JP2015006150A - Production method of double-stranded oligonucleotide subjected to chain exchange - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide.
分子生物学の分野の基本的な技術に、二重鎖核酸の鎖交換反応技術がある。この鎖交換反応技術は、多くの応用があり、例えば、ＳＮＰｓの検出や、ＤＮＡ結合タンパクの検出などを効率的に行うために用いられる。そのために、鎖交換反応技術は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。特に、最近では、テーラーメイド治療への期待が高まるにしたがって、より簡易に遺伝子診断を行うための技術として注目されている。 A basic technique in the field of molecular biology is a double-stranded nucleic acid strand exchange reaction technique. This strand exchange reaction technique has many applications, and is used, for example, to efficiently detect SNPs and DNA binding proteins. For this reason, the strand exchange reaction technique is not limited to basic research in molecular biology, but includes, for example, diagnosis and treatment in the medical field, development and production of therapeutic drugs and diagnostic agents, and enzymes and microorganisms in the industrial and agricultural fields. It is an extremely important technology used for development and manufacturing. In particular, recently, as expectations for tailor-made treatment have increased, it has been attracting attention as a technique for performing genetic diagnosis more easily.
このようなＤＮＡの鎖交換反応は、詳細な解析（非特許文献１：Ｗｉｎｆｒｅｅ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，ｐｐ１７３０３−１７３１４）が行われ、高い精度でシミュレーションすることが可能となっている。このような解析から、鎖交換反応にはある程度の時間を必要とすることがわかっている。そして、鎖交換反応に要する時間の長さは、鎖交換反応を応用を広げるうえで、大きな制約となっている。 Detailed analysis (Non-patent Document 1: Winfree E et al, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, pp 17303-17314) is performed for such a strand exchange reaction of DNA, and simulation is performed with high accuracy. Is possible. From such analysis, it is known that the chain exchange reaction requires a certain amount of time. The length of time required for the chain exchange reaction is a major limitation in extending the application of the chain exchange reaction.
そこで、鎖交換反応の高速化のための手法が検討されてきた。例えば、カチオン性高分子を導入する手法（非特許文献２：Ｍａｒｕｙａｍａ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００１，７，ｐｐ１７６−１８０）が報告されている。しかし、カチオン性高分子を用いる場合はｂｕｆｆｅｒに制限が生じ生体内に近い条件では使用できないという、大きな制約が生じるという問題がある。 Therefore, techniques for speeding up the strand exchange reaction have been studied. For example, a method of introducing a cationic polymer (Non-patent Document 2: Maruyama A et al, Chem. Eur. J. 2001, 7, pp 176-180) has been reported. However, when a cationic polymer is used, there is a problem that the buffer is limited, and there is a great restriction that it cannot be used under conditions close to the living body.
あるいは、例えば、ＰＮＡなどの電荷を持たない骨格（非特許文献３：Ｏｌｉｖｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，１６，ｐｐ３４−３９）を用いることによる鎖交換反応の高速化が報告されている。しかし、このように骨格にＰＮＡを使用しなければならないのであれば、天然の核酸配列を使用できないという、大きな制約が生じるという問題がある。 Alternatively, for example, a high-speed strand exchange reaction by using a non-charged skeleton such as PNA (Non-patent Document 3: Oliver et al, Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, pp34-39) has been reported. ing. However, if PNA must be used for the backbone in this way, there is a problem that a great restriction arises that a natural nucleic acid sequence cannot be used.
本発明者の研究グループによって、光応答性人工ヌクレオチドが開発され、特許出願が行われている（特許文献１）。 A photoresponsive artificial nucleotide has been developed by the inventor's research group, and a patent application has been filed (Patent Document 1).
このように鎖交換反応の高速化のための手法が求められている。本発明の目的は、高速化された鎖交換反応の方法を提供することにある。 Thus, a method for speeding up the strand exchange reaction is required. An object of the present invention is to provide a method for an accelerated strand exchange reaction.
本発明者は、鎖交換反応の高速化を鋭意研究してきたところ、鎖交換反応前の二重鎖、あるいは一重鎖のなかに、ビニルカルバゾール構造を有する光応答性の人工塩基をあらかじめ導入しておき、この光応答性の修飾塩基に光照射して、所定の光架橋を形成させることによって、鎖交換反応が著しく高速化されることを見いだして、本発明に到達した。本発明によれば、鎖交換反応は著しく高速化されて、極めて短時間で、鎖交換された二重鎖を新たに得ることができる。 The present inventor has intensively studied speeding up of the chain exchange reaction, and introduced a photoresponsive artificial base having a vinylcarbazole structure into the double chain or single chain before the chain exchange reaction in advance. In addition, the present inventors have found that the chain exchange reaction is remarkably accelerated by irradiating the photoresponsive modified base with light to form a predetermined photocrosslink. According to the present invention, the strand exchange reaction is remarkably accelerated, and a newly exchanged duplex can be newly obtained in a very short time.
したがって、本発明は、次の（１）〜にある。
（１）
第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第２のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、
第３のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ３）（ただし、
ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、
ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ２の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。
（２）
第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第４のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ４）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ４は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ４のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、
第５のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ５）（ただし、
ＯＤＮ５は、ＯＤＮ４のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、
ＯＤＮ５は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ４は、ＯＤＮ５の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ４の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ５とＯＤＮ４の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。
Therefore, this invention exists in following (1)-.
(1)
A double-stranded oligonucleotide obtained by hybridizing a first oligonucleotide (ODN1) and a second oligonucleotide (ODN2) (however,
ODN2 has a base sequence (HYB1) that can hybridize with ODN1, and has a base sequence (NHYB1) that does not hybridize with ODN1 adjacent to HYB1,
ODN2 has a photoresponsive modified base in the base sequence,
ODN1 does not have a photocrosslinkable base at a position where the photoresponsive modified base of HYB1 of ODN2 can be photocrosslinked,
The double-stranded oligonucleotide is single-stranded in the NYYB1 region of ODN2. )When,
Third oligonucleotide (ODN3) (where
ODN3 continuously has a base sequence (HYB2) that can hybridize to HYB1 and NHYB1 of ODN2,
ODN3 has a photocrosslinkable base at a position where the photoresponsive modified base of ODN2 can be photocrosslinked. ) And photocrosslinking by irradiating with light in an aqueous solution,
A method for producing a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide in which the duplexes of ODN1 and ODN2 are subjected to strand exchange to form a duplex of ODN3 and ODN2.
(2)
A double-stranded oligonucleotide obtained by hybridizing the first oligonucleotide (ODN1) and the fourth oligonucleotide (ODN4) (however,
ODN4 has a base sequence (HYB1) that can hybridize with ODN1, and has a base sequence (NHYB1) that does not hybridize with ODN1 adjacent to HYB1,
The double-stranded oligonucleotide is single-stranded in the NYYB1 region of ODN4. )When,
5th oligonucleotide (ODN5) (however,
ODN5 has a base sequence (HYB2) capable of hybridizing to HYB1 and NHYB1 of ODN4 successively,
ODN5 has a photoresponsive modified base in the base sequence,
ODN4 has a photocrosslinkable base at a position where the photoresponsive modified base of ODN5 can be photocrosslinked. ) And photocrosslinking by irradiating with light in an aqueous solution,
A method for producing a chain-exchanged double-stranded oligonucleotide in which the double-chains of ODN1 and ODN4 are subjected to strand exchange to form a duplex of ODN5 and ODN4.
（３）
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式Ｉ：
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｎ−は、Ｎの一価基を表す。）
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
(3)
A photoresponsive modified base is used as the base moiety of a nucleobase, as shown in the following formula I:
R1 and R2 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or hydrogen;
N- represents a monovalent group of N. )
The method according to any one of (1) to (2), which is a photoresponsive modified base having an artificial base represented by:
（４）
光応答性修飾塩基と光架橋可能な塩基が、シトシン、ウラシル、チミン、シュードウラシル及びシュードチミンからなる群から選択された１種以上の塩基である、（３）に記載の方法。
（５）
光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置が、光応答性修飾塩基の５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置である、（３）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）が、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）の５’末端側又は３’末端側に隣接している、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
光照射が、３６６ｎｍの波長を含む光の光照射である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
光照射が、０．０１〜３０秒間の光照射である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）
光照射が、０〜７０℃の範囲の温度で行われる、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る１本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させて、
鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されたことが、蛍光発光によって検出可能である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
(4)
The method according to (3), wherein the base capable of photocrosslinking with the photoresponsive modified base is at least one base selected from the group consisting of cytosine, uracil, thymine, pseudouracil and pseudothymine.
(5)
The method according to any one of (3) to (4), wherein the position at which the photoresponsive modified base can be photocrosslinked is a position complementary to a base adjacent to the 5 ′ end of the photoresponsive modified base.
(6)
The base sequence that does not hybridize with ODN1 (NHYB1) is adjacent to the 5 ′ end side or 3 ′ end side of the base sequence that can hybridize with ODN1 (HYB1), or any one of (1) to (5) The method described.
(7)
The method according to any one of (1) to (6), wherein the light irradiation is light irradiation including light having a wavelength of 366 nm.
(8)
The method according to any one of (1) to (7), wherein the light irradiation is light irradiation for 0.01 to 30 seconds.
(9)
The method according to any one of (1) to (8), wherein the light irradiation is performed at a temperature in the range of 0 to 70 ° C.
(10)
Fluorescent dye molecule is bound to any one strand of the double-stranded oligonucleotide before the strand exchange reaction, and the fluorescence-quenching molecule is attached to the remaining one strand at a position where the fluorescent dye molecule can be quenched. Combined
The method according to any one of (1) to (9), wherein the production of a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide is detectable by fluorescence.
さらに、本発明は次の（１１）〜にもある。
（１１）
ＯＤＮ２が、ＨＹＢ１の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、（１）に記載の方法。
（１２）
ＯＤＮ２のＨＹＢ１の塩基配列が、光応答性修飾塩基の位置を除いて、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、
ＯＤＮ３のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置、及び光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置を除いて、ＯＤＮ２と相補的な塩基配列である、（１）又は（１１）に記載の方法。
（１３）
ＯＤＮ５が、ＨＹＢ２の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、（２）に記載の方法。
（１４）
ＯＤＮ４のＨＹＢ１の塩基配列が、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、
ＯＤＮ４のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置を除いて、ＯＤＮ５と相補的な塩基配列である、（２）又は（１３）に記載の方法。
Furthermore, this invention exists also in following (11)-.
(11)
The method according to (1), wherein ODN2 has a photoresponsive modified base in the base sequence of HYB1.
(12)
The base sequence of HDN1 of ODN2 is a base sequence complementary to ODN1 except for the position of the photoresponsive modified base,
The base sequence of HDN2 of ODN3 is a base sequence complementary to ODN2 except for a position complementary to the photoresponsive modified base and a position where the photoresponsive modified base can be photocrosslinked, (1) or ( The method according to 11).
(13)
The method according to (2), wherein ODN5 has a photoresponsive modified base in the base sequence of HYB2.
(14)
The base sequence of HYB1 of ODN4 is a base sequence complementary to ODN1,
The method according to (2) or (13), wherein the base sequence of HYB2 of ODN4 is a base sequence complementary to ODN5 except for a position complementary to the photoresponsive modified base.
さらに、本発明は、上述した方法の工程を含む、二重鎖オリゴヌクレオチドを鎖交換する方法にもある。さらに、本発明は、上述した方法の工程を含む、オリゴヌクレオチドを検出する方法にもある。 Furthermore, the present invention also resides in a method for strand exchange of a double-stranded oligonucleotide comprising the above-described method steps. Furthermore, the present invention also resides in a method for detecting an oligonucleotide comprising the steps of the method described above.
さらに、本発明は次の（２１）〜にもある。
（２１）
第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第２のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）。
（２２）
ＯＤＮ２が、ＨＹＢ１の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、（２１）に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
Furthermore, this invention exists also in following (21)-.
(21)
A double-stranded oligonucleotide obtained by hybridizing a first oligonucleotide (ODN1) and a second oligonucleotide (ODN2) (however,
ODN2 has a base sequence (HYB1) that can hybridize with ODN1, and has a base sequence (NHYB1) that does not hybridize with ODN1 adjacent to HYB1,
ODN2 has a photoresponsive modified base in the base sequence,
ODN1 does not have a photocrosslinkable base at a position where the photoresponsive modified base of HYB1 of ODN2 can be photocrosslinked,
The double-stranded oligonucleotide is single-stranded in the NYYB1 region of ODN2. ).
(22)
The double-stranded oligonucleotide according to (21), wherein ODN2 has a photoresponsive modified base in the base sequence of HYB1.
（２３）
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式Ｉ：
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｎ−は、Ｎの一価基を表す。）
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、（２１）〜（２２）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
(23)
A photoresponsive modified base is used as the base moiety of a nucleobase, as shown in the following formula I:
R1 and R2 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or hydrogen;
N- represents a monovalent group of N. )
The double-stranded oligonucleotide according to any one of (21) to (22), which is a photoresponsive modified base having an artificial base represented by:
（２４）
光応答性修飾塩基と光架橋可能な塩基が、シトシン、ウラシル、チミン、シュードウラシル及びシュードチミンからなる群から選択された１種以上の塩基である、（２３）に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２５）
光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置が、光応答性修飾塩基の５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置である、（２３）〜（２４）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２６）
ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）が、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）の５’末端側又は３’末端側に隣接している、（２１）〜（２５）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２７）
二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る１本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させた、（２１）〜（２６）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２８）
二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖が、担体に固定されてなる、（２１）〜（２７）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２９）
二重鎖オリゴヌクレオチドが、折り返された１本のオリゴヌクレオチド鎖によって形成されたものである、（２１）〜（２８）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
(24)
The double-stranded oligonucleotide according to (23), wherein the base capable of photocrosslinking with the photoresponsive modified base is at least one base selected from the group consisting of cytosine, uracil, thymine, pseudouracil and pseudothymine. .
(25)
The duplex according to any one of (23) to (24), wherein the position at which the photoresponsive modified base can be photocrosslinked is a position complementary to the base adjacent to the 5 ′ end of the photoresponsive modified base. Strand oligonucleotides.
(26)
The base sequence that does not hybridize with ODN1 (NHYB1) is adjacent to the 5 ′ end side or 3 ′ end side of the base sequence that can hybridize with ODN1 (HYB1), or any one of (21) to (25) The described double-stranded oligonucleotide.
(27)
A fluorescent dye molecule was bound to any one strand of the double-stranded oligonucleotide, and a fluorescence quencher molecule was bound to the remaining one strand at a position where the fluorescent pigment molecule could be quenched. The double-stranded oligonucleotide according to any one of (21) to (26).
(28)
The double-stranded oligonucleotide according to any one of (21) to (27), wherein any one strand of the double-stranded oligonucleotide is fixed to a carrier.
(29)
The double-stranded oligonucleotide according to any one of (21) to (28), wherein the double-stranded oligonucleotide is formed by a single folded oligonucleotide chain.
さらに、本発明は、上記のＯＤＮ１とＯＤＮ２とＯＤＮ３とからなるキットにもある。また、本発明は、上記のＯＤＮ１とＯＤＮ４とＯＤＮ５とからなるキットにもある。 Furthermore, the present invention also resides in a kit comprising the above ODN1, ODN2 and ODN3. The present invention also resides in a kit comprising the above ODN1, ODN4, and ODN5.
本発明によれば、鎖交換反応は著しく高速化されて、秒単位という極めて短時間で、鎖交換反応を行って、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドを新たに得ることができる。また、本発明による鎖交換反応の高速化は、その原理を光架橋反応においているものであるために、特殊なバッファを使用する等などの制約がない。本発明によれば、重要な要素技術でありながら、従来はその所要時間の長さから応用が限られていた鎖交換反応技術を、遺伝子診断その他の応用に、広く利用することができる。 According to the present invention, the strand exchange reaction is remarkably accelerated, and a strand exchange reaction can be performed in a very short time of a second unit to newly obtain a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide. In addition, the speed-up of the strand exchange reaction according to the present invention is based on the principle of the photocrosslinking reaction, so there is no restriction such as using a special buffer. According to the present invention, although it is an important elemental technique, the strand exchange reaction technique that has been limited in application due to the length of time required for the technique can be widely used for gene diagnosis and other applications.
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［鎖交換反応の概要］
本発明によれば、二重らせんを形成した二重鎖オリゴヌクレオチドの鎖の１本を、外部から添加した一本鎖のオリゴヌクレオチドの鎖と速やかに交換して、新しい二重鎖オリゴヌクレオチドを得ることができる。すなわち、本発明は、速やかな鎖交換反応によって、新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドを速やかに製造する方法である。本発明による高速化の原理は、オリゴヌクレオチド鎖に光応答性修飾塩基を導入して、光架橋を行うことによって、新しく製造される二重鎖オリゴヌクレオチドの生成が、熱力学的に有利なものとなるように導くことにある。
The present invention will be described in detail below by giving specific embodiments. The present invention is not limited to the following specific embodiments.
[Outline of strand exchange reaction]
According to the present invention, one of the strands of a double-stranded oligonucleotide forming a double helix is rapidly exchanged with a strand of a single-stranded oligonucleotide added from the outside, so that a new double-stranded oligonucleotide is obtained. Can be obtained. That is, the present invention is a method for rapidly producing a new combination of double-stranded oligonucleotides by a rapid strand exchange reaction. The principle of speeding up according to the present invention is that the production of a newly produced double-stranded oligonucleotide is thermodynamically advantageous by introducing a photoresponsive modified base into the oligonucleotide chain and carrying out photocrosslinking. It is to lead to become.
鎖交換後に得られる新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドにおいて、光架橋が形成されているためには、鎖交換前の二重鎖オリゴヌクレオチドの鎖に、光応答性修飾塩基を導入しておいてもよく、外部から添加する一本鎖のオリゴヌクレオチドの鎖に、光応答性修飾塩基を導入しておいてもよく、その両方に導入しておいてもよい。 In the new combination of double-stranded oligonucleotides obtained after strand exchange, in order for photocrosslinking to be formed, a photoresponsive modified base is introduced into the strand of the double-stranded oligonucleotide before strand exchange. Alternatively, a photoresponsive modified base may be introduced into a single-stranded oligonucleotide chain added from the outside, or may be introduced into both of them.
［鎖交換前の二重鎖オリゴヌクレオチドに光応答性修飾塩基が導入された態様］
したがって、本発明の好適な実施の一態様は、第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第２のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、第３のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ３）（ただし、ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ２の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法、にある。
[Mode in which photoresponsive modified base is introduced into double-stranded oligonucleotide before strand exchange]
Therefore, one embodiment of a preferred embodiment of the present invention is a double-stranded oligonucleotide obtained by hybridizing the first oligonucleotide (ODN1) and the second oligonucleotide (ODN2) (where ODN2 is ODN1 and Has a base sequence (HYB1) capable of hybridizing, has a base sequence (NHYB1) that does not hybridize to ODN1 adjacent to HYB1, and ODN2 has a photoresponsive modified base in the base sequence , ODN1 does not have a photo-crosslinkable base at the photocrosslinkable position of the photoresponsive modified base of HYB1 of ODN2, and the double-stranded oligonucleotide is single-stranded in the NYYB1 region of ODN2. And a third oligonucleotide (ODN3) (where ODN3 is higher than HYB1 and NHYB1 of ODN2). ODN3 has a base capable of photocrosslinking at a position where the photoresponsive modified base of ODN2 can be photocrosslinked) in an aqueous solution. A method of producing a chain-exchanged double-stranded oligonucleotide in which the double-stranded ODN1 and ODN2 are subjected to strand exchange to become a double-stranded ODN3 and ODN2, comprising a step of photoirradiating and photocrosslinking, It is in.
好適な実施の態様において、ＯＤＮ２が、ＨＹＢ１の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有しているものとすることができる。また、好適な実施の態様において、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の塩基配列が、光応答性修飾塩基の位置を除いて、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、ＯＤＮ３のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置、及び光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置を除いて、ＯＤＮ２と相補的な塩基配列であるものとすることができる。 In a preferred embodiment, ODN2 may have a photoresponsive modified base in the base sequence of HYB1. In a preferred embodiment, the base sequence of HYB1 of ODN2 is a base sequence complementary to ODN1 except for the position of the photoresponsive modified base, and the base sequence of HYB2 of ODN3 is photoresponsive modified. Except for the position complementary to the base and the position where the photoresponsive modified base can be photocrosslinked, the base sequence can be complementary to ODN2.
［外部から添加する一本鎖のオリゴヌクレオチドの鎖に光応答性修飾塩基が導入された態様］
したがって、本発明の好適な実施の一態様は、第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第４のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ４）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、ＯＤＮ４は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ４のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、第５のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ５）（ただし、ＯＤＮ５は、ＯＤＮ４のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、ＯＤＮ５は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、ＯＤＮ４は、ＯＤＮ５の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ４の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ５とＯＤＮ４の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法、にある。
[Mode in which a photoresponsive modified base is introduced into the strand of a single-stranded oligonucleotide added from the outside]
Accordingly, one embodiment of a preferred embodiment of the present invention is a double-stranded oligonucleotide obtained by hybridizing the first oligonucleotide (ODN1) and the fourth oligonucleotide (ODN4) (provided that ODN4 and ODN1 It has a base sequence that can hybridize (HYB1), has a base sequence that does not hybridize to ODN1 (NHYB1) adjacent to this HYB1, and one double-stranded oligonucleotide is present in the NYYB1 region of ODN4. And a fifth oligonucleotide (ODN5) (however, ODN5 has a base sequence (HYB2) capable of hybridizing to HYB1 and NHYB1 of ODN4, and ODN5 has a base sequence) It has a photoresponsive modified base, and ODN4 is photocrosslinkable with the photoresponsive modified base of ODN5. ODN1 and ODN4 duplexes are chain-exchanged and ODN5 and ODN4 are subjected to photoirradiation in an aqueous solution by light irradiation in an aqueous solution. A method for producing a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide having a double-stranded structure.
好適な実施の態様において、ＯＤＮ５が、ＨＹＢ２の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有しているものとすることができる。また、好適な実施の態様において、ＯＤＮ４のＨＹＢ１の塩基配列が、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、ＯＤＮ４のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置を除いて、ＯＤＮ５と相補的な塩基配列であるものとすることができる。 In a preferred embodiment, ODN5 may have a photoresponsive modified base in the base sequence of HYB2. In a preferred embodiment, the base sequence of HDN1 of ODN4 is a base sequence complementary to ODN1, and the base sequence of HYB2 of ODN4 is ODN5 except for a position complementary to the photoresponsive modified base. And a complementary nucleotide sequence.
［オリゴヌクレオチド鎖の長さ等］
本発明の好適な実施の態様において、鎖交換に使用されるオリゴヌクレオチドの長さには特に制約はない。例えば、鎖交換されるオリゴヌクレオチド鎖のＨＹＢ１の塩基配列の長さが、４〜４００００塩基、１０〜１００００塩基、１０〜１０００塩基、１０〜１００塩基などとすることができる。塩基配列が長い場合においても、本発明による光架橋は、熱力学的な原理から、鎖交換反応を有効に高速化する。本発明で１本のオリゴヌクレオチド鎖に導入される光応答性修飾塩基の数は、１個に限られるものではなく、例えば、１個以上、例えば、１〜ｌ００個、１〜１０個、１〜５個とすることができる。したがって、塩基配列が長い場合に、高速化の程度を、所望の程度にまで高めるために、複数の光応答性修飾塩基をオリゴヌクレオチド鎖に導入して、複数箇所で光架橋を形成させることも、本発明の範囲内である。また、鎖交換されるオリゴヌクレオチド鎖のＮＨＹＢ１の長さも特に制約はないが、このＮＨＹＢ１の領域は、二重鎖から露出する一本鎖部分となって、外部から添加した一本鎖オリゴヌクレオチドが最初に付着する部分となるので、その役割を果たす程度の長さがあれば十分であり、例えば、ＮＨＹＢ１の塩基配列の長さが、４〜２４塩基、４〜１６塩基、６〜１２塩基などとすることができる。ＯＤＮ２又はＯＤＮ４のオリゴヌクレオチド鎖において、ＮＨＹＢ１の塩基配列は、ＨＹＢ１の塩基配列の５’末端側又は３’末端側に隣接して位置しており、いずれの位置とするかについては、当業者が適宜選択することができる。好適な実施の態様において、例えば、ＮＨＹＢ１の塩基配列は、ＯＤＮ２又はＯＤＮ４のオリゴヌクレオチド鎖において、ＨＹＢ１の塩基配列の５’末端側に隣接させることができる。
[Length of oligonucleotide chain, etc.]
In a preferred embodiment of the present invention, the length of the oligonucleotide used for strand exchange is not particularly limited. For example, the length of the base sequence of HYB1 of the oligonucleotide chain to be subjected to strand exchange can be 4 to 40000 bases, 10 to 10000 bases, 10 to 1000 bases, 10 to 100 bases, and the like. Even when the base sequence is long, the photocrosslinking according to the present invention effectively speeds up the chain exchange reaction from the thermodynamic principle. The number of photoresponsive modified bases introduced into one oligonucleotide chain in the present invention is not limited to one, for example, one or more, for example, 1 to 100, 1 to 10, 1 ~ 5. Therefore, when the base sequence is long, in order to increase the speedup to a desired level, a plurality of photoresponsive modified bases may be introduced into the oligonucleotide chain to form photocrosslinks at multiple locations. Is within the scope of the present invention. In addition, the length of NHYB1 of the oligonucleotide chain to be subjected to strand exchange is not particularly limited, but this NHYB1 region is a single-stranded portion exposed from the double strand, and the single-stranded oligonucleotide added from the outside is Since it becomes a part to be attached first, it is sufficient if it is long enough to fulfill that role. For example, the length of the base sequence of NHYB1 is 4 to 24 bases, 4 to 16 bases, 6 to 12 bases, etc. It can be. In the oligonucleotide chain of ODN2 or ODN4, the base sequence of NHYB1 is located adjacent to the 5 ′ end side or 3 ′ end side of the base sequence of HYB1, and a person skilled in the art has determined which position to use. It can be selected appropriately. In a preferred embodiment, for example, the nucleotide sequence of NHYB1 can be adjacent to the 5 ′ end side of the nucleotide sequence of HYB1 in the oligonucleotide chain of ODN2 or ODN4.
［光応答性修飾塩基］
光応答性修飾塩基としては、上記原理を実現可能な光応答性修飾塩基であれば使用することができるが、好適に使用可能な光応答性修飾塩基としては、次式Ｉ：
[Photoresponsive modified base]
As the photoresponsive modified base, any photoresponsive modified base capable of realizing the above principle can be used, but the photoresponsive modified base that can be suitably used includes the following formula I:
で表される人工塩基を挙げることができる。この人工塩基が、オリゴヌクレオチド中でジエステル結合したヌクレオチドの塩基部分として、天然の核酸塩基の塩基部分に置換されて、導入されている。 The artificial base represented by can be mentioned. This artificial base is introduced as a base portion of a nucleotide that is diester-bonded in an oligonucleotide, replacing the base portion of a natural nucleobase.
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。 Ra is a cyano group, an amide group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, or hydrogen, preferably a cyano group, an amide group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, or hydrogen, and more preferably a cyano group, an amide A group, a carboxyl group, or an alkoxycarbonyl group. The alkoxycarbonyl group is preferably C2 to C7, more preferably C2 to C6, more preferably C2 to C5, further preferably C2 to C4, further preferably C2 to C3, and particularly preferably C2. it can.
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。 R1 and R2 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, or hydrogen, preferably a cyano group, an amide group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, or hydrogen, and more preferably Is a cyano group, an amide group, a carboxyl group, or an alkoxycarbonyl group. The alkoxycarbonyl group is preferably C2 to C7, more preferably C2 to C6, more preferably C2 to C5, further preferably C2 to C4, further preferably C2 to C3, and particularly preferably C2. it can.
上記のＮ−は、Ｎの一価基を表し、この部分が五単糖の１位にグリコシド結合して、人工塩基として導入されている。すなわち、次式ＩＩ： N- above represents a monovalent group of N, and this part is glycosidically bonded to the 1-position of the pentasaccharide and introduced as an artificial base. That is, the following formula II:
で表されるリボヌクレオチド、または、次式ＩＩＩ： Or a ribonucleotide represented by the following formula III:
で表されるデオキシリボヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合によって、オリゴヌクレオチドの塩基配列中に導入されて、次式ＩＶ： Is introduced into the base sequence of the oligonucleotide by a phosphodiester bond, and is represented by the following formula IV:
で表される核酸（ただし、Ｒｂは、式Ｉの基が塩基部分として導入されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入されたオリゴヌクレオチドの鎖を表す）となっている。なお、１本のオリゴヌクレオチドの鎖に導入される式Ｉの人工塩基の数は、１個に限られるものではない。 (Wherein Rb represents an oligonucleotide chain in which a ribonucleotide or deoxyribonucleotide having the group of formula I introduced as a base moiety is introduced into a base sequence by a phosphodiester bond) ing. Note that the number of artificial bases of Formula I introduced into one oligonucleotide chain is not limited to one.
上記ビニルカルバゾール構造を有する光応答性の人工塩基（光応答性修飾塩基）を導入したオリゴヌクレオチドと、それに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせて二重らせんを形成させて、形成した二重らせんに光照射を行うと、ハイブリダイズした相手方のオリゴヌクレオチドの配列中において、光反応性の人工塩基と相補的に対応して塩基対となるべき塩基から１塩基分だけ３’末端側にある塩基と、光架橋を形成する。 By hybridizing an oligonucleotide into which a photoresponsive artificial base having the vinyl carbazole structure (photoresponsive modified base) is introduced and an oligonucleotide having a complementary base sequence to form a double helix, When the formed double helix is irradiated with light, it is 3 ′ from the base to be paired in a complementary manner with the photoreactive artificial base in the hybridized counterpart oligonucleotide sequence. Forms a photocrosslink with the terminal base.
この光応答性の人工塩基が光架橋を形成可能である相手方の塩基は、ピリミジン環を有する塩基である。一方で、この光応答性の人工塩基は、プリン環を有する塩基とは光架橋を形成しない。すなわち、この光応答性の人工塩基は、例えば、シトシン、ウラシル、及びチミン、さらにシュードウラシル及びシュードチミンに対して光架橋を形成し、一方で、グアニン及びアデニンに対しては光架橋を形成しないという、強い特異性を有している。したがって、本発明においては、それぞれの１本鎖オリゴヌクレオチドの相補的な関係は、光応答性の人工塩基に関して、この条件を満たすようになっている。一方、ハイブリダイズした相手方のオリゴヌクレオチドの配列中において、この光応答性の人工塩基と塩基対となるべき塩基の位置にある塩基については、相補鎖による２重らせんの形成を妨げない限りは、特段の制約がなく、どのような塩基であってもよく、例えば、核酸塩基として、シトシン、ウラシル、チミン、グアニン及びアデニン、あるいはさらにシュードウラシル及びシュードチミンのいずれであっても使用することができる。 The counterpart base with which this photoresponsive artificial base can form a photocrosslink is a base having a pyrimidine ring. On the other hand, this photoresponsive artificial base does not form a photocrosslink with a base having a purine ring. That is, this photoresponsive artificial base forms, for example, photocrosslinks with cytosine, uracil, and thymine, and further with pseudouracil and pseudothymine, while it does not form photocrosslinks with guanine and adenine. It has a strong specificity. Therefore, in the present invention, the complementary relationship of each single-stranded oligonucleotide is such that this condition is satisfied for the photoresponsive artificial base. On the other hand, in the hybridized counterpart oligonucleotide sequence, the base at the position of the base to be paired with this photoresponsive artificial base, unless it prevents the formation of a double helix by the complementary strand, There are no particular restrictions, and any base may be used. For example, any of cytosine, uracil, thymine, guanine and adenine, or pseudouracil and pseudothymine can be used as the nucleobase. .
［鎖交換反応の条件］
本発明による鎖交換反応の高速化は、その原理が光化学反応にあるので、後述する光照射の条件を妨げない限り、鎖交換反応において使用される公知の条件を、特に制限無く使用することができる。例えば、溶液としては、水溶液を使用することができ、公知の塩類、公知の緩衝液、を所望により使用することができる。このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、等をあげることができる。このような塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等を挙げることができ、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2等をあげることができるが、これらに限られるものではない。また、例えば、溶液のｐＨは、鎖交換反応に使用される公知のｐＨを使用することができ、例えば、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．５等とすることができる。また、鎖交換反応に先立って、二重鎖オリゴヌクレオチドを用意するために、適宜、アニーリング等を行ってもよい。また、本発明の鎖交換反応は、広汎な条件下で行うことができることから、この鎖交換反応をＰＣＲのプロセスと組み合わせて、ＰＣＲで使用される条件下で行うこともできる。
[Conditions for strand exchange reaction]
Since the principle of the speed-up of the strand exchange reaction according to the present invention lies in the photochemical reaction, the known conditions used in the strand exchange reaction can be used without particular limitation as long as the light irradiation conditions described below are not hindered. it can. For example, as the solution, an aqueous solution can be used, and known salts and known buffers can be used as desired. Examples of such a buffer solution include a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a Tris buffer solution, a citrate buffer solution, and a cacodylate buffer solution. Examples of such salts include sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, and the like, for example, NaCl, KCl, CaCl 2 , MgCl 2, etc., but are not limited thereto. Absent. Further, for example, the pH of the solution may be a known pH used for the chain exchange reaction, and may be, for example, pH 5.0 to pH 8.0, pH 6.0 to pH 7.5, and the like. Prior to the strand exchange reaction, annealing or the like may be appropriately performed in order to prepare a double-stranded oligonucleotide. Further, since the strand exchange reaction of the present invention can be carried out under a wide range of conditions, this strand exchange reaction can also be carried out under the conditions used in PCR in combination with the PCR process.
［光照射］
光架橋を形成させるための光照射は、一般に３３０〜３７０ｎｍの範囲、好ましくは３３０〜３６０ｎｍの波長を含む光を使用することができる。また、好適な実施の態様において、３６６ｎｍの波長を含む光、特に好ましくは、３６６ｎｍの単波長のレーザー光を使用することができる。鎖交換反応に有利に、光架橋反応を進行させるために、例えば、０〜７０℃の範囲の温度、例えば０〜４０℃の範囲の温度、例えば２０〜４０℃の範囲の温度で、光照射を行うことができる。この光架橋は、光反応を使用しているために、光照射時のｐＨ、塩濃度などに特段の制約がない点で有利である。この光架橋の形成は、光照射によって極めて迅速に進行するために、光照射の時間は、極めて短時間で十分であり、例えば、０．０１〜３０秒間、０．０１〜２０秒間、０．０５〜１０秒間、０．１〜１０秒間、０．１〜５秒間、０．１〜１秒間などの光照射時間とすることができる。光照射によって生じる光架橋は、共有結合であって、十分に安定であり、例えば、二重鎖オリゴヌクレオチドが完全に解離してしまうような強い変性条件下においても、切断されることはない。この光架橋によって、鎖交換反応が、熱力学的に有利となり、迅速に進行する。
[Light irradiation]
The light irradiation for forming the photocrosslink can use light generally having a wavelength in the range of 330 to 370 nm, preferably 330 to 360 nm. In a preferred embodiment, light having a wavelength of 366 nm, particularly preferably, laser light having a single wavelength of 366 nm can be used. In order to allow the photocrosslinking reaction to proceed in favor of the chain exchange reaction, for example, the light irradiation is carried out at a temperature in the range of 0 to 70 ° C., for example in the range of 0 to 40 ° C. It can be performed. This photocrosslinking is advantageous in that there are no particular restrictions on pH, salt concentration, etc. during light irradiation because of the use of a photoreaction. Since the formation of this photocrosslinking proceeds very rapidly by light irradiation, the light irradiation time is very short, for example, 0.01 to 30 seconds, 0.01 to 20 seconds, 0. The light irradiation time can be set to 05 to 10 seconds, 0.1 to 10 seconds, 0.1 to 5 seconds, 0.1 to 1 second, and the like. The photocrosslinking caused by light irradiation is a covalent bond and is sufficiently stable. For example, it is not cleaved even under strong denaturing conditions in which the double-stranded oligonucleotide is completely dissociated. By this photocrosslinking, the chain exchange reaction becomes thermodynamically advantageous and proceeds rapidly.
［鎖交換反応の検出］
鎖交換反応によって、開始時に存在した二重鎖オリゴヌクレオチドが消耗して、新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドが生成したことは、公知の手段によって検出することができる。例えば、分子量の変化があればＰＡＧＥ等の手段でそれを検出してもよく、いずれかの鎖を公知の手段で標識しておいて、ＰＡＧＥ等と組み合わせて検出してもよい。好適な実施の態様において、蛍光発光色素分子と蛍光消光分子とを用いた検出を行うことができる。例えば、鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る１本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させれば、鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドは蛍光発光しない。しかし、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されると、蛍光発光色素分子は蛍光消光分子から離れて、蛍光発光可能となる。蛍光発光分子が鎖交換反応によって一本鎖として遊離するようにしてもよく、蛍光発光分子が鎖交換反応によって二重鎖として残るようにしてもよい。また、このような蛍光発光分子や蛍光消光分子を含めて、所望の標識の部位をいずれかのオリゴヌクレオチドの鎖に結合させて使用する態様もまた、本発明の範囲内である。さらに、このような検出を容易にするために、いずれかのオリゴヌクレオチドの鎖を、担体や固定基板に結合させて使用する態様もまた、本発明の範囲内である。また、上記のように鎖交換反応を検出することによって、鎖交換反応が可能な、二重鎖オリゴヌクレオチド、あるいは外部の一本鎖オリゴヌクレオチドが存在することを検出するということができる。したがって、本発明は、高速化された鎖交換反応によって、二重鎖オリゴヌクレオチド、あるいは外部の一本鎖オリゴヌクレオチドを、検出する方法にもある。
[Detection of strand exchange reaction]
It can be detected by known means that the double-stranded oligonucleotides present at the start are consumed by the strand exchange reaction and a new combination of double-stranded oligonucleotides is produced. For example, if there is a change in molecular weight, it may be detected by means such as PAGE, or any chain may be labeled with known means and detected in combination with PAGE or the like. In a preferred embodiment, detection using a fluorescent dye molecule and a fluorescence quenching molecule can be performed. For example, a fluorescent luminescent dye molecule is bound to any one strand of a double-stranded oligonucleotide before the strand exchange reaction, and the remaining one strand is fluorescent at a position where the fluorescent luminescent dye molecule can be quenched. If a quencher molecule is bound, the double-stranded oligonucleotide before the strand exchange reaction does not emit fluorescence. However, when a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide is produced, the fluorescent luminescent dye molecule is separated from the fluorescence quenching molecule and becomes fluorescent. The fluorescent light emitting molecule may be released as a single chain by a chain exchange reaction, or the fluorescent light emitting molecule may be left as a double chain by a chain exchange reaction. In addition, an embodiment in which such a fluorescent light-emitting molecule or fluorescence quenching molecule is used by binding a desired label site to any oligonucleotide chain is also within the scope of the present invention. Further, in order to facilitate such detection, an embodiment in which any oligonucleotide strand is bound to a carrier or a fixed substrate is also within the scope of the present invention. Moreover, it can be said that the presence of a double-stranded oligonucleotide or an external single-stranded oligonucleotide capable of a strand exchange reaction can be detected by detecting the strand exchange reaction as described above. Therefore, the present invention also resides in a method for detecting a double-stranded oligonucleotide or an external single-stranded oligonucleotide by an accelerated strand exchange reaction.
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例で使用するＯＤＮ１等の番号付けは、実施例以外で使用するＯＤＮ１等の番号付けとは異なるものである。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. The present invention is not limited to the examples illustrated below. Note that the numbering of ODN1 and the like used in the following embodiments is different from the numbering of ODN1 and the like used in other than the embodiments.
［CNVＫ含有ＯＤＮの合成］
次の式Ｖ：
[Synthesis of CNV K-containing ODN]
The following formula V:
で表されるヌクレオチド（CNVＫ）を塩基配列中に有するＯＤＮ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）を製造するために、次のスキーム１（Ｓｃｈｅｍｅ１）にしたがって合成を行った。合成は、特許文献１（国際公開公報ＷＯ２００９／０６６４４７号）に開示された手順にしたがって行った。 In order to produce ODN (oligodeoxyribonucleotide) having the nucleotide represented by ( CNV K) in the base sequence, synthesis was performed according to the following scheme 1 (Scheme 1). The synthesis was performed according to the procedure disclosed in Patent Document 1 (International Publication No. WO2009 / 066447).
上記のように合成した光応答性人工核酸３−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅのアミダイト体をアセトニトリルで１００ ｍＭに調整し、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＡＢＩ３４００）にてＯＤＮ（オリゴヌクレオチド）を合成した。合成したＯＤＮ配列を以下の表１に示す。合成後、２８％アンモニア水を用いて５５℃で８時間脱保護を行った。その後、ＨＰＬＣにて精製を行い、質量分析により目的配列であることを確認した。 The amidite of the photoresponsive artificial nucleic acid 3-cyanovinylcarbazole nucleotide synthesized as described above was adjusted to 100 mM with acetonitrile, and ODN (oligonucleotide) was synthesized with a DNA / RNA synthesizer (ABI 3400, manufactured by Applied Biosystems). The synthesized ODN sequences are shown in Table 1 below. After the synthesis, deprotection was performed for 8 hours at 55 ° C. using 28% aqueous ammonia. Then, it refine | purified in HPLC and confirmed that it was the target arrangement | sequence by mass spectrometry.
［CNVＫを組み込んだＯＤＮによる鎖交換反応の変性ＰＡＧＥ解析］
上記で製造したＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３を使用して、次のスキーム２（Ｓｃｈｅｍｅ２）に示す鎖交換反応を行って、その進行を変性ＰＡＧＥ解析で確認した。この実施例で使用するＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３の番号付けは、本明細書の「課題を解決するための手段」や「発明を実施するための形態」におけるＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３にそれぞれ相当する。
[ Denaturing PAGE analysis of strand exchange reaction by ODN incorporating CNV K]
Using the ODN1, ODN2, and ODN3 produced above, the strand exchange reaction shown in the following scheme 2 (Scheme 2) was performed, and the progress thereof was confirmed by denaturing PAGE analysis. The numbering of ODN1, ODN2, and ODN3 used in this embodiment corresponds to ODN1, ODN2, and ODN3 in “Means for Solving the Problems” and “Mode for Carrying Out the Invention” in this specification, respectively.
１３塩基長のＯＤＮ１は、２１塩基長のＯＤＮ２の３’末端側と相補性ある配列を有しており、二重らせんを形成している。表１のＯＤＮ２のCNVＫは、スキーム２のなかではＸと記載した。二重らせんの中で、ＯＤＮ２のCNVＫ（Ｘ）に対しては、ＯＤＮ１のＡが位置している（スキーム２の上段の図参照）。２１塩基長のＯＤＮ３は、ＯＤＮ２と相補性ある配列を有しており、上記のＯＤＮ２の５’末端側の相補的配列に塩基対を形成して付着する。ＯＤＮ２に付着したＯＤＮ３は、ＯＤＮ３−ＯＤＮ２間の塩基対を適宜形成する。このＯＤＮ３−ＯＤＮ２間の塩基対は、熱力学的な原理にしたがって、ＯＤＮ１−ＯＤＮ２間の塩基対と、あたかも線ファスナーのように、可逆的に置換してゆく（スキーム２の中段の左側の図参照）。可逆的な置換が、Ｘの５’末端側に隣接する塩基（上記ＯＤＮ２においてはＴ）と相補的な位置にある塩基に至ったときに、すなわちＸの５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置にＯＤＮ３のＴが配置されたときに、３６６ｎｍの光照射を行うと、ＯＤＮ２のＸと、Ｘの５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置にあるＯＤＮ３のＴとが、光連結される（スキーム２の中段の右側の図参照）。このようにＸとＴの光連結を介して、ＯＤＮ２とＯＤＮ３とが共有結合的に結合されると、この点において、ＯＤＮ１−ＯＤＮ２間の塩基対と、ＯＤＮ３−ＯＤＮ２間の塩基対との置換は、可逆的ではないものとなり、ＯＤＮ１−ＯＤＮ２間の塩基対が、ＯＤＮ３−ＯＤＮ２間の塩基対へ置換される反応が、速やかに進行して、結果としてＯＤＮ１とＯＤＮ２の二重らせんは、ＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重らせんに鎖交換される（スキーム２の下段の図参照）。ただし、ＯＤＮ２のＸと連結したＯＤＮ３のＴの相補的な位置にはＴがあり、ＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重らせんは、１箇所だけミスマッチがある。 The 13-base-long ODN1 has a sequence complementary to the 3 ′ end side of the 21-base-long ODN2, and forms a double helix. CNV K of ODN2 in Table 1 is described as X in Scheme 2. In the double helix, A of ODN1 is located with respect to CNV K (X) of ODN2 (see the upper diagram of Scheme 2). The 21-base-long ODN3 has a sequence complementary to ODN2, and is attached to the complementary sequence on the 5 ′ end side of the above-mentioned ODN2 by forming a base pair. ODN3 attached to ODN2 appropriately forms a base pair between ODN3 and ODN2. The base pair between ODN3 and ODN2 is reversibly replaced with the base pair between ODN1 and ODN2 as if it were a wire fastener according to the thermodynamic principle (the diagram on the left side of the middle stage of Scheme 2). reference). When reversible substitution reaches a base complementary to the base adjacent to the 5 ′ end of X (T in the above ODN2), that is, complementary to the base adjacent to the 5 ′ end of X When T of ODN3 is arranged at a specific position, when irradiation with light of 366 nm is performed, X of ODN2 and T of ODN3 at a position complementary to the base adjacent to the 5 ′ end side of X are It is optically coupled (see the figure on the right side of the middle part of Scheme 2). Thus, when ODN2 and ODN3 are covalently bound via the photoligation of X and T, at this point, substitution of the base pair between ODN1-ODN2 and the base pair between ODN3-ODN2 is performed. Is not reversible, and the reaction in which the base pair between ODN1 and ODN2 is replaced with the base pair between ODN3 and ODN2 proceeds rapidly, and as a result, the double helix of ODN1 and ODN2 becomes ODN3 And ODN2 double helix (see the bottom diagram in Scheme 2). However, there is T at the complementary position of T of ODN3 linked to X of ODN2, and the double helix of ODN3 and ODN2 has a mismatch at only one position.
このようなスキーム２の反応を、具体的には次のように行った。
５００ｎＭ ＯＤＮ１と５００ｎＭ ＯＤＮ２をバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で７０℃で５分間加熱した後、３７℃もしくは２５℃で１時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ＯＤＮ３を最終濃度が５００ｎＭとなるように加え、すぐＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を３７℃もしくは２５℃で行った。光照射時間は０，０．１，０．５，１，２，５，１０，１５秒（ｓ）行った。それぞれのサンプルを変性ＰＡＧＥによる解析を行い、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析を行った。その結果を図１に示す。
Specifically, the reaction of Scheme 2 was performed as follows.
500 nM ODN1 and 500 nM ODN2 were heated in a buffer (100 mM NaCl, 50 mM sodium cacodylate) at 70 ° C. for 5 minutes and then allowed to stand at 37 ° C. or 25 ° C. for 1 hour or longer for annealing. Thereafter, ODN3 was added to a final concentration of 500 nM, and immediately using a UV-LED irradiator, UV irradiation at 366 nm was performed at 37 ° C. or 25 ° C. The light irradiation time was 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15 seconds (s). Each sample was analyzed by denaturing PAGE, and the rate analysis of the strand exchange reaction via photocrosslinking was performed. The result is shown in FIG.
図１は、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析の変性ＰＡＧＥ解析結果を示す図である。この変性ＰＡＧＥ解析の結果より、鎖交換反応中に光照射を行うことにより、光照射後にクロスリンク体（上記のＯＤＮ２とＯＤＮ３のクロスリンク体）のバンドが出現していることが確認できた。鎖交換前はCNVＫのターゲット塩基の位置（すなわち、CNVＫの５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置）にはアデニン（Ａ）が来ており、光照射を行ってもクロスリンク体は出現しないが、鎖交換反応が起こると、ターゲット塩基の位置にチミン（Ｔ）が来るため、クロスリンク体が出現する。そのためクロスリンク体の出現により鎖交換反応の速度の解析を行うことが出来る。光照射時間によるクロスリンク体の割合変化を図２にまとめた。 FIG. 1 is a diagram showing a modified PAGE analysis result of a rate analysis of a strand exchange reaction via photocrosslinking. From the result of this modified PAGE analysis, it was confirmed that a band of a cross-linked body (cross-linked body of the above ODN2 and ODN3) appeared after light irradiation by performing light irradiation during the chain exchange reaction. Prior to strand exchange, adenine (A) is present at the position of the CNV K target base (ie, the position complementary to the base adjacent to the 5 ′ end of CNV K), and crosslinks even when irradiated with light. The body does not appear, but when a strand exchange reaction occurs, thymine (T) comes to the target base position, so that a cross-linked body appears. Therefore, the rate of the chain exchange reaction can be analyzed by the appearance of the cross-linked body. The change in the ratio of the cross-linked body with the light irradiation time is summarized in FIG.
図２は、光照射時間によるクロスリンク体の変化を示すグラフである。全てのＯＤＮがクロスリンク体（上記のＯＤＮ２とＯＤＮ３のクロスリンク体）となった場合を、１００％とした。CNVＫを組み込み、光照射を行うことによって、５秒間で約７０％以上（２５℃）及び７５％以上（３７℃）の鎖交換反応が進行していた。また、０．５秒間の光照射によっても、５５％から６５％以上（２５℃）、６０％から７２％以上（３７℃）の鎖交換反応が進行していた。２５℃よりも３７℃のほうが鎖交換反応の進行は早い傾向にあったが、２５℃であっても極めて迅速に鎖交換反応が進行していた。 FIG. 2 is a graph showing changes in the cross-link body depending on the light irradiation time. The case where all ODNs became cross-linked bodies (cross-linked bodies of the above-mentioned ODN2 and ODN3) was taken as 100%. By incorporating CNV K and irradiating with light, strand exchange reactions of about 70% or more (25 ° C.) and 75% or more (37 ° C.) proceeded in 5 seconds. In addition, the chain exchange reaction proceeded from 55% to 65% (25 ° C.) and from 60% to 72% (37 ° C.) even after light irradiation for 0.5 seconds. The strand exchange reaction tended to be faster at 37 ° C than at 25 ° C, but the strand exchange reaction proceeded very rapidly even at 25 ° C.
［CNVKを組み込んでいないＯＤＮによる鎖交換反応の蛍光解析］
次の表２に示すＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ６を使用して、実験を行った。これらのＯＤＮを使用して、次のスキーム３（Ｓｃｈｅｍｅ３）に示す鎖交換反応を行った。
[Fluorescence analysis of strand exchange reaction by ODN not incorporating CNV K]
Experiments were performed using ODN4, ODN5, and ODN6 shown in Table 2 below. Using these ODNs, the strand exchange reaction shown in the following scheme 3 (Scheme 3) was performed.
１３塩基長のＯＤＮ４は、５’末端に蛍光色素分子（Ｃｙ３）（Ｆ）を有しており、２１塩基長のＯＤＮ５は、３’末端に蛍光消光分子（Ｄａｂｃｙｌ）（Ｑ）を有している。ＯＤＮ５は、上記のＯＤＮ２においてＸであった位置にＴが位置しており、ＯＤＮ４との配列の相補性は、完全である。これらが二重らせんを形成することによって、蛍光色素分子部位と、蛍光消光分子部位とが近接している場合には、蛍光は観察されない（Ｓｃｈｅｍｅ３の上段の図参照）。２１塩基長のＯＤＮ３は、ＯＤＮ５と相補性の塩基配列を有しており、蛍光色素分子及び蛍光消光分子のいずれも有していない。Ｓｃｈｅｍｅ ２と同様に、ＯＤＮ３がＯＤＮ５に付着して（Ｓｃｈｅｍｅ３の中段の左側の図参照）、熱力学的な原理によって、ＯＤＮ４−ＯＤＮ５の塩基対が、ＯＤＮ３−ＯＤＮ５の塩基対によって、可逆的に置換されていく（Ｓｃｈｅｍｅ３の中段の右側の図参照）。この置換が完全に進行すると、ＯＤＮ３とＯＤＮ５との二重らせんが形成されて、ＯＤＮ４が離脱し、蛍光色素分子部位は、蛍光消光分子部位から隔離されて、蛍光発光可能となる（Ｓｃｈｅｍｅ３の下段の図参照）。ただし、ＯＤＮ３とＯＤＮ５の二重らせんは、１箇所だけ、ＴとＴが相補的な位置に置かれており、ミスマッチがある。 The 13 base long ODN4 has a fluorescent dye molecule (Cy3) (F) at the 5 ′ end, and the 21 base long ODN5 has a fluorescent quencher molecule (Dabcyl) (Q) at the 3 ′ end. Yes. In ODN5, T is located at the position of X in ODN2 described above, and the sequence complementarity with ODN4 is complete. When they form a double helix, no fluorescence is observed when the fluorescent dye molecule site and the fluorescence quenching molecule site are close to each other (see the upper diagram of Scheme 3). ODN3 having a length of 21 bases has a base sequence complementary to ODN5, and has neither a fluorescent dye molecule nor a fluorescence quenching molecule. Similar to Scheme 2, ODN3 attaches to ODN5 (see the left side of the middle stage of Scheme 3), and the base pair of ODN4-ODN5 is reversibly changed by the base pair of ODN3-ODN5 according to the thermodynamic principle. It is replaced (refer to the figure on the right side of the middle part of Scheme 3). When this substitution proceeds completely, a double helix of ODN3 and ODN5 is formed, ODN4 is released, and the fluorescent dye molecule site is isolated from the fluorescence quenching molecule site, allowing fluorescence emission (lower part of Scheme 3). Refer to the figure below). However, in the double helix of ODN3 and ODN5, there is a mismatch because T and T are placed at complementary positions in only one place.
このスキーム３にしたがった実験を、具体的には次のように行った。
５００ｎＭ ＯＤＮ４と５００ｎＭ ＯＤＮ５をバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で７０℃で５分間加熱した後、３７℃もしくは２５℃で１時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ＯＤＮ３を最終濃度が５００ｎＭとなるように加え、蛍光分光光度計を用い、Ｃｙ３の蛍光強度の変化を測定した。その結果を図３に示す。
Specifically, the experiment according to Scheme 3 was performed as follows.
500 nM ODN4 and 500 nM ODN5 were heated in a buffer (100 mM NaCl, 50 mM sodium cacodylate) at 70 ° C. for 5 minutes and then allowed to stand at 37 ° C. or 25 ° C. for 1 hour or longer for annealing. Thereafter, ODN3 was added so as to have a final concentration of 500 nM, and a change in the fluorescence intensity of Cy3 was measured using a fluorescence spectrophotometer. The result is shown in FIG.
図３は、蛍光測定による鎖交換反応の速度解析の結果を示すグラフである。全てのＯＤＮがＯＤＮ３とＯＤＮ５の二重らせんとなった場合を、鎖交換率１００％とした。図３の左図は０秒から３００秒までの変化を示したグラフであり、このうち０秒から１２０秒までの変化を拡大して右図のグラフとして示した。CNVＫを用いていないスキーム３の鎖交換反応では、ＯＤＮ３投入の後に鎖交換反応が７０％超に進行するには、約３００秒を要した。 FIG. 3 is a graph showing the results of the rate analysis of the strand exchange reaction by fluorescence measurement. The case where all ODNs became a double helix of ODN3 and ODN5 was defined as a strand exchange rate of 100%. The left diagram in FIG. 3 is a graph showing a change from 0 seconds to 300 seconds. Among these, the change from 0 seconds to 120 seconds is enlarged and shown as a graph in the right diagram. In the strand exchange reaction of Scheme 3 without using CNV K, it took about 300 seconds for the strand exchange reaction to proceed to more than 70% after the addition of ODN3.
［光架橋による、鎖交換反応の加速の検討］
光架橋の有無による鎖交換反応の比較を図４にまとめた。図４は、光架橋の有無による鎖交換反応のグラフを対比した図である。ここからわかるように、光架橋した場合は、光架橋しない場合と比較して、５秒間で７０％以上の鎖交換反応が進行しており、２５℃と３７℃のいずれの温度であっても、鎖交換反応の進行の圧倒的な加速が確認された。
[Examination of acceleration of strand exchange reaction by photocrosslinking]
A comparison of strand exchange reactions with and without photocrosslinking is summarized in FIG. FIG. 4 is a graph comparing the chain exchange reaction graph with and without photocrosslinking. As can be seen from this, in the case of photocrosslinking, a chain exchange reaction of 70% or more proceeds in 5 seconds as compared to the case of no photocrosslinking, and at any temperature of 25 ° C. and 37 ° C. The overwhelming acceleration of the progress of the strand exchange reaction was confirmed.
鎖交換反応の立ち上がりの近似曲線の傾きからそれぞれの初速を求め光架橋により、おおよそ何倍加速しているのかを求めた。このように求めた光架橋による鎖交換反応の加速率の対比の結果を、次の表３に示す。 Each initial velocity was determined from the slope of the approximate curve of the rise of the chain exchange reaction, and the approximate number of times of acceleration by photocrosslinking was determined. The results of comparison of the acceleration rate of the chain exchange reaction by photocrosslinking thus obtained are shown in Table 3 below.
このように、２５℃の際には、光架橋があることで鎖交換反応が５６倍加速しており、３７℃の際も、光架橋があることで鎖交換反応が７０倍と大きく加速していることが分かった。 Thus, at 25 ° C., the chain exchange reaction is accelerated 56 times due to the presence of photocrosslinking, and at 37 ° C., the chain exchange reaction is accelerated 70 times due to the presence of photocrosslinking. I found out.
［３本目のＯＤＮ鎖にCNVＫを導入した系による鎖交換反応の変性ＰＡＧＥ解析］
鎖交換反応の開始時点において、形成されている二重らせんにはCNVＫが導入されておらず、遊離のＯＤＮにCNVＫが導入されている実験系を使用して、鎖交換反応を解析した。実験には、次の表４に示すＯＤＮ１、ＯＤＮ６、ＯＤＮ７を使用した。これらのＯＤＮを使用して、次のスキーム４（Ｓｃｈｅｍｅ４）に示す鎖交換反応を行った。この実施例で使用するＯＤＮ１、ＯＤＮ６、ＯＤＮ７の番号付けは、本明細書の「課題を解決するための手段」や「発明を実施するための形態」におけるＯＤＮ１、ＯＤＮ４、ＯＤＮ５にそれぞれ相当する。
[ Denaturing PAGE analysis of strand exchange reaction in a system in which CNV K is introduced into the third ODN chain]
The chain exchange reaction was analyzed using an experimental system in which CNV K was not introduced into the formed double helix at the start of the strand exchange reaction, and CNV K was introduced into the free ODN. . In the experiment, ODN1, ODN6, and ODN7 shown in the following Table 4 were used. Using these ODNs, the strand exchange reaction shown in the following scheme 4 (Scheme 4) was performed. The numbering of ODN1, ODN6, and ODN7 used in this embodiment corresponds to ODN1, ODN4, and ODN5 in “Means for Solving the Problems” and “Mode for Carrying Out the Invention” in this specification, respectively.
１３塩基長のＯＤＮ１は、２１塩基長のＯＤＮ６の３’末端側と相補性ある配列を有しており、二重らせんを形成している。二重らせんの形成に参加していない３本目のＯＤＮ鎖である、２１塩基長のＯＤＮ７は、ＯＤＮ６と相補性ある配列を有しており、配列中にCNVＫ（Ｘ）を有している（スキーム４の上段の図参照）。ＯＤＮ７がＯＤＮ６の５’末端側の相補的配列に塩基対を形成して付着すると、ＯＤＮ７−ＯＤＮ６間の塩基対は、熱力学的な原理にしたがって、ＯＤＮ１−ＯＤＮ６間の塩基対と、あたかも線ファスナーのように、可逆的に置換してゆく（スキーム４の中段の左側の図参照）。可逆的な置換が、ＯＤな７のＸに至ったときに、すなわちＸが、相補的な位置にある塩基の３’末端側に隣接する塩基（ＯＤＮ６におけるＴ）と、光連結可能な位置に配置されたときに、３６６ｎｍの光照射を行うと、ＯＤＮ７のＸと、相補的な位置にある塩基の３’末端側に隣接する塩基（ＯＤＮ６におけるＴ）とが、光連結される（スキーム４の中段の右側の図参照）。ＸとＴの光連結を介して、ＯＤＮ６とＯＤＮ７とが共有結合的に結合されると、ＯＤＮ１−ＯＤＮ６間の塩基対が、ＯＤＮ７−ＯＤＮ６間の塩基対へ置換される反応が、速やかに進行して、結果としてＯＤＮ１とＯＤＮ６の二重らせんは、ＯＤＮ７とＯＤＮ６の二重らせんに鎖交換される（スキーム４の下段の図参照）。 The 13-base-length ODN1 has a sequence complementary to the 3 ′ end of 21-base-length ODN6 and forms a double helix. The third ODN chain that does not participate in the formation of the double helix, ODN7 having a length of 21 bases, has a sequence complementary to ODN6, and has CNV K (X) in the sequence. (See the upper diagram in Scheme 4). When ODN7 forms a base pair and attaches to a complementary sequence on the 5 ′ end side of ODN6, the base pair between ODN7 and ODN6 follows the base pair between ODN1 and ODN6 according to the thermodynamic principle. It is reversibly replaced like a fastener (refer to the left figure in the middle of Scheme 4). When the reversible substitution reaches an X of 7 which is OD, that is, X is in a position capable of photoligation with a base adjacent to the 3 ′ end of the base at a complementary position (T in ODN6). When the light is irradiated at 366 nm when placed, the X of ODN7 and the base adjacent to the 3 ′ end of the base at the complementary position (T in ODN6) are photoligated (Scheme 4). (See the figure on the right side of the middle row). When ODN6 and ODN7 are covalently bound via the photoligation of X and T, the base pair between ODN1 and ODN6 is rapidly replaced with the base pair between ODN7 and ODN6. As a result, the double helix of ODN1 and ODN6 is strand-exchanged into a double helix of ODN7 and ODN6 (see the lower diagram in Scheme 4).
このスキーム３にしたがった実験を、具体的には次のように行った。
５００ｎＭ ＯＤＮ１と５００ｎＭ ＯＤＮ６をバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で７０℃で５分間加熱した後、３７℃もしくは２５℃で１時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ＯＤＮ７を最終濃度が５００ｎＭとなるように加え、すぐＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を３７℃もしくは２５℃で行った。光照射時間は０，０．１，０．５，１，５，１０，１５秒行った。それぞれのサンプルを変性ＰＡＧＥによる解析を行い、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析を行った。その結果を図５に示す。
Specifically, the experiment according to Scheme 3 was performed as follows.
500 nM ODN1 and 500 nM ODN6 were heated in a buffer (100 mM NaCl, 50 mM sodium cacodylate) at 70 ° C. for 5 minutes and then allowed to stand at 37 ° C. or 25 ° C. for 1 hour or longer for annealing. Thereafter, ODN7 was added to a final concentration of 500 nM, and immediately using a UV-LED irradiator, UV irradiation at 366 nm was performed at 37 ° C. or 25 ° C. The light irradiation time was 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15 seconds. Each sample was analyzed by denaturing PAGE, and the rate analysis of the strand exchange reaction via photocrosslinking was performed. The result is shown in FIG.
図５は、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析の変性ＰＡＧＥ解析結果を表す図である。この変性ＰＡＧＥ解析の結果より、光照射後にクロスリンク体のバンドが出現していることが確認できた。鎖交換反応中に光照射を行うことにより、クロスリンク体のバンドが出現している。鎖交換によってCNVＫを含むＯＤＮが二本鎖を形成し、チミンと架橋することによってクロスリンク体のバンドが出現する。そのため、クロスリンク体の出現により鎖交換反応の速度の解析を行うことができる。光照射時間によるクロスリンク体の割合変化を図６に示す。 FIG. 5 is a diagram showing a modified PAGE analysis result of a rate analysis of a strand exchange reaction via photocrosslinking. From the result of this modified PAGE analysis, it was confirmed that a cross-linked band appeared after light irradiation. By irradiating light during the chain exchange reaction, a band of a cross-linked body appears. ODN containing CNV K forms a double strand by strand exchange, and a cross-linked band appears by crosslinking with thymine. Therefore, the speed of the strand exchange reaction can be analyzed by the appearance of the cross-linked body. FIG. 6 shows a change in the ratio of the cross-link body depending on the light irradiation time.
図６は、光照射時間によるクロスリンク体の変化を示すグラフである。５秒間の光照射により反応はほぼ定常状態に達していた。光架橋により鎖交換反応が高速に進行していることがわかった。２５℃よりも３７℃のほうが鎖交換反応の進行は早い傾向にあった。 FIG. 6 is a graph showing changes in the cross-link body depending on the light irradiation time. The reaction almost reached a steady state by light irradiation for 5 seconds. It was found that the chain exchange reaction proceeded at high speed by photocrosslinking. The strand exchange reaction tended to be faster at 37 ° C than at 25 ° C.
［CNVKを組み込んでいないＯＤＮによる鎖交換反応の蛍光解析］
次の表５に示すＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ８を使用して、実験を行った。これらのＯＤＮを使用して、次のスキーム５（Ｓｃｈｅｍｅ５）に示す鎖交換反応を行った。
[Fluorescence analysis of strand exchange reaction by ODN not incorporating CNV K]
Experiments were performed using ODN4, ODN5, and ODN8 shown in Table 5 below. Using these ODNs, the strand exchange reaction shown in the following scheme 5 (Scheme 5) was performed.
このスキーム５では、スキーム３において使用したＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ３に代えて、ＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ８を使用して、同様の手順で反応を行っている。ＯＤＮ８は、ＯＤＮ３の塩基配列の１箇所でＴがＡに置換した配列を有しており、その結果、ＯＤＮ５とＯＤＮ８の二重鎖には、ＯＤＮ５とＯＤＮ３の二重鎖に存在していたミスマッチがない。 In this scheme 5, the reaction is carried out in the same procedure using ODN4, ODN5 and ODN8 instead of ODN4, ODN5 and ODN3 used in scheme 3. ODN8 has a sequence in which T is replaced with A at one position of the base sequence of ODN3. As a result, the ODN5 and ODN8 duplexes existed in the ODN5 and ODN3 duplexes. There is no.
この実験は、具体的には次の手順で行った。
５００ｎＭ ＯＤＮ４と５００ｎＭ ＯＤＮ５をバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で７０℃で５分間加熱した後、３７℃もしくは２５℃で１時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ＯＤＮ８を最終濃度が５００ｎＭとなるように加え、蛍光分光光度計を用い、Ｃｙ３の蛍光強度の変化を測定した。その結果を図７に示す。
Specifically, this experiment was performed according to the following procedure.
500 nM ODN4 and 500 nM ODN5 were heated in a buffer (100 mM NaCl, 50 mM sodium cacodylate) at 70 ° C. for 5 minutes and then allowed to stand at 37 ° C. or 25 ° C. for 1 hour or longer for annealing. Thereafter, ODN8 was added so that the final concentration was 500 nM, and the change in the fluorescence intensity of Cy3 was measured using a fluorescence spectrophotometer. The result is shown in FIG.
図７は、蛍光測定による鎖交換反応の速度解析の結果のグラフである。図７の左図のグラフの上側の曲線が３７℃、下側の曲線が２５℃の結果である。図７の右図は、左図の横軸の０〜１２０秒の範囲を拡大したグラフである。CNVＫを用いていない鎖交換反応では２５℃では、約３００秒で６０％近い鎖交換反応が、３７℃の場合は３０秒で８０％近い鎖交換反応が進行していた。光架橋の有無による鎖交換反応の比較を図８にまとめた。 FIG. 7 is a graph showing the result of the rate analysis of the strand exchange reaction by fluorescence measurement. The upper curve in the left graph of FIG. 7 is the result of 37 ° C., and the lower curve is the result of 25 ° C. The right diagram of FIG. 7 is a graph in which the range of 0 to 120 seconds on the horizontal axis of the left diagram is enlarged. In the strand exchange reaction not using CNV K, a strand exchange reaction of nearly 60% progressed in about 300 seconds at 25 ° C., and a strand exchange reaction of nearly 80% progressed in 30 seconds at 37 ° C. A comparison of strand exchange reactions with and without photocrosslinking is summarized in FIG.
図８は、光架橋の有無による鎖交換反応のグラフの比較である。図８の左図は２５℃、右図は３７℃の結果であり、いずれのグラフでも上側の曲線が光架橋ありの場合、下側の曲線が光架橋なしの場合である。光架橋した場合では、秒単位での鎖交換反応の進行が確認され。光架橋していないものとでは圧倒的な加速が確認された。そこで、鎖交換反応の立ち上がりの近似曲線の傾きからそれぞれの初速を求め光架橋により、おおよそ何倍加速しているのかを求めた。光架橋による鎖交換反応の加速率を、次の表６に示す。 FIG. 8 is a comparison of graphs of chain exchange reactions with and without photocrosslinking. The left figure of FIG. 8 shows the results at 25 ° C., and the right figure shows the results at 37 ° C. In both graphs, the upper curve shows the case with photocrosslinking and the lower curve shows the case without photocrosslinking. In the case of photocrosslinking, the progress of the chain exchange reaction in seconds is confirmed. An overwhelming acceleration was confirmed for those not photocrosslinked. Therefore, the initial speed of each was determined from the slope of the approximate curve of the rise of the chain exchange reaction, and the number of times of acceleration by photocrosslinking was determined. The acceleration rate of the chain exchange reaction by photocrosslinking is shown in Table 6 below.
この結果から、２５℃の際には、光架橋により鎖交換反応が１０倍加速しており、３７℃の際も１３倍と大きく加速していることが分かった。 From this result, it was found that the chain exchange reaction was accelerated by 10 times at 25 ° C. by photocrosslinking and was greatly accelerated by 13 times at 37 ° C.
本発明によれば、鎖交換反応は著しく高速化されて、秒単位という極めて短時間で、鎖交換反応を行って、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドを新たに得ることができる。本発明は産業上有用な発明である。 According to the present invention, the strand exchange reaction is remarkably accelerated, and a strand exchange reaction can be performed in a very short time of a second unit to newly obtain a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide. The present invention is industrially useful.
Claims (16)
ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、
第３のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ３）（ただし、
ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、
ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ２の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。 A double-stranded oligonucleotide obtained by hybridizing a first oligonucleotide (ODN1) and a second oligonucleotide (ODN2) (however,
ODN2 has a base sequence (HYB1) that can hybridize with ODN1, and has a base sequence (NHYB1) that does not hybridize with ODN1 adjacent to HYB1,
ODN2 has a photoresponsive modified base in the base sequence,
ODN1 does not have a photocrosslinkable base at a position where the photoresponsive modified base of HYB1 of ODN2 can be photocrosslinked,
The double-stranded oligonucleotide is single-stranded in the NYYB1 region of ODN2. )When,
Third oligonucleotide (ODN3) (where
ODN3 continuously has a base sequence (HYB2) that can hybridize to HYB1 and NHYB1 of ODN2,
ODN3 has a photocrosslinkable base at a position where the photoresponsive modified base of ODN2 can be photocrosslinked. ) And photocrosslinking by irradiating with light in an aqueous solution,
A method for producing a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide in which the duplexes of ODN1 and ODN2 are subjected to strand exchange to form a duplex of ODN3 and ODN2.
ＯＤＮ４は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ４のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、
第５のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ５）（ただし、
ＯＤＮ５は、ＯＤＮ４のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、
ＯＤＮ５は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ４は、ＯＤＮ５の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ４の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ５とＯＤＮ４の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。 A double-stranded oligonucleotide obtained by hybridizing the first oligonucleotide (ODN1) and the fourth oligonucleotide (ODN4) (however,
ODN4 has a base sequence (HYB1) that can hybridize with ODN1, and has a base sequence (NHYB1) that does not hybridize with ODN1 adjacent to HYB1,
The double-stranded oligonucleotide is single-stranded in the NYYB1 region of ODN4. )When,
5th oligonucleotide (ODN5) (however,
ODN5 has a base sequence (HYB2) capable of hybridizing to HYB1 and NHYB1 of ODN4 successively,
ODN5 has a photoresponsive modified base in the base sequence,
ODN4 has a photocrosslinkable base at a position where the photoresponsive modified base of ODN5 can be photocrosslinked. ) And photocrosslinking by irradiating with light in an aqueous solution,
A method for producing a chain-exchanged double-stranded oligonucleotide in which the double-chains of ODN1 and ODN4 are subjected to strand exchange to form a duplex of ODN5 and ODN4.
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｎ−は、Ｎの一価基を表す。）
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。 A photoresponsive modified base is used as the base moiety of a nucleobase, as shown in the following formula I:
R1 and R2 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or hydrogen;
N- represents a monovalent group of N. )
The method according to claim 1, which is a photoresponsive modified base having an artificial base represented by:
鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されたことが、蛍光発光によって検出可能である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 Fluorescent dye molecule is bound to any one strand of the double-stranded oligonucleotide before the strand exchange reaction, and the fluorescence-quenching molecule is attached to the remaining one strand at a position where the fluorescent dye molecule can be quenched. Combined
The method according to claim 1, wherein the production of a strand-exchanged double-stranded oligonucleotide can be detected by fluorescence emission.
ＯＤＮ３のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置、及び光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置を除いて、ＯＤＮ２と相補的な塩基配列である、請求項１又は請求項１０に記載の方法。 The base sequence of HDN1 of ODN2 is a base sequence complementary to ODN1 except for the position of the photoresponsive modified base,
The base sequence of HDN2 of ODN3 is a base sequence complementary to ODN2 except for a position complementary to the photoresponsive modified base and a position where the photoresponsive modified base can be photocrosslinked. Item 11. The method according to Item 10.
ＯＤＮ４のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置を除いて、ＯＤＮ５と相補的な塩基配列である、請求項２又は請求項１２に記載の方法。 The base sequence of HYB1 of ODN4 is a base sequence complementary to ODN1,
The method according to claim 2 or 12, wherein the base sequence of HYB2 of ODN4 is a base sequence complementary to ODN5 except for a position complementary to the photoresponsive modified base.
ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）。 A double-stranded oligonucleotide obtained by hybridizing a first oligonucleotide (ODN1) and a second oligonucleotide (ODN2) (however,
ODN2 has a base sequence (HYB1) that can hybridize with ODN1, and has a base sequence (NHYB1) that does not hybridize with ODN1 adjacent to HYB1,
ODN2 has a photoresponsive modified base in the base sequence,
ODN1 does not have a photocrosslinkable base at a position where the photoresponsive modified base of HYB1 of ODN2 can be photocrosslinked,
The double-stranded oligonucleotide is single-stranded in the NYYB1 region of ODN2. ).
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