JP6101022B2 - Recombinant microorganism and method for producing dipicolinic acid using the same - Google Patents
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Description
本発明は、ジピコリン酸生産能を有する組換え微生物、及び当該組換え微生物を用いたジピコリン酸又はその塩の製造方法に関する。 The present invention relates to a recombinant microorganism having the ability to produce dipicolinic acid, and a method for producing dipicolinic acid or a salt thereof using the recombinant microorganism.
ジピコリン酸（２，６−ピリジンジカルボン酸、ＤＰＡ）は、天然物であり生分解性の高いキレート剤として知られており、産業用の用途として洗剤組成物（特許文献１）や金属隠蔽剤（特許文献２）、酸化防止剤（特許文献３及び４）として利用できることが報告されている。 Dipicolinic acid (2,6-pyridinedicarboxylic acid, DPA) is a natural product and known as a highly biodegradable chelating agent. For industrial use, a detergent composition (Patent Document 1) and a metal concealing agent ( It has been reported that it can be used as Patent Document 2) and an antioxidant (Patent Documents 3 and 4).
ジピコリン酸は、２，６−ルチジンから酸化反応によって合成されることが知られている。すなわち、ニッケル化合物の存在下で次亜ハロゲン酸塩を酸化剤として用いる方法（特許文献５）や、電解酸化法（特許文献６）、空気酸化法（非特許文献１）などが開示されている。しかし、これらの方法では、反応の転化率や選択率が不十分なため、原料である２，６−ルチジンや反応中間体である６−メチル−２−ピリジンカルボン酸等のアルキルピリジンが反応液中に残存し、これらが製品である２，６−ピリジンジカルボン酸（ジピコリン酸）中に不純物として混入してしまう。すなわち、従来のジピコリン酸合成法では、高純度のジピコリン酸を製造することは困難であった。 Dipicolinic acid is known to be synthesized from 2,6-lutidine by an oxidation reaction. That is, a method using a hypohalite as an oxidizing agent in the presence of a nickel compound (Patent Document 5), an electrolytic oxidation method (Patent Document 6), an air oxidation method (Non-Patent Document 1), and the like are disclosed. . However, in these methods, since the conversion rate and selectivity of the reaction are insufficient, 2,6-lutidine as a raw material and alkylpyridine such as 6-methyl-2-pyridinecarboxylic acid as a reaction intermediate are reacted with each other. They remain in the product and are mixed as impurities in 2,6-pyridinedicarboxylic acid (dipicolinic acid), which is a product. That is, it has been difficult to produce high-purity dipicolinic acid by conventional dipicolinic acid synthesis methods.
一方、微生物を使用するジピコリン酸の製造方法によれば、アルキルピリジンを含有することなくジピコリン酸を高純度に製造できると期待される。微生物を用いたジピコリン酸の製造方法としては、胞子を形成する微生物であるバシラス（Bacillus）属を用いた発酵法による製造方法（特許文献７及び８）及びカビを用いた製造方法（特許文献９）が知られている。しかしながら、これらの方法は、工業的に利用可能な生産量を達成できていなかった。 On the other hand, according to the method for producing dipicolinic acid using microorganisms, it is expected that dipicolinic acid can be produced with high purity without containing alkylpyridine. As a method for producing dipicolinic acid using microorganisms, the production method (patent document with spores method producing by fermentation using Bacillus (Bacillus) genus is a microorganism to form a (Patent Documents 7 and 8) and molds 9 )It has been known. However, these methods have not achieved an industrially usable production amount.
遺伝子工学的に改変した微生物を用いたジピコリン酸の製造方法が知られている。特許文献１０には、遺伝子組換えリジン生産菌を利用した製造方法が開示されている。また特許文献１１には、ジピコリン酸合成経路に関与する遺伝子の発現パターンを改変したバシラス（Bacillus）属又はクロストリジウム（Clostridium）属微生物を利用した製造方法が開示されている。 A method for producing dipicolinic acid using a genetically engineered microorganism is known. Patent Document 10 discloses a production method using a recombinant lysine-producing bacterium. Also in Patent Document 11, manufacturing method using the Bacillus (Bacillus) genus or Clostridium (Clostridium) microorganism obtained by modifying the expression pattern of genes involved in dipicolinic acid synthesis pathway is disclosed.
また特許文献１２には、ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌変異株が、酵素の生産性に優れていることが記載されている。しかし、当該変異株においては、プロテアーゼ等の生産性は顕著に向上しているが、一方、アミラーゼの生産性は、欠失させた領域によっては低下する場合があることも記載されている。 Patent Document 12 describes that a Bacillus subtilis mutant obtained by deleting a large region of the genome is excellent in enzyme productivity. However, in the mutant strain, the productivity of protease and the like is remarkably improved, but it is also described that the productivity of amylase may be lowered depending on the deleted region.
本発明は、ジピコリン酸（２，６−ピリジンジカルボン酸、本明細書において、以下ＤＰＡとも称する）を高生産することができる組換え微生物、当該微生物の製造方法、及び当該微生物を用いたＤＰＡ又はその塩の製造方法に関する。 The present invention relates to a recombinant microorganism capable of producing dipicolinic acid (2,6-pyridinedicarboxylic acid, also referred to as DPA in the present specification) at a high rate, a method for producing the microorganism, and a DPA using the microorganism or The present invention relates to a method for producing the salt.
本発明者らは、ＤＰＡを効率良く生産することができる微生物株の開発を進めた。その結果、本発明者らは、野生株に比べてゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入して得られた組換え枯草菌株が、顕著に高いＤＰＡ生産能を有することを見出し、本発明を完成した。 The present inventors have proceeded with the development of a microbial strain capable of efficiently producing DPA. As a result, the inventors of the present invention developed a dipicoline operatively linked to a promoter that works before the spor coat protein deposition phase in the spore formation phase in a Bacillus subtilis mutant strain that lacks a large genomic region compared to the wild strain. The present inventors have found that a recombinant Bacillus subtilis strain obtained by introducing an acid synthase gene has a significantly high ability to produce DPA.
すなわち本発明は、一態様において、以下を提供する：
組換え枯草菌であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、且つ、
胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を有する、
組換え枯草菌。
Thus, in one aspect, the present invention provides the following:
Recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region One or more regions selected from the group consisting of a cgeE-ypmQ region, a yearK-yesX region, a pdp-rocR region, a ycxB-sipU region, a SKIN-Pro7 region, an sbo-ywhH region, a yybP-yyaJ region, and a yncM-fosB region Has a deleted genome, and
Having a dipicolinate synthase gene operably linked to a promoter that works before the spor coat protein deposition phase in the sporulation phase,
Recombinant Bacillus subtilis.
また別の態様において、本発明は、以下を提供する：
組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入する工程を含む、
方法。
In yet another aspect, the present invention provides the following:
A method for producing recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region One or more regions selected from the group consisting of a cgeE-ypmQ region, a yearK-yesX region, a pdp-rocR region, a ycxB-sipU region, a SKIN-Pro7 region, an sbo-ywhH region, a yybP-yyaJ region, and a yncM-fosB region Dipicolinic acid synthase operably linked to a promoter acting before the spor coat protein deposition phase in the spore formation phase in a Bacillus subtilis mutant strain having a genome lacking Comprising the step of introducing the over synthase gene,
Method.
さらに別の態様において、本発明は、上記本発明の組換え枯草菌を用いるジピコリン酸又はその塩の製造方法を提供する。 In still another aspect, the present invention provides a method for producing dipicolinic acid or a salt thereof using the above-described recombinant Bacillus subtilis of the present invention.
本発明の組換え枯草菌は高いＤＰＡ生産能を有する。本発明の組換え枯草菌を用いることによりＤＰＡ又はその塩を効率よく製造することが可能になる。 The recombinant Bacillus subtilis of the present invention has a high DPA production ability. By using the recombinant Bacillus subtilis of the present invention, DPA or a salt thereof can be efficiently produced.
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。 In this specification, the identity of an amino acid sequence and a nucleotide sequence is calculated by Lipman-Pearson method (Lipman, DJ., Pearson. WR .: Science, 227, 1435-1441, 1985). Specifically, it is calculated by performing an analysis by setting Unit size to compare (ktup) as 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又は塩基の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、１〜１２個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個であり得る。また本明細書において、アミノ酸又は塩基の「付加」には、配列の一末端及び両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。 In the present specification, unless otherwise defined, “one or several” used for amino acid or nucleotide deletion, substitution, addition or insertion in an amino acid sequence or nucleotide sequence is, for example, 1 to 12, preferably It may be 1-8, more preferably 1-4. In the present specification, “addition” of amino acids or bases includes addition of one to several amino acids to one and both ends of the sequence.
本明細書において、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の条件が挙げられる。当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。 In this specification, “stringent conditions” relating to hybridization include Molecular Cloning-A Laboratory Manual THIRD EDITION (Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor, 200). Those skilled in the art can appropriately create stringent conditions by adjusting the salt concentration, temperature, etc. of the hybridization solution according to the nucleotide sequence, concentration, length, etc. of the probe.
一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。これら「ストリンジェントな条件」により、塩基配列同一性では約８０％以上若しくは約９０％以上の塩基配列を有する遺伝子の確認が可能である。上記ＳＳＣおよび温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。 For example, the “stringent conditions” are 5 × SSC and 70 ° C. or higher as hybridization conditions, more preferably 5 × SSC and 85 ° C. or higher, and 1 × SSC as washing conditions. 60 ° C. or higher is preferable, and 1 × SSC, 73 ° C. or higher is more preferable. By these “stringent conditions”, a gene having a base sequence identity of about 80% or more or about 90% or more can be confirmed. The combination of the SSC and the temperature condition is an example, and those skilled in the art can realize appropriate stringency by appropriately combining the above or other factors that determine the stringency of hybridization.
本明細書において、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、遺伝子の翻訳開始点からの上流領域及び下流領域には限定されない。 In the present specification, upstream and downstream of a gene indicate a region continuing on the 5 'side and 3' side of the gene or region regarded as a target, respectively. Unless otherwise defined, the upstream and downstream of the gene are not limited to the upstream region and the downstream region from the translation start point of the gene.
本明細書において、転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７１，１３４２−１３４６，１９７４）。 In the present specification, the transcription initiation control region is a region including a promoter and a transcription initiation point, and the translation initiation control region is a site corresponding to a Shine-Dalgarno (SD) sequence that forms a ribosome binding site together with the initiation codon (Shine). J., Dalgarno, L .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 71, 1342-1346, 1974).
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（bacillus.genome.ad.jp/、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。 The name of each gene and genomic region of Bacillus subtilis described herein is JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) published on the Internet (bacillus.genome.ad.jp/, January 18, 2006). (Updated) based on B. subtilis genome data.
本発明の組換え枯草菌は、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株を親株（宿主）として用い、当該親株に、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入することによって作製される。 The recombinant Bacillus subtilis of the present invention uses a Bacillus subtilis mutant strain lacking a large genomic region as a parent strain (host), and can operate on the parent strain with a promoter that works before the spor coat protein deposition phase in the sporulation phase. It is made by introducing a dipicolinate synthase gene linked to the.
上記親株として用いられる枯草菌変異株は、枯草菌野生株（Bacillus subtilis Marburg No.168；本明細書において以下、枯草菌１６８株又は単に１６８株、あるいは野生株と称する）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失している。好ましくは、当該親株としては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域の全てを欠失している枯草菌変異株が挙げられる。このような枯草菌変異株の例としては、特開２００７−１３００１３号公報に記載の枯草菌ＭＧＢ８７４株が挙げられる。あるいは、当該枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株のゲノム領域から、さらに遺伝子又はゲノム領域を欠失させた枯草菌変異株を親株としてもよい。 The Bacillus subtilis mutant used as the parent strain is compared to the genome of Bacillus subtilis Marburg No. 168 (hereinafter referred to as Bacillus subtilis 168 or simply 168, or wild strain in the present specification), A large region in the genome has a deleted genome. That is, in the genome of the Bacillus subtilis mutant strain, in the genome of the Bacillus subtilis wild strain, the profile6 (yoaV-yobO) region, the profile1 (ybbU-ybdE) region, the profile4 (yjcM-yjdJ) region, PBSX (ykdA-xlyA) ) Region, profile5 (ynxB-dut) region, profile3 (ydiM-ydjC) region, spb (yodU-ypqP) region, pks (pksA-ymaC) region, skin (spoIVCB-spoIIIC) region, pps (ppsE-ppsA) region , Profile2 (ydcL-ydeJ) region, ydcL-ydeK-ydhU region, yzB-yitD region, yunA-yurT region, cgeE-ypmQ region, yeK-yesX region, pd One or more regions selected from the group consisting of the -rocR region, ycxB-sipU region, SKIN-Pro7 (spoIVCB-yraK) region, sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region are deleted. . Preferably, as the parent strain, in the genome of Bacillus subtilis wild strain, the profile6 (yoaV-yobO) region, the profile1 (ybbU-ybdE) region, the profile4 (yjcM-yjdJ) region, the PBSX (ykdA-xlyA) region, and the property5 (YnxB-dut) region, profile3 (ydiM-ydjC) region, spb (yodU-ypqP) region, pks (pksA-ymaC) region, skin (spoIVCB-spoIIIC) region, pps (ppsE-ppsA) region, profile2 (ydcL) -YdeJ) region, ydcL-ydeK-ydhU region, yisB-yitD region, yunA-yurT region, cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-locR region ycxB-sipU region, SKIN-Pro7 (spoIVCB-yraK) region, sbo-ywhH region include yybP-yyaJ region and yncM-fosB Bacillus subtilis mutant strain lacking all areas. Examples of such Bacillus subtilis mutant strains include Bacillus subtilis MGB874 strain described in JP-A-2007-130013. Alternatively, a Bacillus subtilis mutant obtained by further deleting a gene or genomic region from the genomic region of the Bacillus subtilis mutant MGB874 strain may be used as the parent strain.
上記親株は、例えば、１６８株等の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノムを、公開されている枯草菌１６８株のゲノムと対比することにより決定することができる。枯草菌１６８株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のＢＳＯＲＦ ＤＢ、又はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335）から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、１又は数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個）の塩基における天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において５０％以上同一、好ましくは６０％以上同一、より好ましくは７０％以上同一、さらに好ましくは８０％以上同一、さらにより好ましくは９０％以上同一、なお好ましくは９５％以上同一なゲノム領域であり得る。 The parent strain can be prepared, for example, by deleting the aforementioned genomic region from any Bacillus subtilis strain such as 168 strain. The target genomic region to be deleted can be determined, for example, by comparing the genome of any Bacillus subtilis strain with the published genome of Bacillus subtilis 168 strain. The complete nucleotide sequence and genome information of Bacillus subtilis 168 strain can be obtained from the above-mentioned BSORF DB or GenBank: AL009126.2 (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335). Those skilled in the art can determine the target genomic region to be deleted based on the genomic information of Bacillus subtilis 168 obtained from these information sources. Here, the genomic region to be deleted is one or several (for example, 1 to 100, preferably 1 to 50) of the nucleotide sequence of the aforementioned genomic region in the publicly available Bacillus subtilis 168 strain. More preferably 1-30 nucleotides, more preferably 1-10, still more preferably 1-5 nucleotides, including natural or artificially induced deletions, substitutions, insertions, additions, etc. It can be a genomic region having a sequence. Alternatively, the genomic region to be deleted is 50% or more identical, preferably 60% or more identical, more preferably 70% or more identical in nucleotide sequence to the aforementioned genomic region in the publicly available Bacillus subtilis 168 strain, More preferably, the genomic region may be 80% or more identical, even more preferably 90% or more identical, and still more preferably 95% or more identical.
あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表１記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばＳＯＥ−ＰＣＲ法（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ：Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）等により調製された欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開２００７−１３００１３号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。 Alternatively, the genomic region to be deleted can be expressed as a region sandwiched between a pair of oligonucleotide sets shown in Table 1. A method for deleting the region described in Table 1 from the Bacillus subtilis genome is not particularly limited. For example, deletion prepared by SOE-PCR (splicing by overlap extension PCR: Gene, 77, 61, 1989) or the like. And double crossover method using DNA fragments. The procedure for preparing a mutant strain in which a predetermined genomic region has been deleted from a Bacillus subtilis wild strain by this method is described in detail in JP-A-2007-130013.
ＳＯＥ−ＰＣＲ法による欠失用ＤＮＡ断片の調製と当該欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図１に示す。初めに、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したＤＮＡ断片を調製する。 FIG. 1 shows an outline of procedures for preparing a deletion DNA fragment by the SOE-PCR method and deleting the target region by the double crossover method using the deletion DNA fragment. First, by the SOE-PCR method, a fragment corresponding to an about 0.1 to 3 kb region adjacent to the upstream of the target region to be deleted (referred to as an upstream fragment) and an about 0.1 to 3 kb adjacent to the downstream in the same manner A DNA fragment in which fragments corresponding to regions (referred to as downstream fragments) are linked is prepared. Preferably, in order to confirm the deletion of the target region, a DNA fragment in which a marker gene fragment such as a drug resistance gene is further linked between the upstream fragment and the downstream fragment is prepared.
まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片（図１中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Ｃｍ）の３断片を調製する。上流断片及び下流断片のＰＣＲ増幅の際には、後に連結される断片の末端１０〜３０ヌクレオチドの配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で連結させる場合、上流断片Ａの下流末端に結合するプライマーの５’末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に結合するプライマーの５’末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ’の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ’の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。 First, by the first PCR, an upstream fragment A and a downstream fragment B of the region to be deleted and, if necessary, three fragments of a marker gene fragment (in FIG. 1, chloramphenicol resistance gene fragment Cm) are prepared. To do. In PCR amplification of the upstream fragment and the downstream fragment, a primer added with a sequence of terminal 10 to 30 nucleotides of the fragment to be ligated later is used. For example, when linking the upstream fragment A, the drug resistance marker gene fragment Cm, and the downstream fragment B in this order, the upstream side of the drug resistance marker gene fragment Cm is attached to the 5 ′ end of the primer that binds to the downstream end of the upstream fragment A. A sequence corresponding to 10 to 30 nucleotides is added (FIG. 1, primer DR1), and at the 5 ′ end of the primer that binds to the upstream end of the downstream fragment B, to the downstream 10 to 30 nucleotides of the drug resistance marker gene fragment Cm. The corresponding sequence is added (FIG. 1, primer DF2). When the upstream fragment A and the downstream fragment B are amplified by PCR using the primer set designed in this way, a region corresponding to the upstream side of the drug resistance marker gene fragment Cm is present on the downstream side of the amplified upstream fragment A ′. Thus, a region corresponding to the downstream side of the drug resistance marker gene fragment Cm is added to the upstream side of the amplified downstream fragment B ′.
次に、１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ’、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ’を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる。 Next, the upstream fragment A ′, the drug resistance marker gene fragment Cm, and the downstream fragment B ′ prepared by the first PCR are mixed and used as a template, and a primer that binds to the upstream side of the upstream fragment (FIG. 1, primer DF1) A second PCR is performed using a pair of primers consisting of a primer (FIG. 1, primer DR2) that binds to the downstream side of the downstream fragment. By this second PCR, a deletion DNA fragment D in which the upstream fragment A, the drug resistance marker gene fragment Cm, and the downstream fragment B are combined in this order can be amplified.
上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用ＤＮＡ断片を調製した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。 A deletion DNA fragment obtained by the above-described method or the like is inserted into a plasmid using an ordinary restriction enzyme and DNA ligase to construct a deletion introduction plasmid. Alternatively, after preparing a deletion DNA fragment in which the upstream fragment and the downstream fragment are directly linked, the deletion DNA fragment is inserted into a plasmid containing a drug resistance marker gene, so that the drug is added to the upstream fragment and the downstream fragment. A plasmid for introducing a deletion having a resistance marker gene fragment can be constructed.
上記手順で構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で２重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在する薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片で形質転換処理をした菌を、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。 The deletion-introducing plasmid constructed by the above procedure is introduced into Bacillus subtilis for which the genomic region is to be deleted by a conventional technique such as competent cell transformation. The introduction of the plasmid causes double crossover homologous recombination between the upstream and downstream fragments on the plasmid and the region homologous to those of the Bacillus subtilis genome, and the region to be deleted becomes a drug resistance marker gene. Replaced transformants are obtained (FIG. 1). The transformant can be selected using the expression of a marker gene such as a drug resistance gene present in the deletion DNA fragment as an indicator. For example, a bacterium that has been transformed with a chloramphenicol resistance gene fragment is cultured in a medium containing an antibiotic (such as chloramphenicol), and the grown colonies are recovered, so that the target region is deleted. A transformant substituted with a chloramphenicol resistance gene can be obtained. Furthermore, by extracting the genomic DNA of the transformant and performing PCR using this as a template, it can be confirmed that the target region has been deleted.
次に、得られた形質転換体から、ゲノムＤＮＡに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図２に示すような２段階相同組換え法を用いることができる（特開平２００９−２５４３５０号公報参照）。当該方法では、初めに第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（下流断片）が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したＤＮＡ断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第１のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第２のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図２を参照）。 Next, the marker gene inserted into the genomic DNA is removed from the obtained transformant. The removal procedure is not particularly limited, but a two-step homologous recombination method as shown in FIG. 2 can be used (see JP 2009-254350 A). In this method, first, a DNA fragment (donor DNA) for the first homologous recombination is prepared. Although it does not specifically limit as a preparation method, The above-mentioned SOE-PCR method etc. are mentioned. Examples of donor DNA include an about 0.1 to 3 kb fragment (upstream fragment) corresponding to a region adjacent to the upstream of the marker gene region to be removed (ie, the deleted region) and a region adjacent to the downstream as well. A DNA fragment in which an approximately 0.1 to 3 kb fragment (downstream fragment) corresponding to is bound to a fragment in the downstream region of the marker gene to be removed can be used. Preferably, a DNA fragment in which a second marker gene or the like serving as an index for homologous recombination is inserted between the downstream fragment and the downstream region fragment of the first marker gene to be removed (see FIG. 2). reference).
次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第１のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した第２のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第２のマーカー遺伝子、第１のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図２参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第１のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。 Next, the prepared donor DNA is introduced into the transformant by a conventional technique such as competent cell transformation, and corresponds to the upstream fragment and the downstream region of the first marker gene on the transformant genome. Homologous recombination occurs between the regions (first homologous recombination). A transformant in which the desired homologous recombination has occurred can be selected using the expression of the second marker gene inserted into the donor DNA as an indicator. In the genomic DNA of a transformant in which the first homologous recombination has occurred appropriately, an upstream fragment, a downstream fragment, and, if necessary, a second marker gene, a first marker gene downstream region, and a downstream fragment are arranged in order. (See FIG. 2). In genomic DNA having such an arrangement, homologous recombination can occur spontaneously between the two downstream fragments (intragenomic homologous recombination). By this intragenomic homologous recombination, the region located between the two downstream fragments is deleted, whereby the first marker gene is removed from the transformant genome.
ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第１のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ，１９７０）。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第２のマーカーとしてchpA遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる（特開２００９-２５４３５０号公報）。 As a means for selecting a transformant in which homologous recombination has occurred in the genome, when the first marker gene is a drug resistance gene, a method of selecting a bacterium having no drug resistance can be mentioned. Penicillin antibiotics act bactericidally on proliferating cells but not non-proliferating cells. Therefore, if a bacterium is cultured in the presence of a drug and a penicillin antibiotic, a drug non-resistant bacterium that does not grow in the presence of the drug can be selectively concentrated (Methods in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, 1970). . Another means is a method of introducing a lethal gene. For example, if a lethal gene such as the chpA gene is introduced into the bacterium as the second marker, the bacterium that did not undergo homologous recombination within the genome will die due to the action of the lethal gene. Transformants can be selected. By extracting genomic DNA from the selected strain and performing PCR using this as a template, it can be confirmed that the target region has been deleted (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-254350).
以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。 As described above, a Bacillus subtilis mutant strain lacking a predetermined region on the genome can be prepared. Furthermore, by repeating the procedure, a Bacillus subtilis mutant strain in which all the genomic regions described above are deleted can be produced.
本発明の組換え枯草菌は、上述した親株に、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより得ることができる。上記遺伝子が導入された本発明の組換え枯草菌は、優れたＤＰＡ産生能を有する。 The recombinant Bacillus subtilis of the present invention can be obtained by introducing a dipicolinate synthase gene operably linked to a promoter acting before the spore coat protein deposition phase in the spore formation phase into the parent strain described above. The recombinant Bacillus subtilis of the present invention into which the above gene is introduced has an excellent ability to produce DPA.
本明細書において「プロモーターと作動可能に連結された遺伝子」とは、当該プロモーターによる制御の下に発現し得るように配置されている遺伝子をいう。 In the present specification, the “gene operably linked to a promoter” refers to a gene arranged so that it can be expressed under the control of the promoter.
本明細書において、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期とは、枯草菌の胞子形成過程において第Ｖ期と称されている期間を意味する。枯草菌の胞子形成過程は、栄養増殖による細胞分裂が停止する第０期に始まり、隔膜が形成される第ＩＩ期、隔膜で隔てられた一方にフォアスポアが形成される第ＩＩＩ期、フォアスポア外周にコルテックス層が形成される第ＩＶ期、コルテックス層の外周にスポアコートタンパク質が沈着する第Ｖ期が含まれる。枯草菌の胞子形成における第０期においてはＲＮＡポリメラーゼであるσＡ及びσＨが遺伝子の転写を制御している。第ＩＩ期においては、隔膜で隔てられた一方側でσＦが転写を制御し、他方側でσＥが転写を制御している。また、第ＩＩＩ期においては、フォアスポア内でσＧが転写を制御し、フォアスポア外でσＥが転写を制御している。さらに、第ＩＶ期においては、スポアコート層に覆われた胞子内部でσＧが転写を制御し、胞子外部でσＫが転写を制御している。さらにまた、第Ｖ期において、スポアコートに覆われた胞子内部でσＧが転写を制御し、胞子外部でσＫが転写を制御している。 In this specification, the spore coat protein deposition period in the spore formation period means a period referred to as the V period in the spore formation process of Bacillus subtilis. The spore formation process of Bacillus subtilis begins in phase 0 when cell division by vegetative growth stops, phase II in which the diaphragm is formed, phase III in which the forapore is formed on one side separated by the diaphragm, Phase IV in which the cortex layer is formed, and phase V in which spore coat protein is deposited on the outer periphery of the cortex layer are included. In the 0th phase of Bacillus subtilis sporulation, RNA polymerases σA and σH control gene transcription. In stage II, σF controls transcription on one side separated by a diaphragm, and σE controls transcription on the other side. In stage III, σG controls transcription within the forespore, and σE controls transcription outside the forespore. Furthermore, in the IV stage, σG controls transcription inside the spore covered with the spore coat layer, and σK controls transcription outside the spore. Furthermore, in the V stage, σG controls transcription inside the spores covered with the spore coat, and σK controls transcription outside the spores.
したがって、枯草菌の場合、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターとしては、σＡ因子依存性プロモーター、σＨ因子依存性プロモーター、σＥ因子依存性プロモーター及びσＦ因子依存性プロモーターが挙げられる。構成的に作用するプロモーターを使用することが好ましく、より好ましい例としては、σＡ依存性プロモーター及びσＨ依存性プロモーターが挙げられる。また、環境ストレスに応じて発現するσＢ因子依存性プロモーターや、ＥＣＦ（ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）σ因子依存性プロモーター（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１４，２２０（１），１５５−６０，２００３）を使用することもできる。 Therefore, in the case of Bacillus subtilis, promoters that function before the spor coat protein deposition phase in the spore formation phase include σA factor-dependent promoters, σH factor-dependent promoters, σE factor-dependent promoters, and σF factor-dependent promoters. . It is preferable to use a promoter that acts constitutively, and more preferable examples include a σA-dependent promoter and a σH-dependent promoter. Moreover, it is also possible to use a σB factor-dependent promoter that is expressed in response to environmental stress, or an ECF (extracytoplasmic function) σ factor-dependent promoter (FEMS Microbiol Lett., 14, 220 (1), 155-60, 2003). it can.
σＡ因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、枯草菌ファージＳＰ０１プロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，４３９−４４３，１９８４）、ｖｅｇ遺伝子、ａｍｙＥ（アミラーゼ）遺伝子、ａｐｒＥ（ズブチリシン）遺伝子及びＳ２３７（Ｓ２３７セルラーゼ、特開２０００−２１００８１号公報）遺伝子のプロモーターを挙げることができる。σＨ因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、ｃｉｔＧ遺伝子、ｓｐｏＶＳ遺伝子及びｓｐｏＶＧ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． （１９８６） ８３：９４３８−９４４２．）遺伝子のプロモーターが挙げられる。σＥ因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、ｃｏｔＥ遺伝子及びｓｐｏＩＶＡ遺伝子のプロモーターが挙げられる。本方法においては、特に、Bacillus subtilisのｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター、及びＳ２３７セルラーゼ遺伝子のプロモーターが望ましい。 The σA factor-dependent promoter is not particularly limited. However, the Bacillus subtilis phage SP01 promoter (Proc. Natl. Acd. Sci. USA., 81, 439-443, 1984), veg gene, amyE (amylase) gene, aprE ( Subtilisin) gene and S237 (S237 cellulase, JP 2000-210081) gene promoters. The σH factor-dependent promoter is not particularly limited, and examples include promoters of citG gene, spoVS gene, and spoVG (Proc. Natl. Acd. Sci. USA. (1986) 83: 9438-9442.) gene. The σE factor-dependent promoter is not particularly limited, and examples include promoters for the cotE gene and the spoIVA gene. In the present method, the promoter of spoVG gene of Bacillus subtilis and the promoter of S237 cellulase gene are particularly desirable.
本明細書において、所定の遺伝子のプロモーターとは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義される。より具体的には、所定の遺伝子のプロモーターとは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域を意味する。 In the present specification, the promoter of a predetermined gene is defined as a region that exists upstream of the coding region in the gene and has a function of controlling the transcription of the gene by the interaction of RNA polymerase. More specifically, the promoter of a predetermined gene means a region of about 200 to 600 nucleotides upstream of the coding region in the gene.
より具体的な例として、σＨ因子依存性プロモーターであるｓｐｏＶＧ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。さらに、配列番号１に示すヌクレオチド配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、σＨ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド、又は配列番号１に示すヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、σＨ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチドも、当該σＨ因子依存性プロモーターとして本発明で使用することができる。ここで、「σＨ因子依存性プロモーターとして機能する」とは、ＲＮＡポリメラーゼであるσＨ因子によって特異的に転写制御されることを意味する。この特異性は、評価対象となるポリヌクレオチドの下流にレポーター遺伝子を結合し、σＨ因子存在下及び不存在下でのレポーター遺伝子の発現を観察することによって評価することができる。 As a more specific example, the nucleotide sequence of the spoVG gene promoter which is a σH factor dependent promoter is shown in SEQ ID NO: 1. Further, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are substituted, deleted, added or inserted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and functioning as a σH factor-dependent promoter, or a sequence 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably, 80% or more with respect to the nucleotide sequence shown in No. 1. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 99% or more identity and functioning as a σH factor-dependent promoter can also be used in the present invention as the σH factor-dependent promoter. Here, “functions as a σH factor-dependent promoter” means that transcription is specifically controlled by a σH factor that is an RNA polymerase. This specificity can be evaluated by binding a reporter gene downstream of the polynucleotide to be evaluated and observing the expression of the reporter gene in the presence and absence of the σH factor.
別の具体的な例として、σＡ因子依存性プロモーターであるＳ２３７セルラーゼ遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列を配列番号２に示す。さらに、配列番号２に示すヌクレオチド配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、σＡ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド、又は配列番号２に示すヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、σＡ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチドも、当該σＡ因子依存性プロモーターとして本発明で使用することができる。ここで、「σＡ因子依存性プロモーターとして機能する」とは、ＲＮＡポリメラーゼであるσＡ因子によって特異的に転写制御されることを意味する。この特異性は、評価対象となるポリヌクレオチドの下流にレポーター遺伝子を結合し、σＡ因子存在下及び不存在下でのレポーター遺伝子の発現を観察することによって評価することができる。 As another specific example, the nucleotide sequence of the promoter of the S237 cellulase gene, which is a σA factor-dependent promoter, is shown in SEQ ID NO: 2. Furthermore, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are substituted, deleted, added or inserted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and functioning as a σA factor-dependent promoter, or a sequence 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 80% or more with respect to the nucleotide sequence shown in No. 2. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 99% or more identity and functioning as a σA factor-dependent promoter can also be used in the present invention as the σA factor-dependent promoter. Here, “functions as a σA factor-dependent promoter” means that the transcription is specifically regulated by the σA factor which is an RNA polymerase. This specificity can be evaluated by binding a reporter gene downstream of the polynucleotide to be evaluated and observing the expression of the reporter gene in the presence and absence of the σA factor.
同様に、本方法において好適に使用されるσＥ因子依存性プロモーターであるｃｏｔＥ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を配列番号３に示す。 Similarly, SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of the cotE gene promoter, which is a σE factor-dependent promoter preferably used in the present method.
例えば他のバチルス属の微生物やクロストリジウム属の微生物のように、枯草菌以外の微生物でも、枯草菌の胞子形成過程と同様な過程を経て胞子が形成される。すなわち、枯草菌以外の微生物であっても、胞子形成過程にスポアコート沈着期が含まれる。したがって、枯草菌以外の微生物からも、スポアコート沈着期より前において働くプロモーターを一義的に同定して単離することができる。例えば、枯草菌以外の他のバチルス属の微生物におけるσＡ因子依存性プロモーター、σＨ因子依存性プロモーター、σＥ因子依存性プロモーター及びσＦ因子依存性プロモーターは、本発明に使用され得るプロモーターである。また例えば、上記クロストリジウム属の微生物においては、σＡ依存性プロモーターに相当するプロモーターとしてｐｔｂ遺伝子プロモーターが知られている。また、クロストリジウム属の微生物においてσＨ依存性プロモーターに相当するプロモーターとしては、ｓｐｏＶＧ遺伝子プロモーターが知られている。さらに、クロストリジウム属の微生物においてσＥ依存性プロモーターに相当するプロモーターとしては、ｆｌｇＥ遺伝子プロモーターが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８７，７１０３−７１１８，２００５及びＮｕｃｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，６，１９７３−１９８１，２００４参照）。 For example, microorganisms other than Bacillus subtilis, such as other Bacillus microorganisms or Clostridium microorganisms, form spores through a process similar to that of Bacillus subtilis. That is, even for microorganisms other than Bacillus subtilis, the spor coat deposition period is included in the spore formation process. Therefore, it is possible to uniquely identify and isolate a promoter that acts before the spoacoat deposition period from microorganisms other than Bacillus subtilis. For example, σA factor-dependent promoters, σH factor-dependent promoters, σE factor-dependent promoters, and σF factor-dependent promoters in other Bacillus microorganisms other than Bacillus subtilis are promoters that can be used in the present invention. In addition, for example, in the above Clostridium microorganism, a ptb gene promoter is known as a promoter corresponding to a σA-dependent promoter. In addition, the spoVG gene promoter is known as a promoter corresponding to the σH-dependent promoter in Clostridium microorganisms. Furthermore, as a promoter corresponding to the σE-dependent promoter in microorganisms of the genus Clostridium, the flgE gene promoter is known (Journal of Bacteriology, 187, 7103-7118, 2005 and Nucleic Acids Research, 32, 6, 1973-1981). , 2004).
本明細書において、上述したプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子とは、下記の化学反応を進行させる活性を有するジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子である。 In the present specification, the dipicolinate synthase gene operably linked to the above-described promoter is a gene encoding dipicolinate synthase having an activity to promote the following chemical reaction.
枯草菌におけるジピコリン酸シンターゼ遺伝子は、ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡをコードするｓｐｏＶＦＡと、ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢをコードするｓｐｏＶＦＢとから構成されている。枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子のヌクレオチド配列及び当該ｓｐｏＶＦＡ遺伝子によりコードされるジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡのアミノ酸をそれぞれ配列番号４及び５に示す。また、枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子のヌクレオチド配列及び当該ｓｐｏＶＦＢ遺伝子によりコードされるジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び７に示す。なお、野生型の枯草菌において、ｓｐｏＶＦＡ及びｓｐｏＶＦＢはこの順で配置されてオペロンを形成しており、共にσＫ因子依存性プロモーターにより転写制御されている。したがって、野生型の枯草菌において、ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子は枯草菌胞子形成過程における第Ｖ期に発現し、内生胞子中にジピコリン酸が蓄積することとなる。 The dipicolinate synthase gene in Bacillus subtilis is composed of spoVFA encoding dipicolinate synthase subunit A and spoVFB encoding dipicolinate synthase subunit B. The nucleotide sequence of the Bacillus subtilis spoVFA gene and the amino acid of dipicolinate synthase subunit A encoded by the spoVFA gene are shown in SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively. The nucleotide sequence of the Bacillus subtilis spoVFB gene and the amino acid sequence of dipicolinate synthase subunit B encoded by the spoVFB gene are shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively. In wild-type Bacillus subtilis, spoVFA and spoVFB are arranged in this order to form an operon, and both are transcriptionally controlled by a σK factor-dependent promoter. Therefore, in wild-type Bacillus subtilis, spoVFA gene and spoVFB gene are expressed in the V stage in the Bacillus subtilis spore formation process, and dipicolinic acid is accumulated in the endospore.
本発明で使用できるジピコリン酸シンターゼ遺伝子の例としては、以下の（i）及び（ii）の組み合わせが挙げられる。
（i）以下のいずれかである枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子：
配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４に示すヌクレオチド配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び、
配列番号５に示すアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ii）以下のいずれかである枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子：
配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号６に示すヌクレオチド配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び、
配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Examples of the dipicolinate synthase gene that can be used in the present invention include the following combinations (i) and (ii).
(I) Bacillus subtilis spoVFA or a gene corresponding to any of the following:
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4. % Or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFB or a gene corresponding thereto. A polynucleotide encoding a protein that exhibits dipicolinate synthase activity.
Hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFB or a gene equivalent thereto. A polynucleotide encoding the protein to be
A polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
Dipicolinate synthase activity in the presence of a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and encoded by Bacillus subtilis spoVFB or a gene corresponding thereto A polynucleotide encoding a protein that exerts:
50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85%, more preferably 90% or more, more preferably 95% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 Or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more of an amino acid sequence having a protein that exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFB or a gene corresponding thereto. Encoding polynucleotide.
(Ii) Bacillus subtilis spoVFB or any of the following genes:
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
60% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. % Or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFA or a gene corresponding thereto. A polynucleotide encoding a protein that exhibits dipicolinate synthase activity.
Hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFA or a corresponding gene. A polynucleotide encoding the protein to be
A polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7;
Dipicolinate synthase activity in the presence of a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and encoded by Bacillus subtilis spoVFA or a gene corresponding thereto A polynucleotide encoding a protein that exerts:
60% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85%, more preferably 90% or more, more preferably 95% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 Or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more of an amino acid sequence that exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFA or a gene corresponding thereto. Encoding polynucleotide.
さらに、上記枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子に相当する遺伝子の例としては、枯草菌以外の微生物由来のジピコリン酸シンターゼ遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物に由来するジピコリン酸シンターゼ遺伝子の例としては、Bacillus licheniformis由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号８）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号９）、Bacillus clausii由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号１０）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号１１）、Clostridium thermocellum由来のＣｔｈｅＤＲＡＦＴ＿２１７０（配列番号１２）及びＣＴＨＥＤＲＡＦＴ＿２１７１（配列番号１３）、Bacillus atrophaeus由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号１４）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号１５）、ならびにBacillus amyloliquefaciens由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号１６）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号１７）等を挙げることができる。本方法においては、上述した如何なる微生物由来のジピコリン酸シンターゼ遺伝子をも使用することができる。 Furthermore, examples of genes corresponding to the Bacillus subtilis spoVFA gene and spoVFB gene include dipicolinate synthase genes derived from microorganisms other than Bacillus subtilis. Examples of dipicolinate synthase genes derived from microorganisms other than Bacillus subtilis include spoVFA (SEQ ID NO: 8) and spoVFB (SEQ ID NO: 9) derived from Bacillus licheniformis , spoVFA (SEQ ID NO: 10) and spoVFB (SEQ ID NO: 10) derived from Bacillus clausii . 11), CtheDRAFT — 2170 (SEQ ID NO: 12) and CTHEDRAFT — 2171 (SEQ ID NO: 13) from Clostridium thermocellum , spoVFA (SEQ ID NO: 14) and spoVFB (SEQ ID NO: 15) from Bacillus atrophaeus, and spoVFA from Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 16) And spoVFB (SEQ ID NO: 17). In this method, any microorganism-derived dipicolinate synthase gene described above can be used.
本発明の組換え枯草菌において、上述したジピコリン酸シンターゼ遺伝子は、上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されている。したがって、本発明の組換え枯草菌において、当該ピコリン酸シンターゼ遺伝子は、当該胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーター支配下に転写される。 In the recombinant Bacillus subtilis of the present invention, the above-described dipicolinate synthase gene is operably linked to a promoter that works before the spor coat protein deposition phase in the sporulation phase. Therefore, in the recombinant Bacillus subtilis of the present invention, the picolinate synthase gene is transcribed under the control of a promoter that works before the spore coat protein deposition phase in the sporulation phase.
上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーター及び上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子は、当該プロモーターの制御下に当該遺伝子が発現されるように配置され、さらに宿主ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片として構築され得る。このＤＮＡ断片を上述した親株（宿主）に導入すれば、宿主ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、宿主を形質転換することができる。形質転換法としては、宿主となる微生物に応じて適切な、且つ一般的な方法を採用することができる。例えば、上流から、上述したプロモーター（例えば、ｓｐｏＶＧ遺伝子プロモーター）、ｓｐｏＶＦＡ、ｓｐｏＶＦＢの順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製する。得られたＤＮＡ断片を用いて宿主を形質転換する。 The promoter that works before the spore coat protein deposition phase in the sporulation phase and the dipicolinate synthase gene are arranged so that the gene is expressed under the control of the promoter, and is further linked to a homologous region with the host genome. As a DNA fragment. If this DNA fragment is introduced into the parent strain (host) described above, the DNA fragment is inserted into the host genome, and the host can be transformed. As a transformation method, an appropriate and general method can be adopted depending on the microorganism as a host. For example, from the upstream, prepare the above-mentioned promoter (for example, spoVG gene promoter), spoVFA, and spoVFB in this order, and then prepare a DNA fragment by combining the fragment with a homologous region of the parental genome. To do. A host is transformed with the obtained DNA fragment.
あるいは、上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーター及び上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子は、当該プロモーターの制御下に当該遺伝子が発現されるように所望のベクターに組み込まれ得る。例えば、上述したプロモーター（例えば、ｓｐｏＶＧ遺伝子プロモーター）領域、ｓｐｏＶＦＡ遺伝子、及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子の断片をＰＣＲ等によって増幅し、次いで当該断片を制限酵素法等の通常の方法によってベクターに挿入し、連結すればよい。その際、ベクター上で、上流から当該プロモーター断片、ｓｐｏＶＦＡ断片、ｓｐｏＶＦＢ断片の順で連結されているようにする。得られた組換えベクターを用いて通常の方法に従い宿主を形質転換することができる。 Alternatively, the promoter that works before the spore coat protein deposition phase in the sporulation phase and the dipicolinate synthase gene can be incorporated into a desired vector so that the gene is expressed under the control of the promoter. For example, if the above-mentioned promoter (for example, spoVG gene promoter) region, spoVFA gene, and spoVFB gene fragment are amplified by PCR or the like, then the fragment is inserted into a vector by a usual method such as a restriction enzyme method and ligated. Good. At that time, the promoter fragment, spoVFA fragment, and spoVFB fragment are ligated in this order from the upstream on the vector. Using the obtained recombinant vector, a host can be transformed according to a usual method.
遺伝子の増幅にはＰＣＲ法などを用いることができる。ＰＣＲ反応は、例えばＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いることができ、反応条件は酵素の製品説明書に従って行えばよい。 A PCR method or the like can be used for gene amplification. For the PCR reaction, for example, Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio) can be used, and the reaction conditions may be performed according to the product instructions for the enzyme.
上記ベクターとしては、プラスミド等の通常のベクターを使用することができる。当該ベクターの種類は、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。また当該プラスミドは、宿主内で自己複製可能なプラスミドであることが好ましく、そのプラスミドが多コピーであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が宿主ゲノム（染色体）に対し、２以上１００コピー以下であれば良く、好ましくは２以上５０コピー以下、より好ましくは２以上３０コピー以下であれば良い。好ましいプラスミドの例としては、例えば、ｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＹＥｇ１Ｓ等が挙げられる。 A normal vector such as a plasmid can be used as the vector. The type of the vector can be appropriately selected according to the type of host. The plasmid is preferably a plasmid capable of self-replication in a host, and more preferably the plasmid is multi-copy. Furthermore, the number of copies of the plasmid may be 2 or more and 100 or less, preferably 2 or more and 50 or less, more preferably 2 or more and 30 or less, relative to the host genome (chromosome). Examples of preferable plasmids include pT181, pC194, pUB110, pE194, pSN2, pHY300PLK, pHYEg1S, and the like.
構築された目的遺伝子を含むベクターは、通常の手法、例えばプロトプラスト法（Ｃｈａｍｇ Ｓ．＆Ｃｏｈｅｎ，ＳＨ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１−１１５，１９７９）やコンピテントセル法（Ｙｏｕｎｇ ＦＥ．＆Ｓｐｉｚｉｚｅｎ Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，８６，３９２−４００，１９６３）により、宿主に導入され得る。 The constructed vector containing the target gene can be prepared by a conventional method such as the protoplast method (Chams S. & Cohen, SH., Mol. Gen. Genet., 168, 111-115, 1979) or the competent cell method (Young FE. & Spizizen J., J. Bacteriol., 86, 392-400, 1963).
さらにまた、上述したＤＮＡ断片で形質転換した組換え微生物を、上述した組換えベクターを用いて再度、形質転換することによって、上述したジピコリン酸シンターゼ遺伝子を高発現できる組換え微生物を取得することができる。形質転換された組換え微生物においては、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーター支配下にジピコリン酸シンターゼ遺伝子が転写されることとなる。 Furthermore, a recombinant microorganism capable of highly expressing the above-described dipicolinate synthase gene can be obtained by transforming the recombinant microorganism transformed with the above-described DNA fragment again with the above-described recombinant vector. it can. In the transformed recombinant microorganism, the dipicolinate synthase gene is transcribed under the control of a promoter that works before the spore coat protein deposition phase in the spore formation phase.
以上の手順で、ゲノムの大領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子が導入された、本発明の組換え枯草菌を作製することができる。本発明の組換え枯草菌は高いＤＰＡ生産能を有している。本発明の組換え枯草菌のＤＰＡ生産能は、同じプロモーターとジピコリン酸シンターゼ遺伝子とが導入された枯草菌野生株（１６８株）と比べて顕著に向上している（下記試験例１〜３参照）。本発明の組換え枯草菌を培養することによって当該菌内に効率よくＤＰＡが生産される。したがって、本発明の別の態様は、上述した本発明の組換え枯草菌を用いるＤＰＡ又はその塩の製造方法に関する。 Through the above procedure, a dipicolinate synthase gene operably linked to a promoter that works before the spor coat protein deposition phase in the spore formation phase is introduced into a Bacillus subtilis mutant strain having a genome in which a large region of the genome has been deleted. In addition, the recombinant Bacillus subtilis of the present invention can be produced. The recombinant Bacillus subtilis of the present invention has a high DPA production ability. The DPA producing ability of the recombinant Bacillus subtilis of the present invention is remarkably improved as compared to the Bacillus subtilis wild strain (168 strain) into which the same promoter and dipicolinate synthase gene are introduced (see Test Examples 1 to 3 below). ). By culturing the recombinant Bacillus subtilis of the present invention, DPA is efficiently produced in the bacterium. Therefore, another aspect of the present invention relates to a method for producing DPA or a salt thereof using the aforementioned recombinant Bacillus subtilis of the present invention.
本発明のＤＰＡ又はその塩の製造方法においては、先ず、上記本発明の組換え枯草菌を培養する。培養する方法に特に制限はなく、通常の微生物の培養方法を用いることができる。すなわち、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含む通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷん及びセルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、グリセロール、エタノール、ソルビトール等のアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸を用いることができる。窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水、尿素、グルタミン酸、リジン、グリシン、アラニン、メチオニン、アスパラギン酸、アルギニン酸等を用いることができる。有機微量栄養源として、ビタミン類、アミノ酸等の要求物質、又は、必要に応じて酵母エキス、コーンスティープリカー等を含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、銅イオン、鉄イオン、マンガンイオン等を添加することが望ましい。場合によっては、消泡剤等も添加される。 In the method for producing DPA or a salt thereof of the present invention, first, the recombinant Bacillus subtilis of the present invention is cultured. There is no restriction | limiting in particular in the method to culture | cultivate, The normal culture method of microorganisms can be used. That is, the medium to be used is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as required. As the carbon source, glucose, lactose, galactose, fructose, starch and cellulose hydrolysates, sugars such as molasses, alcohols such as glycerol, ethanol and sorbitol, organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid are used. be able to. Inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate as the nitrogen source, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia, urea, glutamic acid, lysine, glycine, alanine, methionine, aspartic acid, arginic acid, etc. Can be used. As organic trace nutrient sources, it is desirable to contain required substances such as vitamins and amino acids, or yeast extract, corn steep liquor and the like as necessary. In addition to these, it is desirable to add potassium phosphate, magnesium sulfate, calcium chloride, sodium chloride, copper ions, iron ions, manganese ions, and the like as necessary. In some cases, an antifoaming agent or the like is also added.
培地のｐＨは６．０〜８．０に調節することが適当であり、ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養は、１５〜４５℃、好ましくは２５〜４５℃で、６〜９６時間、更に好ましくは２４〜７２時間行い、必要により通気や攪拌を加えてもよい。なお、組換え枯草菌の場合は、培地のｐＨは、親株として用いた枯草菌が生育し得る範囲、例えば、ｐＨ６．０〜８．０に調整するのが好適である。また、培養条件は、１５〜４２℃、好ましくは２８〜３７℃で２〜４日間振盪、又は通気撹拌培養すればよい。 The pH of the medium is suitably adjusted to 6.0 to 8.0, and the pH may be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. Culturing is carried out at 15 to 45 ° C., preferably 25 to 45 ° C., for 6 to 96 hours, more preferably 24 to 72 hours, and aeration or agitation may be added if necessary. In the case of recombinant Bacillus subtilis, the pH of the medium is preferably adjusted to a range where Bacillus subtilis used as a parent strain can grow, for example, pH 6.0 to 8.0. The culture conditions may be 15 to 42 ° C., preferably 28 to 37 ° C. for 2 to 4 days with shaking or aeration and agitation.
以上のように、本発明の組換え枯草菌を培養することによって、培養上清中にＤＰＡを生産することができる。生産されたＤＰＡは、公知の方法によって回収することができる。なお、上記のように培養した微生物を、アスパラギン酸及び/又はピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させることで、反応上清液中にＤＰＡを産生させることも可能である。この時、エネルギー源として上記培地に添加されるような物質を共存させることでさらに効率よくＤＰＡを産生させることが可能である。 As described above, DPA can be produced in the culture supernatant by culturing the recombinant Bacillus subtilis of the present invention. The produced DPA can be recovered by a known method. In addition, it is also possible to produce DPA in the reaction supernatant by suspending the microorganism cultured as described above in an aqueous solution containing aspartic acid and / or pyruvic acid. At this time, DPA can be produced more efficiently by coexisting a substance that is added to the medium as an energy source.
上記培養上清又は反応上清液からのＤＰＡの単離は、公知の方法、例えば、イオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理による不純物の除去等、又はそれらを組み合わせることで実施することができる。この方法により、容易にジピコリン酸の結晶又は沈殿を得ることができる。 Isolation of DPA from the culture supernatant or reaction supernatant may be performed by a known method, for example, adsorption / desorption by ion exchange resin, solid-liquid separation by crystallization, removal of impurities by membrane treatment, or a combination thereof. Can be implemented. By this method, dipicolinic acid crystals or precipitates can be easily obtained.
上記イオン交換樹脂処理などによって得られたＤＰＡを含有する溶液に、目的に応じた量のアルカリを添加することで、ＤＰＡの塩を得ることができる。具体的には、ＮａＯＨを添加することにより、ジピコリン酸ナトリウム塩を得ることができる。 A salt of DPA can be obtained by adding an amount of alkali according to the purpose to a solution containing DPA obtained by the above ion exchange resin treatment or the like. Specifically, dipicolinic acid sodium salt can be obtained by adding NaOH.
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、あるいは用途を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。 As exemplary embodiments of the present invention, the following compositions, production methods, or uses are further disclosed herein. However, the present invention is not limited to these embodiments.
＜１＞組換え枯草菌であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、且つ、
胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を有する、
組換え枯草菌。
<1> Recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region One or more regions selected from the group consisting of a cgeE-ypmQ region, a yearK-yesX region, a pdp-rocR region, a ycxB-sipU region, a SKIN-Pro7 region, an sbo-ywhH region, a yybP-yyaJ region, and a yncM-fosB region Has a deleted genome, and
Having a dipicolinate synthase gene operably linked to a promoter that works before the spor coat protein deposition phase in the sporulation phase,
Recombinant Bacillus subtilis.
＜２＞組換え枯草菌であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有し、且つ、
胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を有する、
組換え枯草菌。
<2> Recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region a genome having a deleted cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-rocR region, ycxB-sipU region, SKIN-Pro7 region, sbo-ywhH region, yybP-yyaJ region and yncM-fosB region;
Having a dipicolinate synthase gene operably linked to a promoter that works before the spor coat protein deposition phase in the sporulation phase,
Recombinant Bacillus subtilis.
＜３＞上記各領域が表１に記載の各オリゴヌクレオチドセットにより挟まれる領域である＜１＞又は＜２＞記載の組換え枯草菌。 <3> The recombinant Bacillus subtilis according to <1> or <2>, wherein each of the above regions is a region sandwiched between the oligonucleotide sets described in Table 1.
＜４＞上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子、及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子である＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の組換え枯草菌。 <4> The recombinant hay according to any one of <1> to <3>, wherein the dipicolinate synthase gene is a Bacillus subtilis spoVFA gene or a gene equivalent thereto, and a Bacillus subtilis spoVFB gene or a gene equivalent thereto. Fungus.
＜５＞枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、
配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４に示すヌクレオチド配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は、
配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、
配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号６に示すヌクレオチド配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は、
配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、
＜４＞記載の組換え枯草菌。
<5> Bacillus subtilis spoVFA gene or a gene corresponding thereto
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4. % Or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFB or a gene corresponding thereto. A polynucleotide encoding a protein that exhibits dipicolinate synthase activity; or
Hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFB or a gene equivalent thereto. A polynucleotide encoding a protein to be
Bacillus subtilis spoVFB gene or a gene corresponding thereto
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
60% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. % Or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFA or a gene corresponding thereto. A polynucleotide encoding a protein that exhibits dipicolinate synthase activity; or
Hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFA or a corresponding gene. A polynucleotide encoding a protein to be
<4> The recombinant Bacillus subtilis according to the above.
＜６＞上記スポアコートタンパク沈着期は、枯草菌胞子形成期第Ｖ期に相当する期である、＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の組換え枯草菌。 <6> The recombinant Bacillus subtilis according to any one of <1> to <5>, wherein the spore coat protein deposition period is a period corresponding to the V stage of Bacillus subtilis spore formation.
＜７＞上記プロモーターは、σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターである、＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の組換え枯草菌。 <7> The recombinant Bacillus subtilis according to any one of <1> to <6>, wherein the promoter is a σA-dependent promoter or a σH-dependent promoter.
＜８＞上記プロモーターは、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子プロモーター又はｓｐｏＶＧプロモーターである、＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の組換え枯草菌。 <8> The recombinant Bacillus subtilis according to any one of <1> to <7>, wherein the promoter is an S237 cellulase gene promoter or a spoVG promoter.
＜９＞上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、上記組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の組換え枯草菌。 <9> A dipicolinate synthase gene operably linked to a promoter acting before the spore coat protein deposition phase in the sporulation phase is incorporated into a vector capable of self-replication in the recombinant Bacillus subtilis <1> The recombinant Bacillus subtilis according to any one of to <8>.
＜１０＞上記自己複製可能なベクターがｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ又はｐＨＹＥｇ１Ｓである、＜９＞記載の組換え枯草菌。 <10> The recombinant Bacillus subtilis according to <9>, wherein the self-replicating vector is pT181, pC194, pUB110, pE194, pSN2, pHY300PLK or pHYEg1S.
＜１１＞上記＜１＞〜＜１０＞記載の組換え枯草菌を用いるジピコリン酸又はその塩の製造方法。 <11> A method for producing dipicolinic acid or a salt thereof using the recombinant Bacillus subtilis according to <1> to <10> above.
＜１２＞組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入する工程を含む、
方法。
<12> A method for producing recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region One or more regions selected from the group consisting of a cgeE-ypmQ region, a yearK-yesX region, a pdp-rocR region, a ycxB-sipU region, a SKIN-Pro7 region, an sbo-ywhH region, a yybP-yyaJ region, and a yncM-fosB region Dipicolinic acid synthase operably linked to a promoter acting before the spor coat protein deposition phase in the spore formation phase in a Bacillus subtilis mutant strain having a genome lacking Comprising the step of introducing the over synthase gene,
Method.
＜１３＞組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入する工程を含む、
方法。
<13> A method for producing recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region Bacillus subtilis mutant strain having a genome in which the cgeE-ypmQ region, the yeeK-yesX region, the pdp-rocR region, the ycxB-sipU region, the SKIN-Pro7 region, the sbo-ywhH region, the yybP-yyaJ region and the yncM-fosB region are deleted. Further comprising the step of introducing a dipicolinate synthase gene operably linked to a promoter that works before the spor coat protein deposition phase in the sporulation phase,
Method.
＜１４＞上記各領域が表１に記載の各オリゴヌクレオチドセットにより挟まれる領域である＜１２＞又は＜１３＞記載の方法。 <14> The method according to <12> or <13>, wherein each of the regions is a region sandwiched between the oligonucleotide sets described in Table 1.
＜１５＞上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子、及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子である＜１２＞〜＜１４＞のいずれか１に記載の方法。 <15> The method according to any one of <12> to <14>, wherein the dipicolinate synthase gene is a Bacillus subtilis spoVFA gene or a gene corresponding thereto, and a Bacillus subtilis spoVFB gene or a gene corresponding thereto.
＜１６＞枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、
配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４に示すヌクレオチド配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は、
配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、
配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号６に示すヌクレオチド配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は、
配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、
＜１５＞記載の方法。
<16> Bacillus subtilis spoVFA gene or a gene corresponding thereto,
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4. % Or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFB or a gene corresponding thereto. A polynucleotide encoding a protein that exhibits dipicolinate synthase activity; or
Hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFB or a gene equivalent thereto. A polynucleotide encoding a protein to be
Bacillus subtilis spoVFB gene or a gene corresponding thereto
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
60% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. % Or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFA or a gene corresponding thereto. A polynucleotide encoding a protein that exhibits dipicolinate synthase activity; or
Hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by Bacillus subtilis spoVFA or a corresponding gene. A polynucleotide encoding a protein to be
<15> The method described.
＜１７＞上記スポアコートタンパク沈着期は、枯草菌胞子形成期第Ｖ期に相当する期である、＜１２＞〜＜１６＞のいずれか１に記載の方法。 <17> The method according to any one of <12> to <16>, wherein the spore coat protein deposition period is a period corresponding to the V stage of Bacillus subtilis spore formation.
＜１８＞上記プロモーターは、σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターである、＜１２＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法。 <18> The method according to any one of <12> to <17>, wherein the promoter is a σA-dependent promoter or a σH-dependent promoter.
＜１９＞上記プロモーターは、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子プロモーター又はｓｐｏＶＧプロモーターである、＜１２＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の方法。 <19> The method according to any one of <12> to <18>, wherein the promoter is an S237 cellulase gene promoter or a spoVG promoter.
＜２０＞上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、上記組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている＜１２＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の方法。 <20> A dipicolinate synthase gene operably linked to a promoter acting before the spore coat protein deposition phase in the sporulation phase is incorporated into a vector capable of self-replication in the recombinant Bacillus subtilis <12> ~ The method according to any one of <19>.
＜２１＞上記自己複製可能なベクターがｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ又はｐＨＹＥｇ１Ｓである、＜２０＞記載の方法。 <21> The method according to <20>, wherein the self-replicating vector is pT181, pC194, pUB110, pE194, pSN2, pHY300PLK, or pHYEg1S.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
（製造例１）枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株の構築
枯草菌１６８株を親株として、表１に記載の各ヌクレオチド配列に挟まれる各領域について、上述の所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順（特開平２００７−１３００１３号公報）に従ったゲノム領域の欠失、及びそれに続くマーカー遺伝子の削除及び確認を逐次行なうことにより、表１に記載の各ヌクレオチド配列に挟まれる領域全てを欠失させた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株を調製した。
(Production Example 1) Construction of Bacillus subtilis mutant MGB874 strain Using Bacillus subtilis 168 strain as a parent strain, for each region sandwiched between the nucleotide sequences shown in Table 1, a mutant strain in which the above-described predetermined genomic region is deleted is prepared. Deletion of the genomic region and the subsequent deletion and confirmation of the marker gene in accordance with the procedure (Japanese Patent Laid-Open No. 2007-130013) are performed, so that all the regions sandwiched between the nucleotide sequences shown in Table 1 are deleted. A lost Bacillus subtilis mutant MGB874 strain was prepared.
（製造例２）ベクターの構築１
Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来（入手先：特開２０００−２１００８１号公報）のセルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＹＥｇｌＳを鋳型とし、表２記載のプライマーS237UB1（配列番号１８）及びS237sVFABd1（配列番号１９）を用いて、Ｓ２３７プロモーターを含む０．６ｋｂ断片（Ｅ）をＰＣＲにより増幅した。また、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、S237sVFABu2（配列番号２０）、S237sVFABd2（配列番号２１）を用いてジピコリン酸シンターゼ構造遺伝子を含む１．５ｋｂ断片（Ｆ）をＰＣＲにより増幅した。
(Production Example 2) Vector construction 1
Bacillus sp. Recombinant plasmid pHYEglS containing cellulase gene derived from KSM-S237 strain (source: JP 2000-210081) was used as a template, and primers S237UB1 (SEQ ID NO: 18) and S237sVFABd1 (SEQ ID NO: 19) described in Table 2 were used. A 0.6 kb fragment (E) containing the S237 promoter was amplified by PCR. Further, a genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 strain was used as a template, and a 1.5 kb fragment (F) containing dipicolinate synthase structural gene was amplified by PCR using S237sVFABu2 (SEQ ID NO: 20) and S237sVFABd2 (SEQ ID NO: 21). .
次に、得られた断片（Ｅ）及び断片（Ｆ）を、上流からこの順で配置されるようにS237UB1及びS237sVFABd2プライマーを用いたＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、２．１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ制限酵素切断点に挿入し、組換えプラスミドｐＨＹ−ＰＳ２３７−ｓｐｏＶＦＡＢを構築した。プラスミドｐＨＹ−ＰＳ２３７−ｓｐｏＶＦＡＢに対するサンガー法によるシークエンシングによって目的のプロモーター及び遺伝子が挿入されていることを確認した。 Next, the obtained fragment (E) and fragment (F) were combined by the SOE-PCR method using S237UB1 and S237sVFABd2 primers so as to be arranged in this order from the upstream to obtain a 2.1 kb DNA fragment. It was. The obtained DNA fragment was inserted into EcoRI and XbaI restriction enzyme cleavage points of shuttle vector pHY300PLK to construct a recombinant plasmid pHY-PS237-spoVFAB. It was confirmed that the target promoter and gene were inserted by Sanger sequencing for the plasmid pHY-PS237-spoVFAB.
（製造例３）ベクターの構築２
１６８ＶＧｓｐｏＶＦ株（特開２００８−４８７３２号公報）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３記載のプライマーPtsI/PsvG FW（配列番号２２）及びspoVFB/BamHI RV（配列番号２３）を用いて、ｓｐｏＶＧプロモーター及びジピコリン酸シンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（約１．８ｋｂ）をＰＣＲにより増幅した。
(Production Example 3) Vector construction 2
Using the genomic DNA extracted from the 168VGpoVF strain (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-48732) as a template, the spoVG promoter using the primers PtsI / PsvG FW (SEQ ID NO: 22) and spoVFB / BamHI RV (SEQ ID NO: 23) described in Table 3 And a DNA fragment (about 1.8 kb) containing the dipicolinate synthase structural gene was amplified by PCR.
得られたＤＮＡ断片をシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＰｔｓＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入し、組換えプラスミドｐＨＹ−ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢを構築した。プラスミドｐＨＹ−ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢに対するサンガー法によるシークエンシングによって目的のプロモーター及び遺伝子が挿入されていることを確認した。 The obtained DNA fragment was inserted into the PtsI and BamHI restriction sites of shuttle vector pHY300PLK to construct a recombinant plasmid pHY-PspoVG-spoVFAB. It was confirmed that the target promoter and gene were inserted by Sanger sequencing for the plasmid pHY-PspoVG-spoVFAB.
（実施例１）ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が導入された組換え枯草菌の作製−１
製造例１で構築した枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株（特開２００７−１３００１３号公報）を宿主微生物とした。
製造例２で構築したＤＰＡ組換え生産用ベクターｐＨＹ−ＰＳ２３７−ｓｐｏＶＦＡＢを用いて、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１，１９７９）により宿主微生物を形質転換した。テトラサイクリン−塩酸塩５０ｐｐｍを添加したＤＭ３プロトプラスト再生培地（０．５Ｍコハク酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、０．５％カザミノ酸（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、０．３５％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１５％ ＫＨ2ＰＯ4、０．５％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ社製）、１％バクト寒天（ディフコ社製））上に生育したコロニーを目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。
以上の手順により、ＭＧＢ８７４株にBacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１）のプロモーター領域及び枯草菌１６８株由来のｓｐｏＶＦＡ及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子を導入した株（pHY-PS237-spoVFAB/MGB874株）を得た。
(Example 1) Production of recombinant Bacillus subtilis introduced with dipicolinate synthase gene-1
The Bacillus subtilis mutant MGB874 strain (Japanese Patent Laid-Open No. 2007-130013) having a genome in which a large region of the Bacillus subtilis wild strain genome constructed in Production Example 1 was deleted was used as a host microorganism.
Host microorganisms were transformed by the protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet., 168, 111, 1979) using the DPA recombinant production vector pHY-PS237-spoVFAB constructed in Production Example 2. DM3 protoplast regeneration medium supplemented with 50 ppm tetracycline-hydrochloride (0.5 M sodium succinate (pH 7.3), 0.5% casamino acid (Difco), 0.5% yeast extract (Difco), 0 .35% K 2 HPO 4 , 0.15% KH 2 PO 4 , 0.5% glucose, 20 mM MgCl 2 , 0.01% bovine serum albumin (Sigma), 1% Bacto agar (Difco) The colonies grown on the cells were selected as the desired Bacillus subtilis transformants.
According to the above procedure, Bacillus sp. A strain (pHY-PS237-spoVFAB / MGB874 strain) into which the promoter region of cellulase gene (JP 2000-210081) derived from KSM-S237 strain (FERM BP-7875) and spoVFA and spoVFB genes derived from Bacillus subtilis 168 strain were introduced. Obtained.
（実施例２）ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が導入された組換え枯草菌の作製−２
製造例１で構築したＭＧＢ８７４株を宿主微生物とした。
製造例３で構築したＤＰＡ組換え生産用ベクターｐＨＹ−ＰｓｐｏＧＶ−ｓｐｏＶＦＡＢを用いて、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１，１９７９）により宿主微生物を形質転換した。テトラサイクリン−塩酸塩５０ｐｐｍを添加したＤＭ３プロトプラスト再生培地（０．５Ｍコハク酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、０．５％カザミノ酸（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、０．３５％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１５％ ＫＨ2ＰＯ4、０．５％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ社製）、１％バクト寒天（ディフコ社製））上に生育したコロニーを目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。
以上の手順により、ＭＧＢ８７４株に枯草菌１６８株由来のｓｐｏＶＧプロモーター領域とｓｐｏＶＦＡ及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子とを導入した株（pHY-PspoVG-spoVFAB/MGB874株）を得た。
Example 2 Production of Recombinant Bacillus subtilis Introduced with Dipicolinate Synthase Gene-2
The MGB874 strain constructed in Production Example 1 was used as the host microorganism.
Host microorganisms were transformed by the protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet., 168, 111, 1979) using the DPA recombinant production vector pHY-PspoGV-spoVFAB constructed in Production Example 3. DM3 protoplast regeneration medium supplemented with 50 ppm tetracycline-hydrochloride (0.5 M sodium succinate (pH 7.3), 0.5% casamino acid (Difco), 0.5% yeast extract (Difco), 0 .35% K 2 HPO 4 , 0.15% KH 2 PO 4 , 0.5% glucose, 20 mM MgCl 2 , 0.01% bovine serum albumin (Sigma), 1% Bacto agar (Difco) The colonies grown on the cells were selected as the desired Bacillus subtilis transformants.
By the above procedure, a strain (pHY-PspoVG-spoVFAB / MGB874 strain) in which a spoVG promoter region derived from Bacillus subtilis 168 strain and spoVFA and spoVFB genes were introduced into MGB874 strain was obtained.
（比較例１）
枯草菌１６８株にｓｐｏＶＦプロモーターが導入された１６８ＶＧｓｐｏＶＦ株（特開２００８−４８７３２号公報）を宿主として、実施例１と同様の手順で、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子プロモーター及び枯草菌ｓｐｏＶＦＡ及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子を導入した株（pHY-PS237-spoVFAB/168VGspoVF株）を得た。
(Comparative Example 1)
A strain into which the S237 cellulase gene promoter, Bacillus subtilis spoVFA, and spoVFB gene were introduced in the same procedure as in Example 1 using the 168VGspoVF strain (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-48732) in which the spoVF promoter was introduced into the Bacillus subtilis 168 strain (PHY-PS237-spoVFAB / 168VGspoVF strain) was obtained.
（比較例２）
枯草菌１６８株を宿主として、実施例１と同様の手順で、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子プロモーター及び枯草菌ｓｐｏＶＦＡ及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子を導入した株（pHY-PS237-spoVFAB/168株）を得た。
(Comparative Example 2)
Using a Bacillus subtilis 168 strain as a host, a strain (pHY-PS237-spoVFAB / 168 strain) into which the S237 cellulase gene promoter and Bacillus subtilis spoVFA and spoVFB genes were introduced was obtained in the same manner as in Example 1.
（試験例１）ＤＰＡ生産性評価（１）
pHY-PS237-spoVFAB/MGB874株（実施例１）は、１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含む５ｍＬのＬＢ培地（１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ＮａＣｌ）で３０℃において１５時間振盪培養を行い、さらにこの培養液に、ＯＤ≒０．０５になるように３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース＋ＭＳＧ培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース、８％グルタミン酸ナトリウム１水和物、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行った（Ｎ＝３）。
pHY-PS237-spoVFAB/168VGspoVF株（比較例１）は、２０ｍＬの培地（２％酵母エキス、４％コーンスティーブリカー、０．０５％硫酸マグネシウム７水塩、０．００１％硫酸マンガン、０．２％Ｌ−トリプトファン、０．５％リジン塩酸塩、４％アスパラギン酸ナトリウム塩、０．１５％リン酸１カリウム、０．３５％リン酸２カリウム、１４％マルトース１水和物を含有）に摂取し、３７℃、２１０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行った（Ｎ＝３）。
培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＤＰＡ生産量を測定し、１６８ＶＧｓｐｏＶＦ株の形質転換体（比較例１）の生産量を１００％とした場合の相対値を求めた。
(Test Example 1) DPA productivity evaluation (1)
pHY-PS237-spoVFAB / MGB874 strain (Example 1) contains 5 mL of LB medium (1.0% tryptone (Difco), 0.5% yeast extract (Difco)) containing 15 ppm tetracycline. (0% NaCl) at 30 ° C. for 15 hours, and further cultured in 30 mL of 2 × L-maltose + MSG medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1%) so that OD≈0.05. % Sodium chloride, 7.5% maltose, 8% sodium glutamate monohydrate, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline) and shaking culture at 37 ° C. and 210 rpm for 3 days (N = 3).
pHY-PS237-spoVFAB / 168VGspoVF strain (Comparative Example 1) contains 20 mL of medium (2% yeast extract, 4% corn steep liquor, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, 0.001% manganese sulfate, 0.2 % L-tryptophan, 0.5% lysine hydrochloride, 4% sodium aspartate, 0.15% monopotassium phosphate, 0.35% dipotassium phosphate, 14% maltose monohydrate) Then, shaking culture was performed at 37 ° C. and 210 rpm for 3 days (N = 3).
After completion of the culture, the DPA production amount was measured under the analysis conditions shown in the following measurement examples, and the relative value was determined when the production amount of the transformant (Comparative Example 1) of the 168VGspoVF strain was 100%.
ＭＧＢ８７４株にジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入した組換え枯草菌は、培養３日目では、１６８ＶＧｓｐｏＶＦ株からの組換え枯草菌（比較例１）と比較してＤＰＡ生産量が高かった（表４）。 Recombinant Bacillus subtilis in which the dipicolinate synthase gene was introduced into the MGB874 strain had higher DPA production than the recombinant Bacillus subtilis (Comparative Example 1) from the 168VGspoVF strain on the third day of culture (Table 4).
（試験例２）ＤＰＡ生産性評価（２）
pHY-PS237-spoVFAB/MGB874株（実施例１）およびpHY-PS237-spoVFAB/168株（比較例２）は、１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含む５ｍＬのＬＢ培地で３０℃において１５時間振盪培養を行い、さらにこの培養液にＯＤ≒０．０５になるようにＭ（ＭＯＰＳ）＋ＭＳＧ培地（１０％グルコース、１．８％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、８％グルタミン酸ナトリウム１水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）３０ｍＬに接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行った（Ｎ＝３）。
培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＤＰＡ生産量を測定し、１６８株の形質転換体（比較例２）の生産量を１００％とした場合の相対値を求めた。
(Test Example 2) DPA productivity evaluation (2)
The pHY-PS237-spoVFAB / MGB874 strain (Example 1) and the pHY-PS237-spoVFAB / 168 strain (Comparative Example 2) were subjected to shaking culture at 30 ° C. for 15 hours in 5 mL of LB medium containing 15 ppm of tetracycline. M (MOPS) + MSG medium (10% glucose, 1.8% ammonium chloride, 0.15% dipotassium hydrogen phosphate, 0.035% magnesium sulfate heptahydrate so that OD≈0.05. , 0.005% manganese sulfate pentahydrate, 50 mM MOPS (monophorinopropanesulfonic acid) buffer (pH 7.0), other trace metals, 8% sodium glutamate monohydrate, 15 ppm tetracycline) Then, shaking culture was performed at 37 ° C. and 210 rpm for 3 days (N = 3).
After completion of the culture, the production amount of DPA was measured under the analysis conditions shown in the following measurement examples, and the relative value was determined when the production amount of the 168 strain transformant (Comparative Example 2) was taken as 100%.
ＭＧＢ８７４株にジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入した組換え枯草菌は、１６８株からの組換え枯草菌（比較例２）と比較してＤＰＡ生産量が高かった（表５）。 Recombinant Bacillus subtilis in which the dipicolinate synthase gene was introduced into the MGB874 strain had higher DPA production compared to the recombinant Bacillus subtilis from the 168 strain (Comparative Example 2) (Table 5).
（試験例３）ＤＰＡ生産性評価（３）
pHY-PspoVG-spoVFAB/MGB874株（実施例２）は、１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含む５ｍＬのＬＢ培地（１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ＮａＣｌ）で３０℃において１５時間振盪培養を行い、さらにこの培養液に、ＯＤ≒０．０５になるように３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース＋ＭＳＧ培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース、８％グルタミン酸ナトリウム１水和物、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行った（Ｎ＝３）。
培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＤＰＡ生産量を測定し、１６８ＶＧｓｐｏＶＦ株の形質転換体（比較例１）の生産量を１００％とした場合の相対値を求めた。
(Test Example 3) DPA productivity evaluation (3)
pHY-PspoVG-spoVFAB / MGB874 strain (Example 2) was prepared by adding 5 mL of LB medium (1.0% tryptone (Difco), 0.5% yeast extract (Difco)) containing 15 ppm tetracycline. (0% NaCl) at 30 ° C. for 15 hours, and further cultured in 30 mL of 2 × L-maltose + MSG medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1%) so that OD≈0.05. % Sodium chloride, 7.5% maltose, 8% sodium glutamate monohydrate, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline) and shaking culture at 37 ° C. and 210 rpm for 3 days (N = 3).
After completion of the culture, the DPA production amount was measured under the analysis conditions shown in the following measurement examples, and the relative value was determined when the production amount of the transformant (Comparative Example 1) of the 168VGspoVF strain was 100%.
ＭＧＢ８７４株にジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入した組換え枯草菌は、培養３日目では、１６８ＶＧｓｐｏＶＦ株からの組換え枯草菌（比較例１）と比較してＤＰＡ生産量が高かった（表６）。 Recombinant Bacillus subtilis in which the dipicolinate synthase gene was introduced into the MGB874 strain had higher DPA production on the third day of culture than the recombinant Bacillus subtilis (Comparative Example 1) from the 168VGspoVF strain (Table 6).
（測定例）ＤＰＡの定量分析及び分子量分析
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＤＰＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量分析及び分子量分析を行った。使用したＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続して用いた。分析カラムは、Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ ６０（Å）４μｍ ４．６×２５０ｍｍ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ[Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ ｂｏｎｄｅｄ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ]（Ｗａｔｅｒｓ）を使用し、溶離液として２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む水を濃リン酸でｐＨ３．４に合わせた水溶液とアセトニトリル溶液を１：１に混合した溶液を用いた。測定条件としては、検出波長を２７０ｎｍとし、流速を１ｍＬ／分とした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてＭＵＬＴＩ ＳＣＲＥＥＮ ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過処理し調製した。また、濃度検定には２,６−Ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｌｉｃ ａｃｉｄ：ＤＰＡ，９９％(ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ)を用いて検量線を作成した。
(Measurement example) Quantitative analysis and molecular weight analysis of DPA A sample of the culture solution after culturing was subjected to centrifugation at 14,800 rpm at room temperature for 30 minutes (Hitachi Koki, himacCF15RX), and the obtained sample after centrifugation The DPA contained in the supernatant was subjected to quantitative analysis and molecular weight analysis by the HPLC method. The HPLC apparatus used was a liquid feed pump (Shimadzu, LC-9A), an autosampler (Hitachi Measuring Instruments, AS-2000), a column oven (Shimadzu, CTO-6A), a UV detector (Shimadzu, SPD-10A), A degasser (GL Science, DG660B) and a chromatographic data analyzer (Hitachi Instrumentation, D-2500) were connected and used. Analytical column uses High Performance Carbohydrate Column 60 (Å) 4 μm 4.6 × 250 mm HPLC Column [Aminopropylmethylbonded amorphous silica] (Waters) as mM, ED 3 as water and ED as acid 4 A solution prepared by mixing 1: 1 the combined aqueous solution and acetonitrile solution was used. The measurement conditions were a detection wavelength of 270 nm and a flow rate of 1 mL / min. Samples to be subjected to HPLC analysis were prepared by filtering with MULTI SCREEN MNHV45 (manufactured by MILLIPORE, 0.45 μm Durapore membrane) as a pretreatment for removing insoluble matters. For the concentration test, a calibration curve was prepared using 2,6-pyridinical boxlic acid: DPA, 99% (SIGMA-ALDRICH).
Claims (3)
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有し、且つ、
胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を有し、
該プロモーターが、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子プロモーター又はｓｐｏＶＧプロモーターであり、
該Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子プロモーターが、以下：
配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号２に示すヌクレオチド配列において１〜１２個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、σＡ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド；又は
配列番号２に示すヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、σＡ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド、
であり、
該ｓｐｏＶＧプロモーターが、以下：
配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１に示すヌクレオチド配列において１〜１２個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、σＨ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド；又は
配列番号１に示すヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、σＨ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド、
であり、
該ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子と、枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子との組み合わせであり、
該枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、以下:
配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号４に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
であり、
該枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、以下:
配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号６に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
である、
組換え枯草菌。 Recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-ROCR region has ycxB-sipU region, SKIN-Pro7 region, sbo-ywhH region, a genome yybP-yyaJ region and yncM-fosB area have been deleted, and ,
Have a promoter operably linked dipicolinic acid synthase genes acting in prior Spore coat protein deposition life in sporulation,
The promoter is an S237 cellulase gene promoter or spoVG promoter;
The S237 cellulase gene promoter is:
A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2;
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 1 to 12 bases substituted, deleted, added or inserted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and functioning as a σA factor-dependent promoter; or
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and functioning as a σA factor-dependent promoter;
And
The spoVG promoter is:
A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 1 to 12 bases substituted, deleted, added or inserted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and functioning as a σH factor-dependent promoter; or
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and functioning as a σH factor-dependent promoter;
And
The dipicolinate synthase gene is a combination of a Bacillus subtilis spoVFA gene or a gene equivalent thereto, and a Bacillus subtilis spoVFB gene or a gene equivalent thereto,
The Bacillus subtilis spoVFA gene or a gene corresponding thereto is as follows:
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4; or
It consists of a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, and encodes a protein that exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the Bacillus subtilis spoVFB or a gene corresponding thereto. Polynucleotides,
And
The Bacillus subtilis spoVFB gene or a gene corresponding thereto is as follows:
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6; or
It comprises a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, and encodes a protein that exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the Bacillus subtilis spoVFA or a gene corresponding thereto. Polynucleotides,
Is,
Recombinant Bacillus subtilis.
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されたジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入する工程を含み、
該プロモーターが、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子プロモーター又はｓｐｏＶＧプロモーターであり、
該Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子プロモーターが、以下：
配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号２に示すヌクレオチド配列において１〜１２個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、σＡ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド；又は
配列番号２に示すヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、σＡ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド、
であり、
該ｓｐｏＶＧプロモーターが、以下：
配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１に示すヌクレオチド配列において１〜１２個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、σＨ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド；又は
配列番号１に示すヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、σＨ因子依存性プロモーターとして機能するポリヌクレオチド、
であり、
該ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子と、枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子との組み合わせであり、
該枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、以下:
配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号４に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
であり、
該枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、以下:
配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号６に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
である、
方法。 A method for producing recombinant Bacillus subtilis,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-ROCR region, ycxB-sipU region, SKIN-Pro7 region, sbo-ywhH region, Bacillus subtilis mutant having a genome yybP-yyaJ region and yncM-fosB area have been deleted strain, see contains the step of introducing the dipicolinic acid synthase gene operably linked to a promoter which acts in prior spore coat protein deposition life in sporulation,
The promoter is an S237 cellulase gene promoter or spoVG promoter;
The S237 cellulase gene promoter is:
A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2;
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 1 to 12 bases substituted, deleted, added or inserted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and functioning as a σA factor-dependent promoter; or
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and functioning as a σA factor-dependent promoter;
And
The spoVG promoter is:
A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 1 to 12 bases substituted, deleted, added or inserted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and functioning as a σH factor-dependent promoter; or
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and functioning as a σH factor-dependent promoter;
And
The dipicolinate synthase gene is a combination of a Bacillus subtilis spoVFA gene or a gene equivalent thereto, and a Bacillus subtilis spoVFB gene or a gene equivalent thereto,
The Bacillus subtilis spoVFA gene or a gene corresponding thereto is as follows:
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4; or
It consists of a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, and encodes a protein that exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the Bacillus subtilis spoVFB or a gene corresponding thereto. Polynucleotides,
And
The Bacillus subtilis spoVFB gene or a gene corresponding thereto is as follows:
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6; or
It comprises a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, and encodes a protein that exhibits dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the Bacillus subtilis spoVFA or a gene corresponding thereto. Polynucleotides,
Is,
Method.
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