当該技術分野において既知である有用な突然変異誘発技術としては、限定されるものではないが、デノボ遺伝子合成、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発、領域特異性突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、及びＰＣＲによる部位指向突然変異誘発が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９９）を参照）。

修飾されたＴＣＲコード配列の獲得において、当業者は、生物学的活性の損失または低減を伴わずに特定のアミノ酸置換、付加、欠失、及び翻訳後修飾によって修飾され得るＴＣＲ由来タンパク質を認識するであろう。具体的には、保存的アミノ酸置換、即ち、１個のアミノ酸の、類似の大きさ、電荷、極性、及び立体構造の別のアミノ酸への置換は、タンパク質の機能を著しく変更する可能性は低いことは周知である。タンパク質の構成要素である２０個の標準的なアミノ酸は、以下の通り、４つの群の保存的アミノ酸に広範に分類され得る：非極性（疎水性）基は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、及びバリンを含み、極性（非荷電、中性）基は、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、及びチロシンを含み、正荷電（塩基性）基は、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンを含有し、負荷電（酸性）基は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含有する。１個のアミノ酸のタンパク質の同一の群内の別のものへの置換は、タンパク質の生物学的活性に悪影響を有する可能性は低い。

一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲは、安定化されたタンパク質をもたらす可変ドメインの任意の領域（単数または複数）内の追加の突然変異を含有してもよい。一実施形態では、１つ以上の追加の突然変異は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＨＶ４、ＣＤＲ３、ＦＲ２、及びＦＲ３内のうちの１つ以上である。突然変異誘発に使用される領域は、結晶構造または分子モデルを使用して、関心のリガンド（例えば、抗原）と相互作用するＴＣＲの領域を発生させる、指向性進化によって決定され得る。他の例では、可変領域は、アミノ酸を付加または欠失させて、ｓｃＴＣＲとリガンドとの間の所望の相互作用を改変することによって、再成形され得る。

本発明のポリペプチドは、修飾されたＴＣＲ、及びその抗原結合断片（例えば、ｓｃＴＣＲ）、ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」、及び「糖タンパク質」は、互換的に使用され、任意の特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、糖化、リン酸化、及びシグナル配列の付加または欠失などの修飾を除外しない。「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の１つ以上の鎖であって、各鎖がペプチド結合によって共有的に連結されたアミノ酸を含み、該ポリペプチドまたはタンパク質は、天然タンパク質、即ち、自然に発生する細胞、特に非組み換え細胞、または遺伝子的に改変された細胞、もしくは組み換え細胞によって生成されるタンパク質の配列を有する、ペプチド結合によって非共有的及び／または共有的に一緒に連結された複数の鎖を含むことができ、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、及び／もしくは置換を有する分子を含むことができる、アミノ酸の１つ以上の鎖を意味する。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、特に、本開示の修飾されたＴＣＲ、もしくはその抗原結合断片、または修飾されたＴＣＲ、もしくはその抗原結合断片の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、及び／もしくは置換を有する配列を包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸鎖のうちの１つ（「モノマー」と呼ばれる）または複数（「マルチマー」と呼ばれる）を含むことができる。

本明細書で言及される用語「単離されたタンパク質」は、（１）典型的には自然に共に見出されるであろう少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、（２）同一の源に由来する、例えば、同一の種に由来する他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種に由来する細胞によって発現されるか、（４）少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくはそれが自然に共に会合される他の材料から分離されているか、（５）「単離されたタンパク質」が自然に共に会合されるタンパク質の部分と、（共有もしくは非共有相互作用によって）会合されていないか、（６）それが自然に会合されないポリペプチドと、（共有または非共有相互作用によって）作動可能に会合されるか、または（７）自然には発生しない、対象タンパク質を意味する。かかる単離されたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは合成起源のものであり得る他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせによってコードされ得る。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、その（治療的、診断的、予防的、研究、ないしは別の）使用に干渉するであろう、その自然環境で見いだされるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。

具体的な実施形態では、対象の修飾されたＴＣＲは：ａ）本明細書に説明される修飾されたＴＣＲのα鎖可変領域に対して少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖可変領域と、ｂ）本明細書に説明される修飾されたＴＣＲのβ鎖可変領域に対して少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するβ鎖可変領域と、を有してもよい。

具体的な実施形態では、修飾されたＴＣＲは：ａ）ｉ．本明細書に説明される選択されたＴＣＲのα鎖ＣＤＲ１領域に対してアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域、ｉｉ．選択されたＴＣＲのα鎖ＣＤＲ２領域に対してアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域、及びｉｉｉ．選択されたＴＣＲのα鎖ＣＤＲ３領域に対してアミノ酸が同一であるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲ α鎖可変領域と、ｂ）ｉ．選択されたＴＣＲのβ鎖ＣＤＲ１領域に対してアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域、ｉｉ．選択されたＴＣＲのβ鎖ＣＤＲ２領域に対してアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域、及びｉｉｉ．選択されたＴＣＲのβ鎖ＣＤＲ３領域に対してアミノ酸が同一であるＣＤＲ３領域を含む、β鎖可変領域と、を含んでもよく、この場合、ＴＣＲはＷＴ１抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、修飾されたＴＣＲ、またはその抗原結合断片は、変異型の修飾されたＴＣＲであり、この場合、該変異型は、Ｖα及びＶβ領域のＣＤＲ領域中の最大８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個以上のアミノ酸置換を除いて、選択された修飾されたＴＣＲに同一であるα鎖及びβ鎖を含む。この点において、選択された変異型の修飾されたＴＣＲのＣＤＲ領域内に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または特定の実施形態では、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個以上のアミノ酸置換が存在してもよい。置換は、Ｖα及び／またはＶβ領域のいずれかのＣＤＲにあってもよい。（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ，１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ６：１１５３−１１６７を参照）。

一実施形態では、修飾されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチド、またはその抗原結合断片が提供される。他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの変異型であってもよい。ポリヌクレオチド変異型は、本明細書に説明される修飾されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチド配列に対して実質的同一性を有してもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に説明されるＴＣＲをコードする配列などの基準ポリヌクレオチド配列と比較して、本明細書に説明される方法（例えば、下記に説明される、標準的パラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含むポリヌクレオチドであってもよい。当業者は、これらの値は、コドン縮退、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置付けなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するように、適切に調整され得ることを認識するであろう。

典型的には、ポリヌクレオチド変異型は、好ましくは、その変異型ポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの結合親和性が、具体的に本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲと比べて実質的に縮小されないように、１つ以上の置換、付加、欠失、及び／または挿入を含有するであろう。

ポリヌクレオチド配列を比較するとき、下記に説明される通り、最大一致に関して整列されたときに２つの配列中のヌクレオチドの配列が同じであれば、２つの配列は「同一である」と言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列を比較窓上で比較して、配列類似性の局所領域を特定及び比較することによって実施される。本明細書で使用するとき、「比較窓」は、通常３０〜約７５個、４０〜約５０個、少なくとも約２０個の連続的な位置のセグメントを指し、その中で、２つの配列が最適に整列された後に、配列が同一数の連続的な位置の基準配列と比較され得る。

比較のための配列の最適な整列は、生物情報工学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、デフォルトパラメータを使用して実施されてもよい。このプログラムは、以下の参考文献に説明されるいくつかの整列スキームを具現化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａｍｏｄｅｌｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｃｈａｎｇｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｄｉｓｔａｎｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．ＩｎＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣＶｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；ＨｅｉｎＪ．，ＵｎｉｆｉｅｄＡｐｐｒｏａｃｈｔｏＡｌｉｇｎｍｅｎｔａｎｄＰｈｙｌｏｇｅｎｅｓ，ｐｐ．６２６−６４５（１９９０）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｖｏｌ．１８３，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３（１９８９）、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄＭｕｌｌｅｒＷ．，ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７（１９８８）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ１１：１０５（１９７１）、Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５（１９８７）、Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，ＮｕｍｅｒｉｃａｌＴａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＮｕｍｅｒｉｃａｌＴａｘｏｎｏｍｙ，ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９７３）、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：７２６−７３０（１９８３）。

別法として、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ２：４８２（１９８１）の局所同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装によって（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）または調査によって実施されてもよい。

パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズム１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に説明される。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０は、２つ以上のポリヌクレオチド間のパーセント配列同一性を決定するために、例えば、本明細書に説明されるパラメータと共に使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能である。１つの例証的な例では、累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（整合残基の対に対する獲得スコア、常に＞０）及びＮ（不整合残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して算出され得る。各方向のワードヒットの伸長は、累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ降下するとき、累積スコアが、１つ以上の負のスコアを有する残基整列の蓄積によりゼロ以下になるとき、またはどちらかの配列の末端に到達するときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感受性及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）及び１０の予測（Ｅ）、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）整列、５０の（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。

特定の実施形態では、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を少なくとも２０個の位置の比較の窓上で比較することによって決定され、比較窓内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列に関して基準配列（付加または欠失を含まない）と比較されるときに、２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一である核酸塩基が両配列内で発生する位置の数を決定して、整合位置の数を作成し、整合位置の数を基準配列内の位置の総数（即ち、窓の大きさ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを作成することによって算出される。

遺伝子コードの縮退の結果として、本明細書に説明されるＴＣＲをコードする多数のヌクレオチド配列が存在することは、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、例えば、同一抗原に結合する、修飾されたＴＣＲをコードする天然または起源ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に対して最小の配列同一性を有する。にもかかわらず、コドン利用の差により変化するポリヌクレオチドは、本開示によって明白に企図される。特定の実施形態では、哺乳動物発現に関してコドン最適化されている配列が、特に企図される。

ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどに関与する酵素反応のクローン化、ＤＮＡ単離、増幅、及び精製のための標準的な技術、ならびに種々の分離技術は、当業者に既知であり、当業者によって一般的に用いられるものである。多数の標準的な技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．（１９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｗｕ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８，ＰａｒｔＩ、Ｗｕ（ｅｄ．）（１９７９）ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ．６８、Ｗｕｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００及び１０１、ＧｒｏｓｓｍａｎａｎｄＭｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５、Ｍｉｌｌｅｒ（ｅｄ．）（１９７２）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ、ＯｌｄａｎｄＰｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１）ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＧｅｎｅＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａＰｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＳｃｈｌｅｉｆａｎｄＷｅｎｓｉｎｋ（１９８２）ＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ．）（１９８５）ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＶｏｌ．Ｉ及びＩＩ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ．）（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、ならびにＳｅｔｌｏｗａｎｄＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−４，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋに説明される。略語及び命名法は、用いられる場合、当該分野における標準的なものと見なされ、本明細書に記載されるものなどの専門的な論文に一般的に使用される。

ヌクレオチド配列間の相同性は、２本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性が発生する塩基対の範囲に依存するＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって決定され得る。高温及び／または低塩含量の条件は、ハイブリッドの安定性を低減させ、選択された度合いより低い相同性を有する配列のアニールを予防するために変化され得る。例えば、約５５％のＧ−Ｃ含量を有する配列に関して、４０〜５０℃、６ＸＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝材）、及び０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、約６０〜７０％の相同性を示し、５０〜６５℃、１ＸＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、約８２〜９７％の相同性を示し、５２℃、０．１ＸＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、約９９〜１００％の相同性を示す。ヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較する（及び、相同性の度合いを測定する）ための広範なコンピュータプログラムも利用可能であり、市販のソフトウェア及び無料ソフトウェアの両方の提供元リストは、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９９）に見出される。容易に入手可能な配列比較アルゴリズム及び複数配列整列アルゴリズムは、それぞれ、ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにてインターネット上で入手可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷのバージョンはｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋにて入手可能である。

微生物（例えば、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・フィクウム、アワモリコウジカビ、ニホンコウジカビ、トリコデルマ・リーゼイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロミセス・ラクチス、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、大腸菌、バチルス・スブチリス、またはバチルス・リケニフォルミス）、昆虫（ショウジョウバエ）、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＣＨＯ）、または植物種（例えば、キャノーラ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、オオムギ、ライムギ、コムギ）の工業用細胞株は、ＴＣＲタンパク質の組み換え生成のための宿主細胞として使用されてもよい。特定の実施形態では、高親和性ＴＣＲタンパク質または可溶性タンパク質の異種発現の第１のステップでは、ＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲコード配列及び制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、及びターミネーターなどを含むように、発現構築物が組み立てられる。シグナル配列などの他の配列及び選択可能なマーカーも、含まれてもよい。ＴＣＲの細胞外発現を達成するために、発現構築物は、分泌シグナル配列を含んでもよい。実施形態では、シグナル配列は、細胞質発現が所望される場合、発現構築物上に含まれない。実施形態では、プロモーター及びシグナル配列は、宿主細胞中で機能的であり、ＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲタンパク質の発現及び分泌を提供する。効率的な転写を確実にするために、転写ターミネーターが含まれてもよい。発現またはタンパク質精製を強化する補助的な配列も、発現構築物中に含まれてもよい。

種々のプロモーター（転写開始調節領域）が、本開示に従って使用されてもよい。適切なプロモーターの選択は、提案される発現宿主に依存してもよい。異種源に由来するプロモーターは、それらは選択される宿主中で機能的である限り、使用されてもよい。

プロモーターの選択はまた、ペプチドまたはタンパク質生成の所望の効率及びレベルにも依存する。ｔａｃなどの誘導性プロモーターは、大腸菌中でのタンパク質発現のレベルを劇的に増加させるために用いられることが多い。タンパク質の過剰発現は、宿主細胞にとって有害な場合もある。その故、宿主細胞増殖は、制限されてもよい。誘導性プロモーターシステムの使用は、宿主細胞が、遺伝子発現の誘導の前に許容される密度で培養され、それによってより高い生成物収率を促進することを可能にする。

種々のシグナル配列が、本開示に従って使用されてもよい。ＴＣＲコード配列と同種であるシグナル配列が、使用されてもよい。別法として、発現宿主中での効率的な分泌及び処理のために選択または設計されたシグナル配列も、使用されてもよい。例えば、好適なシグナル配列／宿主細胞対としては、Ｂ．スブチリス中での分泌のためのＢ．スブチリスｓａｃＢシグナル配列、及びＰ．パストリス分泌のためのサッカロマイセス・セレビシエα−接合因子またはＰ．パストリス酸ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ開裂部位をコードする配列を直接通じてタンパク質コード配列に結合されてもよく、または通常１０個未満のコドンからなる短ヌクレオチド架橋を通じてもよく、この場合、架橋は下流ＴＣＲ配列の正しいリーディングフレームを確実にする。

転写及び翻訳を強化するための要素は、真核生物タンパク質発現システムに関して特定されている。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター１０００ｂｐを、異種プロモーターのどちらかの側に位置付けることは、植物細胞において転写レベルを１０〜４００倍上昇させ得る。発現構築物はまた、適切な翻訳開始配列も含むべきである。適当な翻訳開始のためのコザックコンセンサス配列を含むような発現構築物の修飾は、翻訳のレベルを１０倍増加させ得る。

多くの場合、選択的なマーカーが用いられ、これは発現構築物の一部であってもよく、またはそれから分離していてもよく（例えば、発現ベクターによって運ばれる）、その結果、マーカーは関心の遺伝子とは異なる部位で統合する。例としては、抗生物質に対する抵抗力を付与する（例えば、ｂｌａは大腸菌宿主細胞に関してアンピシリンに対する抵抗力を付与し、ｎｐｔＩＩは多様な原核及び真核細胞にカナマイシンに対する抵抗力を付与する）か、または宿主が最小培地上で増殖することを可能にする（例えば、ＨＩＳ４はＰ．パストリスまたはＨｉｓ−Ｓ．セレビシエがヒスチジンの不在下で増殖することを可能にする）マーカーが挙げられる。選択可能なマーカーは、マーカーの独立した発現を可能にするために、それ自身の転写及び翻訳開始及び終了調節領域を有する。抗生物質抵抗性がマーカーとして用いられる場合、選択のための抗生物質の濃度は、概して培地１ｍｌ当たり１０〜６００μｇの抗生物質の範囲で、その抗生物質に応じて変動するであろう。

発現構築物は、既知の組み換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９９９）を用いることによって組み立てられる。制限酵素消化及びライゲーションは、ＤＮＡの２つの断片を結合するために用いられる基本的なステップである。ＤＮＡ断片の末端は、ライゲーションの前に修飾を必要とする場合があり、これは、突出の充填、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）による断片（単数または複数）の末端部分の欠失、部位指向突然変異誘発、またはＰＣＲによる新規の塩基対の付加によって達成されてもよい。選択される断片の結合を促進するために、ポリリンカー及びアダプターが用いられてもよい。発現構築物は典型的には、一連の制限、ライゲーション、及び大腸菌の形質転換を用いる段階で組み立てられる。発現構築物の構築に好適な多数のクローン化ベクターは、当該技術分野において既知であり（λＺＡＰａｎｄｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴＳＫ−１，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ；ｐＥＴ，ＮｏｖａｇｅｎＩｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ−Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９９９に記載）、具体的な選択は本開示にとって重要ではない。クローン化ベクターの選択は、発現構築物を宿主細胞内へ導入するために選択される遺伝子移入システムの影響を受けるであろう。各段階の最後に、結果として得られる構築物は、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション、及びＰＣＲ分析によって分析されてもよい。

発現構築物は、線状かもしくは環状かのいずれかのクローン化ベクター構築物として宿主へ形質転換されてもよく、またはクローン化ベクターから除去され、そのまま使用されるか、もしくは送達ベクター上へ導入されてもよい。送達ベクターは、選択される宿主細胞型中での発現構築物の導入及び維持を促進する。発現構築物は、多数の既知の遺伝子移入システムのいずれかによって宿主細胞内へ導入される（例えば、ナチュラルコンピテンス、化学的に媒介された形質転換、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法、遺伝子銃形質転換、遺伝子導入、または結合）（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９）。選択される遺伝子移入システムは、使用される宿主細胞及びベクターシステムに依存する。

例えば、発現構築物は、プロトプラスト形質転換または電気穿孔法によってＳ．セレビシエ細胞内へ導入され得る。Ｓ．セレビシエの電気穿孔法は、容易に達成され、スフェロプラスト形質転換に匹敵する形質転換効率をもたらす。

モノクローナルまたはポリクローナル抗体、好ましくはモノクローナル、特に、リガンド結合部位以外の部位においてＴＣＲタンパク質と反応性であるものは、当該技術分野において既知である方法によって作製することができ、また多くのものが市販されている。例えば、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，２ｄｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ、及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９９）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋを参照されたい。

特定の標的リガンドに対して特異的である細胞結合または可溶性形態のＴＣＲは、例えば、生物学的標本（細胞、組織標本、生検材料、体液など）をスクリーニングするための、または試験標本中の標的リガンドの存在を検出するための診断プローブとして、有用である。しばしば、ＴＣＲは、共有的に、または非共有的にのいずれかで、検出可能なシグナルを提供する物質に結合することによって標識される。好適な標識としては、限定されるものではないが、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学発色剤、磁性粒子などが挙げられる。加えて、ＴＣＲは、第２の結合分子のためのリガンドに結合され得、例えば、ＴＣＲはビオチン化され得る。次に、標的細胞または分子に結合したＴＣＲの検出は、検出可能なストレプトアビジン（蛍光性、放射性、化学発色性、もしくは他の検出可能な分子が付着されるか、または利用可能な発色基質がそれに対して存在する酵素が利用可能であるストレプトアビジン）の結合によって達成され得る。かかる標識及び／または毒性化合物のｓｃＴＣＲに共有結合されるような使用を説明する米国特許としては、限定されるものではないが、第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９２７，１９３号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，６４０，５６１号、第４，３６６，２４１号、第ＲＥ３５，５００号、第５，２９９，２５３号、第５，１０１，８２７号、第５，０５９，４１３号が挙げられる。

標識ＴＣＲは、使用される標識に適切な観察機器または方法を使用して検出され得る。蛍光顕微鏡法または蛍光活性化細胞ソートは、標識が蛍光部分であり、標識が放射性核種、γ計数、オートラジオグラフィー、または液体シンチレーション計数である場合に使用することができ、例えば、その方法が分析されている標本及び使用される放射性核種に適切であるという条件で使用することができる。加えて、本明細書に記されるように、ＭＨＣ構成要素の不在下で標的リガンドのための結合部位の一部ではないＴＣＲの部分を認識した検出可能な分子または粒子が存在する場合に用いられる、二次検出分子または粒子が存在し得る。現場での診断的撮像に有用な化合物は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，１０１，８２７号、同第５，０５９，４１３号を参照されたい。インビボでの療法及び／撮像に有用な放射性核種としては、^１１１Ｉｎｄｉｕｍ、^９７Ｒｕｂｉｄｉｕｍ、^１２５Ｉｏｄｉｎｅ、^１３１Ｉｏｄｉｎｅ、^１２３Ｉｏｄｉｎｅ、^６７Ｇａｌｌｉｕｍ、^９９Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍが挙げられる。毒素としては、とりわけジフテリア毒素、リシン、及びトウゴマの実毒素が挙げられるが、但し、ＴＣＲ−毒素複合体が細胞に結合した後、毒性部分はその細胞毒性効果を発揮し得るように内面化されることが条件である。抗毒素技術は、当該技術分野において周知であり、好適な毒性分子としては、限定されるものではないが、化学療法薬、例えば、ビンデシンなど、抗葉酸剤、例えば、メトトレキサート、シスプラチン、マイトマイシン、アントロシクリン（ａｎｔｈｒｏｃｙｃｌｉｎｅ）、例えば、ダウノマイシン、ダウノルビシン、またはアドリアマイシンなど、及び細胞毒性タンパク質、例えば、リボソーム不活性化タンパク質など（例えば、ジフテリア毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、リシン、緑膿菌外毒素Ａ、またはそれらの組み換え誘導体など）が挙げられる。例えば、概してＯｌｓｎｅｓａｎｄＰｉｈｌ（１９８２）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２５：３５５−３８１、及びＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＴｈｅｒａｐｙ，Ｅｄｓ．ＢａｌｄｗｉｎａｎｄＢｙｅｒｓ，ｐｐ．１５９−１７９，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８５を参照されたい。

ペプチド：主要組織適合性複合体への結合を含むＴＣＲ分子の一般的な構造ならびに作製及び使用の方法は、開示されている。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４号、第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２６３号、第ＷＯ９９／６０１２０号を参照されたい。
薬学的組成物及び治療剤

特定の標的リガンドに対して特異的なＴＣＲは、特定の抗原に関連付けられる疾患、例えば、癌などの腫瘍性疾患または障害に罹患すると考えられる、ヒトを含む動物及び哺乳類の治療に有用である。本明細書に説明される方法に従って治療され得る癌の種類の例としては、限定されるものではないが、ウィルムス腫瘍、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎性癌、皮膚癌、小細胞肺癌、及び精巣癌が挙げられる。

治療用生成物は、本明細書に示される材料を使用して作製され得る。治療用生成物の有効量は、対象における測定可能な効果を生み出す最小用量である。治療用生成物は、当業者によって容易に調製される。一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲは、患者に直接投与される。一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲは、当該技術分野において既知である通りＰＥＧまたは免疫グロブリン定常領域に連結される。この実施形態は、血清クリアランスを伸ばす。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、薬物を癌細胞などの標的細胞へ送達するために化学療法剤または薬物に連結される。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、サイトカインなどの生物学的エフェクター分子に連結される（ＴａｙａｌａｎｄＫａｌｒａ（２００８）ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，５７９，１−１２）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＴＮＦαなどの抗腫瘍活性を有するサイトカインに連結される（Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ，２４，３７３−８３）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３などの免疫阻害サイトカイン連結される（Ｓｔｏｎｅｅｔａｌ．（２０１２）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、別の抗原結合分子に連結されて、二重特異性薬剤を形成する（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．（２０１０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ，２３，５４９−５７、ＴｈａｋｕｒａｎｄＬｕｍ（２０１０）ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ，１２，３４０−９）。一実施形態では、二重特異性分子は、抗ＣＤ３などの１本鎖Ｆｖに連結されたｓｃＴＣＲで構成され（（Ｂａｒｇｏｕｅｔａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１，９７４−７、Ｌｉｄｄｙｅｔａｌ．（２０１２）ＮａｔＭｅｄ，１８，９８０−７）、Ｔ細胞及び罹患細胞を架橋する。一実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＣＤ３などのＴＣＲシグナル伝達ドメインに連結されて、キメラ抗原受容体を形成する（（Ｐｏｒｔｅｒｅｔａｌ．（２０１１）ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，３６５，７２５−３３、Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．（２００９）ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，２１，２１５−２３、Ｓｔｒｏｎｃｅｋｅｔａｌ．（２０１２）ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ，１０，４８）。これらの方法及び、静脈内投与などの他の投与方法は、当該技術分野において既知である。有用用量は、当業者によって決定され得る。

ｓｃＴＣＲ組成物は、当該技術分野において既知である手段のいずれかによって製剤化され得る。それらは典型的には、注射物質、特に、静脈内、腹腔内、もしくは骨膜投与（特定の疾患によって決定される経路による）のためのものとして、または液体溶液かもしくは懸濁液のいずれかとして経鼻もしくは経口投与用の製剤として調製され得る。注射または他の投与の前の、液体中溶液または懸濁液に好適な固体形態も、調製され得る。調製物はまた、例えば、乳化されてもよく、またはリポソーム中にカプセル化されたタンパク質（単数または複数）／ペプチド（単数または複数）であってもよい。

活性成分は、薬学的に許容され、また活性成分に適合する賦形剤または担体などの任意選択的な薬学的添加剤と混合されることが多い。好適な賦形剤としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせが挙げられる。注射物質、エアロゾル、または経鼻製剤中のｓｃＴＣＲの濃度は、通常０．０５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である。具体的な有効用量の選択は、当業者によって知られており、過度の実験をすることなく実施される。類似の用量は、他の粘膜表面に投与され得る。

加えて、所望により、ｓｃＴＣＲを含み得るワクチンは、ワクチンの有効性を強化する湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／または補助剤などの補助物質などの微量の薬学的添加剤を含有してもよい。有効であり得る補助剤の例としては、限定されるものではないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄイソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニルｌ−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）、及び、細菌から抽出される３つの構成要素、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコール酸、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０乳液中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。かかる追加的な製剤、及び当該技術分野において既知である投与形態もまた、使用されてもよい。

本開示のｓｃＴＣＲ、及び／またはＴＣＲ可変領域に類似（９０％超の同一性）の一次構造を有し、標的リガンドに対する高親和性を維持する結合断片は、中性または塩形態としてワクチン中に製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩としては、限定されるものではないが、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、及び例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマレイン酸などの有機酸を用いて形成される酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄など、ならびに有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノ−エタノール、ヒスチジン、及びプロカインに由来してもよい。

治療的使用のためのｓｃＴＣＲは、当該技術分野における既知のものに従って、用量製剤に適合した様式で、予防的及び／または治療的に有効である量及び様式で投与される。一般的には１回の投薬量当たり約１００〜２０，０００μｇのタンパク質の範囲、より一般的には１回の投薬量当たり約１０００〜１０，０００μｇの範囲である、投与される量。類似の組成物は、例えば、標的リガンドが結合される細胞を検出するために、撮像における使用のための標識ｓｃＴＣＲを使用して、類似の方法で投与され得る。投与が必要とされる活性成分の正確な量は、医師または獣医の判断に依存してもよく、またそれぞれに特有であってもよいが、かかる決定は施術者の技術の範囲内である。

ＴＣＲ生成物は、単回投薬で、２回投薬計画で、例えば、２〜８週間空けて、または複数回投与計画で付与されてもよい。複数回投与計画は、治療の主要なコースが１〜１０以上の別々の投薬量と、続いて応答を維持及び／または強化するために必要に応じてその後の時間間隔で投与される他の投薬量と、を含み得るものである。

説明または例示されるすべての製剤または構成要素の組み合わせは、別段に記載のない限り、本開示の実践のために使用され得る。物質の具体的な名称は、当業者が同一の物質に異なる名称を付け得ることが知られる通り、例示的であるように意図される。化合物が、その化合物の特定のイソマーまたはエナンチオマーが明示されないように、例えば、式または化学名で、本明細書に説明されるとき、その説明は、説明される化合物の各イソマー及びエナンチオマーを個々にまたは任意の組み合わせで含むように意図される。当業者は、具体的に例示されるもの以外の方法、標的リガンド、生物学的に活性な基、開始材料、及び合成法が、過度の実験に頼ることなく本開示の実践に用いられ得ることを理解するであろう。任意のかかる方法、標的リガンド、生物学的に活性な基、開始材料、及び合成法のすべての当該技術分野において既知である機能的等価物は、本開示に含まれるように意図される。例えば、温度範囲、時間範囲、または組成物範囲など本明細書において範囲が付与される場合はいかなるときも、その所与の範囲に含まれるすべての中間範囲及び部分範囲ならびに個々の値は、本開示に含まれるように意図される。

実際の製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌｅｔ．ａｌ．，ｉｎＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１ｐ．１を参照）。

主治医は、毒性のためまたは機能不全のため、投与をどのように及びいつ終了、中断、または調節するかを理解するあろうことに留意するべきである。反対に、主治医はまた、臨床応答が適切でない場合に治療をより高いレベルに調整することも理解するであろう。関心の障害の管理において投与される投薬量の規模は、治療される状態の重篤度及び投与の経路と共に変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、一部には標準的な予測評価法によって評価されてもよい。さらに、投薬量及び恐らくは投薬回数はまた、個々の患者の年齢、体重、及び応答に従って変動するであろう。上述のものに匹敵するプログラムはまた、獣医学においても使用され得る。

治療されている具体的な状態及び選択される標的化法に応じて、かかる薬剤は、製剤化され、全身的または局所的に投与されてもよい。製剤化及び投与の技術は、ＡｌｆｏｎｓｏａｎｄＧｅｎｎａｒｏ（１９９５）に見出され得る。好適な経路としては、例えば、経口、直腸、経皮、膣内、経粘膜、または腸内投与、筋肉内、皮下、または髄内注射を含む非経口送達、及びくも膜下腔内、静脈内、または腹腔内注射が挙げられ得る。

注射のために、本開示の薬剤は、水溶液中で、好ましくは、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝剤などの生理的に適合可能な緩衝剤中で製剤化されてもよい。経粘膜投与のために、浸透される障壁に適切である浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、概して当該技術分野において既知である。

全身投与に好適な用量への本開示の実践のための本明細書に開示される化合物を製剤化するための薬学的に許容される担体の使用は、本開示の範囲内である。担体の適当な選択及び好適な製造実践により、本開示の組成物、特に溶液として製剤化されるものは、静脈内注射などによって非経口的に投与されてもよい。適切な化合物は、当該技術分野において周知である薬学的に許容される担体を使用して、経口投与に好適な用量へ容易に製剤化され得る。かかる担体は、本開示の化合物が、治療される患者による経口摂取のために錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化されることを可能にする。

細胞内に投与されるように意図される薬剤は、当業者に周知である技術を使用して投与されてもよい。例えば、かかる薬剤は、リポソーム内にカプセル化され、次に上記に説明される通りに投与されてもよい。リポソームは、水性内部を有する球状脂質二重層である。リポソーム形成時に水溶液中に存在するすべての分子は、水性内部に組み込まれる。リポソームの内容物は、外部の微環境から保護され、かつ、リポソームは細胞膜と融合するため、細胞質内に効率的に送達される。さらに、それらの疎水性により、小有機分子は細胞内に直接投与され得る。

本開示における使用に好適な薬学的組成物としては、意図される目的を達成するような有効量で活性成分が含有される組成物が挙げられる。有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。

活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への処理を促進する賦形剤及び補助物質を含む好適な薬学的に許容される担体を含有してもよい。経口投与のために製剤化される調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、または溶液の形態であってもよく、遅延放出のために製剤化されるか、または調剤が小腸もしくは大腸に達するときにのみ放出されるように製剤化されるものを含む。

本開示の薬学的組成物は、それ自体既知である様式で、例えば、従来的な混合、溶解、粒状化、糖衣錠作製、レビテーティング（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。

非経口投与のための薬学的な製剤としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液が、好適な油性注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含有してもよい。任意選択的に、懸濁液はまた、好適な安定剤、または化合物の可溶性を増加させて、高濃度溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。

経口使用のための薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、結果として得られた混合物を任意選択的に粉末化し、必要に応じて、好適な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得られ得る。好適な賦形剤は、特に、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖など、セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。所望により、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤が添加されてもよい。

糖衣錠コアは、好適なコーティングを用いて提供される。この目的のために、濃縮糖液が使用されてもよく、それは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに好適な有機溶剤または溶剤混合物を任意選択的に含有してもよい。活性化合物投薬量の異なる組み合わせを特定するまたは特徴付けるために、染料または顔料が錠剤または糖衣錠コーティングに添加されてもよい。

経口的に使用され得る薬学的な調製物としては、ゼラチンから作製される押し込み型カプセル、及びゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作製される軟らかい封止カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意選択的に安定剤の混合物中に、活性成分を含有し得る。軟カプセル中では、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が添加されてもよい。
治療法

高親和性ＴＣＲ及び高親和性ＴＣＲを含む薬学的組成物は、例えば、癌、腫瘍、悪性腫瘍、または腫瘍性疾患もしくは障害を有する患者を治療するために使用されてもよい。一実施形態では、癌を有する患者を治療する方法は、本明細書に説明される高親和性ＴＣＲを投与することを含む。一実施形態では、高親和性ＴＣＲは、ＷＴ１に対して特異的である。一実施形態では、ＴＣＲは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＶβを含む。別の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＶαを含む。一実施形態では、高親和性ＴＣＲは、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む１本鎖ＴＣＲである。別の実施形態では、高親和性ＴＣＲは、例えば、化学療法剤などの治療剤と組み合わせて投与される。また別の実施形態では、高親和性ＴＣＲは、生物学的に活性な基に結合される。

本発明の別の態様は、それを必要とする患者に対するＴ細胞の養子移入のための方法であって、本明細書に説明される野生型ＴＣＲまたは高親和性ＴＣＲのいずれかを発現するＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＷＴ１に対して特異的であるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを用いて遺伝子導入されている。一実施形態では、ＴＣＲは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＶβを含む。別の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＶαを含む。一実施形態では、高親和性ＴＣＲは、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む１本鎖ＴＣＲである。

以下の実施例は、本開示の非限定的な実施例をさらに説明する。

実施例１
ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２抗原に対するより高い親和性のためのＴＣＲの改変
改善された親和性及び安定性のための１本鎖ＴＣＲの発見または発生のために使用される一般的な戦略が、図３に示される。このプロセスは、例証される通り６つのステップに関与する。

１）ディスプレイのための１本鎖ＴＣＲフォーマットとしての、Ｐ２２などのＴ細胞クローンに由来するＶα及びＶβＴＣＲ遺伝子（図１に示される配列、及び配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むＶβと配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含むＶα）のクローン化。Ｖ領域は、ＨＬＡ−Ａ２との複合体中のＨＬＡ−Ａ２制限性抗原ペプチドＷＴ１（配列番号６）を認識する。本発明では、クローンＰ２２に由来するＴＣＲＶ領域遺伝子（例えば、Ｄｏｓｓｅｔｔｅｔａｌ．（２００９）ＭｏｌＴｈｅｒ．１７（４），７４２）を１本鎖フォーマット（Ｖβ−リンカー−Ｖα）としてクローン化し、酵母表面上での発現のために酵母ディスプレイベクター内に導入した（図４）。

２）変異性ライブラリの発生、及び抗Ｖβ抗体による安定化された変異型に関するＦＡＣＳまたは電磁ビーズ選択。１本鎖Ｖα及びＶβ ＴＣＲは安定化定常領域の欠損により不安定であることが多いため、変異性の突然変異誘発ライブラリは、酵母の表面上での安定した発現を可能にする突然変異の安定化のために選択されるように発生されるが、但し、ファージ及び哺乳動物を含むがこれらに現地されない他のディスプレイフォーマットが使用されてもよい。ファージディスプレイベクター及びクローン化は、１０^１１のライブラリサイズを生じ、一方酵母ディスプレイベクター及び同種組み換えステップは、１０^１０のライブラリサイズを生じている（（Ｂｅｎａｔｕｉｌｅｔａｌ．（２０１０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ，２３，１５５−９）。固定化したリガンドへの親和性に基づく結合（ファージディスプレイ）または抗原による磁性粒子選択（酵母ディスプレイ）、または標識ペプチド−ＭＨＣ抗原による蛍光活性化細胞のソート（酵母ディスプレイ）を含む、変異型の選択のために種々の方法が使用されている。折り畳まれたエピトープを認識するＴＣＲＶβに対する抗体の利用、蛍光活性化された細胞ソート（ＦＡＣＳ）、または電磁ビーズ選択が、本実施例において改善された抗体結合を有する変異型を単離するために使用される。

３）変異性ライブラリの選択から単離したｓｃＴＣＲクローンを、熱安定性に関して評定し、安定化された変異型を、親和性成熟のためのテンプレートとして選択し、配列決定する。典型的には、酵母上の増加された表面レベル及び溶液中でのより高い安定性に寄与する単一部位突然変異が特定される。

４）安定化させたｓｃＴＣＲ配列を、通常ＣＤＲ１α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ３β内でのＣＤＲライブラリの発生のためのテンプレートとして使用するが、但し、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、ＣＤＲ２β、及びＨＶ４を含むがこれらに限定されない他の領域も使用され得る。本開示では、電磁ビーズ選択及び／または蛍光活性化細胞ソート（ＦＡＣＳ）を使用することによって、酵母ディスプレイされた変異型をペプチド：ＭＨＣへの改善された結合に関してＣＤＲライブラリから選択するが、但し、ファージディスプレイによるパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）または磁気選択または哺乳動物ディスプレイによるＦＡＣＳを含むがこれらに限定されない他の方法を利用した選択が使用されてもよい。

５）ＣＤＲライブラリの選択から単離したｓｃＴＣＲクローンを、それらが改変されたペプチド：ＭＨＣへの特異的結合に関して評定する。プラスミドを酵母クローンから取り出し、配列決定する。

６）親和性のさらなる改善が必要とされる場合、ステップ５において選択したｓｃＴＣＲクローンが、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ３βなどの突然変異を選択しなかった他のループまたは領域におけるさらなるライブラリの発生のためのテンプレートとして使用され得るが、但し、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ２β、及びＨＶ４を含むがこれらに限定されない他の領域も使用され得る。これらのステップの各々の例は、下記にさらに説明される。

実施例２
Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２との複合体におけるＶα２を使用するヒトＴＣＲＡ６の分析
ＴＣＲはすべて、類似のＩｇ折り畳み及び結合角度を採用し、ｐｅｐＭＨＣのＴＣＲ認識は、ＣＤＲループ上の特異性残基によって完全に媒介される（Ｇａｒｃｉａｅｔａｌ．（２００９）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ，１０，１４３−７、Ｍａｒｒａｃｋｅｔａｌ．（２００８）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２６，１７１−２０３、Ｒｕｄｏｌｐｈｅｔａｌ．（２００６）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２４，４１９−６６））。ＷＴ１ＴＣＲの結晶構造は本開示の時点で利用可能ではないが、ＷＴ１Ｐ２２ＴＣＲの同一のＶα２ドメインを使用したＡ６：Ｔａｘペプチド：ＨＬＡ−Ａ２複合体（ＰＤＢ：１ＡＯ７）の構造（Ｇａｒｂｏｃｚｉｅｔａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ，３８４，１３４−１４１）が示される。複合体の側面図は、６つのＣＤＲを含有する可変ドメインの末端が、結合部位の中心領域がペプチドＴａｘ上に位置付けられた状態でＴａｘ：ＨＬＡ．Ａ２分子上に結合することを示した（図２Ａ）。結晶構造は定常領域αを含まないが、但し、定常領域は全長構築物を安定化させるのに役立つ。上記に説明されるステップ２において選択される安定化突然変異は、フレームワーク領域内で、例えば、Ｖα／Ｖβ接触面、または全長ＴＣＲ内でＣα／ＶαもしくはＣβ／Ｖβ接触面の接合が生じる場所などで選択されることが多い。

６つのＣＤＲループを除く、ＴＣＲが「除去された」Ｔａｘ：ＨＬＡ−Ａ２複合体の上視図が示される（図２Ｂ）。この図は、ＴＣＲがペプチド−ＭＨＣ上の対角位置を採用することを示し、この発見は現在すべてのＴＣＲ：ペプチド−ＭＨＣ構造に関して観察されている。この配向では、２つのＣＤＲ３ループはペプチド上に位置付けられ、またＭＨＣ分子のらせんと主に相互作用するＣＤＲ１及びＣＤＲ２ループに由来する種々の残基が存在する。ステップ４及び６における親和性成熟の目的のために、これらのループは、親和性成熟ライブラリの発生の標的とされることが多いが、但し、他の領域が使用されてもよい。

実施例３
ＷＴ１ＴＣＲの酵母ディスプレイ
改善された安定性（ステップ２）または改善された親和性（ステップ５）に関する選択を実施するために、ＴＣＲ突然変異体のライブラリが立体構造エピトープまたはペプチド：ＭＨＣリガンドをそれぞれ認識する抗体に結合するためにスクリーニングされ得るディスプレイシステムを使用することが必要である。３つのディスプレイシステムが、より高い親和性に関してＴＣＲを改変するために使用されており、また酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、及びＴ細胞（哺乳動物細胞）ディスプレイのプロセスのために使用することができた。リボソーム、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＣＩＳディスプレイなどの代替的なディスプレイ方法も、このプロセスに好適であり得る。これらのすべての場合において、抗原に対して低い親和性を有する野生型ＴＣＲがシステム中にクローン化され、強化された安定性及びペプチド：ＭＨＣリガンドに対する親和性を有するＴＣＲを改変するためのテンプレートとして使用された。これらのシステムのいずれも、単一のＴＣＲがライブラリ及び強化された結合特性を有するＴＣＲの選択のためのテンプレートとして使用される、本明細書に説明されるアプローチに適用することができた。

本実施例では、酵母ディスプレイをプラットフォームとして使用した（図４）。ＷＴ１ＴＣＲを、変異性突然変異誘発を介した安定化突然変異のためのテンプレートとして使用し、選択から単離した安定化させたクローンを、親和性成熟のためのテンプレートとして使用した。

実施例４
安定化させたＷＴ１ＴＣＲ、ＷＴ１−Ｄ１３の変異性のライブラリの構築及び選択
Ｐ２２と呼ばれるＷＴ１反応性細胞株をテンプレートとして利用して、ＷＴ１変異性のライブラリをこれまでに説明されている通りに発生させた（Ｒｉｃｈｍａｎｅｔａｌ．（２００９）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ５０４，３２３−３５０）。したがって、線状ｐＣＴ３０２ベクター、ＷＴ１変異性ＰＣＲ生成物、及び免疫適格ＥＢＹ１００酵母細胞を組み合併せることによって、ヒトＷＴ１変異性ｓｃＴＣＲライブラリを酵母ディスプレイベクター内へ導入した。約２．３×１０^７個の独立クローンを含有する結果として得られたライブラリを、電気穿孔法後の酵母の限界希釈アリコートをプレーティングすることによって判断した。ライブラリを、表１に従うＦＡＣＳによって、ヒトｈＶβ３、抗ｈＶβ３．１ＦＩＴＣＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び抗ｈＶβ３ＦＩＴＣＩｇＭ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を認識する２つの抗体に結合するために選択した。

熱変性研究を使用して、Ｖβ３上で折り畳まれたエピトープの認識のためのこれらの抗体を特定した（データは示されていない）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びヤギ抗マウスＩｇＭＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体を使用して、シグナルを増幅させた。３回の反復ソート中に、Ｖβ３陽性染色集団が現れた（図５Ａ）。３回目のソート後に、改善されたＶβ３蛍光に関してＷＴ１−Ｄ１３と呼ばれるクローンが単離され（図５Ｂ）、８０℃に加熱したときに熱安定性を示した（データは示されていない）。ＷＴ１−Ｄ１３クローンを、親和性成熟のためのテンプレートとして使用した。

実施例５
ＣＤＲ１αライブラリ構築、及びＷＴ１：ＨＬＡ．Ａ２、ＷＴ１．１に対する強化された結合を有するＷＴ１ＴＣＲの選択
重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）によって、変異性のＰＣＲライブラリの選択から単離した安定化ＷＴ１−Ｄ１３クローンを、４個の隣接する残基にわたるＣＤＲ１αライブラリの発生のためのテンプレートとして使用した（Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８，５２８−５３５）。したがって、線状ｐＣＴ３０２ベクター、ＷＴ１−Ｄ１３ＣＤＲ１αライブラリＰＣＲ生成物、及び免疫適格ＥＢＹ１００酵母細胞を組み合わせることによって、ヒトＷＴ１−Ｄ１３ＣＤＲ１Α α ｓｃＴＣＲライブラリを酵母ディスプレイベクター内へ導入した。約３．１×１０^６個の独立クローンを含有する結果として得られたライブラリを、電気穿孔法後の酵母の限界希釈アリコートをプレーティングすることによって判断した。ＷＴ１−Ｄ１３ＣＤＲ１αライブラリを、表２に従ってＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ．Ａ２／Ｉｇダイマー（ＢＤＤｉｍｅｒＸ）への結合に関してＦＡＣＳソートした。

ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇダイマーを用いたＦＡＣＳによる５回の選択後、やや陽性の染色集団が現れ始めた（図６Ａ）。５回目のソート後に単離したクローンＷＴ１−Ｄ１３．１は、ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ．Ａ２に対する穏やかな結合改善を示し、さらなる親和性成熟のためのテンプレートとして使用された（図６Ｂ）。

実施例６
ＣＤＲ３ライブラリ構築、及びＷＴ１：ＨＬＡ．Ａ２、ＷＴ１．１．１へのさらに強化された結合を有するＷＴ１ＴＣＲの選択
ＷＴ１ｓｃＴＣＲの親和し得をさらに改善するために、ＷＴ１−Ｄ１３ＣＤＲ１αライブラリから単離したＷＴ１−Ｄ１３．１クローンをテンプレートとして使用して、ＣＤＲ３ライブラリを発生させた。各ＣＤＲ３中に５個の隣接するコドンにわたる縮重コドンを同時に作製する重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲによって、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３ライブラリを発生さた。したがって、線状ｐＣＴ３０２ベクター、ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３ＰＣＲ生成物（即ち、ＣＤＲ３α１、ＣＤＲ３α２、ＣＤＲ３β１、またはＣＤＲ３β２ライブラリ）、及び免疫適格ＥＢＹ１００酵母細胞を組み合わせることによって、各ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３ライブラリを酵母ディスプレイベクター内へ導入した。４つの結果として得られたライブラリをプールし、結果として得られた組み合わせられたライブラリは、電気穿孔法後の酵母の限界希釈アリコートをプレーティングすることによって判定するときに、約３．５×１０^６個の独立クローンを含有した。ＷＴ１−Ｄ１３ＣＤＲ３を組み合わせたライブラリを、ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ．Ａ２／Ｉｇダイマー（ＢＤＤｉｍｅｒＸ）への結合に関して表３のチャートに従ってＦＡＣＳソートした。

ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号８）／ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇダイマーを用いたＦＡＣＳによる３回の選択後、陽性染色集団が現れ始めた（図７Ａ）。３回目のソート後に単離したクローンＷＴ１−Ｄ１３．１．１は、ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号８）／ＨＬＡ．Ａ２に対する増加した結合を示した（図７Ｂ）。

実施例７
高親和性ＷＴ１ＴＣＲ、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１の結合分析
ＣＤＲ３ライブラリの選択から単離したＷＴ１−Ｄ１３．１．１クローンの結合を評定するために、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１をディスプレイする酵母を、大腸菌から発現及び精製したＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号６）／ＨＬＡ．Ａ２ダイマーＨＬＡ−Ａ２−Ｉｇ）及びモノマーで滴定した。ＷＴ−１／Ａ２ダイマーは１６０ｐＭ〜５００ｎＭで分析し（図８Ａ）、モノマーは６．４ｎＭ〜４μＭで分析した（図８Ｂ）。次に、酵母細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＷＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２複合体の濃度に対して各ヒストグラムに関してプロットした。非線形回帰分析を使用して値を正規化し、ディマー（ｄｉｍｍｅｒ）及びモノマーに関して、２５ｎＭ及び２４０ｎＭのＫ_{Ｄ，ａｐｐ}値をそれぞれ決定した（図８Ｃ及び８Ｄ）。したがって、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１はナノモル親和性を示した。

実施例８
可溶性高親和性ＷＴ１ＴＣＲ、ＷＴ１−Ｄ１３．１．１の結合分析
ＷＴ１−Ｄ１３．１．１ｓｃＴｖが高い親和性でＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に特異的に結合することをさらに示すために、可溶性形態のＷＴ１−Ｄ１３．１．１ｓｃＴｖを、大腸菌封入体及びＣ末端ＢｉｒＡタグを介したビオチン化から発現させ、再折り畳みした（Ａｇｇｅｎｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４，３６１−７２、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．（２００７）ＪＥｘｐＭｅｄ，２０４，４９−５５）。ヒト細胞株Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）を、１μＭのＴａｘ、ＭＡＲＴ−１、またはＷＴ１ペプチドと共に定温放置し、洗浄した。ペプチドを事前添加していないＴ２細胞（図９Ａ）、または陰性ペプチドＴａｘを事前添加したＴ２細胞（４ｎＭ〜１μＭ）（図９Ｂ）、ヌルペプチドＭＡＲＴ−１を事前添加したＴ２細胞（４ｎＭ〜１μＭ）（図９Ｃ）、ＷＴ１を事前添加したＴ２細胞（４ｎＭ〜１μＭ）（図９Ｄ）上で滴定した。細胞を洗浄し、ＳＡ−ＰＥと共に定温放置し、フローサイトメトリーによって分析した。ＷＴ１ペプチドを添加した細胞のみがＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲによって結合され（図９Ａ〜Ｄ）、可溶性ＴＣＲはＷＴ１に対して特異的であることを示した。ＷＴ１滴定のＴＣＲ濃度に対するＭＦＩのプロットの非線形回帰は、可溶性ＴＣＲが２６０ｎＭの最小Ｋ_Ｄ値を示すことを示した（図９Ｅ）。

実施例９
ＷＴ１抗原に対する改善された親和性に関する単離されたＴＣＲの配列分析
ＷＴ１特異性（Ｐ２２、Ｄ１３、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１）１本鎖ＴＣＲの配列が、単離したプラスミドから決定され、図１に示される。Ｐ２２、Ｄ１３、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１のＶβ鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１、２１、２１、３、及び３に記載され、Ｐ２２、Ｄ１３、Ｄ１３．１、Ｄ１３．０．１、及びＤ１３．１．１のＶα鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、２２、４、２、及び４に記載される。Ｄ１３．０．１は、最終的な親和性成熟ｓｃＴＣＲＤ１３．１．１（配列番号５）からＣＤＲ１α突然変異体を除去することによって構築されたことに留意されたい。図１の下線付きのアミノ酸位置は、安定化突然変異のための変異性ライブラリ選択から生じた突然変異を示す。ボックス内のアミノ酸位置は、ＣＤＲライブラリから選択された親和性強化突然変異体を示す。

実施例１０
ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞におけるＷＴ１−Ｐ２２、ＷＴ１−Ｄ１３．１、ＷＴ１−Ｄ１３．０．１、及びＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲのインビトロ活性
Ｔ細胞における異なるＷＴ１特異性ＴＣＲの活性を評定するために、ＣＤ８（図１０Ａ）及びＣＤ４（図１０Ｂ）を、ＡＡＤ遺伝子組み換えマウスから単離した（これらは、ＨＬＡ−Ａ２のα１及びα２ドメインならびにマウスＤ^ｂのα３ドメインからなるハイブリッドクラスＩ遺伝子を有するマウスであり、これらのＡＡＤマウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である）。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体に結合したビーズを用いて細胞を活性化させ、次に、Ｃｈｅｒｖｉｎｅｔａｌ，（２０１３）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０（６）：６３４−４４に説明される通り、ＷＴ１−Ｐ２２、ＷＴ１−Ｄ１３．１、ＷＴ１−Ｄ１３．０．１、及びＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲを形質導入した（配列は、Ｄ１３安定化突然変異、Ｖβ Ｆ４８Ｓ、及びＤ５１Ｇを含有しなかった）。Ｔ細胞を、ＡＡＤマウスに由来する脾細胞のコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖｉｌｉｎ）Ａ刺激によって調製した異なる濃度のペプチドＷＴ１及びＡＡＤ芽細胞と共に定温放置した。２４時間の定温放置後、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ濃度に関して上清を分析した。ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｄ１３．０．１及びＤ１３．１．１ＴＣＲによって最も高い活性を示した（図１０Ａ）。ＣＤ４Ｔ細胞は、Ｄ１３．１．１ＴＣＲによってのみ活性化され、Ｄ１３．１．１はＣＤ８とは独立に活性を媒介し得ることを示している（図１０Ｂ）。ＭＡＲＴ１などの他のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドとの反応性は観察されなかった。

実施例１１
ＣＤ８Ｔ細胞中のＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲは、ＷＴ１に構造的に類似したヒトペプチドと反応性ではない
高親和性ＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲの特異性をさらに決定するために、ＷＴ１ペプチドに構造的に類似したペプチドによるインビトロ活性を評定した。ＷＴ１ペプチドに構造的に類似したペプチドに関して、ＷＴ１の９個の残基における保存的突然変異に基づいてプロテオーム探索を実施した。次に、予測アルゴリズムを介してＨＬＡ−Ａ２に対する結合能力に関してヒトプロテオーム中に存在するペプチドにアクセスした。最も高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合すると予測された１０個のペプチド（図１１）を合成し、高親和性ＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲを形質導入した活性化されたＣＤ８Ｔ細胞に対する能力に関して試験した。これらのペプチドのいずれも活性を示さず、このＴＣＲは、これらの１０個の構造的に類似したペプチドと共に提示されるときに特異性を維持することを示唆している。

実施例１２
ＷＴ１、ＷＴ１−Ｄ１３．１、及びＷＴ１−Ｄ１３．１．１ＴＣＲの治療的フォーマット
より高い親和性のＴＣＲは、対応する抗原を発現する細胞を標的とするために種々のフォーマットにおいて使用され得ることは、現在よく知られている。したがって、上記に示される改変戦略から発生されるＴＣＲは、図１２に例証される通り、可溶性形態で、または養子Ｔ細胞療法のためのＴＣＲ遺伝子療法においてのいずれかで使用され得ることは、明らかである。

材料及び方法
抗体、ペプチド：ＨＬＡ−Ａ２、ＭＡＣＳ、及びフローサイトメトリー試薬
酵母表面発現を検出するために使用される抗体としては、抗ＨＡエピトープタグ（クローンＨＡ．１１、Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗ｈＶβ３ＦＩＴＣ抗体（ＣｌｏｎｅＣＨ９２、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）、抗ｈＶβ３．１ＦＩＴＣ抗体（Ｃｌｏｎｅ８Ｆ１０、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ｈＶβ２０抗体（ＣｌｏｎｅＥＬＬ１．４、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）、我々の実験室で発生された抗Ｖα２モノクローナル抗体（データは示されていない）、ヤギ抗マウスＩｇＭＡＰＣ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）_２ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ：ＰＥ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、及びＭＡＣＳマイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｌＢｉｏｔｅｃ）が挙げられる。

ＨＬＡ−Ａ２に結合するペプチド［ＷＴ_{１２６−１３４}：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号６）］を、ＰｅｎｎＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ（Ｈｅｒｓｈｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙにおいて、標準的なＦ−ｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）化学によって合成した。ＦＡＣＳ及びフローサイトメトリー分析のために、組み換え可溶性ダイマーＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ融合タンパク質（ＢＤ（商標）ＤｉｍｅｒＸ）を使用した。加えて、ＵＶ光下でのＵＶ開裂可能ペプチドの別のＨＬＡ．Ａ２制限性ペプチドとの交換によって発生させたモノマーＨＬＡ．Ａ２−ビオチン試薬を、フローサイトメトリー及びＭＡＣＳ選択のために利用した（Ｒｏｄｅｎｋｏｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔＰｒｏｔｏｃ，１，１１２０−１１３２、Ｔｏｅｂｅｓｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔＭｅｄ，１２，２４６−２５１）。

酵母ディスプレイベクターにおけるｓｃＴｖのクローン化及び発現
ＴＣＲ可変領域断片（ｓｃＴｖ）を、Ｔｒｐ培地中の増殖を可能にするガラクトース誘導性ＡＧＡ２融合体を含有する酵母ディスプレイプラスミドｐＣＴ３０２（Ｖβ−Ｌ−Ｖα）中で発現させた（ＢｏｄｅｒａｎｄＷｉｔｔｒｕｐ（２０００）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ，３２８，４３０−４４４）。ｓｃＴｖ遺伝子の誘導は、形質転換されたＥＢＹ１００酵母細胞の選択媒体中での定常期への増殖、続いてガラクトース含有培地への移入に関与する。テンプレートＷＴ１１本鎖ＴＣＲ遺伝子を、構築物のＶα２ドメイン中にＦ４９Ｓ突然変異を有する状態でＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）によって合成した（Ａｇｇｅｎｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ，２４，３６１−３７２）。

ＷＴ１特異性ＴＣＲ遺伝子を、ＣＴＬクローンから単離し（ＰｈｉｌｌｉｐＧｒｅｅｎｂｅｒｇからのＷＴ１に対するＴＣＲ遺伝子、例えば、Ｄｏｓｓｅｔｔｅｔａｌ．（２００９）ＭｏｌＴｈｅｒ．１７（４），７４２）、その遺伝子をＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成し、１本鎖フォーマット（Ｖβ−リンカー−Ｖα）としてクローン化し、酵母の表面上での発現のために酵母ディスプレイベクター内へ導入した。ｓｃＴｖｓｈは、リンカー領域ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号８）によって付着される可変的な含有物（ｖａｒｉａｂｌｅｃｏｎｔａｉｎｓ）で構成された（Ｈｏｏｅｔａｌ．（１９９２）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，８９，４７５９−４７６３、Ｗｅｂｅｒｅｔａｌ．（２００５）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１０２，１９０３３−１９０３８、Ａｇｇｅｎｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ，２４，３６１−３７２）。ｓｃＴｖを、ｐＣＴ３０２のＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位内へ導入した。

変異したｓｃＴｖ酵母ディスプレイライブラリの発生、ディスプレイ、及び選択
変異性のＰＣＲを使用して、これまでに説明されている通りに無作為突然変異を発生させた（Ｒｉｃｈｍａｎｅｔａｌ．（２００９）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，４６，９０２−９１６）。同時に４〜５個の隣接するコドンにわたる重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲによって、ＣＤＲ１及び３ライブラリを発生させた（Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８，５２８−５３５）。

ＷＴ１−Ｄ１３ＣＤＲ１αライブラリのために、以下のプライマー対を利用してｐｒｅ−ＳＯＥＰＣＲ生成物を発生させた：５’−ＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＴＡＴ−３’（Ｓｐｌｉｃｅ４Ｌ）（配列番号９）及び５’−ＡＣＧＡＴＣＧＣＴＡＴＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡＣＡＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＧＣＴ−３’（配列番号１０）、ならびに５’−ＡＴＴＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴＣＧＴＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＣＣＣＣＧ−３’（配列番号１１）及び５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（Ｔ７）（配列番号１２）。各対応するＰｒｅ−ＳＯＥを用いて、Ｔ７及びＳｐｌｉｃｅ４Ｌの両方に沿ってＳＯＥＰＣＲを実施した。

ＷＴ１−Ｄ１３．１ＣＤＲ３ライブラリのために、以下のプライマー対を利用して、４つのライブラリの各々に関してｐｒｅ−ＳＯＥＰＣＲ生成物を発生させた：β１：５’−ＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＴＡＴ−３’（Ｓｐｌｉｃｅ４Ｌ）（配列番号９）、及び５’−ＴＧＣＡＣＡＣＡＧＧＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１３）、及び５’−ＡＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＡＣＴＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＧＣＡＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＧＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＧＡＴＴＡＡＣＧＧＴＧ−３’（配列番号１４）及び５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（Ｔ７）（配列番号１２）；β２：Ｓｐｌｉｃｅ４Ｌ（配列番号９）及び５’−ＴＧＣＡＣＡＣＡＧＧＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１５）、及び５’−ＡＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＡＣＴＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＣＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＧＡＴＴＡＡＣＧＧＴＧ−３’（配列番号１６）及びＴ７（配列番号１２）；α１：Ｓｐｌｉｃｅ４Ｌ（配列番号９）及び５’−ＧＧＣＧＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＧＣＧＣＴＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＣＡＣＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＧＡ−３’（配列番号１７）、及び５’−ＣＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＣＴＴＡＣＣＴＧＴＧＣＧＣＣＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＣＴＣＧＣＴＴＡＡＴＧ−３’（配列番号１８）及びＴ７（配列番号１２）；α２：Ｓｐｌｉｃｅ４Ｌ（配列番号９）及び５’−ＧＧＣＧＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＧＣＧＣＴＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＣＡＣＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＧＡ−３’（配列番号１９）、及び５’−ＣＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＣＴＴＡＣＣＴＧＴＧＣＧＣＣＧＣＧＡＡＴＡＡＣＧＣＧＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＣＴＣＧＣＴＴＡＡＴＧ−３’（配列番号２０）及びＴ７（配列番号１２）。

ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ消化ｐＣＴ３０２に沿って変異性またはＳＯＥＰＣＲ生成物を電気穿孔することにより、ＥＢＹ１００酵母における同種組み換えによって酵母ライブラリを作製した（Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８，５２８−５３５）。ライブラリを、ガラクトース含有培地（ＳＧ−ＣＡＡ）内に４８時間誘導し、１ｍＬの１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、抗体またはペプチド：ＭＨＣ試薬を用いて図４Ａ、５Ａ、６Ａ、８Ａ、及び９Ａに示される濃度で染色した。細胞を洗浄し（１ｍｌ、１％ＰＢＳ／ＢＳＡ）、最も蛍光であった細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）高速ソーターを使用してか、またはＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＭｉｌｔｅｎｙｌＢｉｏｔｅｃ）上でＭＡＣＳＬＳカラムによって選択した。単離したクローンの熱安定性を試験するために、染色プロトコルの前に酵母を高温で３０分間定温放置した（データは示されていない）。

高親和性クローンの単離及び染色
選択の後、限界希釈物をプレーティングすることによってライブラリクローンを単離した。コロニーを増殖させ、ガラクトース含有培地（ＳＧ−ＣＡＡ）内に４８時間誘導し、１ｍＬの１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、種々の濃度のペプチド／ＨＬＡ．Ａ２ＤｉｍｅｒＸ、ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）_２ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体、または種々の濃度のＵＶ交換ペプチド／ＨＬＡ．Ａ２、ＳＡ−ＰＥを用いて染色した。細胞を洗浄し（１ｍｌ、１％ＰＢＳ／ＢＳＡ）、ＡｃｃｕｒｉＣ６フローサイトメータで分析した。

Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）ＹｅａｓｔＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＩＩ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してプラスミドを回収し、ＳｕｂｃｌｏｎｉｎｇＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標）ＤＨ５α（商標）ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への熱ショック形質転換により大腸菌内へ導入した。大腸菌細胞を増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドを単離した。個々のクローンの配列を、サンガー法シーケンシングによって決定した。

参照による援用及び変異形態に関する記載

本明細書に記載されるすべての参考文献、例えば、発行または付与された特許または等価物を含む特許文書、特許出願及び公開、ならびに非特許文献または他の原資料は、各参考文献が本出願において本開示と少なくとも部分的に矛盾しない範囲で、あたかも参照により個々に援用されるかのようにその全体が参照により本明細書に援用され、（例えば、部分的に矛盾する参考文献は、その参考文献の部分的に矛盾する部分を除き参照により援用される）。

本明細書に言及されるすべての特許及び公開は、本開示が付随する当該技術分野の技術者の技術のレベルを示す。本明細書に記載される参考文献は、最先端技術を、場合によりそれらの出願日時点のものを示すようにその全体が参照により本明細書に援用され、この情報が本明細書において用いられ得ることが意図され、また必要に応じて、先行研究における特定の実施形態を除外し（例えば、請求権を放棄する）、本明細書内の開示における方法または材料の特定の包含を伴うことなく最先端の方法または材料を使用する。例えば、化合物が特許請求される場合、本明細書に開示される参考文献中に開示される特定の化合物を含む先行研究において（特に参照される特許文書において）既知である化合物は、特許請求の範囲に含まれるように意図されないことが理解されるべきである。

本明細書においてマーカッシュ群または他の群分類が使用されるとき、その群のすべての個々の構成員ならびにすべての可能な組み合わせ及び部分的組み合わせは、本開示に個々に含まれるように意図される。

本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、それらは、言及される記載の特長、整数、ステップ、または構成要素の存在を明示するものとして解釈されるべきであるが、１つ以上の他の特長、整数、ステップ、構成要素、またはその群の存在または追加を除外するべきではない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」が、例えば、「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）／なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）／から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」などの文法的に類似の用語に任意選択的に置き換えられて、それによって必ずしも同一の広がりを有するとは限らないさらなる実施形態を説明する、開示の別個の実施形態も包含されるように意図される。明確化のために、本明細書で使用するとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「によって特徴付けられる」と同義語であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の記載されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で使用するとき、「からなる」は、特許請求の範囲における要素に明示されていない任意の要素、ステップ、構成要素、または成分を除外する。本明細書で使用するとき、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的及び新規の特徴に物質的に影響を及ぼさない（例えば、活性成分に影響を及ぼさない）材料またはステップを除外しない。本明細書における各例において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる」、及び「からなる」のうちの任意のものは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。本明細書において例証的に説明される本開示は、本明細書において具体的には開示されない任意の要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の不在下で実践されてもよい。

本開示を、種々の具体的かつ好ましい実施形態及び技術を参照して説明してきた。しかしながら、多数の変異形態及び修正形態が本開示の精神及び範囲内でなされ得ることが理解されるべきである。本明細書に具体的に説明されるもの以外の組成物、方法、機器、機器要素、材料、任意選択的な特長、手順、及び技術が、過度の実験に頼ることなく本明細書に広範に開示される通りに本開示の実践に適用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。本明細書に説明される組成物、方法、機器、機器要素、材料、手順、及び技術の当該技術分野において既知であるすべての機能的等価物、ならびにそれらの一部分は、本開示によって包含されるように意図される。範囲が開示される場合はいかなるときも、すべての部分範囲及び個々の値が包含されるように意図される。本開示は、図面に示されるかまたは本明細書に例示されるものを含む、開示される実施形態によって限定されるべきではなく、それらは限定のためではなく例または例証のために付与されている。本明細書に提供されるいくつかの参考文献は、追加の開始材料、追加の合成方法、及び追加の分析方法、及び本開示の追加の使用に関する詳細を提供するために、参照により本明細書に援用される。

当業者は、本開示が目標を実行し、記述される目的及び利点ならびに本明細書に本来備わる目的及び利点を得るように十分に適応されることを、容易に理解するであろう。好ましい実施形態の目下の代表的なものとして本明細書に説明される組成物及び方法及び付属の方法は、例示的であり、本開示の範囲に対する限定であるように意図されない。本開示の趣旨に包含されるそれらの変化及び他の使用は、当業者には想到されるであろう。
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１１．ＢｏｏｎＴ．ａｎｄＯｌｄＬ．Ｊ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒｔｕｍｏｒａｎｔｉｇｅｎｓ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ９，６８１−３．
１２．ＢｏｒｂｕｌｅｖｙｃｈＯ．Ｙ．，ＳａｎｔｈａｎａｇｏｐｏｌａｎＳ．Ｍ．，ＨｏｓｓａｉｎＭ．ａｎｄＢａｋｅｒＢ．Ｍ．（２０１１）ＴＣＲｓｕｓｅｄｉｎｃａｎｃｅｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｗｉｔｈＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａｔｕｍｏｒａｎｔｉｇｅｎｓｖｉａｄｉｓｔｉｎｃｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８７，２４５３−６３．
１３．ＢｒｏｗｅｒＶ．（１９９７）Ｅｎｂｒｅｌ’ｓｐｈａｓｅＩＩＩｒｅｉｎｆｏｒｃｅｓｐｒｏｓｐｅｃｔｓｉｎＲＡ［ｎｅｗｓ］．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５，１２４０．
１４．ＢｕｌｅｋＡ．Ｍ．，ＣｏｌｅＤ．Ｋ．，ＳｋｏｗｅｒａＡ．，ＤｏｌｔｏｎＧ．，ＧｒａｓＳ．，ＭａｄｕｒａＦ．，ＦｕｌｌｅｒＡ．，ＭｉｌｅｓＪ．Ｊ．，ＧｏｓｔｉｃｋＥ．，ＰｒｉｃｅＤ．Ａ．，ＤｒｉｊｆｈｏｕｔＪ．Ｗ．，ＫｎｉｇｈｔＲ．Ｒ．，ＨｕａｎｇＧ．Ｃ．，ＬｉｓｓｉｎＮ．，ＭｏｌｌｏｙＰ．Ｅ．，ＷｏｏｌｄｒｉｄｇｅＬ．，ＪａｋｏｂｓｅｎＢ．Ｋ．，ＲｏｓｓｊｏｈｎＪ．，ＰｅａｋｍａｎＭ．，ＲｉｚｋａｌｌａｈＰ．Ｊ．ａｎｄＳｅｗｅｌｌＡ．Ｋ．（２０１２）ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｋｉｌｌｉｎｇｏｆｈｕｍａｎｂｅｔａｃｅｌｌｓｂｙＣＤ８（＋）Ｔｃｅｌｌｓｉｎｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓ．ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ１３，２８３−９．
１５．ＣｈｅｅｖｅｒＭ．Ａ．，ＡｌｌｉｓｏｎＪ．Ｐ．，ＦｅｒｒｉｓＡ．Ｓ．，ＦｉｎｎＯ．Ｊ．，ＨａｓｔｉｎｇｓＢ．Ｍ．，ＨｅｃｈｔＴ．Ｔ．，ＭｅｌｌｍａｎＩ．，ＰｒｉｎｄｉｖｉｌｌｅＳ．Ａ．，ＶｉｎｅｒＪ．Ｌ．，ＷｅｉｎｅｒＬ．Ｍ．ａｎｄＭａｔｒｉｓｉａｎＬ．Ｍ．（２００９）Ｔｈｅｐｒｉｏｒｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ：ａｎａｔｉｏｎａｌｃａｎｃｅｒｉｎｓｔｉｔｕｔｅｐｉｌｏｔｐｒｏｊｅｃｔｆｏｒｔｈｅａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１５，５３２３−３７．
１６．ＣｈｅｒｖｉｎＡ．Ｓ．，ＡｇｇｅｎＤ．Ｈ．，ＲａｓｅｍａｎＪ．Ｍ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２００８）ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｈｉｇｈｅｒａｆｆｉｎｉｔｙＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｓｉｎｇａＴｃｅｌｌｄｉｓｐｌａｙｓｙｓｔｅｍ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ３３９，１７５−８４．
１７．ＣｈｅｒｖｉｎＡＳ，ＳｔｏｎｅＪＤ，ＳｏｔｏＣＭ，ＥｎｇｅｌｓＢ，ＳｃｈｒｅｉｂｅｒＨ，ＲｏｙＥＪ，ａｎｄＫｒａｎｚＤＭ．（２０１３）ＤｅｓｉｇｎｏｆＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｌｉｂｒａｒｉｅｓｗｉｔｈｄｉｖｅｒｓｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｔｏｅｘａｍｉｎｅａｄｏｐｔｉｖｅＴ−ｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０（６）：６３４−４４
１８．ＣｏｌｂｙＤ．Ｗ．，ＫｅｌｌｏｇｇＢ．Ａ．，ＧｒａｆｆＣ．Ｐ．，ＹｅｕｎｇＹ．Ａ．，ＳｗｅｒｓＪ．Ｓ．ａｎｄＷｉｔｔｒｕｐＫ．Ｄ．（２００４）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｆｆｉｎｉｔｙｂｙｙｅａｓｔｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ３８８，３４８−５８．
１９．ＤａｖｉｓＭ．Ｍ．ａｎｄＢｊｏｒｋｍａｎＰ．Ｊ．（１９８８）Ｔ−ｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓａｎｄＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ３３４，３９５−４０２．
２０．ＤａｖｉｓＭ．Ｍ．，ＢｏｎｉｆａｃｅＪ．Ｊ．，ＲｅｉｃｈＺ．，ＬｙｏｎｓＤ．，ＨａｍｐｌＪ．，ＡｒｄｅｎＢ．ａｎｄＣｈｉｅｎＹ．（１９９８）ＬｉｇａｎｄｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙａｌｐｈａｂｅｔａＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ１６，５２３−５４４．
２１．ＤｉｎｇＹ．Ｈ．，ＢａｋｅｒＢ．Ｍ．，ＧａｒｂｏｃｚｉＤ．Ｎ．，ＢｉｄｄｉｓｏｎＷ．Ｅ．ａｎｄＷｉｌｅｙＤ．Ｃ．（１９９９）ＦｏｕｒＡ６−ＴＣＲ／ｐｅｐｔｉｄｅ／ＨＬＡ−Ａ２ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｔｈａｔｇｅｎｅｒａｔｅｖｅｒｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔＴｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｓａｒｅｎｅａｒｌｙｉｄｅｎｔｉｃａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１１，４５−５６．
２２．ＦｏｏｔｅＪ．ａｎｄＥｉｓｅｎＨ．Ｎ．（２０００）ＢｒｅａｋｉｎｇｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｃｅｉｌｉｎｇｆｏｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７，１０６７９−８１．
２３．ＧａｒｂｏｃｚｉＤ．Ｎ．，ＧｈｏｓｈＰ．，ＵｔｚＵ．，ＦａｎＱ．Ｒ．，ＢｉｄｄｉｓｏｎＷ．Ｅ．ａｎｄＷｉｌｅｙＤ．Ｃ．（１９９６）ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｂｅｔｗｅｅｎｈｕｍａｎＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｖｉｒａｌｐｅｐｔｉｄｅａｎｄＨＬＡ−Ａ２．Ｎａｔｕｒｅ３８４，１３４−１４１．
２４．ＧａｒｃｉａＫ．Ｃ．，ＡｄａｍｓＪ．Ｊ．，ＦｅｎｇＤ．ａｎｄＥｌｙＬ．Ｋ．（２００９）ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｏｆＴＣＲｇｅｒｍｌｉｎｅｂｉａｓｆｏｒＭＨＣｉｓｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇｌｙｓｉｍｐｌｅ．ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ１０，１４３−７．
２５．ＨａｉｄａｒＪ．Ｎ．，ＰｉｅｒｃｅＢ．，ＹｕＹ．，ＴｏｎｇＷ．，ＬｉＭ．ａｎｄＷｅｎｇＺ．（２００９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄｄｅｓｉｇｎｏｆａＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｌｅａｄｓｔｏｎｅａｒｌｙ１００−ｆｏｌｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙｆｏｒｐｅｐＭＨＣ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ７４，９４８−６０．
２６．ＨａｒｋｉｏｌａｋｉＭ．，ＨｏｌｍｅｓＳ．Ｌ．，ＳｖｅｎｄｓｅｎＰ．，ＧｒｅｇｅｒｓｅｎＪ．Ｗ．，ＪｅｎｓｅｎＬ．Ｔ．，ＭｃＭａｈｏｎＲ．，ＦｒｉｅｓｅＭ．Ａ．，ｖａｎＢｏｘｅｌＧ．，ＥｔｚｅｎｓｐｅｒｇｅｒＲ．，ＴｚａｒｔｏｓＪ．Ｓ．，ＫｒａｎｃＫ．，ＳａｉｎｓｂｕｒｙＳ．，ＨａｒｌｏｓＫ．，ＭｅｌｌｉｎｓＥ．Ｄ．，ＰａｌａｃｅＪ．，ＥｓｉｒｉＭ．Ｍ．，ｖａｎｄｅｒＭｅｒｗｅＰ．Ａ．，ＪｏｎｅｓＥ．Ｙ．ａｎｄＦｕｇｇｅｒＬ．（２００９）Ｔｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｄｕｅｔｏｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｃｏｍｍｏｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３０，３４８−５７．
２７．ＨａｗｓｅＷ．Ｆ．，ＣｈａｍｐｉｏｎＭ．Ｍ．，ＪｏｙｃｅＭ．Ｖ．，ＨｅｌｌｍａｎＬ．Ｍ．，ＨｏｓｓａｉｎＭ．，ＲｙａｎＶ．，ＰｉｅｒｃｅＢ．Ｇ．，ＷｅｎｇＺ．ａｎｄＢａｋｅｒＢ．Ｍ．（２０１２）Ｃｕｔｔｉｎｇｅｄｇｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙｄｒｉｖｅｎＴｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８８，５８１９−２３．
２８．ＨｏｌｌｅｒＰ．Ｄ．，ＣｈｌｅｗｉｃｋｉＬ．Ｋ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２００３）ＴＣＲｓｗｉｔｈｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｆｏｒｆｏｒｅｉｇｎｐＭＨＣｓｈｏｗｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ４，５５−６２．
２９．ＨｏｌｌｅｒＰ．Ｄ．，ＨｏｌｍａｎＰ．Ｏ．，ＳｈｕｓｔａＥ．Ｖ．，Ｏ’ＨｅｒｒｉｎＳ．，ＷｉｔｔｒｕｐＫ．Ｄ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２０００）ＩｎｖｉｔｒｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｗｉｔｈｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｆｏｒｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７，５３８７−９２．
３０．ＨｏｌｌｉｇｅｒＰ．，ＰｒｏｓｐｅｒｏＴ．ａｎｄＷｉｎｔｅｒＧ．（１９９３）”Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ”：ｓｍａｌｌｂｉｖａｌｅｎｔａｎｄｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９０，６４４４−８．
３１．ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍＨ．Ｒ．（２００５）Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｉｅｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２３，１１０５−１６．
３２．ＪＪａｒｖｉｓＬ．Ｍ．（２０１２）ＲｅｔｈｉｎｋｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙ−ＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ．ＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ９０，１２−１８．
３３．ＫｅｓｓｅｌｓＨ．Ｗ．，ｖａｎＤｅｎＢｏｏｍＭ．Ｄ．，ＳｐｉｔｓＨ．，ＨｏｏｉｊｂｅｒｇＥ．ａｎｄＳｃｈｕｍａｃｈｅｒＴ．Ｎ．（２０００）ＣｈａｎｇｉｎｇＴｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｂｙｒｅｔｒｏｖｉｒａｌＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｄｉｓｐｌａｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７，１４５７８−８３．
３４．ＫｉｅｋｅＭ．Ｃ．，ＳｈｕｓｔａＥ．Ｖ．，ＢｏｄｅｒＥ．Ｔ．，ＴｅｙｔｏｎＬ．，ＷｉｔｔｒｕｐＫ．Ｄ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（１９９９）ＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｍｕｔａｎｔｓｆｒｏｍａｙｅａｓｔｓｕｒｆａｃｅ− ｄｉｓｐｌａｙｌｉｂｒａｒｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６，５６５１−６．
３５．ＬａｕｃｋＦ．，ＳｍｉｔｈＣ．Ａ．，ＦｒｉｅｄｌａｎｄＧ．Ｆ．，ＨｕｍｐｈｒｉｓＥ．Ｌ．ａｎｄＫｏｒｔｅｍｍｅＴ．（２０１０）ＲｏｓｅｔｔａＢａｃｋｒｕｂ−−ａｗｅｂｓｅｒｖｅｒｆｏｒｆｌｅｘｉｂｌｅｂａｃｋｂｏｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇａｎｄｄｅｓｉｇｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３８，Ｗ５６９−７５．
３６．ＬｉＹ．，ＭｏｙｓｅｙＲ．，ＭｏｌｌｏｙＰ．Ｅ．，ＶｕｉｄｅｐｏｔＡ．Ｌ．，ＭａｈｏｎＴ．，ＢａｓｔｏｎＥ．，ＤｕｎｎＳ．，ＬｉｄｄｙＮ．，ＪａｃｏｂＪ．，ＪａｋｏｂｓｅｎＢ．Ｋ．ａｎｄＢｏｕｌｔｅｒＪ．Ｍ．（２００５）ＤｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓｗｉｔｈｐｉｃｏｍｏｌａｒａｆｆｉｎｉｔｉｅｓｂｙｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２３，３４９−５４．
３７．ＬｉｄｄｙＮ．，ＢｏｓｓｉＧ．，ＡｄａｍｓＫ．Ｊ．，ＬｉｓｓｉｎａＡ．，ＭａｈｏｎＴ．Ｍ．，ＨａｓｓａｎＮ．Ｊ．，ＧａｖａｒｒｅｔＪ．，ＢｉａｎｃｈｉＦ．Ｃ．，ＰｕｍｐｈｒｅｙＮ．Ｊ．，ＬａｄｅｌｌＫ．，ＧｏｓｔｉｃｋＥ．，ＳｅｗｅｌｌＡ．Ｋ．，ＬｉｓｓｉｎＮ．Ｍ．，ＨａｒｗｏｏｄＮ．Ｅ．，ＭｏｌｌｏｙＰ．Ｅ．，ＬｉＹ．，ＣａｍｅｒｏｎＢ．Ｊ．，ＳａｍｉＭ．，ＢａｓｔｏｎＥ．Ｅ．，ＴｏｄｏｒｏｖＰ．Ｔ．，ＰａｓｔｏｎＳ．Ｊ．，ＤｅｎｎｉｓＲ．Ｅ．，ＨａｒｐｅｒＪ．Ｖ．，ＤｕｎｎＳ．Ｍ．，ＡｓｈｆｉｅｌｄＲ．，ＪｏｈｎｓｏｎＡ．，ＭｃＧｒａｔｈＹ．，ＰｌｅｓａＧ．，ＪｕｎｅＣ．Ｈ．，ＫａｌｏｓＭ．，ＰｒｉｃｅＤ．Ａ．，ＶｕｉｄｅｐｏｔＡ．，ＷｉｌｌｉａｍｓＤ．Ｄ．，ＳｕｔｔｏｎＤ．Ｈ．ａｎｄＪａｋｏｂｓｅｎＢ．Ｋ．（２０１２）ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＴＣＲ−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄｔｕｍｏｒｃｅｌｌｋｉｌｌｉｎｇ．ＮａｔＭｅｄ．
３８．Ｌｉｔｖａｋ−ＧｒｅｅｎｆｅｌｄＤ．ａｎｄＢｅｎｈａｒＩ．（２０１２）Ｒｉｓｋｓａｎｄｕｎｔｏｗａｒｄｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ．
３９．ＭａｎｎｉｎｇＴ．Ｃ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（１９９９）ＢｉｎｄｉｎｇｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓｏｆＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ２０，４１７−４２２．
４０．ＭａｒｒａｃｋＰ．，Ｓｃｏｔｔ−ＢｒｏｗｎｅＪ．Ｐ．，ＤａｉＳ．，ＧａｐｉｎＬ．ａｎｄＫａｐｐｌｅｒＪ．Ｗ．（２００８）ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｔｈａｔｃｏｎｔｒｏｌＴＣＲ−ＭＨＣｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２６，１７１−２０３．
４１．ＭａｒｓｈＳ．Ｇ．Ｅ．，ＰａｒｈａｍＰ．ａｎｄＢａｒｂｅｒＬ．Ｄ．（２０００）ＴｈｅＨＬＡＦａｃｔｓＢｏｏｋ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ．
４２．ＭａｓｏｎＤ．（１９９８）ＡｖｅｒｙｈｉｇｈｌｅｖｅｌｏｆｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｓａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｅａｔｕｒｅｏｆｔｈｅＴ− ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ１９，３９５−４０４．
４３．ＭｉｌｌｅｒＢ．Ｒ．，ＤｅｍａｒｅｓｔＳ．Ｊ．，ＬｕｇｏｖｓｋｏｙＡ．，ＨｕａｎｇＦ．，ＷｕＸ．，ＳｎｙｄｅｒＷ．Ｂ．，ＣｒｏｎｅｒＬ．Ｊ．，ＷａｎｇＮ．，ＡｍａｔｕｃｃｉＡ．，ＭｉｃｈａｅｌｓｏｎＪ．Ｓ．ａｎｄＧｌａｓｅｒＳ．Ｍ．（２０１０）ＳｔａｂｉｌｉｔｙｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｓｃＦｖｓｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ２３，５４９−５７．
４４．ＭｏｌｌｏｙＰ．Ｅ．，ＳｅｗｅｌｌＡ．Ｋ．ａｎｄＪａｋｏｂｓｅｎＢ．Ｋ．（２００５）ＳｏｌｕｂｌｅＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ５，４３８−４３．
４５．ＭｕｒｐｈｙＫ．（２０１２）Ｊａｎｅｗａｙ’ｓｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．ＧａｒｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ．
４６．ＮｏｌｄＭ．Ｆ．，Ｎｏｌｄ−ＰｅｔｒｙＣ．Ａ．，ＺｅｐｐＪ．Ａ．，ＰａｌｍｅｒＢ．Ｅ．，ＢｕｆｌｅｒＰ．ａｎｄＤｉｎａｒｅｌｌｏＣ．Ａ．（２０１０）ＩＬ−３７ｉｓａｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ１１，１０１４−２２．
４７．ＰａｓｔａｎＩ．，ＨａｓｓａｎＲ．，ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄＤ．Ｊ．ａｎｄＫｒｅｉｔｍａｎＲ．Ｊ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｔｈｅｒａｐｙｏｆｃａｎｃｅｒ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ６，５５９−６５．
４８．ＰｉｅｒｃｅＢ．Ｇ．，ＨａｉｄａｒＪ．Ｎ．，ＹｕＹ．ａｎｄＷｅｎｇＺ．（２０１０）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆａｆｆｉｎｉｔｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎａＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｖｅａｌｈｉｇｈｌｙｎｏｎａｄｄｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｗｉｔｈｉｎａｎｄｂｅｔｗｅｅｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓａｎｄｃｈａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４９，７０５０−９．

４９．ＰｏｒｔｅｒＤ．Ｌ．，ＬｅｖｉｎｅＢ．Ｌ．，ＫａｌｏｓＭ．，ＢａｇｇＡ．ａｎｄＪｕｎｅＣ．Ｈ．（２０１１）Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄＴｃｅｌｌｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３６５，７２５−３３．
５０．ＲｅｉｃｈｅｒｔＪ．Ｍ．ａｎｄＶａｌｇｅ−ＡｒｃｈｅｒＶ．Ｅ．（２００７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｔｒｅｎｄｓｆｏｒｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ６，３４９−５６．
５１．ＲｉｃａｒｔＡ．Ｄ．ａｎｄＴｏｌｃｈｅｒＡ．Ｗ．（２００７）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｓｉｇｈｔ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｄｒｕｇｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．ＮａｔＣｌｉｎＰｒａｃｔＯｎｃｏｌ４，２４５−５５．
５２．ＲｉｃｈｍａｎＳ．Ａ．，ＡｇｇｅｎＤ．Ｈ．，ＤｏｓｓｅｔｔＭ．Ｌ．，ＤｏｎｅｒｍｅｙｅｒＤ．Ｌ．，ＡｌｌｅｎＰ．Ｍ．，ＧｒｅｅｎｂｅｒｇＰ．Ｄ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２００９）ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｓｔｈａｔｅｎｈａｎｃｅｄｏｍａｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｅｎａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎＶａｌｐｈａＶｂｅｔａｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ４６，９０２−１６．
５３．ＲｉｃｈｍａｎＳ．Ａ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２００７）Ｄｉｓｐｌａｙ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＢｉｏｍｏｌＥｎｇ２４，３６１−７３．
５４．ＲｏｃｋＫ．Ｌ．ａｎｄＧｏｌｄｂｅｒｇＡ．Ｌ．（１９９９）ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＨＣｃｌａｓｓＩ− ｐｒｅｓｅｎｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ１７，７３９−７９．
５５．ＲｕｄｏｌｐｈＭ．Ｇ．，ＳｔａｎｆｉｅｌｄＲ．Ｌ．ａｎｄＷｉｌｓｏｎＩ．Ａ．（２００６）ＨｏｗＴＣＲｓｂｉｎｄＭＨＣｓ，ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２４，４１９−６６．
５６．ＳａｄｅｌａｉｎＭ．，ＢｒｅｎｔｊｅｎｓＲ．ａｎｄＲｉｖｉｅｒｅＩ．（２００９）Ｔｈｅｐｒｏｍｉｓｅａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｐｉｔｆａｌｌｓｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ２１，２１５−２３．
５７．ＳａｍｉＭ．，ＲｉｚｋａｌｌａｈＰ．Ｊ．，ＤｕｎｎＳ．，ＭｏｌｌｏｙＰ．，ＭｏｙｓｅｙＲ．，ＶｕｉｄｅｐｏｔＡ．，ＢａｓｔｏｎＥ．，ＴｏｄｏｒｏｖＰ．，ＬｉＹ．，ＧａｏＦ．，ＢｏｕｌｔｅｒＪ．Ｍ．ａｎｄＪａｋｏｂｓｅｎＢ．Ｋ．（２００７）ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｈｕｍａｎＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓｂｏｕｎｄｔｏｐｅｐｔｉｄｅｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘｒｅｖｅａｌｎａｔｉｖｅｄｉａｇｏｎａｌｂｉｎｄｉｎｇｇｅｏｍｅｔｒｙ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ２０，３９７−４０３．
５８．ＳｃｈｒａｍａＤ．，ＲｅｉｓｆｅｌｄＲ．Ａ．ａｎｄＢｅｃｋｅｒＪ．Ｃ．（２００６）Ａｎｔｉｂｏｄｙｔａｒｇｅｔｅｄｄｒｕｇｓａｓｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ５，１４７−５９．
５９．ＳｃｏｔｔＪ．Ｋ．ａｎｄＳｍｉｔｈＧ．Ｐ．（１９９０）Ｓｅａｒｃｈｉｎｇｆｏｒｐｅｐｔｉｄｅｌｉｇａｎｄｓｗｉｔｈａｎｅｐｉｔｏｐｅｌｉｂｒａｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９，３８６−９０．
６０．ＳｋｏｗｅｒａＡ．，ＥｌｌｉｓＲ．Ｊ．，Ｖａｒｅｌａ−ＣａｌｖｉｎｏＲ．，ＡｒｉｆＳ．，ＨｕａｎｇＧ．Ｃ．，Ｖａｎ−ＫｒｉｎｋｓＣ．，ＺａｒｅｍｂａＡ．，ＲａｃｋｈａｍＣ．，ＡｌｌｅｎＪ．Ｓ．，ＴｒｅｅＴ．Ｉ．，ＺｈａｏＭ．，ＤａｙａｎＣ．Ｍ．，ＳｅｗｅｌｌＡ．Ｋ．，ＵｎｇｅｒＷ．Ｗ．，ＤｒｉｊｆｈｏｕｔＪ．Ｗ．，ＯｓｓｅｎｄｏｒｐＦ．，ＲｏｅｐＢ．Ｏ．ａｎｄＰｅａｋｍａｎＭ．（２００８）ＣＴＬｓａｒｅｔａｒｇｅｔｅｄｔｏｋｉｌｌｂｅｔａｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓｔｈｒｏｕｇｈｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆａｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎｅｐｉｔｏｐｅ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１１８，３３９０−４０２．
６１．ＳｍｉｔｈＣ．Ａ．ａｎｄＫｏｒｔｅｍｍｅＴ．（２００８）Ｂａｃｋｒｕｂ−ｌｉｋｅｂａｃｋｂｏｎｅｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓｎａｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｓｍｕｔａｎｔｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ３８０，７４２−５６．
６２．ＳｏｏＨｏｏＷ．Ｆ．，ＬａｃｙＭ．Ｊ．，ＤｅｎｚｉｎＬ．Ｋ．，ＶｏｓｓＥ．Ｗ．Ｊ．，ＨａｒｄｍａｎＫ．Ｄ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．Ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，４７５９−４７６３．
６３．ＳｔａｒｒＴ．Ｋ．，ＪａｍｅｓｏｎＳ．Ｃ．ａｎｄＨｏｇｑｕｉｓｔＫ．Ａ．（２００３）ＰｏｓｉｔｉｖｅａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌｓ．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２１，１３９−７６．
６４．ＳｔａｒｗａｌｔＳ．Ｅ．，ＭａｓｔｅｌｌｅｒＥ．Ｌ．，ＢｌｕｅｓｔｏｎｅＪ．Ａ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２００３）Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎｃｌａｓｓＩＩＭＨＣｐｒｏｄｕｃｔｂｙｙｅａｓｔｄｉｓｐｌａｙ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ１６，１４７−５６．
６５．ＳｔｏｎｅＪ．Ｄ．，ＣｈｅｒｖｉｎＡ．Ｓ．，ＡｇｇｅｎＤ．Ｈ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２０１２）Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ５０３，１８９−２２２．
６６．ＳｔｏｎｅＪ．Ｄ．，ＹｉｎＹ．，ＭｏＭ．，ＷｅｂｅｒＫ．Ｓ．，ＤｏｎｅｒｍｅｙｅｒＤ．Ｌ．，ＡｌｌｅｎＰ．Ｍ．，ＭａｒｉｕｚｚａＲ．Ａ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２０１２）ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＨｉｇｈ−ＡｆｆｉｎｉｔｙＴＣｅｌｌＲｅｃｅｐｔｏｒ／ＣｙｔｏｋｉｎｅＦｕｓｉｏｎｓｆｏｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＴａｒｇｅｔｉｎｇ．ＩｎＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＥｄｉｔｅｄｂｙＫａｕｍａｙａＰ．）．ＩｎＴｅｃｈ．
６７．ＳｔｒｏｎｃｅｋＤ．Ｆ．，ＢｅｒｇｅｒＣ．，ＣｈｅｅｖｅｒＭ．Ａ．，ＣｈｉｌｄｓＲ．Ｗ．，ＤｕｄｌｅｙＭ．Ｅ．，ＦｌｙｎｎＰ．，ＧａｔｔｉｎｏｎｉＬ．，ＨｅａｔｈＪ．Ｒ．，ＫａｌｏｓＭ．，ＭａｒｉｎｃｏｌａＦ．Ｍ．，ＭｉｌｌｅｒＪ．Ｓ．，ＭｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙＧ．，ＰｏｗｅｌｌＤ．Ｊ．，Ｊｒ．，ＲａｏＭ．，ＲｅｓｔｉｆｏＮ．Ｐ．，ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳ．Ａ．，Ｏ’ＳｈｅａＪ．ａｎｄＭｅｌｉｅｆＣ．Ｊ．（２０１２）Ｎｅｗｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓｉｎｃｅｌｌｕｌａｒｔｈｅｒａｐｙｏｆｃａｎｃｅｒ：ａｓｕｍｍａｒｙｏｆｔｈｅｓｕｍｍｉｔｏｎｃｅｌｌｕｌａｒｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃａｎｃｅｒ．ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ１０，４８．
６８．ＳｗｅｒｓＪ．Ｓ．，ＫｅｌｌｏｇｇＢ．Ａ．ａｎｄＷｉｔｔｒｕｐＫ．Ｄ．（２００４）Ｓｈｕｆｆｌｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｉｅｓｃｒｅａｔｅｄｂｙｉｎｖｉｖｏｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄｙｅａｓｔｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３２，ｅ３６．
６９．ＴａｙａｌＶ．ａｎｄＫａｌｒａＢ．Ｓ．（２００８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｎｄａｎｔｉ−ｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−−ａｎｕｐｄａｔｅ．ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ５７９，１−１２．
７０．ＴｈａｋｕｒＡ．ａｎｄＬｕｍＬ．Ｇ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ１２，３４０−９．
７１．ＴｏｎｅｇａｗａＳ．（１９８８）Ｎｏｂｅｌｌｅｃｔｕｒｅｉｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｒｍｅｄｉｃｉｎｅ−−１９８７．Ｓｏｍａｔｉｃｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ２４，２５３−６５．
７２．ＴｓｏｍｉｄｅｓＴ．Ｊ．，ＡｌｄｏｖｉｎｉＡ．，ＪｏｈｎｓｏｎＲ．Ｐ．，ＷａｌｋｅｒＢ．Ｄ．，ＹｏｕｎｇＲ．Ａ．ａｎｄＥｉｓｅｎＨ．Ｎ．（１９９４）ＮａｔｕｒａｌｌｙｐｒｏｃｅｓｓｅｄｖｉｒａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｏｎｃｅｌｌｓｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１．ＪＥｘｐＭｅｄ１８０，１２８３−９３．
７３．ＴｕｒｎｅｒＤ．Ｊ．，ＲｉｔｔｅｒＭ．Ａ．ａｎｄＧｅｏｒｇｅＡ．Ｊ．（１９９７）Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｌｉｎｋｅｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎＦｖａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｕｓｉｎｇｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２０５，４３−５４．
７４．ＵｔｚＵ．，ＢａｎｋｓＤ．，ＪａｃｏｂｓｏｎＳ．ａｎｄＢｉｄｄｉｓｏｎＷ．Ｅ．（１９９６）ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｏｆｈｕｍａｎＴ−ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１（ＨＴＬＶ−１）Ｔａｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＨＴＬＶ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌｅｘｐａｎｓｉｏｎ．ＪＶｉｒｏｌ７０，８４３−５１．
７５．Ｖａｒｅｌａ−ＲｏｈｅｎａＡ．，ＭｏｌｌｏｙＰ．Ｅ．，ＤｕｎｎＳ．Ｍ．，ＬｉＹ．，ＳｕｈｏｓｋｉＭ．Ｍ．，ＣａｒｒｏｌｌＲ．Ｇ．，ＭｉｌｉｃｉｃＡ．，ＭａｈｏｎＴ．，ＳｕｔｔｏｎＤ．Ｈ．，ＬａｕｇｅｌＢ．，ＭｏｙｓｅｙＲ．，ＣａｍｅｒｏｎＢ．Ｊ．，ＶｕｉｄｅｐｏｔＡ．，ＰｕｒｂｈｏｏＭ．Ａ．，ＣｏｌｅＤ．Ｋ．，ＰｈｉｌｌｉｐｓＲ．Ｅ．，ＪｕｎｅＣ．Ｈ．，ＪａｋｏｂｓｅｎＢ．Ｋ．，ＳｅｗｅｌｌＡ．Ｋ．ａｎｄＲｉｌｅｙＪ．Ｌ．（２００８）ＣｏｎｔｒｏｌｏｆＨＩＶ−１ｉｍｍｕｎｅｅｓｃａｐｅｂｙＣＤ８ＴｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｄＴ−ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＮａｔＭｅｄ１４，１３９０−５．
７６．ＷｅｂｅｒＫ．Ｓ．，ＤｏｎｅｒｍｅｙｅｒＤ．Ｌ．，ＡｌｌｅｎＰ．Ｍ．ａｎｄＫｒａｎｚＤ．Ｍ．（２００５）ＣｌａｓｓＩＩ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏｆｏｒｈｉｇｈｅｒａｆｆｉｎｉｔｙｒｅｔａｉｎｓｐｅｐｔｉｄｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０２，１９０３３−８．
７７．ＷｏｎｇＲ．Ｌ．，ＬｉｕＢ．，ＺｈｕＸ．，ＹｏｕＬ．，ＫｏｎｇＬ．，ＨａｎＫ．Ｐ．，ＬｅｅＨ．Ｉ．，ＣｈａｖａｉｌｌａｚＰ．Ａ．，ＪｉｎＭ．，ＷａｎｇＹ．，ＲｈｏｄｅＰ．Ｒ．ａｎｄＷｏｎｇＨ．Ｃ．（２０１１）Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａｓｃａｆｆｏｌｄｆｏｒｃｒｅａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔｔａｒｇｅｔｅｄｉｍｍｕｎｅｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ２４，３７３−８３．

米国特許

第７，５６９，３５７号、２００４年２月２０日出願、２００９年８月４日発行、ＢｏａｒｄｏｆＴｒｕｓｔｅｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ．ＨｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙＴＣＲｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ．

第７，４６５，７８７号、２００３年１２月１６日出願、２００８年１２月１６日発行、ＢｏａｒｄｏｆＴｒｕｓｔｅｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｕｓｅｓｔｈｅｒｏｆ．

第６，７５９，２４３号、２０００年１２月６日出願、２００４７月６日発行、ＢｏａｒｄｏｆＴｒｕｓｔｅｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ．ＨｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙＴＣＲｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ．

第６，６９９，６５８号、１９９８年１月２０日出願、２００４年３月２日発行、ＢｏａｒｄｏｆＴｒｕｓｔｅｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｕｓｅｓｔｈｅｒｏｆ．

第６，６９６，２５１号、２０００年１１月２８日出願、２００４年２月２４日発行、ＢｏａｒｄｏｆＴｒｕｓｔｅｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｕｓｅｓｔｈｅｒｏｆ．

第６，４２３，５３８号、２０００年１１月２８日出願、２００２年７月２３日発行、ＢｏａｒｄｏｆＴｒｕｓｔｅｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｕｓｅｓｔｈｅｒｏｆ．

第６，３００，０６５号、１９９８年８月２６日出願、２００１年１０月９日発行、ＢｏａｒｄｏｆＴｒｕｓｔｅｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ．Ｙｅａｓｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｕｓｅｓｔｈｅｒｏｆ．

第８，１４３，３７６号、２００５年５月１８日出願、２０１２年３月２７日発行、ＩｍｍｕｎｏｃｏｒｅＬｉｍｉｔｅｄ；ＨｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙＮＹ−ＥＳＯＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ．

第８，０８８，３７９号、２００７年９月２６日出願、２０１２年１月３日発行、ＩｍｍｕｎｏｃｏｒｅＬｉｍｉｔｅｄ；ＭｏｄｉｆｉｅｄＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ．

第８，０１７，７３０号、２００６年５月１９日出願、２０１１年９月１３日発行、ＩｍｍｕｎｏｃｏｒｅＬｉｍｉｔｅｄ；ＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓｗｈｉｃｈｂｉｎｄｔｏＶＹＧＦＶＲＡＣＬ−ＨＬＡ−Ａ２４．

第７，７６３，７１８号、２００７年１０月２９日出願、２０１０年７月２７日発行、ＩｍｍｕｎｏｃｏｒｅＬｉｍｉｔｅｄ；ＳｏｌｕｂｌｅＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．

第７，６６６，６０４号、２００３年７月９日出願、２０１０年２月２３日発行、ＩｍｍｕｎｏｃｏｒｅＬｉｍｉｔｅｄ；ＭｏｄｉｆｉｅｄｓｏｌｕｂｌｅＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ．

第７，６０８，４１０号、２００８年１０月７日出願、２００９年１０月２７日発行、ＩｍｍｕｎｏｃｏｒｅＬｉｍｉｔｅｄ；ＭｅｔｈｏｄｏｆｉｍｐｒｏｖｉｎｇＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ｕｂｌｅＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．

第７，５６９，６６４号、２００３年１０月３日出願、２００９年８月４日発行、ＩｍｍｕｎｏｃｏｒｅＬｉｍｉｔｅｄ；ＳｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．

第８，１０５，８３０号、２００２年１１月５日出願、２０１２年１月３１日発行、ＡｌｔｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｎｄｕｓｅｓｔｈｅｒｏｆ．

第６，５３４，６３３号、１９９９年１０月２１日出願、２００３年３月１８日、ＡｌｔｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｎｄｕｓｅｓｔｈｅｒｏｆ．

Claims

Ｔ細胞クローンに由来するＶα及びＶβを含むＴ細胞受容体、またはその抗原結合断片であって、前記Ｔ細胞受容体は、ペプチドＷＴ１及びＨＬＡ−Ａ２分子の複合体に結合し、前記Ｔ細胞受容体は、配列番号１に記載されるＶβアミノ酸配列及び配列番号２に記載されるＶαアミノ酸配列を含む、前記Ｔ細胞受容体。
請求項１に記載の前記Ｔ細胞受容体を発現する、宿主細胞。
前記細胞は、ヒトＴ細胞である、請求項２に記載の前記宿主細胞。
野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶα及びＶβを含む修飾されたＴ細胞受容体、またはその抗原結合断片であって、前記Ｖαまたは前記Ｖβ、またはその両方は、前記野生型Ｔ細胞受容体に関して１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に突然変異を含み、前記修飾されたＴ細胞受容体は、ペプチドＷＴ１及びＨＬＡ−Ａ２分子の複合体に前記野生型Ｔ細胞受容体よりも高い親和性で結合する、前記修飾されたＴ細胞受容体。
前記修飾されたＴ細胞受容体は、配列番号３に記載されるＶβアミノ酸配列及び配列番号４に記載されるＶαアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
前記修飾されたＴ細胞受容体は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を有する１本鎖Ｔ細胞受容体を含む、請求項４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
配列番号４に記載される前記Ｖαアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾されたＶα、及び配列番号３に記載される前記Ｖβアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾されたＶβを含む、請求項４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
前記修飾されたＴ細胞受容体は、ＣＤＲ１α２９、ＣＤＲ１α３０、ＣＤＲ１α３１、ＣＤＲ３β９５、ＣＤＲ３β９７、ＣＤＲ３β１０３、及びＣＤＲ３β１０４のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
前記修飾されたＴ細胞受容体は、以下のアミノ酸突然変異：ＴＣＲＶβ鎖突然変異Ｓ９５Ｔ、Ｓ９７Ｎ、Ｉ１０３Ｙ、及びＮ１０４Ｌ、ならびにＴＣＲＶα鎖突然変異Ｖ２９Ｄ、Ｓ３０Ｌ、及びＱ３１Ｇ、のうちの１つ以上を含む、請求項４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
前記ペプチドＷＴ１及び前記ＨＬＡ−Ａ２分子の複合体にナノモルまたはより高い親和性で結合する請求項４に記載の修飾されたＴ細胞受容体であって、前記修飾されたＴ細胞受容体は、１０^−６Ｍ以下のＫ_Ｄ値で前記複合体に結合する、請求項４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体。
可溶性形態である、請求項４に記載の修飾されたＴ細胞受容体。
前記ＷＴ１抗原を発現する癌細胞を標的とする治療剤であって、請求項１０に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体を含む、前記治療剤。
前記ＷＴ１抗原を発現する癌細胞を標的とする治療剤であって、請求項４に記載の前記修飾されたＴ細胞受容体を発現するヒトＴ細胞を含む、前記治療剤。
請求項１２に記載の前記治療剤を投与することを含む、前記ＷＴ１抗原を発現する癌を有する対象を治療する方法。
請求項１３に記載の前記治療剤を投与することを含む、前記ＷＴ１抗原を発現する癌を有する対象を治療する方法。