JP2017198707A - Immuno chromatographic analysis device for varicella-zoster virus detection - Google Patents
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Images
Abstract
Description
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスの検出のための免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析キットおよびその検出方法に関する。 The present invention relates to an immunochromatographic analyzer, an immunochromatographic analysis kit for detecting varicella-zoster virus, and a detection method thereof.
水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）は、α−ヘルペスウイルス亜科に属し、約１２５ｋｂｐの塩基配列からなる線状２本鎖ＤＮＡを有するウイルスである。このウイルスは、ヒトに対して初感染時に水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）を引き起こし、治癒後の非活動期は神経細胞周囲の外套細胞に潜伏しており、何らかの原因で免疫力が低下するとウイルスが再び活性化し、帯状疱疹（ｚｏｓｔｅｒ）を引き起こす。免疫抑制状態（免疫抑制剤使用、悪性腫瘍、免疫不全等の基礎疾患）のヒトがＶＺＶに初感染、あるいは再活性化した場合、重症化し、時に致命的になることもあり、早期治療を行うための迅速診断法の確立が望まれている。 Varicella-zoster virus (Vicella-Zoster Virus, VZV) belongs to the α-herpesvirus subfamily and has a linear double-stranded DNA consisting of a base sequence of about 125 kbp. This virus causes varicella at the time of the first infection in humans, is hidden in mantle cells around nerve cells during the inactive period after healing, and when the immunity is reduced for some reason, the virus is activated again, Causes zoster. To treat humans who are immunosuppressed (basic diseases such as use of immunosuppressants, malignant tumors, immunodeficiency, etc.) with VZV for the first time or reactivation, which may become severe and sometimes fatal. The establishment of a rapid diagnosis method is desired.
特許文献１には、帯状疱疹後の神経痛等の予防または治療の手段として、水痘帯状疱疹ウイルスの前初期タンパク質ＩＥ６２を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を用いた、神経疾患の予防または治療剤が開示されている。
特許文献２には、ＤＮａｓｅＸタンパク質の機能を増強するエンドサイトーシス依存性ＤＮＡ取り込み抑制剤が開示されており、ヒトＤＮａｓｅＸを抗原として間接的に、水痘帯状疱疹ウイルス等に起因する病状を予知する方法が開示されている。
In
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、ＶＺＶによって引き起こされる神経痛の原因を検出、または治療する方法であって、ＶＺＶを特異的に検出するものではない。また、特許文献２に記載の方法においても、ＶＺＶそのものを直接検出するのではなく、ヒトＤＮａｓｅＸを抗原として間接的に病状を予知する方法である。このように、これまで、ＶＺＶを特異的に検出する方法は確立されておらず、迅速にＶＺＶの感染を診断することができなかった。そこで本発明は、迅速にＶＺＶの感染を診断する手段を提供することを課題とする。
However, the method described in
ＶＺＶは、糖タンパク質であって、免疫グロブリンＧのＦｃ部位を捕捉する機能を持つ水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（以下、ＶＺＶｇＥともいう）を有している。このＶＺＶｇＥは、他のα−ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ、ＢＨＶ、ＦｅＨＶ等）が有する糖タンパク質Ｅ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｇＥ）と、アミノ酸配列において約５０％程度の相同性を有しており、それぞれのｇＥはその機能、構造ともに類似している。 VZV is a glycoprotein and has varicella-zoster virus glycoprotein E (hereinafter also referred to as VZVgE) having a function of capturing the Fc site of immunoglobulin G. This VZVgE has about 50% homology in amino acid sequence with glycoprotein E (glycoprotein E, gE) possessed by other α-herpesviruses (for example, HSV, BHV, FeHV, etc.). GE is similar in both function and structure.
本発明者らは、ＶＺＶを直接検出する手段として、上記ＶＺＶｇＥに着目し、鋭意研究した結果、ＶＺＶｇＥのある特定の領域を認識する抗体は、他のα−ヘルペスウイルスとは交差反応を示さず、ＶＺＶを特異的に検出できることを見出した。
そして、ＶＺＶｇＥの特定の領域を認識する抗体を用いた免疫クロマト分析装置によれば、迅速に、そして簡易にＶＺＶのヒトへの感染を診断できることを見出し、本発明に至った。
As a means for directly detecting VZV, the present inventors focused on the above-mentioned VZVgE, and as a result of intensive research, the antibody recognizing a specific region of VZVgE does not show cross-reactivity with other α-herpesviruses. It was found that VZV can be specifically detected.
The inventors have found that an immunochromatography analyzer using an antibody that recognizes a specific region of VZVgE can quickly and easily diagnose a human infection with VZV, leading to the present invention.
したがって、本発明は以下の通りである。
１．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）を検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなる前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）のアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
２．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）を検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなる前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）のアミノ酸配列１０８−１３５番目を認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
３．前記試料添加部に添加する試料が、前記水痘帯状疱疹ウイルスを含む水疱内容液である、前記１又は２に記載の免疫クロマト分析装置。
４．前記標識物質保持部が含有する標識物質が金コロイド粒子であり、前記標識物質保持部が前記金コロイド粒子を、０．０５〜１．５μｇ／ｃｍ２含有する、前記１〜３のいずれか１に記載の免疫クロマト分析装置。
５．前記１〜４のいずれか１に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。
６．前記検体希釈液が少なくとも１種の非イオン性界面活性剤を含有する、前記５に記載の免疫クロマト分析キット。
７．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、検体中の水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）を検出する方法であり、前記免疫クロマト分析装置の前記標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなる前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）のアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を含有し、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている抗体により水痘帯状疱疹ウイルスを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の水痘帯状疱疹ウイルスを検出部に含まれる抗体により検出する工程
Therefore, the present invention is as follows.
1. An immunochromatography analyzer for detecting varicella-zoster virus (VZV), comprising a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part and an absorption part,
Immunochromatography, wherein at least one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of glycoprotein E (VZVgE) of the varicella-zoster virus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Analysis equipment.
2. An immunochromatography analyzer for detecting varicella-zoster virus (VZV), comprising a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part and an absorption part,
Immunochromatography, wherein at least one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody that recognizes amino acid sequence 108-135 of glycoprotein E (VZVgE) of the varicella-zoster virus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Analysis equipment.
3. 3. The immunochromatographic analyzer according to 1 or 2, wherein the sample added to the sample adding part is a blister content liquid containing the varicella-zoster virus.
4). Any one of the above 1-3, wherein the labeling substance contained in the labeling substance holding part is colloidal gold particles, and the labeling substance holding part contains 0.05 to 1.5 μg / cm 2 of the gold colloid particles. The immunochromatographic analyzer described in 1.
5. An immunochromatography analysis kit comprising the immunochromatography analyzer according to any one of 1 to 4 and a sample diluent for diluting and developing a sample.
6). 6. The immunochromatographic analysis kit according to 5 above, wherein the sample diluent contains at least one nonionic surfactant.
7). A method for detecting varicella-zoster virus (VZV) in a specimen using an immunochromatography analyzer including a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part, and an absorption part. Yes, at least one of the labeling substance holding part and the detection part of the immunochromatographic analyzer recognizes the amino acid sequence 1-188 of the varicella-zoster virus glycoprotein E (VZVgE) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. An immunochromatographic analysis method comprising the following steps (1) to (4):
(1) A step of adding a sample-containing solution obtained by diluting a sample with a sample dilution solution to a sample addition unit (2) a step of recognizing varicella-zoster virus by an antibody held in a labeling substance holding unit (3) the sample and (4) A step of detecting varicella-zoster virus in the developed mobile phase with an antibody contained in the detection unit.
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）の糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）の特定の部位に結合する抗体を用いた免疫クロマト分析装置である。本発明の免疫クロマト分析装置を用いることによって、ＶＺＶを特異的に迅速かつ簡易に検出できる。すなわち、水痘、帯状疱疹の診断をより確実かつ迅速に行うことができる。 The present invention is an immunochromatographic analyzer using an antibody that binds to a specific site of glycoprotein E (gE) of varicella-zoster virus (Vicella-Zoster Virus, VZV). By using the immunochromatographic analyzer of the present invention, VZV can be specifically and rapidly detected. That is, the diagnosis of chickenpox and shingles can be performed more reliably and quickly.
以下に、本発明を実施するための形態を説明する。 Below, the form for implementing this invention is demonstrated.
本発明の、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）を検出するための免疫クロマト分析装置は、検体を添加する試料添加部と、標識物質を保持する標識物質保持部と、ＶＺＶを検出する検出部を有するクロマトグラフ媒体部と、検出部を通過した液体を吸収する吸収部とを備え、標識物質保持部及び検出部のいずれもが、ＶＺＶの糖タンパク質Ｅ（以下、ＶＺＶｇＥともいう）を認識する抗体を含有しており、特に、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を含有することを特徴としている。好ましくは、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのうち、アミノ酸配列４８−１３５番目を認識する抗体を含有することであり、より好ましくは、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのうち、アミノ酸配列４８−８８番目、８９−１０７番目、及び１０８−１３５番目の少なくともいずれか１つを認識する抗体を含有することであり、特に好ましくは、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのうち、アミノ酸配列１０８−１３５番目を認識する抗体を含有することである。以下、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を含有する場合を例に説明をするが、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が含有する抗体の好ましい態様は、上記のとおりである。 The immunochromatographic analyzer for detecting varicella-zoster virus (VZV) according to the present invention detects a sample addition part for adding a specimen, a labeling substance holding part for holding a labeling substance, and VZV A chromatographic medium part having a detecting part and an absorbing part that absorbs the liquid that has passed through the detecting part, and both the labeling substance holding part and the detecting part are VZV glycoprotein E (hereinafter also referred to as VZVgE). In particular, at least one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is said. Preferably, at least one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody recognizing amino acid sequence 48-135 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, more preferably the labeling substance An antibody in which at least one of the holding part and the detection part recognizes at least one of the amino acid sequences 48-88, 89-107, and 108-135 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Particularly preferably, at least one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody recognizing amino acid sequence 108-135 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. . Hereinafter, the case where at least one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody recognizing amino acid sequence 1-188 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 will be described as an example. And the preferable aspect of the antibody which at least one of a detection part contains is as above-mentioned.
水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）は、α−ヘルペスウイルス亜科に属し、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）及び帯状疱疹（ｚｏｓｔｅｒ）の病原媒体である。このＶＺＶが有する糖タンパク質の１つである、水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）は、配列番号１に示される６２３個のアミノ酸からなり、アミノ酸配列１−５４４番目にあたる細胞外領域（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ）、アミノ酸配列５４５−５６２番目にあたる膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ；ＴＭ）、アミノ酸配列５６３−６２３番目にあたる細胞質尾部（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｔａｉｌ）から構成されている（Ｊｕｒｉｅ Ｋ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ．１９９７，ｐ１１０−１１９）。 Varicella-Zoster Virus (VZV) belongs to the α-herpesvirus subfamily and is a pathogen of varicella and zoster. The varicella-zoster virus glycoprotein E (VZVgE), which is one of the glycoproteins of the VZV, consists of 623 amino acids shown in SEQ ID NO: 1, and is an extracellular region corresponding to the amino acid sequence 1-544 (Extracellular Domain). ), A transmembrane region (TM) corresponding to amino acid sequence 545-562, and a cytoplasmic tail corresponding to amino acid sequence 563-623 (Jurie K et al Journal of Virology, 19). p110-119).
本発明に使用する抗体のうち、後述する免疫クロマト分析装置の標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が含有する抗体は、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち１−１８８番目を認識する。ここで、本明細書において、抗体がある特定のアミノ酸配列を「認識する」とは、該特定のアミノ酸配列に対して、それ以外の他のアミノ酸配列よりも高い親和性をもって結合することを意味する。 Among antibodies used in the present invention, an antibody contained in at least one of a labeling substance holding unit and a detection unit of an immunochromatography analyzer described later recognizes 1-188th amino acid sequence of VZVgE. Here, in this specification, “recognizing” a specific amino acid sequence of an antibody means binding to the specific amino acid sequence with higher affinity than other amino acid sequences. To do.
上記したように、ＶＺＶｇＥは他のα−ヘルペスウイルスのｇＥと約５０％程度のアミノ酸配列の相同性を有する。本発明においては、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を用いることで、相同性の高い他のα−ヘルペスウイルスとも交差反応なく特異的にＶＺＶを検出する免疫クロマト分析装置を提供することが可能となる。 As described above, VZVgE has about 50% amino acid sequence homology with other α-herpesvirus gE. The present invention provides an immunochromatographic analyzer that specifically detects VZV without cross-reaction with other highly homologous α-herpesviruses by using an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE. It becomes possible.
本発明の免疫クロマト分析装置においては、その標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方に、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を含有させておく。すなわち、標識物質保持部のみに上記抗体を含有させておいてもよいし、検出部のみに上記抗体を含有させておいてもよいし、標識物質保持部及び検出部の両方に上記抗体を含有させておいてもよい。 In the immunochromatography analyzer of the present invention, an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE is contained in at least one of the labeling substance holding part and the detection part. That is, the antibody may be contained only in the labeling substance holding part, the antibody may be contained only in the detection part, or the antibody is contained in both the labeling substance holding part and the detection part. You may leave it.
標識物質保持部及び検出部のいずれか一方のみに上記抗体を含有させておくことが好ましいのは、標識物質保持部に担持された抗体（以下、第一抗体ともいう）が認識するＶＺＶｇＥの部位と、検出部に担持された抗体（以下、第二抗体ともいう）が認識するＶＺＶｇＥ部位とが異なることによって、抗体結合によりエピトープがマスクされることなく、または抗原の立体構造変化による影響等の相互作用を受けることなく、以下に示すようなサンドイッチ構造が形成され、検出感度が向上するからである。すなわち、まず、標識物質保持部に担持された抗体（第一抗体）が、ＶＺＶｇＥの一部に結合する。続いて、検出部に固定化された抗体（第二抗体）が、第一抗体が結合した箇所とは別の箇所に結合することによって、ＶＺＶｇＥを抗体同士で挟むようにしてサンドイッチの構造を形成し、ＶＺＶを検出する。 It is preferable to include the antibody in only one of the labeling substance holding part and the detection part. The site of VZVgE recognized by the antibody carried on the labeling substance holding part (hereinafter also referred to as the first antibody) And the VZVgE site recognized by the antibody (hereinafter also referred to as the second antibody) carried on the detection unit, the epitope is not masked by antibody binding, or the influence of the change in the three-dimensional structure of the antigen, etc. This is because a sandwich structure as shown below is formed without receiving an interaction, and detection sensitivity is improved. That is, first, the antibody (first antibody) carried on the labeling substance holding part binds to a part of VZVgE. Subsequently, the antibody immobilized on the detection unit (second antibody) is bound to a location different from the location where the first antibody is bound to form a sandwich structure so that VZVgE is sandwiched between the antibodies, VZV is detected.
（抗体の作製方法）
本明細書において「抗体」とは、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、ファージディスプレイによって作製された抗体およびこれらの結合性断片が含まれる。
抗体産生動物種としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等である。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。
(Method for producing antibody)
As used herein, “antibody” refers to a natural antibody such as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, a chimeric antibody that can be produced using a gene recombination technique, a humanized antibody or a single chain antibody, a human antibody-producing transgenic animal, etc. And human antibodies that can be produced using antibodies, antibodies produced by phage display, and binding fragments thereof.
Examples of antibody-producing animal species include humans, mice, rats, rabbits, goats and horses. The immunoglobulin may be IgG, IgM, IgA, IgE, or IgD.
一実施態様において、免疫原としてのＶＺＶｇＥペプチドは、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＺＶから抽出精製したｇＥタンパク質またはクローニングされたｇＥタンパク質の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製したｇＥタンパク質、さらにはｇＥタンパク質の一部を構成するポリペプチドを免疫原として用いることができる。 In one embodiment, the VZVgE peptide as an immunogen can be produced by known general production methods. That is, a gE protein extracted or purified from a VZV containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a cloned gE protein gene expressed in a host such as E. coli and extracted and purified, and further a gE protein The polypeptide constituting the part can be used as an immunogen.
モノクローナル抗体は、常法に従って、上記免疫原で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する［例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）４９５−４９７）を参照］。ポリクローナル抗体は、常法により、上記免疫原を産生動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより得られる。 Monoclonal antibodies are obtained by hybridizing spleen cells and myeloma cells of mice immunized with the above immunogen according to a conventional method, selecting a hybridoma that produces the target antibody, and obtaining the monoclonal antibody produced from this hybridoma. [See, for example, the Kohler and Milstein technique (Nature 256 (1975) 495-497)]. A polyclonal antibody is obtained by isolating the target antibody from antiserum obtained by immunizing a production animal (eg, human, mouse, rat, rabbit, goat, horse, etc.) with the above immunogen by a conventional method. It is done.
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の上記免疫原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。 Hybridoma clones that produce monoclonal antibodies are screened by culturing the hybridomas, for example, in a microtiter plate, and measuring the reactivity of the culture supernatant of the wells in which proliferation has occurred with the immunogen, for example, an enzyme immunoassay method such as ELISA. It can be performed by measuring.
このハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、単離および／または精製されることが好ましい。 This hybridoma can be cultured using a medium (for example, DMEM containing 10% fetal bovine serum), and the centrifuged supernatant of the culture can be used as a monoclonal antibody solution. In addition, ascites can be generated by injecting the hybridoma into the abdominal cavity of an animal from which the hybridoma is derived, and the obtained ascites can be used as a monoclonal antibody solution. Monoclonal antibodies are preferably isolated and / or purified.
ＶＺＶｇＥを認識する抗体のうち、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の特定部位を認識する抗体は、例えば、上記ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の特定部位に相当するタンパク質の断片を用いたウエスタンブロッティング等により、上記ＶＺＶｇＥを認識する抗体を産生するハイブリドーマの中から、上記ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の特定部位に対してより強い反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得ることができる。具体的には実施例に示すように、例えばＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の１−１８８番目を特異的に認識する抗体は、以下のようなスクリーニングを行うことによって得られる。例えば、実施例にて後述するように、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目のタンパク質の断片により、上記ＶＺＶｇＥを認識する抗体を産生するハイブリドーマの中から、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目に対してより強い反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の４８−８８番目、８９−１０７番目、又は１０８−１３５番目を特異的に認識する抗体についても、同様にして得ることができる。 Among antibodies that recognize VZVgE, antibodies that recognize a specific site in the amino acid sequence of VZVgE recognize the VZVgE by, for example, Western blotting using a protein fragment corresponding to the specific site in the amino acid sequence of VZVgE. It can be obtained by selecting a hybridoma that produces an antibody exhibiting stronger reactivity with respect to a specific site in the amino acid sequence of the VZVgE from among the hybridomas that produce the antibody. Specifically, as shown in the Examples, for example, an antibody that specifically recognizes the 1-188th amino acid sequence of VZVgE can be obtained by performing the following screening. For example, as will be described later in the Examples, a fragment of the VZVgE amino acid sequence 1-188th protein is used to produce a VZVgE-recognizing hybridoma that produces an antibody that recognizes VZVgE. Hybridomas that produce antibodies that exhibit stronger reactivity can be selected. An antibody that specifically recognizes the 48-88th, 89-107th, or 108-135th amino acid sequence of VZVgE can be obtained in the same manner.
以上、本発明に使用する抗体の作製方法について記載したが、具体的には実施例にて詳述する。 As mentioned above, although the production method of the antibody used for this invention was described, it explains in full detail in an Example.
（本発明の免疫クロマト分析装置）
次に、図面を参照しながら本発明の免疫クロマト分析装置の一実施形態について説明する。なお本明細書において、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されていることを意味し、「担持」または「保持」とは、膜等の担体の中または表面を移動可能に配置されることを意味する。
(Immunochromatography analyzer of the present invention)
Next, an embodiment of the immunochromatographic analyzer of the present invention will be described with reference to the drawings. In this specification, “immobilization” means that the antibody is arranged on a carrier such as a membrane so that the antibody does not move, and “support” or “hold” means the inside or the surface of the carrier such as a membrane. Means to be movable.
本発明の免疫クロマト分析装置の一実施形態としては、図１に示すように、試料添加部（サンプルパッドともいう）（１）、標識物質保持部（コンジュゲートパッドともいう）（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、吸収部（５）およびバッキングシート（６）から構成されている。 As an embodiment of the immunochromatography analyzer of the present invention, as shown in FIG. 1, a sample addition part (also called a sample pad) (1), a labeling substance holding part (also called a conjugate pad) (2), a chromatograph It is comprised from the graph medium part (3), the detection part (4), the absorption part (5), and the backing sheet (6).
試料添加部（１）は、免疫クロマト分析装置において、検体（サンプル）を滴下する部位である。試料添加部（１）では検体試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに検体試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、ガラスファイバー濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。 A sample addition part (1) is a site | part which dripped a test substance (sample) in an immunochromatography analyzer. In the sample addition section (1), the specimen sample is rapidly absorbed, but the holding power is weak and the specimen addition section (1) can be constituted by a porous sheet having such a property that the specimen sample moves quickly. Examples of the porous sheet include cellulose filter paper, glass fiber filter paper, polyurethane, polyacetate, cellulose acetate, nylon, and cotton cloth.
標識物質保持部（２）は、後述する標識物質（マーカー物質）を含有しており、該標識物質は抗体と結合した標識抗体として標識物質保持部（２）に担持されている。標識物質と結合する抗体（第一抗体）は、上記したように、ＶＺＶｇＥを認識する抗体である。後述する検出部に含有させる抗体（第二抗体）が、ＶＺＶｇＥを認識する抗体のうちＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体でない場合は、標識物質と結合する抗体（第一抗体）はＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体とする。標識物質保持部内を検体が移動する際に、上記標識抗体（第一抗体）と検体中のＶＺＶとが結合する。標識物質保持部（２）には、グラスファイバーまたはセルロースの膜が通常使用される。 The labeling substance holding part (2) contains a labeling substance (marker substance) which will be described later, and the labeling substance is carried on the labeling substance holding part (2) as a labeled antibody bound to the antibody. As described above, the antibody that binds to the labeling substance (first antibody) is an antibody that recognizes VZVgE. When the antibody (second antibody) to be contained in the detection part described later is not an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE among antibodies that recognize VZVgE, the antibody (first antibody) that binds to the labeling substance is The antibody recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE. When the specimen moves in the labeling substance holding part, the labeled antibody (first antibody) and VZV in the specimen are bound. For the labeling substance holding part (2), a glass fiber or cellulose film is usually used.
標識物質保持部中の抗体（第一抗体）の含有量は、通常０．０３〜０．５０μｇであり、好ましくは０．０５〜０．４μｇであり、より好ましくは０．１〜０．３μｇである。また、標識物質保持部の単位面積当たりの抗体（第一抗体）の含有量は、通常０．０５〜１．０μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．１〜０．８μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１７〜０．６μｇ／ｃｍ２である。 The content of the antibody (first antibody) in the labeling substance holding part is usually 0.03 to 0.50 μg, preferably 0.05 to 0.4 μg, more preferably 0.1 to 0.3 μg. It is. The content of antibody per unit area of the labeling substance holding portion (the first antibody) is usually 0.05~1.0μg / cm 2, there preferably 0.1~0.8μg / cm 2 More preferably, it is 0.17-0.6 microgram / cm < 2 >.
免疫クロマト分析における検出試薬の標識には、一般に酵素等も使用されるが、被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、標識物質としては不溶性担体を用いることが好ましい。抗体を不溶性担体に感作することにより標識化した検出試薬を調製することができる。なお、抗体を不溶性担体に感作する手段は、公知の方法に従えばよい。 An enzyme or the like is generally used for labeling a detection reagent in immunochromatographic analysis, but it is preferable to use an insoluble carrier as the labeling substance because it is suitable for visually determining the presence of the substance to be detected. A labeled detection reagent can be prepared by sensitizing the antibody to an insoluble carrier. The means for sensitizing the antibody to the insoluble carrier may be in accordance with a known method.
標識物質としての不溶性担体には、金、銀もしくは白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、またはその他を用いることができる。特に、金コロイド粒子が、検出が簡便であり、かつ凝集しづらく非特異的な発色が起こりにくい点で好ましい。金コロイドの粒子の平均粒径は、例えば１０ｎｍ〜２５０ｎｍ、好ましくは３５ｎｍ〜１２０ｎｍである。平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：日本電子（株）製、ＪＥＭ−２０１０）により、撮影した投影写真を用いて無造作に１００個の粒子を粒子の投影面積円相当径を計測し、その平均値から算出することができる。標識物質保持部が含有する金コロイド粒子は、標識物質保持部の単位面積あたり、通常０．０２５〜１．５μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．０５〜１．５μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１〜１．０μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは０．２〜０．６μｇ／ｃｍ２である。前記範囲に設定することによって、標識された粒子が分散したまま展開し、抗体の認識部位が阻害されず高感度化できるからである。 Insoluble carriers as labeling substances include colloidal metal particles such as gold, silver or platinum, colloidal metal oxide particles such as iron oxide, colloidal nonmetal particles such as sulfur, and latex particles composed of synthetic polymers. Or others can be used. In particular, colloidal gold particles are preferred because they are easy to detect and are difficult to aggregate and non-specific color development is unlikely to occur. The average particle diameter of the colloidal gold particles is, for example, 10 nm to 250 nm, preferably 35 nm to 120 nm. The average particle diameter was measured with a transmission electron microscope (TEM: manufactured by JEOL Ltd., JEM-2010), and the projected area circle equivalent diameter of 100 particles was measured randomly using the photographed projection photograph. It can be calculated from the average value. Colloidal gold particles labeling substance holding section contains the per unit area of the labeling substance holding portion is usually 0.025~1.5μg / cm 2, preferably 0.05~1.5μg / cm 2, More preferably, it is 0.1-1.0 microgram / cm < 2 >, More preferably, it is 0.2-0.6 microgram / cm < 2 >. This is because, by setting the range, the labeled particles are developed in a dispersed state, and the recognition site of the antibody is not hindered and the sensitivity can be increased.
不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。 The insoluble carrier is a labeling substance suitable for visually determining the presence of the substance to be detected, and is preferably colored in order to facilitate the visual determination. The colloidal metal particles and the colloidal metal oxide particles themselves exhibit a specific natural color corresponding to the particle diameter, and the color can be used as a label.
クロマトグラフ媒体部（３）は、クロマトグラフの展開部位である。クロマトグラフ媒体部（３）は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性の膜である。クロマトグラフで使用される検出試薬、固定化試薬または被検出物質などと反応性を有しないという観点から、また、本発明の効果が向上するという観点から、例えば、ニトロセルロース製のメンブレン（以下、ニトロセルロースメンブレンともいう）や、酢酸セルロース製のメンブレン（以下、酢酸セルロースメンブレンともいう）が好ましく、ニトロセルロースメンブレンがさらに好ましい。なお、セルロース類メンブレン、ナイロンメンブレン及び多孔質プラスチック布類（ポリエチレン、ポリプロピレン）も使用可能である。 The chromatographic medium part (3) is a developed part of the chromatograph. The chromatographic medium part (3) is an inert film made of a microporous material that exhibits capillary action. From the viewpoint of not having reactivity with a detection reagent, an immobilization reagent or a detection substance used in a chromatograph, and from the viewpoint of improving the effect of the present invention, for example, a membrane made of nitrocellulose (hereinafter, Nitrocellulose membrane) and cellulose acetate membrane (hereinafter also referred to as cellulose acetate membrane) are preferred, and nitrocellulose membrane is more preferred. Cellulose membranes, nylon membranes and porous plastic cloth (polyethylene, polypropylene) can also be used.
ニトロセルロースメンブレンとしては、ニトロセルロースが主体で含まれていればよく、純品またはニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とするメンブレンを使用することができる。 As the nitrocellulose membrane, it is sufficient if nitrocellulose is mainly contained, and a membrane mainly composed of nitrocellulose such as a pure product or a nitrocellulose mixed product can be used.
ニトロセルロースメンブレンは、さらに毛細管現象を促進させる物質を含有させることもできる。該物質としては、膜面の表面張力を低下させ、親水性をもたらす物質が好ましい。例えば、糖類、アミノ酸の誘導体、脂肪酸エステル、各種合成界面活性剤またはアルコール等の両親媒性の作用を有する物質であって、被検出物質の移動に影響がなく、マーカー物質（例えば金コロイド粒子など）の発色に影響を及ぼさない物質が好ましい。 The nitrocellulose membrane can further contain a substance that promotes capillary action. As the substance, a substance that lowers the surface tension of the film surface and brings about hydrophilicity is preferable. For example, a substance having an amphipathic action such as saccharides, amino acid derivatives, fatty acid esters, various synthetic surfactants or alcohols, which does not affect the movement of the detected substance, and is a marker substance (for example, gold colloid particles) A substance that does not affect the color development of) is preferred.
ニトロセルロースメンブレンは、多孔性であって、毛細管現象を示す。この毛細管現象の指標は、吸水速度（吸水時間：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｌｏｗ ｔｉｍｅ）を測ることで確認できる。吸水速度は、検出感度と検査時間に影響する。 Nitrocellulose membranes are porous and exhibit capillary action. The index of the capillary phenomenon can be confirmed by measuring the water absorption speed (water absorption time: capillary flow time). The water absorption rate affects detection sensitivity and inspection time.
上記のようなニトロセルロースメンブレンや酢酸セルロースメンブレンに代表されるクロマトグラフ媒体部（３）の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。 The form and size of the chromatographic medium part (3) represented by the above nitrocellulose membrane and cellulose acetate membrane are not particularly limited, and are appropriate in terms of actual operation and reaction results. If it is.
さらに操作をより簡便にするためには、クロマトグラフ媒体部（３）の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。 Furthermore, in order to make the operation easier, it is preferable to provide a support made of plastic or the like on the back surface of the chromatographic medium part (3). The properties of the support are not particularly limited, but when the measurement result is observed by visual judgment, the support preferably has a color that is not similar to the color caused by the labeling substance. Usually, it is preferably colorless or white.
検出部（４）は、前記クロマトグラフ媒体部（３）上に形成される。すなわち、ＶＺＶを認識する抗体が、クロマトグラフ媒体部（３）上の任意の位置に固定化される。該抗体の固定化は常法に従って行うことができる。該抗体（第二抗体）は、標識物質と結合する抗体（第一抗体）が、ＶＺＶｇＥを認識する抗体のうちＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体でない場合は、この検出部に含有させる抗体（第二抗体）はＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体とする。 The detection part (4) is formed on the chromatographic medium part (3). That is, an antibody that recognizes VZV is immobilized at an arbitrary position on the chromatographic medium part (3). The antibody can be immobilized according to a conventional method. This antibody (second antibody) is contained in this detection part when the antibody (first antibody) that binds to the labeling substance is not an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE among antibodies that recognize VZVgE. The antibody (second antibody) to be used is an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE.
検出部（４）における抗体（第二抗体）の含有量は、通常０．１〜３．０μｇであり、好ましくは０．３〜２．０μｇであり、より好ましくは０．３〜１．０μｇである。また、検出部（４）の単位面積当たりの抗体（第二抗体）の含有量は、通常０．０４〜１．０ｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．１２５〜０．８μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１２５〜０．４２μｇ／ｃｍ２である。 The content of the antibody (second antibody) in the detection part (4) is usually 0.1 to 3.0 μg, preferably 0.3 to 2.0 μg, more preferably 0.3 to 1.0 μg. It is. In addition, the content of the antibody (second antibody) per unit area of the detection unit (4) is usually 0.04 to 1.0 g / cm 2 , preferably 0.125 to 0.8 μg / cm 2 . Yes, more preferably 0.125 to 0.42 μg / cm 2 .
また、クロマトグラフ媒体部（３）上には、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体部（３）に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼインまたはゼラチン等のタンパク質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。 Moreover, on the chromatographic medium part (3), in order to prevent the accuracy of analysis from being reduced due to non-specific adsorption, the chromatographic medium part (3) is blocked by a known method as necessary. Processing can be performed. Generally, proteins such as bovine serum albumin, skim milk, casein or gelatin are preferably used for the blocking treatment. After such blocking treatment, if necessary, for example, one or a combination of two or more surfactants such as Tween 20, Triton X-100, or SDS may be washed.
検出部（４）には、上記第二抗体の他に、コントロールとして抗ＩｇＧ抗体を担持させた抗ＩｇＧ抗体塗布部を設けてもよい。該部位は、抗原と反応しなかった標識抗体の標識物質や上記第二抗体と反応しなかった標識抗体の標識物質はこの抗ＩｇＧ抗体塗布部で抗ＩｇＧ抗体と反応し固定化され、展開が正常に行われていることを示すコントロールとして機能する。 In addition to the second antibody, the detection unit (4) may be provided with an anti-IgG antibody application unit carrying an anti-IgG antibody as a control. In this site, the labeled substance of the labeled antibody that did not react with the antigen and the labeled substance of the labeled antibody that did not react with the second antibody react with the anti-IgG antibody in this anti-IgG antibody application part, and are immobilized. Serves as a control to show that it is working correctly.
吸収部（５）は、クロマトグラフ媒体部（３）の末端に、検出部（４）を通過した検体や展開液等の液体を吸収させるために設置される。本発明の免疫クロマト分析装置において、吸収部（５）は、例えばグラスファイバーからなることができる。吸収部（５）がグラスファイバーからなることによって、試料液の液戻りを大幅に低減することができる。 The absorption part (5) is installed at the end of the chromatographic medium part (3) in order to absorb a liquid such as a specimen or a developing solution that has passed through the detection part (4). In the immunochromatography analyzer of the present invention, the absorption part (5) can be made of, for example, glass fiber. When the absorption part (5) is made of glass fiber, the return of the sample liquid can be greatly reduced.
バッキングシート（６）は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部（１）、標識物質保持部（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、および吸収部（５）の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート（６）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。 The backing sheet (6) is a base material. By applying an adhesive on one side or sticking an adhesive tape, one side has adhesiveness, and the sample addition part (1), labeling substance holding part (2), chromatographic medium part ( 3) A part or all of the detection unit (4) and the absorption unit (5) are provided in close contact with each other. The backing sheet (6) is not particularly limited as long as the backing sheet (6) becomes impermeable and impermeable to the sample solution by the adhesive.
上記のようにして作製した免疫クロマト分析装置は、製品化する前に、通常乾燥処理に施される。乾燥温度は例えば２０〜５０℃、乾燥時間は０．５〜１時間である。 The immunochromatographic analyzer produced as described above is usually subjected to a drying treatment before commercialization. The drying temperature is, for example, 20 to 50 ° C., and the drying time is 0.5 to 1 hour.
（本発明の免疫クロマト分析キット）
本発明の免疫クロマト分析キットは、上記の免疫クロマト分析装置と、検体（検体試料または単に試料ということもある）を希釈して展開するための検体希釈液とを含む。
(Immunochromatography kit of the present invention)
The immunochromatography analysis kit of the present invention includes the above-described immunochromatography analyzer and a sample dilution liquid for diluting and developing a sample (sample sample or simply a sample).
本発明の免疫クロマト分析キットにおいて検体希釈液は、展開液としても使用することができるものであるが、通常溶媒として水を用い、これに緩衝液、塩、および非イオン性界面活性剤、さらに、例えば抗原抗体反応の促進または非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物（ＰＶＰ等）、イオン性界面活性剤もしくはポリアニオン、または、抗菌剤、キレート剤等々の１種もしくは２種以上を加えてもよい。 In the immunochromatography analysis kit of the present invention, the sample diluent can also be used as a developing solution, but usually water is used as a solvent, to which a buffer solution, salt, and nonionic surfactant are further added. , For example, one or more of proteins, polymer compounds (PVP, etc.), ionic surfactants or polyanions, or antibacterial agents, chelating agents, etc. for promoting antigen-antibody reactions or suppressing nonspecific reactions May be added.
非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＮＰ−４０（商品名 ノニデット４０）、Ｂｒｉｊ３５、ノニオンＭＮ−８１１（日油社製）等が挙げられ、１種もしくは２種以上を加えてもよい。
好ましくは、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤が、ＨＬＢ値６〜１２の非イオン性界面活性剤を一種以上含むことである。更に好ましくはＨＬＢ値７〜１１、最適にはＨＬＢ値８〜１０の非イオン性界面活性剤を一種以上含むことである。ＨＬＢ値６〜１２の非イオン性界面活性剤としては、好ましくは片末端が水酸基のポリオキシアルキレンエーテルが用いられる。片末端のアルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、繰り返しのアルキルエーテル基のアルキル部位についても、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
Examples of the nonionic surfactant include Triton X-100 (trade name, polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether), Tween 20 (trade name, polyoxyethylene sorbitan monolaurate), and NP-40 (product). Name Nonidet 40), Brij 35, Nonion MN-811 (manufactured by NOF Corporation) and the like may be mentioned, and one or more may be added.
Preferably, the nonionic surfactant contained in the specimen diluent contains one or more nonionic surfactants having an HLB value of 6 to 12. More preferably, it contains at least one nonionic surfactant having an HLB value of 7 to 11, and optimally an HLB value of 8 to 10. As the nonionic surfactant having an HLB value of 6 to 12, a polyoxyalkylene ether having a hydroxyl group at one end is preferably used. The alkyl group at one end may be linear or branched, and the alkyl moiety of the repeated alkyl ether group may be linear or branched.
また、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤が、ＨＬＢ値６〜１２の非イオン性界面活性剤を一種以上含むことに加え、ＨＬＢ値１３〜１８の非イオン性界面活性剤を一種以上含むことがより好ましい。その配合比としては、ＨＬＢ値６〜１２の非イオン性界面活性剤の総量（Ａ）に対するＨＬＢ値１３〜１８の非イオン性界面活性剤の総量（Ｂ）の質量比が、Ａ：Ｂ＝３０：７０〜７０：３０であることが好ましい。より好ましくは、Ａ：Ｂ＝４０：６０〜６０：４０で用いられる。 In addition, the nonionic surfactant contained in the sample diluent contains one or more nonionic surfactants having an HLB value of 6 to 12, and one kind of nonionic surfactant having an HLB value of 13 to 18 More preferably included. As the blending ratio, the mass ratio of the total amount (B) of the nonionic surfactant having an HLB value of 13 to 18 to the total amount (A) of the nonionic surfactant having an HLB value of 6 to 12 is A: B = It is preferable that it is 30: 70-70: 30. More preferably, A: B = 40: 60 to 60:40.
または、検体希釈液中で、検体試料から被検出物質（ＶＺＶｇＥ等）を抽出するために、アルコール等の周知の疎水的な物質（疎水性物質）を検体希釈液に含有させたり、検体を採取した直後に加えたりしてもよい。検体希釈液中に上記疎水性物質を含有させたり、加えたりすることによって、検体を希釈するのと同時に検体から被検出物質（ＶＺＶｇＥ等）を抽出することができるため、事前の抽出の手間を省くことができる上、検出感度を高めることができるため好ましい。 Or, in order to extract the substance to be detected (VZVgE, etc.) from the specimen sample in the specimen dilution liquid, a known hydrophobic substance (hydrophobic substance) such as alcohol is included in the specimen dilution liquid, or the specimen is collected. It may be added immediately after. By adding or adding the hydrophobic substance to the specimen diluent, the substance to be detected (VZVgE, etc.) can be extracted from the specimen at the same time as the specimen is diluted. This is preferable because it can be omitted and the detection sensitivity can be increased.
検体希釈液を展開液として用いる場合には、検体試料と展開液を予め混合した検体含有液を、試料添加部上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に検体試料を試料添加部上に供給・滴下した後、展開液を試料添加部上に供給・滴下して展開させてもよい。 When using a sample diluent as a developing solution, a sample-containing solution in which a sample sample and a developing solution are mixed in advance can be supplied and dropped on the sample addition section, or the sample can be added first. After supplying / dropping on the part, the developing solution may be supplied / dropped on the sample addition part to be developed.
（本発明の免疫クロマト分析方法）
本発明の免疫クロマト分析方法は以下の工程（１）〜（４）を含み、上記の免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質の水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）を検出する方法であり、免疫クロマト分析装置の標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなる水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）のアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を含有し、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法である。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている抗体により水痘帯状疱疹ウイルスを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の水痘帯状疱疹ウイルスを検出部に含まれる抗体により検出する工程
本発明の免疫クロマト分析方法に使用する前記免疫クロマト分析装置における標識物質保持部及び検出部のいずれもが、ＶＺＶｇＥを認識する抗体を含有している。特に、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を含有する。また、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が含有する抗体は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのうち、アミノ酸配列４８−１３５番目を認識する抗体であり、より好ましくは、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのうち、アミノ酸配列４８−８８番目、８９−１０７番目、及び１０８−１３５番目の少なくともいずれか１つを認識する抗体であり、特に好ましくは、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのうち、アミノ酸配列１０８−１３５番目を認識する抗体である。
各工程について以下に説明する。
(Immunochromatographic analysis method of the present invention)
The immunochromatographic analysis method of the present invention includes the following steps (1) to (4), and a varicella-zoster virus (Vericella-Zoster Virus, VZV) as a substance to be detected contained in a specimen using the immunochromatography analyzer described above. Wherein at least one of the labeling substance holding part and the detection part of the immunochromatographic analyzer is amino acid sequence 1-188 of varicella-zoster virus glycoprotein E (VZVgE) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Is an immunochromatographic analysis method comprising the following steps (1) to (4).
(1) A step of adding a sample-containing solution obtained by diluting a sample with a sample dilution solution to a sample addition unit (2) a step of recognizing varicella-zoster virus by an antibody held in a labeling substance holding unit (3) the sample and Step of developing antibody as mobile phase in chromatographic medium part (4) Step of detecting varicella-zoster virus in the developed mobile phase with antibody contained in detection part The immunity used in the immunochromatography analysis method of the present invention Both the labeling substance holding part and the detection part in the chromatographic analyzer contain an antibody that recognizes VZVgE. In particular, at least one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Further, the antibody contained in at least one of the labeling substance holding part and the detection part is preferably an antibody that recognizes amino acid sequence 48-135 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, more preferably, At least one of the labeling substance holding part and the detection part recognizes at least one of the amino acid sequences 48-88, 89-107, and 108-135 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Particularly preferred is an antibody in which at least one of the labeling substance holding part and the detection part recognizes amino acid sequence 108-135 in VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Each step will be described below.
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
工程（１）では、第一に、検体を、測定精度を低下させることなく、免疫クロマトグラフ媒体中をスムーズに移動する程度の濃度に、検体希釈液で適宜調整または希釈して検体含有液とするのが好ましい。検体希釈液は上述したものを使用できる。第二に、検体含有液を試料添加部（１）上に、所定量（通常、０．１〜２ｍｌ）滴下する。検体含有液が滴下されると、検体含有液は試料添加部（１）中で移動を開始する。
(1) Step of adding a sample-containing solution obtained by diluting a sample with a sample dilution solution to the sample addition section In step (1), first, the sample is smoothly passed through the immunochromatographic medium without reducing the measurement accuracy. It is preferable to adjust or dilute with a sample diluent to a concentration that allows the sample to be transferred to a concentration of 1). The specimen dilution liquid described above can be used. Secondly, a predetermined amount (usually 0.1 to 2 ml) of the specimen-containing liquid is dropped onto the sample addition part (1). When the specimen-containing liquid is dropped, the specimen-containing liquid starts to move in the sample addition part (1).
本発明において使用する検体試料は、被検出物質である水痘帯状疱疹ウイルスを含む可能性のある検体試料であり、具体的には、水痘帯状疱疹ウイルスに感染した患者の水疱を穿刺することによって得られる水疱内容液、又は咽頭拭い液等が挙げられるが、これらに限定されない。 The specimen sample used in the present invention is a specimen sample that may contain a varicella-zoster virus that is a substance to be detected. Specifically, the specimen sample is obtained by puncturing a blister of a patient infected with varicella-zoster virus. Such as, but not limited to, blister content liquid or throat wiping liquid.
（２）標識物質保持部に保持されている抗体により水痘帯状疱疹ウイルスを認識させる工程
工程（２）は、工程（１）において試料添加部に添加された検体含有液を、標識物質保持部（２）へと移動させ、標識物質保持部に保持されている標識物質が結合した抗体（第一抗体）により検体中の被検出物質である水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）を認識させる工程である。
(2) The step of recognizing varicella-zoster virus by the antibody held in the labeling substance holding part In the step (2), the sample-containing liquid added to the sample addition part in the step (1) is used as the labeling substance holding part ( 2), and the antibody (first antibody) bound to the labeling substance held in the labeling substance holding part recognizes the varicella-zoster virus glycoprotein E (VZVgE) as the substance to be detected in the sample. It is a process.
標識物質は上記のものを使用できる。標識物質と結合する抗体（第一抗体）は、上記したように、ＶＺＶｇＥを認識する抗体である。同抗体は、試料添加部より展開されてきた検体中のＶＺＶｇＥを認識し結合する。特に、標識物質と結合する抗体（第一抗体）が、前者のＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体である場合は、同抗体は、試料添加部より展開されてきた検体中のＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識し結合する。 The above-mentioned labeling substances can be used. As described above, the antibody that binds to the labeling substance (first antibody) is an antibody that recognizes VZVgE. The antibody recognizes and binds VZVgE in the specimen developed from the sample addition part. In particular, when the antibody that binds to the labeling substance (first antibody) is an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of the former VZVgE, the antibody is VZVgE in the specimen developed from the sample addition part. Recognizes and binds to the amino acid sequence 1-188.
（３）前記検体及び抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
工程（３）は、工程（２）において被検出物質である水痘帯状疱疹ウイルスが標識物質保持部において標識物質が結合した抗体に認識された後、検体および抗体を、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過させる工程である。
(3) Step of developing the sample and antibody as a mobile phase in a chromatographic medium part In step (3), the varicella-zoster virus that is the substance to be detected in step (2) is bound to the labeling substance in the labeling substance holding part After being recognized by the antibody, the sample and the antibody are passed through the chromatographic medium part as a mobile phase.
（４）展開された移動相中の水痘帯状疱疹ウイルスを検出部に含まれる抗体により検出する工程
工程（４）は、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過した検体中の水痘帯状疱疹ウイルスにおけるＶＺＶｇＥが、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部に保持、即ち、固定されている抗体と、前記工程（２）において標識物質が結合した抗体とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する工程である。
該抗体（第二抗体）は、上記したように、ＶＺＶｇＥを認識する抗体である。標識物質と結合する抗体（第一抗体）が、後者のＶＺＶｇＥを認識する抗体のうちＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体でない場合は、この検出部には必ずＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を含有させる。
該抗体は、標識物質保持部より展開されてきた検体中のＶＺＶｇＥを認識し結合する。特に、該抗体（第二抗体）が、前者のＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体である場合は、同抗体は、標識物質保持部より展開されてきた、第一抗体の結合したＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識し結合、捕捉する。
(4) A step of detecting varicella-zoster virus in the developed mobile phase with an antibody contained in the detection unit Step (4) is a step for detecting varicella-zoster virus in a specimen that has passed on the chromatographic medium as a mobile phase. VZVgE is specific so that it is sandwiched between the antibody held in the detection part, that is, immobilized by the antigen-antibody specific binding reaction, and the antibody to which the labeling substance is bound in the step (2). This is a step in which the detection portion is colored by reaction bonding.
The antibody (second antibody) is an antibody that recognizes VZVgE as described above. When the antibody that binds to the labeling substance (first antibody) is not an antibody that recognizes the amino acid sequence 1-188 of VZVgE among the antibodies that recognize the latter VZVgE, the amino acid sequence 1- An antibody that recognizes position 188 is included.
The antibody recognizes and binds VZVgE in the specimen developed from the labeling substance holding part. In particular, when the antibody (second antibody) is an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of the former VZVgE, the antibody is bound by the first antibody developed from the labeling substance holding part. Recognizes, binds to and captures amino acid sequence 1-188 of VZVgE.
標識物質保持部及び検出部のいずれか一方のみがＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識し結合する抗体を含有する場合、検出部に固定化された抗体（第二抗体）は、標識物質保持部に担持された抗体（第一抗体）が結合した箇所と別の箇所に結合し、被検出物質をサンドイッチ状に挟み、検出部が着色する。 When only one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody that recognizes and binds to amino acid sequence 1-188 of VZVgE, the antibody immobilized on the detection part (second antibody) It binds to a portion different from the portion where the antibody (first antibody) carried on the portion is bound, sandwiches the substance to be detected in a sandwich shape, and the detection portion is colored.
被検出物質である水痘帯状疱疹ウイルスが存在しない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体部上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部が着色しない。 In the absence of the varicella-zoster virus that is the substance to be detected, the labeling reagent dissolved in the water of the sample does not cause a specific binding reaction even if it passes through the detection part on the chromatographic medium part. Does not color.
最後に、検体含有液の水分は、吸収部（５）へと移動する。 Finally, the moisture in the specimen-containing liquid moves to the absorption part (5).
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further, this invention is not restrict | limited to the following example.
［試験例１］ＶＺＶｇＥを認識する抗体の作製
ＶＺＶのｇＥタンパク質（ＶＺＶｇＥ）のアミノ酸配列をＤＤＢＪ（国立遺伝学研究所データベース）より入手した（配列番号１）。前記ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列から、膜貫通ドメインを除いた細胞外領域である配列番号２に示すアミノ酸配列（１−５４４番目）を特定し、対応する遺伝子配列を合成した。Ｈｉｓ−ｔａｇ発現用ベクターであるｐＥＴ３０２／ＮＴ−Ｈｉｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理としてアルカリフォスファターゼにより処理し、前記遺伝子配列と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてライゲーション反応をおこなった。
目的遺伝子を組み込んだ組換えＶＺＶｇＥプラスミドを組換え蛋白発現用宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。導入菌をＬＢ寒天平板培地で培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養した。さらに１ｍＭ ＩＰＴＧ（タカラバイオ）を添加して組換えＶＺＶｇＥの発現を誘導した後、Ｅ．ｃｏｌｉを回収した。回収した菌を可溶化バッファー［０．５％Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ−１００（ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよび０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］に再浮遊し、超音波処理により可溶化した後、組換えＶＺＶｇＥをＨｉｓ ｔｒａｐ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。この精製タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）に対して透析し、目的の組換えＶＺＶｇＥとした。
[Test Example 1] Preparation of antibody recognizing VZVgE The amino acid sequence of VZV gE protein (VZVgE) was obtained from DDBJ (National Institute of Genetics Database) (SEQ ID NO: 1). From the VZVgE amino acid sequence, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which is an extracellular region excluding the transmembrane domain, was identified, and the corresponding gene sequence was synthesized. The His-tag expression vector pET302 / NT-His was cleaved with the restriction enzyme EcoRI, then treated with alkaline phosphatase as a dephosphorylation treatment, mixed with the gene sequence, and DNA Ligation.
Kit Ver. Ligation reaction was performed using 2 (Takara Bio).
A recombinant VZVgE plasmid into which the target gene has been incorporated is transformed into a recombinant protein expression host E. coli. and introduced into E. coli BL (DE3) pLysS (Novagen). The introduced bacteria were cultured on an LB agar plate medium, and the obtained colonies were cultured on an LB liquid medium. Further, 1 mM IPTG (Takara Bio) was added to induce the expression of recombinant VZVgE. E. coli was recovered. The collected bacteria are resuspended in a solubilization buffer [0.5% Triron X-100 (sigma), 10 mM imidazole, 20 mM phosphate and 0.5 M NaCl (pH 7.4) (Amersham)] and solubilized by sonication. After that, the recombinant VZVgE was purified using His trap Kit (Amersham). This purified protein was dialyzed against phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS) to obtain the desired recombinant VZVgE.
得られた組換えＶＺＶｇＥを免疫用抗原として、組換えＶＺＶｇＥに対するモノクローナル抗体（以下、抗ＶＺＶｇＥ抗体と称する）を作出した。モノクローナル抗体の作出は次のように、常法に従っておこなった。１００μｇの組換えＶＺＶｇＥと等量のＡｄｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＬ−グルタミン ０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム １００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ ４０μｇ／ｍｌを添加し（ＤＭＥＭ）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ）を１０％となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、０．４μＭ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をＨＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。 Using the obtained recombinant VZVgE as an antigen for immunization, a monoclonal antibody against recombinant VZVgE (hereinafter referred to as anti-VZVgE antibody) was produced. Production of the monoclonal antibody was performed according to a conventional method as follows. 100 μg of recombinant VZVgE and an equivalent amount of Advantant Complete Freund (Difco) were mixed, and mice (BALB / c, 5 weeks old, Japan SLC) were immunized three times, and the spleen cells were used for cell fusion. Sp2 / 0-Ag14 cells (Shulman et al., Nature, 276, 269-270, 1978), which are mouse myeloma cells, were used for cell fusion. For cell culture, L-glutamine 0.3 mg / ml, penicillin G potassium 100 units / ml, streptomycin sulfate 100 μg / ml, Gentacin 40 μg / ml was added to Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) (DMEM), A culture solution in which fetal bovine serum (JRH) was added to 10% was used. Cell fusion was performed by mixing spleen cells of immunized mice and Sp2 / 0-Ag14 cells and adding Polyethylene glycol solution (Sigma) thereto. The fused cells are cultured in HAT-DMEM [serum-added DMEM containing 0.1 mM sodium hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin and 0.016 mM thymidine (Gibco)], and antibody production in the culture supernatant by the enzyme-linked antibody method (ELISA) It was confirmed. Antibody-positive cells were cultured in HT-DMEM [serum-added DMEM containing 0.1 mM sodium hypoxanthine and 0.16 mM thymidine], and further cultured in serum-added DMEM.
クローニングした細胞は、２，６，１０，１４−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を接種しておいたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、リタイア、日本ＳＬＣ）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をプロテインＧカラムに供し、モノクローナル抗体を精製した。
最終的にＶＺＶｇＥを認識するモノクローナル抗体産生細胞が２３クローン得られた。
The cloned cells were intraperitoneally inoculated into mice (BALB / c, Retire, Japan SLC) which had been inoculated with 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Sigma), and ascites was collected. This ascites was applied to a protein G column to purify the monoclonal antibody.
Finally, 23 clones producing monoclonal antibody recognizing VZVgE were obtained.
［試験例２］ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を産生する細胞のスクリーニング
試験例１で得られたＶＺＶｇＥに認識するモノクローナル抗体産生細胞の２３クローンのうち、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を産生する細胞をスクリーニングするため、以下の実験を行った。
試験例１と同様の方法で、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＺＶｇＥのうち、アミノ酸配列１−１８８番目からなるリコンビナントタンパク質を作製し以下の実験に用いた。
作製した０．０１ｍｇ／ｍｌのＶＺＶｇＥ（アミノ酸配列１−１８８番目）リコンビナントタンパク質溶液を、１０％の２−メルカプトエタノールを添加した２×Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＥＦＣＯ社製）と等量で混合し、１００℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、レディーゲル Ｊ５−２０％ １２ｗｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、公知の標準的な方法に従った。泳動後のゲルからタンパク質をＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にブロッテイング装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により転写した。転写後のＰＶＤＦ膜をイムノブロック（ＤＳファーマラボラトリーズ）で室温にて１時間ブロッキングした。
ブロッキング液を除き、ＰＶＤＦ膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ（以下、Ｔ−ＰＢＳという。）で１０分間３回洗浄後、試験例１で得られた２３のモノクローナル抗体産生細胞から産生されたモノクローナル抗体を含む培養上清とともに室温で１時間インキュベートした。抗体の濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌに調製し、１レーン当たり１．０μｇのＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質と反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴ−ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、Ｔ−ＰＢＳで５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製）とともに室温で３０分間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、発色基質である１−ＳｔｅｐＴＭ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）とともにＰＶＤＦ膜をインキュベートして、ＰＶＤＦ膜に結合した抗体を可視化した。その結果、２１ｋＤａのバンド（ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目に相当）が、２３のモノクローナルの中から複数検出できた。後述する免疫クロマト分析試験に供するため、当該抗体のうちから任意に２種類の抗体を選び、該抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして、この２つの独立したクローンを選び、それぞれをハイブリドーマＡ，Ｂと命名した。また、ハイブリドーマＡ，Ｂがそれぞれ産生する抗体を、抗体Ａ，Ｂと命名した。両抗体は、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体である。該ハイブリドーマ２株から得られたモノクローナル抗体のサブクラスはいずれもＩｇＧ１であった。
[Test Example 2] Screening of cells producing an antibody recognizing amino acid sequence 1-188 of VZVgE Among 23 clones of monoclonal antibody-producing cells recognizing VZVgE obtained in Test Example 1,
In the same manner as in Test Example 1, a recombinant protein consisting of amino acid sequence 1-188 of VZVgE consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared and used in the following experiments.
The prepared 0.01 mg / ml VZVgE (amino acid sequence 1-188) recombinant protein solution was mixed with 2 × Tris-Glycine SDS Sample Buffer (manufactured by TEFCO) to which 10% 2-mercaptoethanol was added. And heated at 100 ° C. for 10 minutes and subjected to SDS-PAGE. SDS-PAGE followed a known standard method using Ready Gel J5-20% 12well (manufactured by BIO-RAD). Proteins were transferred from the gel after electrophoresis to Sequi-Blot PVDF Membrane (manufactured by BIO-RAD) using a blotting apparatus (manufactured by BIO-RAD). The transferred PVDF membrane was blocked with an immunoblock (DS Pharma Laboratories) at room temperature for 1 hour.
After removing the blocking solution, the PVDF membrane was washed 3 times for 10 minutes with PBS containing 0.05% Tween 20 (trade name) (hereinafter referred to as T-PBS), and then the 23 monoclonal antibody productions obtained in Test Example 1 were produced. The cells were incubated for 1 hour at room temperature with the culture supernatant containing the monoclonal antibody produced from the cells. Each antibody concentration was adjusted to 10 μg / ml and reacted with 1.0 μg VZVgE recombinant protein per lane. The PVDF membrane was washed 3 times for 10 minutes with T-PBS, and then incubated with alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG (manufactured by SIGMA) diluted 5000 times with T-PBS at room temperature for 30 minutes. After washing with T-PBS three times for 10 minutes, the PVDF membrane was incubated with 1-Step ™ NBT / BCIP (manufactured by PIERCE), which is a chromogenic substrate, to visualize the antibody bound to the PVDF membrane. As a result, a plurality of 21 kDa bands (corresponding to amino acid sequences 1-188 of VZVgE) were detected from 23 monoclonals. For use in the immunochromatographic analysis test described later, two kinds of antibodies are arbitrarily selected from the antibodies, hybridomas producing the antibodies are cloned, the two independent clones are selected, and each of the hybridomas A and B is selected. Named. The antibodies produced by the hybridomas A and B were named antibodies A and B, respectively. Both antibodies are antibodies that recognize amino acid sequence 1-188 of VZVgE. The subclasses of the monoclonal antibodies obtained from the
［試験例３］免疫クロマト分析
本試験では、試験例２で得られた抗体Ａ，Ｂを標識物質保持部及び検出部のいずれかに用いた免疫クロマト分析装置を作製し、免疫クロマト分析を行った。
＜免疫クロマト分析装置の作製＞
（１）試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
（２）標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗体（抗体Ａ，Ｂのいずれか１つ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
[Test Example 3] Immunochromatographic analysis In this test, an immunochromatographic analyzer using the antibodies A and B obtained in Test Example 2 in either the labeling substance holding part or the detecting part was prepared and subjected to immunochromatographic analysis. It was.
<Production of immunochromatographic analyzer>
(1) Preparation of sample addition part The nonwoven fabric (Millipore company_made: 300 mm x 30 mm) which consists of glass fiber was used as a sample addition part.
(2) Preparation of labeling substance holding part 0.5 ml of colloidal gold suspension (manufactured by Tanaka Kikinzoku Kogyo Co., Ltd .: LC 40 nm) diluted with phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 0.05 mg / ml 0.1 ml of the prepared antibody (one of antibodies A and B) was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
Next, 0.1 ml of a phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% by weight of bovine serum albumin (BSA) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, after sufficiently stirring, centrifugation was performed at 8000 × g for 15 minutes to remove the supernatant, and 0.1 ml of a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 1% by mass of BSA was added. The labeling substance solution was prepared by the above procedure.
After adding 300 μL of a 10% by mass trehalose aqueous solution and 1.8 mL of distilled water to 300 μL of the prepared labeling substance solution, uniformly added to a 12 mm × 300 mm glass fiber pad (Millipore), vacuum is added. The labeling substance holding part was produced by drying with a dryer.
（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、抗体（抗体Ａ，Ｂのいずれか１つ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
（４）免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
(3) Preparation of chromatographic medium part and detection part As a membrane, a sheet made of nitrocellulose (manufactured by Millipore, trade name: HF120, 300 mm × 25 mm) was used.
Next, 150 μL of a solution obtained by diluting an antibody (any one of antibodies A and B) with a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 5% by mass of isopropyl alcohol so as to have a concentration of 1.0 mg / ml. Was applied to the detection site (detection line) on the dried membrane in a line shape with an amount of 1 μL / mm (25 μL per sheet) using an immunochromatographic dispenser “XYZ3050” (manufactured by BIODOT) with a width of 1 mm. .
In addition, a goat-derived antiserum having a wide affinity with the gold nanoparticle labeling substance is mixed with a phosphate buffer solution (pH 7.4) downstream of the detection site in order to confirm the presence / absence and development rate of the gold nanoparticle labeling reagent. The solution diluted with was applied to the control site (control line). Then, it was dried at 50 ° C. for 30 minutes and dried overnight at room temperature to prepare a chromatographic medium part and a detection part.
(4) Production of immunochromatography analyzer Next, a substrate consisting of a backing sheet, a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part, absorption for absorbing the developed sample and labeling substance Glass fiber non-woven fabrics were bonded together as a part. And it cut | judged so that a width | variety might be set to 5 mm with the cutter, and it was set as the immunochromatography analyzer. The length of the labeling substance holding part in the sample developing direction was 12 mm.
（５）検体希釈液
１質量％の非イオン性界面活性剤ＮＰ−４０（ナカライテスク社製、商品名：ノニデットＰ−４０、ＨＬＢ値１７．７）と、ノニオンＭＮ−８１１（日油社製、商品名：ノニオンＭＮ−８１１、ＨＬＢ値８．３）との質量比１：１混合物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
(5) Sample diluent 1% by mass of nonionic surfactant NP-40 (manufactured by Nacalai Tesque, trade name: Nonidet P-40, HLB value 17.7) and nonion MN-811 (manufactured by NOF Corporation) , Trade name: Nonion MN-811, HLB value 8.3) and a 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.5) containing a 1: 1 mixture by mass ratio, and a sample diluent for diluting the sample It was.
＜測定＞
試験例２で作製した０．１ｍｇ／ｍｌのＶＺＶｇＥ（アミノ酸配列１−１８８番目）リコンビナントタンパク質を抗原として、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。上記抗原は、上記検体希釈液で１００倍に希釈し、検体試料とした。
<Measurement>
Using 0.1 mg / ml VZVgE (amino acid sequence 1-188th) recombinant protein prepared in Test Example 2 as an antigen, the color intensity at the detection part was measured when the prepared immunochromatography analyzer was used. The antigen was diluted 100 times with the sample diluent to prepare a sample sample.
上記それぞれの検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）を目視で確認した。結果を表１に示す。
なお表１中の評価基準は以下の通りである。
±：発色は確認できるが非常に色が薄いもの
＋＋：強い発色を確認できるもの
150 μL of each sample sample was placed on the sample addition part of the immunochromatography analyzer and developed, and the degree of coloring (coloring intensity) of the detection part was visually confirmed. The results are shown in Table 1.
The evaluation criteria in Table 1 are as follows.
±: Color can be confirmed, but the color is very light ++: Strong color can be confirmed
表１の結果により、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を免疫クロマト分析装置に用いることによって、ＶＺＶを検出することができることが分かった。 From the results in Table 1, it was found that VZV can be detected by using an antibody that recognizes amino acid sequence 1-188 of VZVgE in an immunochromatographic analyzer.
［試験例４］ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列４８−１３５番目を認識する抗体のスクリーニング
試験例１で得られたＶＺＶｇＥに対するモノクローナル抗体のうち、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列４８−１３５番目を認識する抗体をスクリーニングするため、以下の実験を行った。
０．０１ｍｇ／ｍｌのＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質溶液（ＣａｌＢｉｏｒｅａｇｅｎｔ社）を、１０％の２−メルカプトエタノールを添加した２×Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＥＦＣＯ社製）と等量で混合し、１００℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、レディーゲル
Ｊ５−２０％ １２ｗｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、公知の標準的な方法に従った。泳動後のゲルからタンパク質をＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にブロッテイング装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により転写した。転写後のＰＶＤＦ膜をイムノブロック（ＤＳファーマラボラトリーズ）で室温にて１時間ブロッキングした。
ブロッキング液を除き、ＰＶＤＦ膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ（以下、Ｔ−ＰＢＳという。）で１０分間３回洗浄後、試験例１で得られた２３のモノクローナル抗体産生細胞から産生されたモノクローナル抗体を含む培養上清とともに室温で１時間インキュベートした。抗体の濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌに調製し、１レーン当たり１．０μｇのＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質と反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴ−ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、Ｔ−ＰＢＳで５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製）とともに室温で３０分間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、発色基質である１−ＳｔｅｐＴＭ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）とともにＰＶＤＦ膜をインキュベートして、ＰＶＤＦ膜に結合した抗体を可視化した。その結果、ＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質に相当する１１ｋＤａのバンド（ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列４８−１３５番目に相当）が、２３のモノクローナルの中から６つ検出できた。当該抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして、この６つの独立したクローンを選び、それぞれをハイブリドーマ１，２，３，４，５及び６と命名した。また、ハイブリドーマ１，２，３，４，５及び６がそれぞれ産生する抗体を、抗体１，２，３，４，５及び６と命名した。なお、抗体２は試験例２及び３における抗体Ａに該当し、抗体６は試験例２及び３における抗体Ｂに該当する。該ハイブリドーマ６株から得られたモノクローナル抗体のサブクラスは全てＩｇＧ１であった。
[Test Example 4] Screening of an antibody recognizing amino acid sequence 48-135 of VZVgE Among the monoclonal antibodies against VZVgE obtained in Test Example 1, an antibody recognizing amino acid sequence 48-135 of VZVgE was screened. The following experiment was conducted.
0.01 mg / ml VZVgE recombinant protein solution (CalBioreagent) was mixed with 2 × Tris-Glycine SDS Sample Buffer (manufactured by TEFCO) supplemented with 10% 2-mercaptoethanol in an equal volume, and 10% at 100 ° C. Heated for minutes and subjected to SDS-PAGE. SDS-PAGE followed a known standard method using Ready Gel J5-20% 12well (manufactured by BIO-RAD). Proteins were transferred from the gel after electrophoresis to Sequi-Blot PVDF Membrane (manufactured by BIO-RAD) using a blotting apparatus (manufactured by BIO-RAD). The transferred PVDF membrane was blocked with an immunoblock (DS Pharma Laboratories) at room temperature for 1 hour.
After removing the blocking solution, the PVDF membrane was washed 3 times for 10 minutes with PBS containing 0.05% Tween 20 (trade name) (hereinafter referred to as T-PBS), and then the 23 monoclonal antibody productions obtained in Test Example 1 were produced. The cells were incubated for 1 hour at room temperature with the culture supernatant containing the monoclonal antibody produced from the cells. Each antibody concentration was adjusted to 10 μg / ml and reacted with 1.0 μg VZVgE recombinant protein per lane. The PVDF membrane was washed 3 times for 10 minutes with T-PBS, and then incubated with alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG (manufactured by SIGMA) diluted 5000 times with T-PBS at room temperature for 30 minutes. After washing with T-PBS three times for 10 minutes, the PVDF membrane was incubated with 1-Step ™ NBT / BCIP (manufactured by PIERCE), which is a chromogenic substrate, to visualize the antibody bound to the PVDF membrane. As a result, six 11 kDa bands (corresponding to amino acid sequences 48-135 of VZVgE) corresponding to the VZVgE recombinant protein could be detected from among the 23 monoclonals. The hybridoma producing the antibody was cloned, and these six independent clones were selected and designated as
［試験例５］ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列４８−８８番目、８９−１０７番目、１０８−１３５番目を認識する抗体のスクリーニング
０．０１ｍｇ／ｍｌのＶＺＶｇＥペプチド断片（配列番号１のアミノ酸配列４８−８８番目、８９−１０７番目、１０８−１３５番目）を、ペプチドの化学合成法の常法であるペプチド固相化合成法により合成し以下の実験を行った。上記各ペプチド断片を１０％の２−メルカプトエタノールを添加した２×Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＥＦＣＯ社製）と等量で混合し、１００℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、レディーゲル Ｊ５−２０％ １２ｗｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、公知の標準的な方法に従った。泳動後のゲルからタンパク質をＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にブロッテイング装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により転写した。転写後のＰＶＤＦ膜をイムノブロック（ＤＳファーマラボラトリーズ）で室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除き、ＰＶＤＦ膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ（以下、Ｔ−ＰＢＳという。）で１０分間３回洗浄後、上記抗体１，２，３，４，５及び６とともに室温で１時間インキュベートした。抗体の濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌに調製し、１レーン当たり１．０μｇのＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質と反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴ−ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、Ｔ−ＰＢＳで５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製）とともに室温で３０分間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、発色基質である１−ＳｔｅｐＴＭ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）とともにＰＶＤＦ膜をインキュベートして、ＰＶＤＦ膜に結合した抗体を可視化した。各ＶＺＶｇＥペプチド断片（配列番号１のアミノ酸配列４８−８８番目、８９−１０７番目、１０８−１３５番目）に相当するバンドが検出できなかったものを−、検出できたものを＋として、結果を表２に示す。
[Test Example 5] Screening of antibodies recognizing amino acid sequences 48-88, 89-107, 108-135 of VZVgE 0.01 mg / ml of VZVgE peptide fragment (amino acid sequence 48-88 of SEQ ID NO: 1, 89-107th and 108-135th) were synthesized by a peptide solid phase synthesis method which is a conventional method of peptide chemical synthesis, and the following experiments were conducted. Each peptide fragment was mixed with 2 × Tris-Glycine SDS Sample Buffer (manufactured by TEFCO) to which 10% 2-mercaptoethanol was added in an equal amount, heated at 100 ° C. for 10 minutes, and subjected to SDS-PAGE. SDS-PAGE followed a known standard method using Ready Gel J5-20% 12well (manufactured by BIO-RAD). Proteins were transferred from the gel after electrophoresis to Sequi-Blot PVDF Membrane (manufactured by BIO-RAD) using a blotting apparatus (manufactured by BIO-RAD). The transferred PVDF membrane was blocked with an immunoblock (DS Pharma Laboratories) at room temperature for 1 hour. After removing the blocking solution, the PVDF membrane was washed with PBS containing 0.05% Tween 20 (trade name) (hereinafter referred to as T-PBS) three times for 10 minutes, and then the
この結果、抗体１〜３はＶＺＶｇＥのアミノ酸配列４８−８８番目を認識し、抗体４、５はＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１０８−１３５番目を認識し、抗体６はＶＺＶｇＥのアミノ酸配列８９−１０７番目を認識することがわかった。
As a result,
［試験例６］免疫クロマト分析
本試験では、試験例２で得られた抗体１〜６のいずれかを用いた免疫クロマト分析装置を作製し、免疫クロマト分析を行った。
＜免疫クロマト分析装置の作製＞
（１）試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
（２）標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗体（抗体１〜６のいずれか１つ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
[Test Example 6] Immunochromatographic analysis In this test, an immunochromatographic analyzer using any of the
<Production of immunochromatographic analyzer>
(1) Preparation of sample addition part The nonwoven fabric (Millipore company_made: 300 mm x 30 mm) which consists of glass fiber was used as a sample addition part.
(2) Preparation of labeling substance holding part 0.5 ml of colloidal gold suspension (manufactured by Tanaka Kikinzoku Kogyo Co., Ltd .: LC 40 nm) diluted with phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 0.05 mg / ml 0.1 ml of the prepared antibody (any one of
Next, 0.1 ml of a phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% by weight of bovine serum albumin (BSA) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, after sufficiently stirring, centrifugation was performed at 8000 × g for 15 minutes to remove the supernatant, and 0.1 ml of a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 1% by mass of BSA was added. The labeling substance solution was prepared by the above procedure.
After adding 300 μL of a 10% by mass trehalose aqueous solution and 1.8 mL of distilled water to 300 μL of the prepared labeling substance solution, uniformly added to a 12 mm × 300 mm glass fiber pad (Millipore), vacuum is added. The labeling substance holding part was produced by drying with a dryer.
（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、抗体（抗体１〜６のいずれか１つ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
（４）免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
(3) Preparation of chromatographic medium part and detection part As a membrane, a sheet made of nitrocellulose (manufactured by Millipore, trade name: HF120, 300 mm × 25 mm) was used.
Next, 150 μL of a solution obtained by diluting an antibody (any one of
In addition, a goat-derived antiserum having a wide affinity with the gold nanoparticle labeling substance is mixed with a phosphate buffer solution (pH 7.4) downstream of the detection site in order to confirm the presence / absence and development rate of the gold nanoparticle labeling reagent. The solution diluted with was applied to the control site (control line). Then, it was dried at 50 ° C. for 30 minutes and dried overnight at room temperature to prepare a chromatographic medium part and a detection part.
(4) Production of immunochromatography analyzer Next, a substrate consisting of a backing sheet, a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part, absorption for absorbing the developed sample and labeling substance Glass fiber non-woven fabrics were bonded together as a part. And it cut | judged so that a width | variety might be set to 5 mm with the cutter, and it was set as the immunochromatography analyzer. The length of the labeling substance holding part in the sample developing direction was 12 mm.
（５）検体希釈液
１質量％の非イオン性界面活性剤ＮＰ−４０（ナカライテスク社製、商品名：ノニデットＰ−４０、ＨＬＢ値１７．７）と、ノニオンＭＮ−８１１（日油社製、商品名：ノニオンＭＮ−８１１、ＨＬＢ値８．３）との質量比１：１混合物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
(5) Sample diluent 1% by mass of nonionic surfactant NP-40 (manufactured by Nacalai Tesque, trade name: Nonidet P-40, HLB value 17.7) and nonion MN-811 (manufactured by NOF Corporation) , Trade name: Nonion MN-811, HLB value 8.3) and a 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.5) containing a 1: 1 mixture by mass ratio, and a sample diluent for diluting the sample It was.
＜測定＞
０．０１ｍｇ／ｍｌのＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質（ＣａｌＢｉｏｒｅａｇｅｎｔ社）を抗原として、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。上記抗原は、上記検体希釈液で１００倍に希釈し、検体試料とした。
<Measurement>
Using 0.01 mg / ml VZVgE recombinant protein (CalBioreagent) as an antigen, the color intensity in the detection part was measured when the prepared immunochromatography analyzer was used. The antigen was diluted 100 times with the sample diluent to prepare a sample sample.
上記それぞれの検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）を目視で確認した。結果を表３示す。
なお表３中の評価基準は以下の通りである。
−：発色を確認できないもの
±：発色は確認できるが非常に色が薄いもの
＋：発色を確認できるもの
＋＋：強い発色を確認できるもの
＋＋＋：非常に強い発色が確認できるもの
150 μL of each sample sample was placed on the sample addition part of the immunochromatography analyzer and developed, and the degree of coloring (coloring intensity) of the detection part was visually confirmed. The results are shown in Table 3.
The evaluation criteria in Table 3 are as follows.
-: Color that cannot be confirmed ±: Color that can be confirmed but very light color +: Color that can be confirmed ++: Strong color can be confirmed +++: Very strong color can be confirmed
表３の結果により、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列４８−１３５番目を認識する抗体を免疫クロマト分析装置に用いて、ＶＺＶを検出することができることが分かった。特に、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１０８−１３５番目を認識する抗体（抗体４、５）を、標識物質保持部または検出部のいずれか一方に含有させた場合に、ＶＺＶをより強く検出することができることが分かった。 From the results of Table 3, it was found that VZV can be detected using an antibody that recognizes amino acid sequence 48-135 of VZVgE in an immunochromatographic analyzer. In particular, when an antibody (antibodies 4 and 5) that recognizes amino acid sequence 108-135 of VZVgE is contained in either the labeling substance holding part or the detection part, VZV can be detected more strongly. I understood.
［試験例７］実検体による免疫クロマト分析
ＶＺＶを含有する検体試料として、ＶＺＶ感染者の水疱内容液を用いたことを除いて、試験例６を繰り返した。水疱内容液は、ＶＺＶ感染者である被験者の水疱を穿刺することにより採取した。また、採取した水疱内容液は、上記検体希釈液で１０倍に希釈し、検体試料とした。
[Test Example 7] Immunochromatographic analysis using an actual sample Test Example 6 was repeated except that the blister content liquid of a VZV-infected person was used as a sample sample containing VZV. The blister content fluid was collected by puncturing the blister of a subject who was infected with VZV. Further, the blister content liquid collected was diluted 10-fold with the above-mentioned specimen dilution liquid to obtain a specimen sample.
上記それぞれの検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）を目視で確認した。結果を表４示す。
なお表４中の評価基準は以下の通りである。
−：発色を確認できないもの
±：発色は確認できるが非常に色が薄いもの
＋：発色を確認できるもの
＋＋：強い発色を確認できるもの
＋＋＋：非常に強い発色が確認できるもの
150 μL of each sample sample was placed on the sample addition part of the immunochromatography analyzer and developed, and the degree of coloring (coloring intensity) of the detection part was visually confirmed. Table 4 shows the results.
The evaluation criteria in Table 4 are as follows.
-: Color that cannot be confirmed ±: Color that can be confirmed but very light color +: Color that can be confirmed ++: Strong color can be confirmed +++: Very strong color can be confirmed
検体試料を実検体とした場合も、ＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質を抗原とした試験例６と同様の結果となった。 When the specimen sample was used as a real specimen, the same results as in Test Example 6 using the VZVgE recombinant protein as an antigen were obtained.
１ 試料添加部（サンプルパッド）
２ 標識物質保持部
３ クロマトグラフ媒体部
４ 検出部
５ 吸収部
６ バッキングシート
1 Sample addition part (sample pad)
2 Labeling substance holding part 3 Chromatographic medium part 4
Claims (6)
前記標識物質保持部及び検出部のいずれか一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなる前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）のアミノ酸配列１０８−１３５番目を認識する抗体を含有し、もう一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなる前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）のアミノ酸配列４８−８８番目を認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。 An immunochromatography analyzer for detecting varicella-zoster virus (VZV), comprising a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part and an absorption part,
Any one of the labeling substance holding part and the detection part contains an antibody that recognizes amino acid sequence 108-135 of glycoprotein E (VZVgE) of the varicella-zoster virus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, An immunochromatographic analyzer comprising an antibody that recognizes amino acid sequence 48-88 of glycoprotein E (VZVgE) of the varicella-zoster virus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている抗体により水痘帯状疱疹ウイルスを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の水痘帯状疱疹ウイルスを検出部に含まれる抗体により検出する工程 A method for detecting varicella-zoster virus (VZV) in a specimen using an immunochromatography analyzer including a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part, and an absorption part. Yes, any one of the labeling substance holding part and the detection part of the immunochromatography analyzer comprises the amino acid sequence 108-135 of the varicella-zoster virus glycoprotein E (VZVgE) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. And an antibody that recognizes amino acid sequence 48-88 of glycoprotein E (VZVgE) of the varicella-zoster virus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and comprising the following steps ( An immunochromatographic analysis method comprising 1) to (4).
(1) A step of adding a sample-containing solution obtained by diluting a sample with a sample dilution solution to a sample addition unit (2) a step of recognizing varicella-zoster virus by an antibody held in a labeling substance holding unit (3) the sample and (4) A step of detecting varicella-zoster virus in the developed mobile phase with an antibody contained in the detection unit.
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