JP2017195861A - Bacillus subtilis mutants and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規な枯草菌変異株及びその利用に関する。 The present invention relates to a novel Bacillus subtilis mutant and its use.
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。 The industrial production of useful substances by microorganisms includes a wide variety of types including foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, as well as amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. In addition, its application has been extended to a wide range of fields from foods, pharmaceuticals, detergents, daily necessaries such as cosmetics to various chemical raw materials.
ポリ−γ−グルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」とも称する）は、グルタミン酸のγ−位のカルボキシル基とα−位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物であり、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．ｎａｔｔｏ）を始め、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ等の一部のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌や、Ｎａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａ等が産生する粘性物質として知られている。ＰＧＡは、保水性、親水性、増粘性、生分解性等、種々の性質から有用な高分子素材として近年注目され、その生産性の向上が重要な課題の一つとなっている。 Poly-γ-glutamic acid (hereinafter also referred to as “PGA”) is a high molecular compound in which a carboxyl group at the γ-position and an amino group at the α-position of glutamic acid are bonded by a peptide bond, and Bacillus subtilis var. Natto), Bacillus subtilis var. Some bacteria belonging to the genus Bacillus such as chungkookjang, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus anthracis, Bacillus halodurans, etc., and are known to produce Natalba aehypti. In recent years, PGA has attracted attention as a useful polymer material due to various properties such as water retention, hydrophilicity, thickening, biodegradability and the like, and improvement of its productivity has become one of the important issues.
近年、枯草菌について遺伝子破壊株の網羅的な研究が行われ、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子のうち２７１個の遺伝子が生育に必須であることが明らかにされた（非特許文献１）。また、ゲノムの大領域あるいは遺伝子を欠失させた変異株の網羅的解析により、各種酵素の生産性に優れた変異株が見出されている。これらの研究で得られた枯草菌変異株の１つであるＭＧＢ８７４株は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）に由来し、そのゲノムの合計８７４ｋｂが削除された変異株であるが、野生株である１６８株に比較して、タンパク質の分泌生産性が有意に向上することが報告されている（特許文献１）。そして、最近では、当該ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌株を用いて、上記のＰＧＡを効率よく製造する方法が報告されている（特許文献２）。さらに、ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌株に対してアセトイン合成に関わる酵素遺伝子群（ａｌｓＳ遺伝子、ａｌｓＤ遺伝子）を欠失させた場合にＰＧＡの生産性が向上することが報告されている（特許文献３）。 In recent years, exhaustive research on gene-disrupted strains has been conducted on Bacillus subtilis, and it has been clarified that 271 genes out of about 4,100 genes existing in the Bacillus subtilis genome are essential for growth (Non-Patent Documents). 1). Moreover, mutant strains excellent in productivity of various enzymes have been found by comprehensive analysis of mutant strains in which large genomic regions or genes have been deleted. The MGB874 strain, one of the Bacillus subtilis mutants obtained in these studies, is Bacillus subtilis Marburg No. 168 (Bacillus subtilis 168 strain) derived from a mutant strain with a total of 874 kb deleted, but it is reported that the secretory productivity of the protein is significantly improved compared to the wild-type 168 strain (Patent Document 1). Recently, a method for efficiently producing the above PGA using a Bacillus subtilis strain obtained by deleting a large region of the genome has been reported (Patent Document 2). Furthermore, it has been reported that productivity of PGA is improved when an enzyme gene group (alsS gene, alsD gene) involved in acetoin synthesis is deleted from a Bacillus subtilis strain obtained by deleting a large region of the genome. (Patent Document 3).
一方、クエン酸シンターゼは、クエン酸回路の最初の反応を触媒する酵素であり、アセチルＣｏＡの酢酸残基をオキサロ酢酸に付加し、クエン酸を合成する反応を触媒する。
従来、パントエア・アグロメランスに属する微生物に、コリネ型細菌のクエン酸シンターゼ遺伝子を導入した場合にＬ−グルタミン酸の生産能が向上することが報告されている（特許文献４）。しかしながら、枯草菌を用いたＰＧＡ生産性の向上において、クエン酸シンターゼ（ＣｉｔＺ）が関与するという報告はなく、ＣｉｔＺの発現制御とアセトイン合成酵素群の発現制御を組み合わせた場合に如何なる影響を及ぼすかは不明である。
On the other hand, citrate synthase is an enzyme that catalyzes the initial reaction of the citrate cycle, and catalyzes a reaction of synthesizing citric acid by adding an acetic acid residue of acetyl CoA to oxaloacetic acid.
Conventionally, it has been reported that the ability to produce L-glutamic acid is improved when a citrate synthase gene of coryneform bacteria is introduced into a microorganism belonging to Pantoea agglomerans (Patent Document 4). However, there is no report that citrate synthase (CitZ) is involved in the improvement of PGA productivity using Bacillus subtilis, and what effect does it have when combining the expression control of CitZ and the expression control of acetoin synthase group? Is unknown.
本発明は、ＰＧＡを高生産することができる枯草菌変異株及びこれを用いたＰＧＡの生産技術を提供することに関する。 The present invention relates to providing a mutant strain of Bacillus subtilis capable of producing PGA at a high yield and a PGA production technique using the same.
本発明者は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）のゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株を用いてＰＧＡをより効率良く生産することができる微生物株を構築すべく検討した結果、クエン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化した場合、それのみではＰＧＡの生産性は殆ど変わらないが、クエン酸シンターゼ遺伝子の発現強化と共にアセトイン合成遺伝子群が欠失した枯草菌変異株では、アセトイン合成遺伝子群を欠失した枯草菌変異株に比べて優れたＰＧＡ生産能を有することを見出した。 The inventor has reported that the Bacillus subtilis Marburg No. As a result of investigating the construction of a microorganism strain capable of producing PGA more efficiently using a Bacillus subtilis mutant strain lacking a large region of the genome of 168 (Bacillus subtilis 168 strain), the expression of the citrate synthase gene was investigated. When enhanced, PGA productivity is almost unchanged by itself, but in the Bacillus subtilis mutant strain lacking the acetoin synthesis gene group with enhanced expression of the citrate synthase gene, the Bacillus subtilis mutation lacking the acetoin synthesis gene group It has been found that it has an excellent PGA production ability compared to the strain.
すなわち本発明は、以下の（１）〜（５）に係るものである。
（１）枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築され、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
（２）（１）の枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
（３）枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。
（４）組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
（５）（２）の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
That is, the present invention relates to the following (1) to (5).
(1) a Bacillus subtilis mutant,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region Having one or more selected regions of the deleted genome;
A Bacillus subtilis mutant strain that is constructed so that the citrate synthase gene is strongly expressed and at least one gene selected from the group consisting of the alsS gene and the alsD gene is deleted or inactivated.
(2) In the Bacillus subtilis mutant strain of (1), a poly-γ-glutamate synthase gene, or a poly-γ-glutamate synthase gene and a poly-γ-glutamate degrading enzyme gene are enhanced or introduced so that they can be expressed. Bacillus subtilis.
(3) A method for producing a Bacillus subtilis mutant,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region A step of constructing a gene so that the citrate synthase gene is strongly expressed in a Bacillus subtilis mutant strain having a genome in which one or more selected regions are deleted; A method comprising the step of deleting or inactivating at least one gene selected from the group consisting of an alsS gene and an alsD gene.
(4) A method for producing recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region A step of constructing a gene so that the citrate synthase gene is strongly expressed in a Bacillus subtilis mutant strain having a genome in which one or more selected regions are deleted; a step of deleting or inactivating at least one gene selected from the group consisting of an alsS gene and an alsD gene, and a poly-γ-glutamate synthase gene, or a poly-γ-glutamate synthase gene and poly-γ- A method comprising the step of enhancing or introducing a glutamate degrading enzyme gene so as to allow expression.
(5) A method for producing poly-γ-glutamic acid, comprising culturing the recombinant Bacillus subtilis of (2) and recovering poly-γ-glutamic acid from the culture.
本発明によれば、高いＰＧＡ生産能を有する枯草菌変異株が提供される。本発明の枯草菌変異株を用いることによりＰＧＡの効率的生産が実現できる。 According to the present invention, a Bacillus subtilis mutant strain having high PGA production ability is provided. Efficient production of PGA can be realized by using the Bacillus subtilis mutant strain of the present invention.
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。 The name of each gene and genomic region of Bacillus subtilis described in this specification is publicly available on the Internet ([bacillus.genome.ad.jp/], January 2006 in Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)). It is described based on Bacillus subtilis genome data updated on the 18th).
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ Ｖｅｒ．１１（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。 In this specification, the identity of an amino acid sequence and a nucleotide sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Lipman, DJ., Pearson. WR .: Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software Genetyx-Win Ver. 11 (software development) using the homology analysis (Search homology) program, the unit size to compare (ktup) is set to 2 and calculated.
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、アミノ酸配列では１〜１８個、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個であり、ヌクレオチド配列では１〜５６個、好ましくは１〜２８個、より好ましくは１〜１４個、さらに好ましくは１〜７個であり得る。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。 In this specification, unless otherwise defined, “one or several” used for amino acid or nucleotide deletion, substitution, addition or insertion in an amino acid sequence or nucleotide sequence means, for example, 1 to 18 amino acid sequences. , Preferably 1-9, more preferably 1-4, still more preferably 1-2, nucleotide sequence 1-56, preferably 1-28, more preferably 1-14, Preferably it may be 1-7. In the present specification, “addition” of amino acids or nucleotides includes addition of one or several amino acids or nucleotides to one and both ends of the sequence.
本明細書において、別途定義されない限り、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上、好ましくは約９０％以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、又は、６×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、６×ＳＳＣ、６５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。 In the present specification, unless otherwise defined, “stringent conditions” for hybridization are conditions that allow identification of a gene having a nucleotide sequence having a sequence identity of about 80% or more, preferably about 90% or more. It is. “Stringent conditions” include those described in Molecular Cloning-A Laboratory Manual THIRD EDITION (Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Those skilled in the art of hybridization can appropriately create stringent conditions by adjusting the salt concentration, temperature, etc. of the hybridization solution according to the nucleotide sequence, concentration, length, etc. of the probe. For example, the “stringent condition” is preferably 5 × SSC, 70 ° C. or higher, more preferably 5 × SSC, 85 ° C. or higher, or 6 × SSC, 60 ° C. as hybridization conditions. The above is preferable, 6 × SSC, 65 ° C. or more is more preferable, and the cleaning condition is preferably 1 × SSC, 60 ° C. or more, and more preferably 1 × SSC, 73 ° C. or more. The combination of the SSC and the temperature condition is merely an example, and those skilled in the art can realize appropriate stringency by appropriately combining the above or other factors that determine the stringency of hybridization.
本明細書において、遺伝子又は領域の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、遺伝子の翻訳開始点又は転写開始点からの上流領域及び終始コドンからの下流領域には限定されない。 In the present specification, upstream and downstream of a gene or region indicate a region continuing on the 5 'side and 3' side of the gene or region regarded as a target, respectively. Unless otherwise defined, upstream and downstream of a gene are not limited to the upstream region from the translation start point or transcription start point of the gene and the downstream region from the stop codon.
本明細書において、遺伝子の制御領域とは、下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。具体的には、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２−１３４６）。 In the present specification, a gene control region has a function of controlling expression of a downstream gene in a cell, and preferably a region having a function of constitutively expressing or highly expressing a downstream gene. Specifically, it can be defined as a region that exists upstream of the coding region in the gene and has a function of controlling the transcription of the gene by the interaction of RNA polymerase. Preferably, the gene regulatory region in this specification refers to a region of about 200 to 600 nucleotides upstream of the coding region in the gene. The control region includes a gene transcription initiation control region and / or a translation initiation control region, or a region from the transcription initiation control region to the translation initiation control region. The transcription initiation control region is a region containing a promoter and a transcription initiation point, and the translation initiation control region is a site corresponding to a Shine-Dalgarno (SD) sequence that forms a ribosome binding site together with the initiation codon (Shine, J., Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1974, 71: 1342-1346).
本明細書において、ＰＧＡの生産に関わる遺伝子（目的遺伝子）と制御領域とを「作動可能に連結する」とは、制御領域による遺伝子発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子と制御領域を作動可能に連結する方法としては、当該制御領域の下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。
また、本明細書において、目的遺伝子であるＰＧＡの生産に関わる遺伝子を導入した枯草菌変異株を組換え枯草菌といい、目的遺伝子は導入されていないが、目的遺伝子の発現能が優れた宿主として改良された枯草菌を枯草菌変異株という。
In the present specification, “operably linking” a gene (target gene) involved in PGA production and a control region refers to DNA on the DNA so that the function of controlling gene expression by the control region acts on the target gene. This refers to the arrangement of a control region and a target gene. Examples of the method of operably linking the target gene and the control region include a method of linking the target gene downstream of the control region.
In the present specification, a Bacillus subtilis mutant strain into which a gene related to the production of PGA, which is a target gene, is referred to as a recombinant Bacillus subtilis, and a host that has no target gene but has excellent expression ability of the target gene. Bacillus subtilis improved as a Bacillus subtilis mutant.
[１．枯草菌変異株の構築]
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築されており、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株である。
本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、クエン酸シンターゼ遺伝子を強発現させる遺伝子改変と、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化させる改変を加えることによって作製することができる。
[1. Construction of Bacillus subtilis mutants]
The Bacillus subtilis mutant strain of the present invention has a genome in which a large region on the genome of the Bacillus subtilis wild strain is deleted, is constructed so that the citrate synthase gene is strongly expressed, and the alsS gene and the alsD gene A Bacillus subtilis mutant strain in which at least one gene selected from the group consisting of is deleted or inactivated.
The Bacillus subtilis mutant of the present invention is selected from the group consisting of a genetic modification that strongly expresses a citrate synthase gene and an alsS gene and an alsD gene relative to a Bacillus subtilis mutant that lacks a large region of the genome. It can be made by adding a modification that deletes or inactivates at least one gene.
[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]
本発明の枯草菌変異株の親株となる、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８；本明細書において以下、枯草菌１６８株又は単に１６８株、あるいは野生株と称する）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の１以上が欠失している。
ここで示す「領域が欠失」とは、上記記載の遺伝子を両端として挟み込まれる領域を、両端の遺伝子を含めて欠失していることである。
[1-1. Bacillus subtilis mutant lacking genomic region]
A Bacillus subtilis mutant lacking a large genomic region, which is a parent strain of the Bacillus subtilis mutant of the present invention, is a wild strain of Bacillus subtilis (for example, Bacillus subtilis Marburg No. 168; hereinafter, 168 strains of Bacillus subtilis). Compared to the genome of 168 strain or wild strain), a large region in the genome is deleted. That is, in the genome of the Bacillus subtilis mutant strain, in the genome of the Bacillus subtilis wild strain, the profile6 (yoaV-yobO) region, the profile1 (ybbU-ybdE) region, the profile4 (yjcM-yjdJ) region, PBSX (ykdA-xlyA) ) Region, profile5 (ynxB-dut) region, profile3 (ydiM-ydjC) region, spb (yodU-ypqP) region, pks (pksA-ymaC) region, skin (spoIVCB-spoIIIC) region, pps (ppsE-ppsA) region , Profile2 (ydcL-ydeJ) region, ydcL-ydeK-ydhU region, yzB-yitD region, yunA-yurT region, cgeE-ypmQ region, yeK-yesX region, pd One or more of the regions selected from the group consisting of -rocR region, ycxB-sipU region, profile7 (yrkM-yraK or yrkS-yraK) region, sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region are deleted. doing.
“Region deletion” as used herein refers to deletion of a region sandwiched by the above-described gene at both ends, including the genes at both ends.
好ましくは、当該枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の全てを欠失している枯草菌ＭＧＢ８７４株（特開２００７−１３００１３号公報）や、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域からなる群より選択される領域の全てを欠失しているＯＡ１０５株が挙げられる。 Preferably, the Bacillus subtilis mutant is a prophage6 (yoaV-yobO) region, a prophage1 (ybbU-ybdE) region, a prophage4 (yjcM-yjdJ) region, or a PBSX (ykdA-xlyA) region in the genome of a Bacillus subtilis wild strain. , Profile5 (ynxB-dut) region, profile3 (ydiM-ydjC) region, spb (yodU-ypqP) region, pks (pksA-ymaC) region, skin (spoIVCB-spoIIIC) region, pps (ppsE-ppsA2) region (YdcL-ydeJ) region, ydcL-ydeK-ydhU region, yisB-yitD region, yunA-yurT region, cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-locR region Bacillus subtilis MGB874 strain lacking all of the region selected from the group consisting of the YcxB-sipU region, the profile7 (yrkS-yraK) region, the sbo-ywhH region, the yybP-yyaJ region and the yncM-fosB region (specially No. 2007-130013), and in the genome of Bacillus subtilis wild strain, the profile6 (yoaV-yobO) region, the profile1 (ybbU-ybdE) region, the profile4 (yjcM-yjdJ) region, the PBSX (ykdA-xlyA) region, profile5 (ynxB-dut) region, profile3 (ydiM-ydjC) region, spb (yodU-ypqP) region, pks (pksA-ymaC) region, skin (spoIVCB-spoIIIC) region, pps ( PSE-ppsA) region, prophage2 (ydcL-ydeJ) region, prophage7 (yrkM-yraK) OA105 strain lacking all region selected from the group consisting of area and the like.
ＯＡ１０５株は、特開２００７−１３００１３号公報に記載されているｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域を欠失した株（ＭＧＢ４６９株）に対して、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域をさらに欠失することにより、調製される。
なお、本明細書記載のＭＧＢ８７４株の欠失領域であるｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域及びｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域は、隣接した領域であり、特開２００７−１３００１３号公報に記載されているＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域と同じ領域である。
ＭＧＢ４６９株及びＭＧＢ８７４株は国立遺伝学研究所ＮＢＲＰ（ナショナルバイオリソースプロジェクト）より分譲可能となっている（http://www.shigen.nig.ac.jp/bsub/kaoListAction.do）。
The OA105 strain includes a profile6 (yoaV-yobO) region, a profile1 (ybbU-ybdE) region, a profile4 (yjcM-yjdJ) region, a PBSX (ykdA-xlyA) region, and a property5 (described in JP2007-130013A). ynxB-dut) region, profile3 (ydiM-ydjC) region, spb (yodU-ypqP) region, pks (pksA-ymaC) region, skin (spoIVCB-spoIIIC) region, pps (ppsE-ppsA) region, profile2 (ydcL) ydeJ) is prepared by further deleting the profile7 (yrkM-yraK) region with respect to the strain lacking the region (MGB469 strain).
The skin (spoIVCB-spoIIIC) region and the profile7 (yrkS-yraK) region, which are deletion regions of the MGB874 strain described in the present specification, are adjacent regions and are described in JP-A-2007-130013. This is the same region as the SKIN-Pro7 (spoIVCB-yraK) region.
The MGB469 strain and MGB874 strain can be sold by the National Institute of Genetics NBRP (National BioResource Project) (http://www.shigen.nig.ac.jp/bsub/kaoListAction.do).
上記ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、例えば、１６８株（ＮＢＲＣ １１１４７０）等の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノム配列を、公開されている枯草菌１６８株のゲノム配列と対比することにより決定することができる。枯草菌１６８株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のＢＳＯＲＦ ＤＢ、又はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２（[www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]）から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、１又は数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個）のヌクレオチドにおける天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において好ましくは８０％以上同一、さらにより好ましくは９０％以上同一、なお好ましくは９５％以上同一なゲノム領域であり得る。 A Bacillus subtilis mutant strain in which the large region of the genome is deleted can be prepared by deleting the above-described genomic region from any Bacillus subtilis strain such as 168 strain (NBRC 111470). The target genomic region to be deleted can be determined, for example, by comparing the genome sequence of any Bacillus subtilis strain with the published genome sequence of Bacillus subtilis 168 strain. The complete nucleotide sequence and genome information of Bacillus subtilis 168 strain can be obtained from the above-mentioned BSORF DB or GenBank: AL009126.2 ([www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]). Those skilled in the art can determine the target genomic region to be deleted based on the genomic information of Bacillus subtilis 168 obtained from these information sources. Here, the genomic region to be deleted is one or several (for example, 1 to 100, preferably 1 to 50) of the nucleotide sequence of the aforementioned genomic region in the publicly available Bacillus subtilis 168 strain. More preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5 nucleotides including natural or artificially induced deletions, substitutions, insertions, additions, etc. It can be a genomic region having a sequence. Alternatively, the genomic region to be deleted is preferably 80% or more identical, even more preferably 90% or more identical, and still more preferably 95%, in the nucleotide sequence with respect to the aforementioned genomic region in the publicly available Bacillus subtilis 168 strain. % Or more of the genome region.
あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表１に記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばＳＯＥ−ＰＣＲ法（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ：Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）等により調製された欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開２００７−１３００１３号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。 Alternatively, the genomic region to be deleted can be expressed as a region sandwiched between a pair of oligonucleotide sets shown in Table 1. The method for deleting the region described in Table 1 from the Bacillus subtilis genome is not particularly limited. For example, the region is prepared by SOE-PCR (splicing by overlap extension PCR: Gene, 1989, 77: 61-68) or the like. A double crossover method using the deleted DNA fragment. The procedure for preparing a mutant strain in which a predetermined genomic region has been deleted from a Bacillus subtilis wild strain by this method is described in detail in JP-A-2007-130013.
ＳＯＥ−ＰＣＲ法による欠失用ＤＮＡ断片の調製と当該欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図１に示す。初めに、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したＤＮＡ断片を調製する。 FIG. 1 shows an outline of procedures for preparing a deletion DNA fragment by the SOE-PCR method and deleting the target region by the double crossover method using the deletion DNA fragment. First, by the SOE-PCR method, a fragment corresponding to an about 0.1 to 3 kb region adjacent to the upstream of the target region to be deleted (referred to as an upstream fragment) and an about 0.1 to 3 kb adjacent to the downstream in the same manner A DNA fragment in which fragments corresponding to regions (referred to as downstream fragments) are linked is prepared. Preferably, in order to confirm the deletion of the target region, a DNA fragment in which a marker gene fragment such as a drug resistance gene is further linked between the upstream fragment and the downstream fragment is prepared.
まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片（図１中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Ｃｍ）の３断片を調製する。上流断片及び下流断片のＰＣＲ増幅の際には、後に連結される断片の末端１０〜３０ヌクレオチドの配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で連結させる場合、上流断片Ａの下流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ'の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ'の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。 First, by the first PCR, an upstream fragment A and a downstream fragment B of the region to be deleted and, if necessary, three fragments of a marker gene fragment (in FIG. 1, chloramphenicol resistance gene fragment Cm) are prepared. To do. In PCR amplification of the upstream fragment and the downstream fragment, a primer added with a sequence of terminal 10 to 30 nucleotides of the fragment to be ligated later is used. For example, when linking the upstream fragment A, the drug resistance marker gene fragment Cm, and the downstream fragment B in this order, the upstream side of the drug resistance marker gene fragment Cm is attached to the 5 ′ end of the primer that binds to the downstream end of the upstream fragment A. A sequence corresponding to 10 to 30 nucleotides is added (FIG. 1, primer DR1), and at the 5 ′ end of the primer that binds to the upstream end of the downstream fragment B, to the downstream 10 to 30 nucleotides of the drug resistance marker gene fragment Cm. The corresponding sequence is added (FIG. 1, primer DF2). When the upstream fragment A and the downstream fragment B are amplified by PCR using the primer set designed in this way, a region corresponding to the upstream side of the drug resistance marker gene fragment Cm is present on the downstream side of the amplified upstream fragment A ′. Thus, a region corresponding to the downstream side of the drug resistance marker gene fragment Cm is added to the upstream side of the amplified downstream fragment B ′.
次に、１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ'、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ'を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる。 Next, the upstream fragment A ′, the drug resistance marker gene fragment Cm, and the downstream fragment B ′ prepared by the first PCR are mixed and used as a template, and a primer that binds to the upstream side of the upstream fragment (FIG. 1, primer DF1) A second PCR is performed using a pair of primers consisting of a primer (FIG. 1, primer DR2) that binds to the downstream side of the downstream fragment. By this second PCR, a deletion DNA fragment D in which the upstream fragment A, the drug resistance marker gene fragment Cm, and the downstream fragment B are combined in this order can be amplified.
上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用ＤＮＡ断片を調製した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。 A deletion DNA fragment obtained by the above-described method or the like is inserted into a plasmid using an ordinary restriction enzyme and DNA ligase to construct a deletion introduction plasmid. Alternatively, after preparing a deletion DNA fragment in which the upstream fragment and the downstream fragment are directly linked, the deletion DNA fragment is inserted into a plasmid containing a drug resistance marker gene, so that the drug is added to the upstream fragment and the downstream fragment. A plasmid for introducing a deletion having a resistance marker gene fragment can be constructed.
上記手順で構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で２重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在する薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片で形質転換処理をした菌を、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。 The deletion-introducing plasmid constructed by the above procedure is introduced into Bacillus subtilis for which the genomic region is to be deleted by a conventional technique such as competent cell transformation. The introduction of the plasmid causes double crossover homologous recombination between the upstream and downstream fragments on the plasmid and the region homologous to those of the Bacillus subtilis genome, and the region to be deleted becomes a drug resistance marker gene. Replaced transformants are obtained (FIG. 1). The transformant can be selected using the expression of a marker gene such as a drug resistance gene present in the deletion DNA fragment as an indicator. For example, a bacterium that has been transformed with a chloramphenicol resistance gene fragment is cultured in a medium containing an antibiotic (such as chloramphenicol), and the grown colonies are recovered, so that the target region is deleted. A transformant substituted with a chloramphenicol resistance gene can be obtained. Furthermore, by extracting the genomic DNA of the transformant and performing PCR using this as a template, it can be confirmed that the target region has been deleted.
次に、得られた形質転換体から、ゲノムＤＮＡに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図２に示すような２段階相同組換え法を用いることができる（特開平２００９−２５４３５０号公報）。当該方法では、初めに第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（下流断片）が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したＤＮＡ断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第１のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第２のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図２を参照）。 Next, the marker gene inserted into the genomic DNA is removed from the obtained transformant. The removal procedure is not particularly limited, but a two-step homologous recombination method as shown in FIG. 2 can be used (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-254350). In this method, first, a DNA fragment (donor DNA) for the first homologous recombination is prepared. Although it does not specifically limit as a preparation method, The above-mentioned SOE-PCR method etc. are mentioned. Examples of donor DNA include an about 0.1 to 3 kb fragment (upstream fragment) corresponding to a region adjacent to the upstream of the marker gene region to be removed (ie, the deleted region) and a region adjacent to the downstream as well. A DNA fragment in which an approximately 0.1 to 3 kb fragment (downstream fragment) corresponding to is bound to a fragment in the downstream region of the marker gene to be removed can be used. Preferably, a DNA fragment in which a second marker gene or the like serving as an index for homologous recombination is inserted between the downstream fragment and the downstream region fragment of the first marker gene to be removed (see FIG. 2). reference).
次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第１のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した第２のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第２のマーカー遺伝子、第１のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図２参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第１のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。 Next, the prepared donor DNA is introduced into the transformant by a conventional technique such as competent cell transformation, and corresponds to the upstream fragment and the downstream region of the first marker gene on the transformant genome. Homologous recombination occurs between the regions (first homologous recombination). A transformant in which the desired homologous recombination has occurred can be selected using the expression of the second marker gene inserted into the donor DNA as an indicator. In the genomic DNA of a transformant in which the first homologous recombination has occurred appropriately, an upstream fragment, a downstream fragment, and, if necessary, a second marker gene, a first marker gene downstream region, and a downstream fragment are arranged in order. (See FIG. 2). In genomic DNA having such an arrangement, homologous recombination can occur spontaneously between the two downstream fragments (intragenomic homologous recombination). By this intragenomic homologous recombination, the region located between the two downstream fragments is deleted, whereby the first marker gene is removed from the transformant genome.
ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第１のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ，１９７０）。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第２のマーカーとしてｃｈｐＡ（ｍａｚＦ）遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる（特開２００９-２５４３５０号公報を参照）。 As a means for selecting a transformant in which homologous recombination has occurred in the genome, when the first marker gene is a drug resistance gene, a method of selecting a bacterium having no drug resistance can be mentioned. Penicillin antibiotics act bactericidally on proliferating cells but not non-proliferating cells. Therefore, if a bacterium is cultured in the presence of a drug and a penicillin antibiotic, a drug non-resistant bacterium that does not grow in the presence of the drug can be selectively concentrated (Methods in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, 1970). . Another means is a method of introducing a lethal gene. For example, if a lethal gene such as the chpA (mazF) gene is introduced into the bacterium as the second marker, a bacterium that has not undergone homologous recombination within the genome will die due to the action of the lethal gene. A transformant that has undergone the treatment can be selected. By extracting genomic DNA from the selected strain and performing PCR using this as a template, it can be confirmed that the target region has been deleted (see JP 2009-254350 A).
以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が一部又は全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。 As described above, a Bacillus subtilis mutant strain lacking a predetermined region on the genome can be prepared. Furthermore, by repeating this procedure, a Bacillus subtilis mutant strain in which a part or all of the above-described genomic region is deleted can be produced.
[１−２．クエン酸シンターゼ遺伝子の発現強化]
本発明の枯草菌変異株においては、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築されている。
クエン酸シンターゼ遺伝子とは、下記式で示されるように、アセチルＣｏＡの酢酸残基をオキサロ酢酸に付加し、クエン酸を合成する反応を触媒する活性（クエン酸シンターゼ活性）を有するタンパク質（クエン酸シンターゼ）をコードする遺伝子であり、枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子及びそれに相当する遺伝子が包含される。
[1-2. Enhanced expression of citrate synthase gene]
In the Bacillus subtilis mutant of the present invention, the gene is constructed so that the citrate synthase gene is strongly expressed.
The citrate synthase gene is a protein (citrate synthase activity) having an activity (citrate synthase activity) that catalyzes a reaction for adding citric acid by adding an acetic acid residue of acetyl CoA to oxaloacetate, as shown in the following formula. Synthase), and includes a Bacillus subtilis citrate synthase gene and a gene corresponding thereto.
枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子（ｃｉｔＺ遺伝子）は、遺伝子番号：ＢＧ１０８５５として特定され、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列からなる枯草菌クエン酸シンターゼ（ＣｉｔＺ）をコードする。 The Bacillus subtilis citrate synthase gene (citZ gene) is specified as gene number: BG10855, and encodes Bacillus subtilis citrate synthase (CitZ) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. To do.
枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外の微生物のｃｉｔＺ遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等のバチルス属微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとし、ストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物における枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子を同定することができる。 Examples of the gene corresponding to the Bacillus subtilis citrate synthase gene include the citZ gene of microorganisms other than Bacillus subtilis. Examples of microorganisms other than Bacillus subtilis include Bacillus atrophaeus, Bacillus methylotropicus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, and the like, and microorganisms other than these, such as Bacillus megaterium, are not limited. For example, a gene corresponding to the Bacillus subtilis citrate synthase gene is obtained by extracting genomic DNA from the above-mentioned microorganism and using a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof as a probe under stringent conditions. It can be identified by performing Southern hybridization. In addition, for example, a gene corresponding to the Bacillus subtilis citrate synthase gene in the microorganism is identified by comparing the nucleotide sequence of the microorganism genome with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 based on known genome sequence information can do.
例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ １９４２株のクエン酸シンターゼ遺伝子（遺伝子番号：ＥＡＴＲ１９４２＿０２３２０）（配列番号７、８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＡＳ４３．３株のクエン酸シンターゼ遺伝子（遺伝子番号：Ｂ９３８＿１３５４０）（配列番号９、１０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ７株のｃｉｔＺ遺伝子（配列番号１１、１２）は、枯草菌１６８株の枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子との配列同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ８４％、８２％、８２％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９３％、９４％、９４％である。これらは、枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。 For example, the citrate synthase gene of Bacillus atrophaeus 1942 strain (gene number: EATR1942 — 02320) (SEQ ID NO: 7, 8), the citrate synthase gene of Bacillus methylotropicus AS43.3 strain (gene number: B938 — 13540) (SEQ ID NO: 9, 10), The citZ gene of Bacillus amyloliquefaciens DSM7 strain (SEQ ID NOs: 11 and 12) has 84%, 82%, and 82% sequence identity with the Bacillus subtilis citrate synthase gene of Bacillus subtilis 168 strain, respectively, In the amino acid sequences encoded by them, they are 93%, 94% and 94%, respectively. These are exemplified as genes corresponding to the Bacillus subtilis citrate synthase gene.
したがって、枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Thus, the Bacillus subtilis citrate synthase gene or the equivalent gene includes the following:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and having citrate synthase activity;
(C) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having citrate synthase activity;
(D) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(E) a polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having citrate synthase activity;
(F) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having citrate synthase activity.
本発明において、クエン酸シンターゼ遺伝子を強発現させる遺伝子改変とは、当該遺伝子の発現が改変前と比較して増強するような遺伝子改変であればその手段は限定されない。例えば、改変前と比較して発現を増強できる制御領域（強発現制御領域）の制御下にクエン酸シンターゼ遺伝子を作動可能に連結させること、制御領域又は強発現制御領域と作動可能に連結されたクエン酸シンターゼ遺伝子を、細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に新たに導入すること等が挙げられる。好ましくは、野生型クエン酸シンターゼ遺伝子に加えて、強発現制御領域の制御下にあるクエン酸シンターゼ遺伝子をさらに導入することが挙げられる。
斯かる強発現制御領域としては、例えば、バシラス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、ｒＲＮＡオペロンの制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子（ｒｐｌＳ遺伝子等）の制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が例示されるが、特に限定されない。
In the present invention, the means for gene modification that strongly expresses the citrate synthase gene is not limited as long as the gene modification is such that expression of the gene is enhanced as compared with that before modification. For example, the citrate synthase gene is operably linked to a control region or a strong expression control region under the control of a control region (strong expression control region) that can enhance expression compared to before modification. For example, a citrate synthase gene may be newly introduced into the intracellular genome or plasmid. Preferably, in addition to the wild-type citrate synthase gene, a citrate synthase gene under the control of the strong expression control region may be further introduced.
Examples of such a strong expression control region include a control region of an α-amylase gene derived from a Bacillus bacterium, a control region of a protease gene, a control region of an rRNA operon, and a control region of a gene encoding a ribosomal protein (such as an rplS gene). , AprE gene regulatory region, spoVG gene regulatory region, Bacillus sp. Examples include the cellulase gene control region of KSM-S237 strain, the staphylococcus aureus-derived kanamycin resistance gene control region, the chloramphenicol resistance gene control region, and the like (all refer to JP2009-089708). However, it is not particularly limited.
強発現制御領域の制御下にあるクエン酸シンターゼ遺伝子をゲノム中にさらに導入する場合の手順を以下に例示する。
先ず、当該強発現制御領域の制御下にクエン酸シンターゼ遺伝子が発現されるように配置され、さらに宿主ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片として構築され得る。このＤＮＡ断片を上述した宿主に導入すれば、宿主ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、宿主を形質転換することができる。形質転換法としては、宿主となる微生物に応じて適切な、かつ一般的な方法を採用することができる。より具体的には、例えば、上流から、上述した強発現制御領域（例えば、ｓｐｏＶＧ遺伝子やｒｐｌＳ遺伝子制御領域）、クエン酸シンターゼ遺伝子の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製し、得られたＤＮＡ断片を用いて宿主を形質転換することが挙げられる。得られた形質転換体は、形質転換前の宿主と比べてクエン酸シンターゼ遺伝子を多数保有しているため、及び／又は強発現制御領域の制御下に配置されているため、該遺伝子の発現が増強又は付加される。
The procedure for further introducing a citrate synthase gene under the control of the strong expression control region into the genome is exemplified below.
First, it can be constructed as a DNA fragment that is arranged so that the citrate synthase gene is expressed under the control of the strong expression control region, and is further linked to a homologous region with the host genome. When this DNA fragment is introduced into the host described above, the DNA fragment is inserted into the host genome, and the host can be transformed. As a transformation method, an appropriate and general method can be adopted depending on the microorganism as a host. More specifically, for example, a fragment in which the above-described strong expression control region (for example, spoVG gene or rplS gene control region) and citrate synthase gene are arranged in this order is prepared from the upstream, and the fragment of the parental genome is further added to the fragment. A DNA fragment is prepared by ligating a homologous region with a part, and a host is transformed with the obtained DNA fragment. The obtained transformant has a large number of citrate synthase genes compared to the host before transformation and / or is placed under the control of a strong expression control region, so that the expression of the gene is Augmented or added.
[１−３．ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子の欠失又は不活性化]
本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。
ここで、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子は、アセトイン合成に関わる枯草菌遺伝子である。ａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子は、アセトイン合成遺伝子群（ａｌｓＳＤ）として１つのオペロンを形成している。本発明においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されるのが好ましい。
[1-3. Deletion or inactivation of alsS gene and alsD gene]
In the Bacillus subtilis mutant of the present invention, at least one gene selected from the group consisting of the alsS gene and the alsD gene is deleted or inactivated.
Here, the alsS gene and the alsD gene are Bacillus subtilis genes involved in acetoin synthesis. The alsS gene and the alsD gene form one operon as an acetoin synthesis gene group (alsSD). In the present invention, it is preferable that both the alsS gene and the alsD gene are deleted or inactivated.
ａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子のＢＳＯＲＦ ＤＢにおける登録番号及びコードするタンパク質を以下の表２に示す。 Table 2 below shows the registration numbers of the alsS gene and the alsD gene in the BSORF DB and the encoded proteins.
ａｌｓＳ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the alsS gene include the following.
(G) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(H) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and having α-acetolactic acid synthase activity;
(I) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and encodes a protein having α-acetolactic acid synthase activity;
(J) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
(K) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having α-acetolactic acid synthase activity;
(L) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having α-acetolactic acid synthase activity.
また、ａｌｓＤ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｍ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Moreover, the following are mentioned as an alsD gene.
(M) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(N) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and encoding a protein having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(O) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and encodes a protein having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(P) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(Q) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(R) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having α-acetolactic acid decarboxylase activity.
また、本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失又は不活性化に加え、さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化することが、ＰＧＡの生産性をさらに向上させる点で好ましい。さらに、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されるのに加え、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が共に欠失又は不活性化されるのがより好ましい。 Further, in the Bacillus subtilis mutant of the present invention, in addition to the deletion or inactivation of at least one gene selected from the group consisting of the alsS gene and the alsD gene, the ackA gene, the pta gene, the ydaP gene and the ldh gene Deletion or inactivation of at least one gene selected from the group consisting of is preferable from the viewpoint of further improving PGA productivity. Furthermore, it is more preferable that the ackA gene, the pta gene, the ydaP gene, and the ldh gene are both deleted or inactivated in addition to the deletion or inactivation of both the alsS gene and the alsD gene.
ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子及びｙｄａＰ遺伝子は酢酸合成に関わる遺伝子で、ｌｄｈ遺伝子は乳酸合成に関わる遺伝子である。各遺伝子のＢＳＯＲＦ ＤＢにおける登録番号及びコードするタンパク質を以下の表３に示す。当業者は、当該ＢＳＯＲＦ ＤＢの情報に基づいて、親株における上記遺伝子を同定することができる。 The ackA gene, the pta gene and the ydaP gene are genes involved in acetic acid synthesis, and the ldh gene is a gene involved in lactic acid synthesis. The registration numbers in the BSORF DB of each gene and the encoded proteins are shown in Table 3 below. A person skilled in the art can identify the gene in the parent strain based on the information in the BSORF DB.
本発明において、ａｃｋＡ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ａ１）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ａ２）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ３）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ４）配列番号１８０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ５）配列番号１８０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ６）配列番号１８０に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
In the present invention, examples of the ackA gene include the following.
(A1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 179;
(A2) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 179 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and encoding a protein having acetate kinase activity;
(A3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 179 and encodes a protein having acetate kinase activity;
(A4) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 180;
(A5) a polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 180, and encoding a protein having acetate kinase activity;
(A6) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 180 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having acetate kinase activity.
また、ｌｄｈ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｂ１）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ３）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ４）配列番号１８２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ５）配列番号１８２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ６）配列番号１８２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the ldh gene include the following.
(B1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 181;
(B2) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 181 A polynucleotide encoding a protein comprising a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and having L-lactate dehydrogenase activity;
(B3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 181 and encodes a protein having L-lactate dehydrogenase activity;
(B4) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 182;
(B5) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 182 and having L-lactic acid dehydrogenase activity;
(B6) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 182 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having L-lactate dehydrogenase activity.
また、ｐｔａ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｃ１）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ３）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ４）配列番号１８４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ５）配列番号１８４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ６）配列番号１８４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the pta gene include the following.
(C1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 183;
(C2) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 183 A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having phosphate acetyltransferase activity;
(C3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 183 and encodes a protein having phosphate acetyltransferase activity;
(C4) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 184;
(C5) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 184 and having phosphate acetyltransferase activity;
(C6) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 184 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having phosphate acetyltransferase activity.
また、ｙｄａＰ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｄ１）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ２）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ３）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ４）配列番号１８６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ５）配列番号１８６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ６）配列番号１８６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the ydaP gene include the following.
(D1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 185;
(D2) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 185 A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having pyruvate oxidase activity;
(D3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 185 and encodes a protein having pyruvate oxidase activity;
(D4) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 186;
(D5) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 186 and having pyruvate oxidase activity;
(D6) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 186 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having pyruvate oxidase activity.
上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、該遺伝子のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該遺伝子の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。上記遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、該遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別のヌクレオチド配列での置換若しくは挿入による、当該プロモーターの不活性化が挙げられる。上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したＳＯＥ−ＰＣＲ法や相同組換え法、などを挙げることができる。欠失又は不活性化させる遺伝子の枯草菌ゲノム上での位置やヌクレオチド配列は、上述したＢＳＯＲＦ ＤＢにて確認することができる。 Means for deleting or inactivating the gene include mutagenesis for one or more nucleotides on the nucleotide sequence of the gene, substitution or insertion of another nucleotide sequence for the nucleotide sequence, or sequence of the gene Deletion of a part or all of. Examples of means for introducing a mutation that inhibits transcription of the gene include mutagenesis in the promoter region of the gene, and inactivation of the promoter by substitution or insertion with another nucleotide sequence. Specific methods for the above-described mutagenesis and nucleotide sequence substitution or insertion include ultraviolet irradiation, site-specific mutagenesis, and the above [1-1. Examples include the SOE-PCR method and the homologous recombination method described in “Genomic region-deficient Bacillus subtilis mutant strain”. The position or nucleotide sequence of the gene to be deleted or inactivated on the Bacillus subtilis genome can be confirmed by the above-described BSORF DB.
以上の手順で、本発明の枯草菌変異株を作製することができるが、当該枯草菌変異株は、最終的に得られた微生物において、上述したゲノムの大領域の欠失、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するような遺伝子構築、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失又は不活性化が達成されていればよく、それぞれの遺伝子改変・導入工程の順序は特に限定されない。例えば、上述したゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、上述した手順で所定の遺伝子を強発現するように改変し、次いで上述した手順で所定の遺伝子を欠失又は不活性化して製造されてもよく、あるいは、上述したゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、上述した手順で所定の遺伝子を欠失又は不活性化し、次いで上述した手順で所定の遺伝子を強発現するように改変して製造されてもよい。好ましくは、ゲノムの大領域が欠失したゲノム欠失株に対して、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築された枯草菌変異株を親株とし、これにａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化することにより製造できる。 The Bacillus subtilis mutant strain of the present invention can be produced by the above procedure. The Bacillus subtilis mutant strain is a microbial citrate synthase gene as described above. It is only necessary to achieve gene construction that strongly expresses and deletion or inactivation of at least one gene selected from the group consisting of the alsS gene and the alsD gene, and the order of the respective gene modification / introduction steps Is not particularly limited. For example, for a Bacillus subtilis mutant lacking a large region of the genome described above, the predetermined gene is modified to be strongly expressed by the procedure described above, and then the predetermined gene is deleted or inactivated by the procedure described above. Alternatively, for a Bacillus subtilis mutant strain in which a large region of the genome described above has been deleted, a predetermined gene is deleted or inactivated by the procedure described above, and then a predetermined gene is determined by the procedure described above. The gene may be modified so as to be strongly expressed. Preferably, a Bacillus subtilis mutant that has been constructed so that the citrate synthase gene is strongly expressed is a parent strain for a genome-deficient strain in which a large region of the genome has been deleted, and this comprises an alsS gene and an alsD gene. It can be produced by deleting or inactivating at least one gene selected from the group.
[２．組換え枯草菌の構築]
本発明の組換え枯草菌は、上述したクエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築され、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化され、さらに目的とするＰＧＡ合成酵素遺伝子、又はＰＧＡ合成酵素遺伝子及びＰＧＡ分解酵素遺伝子（以下、「目的遺伝子」という）が発現可能なように強化又は導入されたものである。なお、本発明の目的遺伝子が発現可能なように導入された組換え枯草菌には、本来、目的遺伝子が発現している枯草菌において、本発明に関わる遺伝子改変がなされた枯草菌が含まれる。
[2. Construction of recombinant Bacillus subtilis
The recombinant Bacillus subtilis of the present invention is constructed so that the above-described citrate synthase gene is strongly expressed, and at least one gene selected from the group consisting of the alsS gene and the alsD gene is deleted or inactivated. Further, the target PGA synthase gene, or the PGA synthase gene and the PGA degrading enzyme gene (hereinafter, referred to as “target gene”) is enhanced or introduced so that it can be expressed. The recombinant Bacillus subtilis introduced so that the target gene of the present invention can be expressed includes Bacillus subtilis that has been genetically modified according to the present invention in the Bacillus subtilis originally expressing the target gene. .
[２−１．ＰＧＡ合成酵素遺伝子]
ＰＧＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ（配列番号１３）、ｐｇｓＣ（配列番号１５）、ｐｇｓＡ（配列番号１７）及びｐｇｓＥ（配列番号１９）、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が挙げられ、好ましくは、少なくとも枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とを含む組み合わせであり、より好ましくは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせ、あるいは枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせである。
[2-1. PGA synthase gene]
Examples of the PGA synthase gene include a Bacillus subtilis gene pgsB (SEQ ID NO: 13), pgsC (SEQ ID NO: 15), pgsA (SEQ ID NO: 17) and pgsE (SEQ ID NO: 19), and a group consisting of genes corresponding thereto. And at least one selected gene, preferably a combination comprising at least a Bacillus subtilis pgsB gene or an equivalent gene thereof, and a Bacillus subtilis pgsC gene or an equivalent gene thereof, more preferably a Bacillus subtilis pgsB gene or an equivalent thereof. Combination of equivalent gene and Bacillus subtilis pgsC gene or its equivalent gene, Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene, Bacillus subtilis pgsC gene or its equivalent gene, Bacillus subtilis pgsA gene or its equivalent gene, Bacillus subtilis pgsE Combination with a gene or its equivalent gene It is not.
枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１４に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％、例えば、５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the Bacillus subtilis pgsB gene or a gene equivalent thereto include the following:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13;
(B) at least 62%, for example, 62% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 Is 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more. A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence and having an amide ligase activity;
(C) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 and encodes a protein having amide ligase activity;
(D) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;
(E) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and having amide ligase activity;
(F) at least 55%, for example, 55% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 Is 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having 99% or more identity and having an amide ligase activity.
枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'）配列番号１５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号１５に示すヌクレオチド配列と少なくとも５９％、例えば、５９％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号１５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号１６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号１６に示すアミノ酸配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the Bacillus subtilis pgsC gene or a gene corresponding thereto include the following:
(A ′) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15;
(B ′) at least 59%, for example, 59% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 Preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably A polynucleotide encoding a protein comprising a nucleotide sequence having an identity of 99% or more and having a function of generating PGA in the presence of a protein encoded by the Bacillus subtilis pgsB gene or a gene corresponding thereto;
(C ′) in the presence of a protein that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 and that is encoded by the Bacillus subtilis pgsB gene or a gene corresponding thereto. A polynucleotide encoding a protein having a function of generating PGA;
(D ′) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16;
(E ′) Presence of a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 and encoded by the Bacillus subtilis pgsB gene or a gene corresponding thereto. A polynucleotide encoding a protein having the function of generating PGA below;
(F ′) at least 51%, for example, 51% or more, preferably 55% or more, more preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 Preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably Encodes a protein having an amino acid sequence having an identity of 98% or more, more preferably 99% or more and having a function of generating PGA in the presence of the protein encoded by the Bacillus subtilis pgsB gene or a gene corresponding thereto. Polynucleotide.
枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ''）配列番号１７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号１７に示すヌクレオチド配列と少なくとも４８％、例えば、４８％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号１７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号１８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも３０％、例えば、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the Bacillus subtilis pgsA gene or a gene equivalent thereto include the following:
(A ″) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17;
(B ″) at least 48%, for example, 48% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17. More preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more Preferably, PGA is generated in the presence of the nucleotide sequence having identity of 98% or more, more preferably 99% or more, and in the presence of the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene and the Bacillus subtilis pgsC gene or its equivalent gene. A polynucleotide encoding a protein having the function of:
(C ″) hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17, and the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene and the Bacillus subtilis pgsC gene or its A polynucleotide encoding a protein having a function of generating PGA in the presence of a corresponding gene;
(D ″) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18;
(E ″) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene and the Bacillus subtilis pgsC gene Or a polynucleotide encoding a protein having a function of generating PGA in the presence of an equivalent gene;
(F ″) at least 30%, for example, 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18. More preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more Preferably, PGA is produced in the presence of the amino acid sequence having an identity of 98% or more, more preferably 99% or more, and in the presence of the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene and the Bacillus subtilis pgsC gene or its equivalent gene. A polynucleotide encoding a protein having a function.
枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'''）配列番号１９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'''）配列番号１９に示すヌクレオチド配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'''）配列番号１９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'''）配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'''）配列番号２０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'''）配列番号２０に示すアミノ酸配列と少なくとも３５％、例えば、３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the Bacillus subtilis pgsE gene or a gene equivalent thereto include the following:
(A ′ ″) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19;
(B ′ ″) at least 51%, for example, 51% or more, preferably 55% or more, more preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19. , More preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, More preferably 98% or more, more preferably 99% or more of the nucleotide sequence, and the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene, the Bacillus subtilis pgsC gene or its equivalent gene, and the Bacillus subtilis pgsA A polynucleotide encoding a protein having a function of generating PGA in the presence of a gene or an equivalent gene thereof Plastid;
(C ′ ″) hybridizing under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19, and the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene, and the Bacillus subtilis pgsC gene Or a polynucleotide encoding a protein having a function of generating PGA in the presence of the Bacillus subtilis pgsA gene or an equivalent gene thereof;
(D ′ ″) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20;
(E ′ ″) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene, and the Bacillus subtilis a polynucleotide encoding a protein having a function of generating PGA in the presence of the pgsC gene or its equivalent gene and the Bacillus subtilis pgsA gene or its equivalent gene;
(F ″ ′) at least 35%, for example, 35% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 , More preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, More preferably 98% or more, more preferably 99% or more of the amino acid sequence, and the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene, the Bacillus subtilis pgsC gene or its equivalent gene, and the Bacillus subtilis pgsA gene Alternatively, a polynucleotide encoding a protein having a function of generating PGA in the presence of an equivalent gene.
上記において、タンパク質の「アミドリガーゼ活性」は、グルタミン酸、及びＡＴＰ又はＧＴＰを基質とし、これに塩化マンガンを加えた反応溶液中におけるＰＧＡの生成を検出することにより測定することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００２，１８４：３３７−３４３）。また、上述の枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「アミドリガーゼ活性」とは、当該ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子を、上記ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とともに枯草菌又はその変異株に導入した際に、当該株におけるＰＧＡの生産と菌体外への分泌をもたらす能力であり得る。
所定の微生物におけるＰＧＡ生産能の評価は、例えば、グルタミン酸又はその塩を含有するＰＧＡ生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＰＧＡを検出する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，６０：２５５−２５８）；酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：１６８４−１６８７）；培養液から精製し乾燥重量を求める定量法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９，２６３：６−１２）；ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５７：１２１２−１２１３）等によって行うことができる。
In the above, “amide ligase activity” of a protein can be measured by detecting the production of PGA in a reaction solution in which glutamic acid and ATP or GTP are used as a substrate and manganese chloride is added thereto (J. Bacteriol). , 2002, 184: 337-343). The “amide ligase activity” of the protein encoded by the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene refers to the introduction of the pgsB gene or its equivalent gene into Bacillus subtilis or its mutant strain together with the pgsC gene or its equivalent gene. In this case, it may be the ability to cause production of PGA and secretion outside the cell in the strain.
Evaluation of PGA production ability in a predetermined microorganism is, for example, a method of visually observing a translucent viscous substance formed around a colony when cultured on a PGA production agar medium containing glutamic acid or a salt thereof; SDS-PAGE (Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996, 60: 255-258); Method for quantification using an amino acid analyzer after acid hydrolysis (Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, 61: 1684-) 1687); Quantification method for purification from culture broth and determination of dry weight (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 263: 6-12); Quantification / qualitative analysis by HPLC (high performance liquid chromatography) using a gel filtration column Law Biosci.Biotechnol.Biochem, 1993,57:. 1212-1213) can be carried out by, for example.
また、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ、及びｐｇｓＥの各遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ合成に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、ＰＧＡ生産性微生物であってもＰＧＡ非生産性微生物であってもよく、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ等のバチルス属微生物、及びＮａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１３、１５、１７又は１９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１３、１５、１７又は１９で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物における枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子を同定することができる。 Further, examples of genes corresponding to genes of Bacillus subtilis pgsB, pgsC, pgsA, and pgsE include genes involved in PGA synthesis of microorganisms belonging to the genus Bacillus other than Bacillus subtilis or other genera. Microorganisms other than Bacillus subtilis may be PGA-producing microorganisms or non-PGA-producing microorganisms, for example, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus megathium, Bacillus anthracis, etc. Examples include, but are not limited to, Naturalba aegyptica, Hydra, Oceanobacillus iheyensis, and the like. For example, for a gene corresponding to Bacillus subtilis pgsB, pgsC, pgsA or pgsE, genomic DNA is extracted from the above-mentioned microorganism, and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17 or 19 or a fragment thereof is probed. Can be identified by performing Southern hybridization. Further, for example, by comparing the nucleotide sequence of the genome of the microorganism with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17 or 19 based on known genome sequence information, Bacillus subtilis pgsB, pgsC, A gene corresponding to pgsA or pgsE can be identified.
例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｓＣ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０１遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＢ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ９９．９％、７８％、８１％及び６２％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９９．７％、８９％、９３％及び５５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるＰＧＡ生産において利用できることが示されている（特開２０１０−２１３６６４号公報）。 For example, Bacillus sp. PgsB gene of KSM-366 strain (FERM BP-6262), pgsB gene of Bacillus licheniformis ATCC14580 strain, pwsB gene of Bacillus amyloliquefaciens strain 16 The sexes are 99.9%, 78%, 81% and 62% in the nucleotide sequence, respectively, and 99.7%, 89%, 93% and 55% in the amino acid sequence encoded by them, respectively. These are exemplified as genes corresponding to the Bacillus subtilis pgsB gene, and specifically, it has been shown that they can be used in PGA production by Bacillus subtilis (JP 2010-213664 A).
また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＣ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＣ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｔＡ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０２遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＣ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ１００％、７８％、８３％及び５９％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ１００％、８９％、９３％及び５１％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるＰＧＡ生産において利用できることが示されている（特開２０１０−２１３６６４号公報）。 For example, Bacillus sp. The pgsC gene of KSM-366 strain (FERM BP-6262), the pgsC gene of Bacillus licheniformis ATCC14580 strain, the ywtA gene of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 strain, and the Bacillus strain HB8 Sex is 100%, 78%, 83% and 59% in the nucleotide sequence, respectively, and 100%, 89%, 93% and 51% in the amino acid sequence encoded by them, respectively. These are exemplified as genes corresponding to the Bacillus subtilis pgsC gene, and specifically, it has been shown that they can be used in PGA production by Bacillus subtilis (JP 2010-213664 A).
また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＡ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＡ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｔＢ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ２９１７遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＡ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ１００％、６８％、７５％及び４８％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ１００％、６７％、７８％及び３０％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子として例示される（特開２０１０−２１３６６４号公報）。 For example, Bacillus sp. The pgsA gene of KSM-366 strain (FERM BP-6262), the pgsA gene of Bacillus licheniformis ATCC14580 strain, the ywtB gene of Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42 strain 16 and the Oceanbacillus strain 17 The sexes are 100%, 68%, 75% and 48%, respectively, in the nucleotide sequence and 100%, 67%, 78% and 30%, respectively, in their encoded amino acid sequence. These are exemplified as a gene corresponding to the Bacillus subtilis pgsA gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2010-213664).
また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＥ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｐｇｓＥ遺伝子、及びＢａｃｉｌｌｓｕ ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｈ９４０１株のｃａｐＥ遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＥ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ６３％、７６％及び５１％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ４７％、７２％及び３５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。 Further, for example, the pgsE gene of Bacillus licheniformis ATCC 14580 strain, the pgsE gene of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 strain, and the capE gene of Bacillus anthracis H9401 strain are pgs of the E. coli strain 168, % And 51%, and 47%, 72% and 35%, respectively, in their encoded amino acid sequences. These are exemplified as genes corresponding to the Bacillus subtilis pgsE gene.
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢＣＡＥに相当するバチルス属又は他の属に属する微生物の遺伝子の具体的な例としては、下記表４に示す遺伝子が挙げられる。 Specific examples of genes of microorganisms belonging to the genus Bacillus or other genera corresponding to the Bacillus subtilis gene pgsBCAE include the genes shown in Table 4 below.
好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるＰＧＡ合成酵素遺伝子は、上記（ａ）〜（ｆ）、（ａ'）〜（ｆ'）、（ａ''）〜（ｆ''）及び（ａ'''）〜（ｆ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、少なくとも上記（ａ）〜（ｆ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、上記（ａ'）〜（ｆ'）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせを含む。また好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、少なくとも上記（ａ）で表した遺伝子と、（ａ'）で表した遺伝子との組み合わせを含む。さらに好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記（ａ）及び（ａ'）で表した遺伝子の組み合わせであるか、又は上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子の組み合わせである。 In a preferred embodiment, the PGA synthase genes that are forcibly enhanced or introduced in the Bacillus subtilis mutant strain of the present invention are the above (a) to (f), (a ′) to (f ′), (a ″). ) To (f ″) and (a ′ ″) to (f ′ ″), at least one selected from the group consisting of genes, preferably at least the above (a) to (f) And a combination of at least one selected from the group consisting of the genes represented by (a ′) to (f ′) and at least one selected from the group consisting of the genes represented by (a ′) to (f ′). Also preferably, the gene to be enhanced or introduced so that it can be expressed is at least one selected from the group consisting of the genes represented by (a), (a ′), (a ″) and (a ′ ″) above. More preferably, a combination of at least the gene represented by (a) and the gene represented by (a ′) is included. More preferably, the gene to be enhanced or introduced so that it can be expressed is a combination of the genes represented by (a) and (a ′) above, or (a), (a ′), (a ″) above. And a combination of genes represented by (a ′ ″).
別の好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるＰＧＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、配列番号１３、１５、１７、１９並びに２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つが挙げられ、好ましくは、少なくとも配列番号１３、２３、２９、３７、４５及び５１のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１５、２５、３１、３９、４７及び５３のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせを含む。より好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、配列番号１３、２３、２９、３７、４５及び５１のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１５、２５、３１、３９、４７及び５３のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１７、２７、３３、４１、４９及び５５のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１９、３５、４３及び５７のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせである。 In another preferred embodiment, the PGA synthase gene that can be expressed or enhanced in the Bacillus subtilis mutant strain of the present invention includes, for example, SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19 and 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, and at least one of the genes consisting of the sequence shown in FIG. A gene consisting of at least one of the genes shown in any of Nos. 13, 23, 29, 37, 45 and 51 and a sequence shown in any of SEQ ID Nos. 15, 25, 31, 39, 47 and 53 A combination with at least one of the above. More preferably, the gene to be enhanced or introduced so that expression is possible is at least one of the genes consisting of the sequences shown in any of SEQ ID NOs: 13, 23, 29, 37, 45 and 51, and SEQ ID NOs: 15, 25, At least one of the genes consisting of the sequence shown in any of 31, 39, 47 and 53 and at least one of the genes consisting of the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 17, 27, 33, 41, 49 and 55 And at least one of the genes consisting of the sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 19, 35, 43 and 57.
[２−２．ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子]
ＰＧＡ合成酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌においては、さらにＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子が発現可能に強化又は導入されるのが好ましい。微生物がＰＧＡを高生産すると培地の粘度が高まり、その結果、微生物の生存やＰＧＡの生産性に悪影響が及ぶ場合がある。例えば、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が発現可能に強化又は導入されることで、低分子化されたＰＧＡが生産され、培養液の粘度を抑制することにより、ＰＧＡの高生産に伴う上記課題を解決することができる。
したがって、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子（配列番号２１）又はそれに相当する遺伝子が挙げられる。
[2-2. Gene encoding PGA degrading enzyme]
In the recombinant Bacillus subtilis in which the PGA synthase gene is enhanced or introduced so that it can be expressed, it is preferable that the gene encoding the PGA degrading enzyme is further enhanced or introduced so that it can be expressed. When microorganisms produce PGA at a high level, the viscosity of the medium increases, and as a result, the survival of microorganisms and the productivity of PGA may be adversely affected. For example, the Bacillus subtilis pgdS gene or a gene corresponding thereto is strengthened or introduced so that it can be expressed, thereby producing a low molecular weight PGA. The problem can be solved.
Therefore, the gene encoding PGA-degrading enzyme includes the Bacillus subtilis pgdS gene (SEQ ID NO: 21) or a gene corresponding thereto.
枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ分解に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物の枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子は、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子に関して上述したのと同様の手順で、配列番号２４で示されるヌクレオチド配列をもとに探索又は同定することができる。枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当するバチルス属微生物遺伝子の具体的な例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号５９）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号６１）が挙げられる。 Examples of the gene corresponding to the Bacillus subtilis pgdS gene include genes involved in PGA degradation of microorganisms belonging to the genus Bacillus other than Bacillus subtilis or other genera. A gene corresponding to the Bacillus subtilis pgdS gene of a microorganism other than Bacillus subtilis can be searched or identified based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 in the same procedure as described above for the pgsBCAE gene. Specific examples of the Bacillus microorganism gene corresponding to the Bacillus subtilis pgdS gene include the pgdS gene (SEQ ID NO: 59) of Bacillus licheniformis ATCC 14580 and the pgdS gene (SEQ ID NO: 61) of Bacillus amyloliquefaciens FZB42.
枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ｇ）配列番号２１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２１に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２２に示すアミノ酸配列と少なくとも５７％、例えば、５７％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the Bacillus subtilis pgdS gene or a gene equivalent thereto include the following:
(G) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21;
(H) at least 62%, for example, 62% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 Is 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more. A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence and having PGA-degrading activity;
(I) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 and encodes a protein having PGA degrading activity;
(J) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22;
(K) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 and having PGA degrading activity;
(L) at least 57%, for example, 57% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 Is 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably A polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having an identity of 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more and having PGA degrading activity.
好ましい実施形態において、本発明の組換え枯草菌において発現可能なように強化又は導入されるＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子は、上記（ｇ）〜（ｌ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、上記（ｇ）で表した遺伝子である。 In a preferred embodiment, the gene encoding a PGA-degrading enzyme that is fortified or introduced so that it can be expressed in the recombinant Bacillus subtilis of the present invention is selected from the group consisting of the genes represented by (g) to (l) above. And preferably the gene represented by (g) above.
別の好ましい実施形態において、枯草菌ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子は、配列番号２１、５９及び６１のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つである。 In another preferred embodiment, the gene encoding Bacillus subtilis PGA degrading enzyme is at least one of the genes consisting of the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 21, 59, and 61.
[２−３．ＰＧＡの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入]
ＰＧＡの生産に関わる遺伝子（目的遺伝子）を発現可能なように強化又は導入するとは、本発明の枯草菌変異株において、目的遺伝子が少なくとも発現可能な状態に置かれることを意味し、当該遺伝子が本発明の枯草菌変異株中に発現しているか否かは問われない。
斯かる目的遺伝子の発現可能な強化又は導入は、親株のゲノム上の目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の制御領域配列を強制御領域に置換すること、あるいは、強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含む断片を、親株のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって成すことができる。またあるいは、親株中に複数の目的遺伝子を発現可能に存在させる改変により成すこともできる。
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入するための手順の一例を以下に記載する。
[2-3. Reinforcement or introduction of genes related to PGA production]
Enhancing or introducing a gene related to PGA production (target gene) so that it can be expressed means that in the mutant strain of Bacillus subtilis of the present invention, the target gene is placed in a state where it can be expressed at least. It does not matter whether it is expressed in the Bacillus subtilis mutant of the present invention.
Such expression enhancement or introduction of the target gene can be achieved by replacing the control region sequence of the target gene (eg, pgsBCAE gene) on the genome of the parent strain with a strong control region, or operably linked to the strong control region. A fragment containing the target gene can be introduced into the genome of the parent strain or into a plasmid. Alternatively, it can also be made by modifying a parent strain so that a plurality of target genes can be expressed.
An example of a procedure for enhancing or introducing a target gene so that it can be expressed is described below.
（１）目的遺伝子が制御領域と作動可能に連結され、さらに親株ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片を構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ｓｐｏＶＧ遺伝子制御領域、ｒｒｎＯオペロン制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製する。次いで、このＤＮＡ断片を親株に導入すれば、親株ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。 (1) A DNA fragment is constructed in which a target gene is operably linked to a control region and is further linked to a homologous region with the parental genome. For example, from the upstream, a fragment in which a control region (eg, spoVG gene control region, rrnO operon control region) and a target gene (eg, pgsBCAE gene) are arranged in this order is prepared, and further, a fragment of the parental genome is added to the fragment. DNA fragments are prepared by joining homologous regions. Subsequently, when this DNA fragment is introduced into the parent strain, the DNA fragment is inserted into the parent strain genome, and the parent strain can be transformed. The resulting transformant has an increased expression level of the target gene compared to the strain before transformation.
（２）制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含むベクターを構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ＫＳＭ−Ｓ２３７のセルラーゼ遺伝子の制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣ遺伝子）の順で配置したＤＮＡを含むベクターを調製する。次いで、このベクターを親株に導入すれば、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。 (2) Construct a vector containing the gene of interest operably linked to the control region. For example, a vector containing DNA arranged in the order of a control region (for example, a control region of a cellulase gene of KSM-S237) and a target gene (for example, a pgsBC gene) is prepared from upstream. Subsequently, the parent strain can be transformed by introducing this vector into the parent strain. The resulting transformant has an increased expression level of the target gene compared to the strain before transformation.
ここで、目的遺伝子の発現に使用され得る制御領域は、好ましくは、宿主内において下流の目的遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流の目的遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する制御領域である。また好ましくは、目的遺伝子の野生型の制御領域と比較して、目的遺伝子の発現を強化することができる制御領域（強制御領域）である。 Here, the control region that can be used for the expression of the target gene preferably has a function of increasing the expression of the downstream target gene in the host, and more preferably, the downstream target gene is constitutively expressed or highly expressed. This is a control area having a function to be performed. Also preferred is a control region (strong control region) that can enhance expression of the target gene as compared to the wild type control region of the target gene.
ＰＧＡ合成酵素遺伝子、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現に使用され得る制御領域の例としては、バチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、ｒｒｎＯオペロン制御領域、ｔｕｆＡ遺伝子制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が挙げられる。 Examples of control regions that can be used for expression of a gene encoding a PGA synthase gene and a PGA-degrading enzyme include a control region of an α-amylase gene derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus, a control region of a protease gene, an rrnO operon control region, tufA Gene regulatory region, aprE gene regulatory region, spoVG gene regulatory region, Bacillus sp. Examples include a cellulase gene control region of KSM-S237 strain, a staphylococcus aureus-derived kanamycin resistance gene control region, a chloramphenicol resistance gene control region, and the like (all of which are described in JP-A-2009-089708).
好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点の上流０．４〜１．０ｋｂ領域（配列番号６３）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列、ｓｐｏＶＧ遺伝子の翻訳開始点の上流０．２ｋｂの領域（配列番号１７８）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列、ｒｒｎＯオペロンの１６ＳｒＲＮＡの上流０．２〜1.０ｋｂ領域（配列番号６４）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列、ｔｕｆＡ遺伝子の翻訳開始点の上流１ｋｂの領域（配列番号６５）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が挙げられる。 Preferably, Bacillus sp. A 0.4 to 1.0 kb region upstream of the translation start point of the cellulase gene, which is the control region of the cellulase gene of the KSM-S237 strain (SEQ ID NO: 63), and 80% or more, preferably 90% or more in the region and nucleotide sequence More preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and gene expression equivalent to that region. A base sequence having a control function, a region of 0.2 kb upstream of the translation start point of the spoVG gene (SEQ ID NO: 178), and 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more in the region and the nucleotide sequence; More preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more. And a nucleotide sequence having a gene expression control function equivalent to that of the region, an upstream 0.2-1.0 kb region (SEQ ID NO: 64) of the 16S rRNA of the rrnO operon, and 80 in the nucleotide sequence of the region. % Or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, And a nucleotide sequence having a gene expression control function equivalent to the region, a 1 kb region upstream of the translation start point of the tufA gene (SEQ ID NO: 65), and 80% or more, preferably 90% or more, in the region and nucleotide sequence. Preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably Or a nucleotide sequence having 99% or more identity and having a gene expression control function equivalent to that of the region.
より好ましくは、ＰＧＡ合成酵素遺伝子（例えば、枯草菌ｐｇｓＢＣ遺伝子又はその相当遺伝子）に対しては上記ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子の制御領域が、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子群全て（例えば、枯草菌ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子又はその相当遺伝子群）に対してはｓｐｏＶＧ遺伝子制御領域、又はｒｒｎＯオペロン制御領域が、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子に対してはｔｕｆＡ遺伝子制御領域が使用される。 More preferably, for the PGA synthase gene (for example, Bacillus subtilis pgsBC gene or an equivalent gene thereof), the control region of the KSM-S237 cellulase gene is the entire poly-γ-glutamate synthase gene group (for example, Bacillus subtilis). The spoVG gene control region or the rrnO operon control region is used for the pgsBCAE gene or its corresponding gene group, and the tufA gene control region is used for the gene encoding poly-γ-glutamate degrading enzyme.
目的遺伝子又は制御領域の親株への導入には、細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に新たに導入すること等が挙げられ、使用されるベクターは、プラスミド等の形質転換に一般的に使用されるベクターであればよい。ベクターの種類は、適宜選択することができるが、親株内で自己複製可能なベクター（例えばプラスミド）であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が親株のゲノム（染色体）に対し、２以上１００コピー以下、好ましくは２以上５０コピー以下、より好ましくは２以上３０コピー以下である。好ましいプラスミドの例としては、例えば、ｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。 Examples of introduction of a target gene or control region into a parent strain include introduction of a gene into a cell genome or a plasmid, and a vector to be used is generally used for transformation of a plasmid or the like. Any vector may be used. The type of vector can be selected as appropriate, but it is preferably a vector (for example, a plasmid) capable of self-replication in the parent strain, and more preferably a multicopy vector. Furthermore, the number of copies of the plasmid is 2 or more and 100 or less, preferably 2 or more and 50 or less, more preferably 2 or more and 30 or less, relative to the genome (chromosome) of the parent strain. Examples of preferable plasmids include pT181, pC194, pUB110, pE194, pSN2, pHY300PLK, and the like.
目的遺伝子又は制御領域のベクターへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、目的遺伝子及び制御領域の断片をＰＣＲ等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミド等のベクターに挿入し、連結すればよい。あるいは、目的遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミド等のベクターに挿入してもよい。その際、ベクター上において、上流から制御領域断片、目的遺伝子の断片の順で連結されているようにする。 Insertion of a gene of interest or a control region into a vector can be performed according to a conventional method in the art. For example, the target gene and control region fragments may be amplified by PCR or the like, and these fragments may be inserted into a vector such as a plasmid by a restriction enzyme method or the like and ligated. Alternatively, a fragment in which a target gene and a regulatory region fragment are linked in advance may be prepared and inserted into a vector such as a plasmid. At that time, on the vector, the control region fragment and the target gene fragment are ligated in this order from the upstream.
ＰＧＡ合成酵素遺伝子が枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせの場合は、親株に導入するＤＮＡ断片やベクター上において、上流から制御領域断片、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子の断片、次いで枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の断片の順で連結されているようにするとよい。 When the PGA synthase gene is a combination of the Bacillus subtilis pgsB gene or its equivalent gene and the Bacillus subtilis pgsC gene or its equivalent gene, on the DNA fragment or vector to be introduced into the parent strain, the control region fragment from the upstream, the Bacillus subtilis pgsB gene Or it is good to make it connect in order of the fragment | piece of the equivalent gene, and then the Bacillus subtilis pgsC gene or the fragment of the equivalent gene.
親株へのＤＮＡ断片又はベクターの導入は、例えばプロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）やコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６３，８６：３９２−４００、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）などの通常の手法に従って行うことができる。 DNA fragments or vectors can be introduced into the parent strain by, for example, the protoplast method (Mol. Gen. Genet., 1979, 168: 111-115) or the competent cell method (J. Bacteriol., 1963, 86: 392-400, J Bacteriol., 1960, 81: 741-746).
[３．ＰＧＡの製造]
斯くして得られた本発明の組換え枯草菌は、親株となるゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子の発現を強化した組換え枯草菌と比べて、遥かに高いＰＧＡ生産能を有している。
よって、本発明の組換え枯草菌を培養することによって、当該菌外に効率よくＰＧＡを生産することが可能になる。
本発明のＰＧＡの製造方法においては、先ず、適切な培地において上記本発明の組換え枯草菌を培養し、菌体外に生産されたＰＧＡを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。当該培地は、合成培地であっても天然培地であってもよい。
[3. Production of PGA]
The recombinant Bacillus subtilis of the present invention thus obtained is compared to the recombinant Bacillus subtilis with enhanced expression of the PGA synthase gene, compared to the Bacillus subtilis mutant lacking a large region of the parent genome. It has a much higher PGA production capacity.
Therefore, by culturing the recombinant Bacillus subtilis of the present invention, PGA can be efficiently produced outside the bacteria.
In the method for producing PGA of the present invention, first, the recombinant Bacillus subtilis of the present invention is cultured in an appropriate medium, and PGA produced outside the cells is recovered from the medium. Medium includes carbon sources such as glycerol, glucose, fructose, maltose, xylose, arabinose, various organic acids, various amino acids, polypeptone, tryptone, nitrogen sources such as ammonium sulfate and urea, inorganic salts such as sodium salts, and other necessary nutrients A medium having a composition containing a source, a trace metal salt and the like can be used. The medium may be a synthetic medium or a natural medium.
ＰＧＡの製造においては、必ずしも培地にグルタミン酸を添加する必要はないが、ＰＧＡの生産性をより向上させるために、本発明の組換え枯草菌が生育に最低限必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地で、当該組換え枯草菌を培養することができる。グルタミン酸は、培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度（グルタミン酸換算）は、例えば培地中、好ましくは０．００５〜６００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜４００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜３００ｇ／Ｌであり得る。培地中のグルタミン酸濃度は、ＰＧＡの生産性向上の点から、０．００５ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、他方、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分の析出を回避する点から、グルタミン酸濃度６００ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。 In the production of PGA, it is not always necessary to add glutamic acid to the medium. However, in order to further improve the productivity of PGA, the amount of glutamic acid required for the growth of the recombinant Bacillus subtilis of the present invention is minimal. The recombinant Bacillus subtilis can be cultured in a medium to which glutamic acid is added. Glutamic acid is preferably added to the medium as sodium glutamate, and its concentration (in terms of glutamic acid) is preferably, for example, 0.005 to 600 g / L, more preferably 0.05 to 500 g / L in the medium. More preferably, it may be 0.1-400 g / L, More preferably, it may be 0.5-300 g / L. The glutamic acid concentration in the medium is preferably 0.005 g / L or more from the viewpoint of improving the productivity of PGA. On the other hand, sodium glutamate and other medium components in the medium due to exceeding the saturated solubility of sodium glutamate From the viewpoint of avoiding precipitation, the glutamic acid concentration is preferably 600 g / L or less.
培養条件として、至適温度は、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃である。至適ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、より好ましくは５〜８である。また、培養日数は、菌接種後、好ましくは１〜１０日間であり、より好ましくは１〜５日間である。
培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際には、ＰＧＡを生産させた菌体と分離する必要がある。ＰＧＡを分離する手段としては、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、ｐＨをＰＧＡの等電点付近に維持することでＰＧＡを沈殿として回収する方法、さらに上記手法の組み合わせ等が挙げられる。
As the culture conditions, the optimum temperature is preferably 10 to 40 ° C, more preferably 30 to 40 ° C. The optimum pH is preferably pH 4-8, more preferably 5-8. Moreover, the culture days are preferably 1 to 10 days, more preferably 1 to 5 days after the inoculation of bacteria.
When recovering the PGA accumulated in the medium, it is necessary to separate it from the cells that produced the PGA. Examples of means for separating PGA include centrifugation, ultrafiltration membrane, electrodialysis, a method of recovering PGA as a precipitate by maintaining the pH near the isoelectric point of PGA, and a combination of the above methods. .
本発明の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築され、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
＜２＞ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する、＜１＞の枯草菌変異株。
＜３＞ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されている＜１＞又は＜２＞の枯草菌変異株。
＜４＞さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、＜１＞〜＜３＞のいずれかの枯草菌変異株。
＜５＞さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が共に欠失又は不活性化されている、＜１＞〜＜３＞のいずれかの枯草菌変異株。
＜６＞クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するような遺伝子構築が、野生型クエン酸シンターゼ遺伝子に加えて、強発現制御領域の制御下にあるクエン酸シンターゼ遺伝子をさらに導入することによりなされる、＜１＞〜＜５＞の枯草菌変異株。
＜７＞クエン酸シンターゼ遺伝子が、下記の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜６＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜８＞ａｌｓＳ遺伝子が、下記の（ｇ）〜（ｌ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜７＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ｇ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜９＞ａｌｓＤ遺伝子が、下記の（ｍ）〜（ｒ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜８＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ｍ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号７に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号８に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１０＞ａｃｋＡ遺伝子が以下の群より選択される、＜１＞〜＜９＞のいずれかの枯草菌変異株。
（１）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４）配列番号１８０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５）配列番号１８０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６）配列番号１８０に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１１＞ｐｔａ遺伝子が、以下の群より選択される、＜１＞〜＜１０＞のいずれかの枯草菌変異株。
（１）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４）配列番号１８４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５）配列番号１８４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６）配列番号１８４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１２＞ｙｄａＰ遺伝子が、以下の群より選択される、＜１＞〜＜１１＞のいずれかの枯草菌変異株。
（１）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４）配列番号１８６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５）配列番号１８６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６）配列番号１８６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１３＞ｌｄｈ遺伝子が、以下の群より選択される、＜１＞〜＜１２＞のいずれかの枯草菌変異株。
（１）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４）配列番号１８２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５）配列番号１８２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６）配列番号１８２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１４＞＜１＞〜＜１３＞のいずれかの枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
＜１５＞ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子及びｐｇｓＥ遺伝子、並びにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子である＜１４＞の組換え枯草菌。
＜１６＞ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子、ｐｇｓＥ遺伝子及びｐｇｄＳ遺伝子、又はこれらに相当する遺伝子である＜１４＞の組換え枯草菌。
＜１７＞枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。
＜１８＞組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
＜１９＞＜１４＞〜＜１６＞のいずれかの組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
The following are further disclosed herein as exemplary embodiments of the invention. However, the present invention is not limited to these embodiments.
<1> a Bacillus subtilis mutant,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region Having one or more selected regions of the deleted genome;
A Bacillus subtilis mutant strain that is constructed so that the citrate synthase gene is strongly expressed and at least one gene selected from the group consisting of the alsS gene and the alsD gene is deleted or inactivated.
<2> profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA- YurT region, cgeE-ypmQ region, yek-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region <1> Bacillus subtilis mutant.
<3> A Bacillus subtilis mutant strain according to <1> or <2>, wherein both the alsS gene and the alsD gene are deleted or inactivated.
<4> Bacillus subtilis according to any one of <1> to <3>, wherein at least one gene selected from the group consisting of an ackA gene, a pta gene, a ydaP gene, and an ldh gene is deleted or inactivated Mutant strain.
<5> The Bacillus subtilis mutant strain according to any one of <1> to <3>, wherein the ackA gene, the pta gene, the ydaP gene, and the ldh gene are all deleted or inactivated.
<6> The gene construction in which the citrate synthase gene is strongly expressed is achieved by further introducing a citrate synthase gene under the control of the strong expression control region in addition to the wild-type citrate synthase gene. Bacillus subtilis mutants of 1> to <5>.
<7> The Bacillus subtilis mutant strain according to any one of <1> to <6>, wherein the citrate synthase gene is selected from the group consisting of the following (a) to (f).
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and having citrate synthase activity;
(C) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having citrate synthase activity;
(D) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(E) a polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having citrate synthase activity;
(F) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having citrate synthase activity.
<8> The Bacillus subtilis mutant strain according to any one of <1> to <7>, wherein the alsS gene is selected from the group consisting of the following (g) to (l).
(G) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5;
(H) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and having α-acetolactic acid synthase activity;
(I) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and encodes a protein having α-acetolactic acid synthase activity;
(J) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(K) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having α-acetolactic acid synthase activity;
(L) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having α-acetolactic acid synthase activity.
<9> The Bacillus subtilis mutant strain according to any one of <1> to <8>, wherein the alsD gene is selected from the group consisting of the following (m) to (r).
(M) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7;
(N) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and encoding a protein having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(O) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and encodes a protein having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(P) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
(Q) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(R) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having α-acetolactic acid decarboxylase activity.
<10> The Bacillus subtilis mutant strain according to any one of <1> to <9>, wherein the ackA gene is selected from the following group.
(1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 179;
(2) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 179 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and encoding a protein having acetate kinase activity;
(3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 179 and encodes a protein having acetate kinase activity;
(4) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 180;
(5) a polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 180, and encoding a protein having acetate kinase activity;
(6) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 180 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having acetate kinase activity.
<11> The Bacillus subtilis mutant strain according to any one of <1> to <10>, wherein the pta gene is selected from the following group.
(1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 183;
(2) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 183 A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having phosphate acetyltransferase activity;
(3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 183 and encodes a protein having phosphate acetyltransferase activity;
(4) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 184;
(5) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 184 and having phosphate acetyltransferase activity;
(6) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 184 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having phosphate acetyltransferase activity.
<12> The Bacillus subtilis mutant strain according to any one of <1> to <11>, wherein the ydaP gene is selected from the following group.
(1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 185;
(2) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 185 A polynucleotide encoding a protein consisting of a nucleotide sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having pyruvate oxidase activity;
(3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 185 and encodes a protein having pyruvate oxidase activity;
(4) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 186;
(5) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 186 and having pyruvate oxidase activity;
(6) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 186 A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having pyruvate oxidase activity.
<13> Ldh gene is selected from the following group, The Bacillus subtilis mutant in any one of <1>-<12>.
(1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 181;
(2) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 181 A polynucleotide encoding a protein comprising a nucleotide sequence preferably having 98% or more identity, more preferably 99% or more identity, and having L-lactate dehydrogenase activity;
(3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 181 and encodes a protein having L-lactate dehydrogenase activity;
(4) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 182;
(5) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 182 and having L-lactic acid dehydrogenase activity;
(6) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 182 A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity, and having L-lactate dehydrogenase activity.
<14> In the Bacillus subtilis mutant strain of any one of <1> to <13>, a poly-γ-glutamate synthase gene, or a poly-γ-glutamate synthase gene and a poly-γ-glutamate degrading enzyme gene can be expressed Recombinant Bacillus subtilis enhanced or introduced into
<15> The gene encoding poly-γ-glutamate synthase is at least one gene selected from the group consisting of a Bacillus subtilis pgsB gene, a pgsC gene, a pgsA gene, a pgsE gene, and a gene corresponding thereto. <14> The recombinant Bacillus subtilis according to <14>, wherein the poly-γ-glutamate-degrading enzyme gene is a Bacillus subtilis pgdS gene or a gene corresponding thereto.
<16> The poly-γ-glutamate synthase gene and the poly-γ-glutamate degrading enzyme gene are Bacillus subtilis pgsB gene, pgsC gene, pgsA gene, pgsE gene and pgdS gene, or genes corresponding thereto <14 > Recombinant Bacillus subtilis.
<17> A method for producing a Bacillus subtilis mutant,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region A step of constructing a gene so that the citrate synthase gene is strongly expressed in a Bacillus subtilis mutant strain having a genome in which one or more selected regions are deleted; And at least one gene selected from the group consisting of an alsS gene and an alsD gene is deleted or inactivated.
<18> A method for producing recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region A step of constructing a gene so that the citrate synthase gene is strongly expressed in a Bacillus subtilis mutant strain having a genome in which one or more selected regions are deleted; a step of deleting or inactivating at least one gene selected from the group consisting of an alsS gene and an alsD gene, and a poly-γ-glutamate synthase gene, or a poly-γ-glutamate synthase gene and poly-γ- A method comprising the step of enhancing or introducing a glutamate-degrading enzyme gene into an expressible state.
<19> A method for producing poly-γ-glutamic acid, comprising a step of culturing the recombinant Bacillus subtilis of any one of <14> to <16> and recovering poly-γ-glutamic acid from the culture.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
実施例１ 菌株の構築
（１−１）トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４株；特開２００７−１３００１３号公報）におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株の元株である枯草菌１６８株は、遺伝子型としてｔｒｐＣ２を所持している。つまり１６８株はトリプトファン合成に関与するインドール−３−グリセロールリン酸シンターゼをコードするｔｒｐＣ遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株はトリプトファン非要求性であることが知られている（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ａ．Ｍ．＆Ｇａｌｉｚｚｉ，Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４５（Ｐｔ１２）：３３１９−３３２０）。枯草菌１６８株とＡＴＣＣ６０５１Ｔ株のｔｒｐＣ遺伝子を比較したところ、３２８番目から３３０番目のヌクレオチドＡＴＴが枯草菌１６８株では存在しないことがわかった。そこで、ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株ゲノムを鋳型とし、表５記載のｔｒｐＣ＿Ｆ１及びｔｒｐＣ＿Ｒ１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を構築した。このＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株をコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）で形質転換し、トリプトファン非添加のＳＭＡ寒天培地（０．２％硫酸アンモニウム、１．４％リン酸水素２カリウム、０．６％リン酸２水素カリウム、０．１％クエン酸３ナトリウム-２水和物、０．５％グルコース、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、１．５％寒天）に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性の枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株を得た。
Example 1 Construction of Strain (1-1) Preparation of Tryptophan Requirement Release Strain Tryptophan Requirement in a Bacillus subtilis Mutant (MGB874 Strain; Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-130013) in which a large region of the Bacillus subtilis wild type genome is deleted Was released. The Bacillus subtilis 168 strain, which is the original strain of the Bacillus subtilis mutant MGB874, possesses trpC2 as a genotype. In other words, strain 168 is required for tryptophan synthesis due to the trpC gene mutation encoding indole-3-glycerol phosphate synthase involved in tryptophan synthesis. Also, it is known that the Bacillus subtilis ATCC6051T strain is tryptophan non-requirement (Albertini, AM & Galizzi, A. Microbiology, 1999, 145 (Pt12): 3319-3320). When the trpC genes of Bacillus subtilis 168 and ATCC6051T were compared, it was found that nucleotides ATT from 328 to 330 were not present in Bacillus subtilis 168. Therefore, PCR was performed using the ATCC6051T strain genome as a template and using the trpC_F1 and trpC_R1 primers listed in Table 5 to construct a PCR product. Using this PCR product, the Bacillus subtilis mutant strain MGB874 was transformed by the competent method (J. Bacteriol., 1960, 81: 741-746), and tryptophan-free SMA agar medium (0.2% ammonium sulfate, 1% .4% dipotassium hydrogen phosphate, 0.6% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% trisodium citrate dihydrate, 0.5% glucose, 0.035% magnesium sulfate heptahydrate, Colonies that grew on 1.5% agar) were isolated as transformants. Thus, a Bacillus subtilis mutant MGB874T strain not requiring tryptophan was obtained.
（１−２）ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築
上記（１−１）で構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株を宿主として、ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築を行った。本変異株の作製は、ＩＰＴＧ制御領域と遊離のｍＲＮＡ切断リボヌクレアーゼであるｍａｚＦ遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
(1-2) Construction of Bacillus subtilis mutant strain (MGB874T_ΔalsSD strain) lacking the alsSD gene group Bacillus subtilis lacking the alsSD gene group using the Bacillus subtilis mutant strain MGB874T strain constructed in (1-1) above as a host A fungal mutant (MGB874T_ΔalsSD strain) was constructed. This mutant strain was constructed by a marker-free deletion method using a cassette in which the IPTG regulatory region and a free mRNA-cleaving ribonuclease mazF gene were fused (Morimoto, T. et al., In Strain Engineering, pp 345-358. Springer).
始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１及びａｌｓＳＤ−ＤＲ１を用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群の開始コドン上流に隣接する領域である断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ２及びａｌｓＳＤ−ＤＲ２を用いて、ａｌｓＤ遺伝子遺伝子の停止コドン下流の領域である断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＩＦ及びａｌｓＳＤ−ＩＲを用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群ＯＲＦ内と相同領域である断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、枯草菌変異株ＴＯＭ３１０（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｍａｚＦカセット断片（Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。 First, using a genomic DNA extracted from the Bacillus subtilis mutant strain MGB874T as a template and using primers alsSD-DF1 and alsSD-DR1 shown in Table 6, a fragment (A ) Was amplified by PCR. Further, a fragment (B), which is a region downstream of the stop codon of the alsD gene gene, was amplified by PCR using the genomic DNA as a template and primers alsSD-DF2 and alsSD-DR2 shown in Table 6. Further, using the genomic DNA as a template, a fragment (C) that is a homologous region within the alsSD gene group ORF was amplified by PCR using the primers alsSD-IF and alsSD-IR described in Table 6. Furthermore, using Bacillus subtilis mutant TOM310 (Morimoto, T. et al., In Strain Engineering, pp345-358. Springer) genomic DNA as a template, and using primers pAPNC-F and chpA-R described in Table 6, Spectino The mazF cassette fragment (D) containing the mycin resistance gene was amplified by PCR.
次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｂ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｃ）をこの順となる様に表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１及びａｌｓＳＤ−ＩＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株の形質転換を行い、ＩＰＴＧを含まずスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。 Next, SOE-PCR was performed using the primers alsSD-DF1 and alsSD-IR described in Table 6 so that the obtained fragment (A), fragment (B), fragment (D) and fragment (C) were in this order. The final DNA fragment was obtained by ligation by the method. The resulting DNA fragment was used to transform the Bacillus subtilis mutant MGB874T strain by competent method (J. Bacteriol., 1960, 81: 741-746), and LB agar not containing IPTG but containing spectinomycin. Colonies that grew on the medium were isolated as transformants.
最後に、ｍａｚＦ遺伝子カセットを除くため、ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地上で培養し、生育したコロニーを選択した。得られた変異株は、断片（Ｂ）において細胞内相同組換えによりｍａｚＦカセットが除去された変異株となる（以下、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株と称する）。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株はゲノム上のａｌｓＳ遺伝子開始コドンからａｌｓＤ遺伝子停止コドン領域が欠失し、更に薬剤選択マーカーが除去された変異を有する枯草菌変異株である。本実施例でのｍａｚＦ遺伝子カセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築したａｌｓＳＤ遺伝子群欠失方法を図３に示した。 Finally, in order to remove the mazF gene cassette, it was cultured on an LB agar medium containing IPTG, and grown colonies were selected. The obtained mutant strain is a mutant strain in which the mazF cassette is removed by intracellular homologous recombination in the fragment (B) (hereinafter referred to as Bacillus subtilis mutant strain MGB874T_ΔalsSD strain). The Bacillus subtilis mutant MGB874T_ΔalsSD strain is a Bacillus subtilis mutant having a mutation in which the alsD gene stop codon region has been deleted from the start codon of the alsS gene on the genome and the drug selection marker has been removed. The alsSD gene group deletion method constructed by the marker-free deletion method using the mazF gene cassette in this Example is shown in FIG.
得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７４：５４６３）によるシークエンシングによって、ゲノム上のａｌｓＳＤ遺伝子群の欠失が生じていることを確認した。 PCR using genomic DNA of the obtained Bacillus subtilis mutant MGB874T_ΔalsSD strain and subsequent sequencing by the Sanger method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 74: 5463) It was confirmed that a deletion occurred.
（１−３）ａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株）の構築
上記（１−２）で構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株を宿主として、上述の手法と同様に、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失された変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株）の構築を行った。
(1-3) Construction of a Bacillus subtilis mutant strain (MGB874T_ΔalsSDΔackAΔptaΔydaPΔldh strain) lacking the alsSD gene group, ackA gene, pta gene, ydaP gene and ldh gene The Bacillus subtilis mutant strain MGB874T_ΔalsSD constructed in (1-2) above As a host, a mutant strain (MGB874T_ΔalsSDΔackAΔptaΔydaPΔldh strain) from which the ackA gene, the pta gene, the ydaP gene and the ldh gene were deleted was constructed in the same manner as described above.
ａｃｋＡ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーａｃｋＡ−ＤＦ１及びａｃｋＡ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーａｃｋＡ−ＤＦ２及びａｃｋＡ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーａｃｋＡ−ＩＦ及びａｃｋＡ−ＩＲを、それぞれ使用した。 When the ackA gene was deleted, the fragments ACKA-DF1 and ackA-DR1 described in Table 6 were used for fragment (A) amplification, and the primers ackA-DF2 and ackA-DR2 described in Table 6 were used for fragment (B) amplification. (C) Primers ackA-IF and ackA-IR listed in Table 6 were used for amplification.
ｐｔａ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーｐｔａ−ＤＦ１及びｐｔａ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーｐｔａ−ＤＦ２及びｐｔａ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーｐｔａ−ＩＦ及びｐｔａ−ＩＲを、それぞれ使用した。 Upon deletion of the pta gene, the fragments pA-DF1 and pta-DR1 described in Table 6 were used for the fragment (A) amplification, and the primers pta-DF2 and pta-DR2 described in Table 6 were used for the fragment (B) amplification. (C) Primers pta-IF and pta-IR described in Table 6 were used for amplification.
ｙｄａＰ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーｙｄａＰ−ＤＦ１及びｙｄａＰ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーｙｄａＰ−ＤＦ２及びｙｄａＰ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーｙｄａＰ−ＩＦ及びｙｄａＰ−ＩＲを、それぞれ使用した。 When the ydaP gene was deleted, the fragments (A) were amplified using the primers ydaP-DF1 and ydaP-DR1 described in Table 6, and the fragments (B) were amplified using the primers ydaP-DF2 and ydaP-DR2 described in Table 6. (C) Primers ydaP-IF and ydaP-IR listed in Table 6 were used for amplification.
ｌｄｈ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーｌｄｈ−ＤＦ１及びｌｄｈ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーｌｄｈ−ＤＦ２及びｌｄｈ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーｌｄｈ−ＩＦ及びｌｄｈ−ＩＲを、それぞれ使用した。 When the ldh gene was deleted, primers ldh-DF1 and ldh-DR1 described in Table 6 were used for fragment (A) amplification, and primers ldh-DF2 and ldh-DR2 described in Table 6 were used for fragment (B) amplification. (C) Primers ldh-IF and ldh-IR listed in Table 6 were used for amplification, respectively.
順次、欠失変異を集積させ、最終的に枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株を構築した。得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。 Sequentially, deletion mutations were accumulated, and finally a Bacillus subtilis mutant MGB874T_ΔalsSDΔackAΔptaΔydaPΔldh was constructed. It was confirmed by PCR using genomic DNA of the obtained Bacillus subtilis mutant strain MGB874T_ΔalsSDΔackAΔptaΔydaPΔldh and subsequent sequencing by the Sanger method that deletion of each gene introduced with mutations on the genome was confirmed.
（１−４）クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株）の構築
ゲノム上のアルカリセリンプロテアーゼをコードするａｐｒＥ遺伝子を分断する形で、クエン酸シンターゼ遺伝子ｃｉｔＺを導入するためのコンストラクトを構築した。ｃｉｔＺ遺伝子発現の制御領域として、恒常的発現制御である胞子形成に関与するｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域を用いた。
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーｎｅｗ−ａｐｒＥ−ＵＦ及びａｐｒＥ／ＰｓｐｏＶＧ−Ｒを用いて、ａｐｒＥ遺伝子上流領域を含む断片（Ｅ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーｅｒｍ ｐｔ２／ａｐｒＥ−Ｆ及びｎｅｗ−ａｐｒＥ−ＤＲを用いて、ａｐｒＥ遺伝子下流領域を含む断片（Ｆ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーａｐｒＥ／ＰｓｐｏＶＧ−Ｆ及びＰｓｐｏＶＧ／ｃｉｔＺ−Ｒを用いて、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域の断片（Ｇ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーＰｓｐｏＶＧ／ｃｉｔＺ−Ｆ及びｃｉｔＺ／ｅｒｍ ｐｔ２−Ｒを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ｃｉｔＺ遺伝子ＯＲＦの断片（Ｈ）をＰＣＲ増幅した。プラスミドｐＭｕｔｉｎ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，３０９７−３１０４，１９９８）を鋳型とし、表７記載のプライマーｅｒｍ ｐｔ２−Ｆ及びｅｒｍ ｐｔｗ／ａｐｒＥ−Ｒを用いて、エリスロマイシン耐性遺伝子を含む領域の断片（Ｉ）をＰＣＲにより増幅した。
(1-4) Construction of a Bacillus subtilis mutant strain (MGB874T_citZ strain) in which the citrate synthase gene is strongly expressed In order to introduce the citrate synthase gene citZ in a form that disrupts the aprE gene encoding the alkaline serine protease on the genome A construct was constructed. As the control region of citZ gene expression, the control region of the spoVG gene involved in sporulation, which is a constant expression control, was used.
Using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant strain MGB874T as a template and using primers new-aprE-UF and aprE / PspoVG-R described in Table 7, a fragment (E) containing the upstream region of the aprE gene was amplified by PCR. Next, using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant strain MGB874T as a template, the fragment (F) containing the downstream region of the aprE gene was amplified by PCR using the primers ermpt2 / aprE-F and new-aprE-DR described in Table 7. did. Next, using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant strain MGB874T as a template and using the primers aprE / PspoVG-F and PspoVG / citZ-R described in Table 7, the fragment (G) of the control region of the spoVG gene was amplified by PCR. . Next, PCR amplification was performed using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant MGB874T strain as a template and using the primers PspoVG / citZ-F and citZ / ermpt2-R described in Table 7, and the fragment (H) of the citZ gene ORF was obtained. PCR amplified. Using the plasmid pMutin3 (Microbiology, 144, 3097-3104, 1998) as a template and primers erm pt2-F and erm ptw / aprE-R described in Table 7, the fragment (I) of the region containing the erythromycin resistance gene was PCR Amplified by
次に、得られた断片（Ｅ）、断片（Ｇ）、断片（Ｈ）、断片（Ｉ）及び断片（Ｆ）をこの順となる様に表７記載のプライマーｎｅｗ−ａｐｒＥ−ＵＦ及びｎｅｗ−ａｐｒＥ−ＤＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔを形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株を得た。 Next, the obtained fragments (E), (G), (H), (I) and (F) were arranged in this order with the primers new-aprE-UF and new- The final PCR product was obtained by binding by the SOE-PCR method using aprE-DR. The resulting final PCR product was used to transform Bacillus subtilis mutant MGB874T to obtain Bacillus subtilis mutant MGB874T_citZ.
得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。 It was confirmed that the target gene was introduced at a predetermined position on the genome by PCR using genomic DNA of the obtained Bacillus subtilis mutant MGB874T_citZ strain and subsequent sequencing by the Sanger method.
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株は、ゲノム上に生来のｃｉｔＺ遺伝子と、導入したＰｓｐｏＶＧ制御下の枯草菌ｃｉｔＺ遺伝子との両方を有する枯草菌変異株である。本実施例のクエン酸シンターゼ遺伝子の導入手順及び導入位置を図４に示した。 The Bacillus subtilis mutant MGB874T_citZ is a Bacillus subtilis mutant having both the native citZ gene on the genome and the introduced Bacillus subtilis citZ gene under the control of PspoVG. The introduction procedure and introduction position of the citrate synthase gene of this example are shown in FIG.
（１−５）ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株）の構築
始めに、枯草菌が本来ゲノム上に有するＰＧＡ合成酵素遺伝子群（ｐｇｓＢＣＡＥ）及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の欠失変異導入を行った。本変異株の作製は、ＩＰＴＧ制御領域と遊離のｍＲＮＡ切断リボヌクレアーゼであるｍａｚＦ遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
(1-5) Construction of recombinant Bacillus subtilis (MGB874T_PGA strain) in which expression of genes encoding PGA synthase gene group and PGA degrading enzyme is enhanced First, PGA synthase gene group originally possessed by Bacillus subtilis on the genome Deletion mutagenesis of genes encoding (pgsBCAE) and PGA degrading enzyme was performed. This mutant strain was constructed by a marker-free deletion method using a cassette in which the IPTG regulatory region and a free mRNA-cleaving ribonuclease mazF gene were fused (Morimoto, T. et al., In Strain Engineering, pp 345-358. Springer).
実施例（１−１）にて構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、断片（Ｊ）増幅には表８記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＤＲ１を、断片（Ｋ）増幅には表８記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ２及びｐｇｓ−ＤＲ２を、断片（Ｌ）増幅には表８記載のプライマーｐｇｓ−ＩＦ及びｐｇｓ−ＩＲを、それぞれ使用した。さらに、枯草菌変異株ＴＯＭ３１０（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｍａｚＦカセット断片（Ｍ）をＰＣＲにより増幅した。次に、得られた断片（Ｊ）、断片（Ｋ）、断片（Ｍ）及び断片（Ｌ）をこの順となる様に表８記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＩＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。構築した最終ＰＣＲ産物で枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株を形質転換した。得られた形質転換体（枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株）のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。 Using the genomic DNA extracted from the Bacillus subtilis mutant MGB874T constructed in Example (1-1) as a template, the fragments pgs-DF1 and pgs-DR1 described in Table 8 were used for the fragment (J) amplification. ) Primers pgs-DF2 and pgs-DR2 described in Table 8 were used for amplification, and primers pgs-IF and pgs-IR described in Table 8 were used for fragment (L) amplification. Furthermore, using Bacillus subtilis mutant TOM310 (Morimoto, T. et al., In Strain Engineering, pp345-358. Springer) genomic DNA as a template, using primers pAPNC-F and chpA-R described in Table 8, Spectino The mazF cassette fragment (M) containing the mycin resistance gene was amplified by PCR. Next, SOE-PCR was performed using the primers pgs-DF1 and pgs-IR described in Table 8 so that the obtained fragment (J), fragment (K), fragment (M) and fragment (L) were in this order. The final DNA fragment was obtained by ligation by the method. A Bacillus subtilis mutant MGB874T strain was transformed with the constructed final PCR product. By using PCR using genomic DNA of the obtained transformant (Bacillus subtilis mutant strain MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS strain) and subsequent sequencing by the Sanger method, it is confirmed that deletion has occurred for each gene into which mutations have been introduced on the genome. confirmed.
次いで、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−１ｒを用いて、ｔｕｆＡ遺伝子下流領域の断片（Ｎ）をＰＣＲにより増幅した。また、表８記載のプライマーｔｕｆＡ−２ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いて、ｔｕｆＡ遺伝子下流領域の断片（Ｏ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーＢＳｐｇｄＳ−Ｆ及びＢＳｐｇｄＳ−Ｒを用いて、ｐｇｄＳ遺伝子ＯＲＦの断片（Ｐ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＡＰＮＣ２１３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）を鋳型とし、表８記載のプライマーｓｐｃ−Ｆ及びｓｐｃ−Ｒを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片（Ｑ）をＰＣＲ増幅した。 Next, a gene encoding PGA degrading enzyme was introduced. Using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant MGB874T strain as a template and the primers tufA-1f and tufA-1r shown in Table 8, the fragment (N) in the downstream region of the tufA gene was amplified by PCR. In addition, a fragment (O) in the downstream region of the tufA gene was amplified by PCR using the primers tufA-2f and tufA-2r shown in Table 8. Subsequently, the fragment (P) of the pgdS gene ORF was amplified by PCR using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant strain MGB874T as a template and using the primers BSpgdS-F and BSpgdS-R described in Table 8. Next, using the plasmid pAPNC213 (Morimoto T. et al., Microbiology, 2002, 148: 3539-3552) carrying the spectinomycin resistance gene as a template, using primers spc-F and spc-R described in Table 8, Amplification was performed, and the spectinomycin resistance gene fragment (Q) was PCR amplified.
次に、得られた断片（Ｎ）、断片（Ｐ）、断片（Ｑ）及び断片（Ｏ）をこの順となるように表８記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて上述した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株を形質転換し、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株を得た。 Next, SOE-PCR was performed using the primers tufA-1f and tufA-2r described in Table 8 so that the obtained fragment (N), fragment (P), fragment (Q) and fragment (O) were in this order. The final PCR product was obtained by ligation by the method. The above-mentioned final PCR product was used to transform the aforementioned Bacillus subtilis mutant MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS strain to obtain recombinant Bacillus subtilis MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_PtufA-pgdS strain.
得られた組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。 The obtained recombinant Bacillus subtilis MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_PtufA-pgdS strain was subjected to PCR using the genomic DNA and subsequent sequencing by the Sanger method to confirm that the target gene was introduced at a predetermined position on the genome.
次いで、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及び表８記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＲを用いて、ａｍｙＥ上流領域の断片（Ｒ）をＰＣＲにより増幅した。ｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）で枯草菌野生株１６８を形質転換した変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーｃａｔ−Ｆ及び表８記載のプライマーａｍｙＥ−ＤＲを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｍｙＥ下流領域の断片（Ｓ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし表８記載のプライマーａｍｙＥ／ＰＶＧ−Ｆ及びＰＶＧ／ｂｓ−ｐｇｓＲを用いて、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域の断片（Ｔ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーｂｓ−ｐｇｓＦ及びｂｓ−ｐｇｓ／ｃａｔＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子群の断片（Ｕ）をＰＣＲ増幅した。 Subsequently, the PGA synthase gene group was introduced. Using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant MGB874T strain as a template, the amyE upstream region fragment (R) was amplified by PCR using the primer amyE-UF described in Table 8 and the primer amyE-UR described in Table 8. Primer cat-F and Table 8 listed in Table 8 using the genomic DNA of a mutant strain obtained by transforming Bacillus subtilis wild strain 168 with pDLT3 (Morimoto T. et al., Microbiology, 2002, 148: 3539-3552) as a template. The amyE downstream region fragment (S) containing the chloramphenicol resistance gene was amplified by PCR using the primer amyE-DR. Subsequently, the fragment (T) of the control region of the spoVG gene was amplified by PCR using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant MGB874T strain as a template and using the primers amyE / PVG-F and PVG / bs-pgsR described in Table 8. Next, PCR amplification was performed using the genomic DNA of the Bacillus subtilis mutant MGB874T strain as a template and using the primers bs-pgsF and bs-pgs / catR described in Table 8, and the fragment (U) of the pgsBCAE gene group was PCR amplified. .
次に、得られた断片（Ｒ）、断片（Ｔ）、断片（Ｕ）及び断片（Ｓ）をこの順となる様に表８記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及びａｍｙＥ−ＤＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株を形質転換し、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株を得た。 Next, SOE-PCR was performed using the primers amyE-UF and amyE-DR shown in Table 8 so that the obtained fragment (R), fragment (T), fragment (U) and fragment (S) were in this order. The final PCR product was obtained by ligation by the method. The obtained final PCR product was used to transform a recombinant Bacillus subtilis MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_PtufA-pgdS strain to obtain a recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA strain.
得られた組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。 Using the PCR method using the genomic DNA of the obtained recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA strain, it was confirmed that the target gene group was introduced at a predetermined position on the genome.
（１−６）クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株）の構築
始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株として構築した。
(1-6) Construction of recombinant Bacillus subtilis (MGB874T_PGA_citZ strain) in which citrate synthase gene is strongly expressed and the expression of genes encoding PGA synthase gene group and PGA degrading enzyme is enhanced The recombinant B. subtilis MGB874T_PGA strain was transformed by the competent method (J. Bacteriol., 1960, 81: 741-746) using the genomic DNA of the MGB874T_citZ strain, and colonies grown on the LB agar medium containing erythromycin were obtained. Recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_citZ strain was constructed.
得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。 Using the PCR method using the genomic DNA of the obtained recombinant Bacillus subtilis, it was confirmed that the target gene group was introduced at a predetermined position on the genome.
（１−７）ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築 (1-7) Construction of recombinant Bacillus subtilis (MGB874T_PGA_ΔalsSD strain) in which the expression of genes encoding the PGA synthase gene group and the PGA degrading enzyme is enhanced by deletion of the alsSD gene group
始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株を宿主として、先述した（１−２）と同様の手法にて、表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１、ａｌｓＳＤ−ＤＲ１、ａｌｓＳＤ−ＤＦ２、ａｌｓＳＤ−ＤＲ２、ａｌｓＳＤ−ＩＦ、ａｌｓＳＤ−ＩＲ、ｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群の欠失を行い、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ΔａｌｓＳＤ株を構築した。 First, with the Bacillus subtilis mutant MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS strain as the host, the primers alsSD-DF1, alsSD-DR1, alsSD-DF2, alsSD-DR2, alsSD- The alsSD gene group was deleted using IF, alsSD-IR, pAPNC-F and chpA-R to construct a Bacillus subtilis mutant MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_ΔalsSD strain.
次に、（１−５）と同様の手法で、ゲノム上にＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を強化する変異を導入し、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株を構築した。 Next, by the same method as in (1-5), a mutation that enhances the expression of a gene encoding a PGA synthase gene group and a PGA degrading enzyme was introduced on the genome to construct a recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_ΔalsSD strain.
得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。 Using the PCR method using the obtained genomic DNA of recombinant Bacillus subtilis, it was confirmed that the target gene group was introduced and deleted at a predetermined position on the genome.
（１−８）ａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株）の構築 (1-8) Recombinant Bacillus subtilis (MGB874T_PGA_ΔalsSDΔackAΔptaΔydaPΔldh) in which the expression of the genes encoding the PGA synthase gene group and the PGA degrading enzyme is enhanced by deleting the alsSD gene group, ackA gene, pta gene, ydaP gene and ldh gene Construction)
始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ΔａｌｓＳＤ株を宿主として、先述した（１−３）と同様の手法にて順次、欠失変異を集積させ、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株を構築した。 First, using the Bacillus subtilis mutant MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_ΔalsSD as a host, deletion mutations were successively accumulated in the same manner as described in (1-3) above, and Bacillus subtilis mutant MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_ΔalsSDΔackAΔptaΔdah strain was constructed.
次に、（１−５）と同様の手法で、ゲノム上にＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を強化する変異を導入し、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株を構築した。 Next, a mutation that enhances the expression of a gene encoding a PGA synthase gene group and a PGA degrading enzyme was introduced on the genome by the same method as in (1-5) to construct a recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_ΔalsSDΔackAΔptaΔydaPΔldh strain.
得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。 Using the PCR method using the obtained genomic DNA of recombinant Bacillus subtilis, it was confirmed that the target gene group was introduced and deleted at a predetermined position on the genome.
（１−９）クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ＿ｃｉｔＺ株）の構築
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ＿ｃｉｔＺ株として構築した。
(1-9) Recombinant Bacillus subtilis (MGB874T_PGA_ΔalsSD_citZ strain) in which the citrate synthase gene is strongly expressed, the alsSD gene group is deleted, and the expression of genes encoding PGA synthase gene group and PGA degrading enzyme is enhanced Construction of recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_ΔalsSD strain by competent method (J. Bacteriol., 1960, 81: 741-746) using genomic DNA of Bacillus subtilis mutant MGB874T_citZ strain, and LB agar medium containing erythromycin The colonies that grew on the cells were constructed as recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_ΔalsSD_citZ strain.
得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。 Using the PCR method using the genomic DNA of the obtained recombinant Bacillus subtilis, it was confirmed that the target gene group was introduced at a predetermined position on the genome.
（１−１０）クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ｃｉｔＺ株）の構築
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ｃｉｔＺ株として構築した。
(1-10) Expression of a gene that strongly expresses a citrate synthase gene, further lacks an alsSD gene group, an ackA gene, a pta gene, a ydaP gene, and an ldh gene, and encodes a PGA synthase gene group and a PGA degrading enzyme Of Recombinant Bacillus subtilis (MGB874T_PGA_ΔalsSDΔackAΔptaΔydaPΔldh_citZ Strain) Enhanced by Competent Method (J. The colonies grown on the LB agar medium containing erythromycin were transformed into recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_ΔalsSDΔ It was constructed as the ackAΔptaΔydaPΔldh_citZ strain.
得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。 Using the PCR method using the genomic DNA of the obtained recombinant Bacillus subtilis, it was confirmed that the target gene group was introduced at a predetermined position on the genome.
実施例２ ＰＧＡ生産性評価１
実施例１にて得られた組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ及び組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株を５ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属）で３０℃にて１２〜１６時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム）に１ｍＬ（約３％（ｖ／ｖ））接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで１日〜２日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量を測定した。組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株の到達ＰＧＡ生産量は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株における到達ＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。
Example 2 PGA Productivity Evaluation 1
Recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA and recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_citZ obtained in Example 1 were mixed with 5 mL of 5% glucose M modified medium (5% glucose, 0.6% ammonium chloride, 0.15% dipotassium hydrogen phosphate). 0.035% magnesium sulfate heptahydrate, 0.005% manganese sulfate pentahydrate, 50 mM MOPS (monophorinopropanesulfonic acid) buffer (pH 7.0, other trace metals) at 30 ° C. After shaking culture for 12 to 16 hours, the obtained culture solution was added to 30 mL of 5% glucose M modified medium (5% glucose, 0.6% ammonium chloride, 0.15% dipotassium hydrogen phosphate, 0.035). % Magnesium sulfate heptahydrate, 0.005% manganese sulfate pentahydrate, 50 mM MOPS (monoholinopropanesulfone ) Inoculate 1 mL (about 3% (v / v)) of buffer (pH 7.0), other trace metals, 4.0% calcium carbonate, and perform shaking culture at 37 ° C. and 210 rpm for 1 to 2 days. It was. After completion of the culture, the PGA production amount was measured under the analysis conditions shown in the following measurement examples. The reached PGA production amount of the recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_citZ strain is shown as a relative value when the reached PGA production amount in the recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA strain is 100%.
結果を表９に示す。ｃｉｔＺ遺伝子が強発現した組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡと比較して、到達ＰＧＡ生産量に変化は認められなかった。 The results are shown in Table 9. In the recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_citZ strain in which the citZ gene was strongly expressed, no change was observed in the amount of reached PGA compared to the recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA.
実施例２ ＰＧＡ生産性評価２
実施例１にて得られた組換え枯草菌を５ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属）で３０℃にて１２〜１６時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム）に１ｍＬ（約３％（ｖ／ｖ））接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで１日〜２日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量を測定した。各株の到達ＰＧＡ生産量は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株における到達ＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。
Example 2 PGA Productivity Evaluation 2
The recombinant Bacillus subtilis obtained in Example 1 was treated with 5 mL of 5% glucose M modified medium (5% glucose, 0.6% ammonium chloride, 0.15% dipotassium hydrogen phosphate, 0.035% magnesium sulfate 7 Hydrate, 0.005% manganese sulfate pentahydrate, 50 mM MOPS (monophorinopropanesulfonic acid) buffer (pH 7.0), other trace metals), shake culture at 30 ° C. for 12-16 hours Further, the obtained culture solution was added to 30 mL of 5% glucose M modified medium (5% glucose, 0.6% ammonium chloride, 0.15% dipotassium hydrogen phosphate, 0.035% magnesium sulfate heptahydrate, 1m in 0.005% manganese sulfate pentahydrate, 50mM MOPS (monophorinopropanesulfonic acid) buffer (pH 7.0), other trace metals, 4.0% calcium carbonate) (About 3% (v / v)) was inoculated, 37 ℃, 1 day at 210rpm ~ 2 days, was shaking culture. After completion of the culture, the PGA production amount was measured under the analysis conditions shown in the following measurement examples. The reached PGA production amount of each strain is shown as a relative value when the reached PGA production amount in the recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA strain is defined as 100%.
結果を表１０に示す。ｃｉｔＺ遺伝子が強発現し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失した組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ＿ｃｉｔＺ株は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株と比較して、到達ＰＧＡ生産量が高かった。また、ｃｉｔＺ遺伝子が強発現し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失した組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ｃｉｔＺ株は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株と比較して、到達ＰＧＡ生産量が高かった。以上の結果から、クエン酸シンターゼ遺伝子の発現強化は特定の遺伝子欠失変異と組み合わせることで高い効果を発揮することを見出した。 The results are shown in Table 10. The recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_ΔalsSD_citZ strain, in which the citZ gene was strongly expressed and the alsSD gene group was deleted, had a higher PGA production amount than the recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA and the recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_ΔalsSD strain. Moreover, the recombinant Bacillus subtilis MGB874T_PGA_ΔalsSDΔackAΔptaΔydaPΔldh_citΔPdAdAdApAdD is compared to the recombinant Bacillus subtilis MGB874TdPdAdA Production was high. From the above results, it was found that enhanced expression of the citrate synthase gene exhibits a high effect when combined with a specific gene deletion mutation.
＜ＰＧＡの定量分析＞
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＰＧＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量分析を行った。使用したＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる２種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界＞５×１０７）及びＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界１×１０６）を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムＴＳＫ ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＰＷＸＬ（６．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×４．０ｃｍ）を接続した。溶離液には０．１Ｍ硫酸ナトリウム、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度は５０℃、溶出ピークの検出波長は２１０ｎｍを用いた。試料注入量はサンプルループ（レオダイン）を用い、１分析あたり５０μＬとした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてＭＵＬＴＩ ＳＣＲＥＥＮ ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量８０万のＰＧＡ（明治フードマテリアル）を用いて検量線を作成した。
<Quantitative analysis of PGA>
The culture solution sample after completion of the culture is subjected to centrifugation at 14,800 rpm for 30 minutes at room temperature (Hitachi Koki, himacCF15RX), and PGA contained in the obtained sample supernatant after centrifugation is analyzed by HPLC. Quantitative analysis was performed. The HPLC apparatus used was a liquid feed pump (Shimadzu, LC-9A), an autosampler (Hitachi Measuring Instruments, AS-2000), a column oven (Shimadzu, CTO-6A), a UV detector (Shimadzu, SPD-10A), A degasser (GL Science, DG660B) and a chromatographic data analyzer (Hitachi Instrumentation, D-2500) were connected and used. The analytical columns were two types of gel filtration columns for hydrophilic polymer TSKgel G6000PWXL (7.8 mm ID × 30 cm, exclusion limit> 5 × 10 7 ) and TSKgel G4000PWXL (7.8 mm I) with different exclusion limits. D. × 30 cm, exclusion limit 1 × 10 6 ), and guard column TSK guardcolumn PWXL (6.0 mm ID × 4.0 cm) was connected immediately before these analytical columns. The eluent used was 0.1 M sodium sulfate, the flow rate was 1.0 mL / min, the column temperature was 50 ° C., and the detection wavelength of the elution peak was 210 nm. The sample injection amount was 50 μL per analysis using a sample loop (rheodyne). Samples to be subjected to HPLC analysis were prepared by filtering with MULTI SCREEN MNHV45 (manufactured by MILLIPORE, 0.45 μm Durapore membrane) as a pretreatment for removing insoluble matters. For the concentration test, a calibration curve was prepared using PGA (Meiji Food Material) with a molecular weight of 800,000.
Claims (14)
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築され、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。 Bacillus subtilis mutant strain,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region Having one or more selected regions of the deleted genome;
A Bacillus subtilis mutant strain that is constructed so that the citrate synthase gene is strongly expressed and at least one gene selected from the group consisting of the alsS gene and the alsD gene is deleted or inactivated.
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The Bacillus subtilis mutant according to any one of claims 1 to 5, wherein the citrate synthase gene is selected from the group consisting of the following (a) to (f).
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encoding a protein having citrate synthase activity;
(C) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having citrate synthase activity;
(D) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(E) a polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having citrate synthase activity;
(F) A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having citrate synthase activity.
（ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The Bacillus subtilis mutant according to any one of claims 1 to 6, wherein the alsS gene is selected from the group consisting of the following (g) to (l).
(G) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(H) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and encoding a protein having α-acetolactic acid synthase activity;
(I) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and encodes a protein having α-acetolactic acid synthase activity;
(J) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
(K) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having α-acetolactic acid synthase activity;
(L) A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having α-acetolactic acid synthase activity.
（ｍ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The Bacillus subtilis mutant according to any one of claims 1 to 7, wherein the alsD gene is selected from the group consisting of the following (m) to (r).
(M) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(N) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and having a nucleotide sequence of 80% or more and encoding a protein having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(O) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and encodes a protein having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(P) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(Q) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having α-acetolactic acid decarboxylase activity;
(R) A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having α-acetolactic acid decarboxylase activity.
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。 A method for producing a Bacillus subtilis mutant,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region A step of constructing a gene so that the citrate synthase gene is strongly expressed in a Bacillus subtilis mutant strain having a genome in which one or more selected regions are deleted; And at least one gene selected from the group consisting of an alsS gene and an alsD gene is deleted or inactivated.
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。 A method for producing recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, profile7 region (yrkM-yraK or yrkS-yraK), sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region A step of constructing a gene so that the citrate synthase gene is strongly expressed in a Bacillus subtilis mutant strain having a genome in which one or more selected regions are deleted; a step of deleting or inactivating at least one gene selected from the group consisting of an alsS gene and an alsD gene, and a poly-γ-glutamate synthase gene, or a poly-γ-glutamate synthase gene and poly-γ- A method comprising the step of enhancing or introducing a glutamate degrading enzyme gene so as to allow expression.
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