JP2017210448A - Photoresponsive artificial nucleic acid probe for anti-gene method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アンチジーン法用光応答性人工核酸プローブに関する。 The present invention relates to a photoresponsive artificial nucleic acid probe for an antigene method.
遺伝子の発現を抑制することによって疾患を治療しようとする試みが行われている。遺伝子の発現の流れに沿って、ゲノムＤＮＡからの転写をブロックしようとする方法、転写されたｍＲＮＡを破壊しようとする方法、ｍＲＮＡからの翻訳をブロックしようとする方法、転写因子の働きを抑制しようとする方法などが、検討されている。 Attempts have been made to treat the disease by suppressing gene expression. Along with gene expression, try to block transcription from genomic DNA, try to destroy transcribed mRNA, try to block translation from mRNA, and suppress transcription factors The method of and is considered.
アンチジーン法は、ゲノムＤＮＡ中の標的となる遺伝子の２本鎖ＤＮＡに対して、ＤＮＡからなる核酸医薬を結合させて、転写を阻害し、これによってその遺伝子からの転写を半永久的に抑制しようとする方法である。このようなアンチジーン法を可能とする核酸医薬が、永らく求められてきた。 In the antigene method, a nucleic acid drug consisting of DNA is bound to the double-stranded DNA of the target gene in the genomic DNA to inhibit transcription, thereby inhibiting transcription from that gene semipermanently. It is a method. Nucleic acid drugs that enable such an anti-gene method have long been sought.
光反応による核酸の連結の技術として、５−シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術（特許文献１：特許第３７５３９３８号、特許文献２：特許第３７５３９４２号）、３−ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシド又はヌクレオシドアナログを使用した光架橋技術（特許文献３：特許第４８１４９０４号、特許文献４：特許第４９４０３１１号、特許文献５：国際公開ＷＯ２０１４／１５７５６５Ａ１号公報）が知られている。これらの技術によって核酸二重鎖の鎖間に光架橋を形成することができる。この光架橋は、共有結合による架橋であり、化学的に安定である。 As a technology for linking nucleic acids by photoreaction, photoligation technology using 5-cyanovinyldeoxyuridine (Patent Document 1: Patent No. 3753938, Patent Document 2: Patent No. 3753942), 3-vinylcarbazole structure as a base site Photocrosslinking techniques using modified nucleosides or nucleoside analogs (Patent Document 3: Patent No. 4814904, Patent Document 4: Patent No. 4940311, Patent Document 5: International Publication No. WO2014 / 157565A1) are known. These techniques can form photocrosslinks between the strands of nucleic acid duplexes. This photocrosslinking is a covalent crosslink and is chemically stable.
本発明者は、３−ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドを使用した人工核酸によって、アンチジーン法を実現する試みを行ってきた。すなわち、３−ビニルカルバゾール構造を有する人工核酸プローブによって、アンチジーン法を行う場合には、ゲノムのＤＮＡに対して光架橋を行って、細胞の修復系などの影響を受けないようにすることができると考えて、これを実現する試みを行ってきた。このためには、ゲノムの二本鎖ＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両側の鎖を光架橋によりブロックする必要がある。しかし、このような人工核酸プローブのセットを用意すると、これらは相補的な配列を有するものとなるためにプローブ同士で会合して、その結果として、センス鎖用の人工核酸プローブとアンチセンス鎖用の人工核酸プローブが光架橋してしまい、十分なアンチジーン効果が得られないという問題に直面した。 The present inventor has attempted to realize an antigene method using an artificial nucleic acid using a modified nucleoside having a 3-vinylcarbazole structure at the base site. That is, when the anti-gene method is performed with an artificial nucleic acid probe having a 3-vinylcarbazole structure, photocrosslinking may be performed on genomic DNA so as not to be affected by a cell repair system or the like. I thought I could do it and tried to make this happen. For this purpose, it is necessary to block the strands on both sides of the sense strand and antisense strand of the double-stranded DNA of the genome by photocrosslinking. However, when such a set of artificial nucleic acid probes is prepared, these have complementary sequences, so the probes are associated with each other, and as a result, the artificial nucleic acid probe for the sense strand and the antisense strand are used. This artificial nucleic acid probe was photocrosslinked, and the problem that sufficient antigene effect could not be obtained.
したがって、本発明の目的は、アンチジーン法に好適に使用可能な人工核酸プローブを提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an artificial nucleic acid probe that can be suitably used for an antigene method.
本発明者は、アンチジーン法に使用される人工核酸プローブについて、鋭意研究してきたところ、３−ビニルカルバゾール構造を有する光架橋性の人工塩基は、ピリミジン塩基と非常に高速に光架橋可能であるが、シアノウリジン構造又はシアノシチジン構造を有する人工塩基に対する光架橋反応に限っては非常に遅いという知見を得た。そして、この知見に基づいて、アンチジーン法用人工核酸プローブ同士が架橋した際に光架橋するべきピリミジン塩基をシアノウリジン構造又はシアノシチジン構造を有する人工塩基に置換することによってプローブ同士の光架橋を抑制するという着想に到達した。そして、このシアノウリジン構造又はシアノシチジン構造を有する人工塩基と３−ビニルカルバゾール構造を有する光架橋性の人工塩基とを含む人工核酸プローブを用いることによってプローブ同士の架橋を抑制し、長鎖の二本鎖ＤＮＡに対して選択的に光架橋可能とすることによって、十分なアンチジーン効果を発揮できる人工核酸プローブを提供できることを見いだして、本発明に到達した。 The present inventor has intensively studied an artificial nucleic acid probe used in the antigene method, and a photocrosslinkable artificial base having a 3-vinylcarbazole structure can be photocrosslinked with a pyrimidine base at a very high speed. However, it was found that the reaction was very slow only for the photocrosslinking reaction to an artificial base having a cyanouridine structure or a cyanocytidine structure. And based on this knowledge, when the artificial nucleic acid probes for the antigene method are cross-linked, the pyrimidine base that should be photo-crosslinked is replaced with an artificial base having a cyanouridine structure or a cyanocytidine structure, thereby photocrosslinking the probes. The idea of suppression has been reached. Then, by using an artificial nucleic acid probe containing an artificial base having this cyanouridine structure or cyanocytidine structure and a photocrosslinkable artificial base having a 3-vinylcarbazole structure, crosslinking between the probes is suppressed, and long-chain The inventors have found that an artificial nucleic acid probe capable of exhibiting a sufficient antigene effect can be provided by selectively allowing photocrosslinking to a double-stranded DNA, and the present invention has been achieved.
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
標的二重鎖核酸を光架橋するための光応答性人工核酸プローブであって、
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入され、以下の式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された人工核酸からなる、光応答性人工核酸プローブ：
式（Ｉ）：
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１４は、水素原子であり、
Ｒ１５は、水酸基であり、
Ｒ１６は、水素原子又は水酸基である）、
式（ＩＩ）：
Ｒ２４は、水素原子であり、
Ｒ２５は、水酸基であり、
Ｒ２６は、水素原子又は水酸基である）、
式（ＩＩＩ）：
Ｒ３４は、水素原子であり、
Ｒ３５は、水酸基であり、
Ｒ３６は、水素原子又は水酸基である）。
（２）
（１）に記載の光応答性人工核酸プローブであって、光応答性人工核酸プローブが、光応答性人工核酸プローブ１と光応答性人工核酸プローブ２とのセットからなり、
光応答性人工核酸プローブ１は、標的二重鎖核酸の片側の鎖（標的核酸鎖１）の一部と相補的な塩基配列を有し、
光応答性人工核酸プローブ１は、標的核酸鎖１の塩基配列中のピリミジン塩基に対して、光架橋可能な位置に、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドを有し、
光応答性人工核酸プローブ１は、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列と、相補的でない部分塩基配列の部分を有し、
光応答性人工核酸プローブ１は、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列の中に位置しており、
光応答性人工核酸プローブ２は、標的二重鎖核酸の標的核酸鎖１でない側の鎖（標的核酸鎖２）の一部と相補的な塩基配列を有し、
光応答性人工核酸プローブ２は、標的核酸鎖２の塩基配列中のピリミジン塩基に対して、光架橋可能な位置に、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドを有し、
光応答性人工核酸プローブ２は、光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的な部分塩基配列と、相補的でない部分塩基配列を有し、
光応答性人工核酸プローブ２は、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが、光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的な部分塩基配列の中に位置しており、
さらに、光応答性人工核酸プローブ１の塩基配列は、
標的核酸鎖２の塩基配列において光応答性人工核酸プローブ２の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基と対応する位置に、ピリミジン塩基に代えて、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを塩基として有しており、
さらに、光応答性人工核酸プローブ２の塩基配列は、
標的核酸鎖１の塩基配列において光応答性人工核酸プローブ１の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基と対応する位置に、ピリミジン塩基に代えて、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを塩基として有している、光応答性人工核酸プローブ。
（３）
光応答性人工核酸プローブ１に含まれる、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列が、４塩基長〜４０００塩基長の範囲の長さを有する、（２）に記載の光応答性人工核酸プローブ。
（４）
光応答性人工核酸プローブ１に含まれる、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的でない部分塩基配列が、２塩基長〜２００塩基長の範囲の長さを有する、（２）〜（３）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブ。
（５）
光応答性人工核酸プローブ２に含まれる、光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的でない部分塩基配列が、２塩基長〜２００塩基長の範囲の長さを有する、（２）〜（４）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブ。
（６）
光応答性人工核酸プローブ１の塩基配列に含まれている、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドの数が、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列の１００塩基長あたりに換算して、０．１個〜１０個の範囲にある、（２）〜（５）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブ。
（７）
光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基が、チミン（Ｔ）又はシトシン（Ｃ）である、（２）〜（６）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブ。
（８）
標的二重鎖核酸が、標的遺伝子の二重鎖核酸である、（１）〜（７）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブ。
（９）
（１）〜（８）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブからなる、二重鎖核酸用光架橋剤。
（１０）
（１）〜（８）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブからなる、アンチジーン法用標的遺伝子発現抑制剤。
Accordingly, the present invention includes the following (1) and below.
(1)
A photoresponsive artificial nucleic acid probe for photocrosslinking a target double-stranded nucleic acid,
The photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the following formula (I) is introduced into the base sequence by a phosphodiester bond, and the artificial nucleoside represented by the following formula (II) or formula (III) is a phosphodiester bond. A photoresponsive artificial nucleic acid probe comprising an artificial nucleic acid introduced into a base sequence by:
Formula (I):
R12 and R13 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or a hydrogen atom,
R14 is a hydrogen atom;
R15 is a hydroxyl group;
R16 is a hydrogen atom or a hydroxyl group),
Formula (II):
R24 is a hydrogen atom,
R25 is a hydroxyl group;
R26 is a hydrogen atom or a hydroxyl group),
Formula (III):
R34 is a hydrogen atom,
R35 is a hydroxyl group,
R36 is a hydrogen atom or a hydroxyl group).
(2)
The photoresponsive artificial nucleic acid probe according to (1), wherein the photoresponsive artificial nucleic acid probe comprises a set of a photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and a photoresponsive artificial nucleic acid probe 2;
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a base sequence complementary to a part of one strand (target nucleic acid strand 1) of the target double-stranded nucleic acid,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) at a position capable of photocrosslinking with respect to a pyrimidine base in the base sequence of the target nucleic acid strand 1;
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and a partial base sequence that is not complementary,
In the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1, the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is located in a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 has a base sequence complementary to a part of the target nucleic acid strand 1 side (target nucleic acid strand 2) of the target double-stranded nucleic acid,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 has a photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) at a position capable of photocrosslinking with respect to the pyrimidine base in the base sequence of the target nucleic acid strand 2,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 has a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and a partial base sequence that is not complementary,
In the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2, the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is located in a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1,
Furthermore, the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is
In place of the pyrimidine base at the position corresponding to the pyrimidine base at the position where the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 can be photocrosslinked in the base sequence of the target nucleic acid chain 2 Having an artificial nucleoside represented by formula (II) or formula (III) as a base,
Furthermore, the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 is
In place of the pyrimidine base at the position corresponding to the pyrimidine base at the position where the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is photocrosslinkable in the base sequence of the target nucleic acid strand 1 A photoresponsive artificial nucleic acid probe having an artificial nucleoside represented by formula (II) or formula (III) as a base.
(3)
The partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 contained in the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a length in the range of 4 base lengths to 4000 base lengths according to (2). Photoresponsive artificial nucleic acid probe.
(4)
The partial base sequence that is not complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 included in the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a length in the range of 2 base lengths to 200 base lengths (2) to (3 The photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of the above.
(5)
The partial base sequence that is not complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 included in the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 has a length in the range of 2 base lengths to 200 base lengths (2) to (4 The photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of the above.
(6)
The number of photocrosslinkable artificial nucleosides represented by the formula (I) contained in the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2. The photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of (2) to (5), which is in the range of 0.1 to 10 in terms of length per 100 bases.
(7)
The photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of (2) to (6), wherein the pyrimidine base at a position capable of photocrosslinking is thymine (T) or cytosine (C).
(8)
The photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of (1) to (7), wherein the target double-stranded nucleic acid is a double-stranded nucleic acid of a target gene.
(9)
A photocrosslinking agent for double-stranded nucleic acid, comprising the photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of (1) to (8).
(10)
(1) A target gene expression inhibitor for antigene method, comprising the photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of (1) to (8).
（１１）
（１）〜（８）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブを使用して標的二重鎖核酸を光架橋することによって、光架橋された二重鎖核酸を製造する方法。
（１２）
（１）〜（８）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブを使用して標的遺伝子の二重鎖核酸を光架橋する工程、
を含む、標的遺伝子の発現を光抑制する方法。
（１３）
（２）〜（８）のいずれかに記載の光応答性人工核酸プローブ１及び光応答性人工核酸プローブ２を、標的二重鎖核酸とハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズした光応答性人工核酸プローブ１及び光応答性人工核酸プローブ２と、標的二重鎖核酸に対して、光照射して、光応答性人工核酸プローブ１と標的核酸鎖１を光架橋し、光応答性人工核酸プローブ２と標的核酸鎖２を光架橋する工程、
を含む、（１１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）
光応答性人工核酸プローブ１と光応答性人工核酸プローブ２とのプローブ間の光架橋形成が抑制された、（１３）に記載の方法。
（１５）
（１２）〜（１４）のいずれかに記載された方法によって、発現抑制された標的遺伝子を製造する方法。
(11)
A method for producing a photocrosslinked double-stranded nucleic acid by photocrosslinking a target double-stranded nucleic acid using the photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of (1) to (8).
(12)
A step of photocrosslinking a double-stranded nucleic acid of a target gene using the photoresponsive artificial nucleic acid probe according to any one of (1) to (8),
A method for optically suppressing the expression of a target gene, comprising:
(13)
A step of hybridizing the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 according to any one of (2) to (8) with a target double-stranded nucleic acid;
The hybridized photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and the target double-stranded nucleic acid are irradiated with light to photocrosslink the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the target nucleic acid strand 1. , Photocrosslinking the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and the target nucleic acid chain 2;
The method in any one of (11)-(12) containing.
(14)
(13) The method according to (13), wherein photocrosslinking between the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 is suppressed.
(15)
(12) A method for producing a target gene whose expression is suppressed by the method described in any one of (14).
本発明の人工核酸プローブは、標的二重鎖核酸に対して光架橋を形成できて、プローブ同士の光架橋が十分に抑制されたものとなっており、アンチジーン法による遺伝子発現抑制に好適に使用することができる。 The artificial nucleic acid probe of the present invention can form a photocrosslink with respect to the target double-stranded nucleic acid, and the photocrosslink between the probes is sufficiently suppressed, and is suitable for gene expression suppression by the antigene method. Can be used.
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below by giving specific embodiments. The present invention is not limited to the following specific embodiments.
［光応答性人工核酸プローブ］
本発明の光応答性人工核酸プローブは、標的である二重鎖核酸を光架橋するための光応答性人工核酸プローブであり、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入され、さらに同じプローブ分子中に同時に、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入されている。式（Ｉ）では人工ヌクレオシドの塩基部分として、３−ビニルカルバゾール構造を有する光架橋性の人工塩基を有している。式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）では、人工ヌクレオシドの塩基部分として、それぞれ、シアノウリジン構造又はシアノシチジン構造を有する光架橋性の人工塩基を有している。好適な実施の態様において、光応答性人工核酸プローブは、光応答性人工核酸プローブ１と光応答性人工核酸プローブ２とのセットからなる。
[Photoresponsive artificial nucleic acid probe]
The photoresponsive artificial nucleic acid probe of the present invention is a photoresponsive artificial nucleic acid probe for photocrosslinking a target double-stranded nucleic acid, and the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is a phosphodiester. An artificial nucleoside represented by the formula (II) or the formula (III) is introduced into the base sequence by a phosphodiester bond at the same time in the same probe molecule. In the formula (I), the artificial nucleoside has a photocrosslinkable artificial base having a 3-vinylcarbazole structure as the base moiety. In the formula (II) or the formula (III), the artificial nucleoside has a photocrosslinkable artificial base having a cyanouridine structure or a cyanocytidine structure, respectively. In a preferred embodiment, the photoresponsive artificial nucleic acid probe consists of a set of a photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and a photoresponsive artificial nucleic acid probe 2.
［３−ビニルカルバゾール構造を有する光架橋性人工ヌクレオシド］
３−ビニルカルバゾール構造を有する光架橋性人工ヌクレオシドとして、次の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドを好適に使用できる：
As a photocrosslinkable artificial nucleoside having a 3-vinylcarbazole structure, a photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the following formula (I) can be suitably used:
式Ｉ中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１４は、水素原子であり、
Ｒ１５は、水酸基であり、
Ｒ１６は、水素原子又は水酸基である。
In Formula I, R11 is a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or a hydrogen atom,
R12 and R13 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or a hydrogen atom,
R14 is a hydrogen atom;
R15 is a hydroxyl group;
R16 is a hydrogen atom or a hydroxyl group.
アルコキシカルボニル基としては、例えばＣ２〜Ｃ７、好ましくはＣ２〜Ｃ６、Ｃ２〜Ｃ５、Ｃ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用できる。 As the alkoxycarbonyl group, for example, C2 to C7, preferably C2 to C6, C2 to C5, C2 to C4, more preferably C2 to C3, particularly preferably C2 can be used.
好適な実施の態様において、Ｒ１１を、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はＣ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基とすることができ、Ｒ１２及びＲ１３を水素原子とすることができる。 In a preferred embodiment, R11 can be a cyano group, an amide group, a carboxyl group, or a C2-C7 alkoxycarbonyl group, and R12 and R13 can be hydrogen atoms.
［シアノウリジン構造を有する人工ヌクレオシド］
シアノウリジン構造を有する人工ヌクレオシドとして、次の式（ＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを好適に使用できる：
As an artificial nucleoside having a cyanouridine structure, an artificial nucleoside represented by the following formula (II) can be preferably used:
式ＩＩ中、Ｒ２１は、シアノ基であり、
Ｒ２４は、水素原子であり、
Ｒ２５は、水酸基であり、
Ｒ２６は、水素原子又は水酸基である。
In Formula II, R21 is a cyano group,
R24 is a hydrogen atom,
R25 is a hydroxyl group;
R26 is a hydrogen atom or a hydroxyl group.
［シアノシチジン構造を有する人工ヌクレオシド］
シアノシチジン構造を有する人工ヌクレオシドとして、次の式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを好適に使用できる：
As an artificial nucleoside having a cyanocytidine structure, an artificial nucleoside represented by the following formula (III) can be preferably used:
ただし、式ＩＩＩ中、Ｒ３１は、シアノ基であり、
Ｒ３４は、水素原子であり、
Ｒ３５は、水酸基であり、
Ｒ３６は、水素原子又は水酸基である。
However, in Formula III, R31 is a cyano group,
R34 is a hydrogen atom,
R35 is a hydroxyl group,
R36 is a hydrogen atom or a hydroxyl group.
［光応答性人工核酸プローブ１］
光応答性人工核酸プローブ１は、標的二重鎖核酸の片側の鎖（標的核酸鎖１）の一部と相補的な塩基配列を有し、
標的核酸鎖１の塩基配列中のピリミジン塩基に対して、光架橋可能な位置に、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドを有し、
光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列と、相補的でない部分塩基配列の部分を有し、
式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列の中に位置している。
[Photoresponsive artificial nucleic acid probe 1]
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a base sequence complementary to a part of one strand (target nucleic acid strand 1) of the target double-stranded nucleic acid,
A photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) at a position capable of photocrosslinking with respect to the pyrimidine base in the base sequence of the target nucleic acid strand 1;
A partial base sequence complementary to the light-responsive artificial nucleic acid probe 2 and a non-complementary partial base sequence,
The photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is located in a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2.
［光応答性人工核酸プローブ２］
光応答性人工核酸プローブ２は、標的二重鎖核酸の標的核酸鎖１でない側の鎖（標的核酸鎖２）の一部と相補的な塩基配列を有し、
標的核酸鎖２の塩基配列中のピリミジン塩基に対して、光架橋可能な位置に、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドを有し、
光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的な部分塩基配列と、相補的でない部分塩基配列を有し、
式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが、光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的な部分塩基配列の中に位置している。
[Photoresponsive artificial nucleic acid probe 2]
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 has a base sequence complementary to a part of the target nucleic acid strand 1 side (target nucleic acid strand 2) of the target double-stranded nucleic acid,
A photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) at a position capable of photocrosslinking with respect to the pyrimidine base in the base sequence of the target nucleic acid strand 2;
A partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and a non-complementary partial base sequence,
The photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is located in a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1.
［光応答性人工核酸プローブ１及び２における式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドの配置］
もし、光応答性人工核酸プローブ１及び２において、上述のような式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドのみが導入されていた場合には、プローブ同士の光架橋が生じてしまい、有効なプローブとはならない。本発明では、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを以下の配置で導入することによって、光応答性人工核酸プローブ１及び２において、プローブ間の光架橋形成を抑制して、有効なプローブとして作用させている。
[Arrangement of artificial nucleoside represented by formula (II) or formula (III) in photoresponsive artificial nucleic acid probes 1 and 2]
If only the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) as described above is introduced in the photoresponsive artificial nucleic acid probes 1 and 2, photocrosslinking between the probes occurs, It is not a valid probe. In the present invention, by introducing the artificial nucleoside represented by the formula (II) or the formula (III) in the following arrangement, the photoresponsive artificial nucleic acid probes 1 and 2 suppress the formation of photocrosslinks between the probes. , Acting as an effective probe.
すなわち、光応答性人工核酸プローブ１の塩基配列は、さらに、標的核酸鎖２の塩基配列において光応答性人工核酸プローブ２の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基と対応する位置に、ピリミジン塩基に代えて、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを塩基として有しており、
光応答性人工核酸プローブ２の塩基配列は、さらに、標的核酸鎖１の塩基配列において光応答性人工核酸プローブ１の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基と対応する位置に、ピリミジン塩基に代えて、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを塩基として有している。
That is, the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is further capable of photocrosslinking the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 in the base sequence of the target nucleic acid chain 2. It has an artificial nucleoside represented by the formula (II) or the formula (III) as a base instead of the pyrimidine base at a position corresponding to the pyrimidine base at the position,
The base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 is further located at a position where the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 can be photocrosslinked in the base sequence of the target nucleic acid chain 1. Instead of the pyrimidine base, an artificial nucleoside represented by the formula (II) or the formula (III) is used as a base at a position corresponding to a certain pyrimidine base.
［光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基］
式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドは、光架橋可能な位置に配置されたピリミジン塩基との間に光架橋を形成できる。ピリミジン塩基としては、例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシンをあげることができ、好ましくはチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）をあげることができる。
[Pyrimidine bases at photocrosslinkable positions]
The photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) can form a photocrosslink with a pyrimidine base arranged at a position capable of photocrosslinking. Examples of the pyrimidine base include thymine (T), cytosine (C), uracil (U), 5-methylcytosine, and 5-hydroxymethylcytosine, preferably thymine (T) and cytosine (C). I can give you.
［光架橋可能な位置］
式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドによる光架橋は、光架橋性人工ヌクレオシドが含まれる人工核酸が、この人工核酸に対して相補的な塩基配列を有する核酸鎖と、少なくとも部分的に、いったん二重鎖を形成して、その後に光照射されることによって、形成できる。この場合に、光架橋性人工ヌクレオシドの光架橋性人工塩基は、相補的な塩基配列を有する核酸の塩基配列中において、光架橋性人工塩基と相補的な位置にある塩基から１塩基だけ５’末端側に位置する塩基（相補的な位置にある塩基の５’末端側の隣の塩基）との間に、光架橋を形成できる。すなわち、相補的な塩基配列中において、光架橋性人工塩基と相補的な位置にある塩基から１塩基だけ５’末端側の位置が、光架橋可能な位置である。
[Photocrosslinkable position]
The photocrosslinking by the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is carried out in such a manner that the artificial nucleic acid containing the photocrosslinkable artificial nucleoside has a nucleic acid chain having a base sequence complementary to the artificial nucleic acid and at least partially. In addition, it can be formed by once forming a double chain and then irradiating with light. In this case, the photocrosslinkable artificial base of the photocrosslinkable artificial nucleoside is 5 ′ from the base at a position complementary to the photocrosslinkable artificial base in the base sequence of the nucleic acid having a complementary base sequence. A photocrosslink can be formed between the base located on the terminal side (the base adjacent to the 5 ′ terminal side of the base at the complementary position). In other words, in the complementary base sequence, the position on the 5 ′ end side by one base from the base complementary to the photocrosslinkable artificial base is a position capable of photocrosslinking.
［プローブ同士の光架橋の抑制］
式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基のヌクレオシドが、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドへと置換されると、置換前であれば形成されたはずの光架橋が、置換後には形成されない。この結果として、光応答性人工核酸プローブ１と光応答性人工核酸プローブ２は、プローブ間の光架橋が、置換前であれば形成されたはずのところ、置換後には形成されない。すなわち、光応答性人工核酸プローブのプローブ同士の光架橋の形成が、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドの導入によって、抑制される。プローブ同士が光架橋してしまうと、標的である二重鎖核酸との光架橋が形成されないままに、活性あるプローブが失われてしまうことになるから、プローブ同士の光架橋の抑制を可能とする本発明によって初めて、光応答性人工核酸プローブが実用化されたと言える。
[Inhibition of photocrosslinking between probes]
When the nucleoside of the pyrimidine base in the photocrosslinkable position of the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is substituted with the artificial nucleoside represented by the formula (II) or the formula (III), The photocrosslinks that would have been formed before would not be formed after substitution. As a result, the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 are not formed after substitution, although photocrosslinking between the probes should be formed before substitution. That is, the formation of photocrosslinks between the probes of the photoresponsive artificial nucleic acid probe is suppressed by introduction of the artificial nucleoside represented by the formula (II) or the formula (III). If the probes are photocrosslinked, active probes will be lost without photocrosslinking with the target double-stranded nucleic acid, making it possible to suppress photocrosslinking between probes. It can be said that the photoresponsive artificial nucleic acid probe has been put into practical use for the first time by the present invention.
［光応答性人工核酸プローブ１及び２の間の相補的な部分塩基配列］
好適な実施の態様において、光応答性人工核酸プローブ１に含まれる、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列が、例えば４塩基長〜４０００塩基長、４塩基長〜１００塩基長、６塩基長〜６０塩基長、８塩基長〜３０塩基長の範囲の長さを有するものとできる。光応答性人工核酸プローブ２に含まれる、光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的な部分塩基配列もまた、上記と同じ長さとなる。
[Complementary partial base sequence between photoresponsive artificial nucleic acid probes 1 and 2]
In a preferred embodiment, the partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 contained in the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is, for example, 4 base length to 4000 base length, 4 base length to 100. It can have a length in the range of base length, 6 base length to 60 base length, 8 base length to 30 base length. The partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 contained in the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 also has the same length as described above.
［光応答性人工核酸プローブ１及び２の間の相補的でない部分塩基配列］
好適な実施の態様において、光応答性人工核酸プローブ１に含まれる、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的でない部分塩基配列が、例えば２塩基長〜２００塩基長、４塩基長〜４０塩基長、６塩基長〜２０塩基長の範囲の長さを有するものとできる。好適な実施の態様において、光応答性人工核酸プローブ２に含まれる、光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的でない部分塩基配列が、例えば２塩基長〜２００塩基長、４塩基長〜４０塩基長、６塩基長〜２０塩基長の範囲の長さを有するものとできる。
[Non-complementary partial base sequence between photoresponsive artificial nucleic acid probes 1 and 2]
In a preferred embodiment, the partial base sequence that is not complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 contained in the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is, for example, 2 base lengths to 200 base lengths, 4 base lengths to 40 bases. The base length can be 6 to 20 bases. In a preferred embodiment, the partial base sequence that is not complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 contained in the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 is, for example, 2 base length to 200 base length, 4 base length to 40 The base length can be 6 to 20 bases.
［光応答性人工核酸プローブの塩基配列に含まれる光架橋性人工ヌクレオシドの数］
好適な実施の態様において、光応答性人工核酸プローブ１の塩基配列に含まれている、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドの数が、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列の１００塩基長あたりに換算して、例えば０．１個〜１０個の範囲、１個〜１０個の範囲、２個〜８個の範囲とすることができる。光応答性人工核酸プローブ１の塩基配列に含まれている、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドの数もまた、上記式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドの数と同じ数となる。これに対応して、光応答性人工核酸プローブ２の塩基配列に含まれている、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドの数、及び式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドの数もまた、同じ数となる。
[Number of photocrosslinkable artificial nucleosides contained in the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe]
In a preferred embodiment, the number of photocrosslinkable artificial nucleosides represented by the formula (I) contained in the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is different from that of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2. In terms of per 100 base lengths of the complementary partial base sequence, for example, the range can be 0.1 to 10 ranges, 1 to 10 ranges, or 2 to 8 ranges. The number of artificial nucleosides represented by the formula (II) or (III) contained in the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is also the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the above formula (I). The same number as Correspondingly, the number of photocrosslinkable artificial nucleosides represented by the formula (I) contained in the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and the formula (II) or the formula (III) The number of artificial nucleosides that are made will also be the same.
［標的二重鎖核酸］
本発明の光応答性人工核酸プローブによれば、標的である二重鎖核酸を光架橋することができる。好適な実施の態様において、標的二重鎖核酸は、標的遺伝子の二重鎖核酸とすることができ、この光架橋によって標的遺伝子をマスクしてその発現を不可逆的に抑制することができる。このような発現抑制であれば、例えば細胞内の修復機構によって、修復されてしまうこともない。標的遺伝子の二重鎖核酸は、生物のゲノムＤＮＡであってもよいが、特定の目的のために準備された人工的な遺伝子ＤＮＡであってもよく、人工核酸プローブの光架橋による結合が効果的に使用できる対象であればよい。いわゆるアンチジーン法の対象となる遺伝子を、標的二重鎖核酸として使用してもよい。
[Target double-stranded nucleic acid]
According to the photoresponsive artificial nucleic acid probe of the present invention, a target double-stranded nucleic acid can be photocrosslinked. In a preferred embodiment, the target double-stranded nucleic acid can be a double-stranded nucleic acid of a target gene, and the target gene can be masked by this photocrosslinking to suppress its expression irreversibly. If such expression is suppressed, it is not repaired by, for example, an intracellular repair mechanism. The double-stranded nucleic acid of the target gene may be the genomic DNA of the organism, but it may also be an artificial gene DNA prepared for a specific purpose, and the effect of photocrosslinking of the artificial nucleic acid probe is effective As long as the target can be used. You may use the gene used as the object of what is called an antigene method as a target double strand nucleic acid.
［標的二重鎖核酸を光架橋する方法］
本発明によれば、光応答性人工核酸プローブを使用して標的二重鎖核酸を光架橋することができる。好適な実施の態様において、本発明は、光応答性人工核酸プローブ１及び光応答性人工核酸プローブ２を、標的二重鎖核酸とハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズした光応答性人工核酸プローブ１及び光応答性人工核酸プローブ２と、標的二重鎖核酸に対して、光照射して、光応答性人工核酸プローブ１と標的核酸鎖１を光架橋し、光応答性人工核酸プローブ２と標的核酸鎖２を光架橋する工程、を含む方法によって実施することができる。
[Method of photocrosslinking target double-stranded nucleic acid]
According to the present invention, a target double-stranded nucleic acid can be photocrosslinked using a photoresponsive artificial nucleic acid probe. In a preferred embodiment, the present invention comprises a step of hybridizing the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 with a target double-stranded nucleic acid, the hybridized photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and The photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and the target double-stranded nucleic acid are irradiated with light to photocrosslink the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the target nucleic acid strand 1, and the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and the target nucleic acid Can be carried out by a method comprising a step of photocrosslinking the chain 2.
［光応答性人工核酸プローブと標的二重鎖核酸とのハイブリダイズ］
光架橋に先立って、光応答性人工核酸プローブ１及び光応答性人工核酸プローブ２を、標的二重鎖核酸と共存させて、ハイブリダイズさせる。光応答性人工核酸プローブの一重鎖は、熱力学的な挙動にしたがって、標的二重鎖核酸へと侵入して、相補性ある配列領域に沿って部分的にハイブリダイズし、あるいは再び解離する。ハイブリダイズの公知の条件によって、このような状態とすることができる。このような条件として、例えば、温度を０℃〜７０℃の範囲、２０℃〜４０℃の範囲、ｐＨをｐＨ３〜１１の範囲、ｐＨ５〜７．５の範囲とすることができる。
[Hybridization of photoresponsive artificial nucleic acid probe and target double-stranded nucleic acid]
Prior to photocrosslinking, the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 are hybridized in the presence of the target double-stranded nucleic acid. The single strand of the light-responsive artificial nucleic acid probe enters the target double-stranded nucleic acid according to thermodynamic behavior and partially hybridizes along the complementary sequence region or dissociates again. Such a state can be obtained by known conditions for hybridization. As such conditions, for example, the temperature can be in the range of 0 ° C. to 70 ° C., the range of 20 ° C. to 40 ° C., the pH in the range of pH 3 to 11, and the range of pH 5 to 7.5.
［光照射による光架橋の形成］
ハイブリダイズによって、光架橋可能に配置された光応答性人工核酸プローブは、標的二重鎖核酸との間に、光架橋を形成する。ハイブリダイズによる配置にしたがって、光応答性人工核酸プローブ１は、標的核酸鎖１との間に、光架橋を形成し、光応答性人工核酸プローブ２は、標的核酸鎖２との間に、光架橋を形成する。ハイブリダイズによって形成された二重鎖領域は、光架橋によって固定されたために、熱力学的な挙動によって再び解離することはないものとなる。そのために二重鎖領域の伸長が一方的に進行して、標的二重鎖核酸の２本の鎖は、それぞれ光応答性人工核酸プローブの鎖と、二重鎖を形成した状態となる（図７の右端から２番目の図を参照）。
[Formation of photocrosslinking by light irradiation]
The photoresponsive artificial nucleic acid probe arranged to be photocrosslinkable by hybridization forms a photocrosslink with the target double-stranded nucleic acid. According to the arrangement by hybridization, the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 forms a photocrosslink with the target nucleic acid strand 1, and the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 with the target nucleic acid strand 2 Form a crosslink. Since the double-stranded region formed by hybridization is fixed by photocrosslinking, it does not dissociate again due to thermodynamic behavior. As a result, the extension of the double-stranded region proceeds unilaterally, and the two strands of the target double-stranded nucleic acid are in a state of forming a double strand with the strand of the photoresponsive artificial nucleic acid probe, respectively (Fig. (See the second figure from the right end of 7).
光応答性人工核酸プローブに含まれる式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドの塩基と式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドの塩基は、標的核酸鎖の塩基配列中の光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基との間に、光架橋を形成する。光応答性人工核酸プローブ同士は、熱力学的な挙動にしたがってハイブリダイズしたとしても、光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基が置換されてしまっているために、光架橋を形成することはないものとなっている。そのために、光応答性人工核酸プローブ同士が、光架橋によって固定されることはなく、熱力学的な挙動によって再び解離する（図７の左端から２番目の図を参照）。 The base of the target nucleic acid chain is the base of the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by formula (I) and the base of the artificial nucleoside represented by formula (II) or (III) contained in the photoresponsive artificial nucleic acid probe. A photocrosslink is formed with a pyrimidine base in a position capable of photocrosslinking. Even if photoresponsive artificial nucleic acid probes are hybridized according to thermodynamic behavior, they do not form photocrosslinks because the pyrimidine base at the photocrosslinkable position is substituted. It has become. Therefore, the photoresponsive artificial nucleic acid probes are not fixed by photocrosslinking but dissociate again by thermodynamic behavior (see the second figure from the left end of FIG. 7).
［光照射］
光照射による光架橋の形成は、光化学反応であるために、温度、溶媒、塩濃度、ｐＨ等について、広範な条件下で実施することができる。このため、生理的な条件下でも実施することができて、遺伝子の発現抑制のために好適に使用することができる。好適な実施の態様において、光照射は、ハイブリダイズの条件と、同条件下で行うことができる。光照射は、例えば、３４０ｎｍ〜３９０ｎｍの範囲、３６０ｎｍ〜３９０ｎｍの範囲の波長を含む光、例えば３８５ｎｍの波長を含む光の照射によって行うことができる。光照射は、例えば０．１秒〜６０秒、１秒〜３０秒、５秒〜１５秒の範囲の照射時間によって行うことができる。光照射は、例えば０℃〜４０℃、０℃〜３０℃、０℃〜２０℃、０℃〜１０℃の範囲の温度で行うことができ、例えば氷冷下の温度で、例えば３７℃で、行うことができる。
[Light irradiation]
Formation of photocrosslinking by light irradiation is a photochemical reaction, and therefore can be performed under a wide range of conditions with respect to temperature, solvent, salt concentration, pH, and the like. For this reason, it can be carried out even under physiological conditions and can be suitably used for the suppression of gene expression. In a preferred embodiment, the light irradiation can be performed under the same conditions as the hybridization conditions. The light irradiation can be performed, for example, by irradiation with light having a wavelength in the range of 340 nm to 390 nm, light having a wavelength of 360 nm to 390 nm, for example, light having a wavelength of 385 nm. The light irradiation can be performed with an irradiation time in the range of 0.1 second to 60 seconds, 1 second to 30 seconds, 5 seconds to 15 seconds, for example. The light irradiation can be performed at a temperature in the range of, for example, 0 ° C. to 40 ° C., 0 ° C. to 30 ° C., 0 ° C. to 20 ° C., 0 ° C. to 10 ° C. ,It can be carried out.
［光応答性人工核酸プローブのセット］
本発明の光応答性人工核酸プローブは、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）表される光架橋性人工ヌクレオシドを、同じプローブ分子中に導入しており、これによってプローブ分子同士の光架橋形成を抑制して、プローブとしての失活を防止している。そこで、このような効果が生じるように式（Ｉ）及び式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが導入された光応答性人工核酸プローブであれば、本発明の範囲内であり、このようなプローブを使用した光架橋形成方法、光架橋体の製造方法、遺伝子発現抑制方法もまた、本発明の範囲内である。例えば、光応答性人工核酸プローブへの光架橋性人工ヌクレオシドの導入個数や全体の塩基長によらず、本発明の範囲内である。好適な実施の態様において、光応答性人工核酸プローブのセットとして、光応答性人工核酸プローブ１と光応答性人工核酸プローブ２の２種類のプローブ分子を使用することができる。しかし、光応答性人工核酸プローブのセットが、配列の特性により１種類のプローブ分子となった場合においても本発明の範囲内であり、あるいは２種類よりも多くの種類のプローブ分子が使用される場合においても本発明の範囲内である。
[Set of photoresponsive artificial nucleic acid probes]
In the photoresponsive artificial nucleic acid probe of the present invention, the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by formula (I) and formula (II) or formula (III) is introduced into the same probe molecule. Inhibition of photocrosslinking is prevented, and inactivation as a probe is prevented. Then, if it is a photoresponsive artificial nucleic acid probe into which the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) and the formula (II) or the formula (III) is introduced so as to produce such an effect, Within the scope of the present invention, a method for forming a photocrosslink using such a probe, a method for producing a photocrosslinked product, and a method for suppressing gene expression are also within the scope of the present invention. For example, it is within the scope of the present invention regardless of the number of photocrosslinkable artificial nucleosides introduced into the photoresponsive artificial nucleic acid probe and the total base length. In a preferred embodiment, two types of probe molecules, photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and photoresponsive artificial nucleic acid probe 2, can be used as a set of photoresponsive artificial nucleic acid probes. However, even when the set of photoresponsive artificial nucleic acid probes becomes one type of probe molecule due to the characteristics of the sequence, it is within the scope of the present invention, or more than two types of probe molecules are used. Even in this case, it is within the scope of the present invention.
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. The present invention is not limited to the examples illustrated below.
［実施例１］
［CNVＫ含有ＯＤＮの合成］
光応答性人工核酸３−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（CNVＫ）のアミダイト体、５−ｃｙａｎｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（CNＵ）のアミダイト体を、特許文献４（特許第４９４０３１１号）に開示された手順で合成した。合成したこれらのアミダイト体を、アセトニトリルで１００ｍＭの濃度へ調製し、核酸合成装置（製品名ＡＢＩ３４００、アプライドバイオシス社製）を使用して、ＯＤＮ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）を合成した。合成したＯＤＮはその後、２８％アンモニア水を用いて５５℃で８時間脱保護を行った。さらにその後、ＨＰＬＣにて精製を行い、質量分析により目的配列であることを確認した。合成したＯＤＮ（Ｐｒｏｂｅ１（Ｔ）、Ｐｒｏｂｅ１（CNＵ）、Ｐｒｏｂｅ２（Ｔ）、Ｐｒｏｂｅ２（CNＵ））の塩基配列を、表１に示す。Ｔｅｍｐ−１、Ｔｅｍｐ−２も同様の手法によって合成して、目的配列を得た。これらをあわせて、実験に使用した配列を、以下の表１に示す。
[Example 1]
[Synthesis of CNV K-containing ODN]
The amidite form of the photoresponsive artificial nucleic acid 3-cyanovinylcarbazole nucleotide ( CNV K) and the amidite form of 5-cyano-2'-deoxyuridine ( CN U) were synthesized by the procedure disclosed in Patent Document 4 (Patent No. 4940311). did. These synthesized amidites were prepared to a concentration of 100 mM with acetonitrile, and ODN (oligodeoxyribonucleotide) was synthesized using a nucleic acid synthesizer (product name ABI3400, manufactured by Applied Biosys). The synthesized ODN was then deprotected for 8 hours at 55 ° C. using 28% aqueous ammonia. Thereafter, purification was performed by HPLC, and the target sequence was confirmed by mass spectrometry. Table 1 shows the base sequences of the synthesized ODNs (Probe 1 (T), Probe 1 ( CN U), Probe 2 (T), and Probe 2 ( CN U)). Temp-1 and Temp-2 were synthesized by the same method to obtain the target sequence. Table 1 below shows the sequences used in the experiment together.
表中、光応答性人工核酸（Ｐｒｏｂｅ１（Ｔ）、Ｐｒｏｂｅ１（CNＵ）、Ｐｒｏｂｅ２（Ｔ）、Ｐｒｏｂｅ２（CNＵ））は、配列中に、次の式で表されるcnvＫ（３−シアノビニルカルバゾール−１’−β−デオキシリボシド）を、式（Ｉ）の光応答性人工塩基を有するヌクレオシドとして、リン酸ジエステル結合して有している。
表中、光応答性人工核酸（Ｐｒｏｂｅ１（CNＵ）、Ｐｒｏｂｅ２（CNＵ））は、上記配列中に、cnvＫ（３−シアノビニルカルバゾール−１’−β−デオキシリボシド）に加えて、次の式で表される５−ｃｙａｎｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（CNＵ）を、式（ＩＩ）の人工塩基を有するヌクレオシドとして、リン酸ジエステル結合して有している。
表中、アンチジーン法の人工核酸プローブとして本実験で使用したＰｒｏｂｅ１（Ｔ）、Ｐｒｏｂｅ１（CNＵ）、Ｐｒｏｂｅ２（Ｔ）、Ｐｒｏｂｅ２（CNＵ）は、アンチジーン法で使用できるように、Ｔｅｍｐ−１、Ｔｅｍｐ−２の中の配列の一部と、表の通りにそれぞれ相補的な配列を有している。Ｐｒｏｂｅ１（Ｔ）とＰｒｏｂｅ１（CNＵ）は、Ｐｒｏｂｅ１（Ｔ）の特定のＴがＰｒｏｂｅ１（CNＵ）ではCNＵに置換されていることを除いて、同じ配列である。Ｐｒｏｂｅ２（Ｔ）とＰｒｏｂｅ２（CNＵ）は、Ｐｒｏｂｅ２（Ｔ）の特定のＴがＰｒｏｂｅ２（CNＵ）ではCNＵに置換されていることを除いて、同じ配列である。Ｐｒｏｂｅ１（（Ｔ）及び（CNＵ））とＰｒｏｂｅ２（（Ｔ）及び（CNＵ））とは、相補的な配列を有しており、人工核酸の配列中に含まれている人工塩基は相補的な位置にある塩基がいずれの塩基であっても相補鎖の形成を妨げない。 In the table, was used in this experiment as an artificial nucleic acid probe of the antigene method Probe1 (T), Probe1 (CN U), Probe2 (T), Probe2 (CN U) , as can be used in anti-gene method, TEMP 1, part of the sequence in Temp-2 and each has a complementary sequence as shown in the table. Probe1 (T) and Probe1 ( CN U) are the same sequences except that a specific T of Probe1 (T) is replaced with CN U in Probe1 ( CN U). Probe2 (T) and Probe2 ( CN U) are the same sequence except that a specific T of Probe 2 (T) is replaced with CN U in Probe 2 ( CN U). Probe1 ((T) and (CN U)) and Probe2 and ((T) and (CN U)) has a sequence complementary, artificial bases contained in the sequence of the artificial nucleic acid complementary Even if the base at the proper position is any base, the formation of the complementary strand is not hindered.
表中、ゲノム遺伝子のＤＮＡの代替として本実験で使用したＴｅｍｐ−１、Ｔｅｍｐ−２は、相補的な配列を有していて、二重鎖ＤＮＡを形成可能であり、末端に標識部位として、蛍光色素（Ｃｙ３）を有している。Ｔｅｍｐ−１はＴｅｍｐ−２よりも配列長が長いために、Ｔｅｍｐ−１の鎖とＴｅｍｐ−２の鎖とによって形成される二重鎖は、末端に一重鎖部分を有する。 In the table, Temp-1 and Temp-2 used in this experiment as an alternative to the DNA of the genomic gene have complementary sequences and can form a double-stranded DNA. It has a fluorescent dye (Cy3). Since Temp-1 has a longer sequence length than Temp-2, the duplex formed by the Temp-1 strand and the Temp-2 strand has a single-stranded portion at the end.
［CNＵ置換CNVＫプローブによるプローブ同士の光架橋反応の抑制］
１０ｎＭ Ｔｅｍｐ−１、Ｔｅｍｐ−２と１０μＭのｐｒｏｂｅ１とｐｒｏｂｅ２をｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｎａ−ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）に溶解させ、３７℃で静置した。その後、ＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３８５ｎｍのＵＶ光の照射を３７℃で行った。光照射時間は０秒、１秒、５秒、１０秒、３０秒行った。それぞれのサンプルを変性ＰＡＧＥによる解析を行い、CNＵ置換CNVＫプローブの架橋抑制効果の検証を行った。変性ＰＡＧＥによる解析結果を図１に示す。また、図１の変性ＰＡＧＥを定量化したグラフを、図２として示す。図２は、CNＵ置換CNVＫプローブによるプローブ間光架橋の抑制の結果を示すグラフである。
[Suppression of photocrosslinking reaction between probes by CN U substituted CNV K probe]
10 nM Temp-1, Temp-2, and 10 μM probe1 and probe2 were dissolved in buffer (100 mM NaCl, 50 mM Na-carboxylate) and allowed to stand at 37 ° C. Then, irradiation of 385 nm UV light was performed at 37 ° C. using a UV-LED irradiator. The light irradiation time was 0 second, 1 second, 5 seconds, 10 seconds, and 30 seconds. Each sample is analyzed by denaturing PAGE, and verified the crosslinking effect of inhibiting CN U substituted CNV K probe. The analysis result by denaturing PAGE is shown in FIG. Moreover, the graph which quantified the modification | denaturation PAGE of FIG. 1 is shown as FIG. FIG. 2 is a graph showing the results of suppression of interprobe photocrosslinking by a CN U-substituted CNV K probe.
これらの結果から示されるように、Ｐｒｏｂｅ１とＰｒｏｂｅ２が共にチミンの場合（図１のＡ）（図２のＰｒｏｂｅ（Ｔ／Ｔ））、もしくはどちらか一方だけCNＵに置換されている場合（図１のＢ）（図２のＰｒｏｂｅ（Ｔ／CNＵ））及び（図１のＣ）（図２のＰｒｏｂｅ（CNＵ／Ｔ））の場合には、１秒の光照射で８０％近い光架橋反応が進行している。このことは、アンチジーン法でこれらをプローブとして用いた場合に、プローブ同士の架橋によって、有効なプローブが秒単位の時間で失われてしまうことを意味する。一方、Ｐｒｏｂｅ１とＰｒｏｂｅ２が共にCNＵに置換されている場合（図１のＤ）（図２のＰｒｏｂｅ（CNＵ／CNＵ））では、光照射を３０秒行っても９５％以上のプローブが未架橋の状態で残っており、CNＵ置換CNVＫプローブの組み合わせを用いることによってプローブ同士の架橋が抑制できていることが確認された。 As shown from these results, when both Probe1 and Probe2 are thymine (A in FIG. 1) (Probe (T / T) in FIG. 2), or when only one of them is replaced with CN U (FIG. 1). 1 B) (Probe (T / CN U) in FIG. 2) and (C in FIG. 1) (Probe ( CN U / T) in FIG. 2) A crosslinking reaction is in progress. This means that when these are used as probes in the anti-gene method, effective probes are lost in seconds by cross-linking of the probes. On the other hand, when both Probe 1 and Probe 2 are replaced with CN U (D in FIG. 1) (Probe ( CN U / CN U) in FIG. 2), more than 95% of the probes are detected even after 30 seconds of light irradiation. It remained in an uncrosslinked state, and it was confirmed that cross-linking of probes could be suppressed by using a combination of CN U-substituted CNV K probes.
上記の実験による架橋反応と抑制のスキームを、図３及び図４として示す。 The cross-linking reaction and inhibition scheme by the above experiment is shown as FIG. 3 and FIG.
［CNＵ置換CNVＫプローブを用いた二本鎖への光架橋］
このように、CNVＫプローブのアンチジーン法への適応の際に問題となっていたプローブ同士の光架橋がCNＵに置換することによって抑制できることが確認できた。そこで、次に、長い二本鎖ＤＮＡへのCNＵ置換CNVＫプローブの光架橋反応の確認を行った。１０ｎＭのＴｅｍｐ−１、Ｔｅｍｐ−２と、１０μＭのＰｒｏｂｅ１（（Ｔ）及び（cnＵ））とＰｒｏｂｅ２（（Ｔ）及び（cnＵ））をｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｎａ−ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）に溶解させ、３７℃で静置した。その後、ＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３８５ｎｍの光照射を３７℃で３０秒間行った。それぞれのサンプルを変性ＰＡＧＥによる解析を行い、それぞれのプローブを使用した際の二本鎖ＤＮＡに対する光架橋率を算出した。長い二本鎖に対する光架橋反応の変性ＰＡＧＥによる解析結果を図５に示す。また、図５の変性ＰＡＧＥを定量化したグラフを、図６として示す。図６は、CNＵ置換CNVＫプローブの二本鎖ＤＮＡに対する光架橋率を示すグラフである。図６の棒グラフのそれぞれのバーの上部にある数値は、それぞれの架橋率（％）である。
[ Photocrosslinking to double strand using CN U-substituted CNV K probe]
Thus, it was confirmed that the photocrosslinking between the probes, which had been a problem when the CNV K probe was applied to the antigene method, could be suppressed by substituting CNU . Accordingly, next, it was confirmed photocrosslinking reaction of CN U substituted CNV K probes to long double-stranded DNA. A Temp-1, Temp-2 of 10 nM, was dissolved in a 10μM Probe1 ((T) and (cn U)) and Probe2 ((T) and (cn U)) a buffer (100mM NaCl, 50mM Na- cacodylate) And allowed to stand at 37 ° C. Then, using a UV-LED irradiator, 385 nm light irradiation was performed at 37 ° C. for 30 seconds. Each sample was analyzed by denaturing PAGE, and the photocrosslinking rate for the double-stranded DNA when each probe was used was calculated. FIG. 5 shows the analysis results of the photocrosslinking reaction for long double strands by denaturing PAGE. Moreover, the graph which quantified the modified | denatured PAGE of FIG. 5 is shown as FIG. FIG. 6 is a graph showing the photocrosslinking rate of a CN U-substituted CNV K probe to double-stranded DNA. The numerical values at the top of each bar in the bar graph of FIG. 6 are the respective cross-linking ratios (%).
図５の変性ＰＡＧＥにおいて、Ｔｅｍｐ１及びＴｅｍｐ２の矢印の位置は、それぞれのＤＮＡ鎖が単独で泳動された場合のバンドの位置を示す。図５の変性ＰＡＧＥにおいて、Ｔｅｍｐ１＿架橋体及びＴｅｍｐ２＿架橋体の矢印の位置は、それぞれのＤＮＡ鎖がプローブによって架橋された場合のバンドの位置を示す。図５及び図６において、光照射のマル（○）は光照射有りを示し、バツ（×）は光照射無しを示す。図６の棒グラフのそれぞれのバーの上部にある数値は、それぞれの架橋率（％）の値である。 In the denaturing PAGE of FIG. 5, the positions of the Temp1 and Temp2 arrows indicate the positions of the bands when the respective DNA strands are electrophoresed alone. In the modified PAGE of FIG. 5, the positions of the arrows of the Temp1_crosslinked product and the Temp2_crosslinked product indicate the positions of the bands when the respective DNA strands are crosslinked by the probe. In FIGS. 5 and 6, the light irradiation circle (◯) indicates that there is light irradiation, and the cross (×) indicates that there is no light irradiation. The numerical value at the top of each bar in the bar graph of FIG. 6 is the value of the respective cross-linking rate (%).
これらの結果から示されるように、各プローブを用いた際の光架橋を変性ＰＡＧＥにより解析したところ、Ｐｒｏｂｅ１とＰｒｏｂｅ２の両側、もしくは片側がチミンの場合には長い二本鎖ＤＮＡにはほとんど光架橋していなかった。一方、両側のプローブをCNＵに置換した場合では二本鎖ＤＮＡに対してそれぞれプローブが光架橋したバンドが確認できた。この結果から、CNＵに置換したCNVＫプローブを用いることによって長い二本鎖ＤＮＡに対して等温条件下で光架橋可能であることが明らかとなった。すなわち、ＰＣＲサイクルのような昇温降温のサイクルを行う必要がなく、作業温度を維持しただけであって特段の温度操作を要しない条件下で（等温条件下で）、CNＵに置換したCNVＫプローブは長い二本鎖ＤＮＡに光架橋した。 As shown by these results, when photocrosslinking when each probe was used was analyzed by denaturing PAGE, when both sides of Probe1 and Probe2 or one side was thymine, almost no photocrosslinking was observed in long double-stranded DNA. I did not. On the other hand, when the probes on both sides were replaced with CN U, bands in which the probes were photocrosslinked with respect to the double-stranded DNA were confirmed. These results revealed a photocrosslinkable under isothermal conditions for long double-stranded DNA by using CNV K probe was replaced by CN U. That is, there is no need to perform a temperature increase / decrease cycle such as a PCR cycle, and the CNV replaced with CN U under the condition that only the working temperature is maintained and no special temperature operation is required (under isothermal conditions). The K probe was photocrosslinked to long double stranded DNA.
［結果のまとめ］
図７に、CNＵ置換CNVＫプローブによる二本鎖ＤＮＡへの光架橋反応のスキームを示す説明図を示す。なお、図７ではさらにＰＣＲにおける鎖の伸長のブロックの様子をあわせて示す。このように、CNVＫプローブの光架橋位置に存在するＴをCNＵに置換することによってプローブ同士の架橋を抑制でき、３７℃の条件下で二本鎖に対して光架橋していると本発明者は考えている。
[Summary of results]
FIG. 7 is an explanatory diagram showing a scheme of a photocrosslinking reaction to a double-stranded DNA using a CN U-substituted CNV K probe. FIG. 7 also shows the state of the chain extension block in PCR. In this way, by substituting CN at the photocrosslinking position of the CNV K probe with CNU , cross-linking of the probes can be suppressed. The inventor thinks.
［実施例２］
［アンチジーン法］
実際にアンチジーン法として、光架橋により遺伝子の増幅が抑制できるかどうかの検証を以下の通りに行った。
[Example 2]
[Anti-gene method]
As an anti-gene method, verification as to whether gene amplification can be suppressed by photocrosslinking was carried out as follows.
［CNVＫ含有ＯＤＮの合成］
研究室で合成した光応答性人工核酸３−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（CNVＫ）のアミダイト体、５−ｃｙａｎｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（CNＵ）のアミダイト体をアセトニトリルで１００ｍＭに調製し、ＡＢＩ３４００にてＯＤＮを合成した。合成したＯＤＮ配列は下記表２に示す。これらが実験に使用したプローブ配列である。合成後、２８％アンモニア水を用いて５５℃で８時間脱保護を行った。その後、ＨＰＬＣにて精製を行い、質量分析により目的配列であることを確認した。
[Synthesis of CNV K-containing ODN]
Amidite bodies of photoresponsive artificial nucleic acid 3-cyanovinylcarbazole nucleotide ( CNV K) and 5-cyano-2'-deoxyuridine ( CN U) synthesized in the laboratory were prepared to 100 mM with acetonitrile, and ODN was prepared using ABI3400. Synthesized. The synthesized ODN sequence is shown in Table 2 below. These are the probe sequences used in the experiment. After the synthesis, deprotection was performed for 8 hours at 55 ° C. using 28% aqueous ammonia. Then, it refine | purified in HPLC and confirmed that it was the target arrangement | sequence by mass spectrometry.
［光架橋のスキームとアンチジーン法］
以下の実験においてターゲットとなる二本鎖ＤＮＡとして、ヒトのゲノムＤＮＡ（３０億塩基対）を使用した。その中でＰｒｏｂｅが結合するのは染色体１７（８８００万塩基対）のＢＲＣＡ１遺伝子である。ＢＲＣＡ１はガン関連遺伝子の一つである。Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに対して図８に示してあるように光架橋する配列になっている。図８は、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに対するＰｒｏｂｅの光架橋の説明図である。
[Photocrosslinking scheme and anti-gene method]
Human genomic DNA (3 billion base pairs) was used as the target double-stranded DNA in the following experiments. Among them, Probe binds to the BRCA1 gene of chromosome 17 (88 million base pairs). BRCA1 is one of cancer-related genes. As shown in FIG. 8, the genomic DNA has a photocrosslinking sequence. FIG. 8 is an explanatory diagram of probe photocrosslinking to Genomic DNA.
プローブ同士では図９に示す二本鎖のような二本鎖は形成できるものの、架橋部位にCNＵが来るように設計してあり、プローブ同士で光架橋することはできない。図９はプローブ同士の二本鎖構造を示す説明図である。 Although a double strand such as the double strand shown in FIG. 9 can be formed between the probes, it is designed so that CNU comes to the cross-linking site, and the probes cannot be photocrosslinked. FIG. 9 is an explanatory diagram showing a double-stranded structure between probes.
そして、今回は光架橋されたＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡが増幅されないことを確認する為に、リアルタイムＰＣＲにより増幅抑制率を算出した。ＰＣＲに使用するプライマー配列は表３に示す通りである。
上記のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅されるＢＲＣＡ１の配列を図１０に示す。実際には二本鎖のＤＮＡであるが、ここではターゲットとなるＢＲＣＡ１側の配列を記載している。 The sequence of BRCA1 amplified by PCR using the above primers is shown in FIG. Actually, it is a double-stranded DNA, but here, the target sequence of BRCA1 is described.
図１０の配列において、プローブは配列の３行目のＡＧＣＣからＣＣＡＴまでの部分に結合する。図１０の配列の１行目のＡＡＴＧからＡＧＴＡまでと、５行目のＧＴＡＡから６行目のＡＣＡＴまでは、ＰＣＲの際のプライマー配列である。
反応スキームとしては長いＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに対してプローブ投入後光照射を行うことによって光架橋反応が進行する。そこにプライマーを投入し、ＰＣＲ反応を行う。通常はＰＣＲによって、目的とするＤＮＡ断片（３２０ｂｐ）が増幅されるのだが、光架橋されたＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡは光架橋反応によってＰＣＲが阻害されるため、増幅が起こらない。このスキームを図１１として示す。
In the sequence of FIG. 10, the probe binds to the part from AGCC to CCAT in the third row of the sequence. In the sequence of FIG. 10, AATG to AGTA in the first row and GTAA in the fifth row to ACAT in the sixth row are primer sequences for PCR.
As a reaction scheme, a photocrosslinking reaction proceeds by irradiating a long genomic DNA with light after introducing a probe. Primers are put there and a PCR reaction is performed. Usually, the target DNA fragment (320 bp) is amplified by PCR, but amplification does not occur in the photocrosslinked Genomic DNA because PCR is inhibited by the photocrosslinking reaction. This scheme is shown as FIG.
［Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡとｐｒｏｂｅとの光架橋反応］
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ １００ｎｇ／ｕｌに対してｐｒｏｂｅ−３とｐｒｏｂｅ−４をそれぞれ２００ｐＭの濃度になるように調製した。サンプル調製後、３７度で１５分間インキュベートした後、３７℃の温度プレート上で３８５ｎｍの光照射を１時間行った。その後、光照射後のサンプル２３μＬに対してＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒを１μｌ（終濃度５００ｎＭ）になるように加え、ＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を２５μＬ加え、リアルタイムＰＣＲにより解析した。図１２にリアルタイムＰＣＲ解析結果を示す。
[Photocrosslinking reaction of Human Genomic DNA and probe]
Probe-3 and probe-4 were each prepared to a concentration of 200 pM against 100 ng / ul of Human Genomic DNA. After sample preparation, the plate was incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then irradiated with light of 385 nm on a temperature plate at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, 1 μl (primary concentration 500 nM) of PCR primer was added to 23 μL of the sample after light irradiation, and 25 μL of SYBR premix Ex Taq II (Takara) was added, and analyzed by real-time PCR. FIG. 12 shows the results of real-time PCR analysis.
図１２のグラフのカーブは、それぞれ、サイクル数２５において縦軸の値が大きいカーブから順に、プローブなしのカーブ、ｐｒｏｂｅ３とｐｒｏｂｅ４を使用したカーブ、ｐｒｏｂｅ−３（CNＵ）とｐｒｏｂｅ−４（CNＵ）を使用したカーブを意味する。
通常のＰＣＲ（プローブなし）の場合にはＰＣＲの増幅反応が進むにつれて蛍光の値が増加して行く様子が確認できる。一方、ｐｒｏｂｅ−３とｐｒｏｂｅ−４を投入した場合にも蛍光が増加してゆく。一方、ｐｒｏｂｅ−３（CNＵ）とｐｒｏｂｅ−４（CNＵ）を入れたものでは、蛍光の値が増加してゆくサイクル数が遅くなっている。これは増幅に使用できるＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡが少ないことを示しており、ｐｒｏｂｅ−３（CNＵ）とｐｒｏｂｅ−４（CNＵ）がＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに光架橋し、増幅を阻害していることが確認できた。
The curves in the graph of FIG. 12 are the curves without probes, the curves using probe3 and probe4, probe-3 ( CN U) and probe-4 ( CN U) means a curve using.
In the case of normal PCR (no probe), it can be confirmed that the fluorescence value increases as the PCR amplification reaction proceeds. On the other hand, when probe-3 and probe-4 are added, fluorescence increases. On the other hand, in the case where probe-3 ( CN U) and probe-4 ( CN U) are inserted, the number of cycles in which the fluorescence value increases is slow. This indicates that less Genomic DNA that can be used for amplification, probe-3 (CN U) and probe-4 (CN U) is photocrosslinked in Genomic DNA, it was confirmed that inhibiting amplification .
次に５０％増幅された際のサイクル数を基に、増幅抑制率を算出した。図１３に算出した増幅抑制率のグラフを示す。図１３において（１）〜（３）はそれぞれ以下である： （１）：プローブなし、（２）：ｐｒｏｂｅ３とｐｒｏｂｅ４を使用、（３）：ｐｒｏｂｅ−３（CNＵ）とｐｒｏｂｅ−４（CNＵ）を使用。その結果、ｐｒｏｂｅ−３（CNＵ）とｐｒｏｂｅ−４（CNＵ）を使用した際にｐｒｏｂｅなしの場合と比較して約９６％の増幅抑制効果があることが分かった。 Next, the amplification suppression rate was calculated based on the number of cycles when 50% amplification was performed. FIG. 13 shows a graph of the calculated amplification suppression rate. In FIG. 13, (1) to (3) are as follows: (1): no probe, (2): using probe 3 and probe 4, (3): probe-3 ( CN U) and probe-4 ( CN Use U). As a result, it was found that when probe-3 ( CN U) and probe-4 ( CN U) were used, there was an amplification suppression effect of about 96% compared to the case without probe.
［結果のまとめ］
これらの結果から、CNＵ、CNVＫを用いた長い二本鎖に対する光架橋反応はＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの様な非常に長いＤＮＡに対しても高効率に光架橋していることが確認できた。また、光架橋された二本鎖ＤＮＡはＰＣＲのような遺伝子増幅を阻害していることから、高いアンチジーン効果を有していることが明らかとなった。
[Summary of results]
From these results, it was confirmed that the photocrosslinking reaction to long double strands using CN U and CNV K was highly efficient to photocrosslinking even very long DNA such as Human Genomic DNA. Moreover, since the photocrosslinked double-stranded DNA inhibits gene amplification such as PCR, it has been clarified that it has a high antigene effect.
［実施例３］
［シアノシチジン置換］
［ＯＤＮの合成］
研究室で合成した光応答性人工核酸３−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（CNVＫ）のアミダイト体、及びＴｒｉａｚｏｌｅ−５’−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−２’−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（CNＣ）のアミダイト体をアセトニトリルで１００ｍＭに調整し、ＡＢＩ３４００にてＯＤＮを合成した。合成したＯＤＮ配列は次の表４に示す。合成後、２８％アンモニア水を用いて５５℃で１２時間脱保護を行った。その後、ＨＰＬＣにて精製を行い、質量分析により目的配列であることを確認した。シアノシチジン（CNＣ）の化学構造式を以下に示す。
[Example 3]
[Cyanocytidine substitution]
[Synthesis of ODN]
The amidite form of the photoresponsive artificial nucleic acid 3-cyanovinylcarbazole nucleotide ( CNV K) synthesized in the laboratory and the amidite form of Triazole-5'-trifluoromethyl-2'-deoxythymidine ( CN C) were adjusted to 100 mM with acetonitrile, and adjusted to 100 mM with acetonitrile. ODN was synthesized. The synthesized ODN sequence is shown in Table 4 below. After the synthesis, deprotection was performed for 12 hours at 55 ° C. using 28% aqueous ammonia. Then, it refine | purified in HPLC and confirmed that it was the target arrangement | sequence by mass spectrometry. The chemical structural formula of cyanocytidine ( CNC ) is shown below.
［CNVＫとCNＣの光反応性の解析］
１０μＭ ＯＤＮ（Ｋ）と１０μＭ ＯＤＮ（CNＣ）をｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で９０℃で５分間加熱した後、ゆっくり４℃までアニーリングを行った。その後、ＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を４℃で行い、ＵＰＬＣ解析を行った。ＵＰＬＣ解析結果を図１４に示す。
[Analysis of photoreactivity of CNV K and CN C]
10 μM ODN (K) and 10 μM ODN ( CN C) were heated in buffer (100 mM NaCl, 50 mM sodium cacodylate) at 90 ° C. for 5 minutes, and then slowly annealed to 4 ° C. Thereafter, using a UV-LED irradiator, UV irradiation at 366 nm was performed at 4 ° C., and UPLC analysis was performed. The UPLC analysis result is shown in FIG.
ＵＰＬＣ解析の結果、CNＣはCNVＫとの光架橋反応が著しく低いことが明らかとなった。すなわち、図１５で示すような光架橋反応はほぼ進行しないことがわかった。 Results of UPLC analysis, CN C was found to be significantly lower photocrosslinking reaction with CNV K. That is, it was found that the photocrosslinking reaction as shown in FIG.
本発明は、標的二重鎖核酸に対して光架橋を形成できて、プローブ同士の光架橋が十分に抑制された人工核酸プローブを提供する。本発明は産業上有用な発明である。 The present invention provides an artificial nucleic acid probe that can form a photocrosslink with respect to a target double-stranded nucleic acid and sufficiently suppresses photocrosslinking between probes. The present invention is industrially useful.
Claims (14)
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入され、以下の式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された人工核酸からなる、光応答性人工核酸プローブ：
式（Ｉ）：
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１４は、水素原子であり、
Ｒ１５は、水酸基であり、
Ｒ１６は、水素原子又は水酸基である）、
式（ＩＩ）：
Ｒ２４は、水素原子であり、
Ｒ２５は、水酸基であり、
Ｒ２６は、水素原子又は水酸基である）、
式（ＩＩＩ）：
Ｒ３４は、水素原子であり、
Ｒ３５は、水酸基であり、
Ｒ３６は、水素原子又は水酸基である）。 A photoresponsive artificial nucleic acid probe for photocrosslinking a target double-stranded nucleic acid,
The photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the following formula (I) is introduced into the base sequence by a phosphodiester bond, and the artificial nucleoside represented by the following formula (II) or formula (III) is a phosphodiester bond. A photoresponsive artificial nucleic acid probe comprising an artificial nucleic acid introduced into a base sequence by:
Formula (I):
R12 and R13 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or a hydrogen atom,
R14 is a hydrogen atom;
R15 is a hydroxyl group;
R16 is a hydrogen atom or a hydroxyl group),
Formula (II):
R24 is a hydrogen atom,
R25 is a hydroxyl group;
R26 is a hydrogen atom or a hydroxyl group),
Formula (III):
R34 is a hydrogen atom,
R35 is a hydroxyl group,
R36 is a hydrogen atom or a hydroxyl group).
光応答性人工核酸プローブ１は、標的二重鎖核酸の片側の鎖（標的核酸鎖１）の一部と相補的な塩基配列を有し、
光応答性人工核酸プローブ１は、標的核酸鎖１の塩基配列中のピリミジン塩基に対して、光架橋可能な位置に、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドを有し、
光応答性人工核酸プローブ１は、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列と、相補的でない部分塩基配列の部分を有し、
光応答性人工核酸プローブ１は、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが、光応答性人工核酸プローブ２に対して相補的な部分塩基配列の中に位置しており、
光応答性人工核酸プローブ２は、標的二重鎖核酸の標的核酸鎖１でない側の鎖（標的核酸鎖２）の一部と相補的な塩基配列を有し、
光応答性人工核酸プローブ２は、標的核酸鎖２の塩基配列中のピリミジン塩基に対して、光架橋可能な位置に、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドを有し、
光応答性人工核酸プローブ２は、光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的な部分塩基配列と、相補的でない部分塩基配列を有し、
光応答性人工核酸プローブ２は、式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが、光応答性人工核酸プローブ１に対して相補的な部分塩基配列の中に位置しており、
さらに、光応答性人工核酸プローブ１の塩基配列は、
標的核酸鎖２の塩基配列において光応答性人工核酸プローブ２の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基と対応する位置に、ピリミジン塩基に代えて、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを塩基として有しており、
さらに、光応答性人工核酸プローブ２の塩基配列は、
標的核酸鎖１の塩基配列において光応答性人工核酸プローブ１の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドが光架橋可能な位置にあるピリミジン塩基と対応する位置に、ピリミジン塩基に代えて、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される人工ヌクレオシドを塩基として有している、光応答性人工核酸プローブ。 The photoresponsive artificial nucleic acid probe according to claim 1, wherein the photoresponsive artificial nucleic acid probe comprises a set of a photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and a photoresponsive artificial nucleic acid probe 2,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a base sequence complementary to a part of one strand (target nucleic acid strand 1) of the target double-stranded nucleic acid,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) at a position capable of photocrosslinking with respect to a pyrimidine base in the base sequence of the target nucleic acid strand 1;
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 has a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and a partial base sequence that is not complementary,
In the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1, the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is located in a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 has a base sequence complementary to a part of the target nucleic acid strand 1 side (target nucleic acid strand 2) of the target double-stranded nucleic acid,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 has a photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) at a position capable of photocrosslinking with respect to the pyrimidine base in the base sequence of the target nucleic acid strand 2,
The photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 has a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and a partial base sequence that is not complementary,
In the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2, the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) is located in a partial base sequence complementary to the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1,
Furthermore, the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is
In place of the pyrimidine base at the position corresponding to the pyrimidine base at the position where the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 can be photocrosslinked in the base sequence of the target nucleic acid chain 2 Having an artificial nucleoside represented by formula (II) or formula (III) as a base,
Furthermore, the base sequence of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 is
In place of the pyrimidine base at the position corresponding to the pyrimidine base at the position where the photocrosslinkable artificial nucleoside represented by the formula (I) of the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 is photocrosslinkable in the base sequence of the target nucleic acid strand 1 A photoresponsive artificial nucleic acid probe having an artificial nucleoside represented by formula (II) or formula (III) as a base.
を含む、標的遺伝子の発現を光抑制する方法。 A step of photocrosslinking a double-stranded nucleic acid of a target gene using the photoresponsive artificial nucleic acid probe according to claim 1;
A method for optically suppressing the expression of a target gene, comprising:
ハイブリダイズした光応答性人工核酸プローブ１及び光応答性人工核酸プローブ２と、標的二重鎖核酸に対して、光照射して、光応答性人工核酸プローブ１と標的核酸鎖１を光架橋し、光応答性人工核酸プローブ２と標的核酸鎖２を光架橋する工程、
を含む、請求項１１〜１２のいずれかに記載の方法。 A step of hybridizing the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 according to any one of claims 2 to 8 with a target double-stranded nucleic acid;
The hybridized photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and the target double-stranded nucleic acid are irradiated with light to photocrosslink the photoresponsive artificial nucleic acid probe 1 and the target nucleic acid strand 1. , Photocrosslinking the photoresponsive artificial nucleic acid probe 2 and the target nucleic acid chain 2;
The method according to claim 11, comprising:
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