JP2017210425A - Magnetic polymer micelle - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、磁性有機化合物を内包した磁性高分子ミセルに関する。 The present invention relates to a magnetic polymer micelle encapsulating a magnetic organic compound.
従来の磁性粒子の合成方法は，無機金属化合物である酸化鉄を用いることを前提としていた。しかし、この方法は合成の過程で高温を必要とすること、時間がかかること、有毒な有機溶媒が必須であることなどの不便が多い。また、生成する粒子の形状やサイズを制御するのも困難である。 The conventional method for synthesizing magnetic particles is based on the premise that iron oxide, which is an inorganic metal compound, is used. However, this method has many inconveniences such as requiring a high temperature in the process of synthesis, taking time, and requiring a toxic organic solvent. In addition, it is difficult to control the shape and size of the generated particles.
磁性有機物質は一般的に疎水性で、有機溶媒にしか溶けず、また溶けると磁性が弱まってしまう。水性溶媒に溶けないことで、医療や生物学の研究への応用が大きく制限されてしまっている。 Magnetic organic materials are generally hydrophobic and are soluble only in organic solvents, and when dissolved, the magnetism is weakened. The insolubility in aqueous solvents has severely limited its application to medical and biological research.
ドラッグデリバリーへの応用を目的としたミセルやリポソームの研究はこれまでも行われているが、どれも薬剤の充填率は10％未満に留まっている。特に、タキソールやメトトレキサートなど疎水性の強い抗がん剤はミセル内への充填が難しく、5％に満たない。加えて、体内の目的の場所に鉄を輸送することはとても難しく、その効率は現在も低いままである。さらに、従来のミセルやリポソームは安定性が十分に高いとは言い難い。十分に高い安定性を有しないと、外的刺激や体内を移動している間に壊れる恐れがあり、患者にとって重篤な副作用を引き起こしかねない。さらに、分解や細胞への取り込みがなされずに肝臓や腎臓などの臓器に蓄積されるのではないかとの指摘もある。 Although micelles and liposomes have been researched for drug delivery applications, the drug loading rate has remained below 10%. In particular, anti-cancer drugs with strong hydrophobicity such as taxol and methotrexate are difficult to fill into micelles, and the amount is less than 5%. In addition, it is very difficult to transport iron to the intended location in the body, and its efficiency remains low today. Furthermore, it is difficult to say that conventional micelles and liposomes are sufficiently stable. If it is not sufficiently stable, it can be damaged by external stimuli or while moving around the body, which can cause serious side effects for the patient. Furthermore, it is pointed out that they may accumulate in organs such as the liver and kidney without being decomposed or taken into cells.
本願発明者らは、これまでに、穏やかな条件下で容易に合成できる磁性有機化合物として金属サレン錯体化合物を同定している（非特許文献１、２、特許文献１、２）。金属サレン錯体は抗がん活性を有することも報告している。しかしながら、金属サレン錯体化合物は正常細胞に対しても毒性を示すため、医薬品として用いるためにはこの細胞毒性が問題となる。 The present inventors have so far identified a metal-salen complex compound as a magnetic organic compound that can be easily synthesized under mild conditions (Non-patent Documents 1 and 2, Patent Documents 1 and 2). It has also been reported that metal salen complexes have anticancer activity. However, since the metal-salen complex compound is toxic to normal cells, this cytotoxicity becomes a problem for use as a pharmaceutical product.
本発明の目的は、磁性有機化合物を医薬品として実用化するために有用な手段を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a useful means for putting a magnetic organic compound into practical use as a pharmaceutical.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、熱感受性を有するポリマー鎖とpH感受性を有する導電性のポリマー鎖を用いたブロック共重合体を用いてミセルを形成させることで、磁性有機化合物を高い充填率で内包した安定性の高い磁性高分子ミセルを簡便な工程で製造できることを見出し、さらに、この磁性高分子ミセルによれば、磁力を用いて所望の局所領域にミセルを集積できるだけでなく、交流磁場の印加等による発熱を利用した温熱療法や、さらにはMRIやCT用の造影剤としても活用できることを見出し、本願発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present application have highly filled a magnetic organic compound by forming micelles using a block copolymer using a heat-sensitive polymer chain and a pH-sensitive conductive polymer chain. It has been found that highly stable magnetic polymer micelles encapsulated at a high rate can be produced in a simple process. Furthermore, according to this magnetic polymer micelle, not only can micelles be accumulated in a desired local region using magnetic force, but also AC The present invention was completed by discovering that it can be used as a thermotherapy using heat generated by application of a magnetic field or the like, and also as a contrast agent for MRI or CT.
すなわち、本発明は、熱感受性ポリマーセグメント及びpH感受性ポリマーセグメントを含む少なくとも１種のブロック共重合体と、少なくとも１種の磁性有機化合物とを含む、磁性高分子ミセルを提供する。また、本発明は、上記本発明の磁性高分子ミセルを含む医薬品を提供する。 That is, the present invention provides a magnetic polymer micelle comprising at least one block copolymer comprising a heat sensitive polymer segment and a pH sensitive polymer segment, and at least one magnetic organic compound. Moreover, this invention provides the pharmaceutical containing the magnetic polymer micelle of the said invention.
本発明の磁性高分子ミセルは、有毒な溶媒を必要とせず、穏やかな反応条件で、シンプルな工程で製造することができる。本発明の磁性高分子ミセルは従来の薬剤内包ミセルやリポソームと比べて薬剤（磁性有機化合物）の充填率が非常に高く、３０％以上の充填率で磁性有機化合物を内包できる。この磁性高分子ミセルには以下の利点がある。
(1) 磁性化合物を内包するため、磁石を用いて目的の局所領域にミセルを輸送できる。充填率が高い分、ミセルの磁性も強くなる。
(2) ミセルの安定性は非常に高く、薬剤の漏出による副作用が起こりにくい。熱や電気的刺激等の外的刺激を加えなければほとんど崩壊しないので、正常組織・細胞への悪影響を回避しつつ、集積させた局部において効率的に薬効をもたらすことができる（内包させた磁性有機化合物、担持させた薬剤の徐放のタイミングを良好にコントロールできる）。
(3) pH感受性を利用して、がんやアテローム性動脈硬化病巣などの低pHの病変部で薬剤を放出させ、良好な治療効果を得ることができる。
(4) 交流磁場の印加や近赤外線レーザーの照射により磁性有機化合物が発熱し、ミセルそのものを発熱させることができる。この発熱を利用してがんに対する温熱療法を行なうことができる。
(5) MRIやCTに映るため、造影剤として利用できる。
The magnetic polymer micelle of the present invention does not require a toxic solvent and can be produced by a simple process under mild reaction conditions. The magnetic polymer micelle of the present invention has a very high filling rate of the drug (magnetic organic compound) compared to conventional drug-encapsulated micelles and liposomes, and can encapsulate the magnetic organic compound at a filling rate of 30% or more. This magnetic polymer micelle has the following advantages.
(1) Since a magnetic compound is included, micelles can be transported to a target local region using a magnet. The higher the filling rate, the stronger the micelle magnetism.
(2) The stability of micelles is very high, and side effects due to drug leakage are unlikely to occur. Since it hardly collapses unless external stimuli such as heat and electrical stimuli are applied, it can effectively exert a medicinal effect in the accumulated local area while avoiding adverse effects on normal tissues and cells (encapsulated magnetism The timing of sustained release of the organic compound and the supported drug can be well controlled).
(3) By using pH sensitivity, a drug can be released at a low pH lesion such as cancer or atherosclerotic lesion, and a good therapeutic effect can be obtained.
(4) The magnetic organic compound generates heat by application of an alternating magnetic field or near-infrared laser irradiation, and the micelle itself can generate heat. Using this fever, hyperthermia for cancer can be performed.
(5) Can be used as a contrast agent because it appears on MRI and CT.
本発明の磁性高分子ミセルは、熱感受性ポリマーセグメント及びpH感受性ポリマーセグメントを含む少なくとも１種のブロック共重合体と、磁性有機化合物とを含む。当該ミセルはコアシェル型のミセルであり、熱感受性ポリマーセグメントがミセルのコア層を、pH感受性ポリマーセグメントがミセルのシェル層を形成する。磁性有機化合物はミセルの内部、主としてコア層内に含まれる。pH感受性ポリマーセグメントは、低pH（酸性）環境下で分解するpH感受性をミセルに付与し、熱感受性ポリマーセグメントは、高温環境下で分解する熱感受性をミセルに付与する。 The magnetic polymer micelle of the present invention includes at least one block copolymer including a heat-sensitive polymer segment and a pH-sensitive polymer segment, and a magnetic organic compound. The micelle is a core-shell type micelle, and the heat-sensitive polymer segment forms a micelle core layer, and the pH-sensitive polymer segment forms a micelle shell layer. The magnetic organic compound is contained inside the micelle, mainly in the core layer. The pH sensitive polymer segment imparts a micelle with pH sensitivity that degrades in a low pH (acidic) environment, and the heat sensitive polymer segment imparts heat sensitivity to the micelle that degrades in a high temperature environment.
本発明の磁性高分子ミセル複合体において、ブロック共重合体を構成するポリマーは、ドープ型でも非ドープ型でもよい。すなわち、本発明の磁性高分子ミセルは、ドープ剤をさらに含んでいてもよい。 In the magnetic polymer micelle composite of the present invention, the polymer constituting the block copolymer may be doped or undoped. That is, the magnetic polymer micelle of the present invention may further contain a dopant.
熱感受性ポリマーセグメント、及びpH感受性ポリマーセグメントは、単独重合体で構成されていてもよいし、これらのセグメント自体が２種以上のポリマーのブロック共重合体で構成されていてもよい。 The heat-sensitive polymer segment and the pH-sensitive polymer segment may be composed of a homopolymer, or these segments themselves may be composed of a block copolymer of two or more kinds of polymers.
pH感受性ポリマーセグメントとしては、pH感受性でかつ導電性のポリマーが用いられる。好ましくは、pH感受性ポリマーセグメントは、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリエチレンイミン、アラビアゴム、キトサン、及びポリエチレングリコール（PEG）からなるポリマー群より選択される少なくとも１種のポリマーを含む。これらのポリマー群のうちいずれか１種の単独重合体でもよいし、該ポリマー群のうちの２種以上のポリマーのブロック共重合体でもよい。該ポリマー群のうちの少なくとも１種と他のポリマーとのブロック共重合体でもよい。 As the pH-sensitive polymer segment, a pH-sensitive and conductive polymer is used. Preferably, the pH sensitive polymer segment comprises at least one polymer selected from the group consisting of polypyrrole, polyaniline, polythiophene, polyethyleneimine, gum arabic, chitosan, and polyethylene glycol (PEG). Any one of these polymer groups may be a homopolymer, or a block copolymer of two or more polymers in the polymer group. It may be a block copolymer of at least one member of the polymer group and another polymer.
熱感受性ポリマーセグメントは、好ましくは、ポリカプロラクトン、ポリN-イソプロピルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルセルロース、及びポリビニルメチルエーテルからなるポリマー群より選択される少なくとも１種のポリマーを含む。これらのポリマー群のうちいずれか１種の単独重合体でもよいし、該ポリマー群のうちの２種以上のポリマーのブロック共重合体でもよい。該ポリマー群のうちの少なくとも１種と他のポリマーとのブロック共重合体でもよく、例えば、該ポリマー群から選択される１種のポリマーとPEGとの共重合体を含んでいてもよい。PEGは単独ではpH感受性を示すが、熱感受性のポリマーとのブロック共重合体は熱感受性ポリマーセグメントとして利用できる。そのような熱感受性ポリマーとPEGのブロック共重合体の具体例としては、下記実施例にも記載されているポリカプロラクトン−PEG共重合体を挙げることができるが、これに限定されない。 The heat sensitive polymer segment preferably comprises at least one polymer selected from the group of polymers consisting of polycaprolactone, poly N-isopropylacrylamide, hydroxypropyl cellulose, and polyvinyl methyl ether. Any one of these polymer groups may be a homopolymer, or a block copolymer of two or more polymers in the polymer group. It may be a block copolymer of at least one of the polymer group and another polymer, and may include, for example, a copolymer of one polymer selected from the polymer group and PEG. PEG alone is pH sensitive, but block copolymers with heat sensitive polymers can be used as heat sensitive polymer segments. Specific examples of such a heat-sensitive polymer and PEG block copolymer include, but are not limited to, polycaprolactone-PEG copolymers described in the following examples.
磁性有機化合物は、磁性を有する有機化合物であれば特に限定されない。好ましい例として、サレンを配位子とする金属錯体である金属サレン錯体を挙げることができる。自己磁性を有する様々な金属サレン錯体が知られており、製造方法も公知であり、市販品も存在する。本発明では、磁性有機化合物として、自己磁性を有するいずれの金属サレン錯体でも使用可能である。金属サレン錯体において、金属は好ましくはFe、Cr、Mn、Co、Ni、Mo、Ru、Rh、Pd、W、Re、Os、Ir、Pt、Nd、Sm、Eu、Gd等の遷移金属である。 The magnetic organic compound is not particularly limited as long as it is an organic compound having magnetism. As a preferable example, a metal salen complex which is a metal complex having salen as a ligand can be given. Various metal-salen complexes having self-magnetism are known, production methods are also known, and commercially available products exist. In the present invention, any metal-salen complex having self magnetism can be used as the magnetic organic compound. In the metal-salen complex, the metal is preferably a transition metal such as Fe, Cr, Mn, Co, Ni, Mo, Ru, Rh, Pd, W, Re, Os, Ir, Pt, Nd, Sm, Eu, Gd, etc. .
好ましい金属サレン錯体の具体例として、下記式(I)又は(II)で表される金属サレン錯体を挙げることができる。 Specific examples of preferable metal salen complexes include metal salen complexes represented by the following formula (I) or (II).
式(I)及び(II)中、
MはFe、Cr、Mn、Co、Ni、Mo、Ru、Rh、Pd、W、Re、Os、Ir、Pt、Nd、Sm、Eu、又はGdであり、
a〜pは水素であるか、又はa〜pの少なくとも一つが水素以外の官能基・置換基（例えば、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルキルカルボニル基、アルキルカルボキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ヒドロキシアルキル基、アルキルオキシカルボニル基、シクロアルキル基、アリール基など（いずれもアルキル部分は炭素数が１〜５程度が好ましく、アルキル部分の炭素のうち少なくとも１個が酸素原子、窒素原子又は硫黄原子に置き換わっていてもよい。））で置換されていてもよい。
In formulas (I) and (II),
M is Fe, Cr, Mn, Co, Ni, Mo, Ru, Rh, Pd, W, Re, Os, Ir, Pt, Nd, Sm, Eu, or Gd,
a to p are hydrogen, or at least one of a to p is a functional group / substituent other than hydrogen (for example, halogen, alkyl group, alkoxy group, hydroxyl group, carboxyl group, carbonyl group, alkylcarbonyl group, alkyl group) A carboxyl group, an amino group, an alkylamino group, a hydroxyalkyl group, an alkyloxycarbonyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, etc. (all alkyl moieties preferably have about 1 to 5 carbon atoms, and at least one of the carbon atoms in the alkyl moiety) Each may be replaced by an oxygen atom, a nitrogen atom or a sulfur atom))).
上記式(I)又は(II)で表される金属サレン錯体及びその製造方法も公知であり、例えばWO 2010/058280及びWO 2012/086683に記載されている。これらの金属サレン錯体には、それ自体に抗がん活性があることが知られている（WO 2010/058280、WO 2012/086683）。 A metal-salen complex represented by the above formula (I) or (II) and a method for producing the same are also known, and are described, for example, in WO 2010/058280 and WO 2012/086683. It is known that these metal salen complexes themselves have anticancer activity (WO 2010/058280, WO 2012/086683).
上記式(I)又は(II)で表される金属サレン錯体の中でも特に好ましいものとして、鉄サレン錯体（Eguchi et al. (2015) A magnetic anti-cancer compound for magnet-guided delivery and magnetic resonance imaging. Scientific Reports, 5, 9194、及びSato et al. (2016) Simultaneous hyperthermia-chemotherapy with controlled drug delivery using single-drug nanoparticles. Scientific Reports, 6, 24629）が挙げられる。鉄サレン錯体は以下の構造（すなわち上記式のうちの(II)）を有することが結晶学的解析により確認されている（Eguchi et al. (2015)、上掲）。 Among the metal-salen complexes represented by the above formula (I) or (II), an iron-salen complex (Eguchi et al. (2015) A magnetic anti-cancer compound for magnet-guided delivery and magnetic resonance imaging. Scientific Reports, 5, 9194, and Sato et al. (2016) Simultaneous hyperthermia-chemotherapy with controlled drug delivery using single-drug nanoparticles. Scientific Reports, 6, 24629). It has been confirmed by crystallographic analysis that the iron-salen complex has the following structure (ie (II) of the above formula) (Eguchi et al. (2015), supra).
本発明の磁性高分子ミセルの製造においては、pH感受性ポリマーセグメント及び熱感受性ポリマーセグメントを含む両親媒性のブロック共重合体の分子が会合してミセルを形成する系内に磁性有機化合物を共存させればよい。ブロック共重合体分子の内側に磁性有機化合物の分子が集まってミセルが形成され、その結果、ミセルの内側に磁性有機化合物が内包された本発明の磁性高分子ミセルを得ることができる。本発明の磁性高分子ミセルは、毒性の高い溶媒を使用することなく、また高温処理なども不要で反応条件も穏やかであり、シンプルな工程で製造することができる。 In the production of the magnetic polymer micelle of the present invention, a magnetic organic compound is allowed to coexist in a system in which molecules of an amphiphilic block copolymer containing a pH-sensitive polymer segment and a thermosensitive polymer segment associate to form a micelle. Just do it. Molecules are formed by gathering the molecules of the magnetic organic compound inside the block copolymer molecule, and as a result, the magnetic polymer micelle of the present invention in which the magnetic organic compound is encapsulated inside the micelle can be obtained. The magnetic polymer micelle of the present invention can be produced by a simple process without using a highly toxic solvent, requiring no high-temperature treatment, and mild reaction conditions.
pH感受性ポリマーセグメント及び熱感受性ポリマーセグメントを含むブロック共重合体の市販品を用いる場合には、まずメタノールやクロロホルムなどの有機溶媒中に磁性有機化合物を溶解し、必要に応じて超遠心や磁気分離を行なって不溶の沈殿物を溶液から分離除去し、この溶液中にpH感受性ポリマーセグメント及び熱感受性ポリマーセグメントを含むブロック共重合体を添加し、強く撹拌すればよい。 When using a commercially available block copolymer containing a pH-sensitive polymer segment and a heat-sensitive polymer segment, first dissolve the magnetic organic compound in an organic solvent such as methanol or chloroform, and then perform ultracentrifugation or magnetic separation as necessary. The insoluble precipitate is separated and removed from the solution, and the block copolymer containing the pH-sensitive polymer segment and the heat-sensitive polymer segment is added to the solution and stirred vigorously.
pH感受性ポリマーセグメント及び熱感受性ポリマーセグメントを含むブロック共重合体をモノマーの重合によって製造する場合には、磁性有機化合物の共存下でブロック共重合体を生成させればよい。モノマーの重合によるブロック共重合体の製造方法としては、pH感受性ポリマー鎖及び熱感受性ポリマー鎖をそれぞれ重合してから各ポリマー鎖を結合させる方法と、一方のポリマー鎖を重合した後、その末端に他方のモノマーを重合させる方法がある。前者の場合には、磁性有機化合物の共存下で各ポリマー鎖を結合すればよく、後者の場合には、磁性有機化合物の共存下でポリマー鎖末端に他方のモノマーを重合させればよい。pH感受性ポリマー及び熱感受性ポリマーに市販のポリマーを用いてもよく、その場合には、上記の前者と同様に、磁性有機化合物の共存下で各ポリマー鎖を結合すればよい。 When a block copolymer containing a pH sensitive polymer segment and a heat sensitive polymer segment is produced by polymerization of monomers, the block copolymer may be produced in the presence of a magnetic organic compound. As a method for producing a block copolymer by polymerizing monomers, there are a method in which each of the pH-sensitive polymer chain and the heat-sensitive polymer chain is polymerized and then each polymer chain is bonded, and after polymerizing one of the polymer chains, a terminal is attached to the terminal There is a method of polymerizing the other monomer. In the former case, each polymer chain may be bonded in the presence of the magnetic organic compound, and in the latter case, the other monomer may be polymerized at the end of the polymer chain in the presence of the magnetic organic compound. Commercially available polymers may be used for the pH-sensitive polymer and the heat-sensitive polymer. In that case, the polymer chains may be bonded in the presence of a magnetic organic compound, as in the former case.
コア層を形成する熱感受性ポリマーセグメントに両親媒性のブロック共重合体を用いる場合には、まず、水−有機溶媒の2相エマルジョン法などによって、磁性有機化合物を内包した熱感受性ブロック共重合体のミセルを形成させ、このミセルにpH感受性ポリマーを結合させることにより、本発明の磁性高分子ミセルを調製することもできる。この製造方法の具体例が下記実施例に製造例２として記載されている。 When an amphiphilic block copolymer is used for the heat-sensitive polymer segment forming the core layer, first, a heat-sensitive block copolymer containing a magnetic organic compound by a two-phase emulsion method of water-organic solvent. The magnetic polymer micelle of the present invention can also be prepared by forming a micelle of this type and binding a pH-sensitive polymer to the micelle. A specific example of this production method is described as Production Example 2 in the following Examples.
上記のような方法で製造される本発明の磁性高分子ミセルは、従来の方法で製造したコアシェル型ミセルよりも磁性有機化合物の充填率が高く、３０％以上の充填率で磁性有機化合物を内包する。 The magnetic polymer micelle of the present invention produced by the method as described above has a higher filling rate of the magnetic organic compound than the core-shell micelle produced by the conventional method, and contains the magnetic organic compound at a filling rate of 30% or more. To do.
本発明では、ミセル表面に被覆剤を結合させ、被覆剤によって表面を被覆してもよい。被覆剤として、タンパク質、タンパク質断片、オリゴペプチド、多糖のような天然ポリマー物質や、コハク酸、アミノ酸等のその他の生体物質を用いることで、ミセル表面に官能基を付与できるのみならず、安定した生体適合性をミセルに与えることもできる。また、被覆剤でのミセル表面の被覆により、内包する磁性有機化合物をクラスター化し、コア（内部の磁性有機化合物の粒子）のサイズを調整することができる。天然ポリマーの具体例を挙げると、タンパク質の好ましい例としては血清アルブミン等のアルブミンを挙げることができ、多糖の好ましい例としては、アラビアゴム等の植物ゴム、及びデキストラン等を挙げることができるが、これらに限定されない。 In the present invention, a coating agent may be bonded to the micelle surface and the surface may be coated with the coating agent. By using natural polymer substances such as proteins, protein fragments, oligopeptides and polysaccharides, and other biological substances such as succinic acid and amino acids as a coating agent, functional groups can be added to the micelle surface as well as stable. Biocompatibility can also be imparted to micelles. Further, by coating the micelle surface with a coating agent, the magnetic organic compound to be encapsulated can be clustered to adjust the size of the core (particles of the internal magnetic organic compound). As specific examples of natural polymers, preferred examples of proteins include albumins such as serum albumin, and preferred examples of polysaccharides include vegetable gums such as gum arabic and dextran, It is not limited to these.
また、本発明の磁性高分子ミセルにリンカーを介して又は介さずにさらなる薬剤を担持させてもよい。さらなる薬剤は、通常、ミセル表面に結合される。担持させ得る薬剤の例としては、低分子抗がん剤（メトトレキサート、タキソール系抗がん剤など）、抗生物質、抗体、抗体断片（Fab、F(ab')2、scFv等）、ペプチド（組換えリガンド、組換え受容体断片等）、核酸（アプタマー、アンチセンス核酸、リボザイム、siRNA、デコイ核酸等）、酵素、ホルモン、バイオマーカー等を挙げることができる。リンカーの要否、及び使用するリンカーの種類は、担持させる薬剤の化学構造等に応じて適宜決定、選択することができる。リンカーの具体例としては、塩化セチルピリニジウム、EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）、NHS（N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）などを挙げることができるが、これらに限定されない。 Further, a further drug may be supported on the magnetic polymer micelle of the present invention via a linker or not. The additional drug is usually bound to the micelle surface. Examples of drugs that can be carried include small molecule anticancer drugs (methotrexate, taxol anticancer drugs, etc.), antibiotics, antibodies, antibody fragments (Fab, F (ab ') 2 , scFv, etc.), peptides ( And recombinant ligands, recombinant receptor fragments, etc.), nucleic acids (aptamers, antisense nucleic acids, ribozymes, siRNA, decoy nucleic acids, etc.), enzymes, hormones, biomarkers and the like. The necessity of the linker and the type of linker to be used can be determined and selected as appropriate according to the chemical structure of the drug to be carried. Specific examples of the linker include cetylpyridinium chloride, EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), NHS (N-hydroxysuccinimide ester), and the like. Not.
本発明の磁性高分子ミセルは、乾燥状態（例えば、凍結乾燥させた粉末の形態）で提供されてもよいし、液相中に懸濁した懸濁液ないしは分散液の状態で提供されてもよい。本発明のミセルは、液相中でナノサイズ（10〜500 nm程度、例えば10〜300 nm程度）のミセル粒子を形成し、６か月以上の長期間にわたって良好なコロイド状態を維持できる。 The magnetic polymer micelle of the present invention may be provided in a dry state (for example, in the form of a freeze-dried powder), or may be provided in the form of a suspension or dispersion suspended in a liquid phase. Good. The micelle of the present invention forms micelle particles of nano size (about 10 to 500 nm, for example about 10 to 300 nm) in the liquid phase, and can maintain a good colloidal state for a long period of 6 months or more.
本発明の磁性高分子ミセルを含む医薬品には、疾患の治療薬の他、診断薬も包含される。以下、本発明の磁性高分子ミセルの特性に基づく応用例について説明する。 In addition to therapeutic agents for diseases, diagnostic agents are also included in the pharmaceuticals containing the magnetic polymer micelles of the present invention. Hereinafter, application examples based on the characteristics of the magnetic polymer micelle of the present invention will be described.
本発明の磁性高分子ミセルは、pH7〜pH6以下の低pH環境下で分解し、内包する磁性有機化合物や担持しているさらなる薬剤を放出する。pHが低いほど放出率が高まる。また、体温以上、例えば42℃〜45℃以上の高温によっても分解し、磁性有機化合物等を放出する。低pHと高温処理を組み合わせることでさらに放出率を高めることができる。本発明のミセルは安定性に優れ、外的刺激（熱、低pH、電気的刺激）を加えなければ崩壊しないので、内包される磁性有機化合物や所望により担持されるさらなる薬剤が体内の正常組織・細胞に毒性を及ぼすリスクが非常に低い。磁性を有する本発明のミセルは、磁力により生体内の所望の局所領域に集積させることができる。従って、生体に投与後、磁力により所望の局所領域に集積させてから熱や電気的刺激を加えることで、患部のみで効率的に薬効を発揮させることができる。また、本発明の磁性高分子ミセルは、近赤外線レーザー照射や交流磁場印加によって内包する磁性有機化合物が高い熱を発するので、がん等の温熱療法にも利用することもできる。「温熱療法剤」という語は、温熱療法における本発明の磁性高分子ミセルないしは該ミセルを含む医薬品の使用を意味する。ミセル自体が加熱されることでミセルの崩壊も促され、内包する磁性有機化合物や担持させたさらなる薬剤の薬効も得られる。 The magnetic polymer micelle of the present invention decomposes in a low pH environment of pH 7 to pH 6 or less, and releases the encapsulated magnetic organic compound and the further drug carried. The lower the pH, the higher the release rate. Further, it decomposes even at a body temperature or higher, for example, 42 ° C. to 45 ° C. or higher, and releases a magnetic organic compound. The release rate can be further increased by combining low pH and high temperature treatment. The micelles of the present invention are excellent in stability and do not collapse unless external stimuli (heat, low pH, electrical stimuli) are applied, so that the encapsulated magnetic organic compound and the additional drug carried as desired are contained in normal tissues in the body. • Very low risk of cell toxicity. The micelle of the present invention having magnetism can be accumulated in a desired local region in the living body by magnetic force. Therefore, after administration to a living body, heat and electrical stimulation are applied after accumulating in a desired local region by magnetic force, so that the medicinal effect can be efficiently exhibited only at the affected part. The magnetic polymer micelle of the present invention can also be used for thermotherapy for cancer and the like because the magnetic organic compound contained by near-infrared laser irradiation or alternating magnetic field application generates high heat. The term “thermotherapy agent” means the use of the magnetic polymer micelle of the present invention or a medicine containing the micelle in thermotherapy. By heating the micelles themselves, the micelles are promoted to collapse, and the medicinal effects of the encapsulated magnetic organic compound and the further drug carried can be obtained.
低pH環境で分解する性質は、患部のpHが低くなる疾患の治療に有利である。そのような疾患の具体例としては、第一にがんを挙げることができる。また、生体内でマクロファージが集積する部位はpHが低いことが知られており（Dongjin Park et al. Chem. Commun., 2014, 50, 15014-15017）、本発明の磁性高分子ミセルはそのようなマクロファージ集積病変部の治療にも有用である。マクロファージ集積病変部の具体例として、アテローム性動脈硬化病巣を挙げることができる。磁性有機化合物の中でも、上記式(I)、(II)で表される金属サレン錯体には抗がん活性があることが知られており、金属サレン錯体を内包する磁性高分子ミセルはそれ自体をがんの治療剤として活用できる。また金属サレン錯体の細胞毒性を利用してがん以外の病変部細胞を損傷させ、治療効果を得ることもできる。所望の薬剤をミセルに担持させることで、さらなる治療効果を得ることができる。 The property of degrading in a low pH environment is advantageous for treating diseases in which the pH of the affected area is low. As a specific example of such a disease, cancer can be mentioned first. Moreover, it is known that the site where macrophages accumulate in vivo is low in pH (Dongjin Park et al. Chem. Commun., 2014, 50, 15014-15017), and the magnetic polymer micelle of the present invention is It is also useful for treating macrophage accumulation lesions. A specific example of a macrophage accumulation lesion is an atherosclerotic lesion. Among the magnetic organic compounds, the metal salen complexes represented by the above formulas (I) and (II) are known to have anticancer activity, and the magnetic polymer micelles enclosing the metal salen complex itself Can be used as a therapeutic agent for cancer. In addition, the cytotoxic effect of the metal-salen complex can be used to damage lesion cells other than cancer and obtain a therapeutic effect. A further therapeutic effect can be obtained by loading a desired drug on a micelle.
磁性を持つ本発明のミセルはMRIやCTに写るので、MRI用又はCT用の造影剤としても有用である。 The micelle of the present invention having magnetism is useful as a contrast agent for MRI or CT because it appears on MRI or CT.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
下記実施例において、試薬類はシグマ−アルドリッチ社より高純度のものを購入した。Fe(Salen)は、WO 2012/086683に記載の方法により作製したもの、又は東京化成工業より購入したものを用いた。調製したミセルの粒子径及び粒子構造は、H-7500透過型電子顕微鏡（日立製作所、日本国東京）を用いて80 kVで観察した。磁場での発熱の測定では、トランジスタインバータ（Hot Shot, Ameritherm Inc., 米国ニューヨーク州）を用いて内径4cmの垂直コイルにより交流磁場を発生させた。周波数308 kHz、電流250 Aで交流磁場を印加した。ハンディタイプ温度計測器HA-200（安立計器株式会社、日本国東京）を用いて温度を測定した。細胞傷害作用はスペクトル型in vivoイメージングシステム（IVIS）によりモニターした。 In the following examples, reagents having a high purity were purchased from Sigma-Aldrich. Fe (Salen) used was prepared by the method described in WO 2012/086683 or purchased from Tokyo Chemical Industry. The particle size and particle structure of the prepared micelles were observed at 80 kV using an H-7500 transmission electron microscope (Hitachi, Tokyo, Japan). In the measurement of heat generation in a magnetic field, an alternating magnetic field was generated by a vertical coil having an inner diameter of 4 cm using a transistor inverter (Hot Shot, Ameritherm Inc., New York, USA). An alternating magnetic field was applied at a frequency of 308 kHz and a current of 250 A. The temperature was measured using a handy type temperature measuring instrument HA-200 (Anritsu Keiki Co., Ltd., Tokyo, Japan). The cytotoxic effect was monitored by a spectral in vivo imaging system (IVIS).
略号はそれぞれ下記を指す。
PPy: ポリピロール
PCL: ポリカプロラクトン
GA: アラビアゴム
BSA: ウシ血清アルブミン
PEG: ポリエチレングリコール
PEI: ポリエチレンジアミン
Fe(Salen): μ-オキソN,N'-ビス(サリチリデン)エチレンジアミン鉄
Each abbreviation refers to the following.
PPy: Polypyrrole
PCL: Polycaprolactone
GA: Arabic gum
BSA: Bovine serum albumin
PEG: Polyethylene glycol
PEI: Polyethylenediamine
Fe (Salen): μ-oxo N, N'-bis (salicylidene) ethylenediamine iron
１．Fe(Salen)内包ミセルの調製（調製例１）
下記の手順により、熱感受性ポリマーセグメントをPCLとし、pH感受性ポリマーセグメントをPPyとするブロック共重合体によるFe(Salen)内包ミセルを調製した。
1. Preparation of Fe (Salen) -encapsulated micelle (Preparation Example 1)
By the following procedure, Fe (Salen) -encapsulated micelles were prepared from a block copolymer in which the heat-sensitive polymer segment was PCL and the pH-sensitive polymer segment was PPy.
10 mgのFe(Salen)（東京化成工業）を100 mLのメタノールに溶解して十分に撹拌し、150,000 rpmで遠心した後、ネオジウム磁石を用いた濾過により、不溶の沈殿物を溶液から分離除去した。2.5 mLの0.5 wt％ブロック共重合体PPy-PCL（シグマ−アルドリッチ、PPy鎖の分子量は4,000、PCL鎖の分子量は2,000。PPy鎖上にp-トルエンスルホン酸が25％ドープされているもの。）を超音波ホーンによりパルスモードで10秒間超音波処理し、上記で調製したFe(Salen)溶液に添加した。15分間強く撹拌すると、黒色のPPy-PCL-Fe(Salen)化合物が沈降した。この黒色化合物をネオジウム磁石で分離回収し、ミセルに充填されなかったFe(Salen)及び残余のPPy-PCL分子を除去し（メタノール中に溶解しているFe(Salen)は、その常磁性のために磁石に吸引されないので、Fe(Salen)が内包された共重合体のミセルのみ磁石で吸引回収できる）、5 mgのPPy-PCL-Fe(Salen)ミセル化合物を得た。 Dissolve 10 mg of Fe (Salen) (Tokyo Chemical Industry) in 100 mL of methanol, stir well, centrifuge at 150,000 rpm, and separate and remove insoluble precipitate from the solution by filtration using a neodymium magnet. did. 2.5 mL of 0.5 wt% block copolymer PPy-PCL (Sigma-Aldrich, PPy chain molecular weight 4,000, PCL chain molecular weight 2,000. PPy chain 25% doped with p-toluenesulfonic acid. ) Was sonicated for 10 seconds in pulse mode with an ultrasonic horn and added to the Fe (Salen) solution prepared above. When vigorously stirred for 15 minutes, a black PPy-PCL-Fe (Salen) compound precipitated. This black compound was separated and collected with a neodymium magnet to remove Fe (Salen) and the remaining PPy-PCL molecules that were not filled in the micelles (Fe (Salen) dissolved in methanol is paramagnetic). Therefore, only the micelle of the copolymer containing Fe (Salen) can be sucked and collected by the magnet), and 5 mg of PPy-PCL-Fe (Salen) micelle compound was obtained.
次いで、ウシ血清アルブミン又はアラビアゴムによるPPy-PCL-Fe(Salen)ミセル表面の被覆処理を行なった。回収した黒色のPPy-PCL-Fe(Salen)化合物をメタノールで数回洗浄した後、50mLの生理食塩水中に添加し、パルスモードで10秒間超音波処理して分散させた。この分散液に、被覆剤として過剰量（50 mg）のウシ血清アルブミン（BSA, 分子量66.5kDa）又はアラビアゴム（GA, 分子量250kDa）を添加して溶解させた。反応混合物をパルスモードで10秒間超音波処理し、150,000 rpmで30分間超遠心した後、磁気分離洗浄を３回行ない、ミセルに結合しなかった被覆剤を除去し、BSA又はGAで表面を被覆したミセルBSA-PPy-PCL-Fe(Salen)及びGA-PPy-PCL-Fe(Salen)を得た。 Next, the surface treatment of PPy-PCL-Fe (Salen) micelles with bovine serum albumin or gum arabic was performed. The collected black PPy-PCL-Fe (Salen) compound was washed several times with methanol, added to 50 mL of physiological saline, and dispersed by sonication for 10 seconds in a pulse mode. To this dispersion, an excess amount (50 mg) of bovine serum albumin (BSA, molecular weight 66.5 kDa) or gum arabic (GA, molecular weight 250 kDa) was added and dissolved as a coating agent. The reaction mixture was sonicated in pulse mode for 10 seconds, ultracentrifuged at 150,000 rpm for 30 minutes, then magnetically washed three times to remove the coating that did not bind to the micelles, and the surface was coated with BSA or GA. Micelles BSA-PPy-PCL-Fe (Salen) and GA-PPy-PCL-Fe (Salen) were obtained.
本調製例１で得られた、pH感受性セグメントがpH6未満の条件下で分解するFe(Salen)内包ミセルの構造の模式図を図１に示す（ミセル表面のBSA分子及びGA分子は図中では省略）。 A schematic diagram of the structure of Fe (Salen) -encapsulated micelles obtained in Preparation Example 1 that decomposes under conditions where the pH-sensitive segment is less than pH 6 is shown in FIG. 1 (BSA and GA molecules on the micelle surface are shown in the figure) (Omitted).
本調製例１で調製したFe(Salen)内包ミセルPPy-PCL-Fe(Salen)について、Fe(Salen)充填容量（loading capacity, %）及びFe(Salen)充填効率（loading efficiency, %）を下記の式により求めた。
Fe(Salen)充填容量(%)＝MinitialFe(Salen)− MFe(Salen) in excess)/(Mmicelle) x 100
Fe(Salen)充填効率(%)＝(MinitialFe(Salen)− MFe(Salen) in excess)/(MinitialFe(Salen)) x 100
式中、
MinitialFe(Salen): 添加したFe(Salen)の初期量[mg]
MFe(Salen) in excess: 上清中のFe(Salen)量（ミセルに内包されなかったFe(Salen)量）[mg]
Mmicelle: 得られたFe(Salen)内包ミセル量[mg]
本調製例１では、MinitialFe(Salen)が10 mgであり、Mmicelleは5 mgであり、MFe(Salen) in excessを化学量論的に算出すると約5.5 mgであったので、Fe(Salen)充填効率は約45 wt%、Fe(Salen)充填容量は約90 wt%であった。
For Fe (Salen) -encapsulated micelle PPy-PCL-Fe (Salen) prepared in Preparation Example 1, Fe (Salen) filling capacity (loading capacity,%) and Fe (Salen) filling efficiency (loading efficiency,%) are as follows. It was calculated by the following formula.
Fe (Salen) filling capacity (%) = M initialFe (Salen) − M Fe (Salen) in excess ) / (M micelle ) x 100
Fe (Salen) filling efficiency (%) = (M initialFe (Salen) − M Fe (Salen) in excess ) / (M initialFe (Salen) ) x 100
Where
M initialFe (Salen) : Initial amount of added Fe (Salen) [mg]
M Fe (Salen) in excess : Fe (Salen) content in the supernatant (Fe (Salen) content not contained in micelles) [mg]
M micelle : Fe (Salen) -encapsulated micelle amount [mg]
In Preparation Example 1, M initialFe (Salen) was 10 mg, M micelle was 5 mg, and M Fe (Salen) in excess was calculated stoichiometrically to be about 5.5 mg. Salen) filling efficiency was about 45 wt% and Fe (Salen) filling capacity was about 90 wt%.
２．Fe(Salen)内包ミセルの調製（調製例２）
下記の手順により、熱感受性ポリマーセグメントをPCL-PEG、pH感受性ポリマーセグメントをポリエチレンイミン又はアラビアゴムとするブロック共重合体によるFe(Salen)内包ミセルを調製した。
2. Preparation of Fe (Salen) -encapsulated micelle (Preparation Example 2)
According to the following procedure, Fe (Salen) -encapsulating micelles with a block copolymer in which the heat-sensitive polymer segment was PCL-PEG and the pH-sensitive polymer segment was polyethyleneimine or gum arabic were prepared.
10 mgのFe(Salen)（東京化成工業）を10 mLのクロロホルムに溶解して十分に撹拌し、150,000 rpmで遠心した後、ネオジウム磁石を用いた濾過により、不溶の沈殿物を溶液から分離除去した。2 mgのブロック共重合体PCL-PEG-R（R=COOH）（シグマ−アルドリッチ、PCL鎖の分子量は5,000、PEG鎖の分子量は5,000）を1mLのクロロホルムに溶解し、上記で調製したFe(Salen)溶液に添加した。15分間強く撹拌して得られた透明な溶液を1mLの水と混合した。この混合物を、全てのFe(Salen)が上層の水相に移動するまで、超音波ホーンを用いてパルスモードで1分間超音波処理した。クロロホルム相を除去した後、2mgのポリエチレンジアミン（PEI）（分子量2,500、シグマ−アルドリッチ）を1mLの0.5％アセテートに溶解したものを添加して反応させた。2時間の反応により、PCL-PEGのCOOH基をPEIのアミノ基に静電気的に結合させた。不安定なミセル構造物を除去するため、10mLのクロロホルムを用いて洗浄して未結合のFe(Salen)を分離し、上層の水相を新鮮なクロロホルムで洗浄した。室温で乾燥させた後、得られた紫色のFe(Salen)内包ミセルPEI-PEG-PCL-Fe(Salen)を生理食塩水中に分散させ、8,000 rpmで30分間の超遠心洗浄を行ない、再度生理食塩水中に分散させ、10秒間超音波処理した。 Dissolve 10 mg of Fe (Salen) (Tokyo Chemical Industry) in 10 mL of chloroform, stir well, centrifuge at 150,000 rpm, and separate and remove insoluble precipitate from the solution by filtration using a neodymium magnet. did. 2 mg of the block copolymer PCL-PEG-R (R = COOH) (Sigma-Aldrich, the molecular weight of the PCL chain is 5,000, the molecular weight of the PEG chain is 5,000) is dissolved in 1 mL of chloroform, and the Fe ( Salen) was added to the solution. The clear solution obtained after vigorous stirring for 15 minutes was mixed with 1 mL of water. The mixture was sonicated in pulse mode for 1 minute using an ultrasonic horn until all Fe (Salen) was transferred to the upper aqueous phase. After removing the chloroform phase, 2 mg of polyethylenediamine (PEI) (molecular weight 2,500, Sigma-Aldrich) dissolved in 1 mL of 0.5% acetate was added and reacted. By the reaction for 2 hours, the COOH group of PCL-PEG was electrostatically bound to the amino group of PEI. In order to remove unstable micelle structures, unbound Fe (Salen) was separated by washing with 10 mL of chloroform, and the upper aqueous phase was washed with fresh chloroform. After drying at room temperature, the obtained purple Fe (Salen) -encapsulated micelles PEI-PEG-PCL-Fe (Salen) are dispersed in physiological saline and subjected to ultracentrifugation washing at 8,000 rpm for 30 minutes. Dispersed in saline and sonicated for 10 seconds.
また、PEIに代えてアラビアゴム（分子量5,000〜25,000）を使用し、上記と同様の手順により、Fe(Salen)内包ミセルGA-PEG-PCL-Fe(Salen)を調製した。 Further, using gum arabic (molecular weight 5,000-25,000) instead of PEI, Fe (Salen) -encapsulating micelle GA-PEG-PCL-Fe (Salen) was prepared by the same procedure as described above.
本調製例２で得られた、pH感受性セグメントがpH7未満の条件下で分解するFe(Salen)内包ミセルPEI-PEG-PCL-Fe(Salen)及びGA-PEG-PCL-Fe(Salen)の構造の模式図を図２に示す。なお、ここではPCL-PEG-R（R=COOH）を用いたが、RがNH4、CH4、OH、又はSHであるブロック共重合体を使用しても同様にFe(Salen)内包ミセルを調製することができる。 Structures of Fe (Salen) -encapsulated micelles PEI-PEG-PCL-Fe (Salen) and GA-PEG-PCL-Fe (Salen) obtained in Preparation Example 2 that decompose under the condition that the pH-sensitive segment is less than pH 7 A schematic diagram of is shown in FIG. Although PCL-PEG-R (R = COOH) is used here, Fe (Salen) -encapsulated micelles are similarly used when a block copolymer in which R is NH 4 , CH 4 , OH, or SH is used. Can be prepared.
３．Fe(Salen)内包ミセルの調製（調製例３）
下記の手順により、調製例１のブロック共重合体及び調製例２のブロック共重合体を組み合わせた、2種類のブロック共重合体を含むFe(Salen)内包ミセルを調製した。
3. Preparation of Fe (Salen) -encapsulated micelle (Preparation Example 3)
According to the following procedure, Fe (Salen) -containing micelles containing two types of block copolymers were prepared by combining the block copolymer of Preparation Example 1 and the block copolymer of Preparation Example 2.
10 mgのFe(Salen)（東京化成工業）を10 mLのクロロホルムに溶解して十分に撹拌し、150,000 rpmで遠心した後、ネオジウム磁石を用いて濾過し、不溶の沈殿物を溶液から分離除去した。50μLの0.5wt％ブロック共重合体PPy-PCL（シグマ−アルドリッチ、調製例１と同じ）、及び1mLのクロロホルムに溶解した1.5 mgのブロックコポリマーPCL-PEG-R（R=COOH）（シグマ−アルドリッチ、調製例２と同じ）を、上記で調製したFe(Salen)溶液に添加した。15分間強く撹拌して得られた透明な溶液を1mLの水と混合した。この混合物を、全てのFe(Salen)相が上層の水相に移動するまで、超音波ホーンを用いてパルスモードで1分間超音波処理した。クロロホルム相を除去した後、2mgのポリエチレンジアミン（PEI）（分子量2500、シグマ−アルドリッチ）を1mLの0.5％アセテートに溶解したものを添加して反応させた。2時間の反応により、PCL-PEGのCOOH基をPEIのアミノ基に静電気的に結合させた。不安定なミセル構造物を除去するため、10mLのクロロホルムを用いて洗浄して未結合のFe(Salen)を分離し、上層の水相を新鮮なクロロホルムで洗浄した。室温で乾燥させた後、得られた紫色のFe(Salen)内包ミセル[PPy-PCL/PEI-PEG-PCL]-Fe(Salen)を生理食塩水中に分散させ、8,000 rpmで30分間の超遠心洗浄を行ない、再度生理食塩水中に分散させ、10秒間超音波処理した。 Dissolve 10 mg of Fe (Salen) (Tokyo Kasei Kogyo) in 10 mL of chloroform, stir well, centrifuge at 150,000 rpm, and filter with a neodymium magnet to separate and remove insoluble precipitates from the solution. did. 50 μL of 0.5 wt% block copolymer PPy-PCL (Sigma-Aldrich, same as Preparation Example 1) and 1.5 mg of block copolymer PCL-PEG-R (R = COOH) (Sigma-Aldrich) dissolved in 1 mL of chloroform The same as in Preparation Example 2) was added to the Fe (Salen) solution prepared above. The clear solution obtained after vigorous stirring for 15 minutes was mixed with 1 mL of water. The mixture was sonicated in pulse mode for 1 minute using an ultrasonic horn until all the Fe (Salen) phase was transferred to the upper aqueous phase. After removing the chloroform phase, 2 mg of polyethylenediamine (PEI) (molecular weight 2500, Sigma-Aldrich) dissolved in 1 mL of 0.5% acetate was added and reacted. By the reaction for 2 hours, the COOH group of PCL-PEG was electrostatically bound to the amino group of PEI. In order to remove unstable micelle structures, unbound Fe (Salen) was separated by washing with 10 mL of chloroform, and the upper aqueous phase was washed with fresh chloroform. After drying at room temperature, the obtained purple Fe (Salen) -encapsulated micelle [PPy-PCL / PEI-PEG-PCL] -Fe (Salen) was dispersed in physiological saline and ultracentrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes Washing was performed, and the sample was again dispersed in physiological saline and sonicated for 10 seconds.
また、PEIに代えてキトサン（分子量2500）を使用し、上記と同様の手順により、Fe(Salen)内包ミセル[PPy-PCL/キトサン-PEG-PCL]-Fe(Salen)を調製した。 In addition, Fe (Salen) -encapsulated micelle [PPy-PCL / chitosan-PEG-PCL] -Fe (Salen) was prepared by the same procedure as described above, using chitosan (molecular weight 2500) instead of PEI.
本調製例３で得られたFe(Salen)内包ミセルの構造の模式図を図３に示す。当該ミセルは、熱感受性ポリマーセグメントをPCLとし、pH感受性ポリマーセグメントをPPyとするブロック共重合体（PPy：PCL＝2:1）と、熱感受性ポリマーセグメントをPCL-PEGとし、pH感受性ポリマーセグメントをPEI又はキトサンとするブロック共重合体（PEI：PEG：PCL又はキトサン＝1:2:2）とを組み合わせたミセルである。２種類のブロック共重合体のモル比は、PPy-PCL：PEI-PEG-PCL（又はキトサン-PEG-PCL）＝6：7.5であり、ミセルはpH7未満で分解するpH感受性を示す。 A schematic diagram of the structure of the Fe (Salen) -encapsulating micelle obtained in Preparation Example 3 is shown in FIG. The micelle consists of a block copolymer (PPy: PCL = 2: 1) in which the heat-sensitive polymer segment is PCL and the pH-sensitive polymer segment is PPy, the heat-sensitive polymer segment is PCL-PEG, and the pH-sensitive polymer segment is It is a micelle combined with a block copolymer (PEI: PEG: PCL or chitosan = 1: 2: 2) as PEI or chitosan. The molar ratio of the two types of block copolymers is PPy-PCL: PEI-PEG-PCL (or chitosan-PEG-PCL) = 6: 7.5, and micelles exhibit a pH sensitivity that degrades below pH 7.
４．磁性化合物担持ミセルの構造
調製例１のミセルGA-PPy-PCL-Fe(Salen)の透過型電子顕微鏡像を図４に示す。ミセルは30％以上のFe(Salen)を含有し、PCL及びFe(Salen)を含むコア部が導電性のPPy層及び最外層のアラビアゴム層で構成されるシェルに包まれたマルチコアシェル構造が確認された。
4). Structure of magnetic compound-supported micelle A transmission electron microscope image of the micelle GA-PPy-PCL-Fe (Salen) of Preparation Example 1 is shown in FIG. The micelle contains 30% or more Fe (Salen), and the core part containing PCL and Fe (Salen) has a multi-core shell structure wrapped in a shell composed of a conductive PPy layer and the outermost gum arabic layer. confirmed.
５．磁性化合物内包ミセルの磁性強度測定
ミセルに充填したFe(Salen)の磁性強度を測定し、ミセルに充填していないFe(Salen)と比較した。Fe(Salen)内包ミセルは、調製例１のGA-PPy-PCL-Fe(Salen)を用いた。ミセル非充填のFe(Salen)として、東京化成工業製のFe(Salen)をシンキー製ナノ粉砕機NP-100で粉砕したもの、及び未粉砕のものの2種類を用いた。
5. Measurement of magnetic strength of micelle encapsulating magnetic compound The magnetic strength of Fe (Salen) filled in the micelle was measured and compared with Fe (Salen) not filled in the micelle. As the Fe (Salen) -encapsulating micelle, GA-PPy-PCL-Fe (Salen) of Preparation Example 1 was used. As the micelle-unfilled Fe (Salen), two types were used, one obtained by pulverizing Fe (Salen) manufactured by Tokyo Kasei Kogyo with a NP-100 nano-pulverizer manufactured by Shinky and one not yet pulverized.
上記3種類の試料に生理食塩水を加え、それぞれFe(salen)の含有量が1mg/mLとなるように調製した。調製した試料をガラスキャピラリーに20μL吸い上げ、電子スピン共鳴装置（Electron Spin Resonance; ESR）で磁場強度3500G付近のエネルギー吸収を検出した。グラフの磁場−エネルギー吸収曲線とX軸との間の面積を磁性強度の指標として、各試料のもつ磁性の強さを比較した。各試料ともサンプル数を４とし、４回の測定値の平均値を求めて比較した。 Saline was added to the above three types of samples, and each was prepared so that the content of Fe (salen) was 1 mg / mL. 20 μL of the prepared sample was sucked into a glass capillary, and energy absorption near a magnetic field strength of 3500 G was detected with an electron spin resonance (ESR). Using the area between the magnetic field-energy absorption curve of the graph and the X axis as an index of magnetic strength, the magnetic strength of each sample was compared. For each sample, the number of samples was 4, and the average value of four measurements was obtained and compared.
測定結果を図５に示す。ミセルに内包させることでFe(Salen)の磁性が高まることが確認された。 The measurement results are shown in FIG. It was confirmed that the magnetic properties of Fe (Salen) increased by inclusion in micelles.
６．磁性化合物内包ミセルを用いた温熱療法
(1) J-H. Kim and T-M. Lu, RSC Advances 6(21)、 2016に記載の方法により、NIRレーザー照射による温熱療法の検討実験を行なった。25℃の2.5 mg/mLミセル溶液0.5 mL（調製例１のミセルGA-PPy-PCL-Fe(Salen)を使用）にNIRレーザー（800 nm）を照射し、液温を測定した。結果を図６に示す。レーザー照射開始から短時間のうちに温度の上昇がみられた。
6). Hyperthermia using magnetic compound-encapsulated micelles
(1) Thermotherapy with NIR laser irradiation was examined by the method described in JH. Kim and TM. Lu, RSC Advances 6 (21), 2016. NIR laser (800 nm) was irradiated to 0.5 mL of a 2.5 mg / mL micelle solution at 25 ° C. (using the micelle GA-PPy-PCL-Fe (Salen) of Preparation Example 1), and the liquid temperature was measured. The results are shown in FIG. The temperature increased within a short period of time from the start of laser irradiation.
(2) 交流磁場の印加によるミセルの発熱を調べた。ミセル溶液（調製例１のミセルGA-PPy-PCL-Fe(Salen)を使用。濃度は10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL）及び東京化成工業製Fe(salen)懸濁液（2.5mg/mL）をそれぞれ1.5mLチューブに1mLずつ入れ、温度計の先端を完全に液に浸かるように刺した。チューブをコイルの中心に固定し、電流378.8A、周波数308〜309kHzの交流磁場を印加した。試料の温度を5分間隔で40分間記録した。 (2) The heat generation of micelles by applying an alternating magnetic field was investigated. Micellar solution (using micelle GA-PPy-PCL-Fe (Salen) from Preparation Example 1. Concentration is 10 mg / mL, 5 mg / mL, 2.5 mg / mL) and Tokyo Chemical Industry Fe (salen) suspension (2.5 mg / mL) was put in 1 mL each in a 1.5 mL tube, and the tip of the thermometer was stabbed so that it was completely immersed in the liquid. The tube was fixed at the center of the coil, and an alternating magnetic field having a current of 378.8 A and a frequency of 308 to 309 kHz was applied. The temperature of the sample was recorded for 40 minutes at 5 minute intervals.
温度の測定結果を図７に示す。交流磁場の印加によっても数分以内に温度の上昇がみられた。図５に示した結果と合致するように、ミセル非担持のFe(Salen)よりも磁性が高まったFe(Salen)内包ミセルは、交流磁場の印加によりミセル非担持のFe(Salen)よりもはるかに高温まで温度が上昇した。 The measurement result of temperature is shown in FIG. Even with the application of an alternating magnetic field, the temperature rose within a few minutes. As is consistent with the results shown in FIG. 5, Fe (Salen) -encapsulated micelles having higher magnetic properties than micelle-unsupported Fe (Salen) are far more than micelle-unsupported Fe (Salen) by applying an alternating magnetic field. The temperature rose to a high temperature.
(3) 次いで、ヒト子宮頸がん由来細胞であるHeLa細胞を用いて、Fe(Salen)内包ミセルを用いた温熱療法の効果をさらに詳細に検討した。96穴プレートの各ウェルに100μLのHeLa細胞懸濁液（細胞数は各ウェル5000個）を添加し、調製例１のミセルGA-PPy-PCL-Fe(Salen)を終濃度0.1 mg/mLで添加混合し、液温が42℃に達するまで約10分間NIRレーザー（波長800 nm）を照射した。 (3) Next, the effect of hyperthermia using Fe (Salen) -encapsulated micelles was examined in more detail using HeLa cells, which are cells derived from human cervical cancer. Add 100 μL of HeLa cell suspension (5000 cells per well) to each well of the 96-well plate, and add the micelle GA-PPy-PCL-Fe (Salen) from Preparation Example 1 at a final concentration of 0.1 mg / mL. The mixture was added and irradiated with a NIR laser (wavelength 800 nm) for about 10 minutes until the liquid temperature reached 42 ° C.
結果を図８に示す。蛍光の色により生存細胞と死細胞を区別した。図８中では赤色蛍光を発する死細胞を実線で囲んで示す。ミセル非混合でレーザー照射したHeLa細胞（図８左）では死細胞はほとんど観察されなかったが、ミセルと混合してレーザー照射したHeLa細胞（図８右）では８０％に上る細胞が死亡しており、レーザー照射されたミセルの発熱により細胞を殺傷できることが確認された。 The results are shown in FIG. Viable and dead cells were distinguished by the color of fluorescence. In FIG. 8, dead cells that emit red fluorescence are surrounded by a solid line. Although almost no dead cells were observed in HeLa cells irradiated with laser without mixing micelles (Figure 8 left), up to 80% of the cells died with HeLa cells mixed with micelles and irradiated with laser (Figure 8 right). It was confirmed that the cells could be killed by the fever of the micelles irradiated with the laser.
細胞培養液中へのミセルの添加濃度とレーザー照射後のHeLa細胞の生存率との関係を調べた結果を図９に示す。80μg/mL以上のミセル濃度において、レーザー照射により80％以上の細胞を殺傷できた。 FIG. 9 shows the results of examining the relationship between the concentration of micelles added to the cell culture medium and the survival rate of HeLa cells after laser irradiation. At a micelle concentration of 80 μg / mL or more, 80% or more of the cells could be killed by laser irradiation.
以上の(1)〜(3)により、本発明のFe(Salen)内包ミセルは、レーザー照射や磁場の印加などの手段と組み合わせてがん等の温熱療法に適用できる可能性が示された。 From the above (1) to (3), the Fe (Salen) -encapsulated micelles of the present invention have been shown to be applicable to thermotherapy such as cancer in combination with laser irradiation or magnetic field application.
７．温度変化及びpH変化によるミセルからの薬剤放出
調製例１のミセルGA-PPy-PCL-Fe(Salen)を用いて、温度変化及びpH変化によるミセルからの薬剤放出を調べた。ミセルを生理食塩水に溶解し、塩酸でpHを調整した。37℃、45℃、50℃、55℃又は60℃でミセル溶液を1時間加熱した後、室温で48時間インキュベートし、ミセルから放出されたFe(Salen)の溶液中濃度（〜30％）をUV-vis分光光度計（Nanodrop, サーモフィッシャー社）によりλmax 310 nmで測定した。
7). Drug release from micelles due to temperature change and pH change Using micelle GA-PPy-PCL-Fe (Salen) of Preparation Example 1, drug release from micelles due to temperature change and pH change was examined. Micelle was dissolved in physiological saline, and the pH was adjusted with hydrochloric acid. Heat the micelle solution at 37 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C or 60 ° C for 1 hour, then incubate at room temperature for 48 hours to determine the concentration of Fe (Salen) released from the micelle in solution (~ 30%) Measurement was performed at λmax 310 nm with a UV-vis spectrophotometer (Nanodrop, Thermo Fisher).
結果を図１０に示す。中性条件では、ミセルを加熱してもミセルからのFe(Salen)の放出はほとんど生じず、60℃の加熱で放出量は6.5％程度であった。低pH条件では45℃程度の加熱でも10％〜25％程度のFe(Salen)の放出がみられ、温度が高いほど多量のFe(Salen)が放出された。特にpH4では体温程度（37℃）でも10％以上の薬剤の放出が見られた。この結果は、低pHを示す病変部、例えばがん病変部や、アテローム性動脈硬化病変部などのマクロファージが集積する病変部（Park et al., Chem. Commun., 2014, 50, pp.15014-15017）に対して選択的に作用する治療手段としての本発明のミセルの有効性を示唆している。 The results are shown in FIG. Under neutral conditions, even when micelles were heated, Fe (Salen) was hardly released from the micelles, and when heated at 60 ° C., the release amount was about 6.5%. Under low pH conditions, about 10% to 25% of Fe (Salen) was released even when heated to about 45 ° C., and a larger amount of Fe (Salen) was released as the temperature increased. In particular, at pH 4, a drug release of 10% or more was observed even at about body temperature (37 ° C). This result shows that lesions exhibiting low pH, such as cancer lesions and atherosclerotic lesions, where macrophages accumulate (Park et al., Chem. Commun., 2014, 50, pp.15014 -15017) suggests the effectiveness of the micelles of the present invention as a therapeutic tool that acts selectively.
８．Fe(Salen)内包ミセルの細胞毒性
ヒト卵巣類内膜癌由来細胞株OVK18を用いてFe(Salen)内包ミセルの細胞毒性をXTTアッセイにより調べた。アッセイには市販のXTTアッセイキット（ロシュ社）を用いた。
8). Cytotoxicity of Fe (Salen) -encapsulated micelles The cytotoxicity of Fe (Salen) -encapsulated micelles was examined by XTT assay using a human ovarian endometrial cancer-derived cell line OVK18. A commercially available XTT assay kit (Roche) was used for the assay.
96ウェル平底プレートのウェルにOVK18細胞を20,000個/ウェル/50μLで添加し、5％CO2下で37℃、3時間インキュベートした。調製例１のFe(Salen)内包ミセルGA-PPy-PCL-Fe(Salen)、又はFe(Salen)を3.13〜50μg/mLの終濃度となるように各ウェルの細胞に50μL/ウェルで添加し、5％CO2下で37℃、24時間インキュベートした。XTT試薬を50μL/ウェルで細胞に添加し、5％CO2下で37℃、2時間インキュベートした後、測定波長490nm、参照波長655nmで吸光度を測定し、細胞の増殖を調べた。 OVK18 cells were added to wells of a 96-well flat bottom plate at 20,000 cells / well / 50 μL and incubated at 37 ° C. for 3 hours under 5% CO 2 . Add Fe (Salen) -encapsulated micelles of Preparation Example 1 GA-PPy-PCL-Fe (Salen) or Fe (Salen) to cells in each well at a final concentration of 3.13-50 μg / mL at 50 μL / well. Incubated for 24 hours at 37 ° C., 5% CO 2 . XTT reagent was added to the cells at 50 μL / well and incubated at 37 ° C. for 2 hours under 5% CO 2 , and then the absorbance was measured at a measurement wavelength of 490 nm and a reference wavelength of 655 nm to examine cell proliferation.
結果を図１１に示す。ミセルに担持させないFe(Salen)は、約3μg/mLの濃度でも細胞を傷害し、12.5μg/mLの濃度で50％以上の細胞を殺傷した。一方、上記調製例の通りに調製したFe(Salen)内包ミセルは、12.5μg/mLの濃度でもほとんど細胞毒性を示さず、50μg/mLの処理濃度でも、ミセル非担持のFe(Salen)を3.13μg/mLの濃度で処理した時と同程度の細胞毒性しか示さなかった。上記の通りにミセルに内包させることでFe(Salen)の細胞毒性を大幅に低減できることが確認された。 The results are shown in FIG. Fe (Salen) not supported on micelles damaged cells even at a concentration of about 3 μg / mL, and killed 50% or more of cells at a concentration of 12.5 μg / mL. On the other hand, the Fe (Salen) -encapsulated micelle prepared as in the above preparation example shows almost no cytotoxicity even at a concentration of 12.5 μg / mL, and even when treated at 50 μg / mL, the micelle-free Fe (Salen) is 3.13 It showed only the same level of cytotoxicity as when treated at a concentration of μg / mL. It was confirmed that the cytotoxicity of Fe (Salen) can be greatly reduced by inclusion in micelles as described above.
９．Fe(Salen)内包ミセルの細胞毒性（加熱がミセルの細胞毒性に与える影響）
Fe(Salen)内包ミセルでの細胞処理時に細胞懸濁液を加熱し、外部からの加熱がミセルの細胞毒性に与える影響をXTTアッセイにより調べた。
9. Cytotoxicity of Fe (Salen) -encapsulated micelles (Effect of heating on micelle cytotoxicity)
The cell suspension was heated during cell treatment with Fe (Salen) -encapsulated micelles, and the effect of external heating on the micelle cytotoxicity was examined by XTT assay.
(1) 調製例１のFe(Salen)内包ミセルGA-PPy-PCL-Fe(Salen)
上記８．の実験系で、Fe(Salen)内包ミセル又はFe(Salen)で細胞を処理する工程において、ウェルを43℃で30分間又は60分間加熱した後、室温で引き続き細胞の処理を行なった（薬剤処理時間は合計で24時間とした）。
(1) Fe (Salen) -encapsulating micelles of Preparation Example 1 GA-PPy-PCL-Fe (Salen)
Above 8. In the experimental system, in the step of treating cells with Fe (Salen) -encapsulated micelles or Fe (Salen), the wells were heated at 43 ° C. for 30 or 60 minutes and then treated at room temperature (drug treatment) The total time was 24 hours).
結果を図１２に示す。細胞増殖は、43℃の加熱処理を行なった場合でも加熱処理なし（室温, RT）の場合と同等であった。図１０に示した結果とも合致するように、Fe(Salen)内包ミセルは、中性のミセル溶液を外部から43℃程度に加熱する程度では崩壊せず、ミセルに内包したFe(Salen)の漏出が生じないことが示唆された。 The results are shown in FIG. Cell growth was equivalent to that without heat treatment (room temperature, RT) even when heat treatment was performed at 43 ° C. As is consistent with the results shown in FIG. 10, the Fe (Salen) -encapsulated micelles do not collapse to the extent that the neutral micelle solution is heated to about 43 ° C. from the outside, and the leakage of Fe (Salen) encapsulated in the micelles It was suggested that no occurs.
(2) 調製例２のFe(Salen)内包ミセルPEI-PEG-PCL-Fe(Salen)
熱感受性ポリマーセグメントをPCL-PEGで、pH感受性ポリマーセグメントをPEIで構成したFe(Salen)内包ミセルについて、加熱の影響を検討した。細胞はOVK18の他にヒト滑膜肉腫由来細胞株HS-SY-IIも使用した。細胞数はいずれも20,000個/ウェルとした。ミセルによる処理濃度は0.5〜10μg/mLとし、処理開始から1時間45℃で加熱した後、室温で引き続き23時間処理した。非加熱コントロールの細胞はミセル処理を室温で24時間行なった。
(2) Fe (Salen) -encapsulating micelles of Preparation Example 2 PEI-PEG-PCL-Fe (Salen)
The effect of heating was examined on Fe (Salen) -encapsulated micelles in which the heat-sensitive polymer segment was composed of PCL-PEG and the pH-sensitive polymer segment was composed of PEI. The cells used were human synovial sarcoma-derived cell line HS-SY-II in addition to OVK18. The number of cells was 20,000 / well. The treatment concentration with micelles was 0.5 to 10 μg / mL. After heating at 45 ° C. for 1 hour from the start of treatment, the treatment was continued at room temperature for 23 hours. Non-heated control cells were treated with micelles at room temperature for 24 hours.
結果を図１３に示す。いずれの細胞株に対しても、加熱処理の導入により増殖抑制作用の増加が若干認められた。調製例１のミセルと比べると当該ミセルは加熱に対してやや敏感であることが示唆された。 The results are shown in FIG. For all cell lines, a slight increase in growth inhibitory effect was observed with the introduction of heat treatment. Compared with the micelle of Preparation Example 1, it was suggested that the micelle was somewhat sensitive to heating.
(3) 調製例２のFe(Salen)内包ミセルGA-PEG-PCL-Fe(Salen)
熱感受性ポリマーセグメントをPCL-PEGで、pH感受性ポリマーセグメントをGAで構成したFe(Salen)内包ミセルについて、(2)と同様の検討を行なった。結果を図１４に示す。当該ミセルは、非加熱条件ではOVK18に対する増殖抑制作用はHS-SY-IIに対する増殖抑制作用よりも弱いが、加熱によりOVK18に対する増殖抑制作用が大幅に増加した。HS-SY-IIに対しては加熱による増殖抑制作用の増大は見られなかった。細胞の種類（腫瘍の種類）によってもミセルの効果が異なり得ることが示唆された。
(3) Fe (Salen) -encapsulating micelle GA-PEG-PCL-Fe (Salen) of Preparation Example 2
Fe (Salen) -containing micelles in which the thermosensitive polymer segment is composed of PCL-PEG and the pH-sensitive polymer segment is composed of GA were examined in the same manner as in (2). The results are shown in FIG. The micelles had a growth inhibitory action against OVK18 that was weaker than that against HS-SY-II under non-heated conditions, but the growth inhibitory action against OVK18 was significantly increased by heating. HS-SY-II did not increase the growth inhibitory effect due to heating. It was suggested that the effect of micelles may vary depending on the cell type (tumor type).
(4) 調製例３のFe(Salen)内包ミセル
２種類の熱感受性ブロック−pH感受性ブロック共重合体を組み合わせた調製例３のFe(Salen)内包ミセル[PPy-PCL/PEI-PEG-PCL]-Fe(Salen)について、(2)と同様の検討を行なった。結果を図１５に示す。HS-SY-IIに対しては、加熱により増殖抑制作用がやや増大した。
(4) Fe (Salen) -encapsulated micelles of Preparation Example 3 Fe (Salen) -encapsulated micelles of Preparation Example 3 combining two types of heat-sensitive block-pH-sensitive block copolymers [PPy-PCL / PEI-PEG-PCL] -Fe (Salen) was examined in the same manner as (2). The results are shown in FIG. For HS-SY-II, the growth inhibitory effect was slightly increased by heating.
１０．抗がん剤担持Fe(Salen)内包ミセルの調製及びその抗がん活性の評価
(1) 抗がん剤担持ミセルの調製
抗がん剤としてメトトレキサート（MTX）を用いた。Fe(Salen)内包ミセルにMTXを担持させるため、まずミセルに塩化セチルピリジニウムを担持させた。脱イオン水中にFe(Salen)内包ミセル（分散剤不使用の調製例１のミセルPPy-PCL-Fe(Salen)）を溶解させた1 mg/mLミセル溶液1 mLを10 mg/mLの塩化セチルピリジニウム1 mLと混合し、水酸化カリウムでpH8に調整した。1時間反応させた後、水酸化カリウムでpH8とした水にて3回ミセルを洗浄し、ミセル表面に塩化セチルピリジニウムを結合させた。
10. Preparation of anticancer drug-supported Fe (Salen) -encapsulated micelle and evaluation of its anticancer activity
(1) Preparation of micelle loaded with anticancer agent Methotrexate (MTX) was used as an anticancer agent. In order to support MTX in Fe (Salen) -containing micelles, first, cetylpyridinium chloride was supported in micelles. 1 mg / mL micelle solution containing 10 mg / mL cetyl chloride in which Fe (Salen) -encapsulated micelles (micelle PPy-PCL-Fe (Salen) in Preparation Example 1 without using a dispersant) is dissolved in deionized water It was mixed with 1 mL of pyridinium and adjusted to pH 8 with potassium hydroxide. After reacting for 1 hour, the micelle was washed three times with water adjusted to pH 8 with potassium hydroxide, and cetylpyridinium chloride was bound to the micelle surface.
洗浄後の塩化セチルピリジニウム結合ミセルを滅菌水1 mLに溶解し、MTX（DMSO溶液、pH8）を2mg/mLの濃度で添加、混合した。1時間反応させた後、生理食塩水（pH8）で洗浄し、塩化セチルピリジニウムを介してMTXがミセル表面に担持されたMTX担持Fe(Salen)内包ミセルM-MTX CPyを得た。 The washed cetylpyridinium chloride-coupled micelles were dissolved in 1 mL of sterilized water, and MTX (DMSO solution, pH 8) was added and mixed at a concentration of 2 mg / mL. After reacting for 1 hour, it was washed with physiological saline (pH 8) to obtain MTX-supported Fe (Salen) -encapsulated micelle M-MTX CPy in which MTX was supported on the micelle surface via cetylpyridinium chloride.
さらに、塩化セチルピリジニウム以外のリンカーとして、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）を用いてMTX担持ミセルを調製した。脱イオン水中にFe(Salen)内包ミセルを溶解させた1 mg/mLミセル溶液1mLを10 mg/mL EDC及びMTX（DMSO, pH 8, 2 mg/mL）と混合し、1時間反応させた後、生理食塩水(pH 8)で洗浄することにより、EDSを介してMTXを表面に担持させたミセルM-MTX EDCを得た。 Furthermore, MTX-supported micelles were prepared using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) as a linker other than cetylpyridinium chloride. After mixing 1 mL of 1 mg / mL micelle solution with Fe (Salen) -encapsulated micelles dissolved in deionized water with 10 mg / mL EDC and MTX (DMSO, pH 8, 2 mg / mL) and reacting for 1 hour By washing with physiological saline (pH 8), micelle M-MTX EDC carrying MTX on the surface via EDS was obtained.
リンカーを用いずにMTXを担持させたミセルM-MTXは、1 mg/mLのFe(Salen)内包ミセルをMTX (DMSO, pH 8, 2 mg/mL）と混合し、1時間反応させた後、生理食塩水(pH 8)で洗浄することにより調製した。 Micelle M-MTX loaded with MTX without using a linker is mixed with 1 mg / mL Fe (Salen) -encapsulated micelle with MTX (DMSO, pH 8, 2 mg / mL) and reacted for 1 hour It was prepared by washing with physiological saline (pH 8).
(2) 抗がん剤担持ミセルの抗がん活性
上記で調製した各種MTX担持Fe(Salen)内包ミセル（M-MTX、M-MTX EDC、M-MTX CPy）及びMTX非担持のFe(Salen)内包ミセル（M）について、XTTアッセイにより抗がん活性を調べた。アッセイには市販のキット（ロシュ社）を用いた。
(2) Anticancer activity of anticancer drug-supported micelles MTX-supported Fe (Salen) -encapsulated micelles prepared above (M-MTX, M-MTX EDC, M-MTX CPy) and MTX-non-supported Fe (Salen ) Encapsulated micelles (M) were examined for anticancer activity by XTT assay. A commercially available kit (Roche) was used for the assay.
＜方法＞
96ウェル平底プレートのウェルにHeLa細胞を5000個/ウェル/50μLで添加し、5％CO2下で37℃、3時間インキュベートした。上記の薬剤のいずれかを終濃度15μg/mL又は30μg/mLとなるように50μL/ウェルで細胞に添加し、5％CO2下で37℃、24時間インキュベートした。XTT試薬を50μL/ウェルで細胞に添加し、5％CO2下で37℃、2時間インキュベートした後、測定波長490nm、参照波長655nmで吸光度を測定し、細胞の増殖を調べた。
<Method>
HeLa cells were added to wells of a 96-well flat bottom plate at 5000 cells / well / 50 μL, and incubated at 37 ° C. for 3 hours under 5% CO 2 . Any of the above drugs was added to the cells at a final concentration of 15 μg / mL or 30 μg / mL at 50 μL / well and incubated at 37 ° C. for 24 hours under 5% CO 2 . XTT reagent was added to the cells at 50 μL / well and incubated at 37 ° C. for 2 hours under 5% CO 2 , and then the absorbance was measured at a measurement wavelength of 490 nm and a reference wavelength of 655 nm to examine cell proliferation.
＜結果＞
結果を図１６に示す。塩化セチルピリジニウムを用いてMTXを担持させたミセルは、他のミセルと比べて抗がん細胞傷害活性が最も高かった。このことは、塩化セチルピリジニウムがミセルのPPyシェル上にMTXを担持させるリンカーとして非常に有用であることを示している。
<Result>
The results are shown in FIG. Micelle loaded with MTX using cetylpyridinium chloride had the highest anticancer cytotoxic activity compared to other micelles. This indicates that cetylpyridinium chloride is very useful as a linker to carry MTX on the PPy shell of micelles.
１１．Fe(Salen)の担持量又は被覆剤によるミセルの調製
以下のミセルについて、構造、光学的性質、磁性強度を解析し、被覆剤による調製の効果を検討した。
M1: 被覆剤を使用しないほかは調製例１の通りに調製したミセル
M1.5: M1においてFe(Salen)の使用量を1.5倍に増やして調製したミセル
M2: 被覆剤としてBSAを用いて調製した調製例１のミセル
M3: 被覆剤としてアラビアゴム（GA）を用いて調製した調製例１のミセル
11. Preparation of micelle with Fe (Salen) loading or coating agent The structure, optical properties and magnetic strength of the following micelles were analyzed, and the effect of preparation with the coating agent was examined.
M1: micelle prepared as in Preparation Example 1 except that no coating agent was used
M1.5: micelle prepared by increasing the amount of Fe (Salen) used in M1 by 1.5 times
M2: micelle of Preparation Example 1 prepared using BSA as coating agent
M3: micelle of Preparation Example 1 prepared using gum arabic (GA) as a coating agent
(1) 調製したミセルの構造解析
被覆剤で覆われていない裸のミセルであるM1では、透過型電子顕微鏡（TEM）により観察された酸化鉄の粒子は１％未満であった（図１７）。ミセル内部に充填されたFe(Salen)分子が乾燥状態ではクラスター化しておらず、Fe(Salen)粒子のサイズがTEMの検出下限値を下回っていたために、乾燥状態のミセル試料において内部のFe(Salen)を直接観察することは困難であった。
(1) Structural analysis of the prepared micelle In M1, which is a bare micelle not covered with a coating agent, the iron oxide particles observed by a transmission electron microscope (TEM) were less than 1% (FIG. 17). . The Fe (Salen) molecules packed inside the micelles were not clustered in the dry state, and the size of the Fe (Salen) particles was below the detection limit of TEM. It was difficult to observe Salen) directly.
Fe(Salen)の量を1.5倍に増やして調製したM1.5では、TEMにより酸化鉄の粒子が多少観察された（図１８）。元素マッピング（図１８左下）でも、ナノサイズの酸化鉄粒子の存在が確認された。ミセル粒子のラインスキャン（図１８右下）の結果、ポリマーのシェル構造に加え酸化鉄のコア構造も確認された。Fe(Salen)を増量することでミセル内部のFe(Salen)分子がより密に集積してクラスター化していることが確認された。 In M1.5 prepared by increasing the amount of Fe (Salen) by 1.5 times, some iron oxide particles were observed by TEM (FIG. 18). The presence of nano-sized iron oxide particles was also confirmed by elemental mapping (lower left of FIG. 18). As a result of the line scan of the micelle particles (lower right of FIG. 18), the core structure of iron oxide was confirmed in addition to the polymer shell structure. By increasing the amount of Fe (Salen), it was confirmed that the Fe (Salen) molecules inside the micelles were more closely accumulated and clustered.
Fe(Salen)の量はM1と同じであるが表面をGAで被覆したM3では、サイズが均一な酸化鉄の粒子構造が多数観察された（図１９）。表面をGAで被覆することで、ミセル内部のFe(Salen)分子がさらに密に集積し、M1.5よりも大きなクラスターを形成していることが確認された。 The amount of Fe (Salen) was the same as that of M1, but in M3 whose surface was coated with GA, many particle structures of iron oxide having a uniform size were observed (FIG. 19). By covering the surface with GA, it was confirmed that Fe (Salen) molecules inside the micelles were more densely accumulated and formed clusters larger than M1.5.
各サンプルのX線回折測定の結果によると、M1及びM1.5のミセルサンプルでは結晶相としてFe3O4と推測される回折角2θ＝41°のピークが検出されたが、C16H14FeN2O2と推測されるピークは検出されなかった。ピーク形状から、非晶質成分が主成分であると推測された。Fe3O4はFe(Salen)の分解により生じた不純物と考えられる。このFe3O4のピークの強度は、M1では1950、M1.5では300であり、ミセルに担持させるFe(Salen)の量を多くすることでFe(Salen)の分解不純物が低減された。 According to the results of X-ray diffraction measurement of each sample, a peak at a diffraction angle 2θ = 41 °, which is presumed to be Fe 3 O 4 , was detected as a crystal phase in the micelle samples of M1 and M1.5, but C 16 H 14 A peak presumed to be FeN 2 O 2 was not detected. From the peak shape, it was estimated that the amorphous component was the main component. Fe 3 O 4 is considered to be an impurity generated by the decomposition of Fe (Salen). The intensity of this Fe 3 O 4 peak was 1950 for M1 and 300 for M1.5, and by increasing the amount of Fe (Salen) supported on the micelle, the decomposition impurities of Fe (Salen) were reduced.
(2) 調製したミセルの光学的性質
調製例１のミセルPPy-PCL-Fe(Salen)、BSA-PPy-PCL-Fe(Salen)及びGA-PPy-PCL-Fe(Salen)の紫外可視分光（UV-vis）スペクトル及びフーリエ変換赤外分光（FT-IR）スペクトルを図２０に示す。比較のため、ブロックコポリマーPPy-PCL、ミセル非担持のFe(Salen)、並びに被覆剤として用いたBSA及びGAについても測定を行なった。
(2) Optical properties of the prepared micelles UV-visible spectroscopy of the micelles PPy-PCL-Fe (Salen), BSA-PPy-PCL-Fe (Salen) and GA-PPy-PCL-Fe (Salen) of Preparation Example 1 The UV-vis) spectrum and the Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) spectrum are shown in FIG. For comparison, measurements were also made on the block copolymer PPy-PCL, micelle-unsupported Fe (Salen), and BSA and GA used as coating agents.
UV-vis吸光分光測定（図20a）によると、PPy-PCL-Fe(Salen)ミセル（Fe(Salen)-Micelle）の表面は典型的なPPyの特徴を示し、PCLの288 nmの吸光度ピーク及びFe(Salen)の310 nmの吸光度ピークは消失していた。このことは、Fe(Salen)がPPy-PCLポリマーの内側に充填できていることを示している。特に、トルエンスルホン酸でドープされたPPyポリマーの特徴的なバイポーラロン状態として、700〜800 nmの近赤外光（NIR）の波長帯で応答性のピーク（バイポーラロン）が観察され、NIR照射により熱を生成できることがUV-visスペクトルからも確認された。 According to UV-vis spectrophotometry (Figure 20a), the surface of PPy-PCL-Fe (Salen) micelles (Fe (Salen) -Micelle) shows typical PPy characteristics, with a PCL absorbance peak at 288 nm and The absorbance peak at 310 nm of Fe (Salen) disappeared. This indicates that Fe (Salen) can be filled inside the PPy-PCL polymer. In particular, as a characteristic bipolaron state of PPy polymer doped with toluenesulfonic acid, a response peak (bipolaron) is observed in the near infrared light (NIR) wavelength band of 700 to 800 nm, and NIR irradiation It was also confirmed from the UV-vis spectrum that heat can be generated.
図20bに示したFe(Salen)のFT-IRスペクトルによると、1619, 1384, 1336, 及び1302 cm-1のバンドがFe(Salen)の典型的なIRバンドであり、マグネタイトに関する580 cm-1付近のFe-Oの振動バンドは全く観察されなかった。また、図20bのミセルのFT-IRスペクトルでは、フリーのFe(Salen)のスペクトルとの比較によりFe(Salen)のピークが消失していることがわかり、ミセル上のPPy表面の化学官能性が有効であることが確認された。Fe(Salen)内包ミセルのFTIRスペクトルでは、1200及び910 cm-1に特徴的なバイポーラロンバンドが観察されたが、このことは、S-O、C-S伸縮振動が700〜500 cm-1の領域で観察されるp-トルエンスルホン酸によってPPyシェルがドープされた状態にあることを示している。1562及び1434 cm-1のC=C伸縮振動、1359 cm-1のC-N、C-C振動、1198及び1142 cm-1のC-H面内変角振動、780〜1033 cm-1のC-H面外変角振動。3400 cm-1のピークはN-H伸縮振動として割り当てられた。これらのピークはPPyポリマー主鎖に由来していると考えられ、ミセル形成過程でPPy主鎖が修飾をほとんど受けていないことが示唆される。 According to the FT-IR spectrum of Fe (Salen) shown in FIG. 20b, the bands of 1619, 1384, 1336, and 1302 cm −1 are typical IR bands of Fe (Salen) and 580 cm −1 for magnetite. No nearby Fe-O vibration band was observed. In addition, in the FT-IR spectrum of the micelle in Fig. 20b, it can be seen that the peak of Fe (Salen) disappears by comparison with the spectrum of free Fe (Salen), and the chemical functionality of the PPy surface on the micelle is It was confirmed to be effective. In the FTIR spectrum of Fe (Salen) -encapsulated micelles, characteristic bipolaron bands at 1200 and 910 cm -1 were observed, which was observed in the region where SO and CS stretching vibrations were 700 to 500 cm -1. This indicates that the PPy shell is doped with p-toluenesulfonic acid. 1562 and 1434 cm -1 C = C stretching vibration, 1359 cm -1 CN, CC vibration, 1198 and 1142 cm -1 CH in-plane bending vibration, 780 to 133 cm -1 CH out-of-plane bending vibration . The peak at 3400 cm -1 was assigned as NH stretching vibration. These peaks are considered to be derived from the PPy polymer main chain, suggesting that the PPy main chain is hardly modified during the micelle formation process.
図20c、20dは被覆剤GA、BSAで表面被覆されたミセルのUV-Visスペクトル及びFT-IRスペクトルである。これらのスペクトルもミセル表面のBSA及びGAの特徴的な化学官能性を示しており、ミセル表面を生体官能化できていることが確認された。興味深いことに、GA被覆ミセルでは、700〜800 nmのNIR応答性吸光度ピークが消失していた。このことは、BSA被覆ミセルや裸の（被覆なしの）ミセルのようなマルチコアミセルとは異なり、FeNPシングルコアの形成と一致している。 20c and 20d are UV-Vis spectra and FT-IR spectra of micelles surface-coated with coating agents GA and BSA. These spectra also show the characteristic chemical functionality of BSA and GA on the micelle surface, and it was confirmed that the micelle surface could be biofunctionalized. Interestingly, the NIR-responsive absorbance peak at 700-800 nm disappeared in GA-coated micelles. This is consistent with the formation of FeNP single cores, unlike multi-core micelles such as BSA-coated micelles or bare (uncoated) micelles.
(3) 調製したミセルのコロイド特性
動的光散乱法（DLS）及びゼータ電位測定によりミセルのコロイド特性を評価した結果を図21a及び21bにそれぞれ示す。観察されたミセルのサイズは、TEM解析で得られたサイズよりも大きかった（〜300 nm）。このことは、液相中ではミセルコロイドが膨張していることを示している。多分散指数（Polydispersity index）は、BSA被覆ミセルが0.272±0.007、GA被覆ミセルが0.339±0.032、裸のミセルが0.352±0.021であり、液体中での高い単分散性を有していた。ゼータ電位は、BSA被覆ミセルが-25 mV、GA被覆ミセルが-30 mV、裸のミセルが+26 mVであり、高いコロイド安定性をもって生体適合的に表面安定化できていた。これらの結果より、ミセルは6か月以上の期間卓越したコロイド安定性を示すことがわかった。
(3) Colloidal properties of prepared micelles The results of evaluating the colloidal properties of micelles by dynamic light scattering (DLS) and zeta potential measurement are shown in FIGS. 21a and 21b, respectively. The observed micelle size was larger than that obtained by TEM analysis (˜300 nm). This indicates that the micelle colloid is expanded in the liquid phase. The polydispersity index was 0.272 ± 0.007 for BSA-coated micelles, 0.339 ± 0.032 for GA-coated micelles and 0.352 ± 0.021 for naked micelles, and had high monodispersity in liquid. The zeta potential was -25 mV for BSA-coated micelles, -30 mV for GA-coated micelles, and +26 mV for naked micelles, and could be surface-stabilized biocompatiblely with high colloidal stability. These results showed that micelles showed excellent colloidal stability for more than 6 months.
(4) 調製したミセルの磁気的性質
各ミセルの磁性強度をESRにより測定した。ミセル非担持のFe(Salen)サンプルは、精製サンプルを２種類（Fe(Salen) purified 1、Fe(Salen) purified 2）、未精製サンプルを１種類（Fe(Salen) TCI）準備した。各サンプル３回の測定を行い、平均値を求めた。
Fe(Salen)の精製サンプルは次の通りに作製した。東京化成工業製のFe(Salen)粉末をアセトンに溶解して十分に撹拌し、150,000 rpmで遠心し、ネオジウム磁石を用いた濾過により不溶の沈殿物を分離除去した後、乾燥させて粉末状とした。乾燥を２５℃で行なった精製サンプルをFe(Salen) purified 1、４５℃で行なった精製サンプルをFe(Salen) purified 2とした。
(4) Magnetic properties of the prepared micelles The magnetic strength of each micelle was measured by ESR. As for the Fe (Salen) sample not supporting micelles, two types of purified samples (Fe (Salen) purified 1, Fe (Salen) purified 2) and one type of unpurified sample (Fe (Salen) TCI) were prepared. Each sample was measured three times to obtain an average value.
A purified sample of Fe (Salen) was prepared as follows. Tokyo Chemical Industry's Fe (Salen) powder is dissolved in acetone and stirred well, centrifuged at 150,000 rpm, insoluble precipitates are separated and removed by filtration using a neodymium magnet, and then dried to form a powder. did. The purified sample that had been dried at 25 ° C. was Fe (Salen) purified 1, and the purified sample that had been dried at 45 ° C. was Fe (Salen) purified 2.
結果を図２２に示す。被覆剤を使用していないM1と比べ、被覆剤を使用したM2及びM3では磁性がわずかに低下したが、磁性強度はほとんど同レベルであった。 The results are shown in FIG. Compared to M1, which did not use a coating agent, the magnetism was slightly decreased in M2 and M3 using a coating agent, but the magnetic strength was almost the same level.
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