JP2017190344A

JP2017190344A - 赤血球を増加させるための方法および組成物

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Publication number: JP2017190344A
Application number: JP2017144654A
Authority: JP
Inventors: クマールラビンドラ; Kumar Ravindra; ベンカタサイラジャセクハルスラガニナガ; Venkata Sai Rajasekhar Suragani Naga; ノプフジョン; Knoff John
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Current assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2017-07-26
Publication date: 2017-10-19
Also published as: AU2018202326A1; JP6234993B2; JP2021107453A; EP2844272A4; EP3351260A1; AU2021201196A1; US20210277082A1; US20180186851A1; US20200115428A1; JP2015514115A; JP2019156858A; AU2013243388B2; CA2869474A1; US20130281371A1; US9809636B2; AU2018202326B2; AU2013243388A1; EP3351260B1; WO2013152213A1; US11807673B2

Abstract

【課題】赤血球を増加させるための方法および組成物を提供すること。
【解決手段】ある特定の態様において、本発明は、齧歯類および霊長類を含む脊椎動物における、特にヒトにおける赤血球および／またはヘモグロビンレベルを増大させるための、ＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドまたはこれらの組合せを含む組成物および方法を提供する。例えば、患者における赤血球レベルを増大させるため、または貧血を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、ＢＭＰ９ポリペプチドおよびＢＭＰ１０ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを投与することを含む方法が提供される。
【選択図】なし

Description

関連出願の引用
本願は、２０１２年４月６日に出願した米国仮特許出願第６１／６２１，１５４号に対する優先権およびその利益を主張する。この出願の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。

発明の背景
成熟赤血球（red blood cell）、即ちエリスロサイト（erythrocyte）は、脊椎動物
の循環器系における酸素輸送を担う。赤血球は、ヘモグロビンを高濃度で含有し、ヘモグロビンは、相対的に高い酸素分圧（ｐＯ_２）の肺において酸素に結合し、相対的に低いｐＯ_２の身体区域に酸素を送達するタンパク質である。

成熟赤血球は、赤血球生成と呼ばれる過程において多能性造血幹細胞から産生される。出生後の赤血球生成は、主として骨髄および脾臓の赤色脾髄において行われる。様々なシグナル伝達経路の協調作用は、細胞の増殖、分化、生存および死亡のバランスを制御する。正常条件下において、赤血球は、体内において一定の赤血球量を維持する速度で産生され、産生は、酸素圧（oxygen tension）または組織需要の増加または減少を含む様々な
刺激に応答して増加または減少し得る。赤血球生成の過程は、系列にコミットした前駆細胞の形成に始まり、一連の別個の前駆細胞型を経て進行する。赤血球生成の最終段階は、網状赤血球が血流に放出され、成熟赤血球の形態をとりつつそのミトコンドリアおよびリボソームを失うときに為される。血液における網状赤血球のレベルの上昇または網状赤血球：エリスロサイト比の上昇は、赤血球産生速度の増加を示す。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、脊椎動物における出生後の赤血球生成の最も顕著な正の調節因子として広く認識されている。ＥＰＯは、組織酸素圧の低下（低酸素）および低赤血球レベルまたは低ヘモグロビンレベルに対する代償性赤血球新生応答を調節する。ヒトにおいて、ＥＰＯレベルの上昇は、骨髄および脾臓における赤血球前駆細胞の生成を刺激することにより赤血球形成を促進する。マウスにおいて、ＥＰＯは、主として脾臓における赤血球生成を増強する。

貧血は、血液における正常レベルよりも低いレベルのヘモグロビンまたは赤血球によって特徴付けられた、広く定義された状態である。場合によっては、貧血は、赤血球の産生または生存における原発性障害によって引き起こされる。より一般には、貧血は、他の系の疾患に続発する（Weatherall & Provan（２０００年）Lancet ３５５巻、１１６９
〜１１７５頁）。貧血は、赤血球の産生速度の低下もしくは破壊速度の増加または出血による赤血球の損失に起因し得る。貧血は、例えば、慢性腎不全、化学療法処置、骨髄異形成症候群、関節リウマチおよび骨髄移植を含む種々の障害に起因し得る。

ＥＰＯによる処置は、典型的には、健康なヒトにおいて数週間の期間にわたりヘモグロビンの約１〜３ｇ／ｄＬの上昇を引き起こす。貧血性個体に投与されると、この処置レジメンは多くの場合、ヘモグロビンおよび赤血球レベルの実質的な増大をもたらし、クオリティ・オブ・ライフにおける改善および生存延長を導く。ＥＰＯは、一様に有効ではなく、多くの個体は、さらに高い用量に対してさせ抵抗性である（Horlら（２０００年）Nephrol Dial Transplant １５巻、４３〜５０頁）。５０％を超えるがん患者がＥＰＯに
対し不適切な応答を有し、末期腎疾患のおよそ１０％が反応性低下し（Glaspyら（１９９７年）J Clin Oncol １５巻、１２１８〜１２３４頁；Demetriら（１９９８年）J Clin Oncol １６巻、３４１２〜３４２５頁）、骨髄異形成症候群の１０％未満が有利に
応答する（Estey（２００３年）Curr Opin Hematol １０巻、６０〜６７頁）。炎症、鉄およびビタミンの欠乏、不適切な透析、アルミニウム毒性ならびに副甲状腺機能亢進を含む数種類の因子は、治療応答不良を予測することができる。ＥＰＯに対する抵抗性の分子機序は現在のところ不明である。最近の証拠は、より高い用量のＥＰＯが、一部の患者集団における心血管罹患率、腫瘍成長および死亡率のリスクの増加を伴い得ることを示唆する（Krapfら、２００９年、Clin J Am Soc Nephrol ４巻：４７０〜４８０頁；Glaspy、２００９年、Annu Rev Med ６０巻：１８１〜１９２頁）。従って、ＥＰＯに基づく治療化合物（エリスロポエチン刺激剤、ＥＳＡ）は、赤血球輸血の必要の回避に十分な最低用量で投与されることが推奨された（Jelkmannら、２００８年、Crit Rev Oncol. Hematol ６７巻：３９〜６１頁）。

Weatherall & Provan（２０００年）Lancet ３５５巻、１１６９〜１１７５頁 Horlら（２０００年）Nephrol Dial Transplant １５巻、４３〜５０頁 Glaspyら（１９９７年）J Clin Oncol １５巻、１２１８〜１２３４頁 Demetriら（１９９８年）J Clin Oncol １６巻、３４１２〜３４２５頁 Estey（２００３年）Curr Opin Hematol １０巻、６０〜６７頁 Krapfら、２００９年、Clin J Am Soc Nephrol ４巻：４７０〜４８０頁 Glaspy、２００９年、Annu Rev Med ６０巻：１８１〜１９２頁 Jelkmannら、２００８年、Crit Rev Oncol. Hematol ６７巻：３９〜６１頁

よって、本開示の目的は、患者における赤血球レベルを増大させるための代替的な方法および組成物を提供することである。

発明の概要
一部には、本開示は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを使用して、赤血球およびヘモグロビンのレベルを増大させ得ることを実証する。特に、本開示は、ＢＭＰ９がｉｎｖｉｖｏで投与されると、赤血球レベル、ヘマトクリットおよびヘモグロビンの著明かつ急速な増加を引き起こすことを実証する。ＢＭＰ１０は、ＢＭＰ９と密接に関係し、同じ受容体セットを介してシグナル伝達することが公知である。従って、ある特定の実施形態において、本開示は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチド（またはこれらの組合せ）を使用して、患者における赤血球およびヘモグロビンのレベルを増大させ、それを必要とする患者における赤血球またはヘモグロビンの低いレベルに関連する障害を処置するための方法を提供する。

ある特定の態様において、本開示は、ＢＭＰ９ポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、ＢＭＰ９ポリペプチドは、配列番号１、２、３、７、８もしくは１６のアミノ酸配列または前述のいずれかに対して少なくとも、６３％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるアミノ酸配列を有する。ＢＭＰ９ポリペプチドは、ＢＭＰ９の成熟部分をコードするヌクレオチド１１２１〜１４５０等、そのいずれかの部分を含む、配列番号１１の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むことができ、ＢＭＰ９ポリペプチドは、低度にストリンジェント、中程度にストリンジェントまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１１のヌクレオチド１１２１〜１４５０の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされ得る。

ある特定の態様において、本開示は、ＢＭＰ１０ポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、ＢＭＰ１０ポリペプチドは、配列番号４、５、６、９、１０もしくは１７のアミノ酸配列または前述のいずれかに対して少なくとも、６３％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるアミノ酸配列を有する。ＢＭＰ１０ポリペプチドは、ＢＭＰ１０の成熟部分をコードするヌクレオチド１１０８〜１４３１等、そのいずれかの部分を含む、配列番号１２の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むことができ、ＢＭＰ１０ポリペプチドは、低度にストリンジェント、中程度にストリンジェントまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１２のヌクレオチド１１０８〜１４３１の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする核酸（nucleic）によってコードされ得る。

ある特定の態様において、本開示は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬品調製物を提供する。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、１０マイクロモル濃度未満、１マイクロモル濃度未満、１００ナノモル濃度未満、１０ナノモル濃度未満または１ナノモル濃度未満のＫｄで、１種または複数のＩ型（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２）またはＩＩ型（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ）受容体に結合することができる。典型的には、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方に結合するが、これらの受容体の一方との結合は、非常に弱い親和性においてであり得る。場合によって、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、ＩＤ１遺伝子由来のＢＭＰ応答性エレメント（ＢＲＥ）を含有するプロモーター等、細胞におけるＳＭＡＤ１応答性プロモーターまたはＳＭＡＤ５応答性プロモーターからの発現を刺激する。

医薬品調製物は、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドまたはＢＭＰ１０プロドメインポリペプチドをさらに含むことができる。ある特定の実施形態において、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドは、配列番号１の２３〜３１９のアミノ酸配列またはこれに対して少なくとも、６３％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるアミノ酸配列を有する。ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドは、そのいずれかの部分を含む、配列番号１１のヌクレオチド２３０〜１１２０の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むことができ、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドは、低度にストリンジェント、中程度にストリンジェントまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１１のヌクレオチド２３０〜１１２０の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされ得る。ある特定の実施形態において、ＢＭＰ１０プロドメインポリペプチドは、配列番号４の２２〜３１６のアミノ酸配列またはこれに対して少なくとも、６３％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるアミノ酸配列を有する。ＢＭＰ１０プロドメインポリペプチドは、そのいずれかの部分を含む、配列番号１２のヌクレオチド２２３〜１１０７の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むことができ、ＢＭＰ１０プロドメインポリペプチドは、低度にストリンジェント、中程度にストリンジェントまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１２のヌクレオチド２２３〜１１０７の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされ得る。プロドメインポリペプチドは、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合することができる。

好ましくは、医薬品調製物は、実質的にパイロジェン・フリーである。一般に、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドが、患者における好ましくない免疫応答の見込みを減弱することができるように、天然グリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株において発現されることが好ましい。ヒト細胞株およびＣＨＯ細胞株の使用が成功したため、他の一般的な哺乳動物発現ベクターが有用であることが予想される。

ある特定の態様において、本開示は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを作製するための方法を提供する。このような方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等、適した細胞において本明細書に開示されている核酸（例えば、配列番号１１または１２）のいずれかを発現させることを含むことができる。このような方法は、ａ）ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの発現に適した条件下で、ＢＭＰ９発現構築物またはＢＭＰ１０発現構築物で形質転換された細胞を培養することと、ｂ）このようにして発現されたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを回収することとを含むことができる。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、細胞培養物からタンパク質を得るための周知の技法のいずれかを使用して、粗製か、部分的に精製されたかまたは高度に精製された画分として回収することができる。精製は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡｃｔｒＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢもしくはＢＭＰＲＩＩまたはＢＭＰ９もしくはＢＭＰ１０に結合するこれらの改変版等、受容体タンパク質のリガンド結合ドメインと接触させることにより、達成することができる。リガンド結合ドメインは、例えば、ＩｇＧのＦｃ部分との（場合によって、介在するリンカーとの）融合体として使用することができ、かつプロテインＡでコーティングした表面上に固定することができる。

ある特定の態様において、ＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドまたは前述のうち１種もしくは複数を含む医薬品調製物は、対象における赤血球産生を促進するかまたは赤血球レベルを増大させるための方法において使用することができる。ある特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者における低い赤血球数または低いヘモグロビンレベルに関連する障害（例えば、貧血）を処置するため、あるいは赤血球産生を促進するための方法を提供する。方法は、これを必要とする対象に、有効量のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを投与することを含むことができる。ある特定の態様において、本開示は、本明細書に記載されている障害または状態の処置のための医薬を作製するための、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの使用を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
患者における赤血球レベルを増大させるため、または貧血を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、ＢＭＰ９ポリペプチドおよびＢＭＰ１０ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを投与することを含む方法。
（項目２）
前記ポリペプチドが、ＢＭＰ９ポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、配列番号３の配列に対して少なくとも６３％同一のアミノ酸配列を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１１のヌクレオチド１１２１〜１４５０の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、配列番号３の配列に対して同一のアミノ酸配列を含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記ポリペプチドが、ＢＭＰ１０ポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＢＭＰ１０ポリペプチドが、配列番号６の配列に対して少なくとも６３％同一のアミノ酸配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ＢＭＰ１０ポリペプチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１２のヌクレオチド１１０８〜１４３１の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記ＢＭＰ１０ポリペプチドが、配列番号６の配列に対して同一のアミノ酸配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドが、医薬品調製物において投与される、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記医薬品調製物が、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドおよびＢＭＰ１０プロドメインポリペプチドからなる群から選択されるプロドメインポリペプチドを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記プロドメインポリペプチドが、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記プロドメインポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２３〜３１９の配列に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記プロドメインポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２３〜３１９のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記医薬品調製物が、前記ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドと非共有結合により会合したＢＭＰ９ポリペプチドを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記医薬品調製物が、前記ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドと非共有結合により会合したＢＭＰ１０ポリペプチドを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記プロドメインポリペプチドが、ＢＭＰ１０プロドメインポリペプチドである、項目１１に記載の方法。
（項目１８）
前記プロドメインポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸２２〜３１６の配列に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記プロドメインポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸２２〜３１６のアミノ酸配列を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記患者が、慢性腎臓疾患に伴う貧血を有する、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記患者が、化学療法処置に伴う貧血を有する、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記化学療法処置が、タキサンである、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記患者が、失血の結果として貧血を有する、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。（項目２４）
ＢＭＰポリペプチドと、プロドメインポリペプチドとを含む医薬品調製物であって、前記ＢＭＰポリペプチドが、ＢＭＰ９ポリペプチドおよびＢＭＰ１０ポリペプチドからなる群から選択され、前記プロドメインポリペプチドが、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドおよびＢＭＰ１０プロドメインポリペプチドからなる群から選択される医薬品調製物。
（項目２５）
前記ＢＭＰポリペプチドの実質的な部分が、前記プロドメインポリペプチドと非共有結合により会合する、項目２４に記載の医薬品調製物。
（項目２６）
前記ＢＭＰポリペプチドが、ＢＭＰ９ポリペプチドである、項目２４に記載の医薬品調製物。
（項目２７）
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、配列番号３の配列に対して少なくとも６３％同一のアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の医薬品調製物。
（項目２８）
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１１のヌクレオチド１１２１〜１４５０の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の医薬品調製物。
（項目２９）
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、配列番号３の配列と同一のアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の医薬品調製物。
（項目３０）
前記ポリペプチドが、ＢＭＰ１０ポリペプチドである、項目２４に記載の医薬品調製物。
（項目３１）
前記ＢＭＰ１０ポリペプチドが、配列番号６の配列に対して少なくとも６３％同一のアミノ酸配列を含む、項目３０に記載の医薬品調製物。
（項目３２）
前記ＢＭＰ１０ポリペプチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１２のヌクレオチド１１０８〜１４３１の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、項目３０に記載の医薬品調製物。（項目３３）
前記ＢＭＰ１０ポリペプチドが、配列番号６の配列と同一のアミノ酸配列を含む、項目３０に記載の医薬品調製物。
（項目３４）
前記プロドメインポリペプチドが、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドである、項目２５〜３３のいずれかに記載の医薬品調製物。
（項目３５）
前記プロドメインポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２３〜３１９の配列に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、項目３４に記載の医薬品調製物。
（項目３６）
前記プロドメインポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２３〜３１９のアミノ酸配列を含む、項目３４に記載の医薬品調製物。
（項目３７）
前記プロドメインポリペプチドが、ＢＭＰ１０プロドメインポリペプチドである、項目２５〜３３のいずれかに記載の医薬品調製物。
（項目３８）
前記プロドメインポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸２２〜３１６の配列に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、項目３７に記載の医薬品調製物。
（項目３９）
前記プロドメインポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸２２〜３１６のアミノ酸配列を含む、項目３７に記載の医薬品調製物。

図１は、ヒト、マウスおよびニワトリのＢＭＰ９タンパク質の多重配列アライメントを示す。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して得られた。図２は、ヒト、マウスおよびニワトリのＢＭＰ１０タンパク質の多重配列アライメントを示す。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して得られた。図３は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０の成熟部分のアライメントを示す。

発明の詳細な説明
１．概要
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における多種多様な細胞型に対して生物学的効果を発揮することが公知である。スーパーファミリーのメンバーは、胚発生の際にパターン形成および組織特化において重要な機能を行い、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化過程に影響を与えることができる。ＴＧＦ−ベータファミリーのメンバーの活性を操作することにより、多くの場合、生物において顕著な生理的変化を引き起こすことが可能になる。例えば、ピエモンテ（Piedmontese）およびベルジャン・ブルー（Belgian Blue）のウシ品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子に、著しい筋量増加をもたらす機能喪失型突然変異を保有する。Grobetら、Nat Genet.１９９７年、１７巻（１号）：７１〜４頁。さらに、ヒトにおいて、ＧＤＦ８の不活性アレルは、筋量増加と、報告によれば、並外れた力に関連する。Schuelkeら、N Engl J Med ２００４年、３５０巻：２６８２〜８頁。

骨形成タンパク質９（ＢＭＰ９）およびＢＭＰ１０は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの２種の密接に関係したメンバーである。これらのタンパク質は、血液中を循環することのできるジスルフィド結合したホモ二量体として産生されると考えられる。ＢＭＰシグナルは、リガンド刺激により下流のＳｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー型複合体によって媒介される（Massague'、２０００年、Nat. Rev. Mol. Cell Biol.１巻：１６９〜１７８頁）。これらのＩ型受容体およびＩＩ型受容体は、システイン・リッチ領域を備えるリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測セリン／スレオニン特異性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達に必須である。ＩＩ型受容体は、リガンド結合およびＩ型受容体発現に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型のアクチビン受容体は、リガンド結合後に安定的な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０は、Ｉ型受容体ＡＬＫ１およびＡＬＫ２ならびにＩＩ型受容体ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢおよびＢＭＰＲＩＩを介してシグナル伝達すると考えられる。

本明細書において実証されている通り、ＢＭＰ９ポリペプチド（と、相同性および共通シグナル伝達経路により推論される通り、ＢＭＰ１０ポリペプチド）は、ｉｎｖｉｖｏにおける赤血球レベルを増大させるのに有効であり、種々の貧血モデルにおいて有益な効果を有することが予想される。造血が、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦおよび鉄恒常性を含む種々の因子により調節される複雑な過程であることに留意されたい。用語「赤血球レベルを増大させる」および「赤血球形成を促進する」は、ヘマトクリット、赤血球数およびヘモグロビン測定値等、臨床的に観察可能な測定基準を指し、このような変化を生じる機序に関して中立であることが企図される。

本明細書において使用されている用語は、一般に、本発明の文脈内において、また、各用語が使用される特定の文脈において、本技術分野におけるその通常の意味を有する。ある特定の用語は、本明細書の後述または他の箇所で記述されており、本発明の組成物および方法ならびにこれをどのようにして作製および使用するかの記載において実行者（practitioner）に対し追加的なガイダンスを提供する。用語のいずれかの使用の範囲または意味は、用語が使用されている特定の文脈から明らかになるであろう。

「約」および「およそ」は、一般に、測定値の性質または精度を考慮した、測定された量の許容できる程度の誤差を意味するものとする。典型的に、誤差の例示的な程度は、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内である。

あるいは、また、特に生物系において、用語「約」および「およそ」は、所定の値の一桁以内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは、２倍以内の値を意味し得る。本明細書に提示されている数的な量は、他に特に明記されていなければ近似的なものであり、明確に記述されていなければ、用語「約」または「およそ」が推論され得る状況を意味する。

本発明の方法は、野生型配列と１種または複数の突然変異体（配列バリアント）を含む配列を互いに比較するステップを含むことができる。このような比較は、典型的には、例えば、本技術分野において周知の配列アライメントプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、数例を挙げると、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を使用した、ポリマー配列のアライメントを含む。当業者であれば、このようなアライメントにおいて、突然変異が残基の挿入または欠失を含有する場合、配列アライメントが、挿入または欠失された残基を含有しないポリマー配列において「ギャップ」（典型的にはダッシュ記号または「Ａ」により表される）を導入することを容易に認めることができる。

「相同」は、そのあらゆる文法形式および綴り方のバリエーションにおいて、同じ生物種におけるスーパーファミリー由来のタンパク質ならびに異なる生物種由来の相同タンパク質を含め、「共通進化的起源」を保有する２種のタンパク質間の関係性を指す。このようなタンパク質（およびそれをコードする核酸）は、同一性パーセントの観点からであれ、特異的な残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性により反映される通りの配列相同性を有する。

用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法形式において、共通の進化的起源を共有しても共有しなくてもよい、核酸配列間またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す。

しかし、一般的な使用法において、また、本願において、用語「相同」は、「高度に」等の副詞により修飾される場合、配列類似性を指すことができ、これは共通進化的起源に関係しても関連しなくてもよい。

２．ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のポリペプチドおよび核酸
ある特定の態様において、本発明は、例えば、成熟ヒトＢＭＰ９タンパク質および成熟ヒトＢＭＰ１０タンパク質、ならびに、共有結合によって結合したものであれ非共有結合によって結合したものであれ、プロドメインを保持するＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドならびに前述のバリアントおよび切断型を含む、ＢＭＰ９ポリペプチドおよびＢＭＰ１０ポリペプチドに関する。このようなバリエーションおよび切断型は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＢＭＰＲ２およびＡｃｔＲＩＩＢを含む、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０の公知の受容体のうち１種または複数によりシグナル伝達を刺激する能力を保持するように選択することができる。場合によって、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、ＢＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物をトランスフェクトした細胞株におけるルシフェラーゼの発現を増加させることができる。

本明細書において使用される場合、用語「ＢＭＰ−９」または「ＢＭＰ−１０」は、いずれかの種由来のそれぞれＢＭＰ−９タンパク質またはＢＭＰ−１０タンパク質のファミリーと、変異誘発、切断または他の改変によるこのようなタンパク質に由来するバリアントを指す。ＢＭＰ−９タンパク質およびＢＭＰ−１０タンパク質は、図１および２に示す通り、特にタンパク質の成熟部分において、脊椎動物系列にわたって十分に保存されている。ヒトＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０の成熟部分はまた、互いに実質的な同一性を示す（６４％）（図３）。ＢＭＰ−９またはＢＭＰ−１０ファミリーのメンバーは、一般に、シグナルペプチドと、ＩＩ型受容体（例えば、ＢＭＰＲ２、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ）との結合と競合する様式で成熟部分に結合するプロドメインと、システインノットを含有する成熟部分とで構成された分泌タンパク質である。成熟部分は、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ１またはＡＬＫ２）およびＩＩ型受容体（例えば、ＢＭＰＲ２、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢ）の両方に結合して、シグナル伝達複合体を形成する。

用語「ＢＭＰ９ポリペプチド」は、それぞれＢＭＰ−９ファミリーメンバーのいずれかの天然起源のポリペプチドおよび有用な活性を保持するそのいずれかのバリアント（突然変異体、断片、融合体およびペプチド模倣型を含む）を含むポリペプチドを含む。例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドは、いずれか公知のＢＭＰ９タンパク質の配列に由来するポリペプチドを含むことができ、プロタンパク質型（プロドメインおよび成熟部分の両方を含有する）および完全な成熟型として、シグナルペプチドと共に発現される型を含むことができる。図１に示す通り、ヒト、マウスおよびニワトリといった多様な脊椎動物は、高度に保存されたＢＭＰ９タンパク質を有し、従って、機能的バリアントは、例えば、異なる脊椎動物種の間で保存性が低いアミノ酸の参照により選択することができる（このような変化は一般に許容されるため）。ＢＭＰ９ポリペプチドは、配列番号１、２、３、７もしくは８または配列番号７もしくは８の成熟部分のいずれか等、天然に存在するＢＭＰ９ポリペプチドの配列に対して少なくとも、６３％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるかまたはこれからなることができる。本明細書に記載されているあらゆるヒトＢＭＰ９ポリペプチドのアミノ酸のナンバリングは、他に特に指定されていなければ、配列番号１のナンバリングに基づく。

ＢＭＰ９ポリペプチドの例として、次のものが挙げられる。
全長ヒトＢＭＰ９前駆体（アミノ酸１〜２２に相当するシグナル配列を含む）（ＧｅｎｂａｎｋＮＰ＿０５７２８８）：

全長ヒトＢＭＰ９プロタンパク質（シグナル配列が除去されているがプロドメインを含み、配列番号１のアミノ酸２３〜４２９に相当する）：

成熟ヒトＢＭＰ９（シグナル配列およびプロドメインの両方が除去されており、配列番号１のアミノ酸３２０〜４２９に相当する）：

用語「ＢＭＰ１０ポリペプチド」は、それぞれＢＭＰ１０ファミリーメンバーのいずれかの天然に存在するポリペプチドおよび有用な活性を保持するそのいずれかのバリアント（突然変異体、断片、融合体およびペプチド模倣型を含む）を含むポリペプチドを含む。例えば、ＢＭＰ１０ポリペプチドは、いずれか公知のＢＭＰ１０タンパク質の配列に由来するポリペプチドを含むことができ、プロタンパク質型および完全な成熟型として、シグナルペプチドと共に発現される型を含むことができる。図２に示す通り、ヒト、マウスおよびニワトリといった多様な脊椎動物は、高度に保存されたＢＭＰ１０タンパク質を有し、従って、機能的バリアントは、例えば、異なる脊椎動物種の間で保存性が低いアミノ酸の参照により選択することができる。ＢＭＰ１０ポリペプチドは、配列番号４、５、６、９もしくは１０または配列番号９もしくは１０の成熟部分のいずれか等、天然に存在するＢＭＰ１０ポリペプチドの配列に対して少なくとも、６３％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるかまたはこれからなることができる。本明細書に記載されているあらゆるヒトＢＭＰ１０ポリペプチドのアミノ酸のナンバリングは、他に特に指定されていなければ、配列番号４のナンバリングに基づく。

ＢＭＰ１０ポリペプチドの例として、次のものが挙げられる。
全長ヒトＢＭＰ１０前駆体（アミノ酸１〜２１に相当するシグナル配列を含む）（ＧｅｎｂａｎｋＮＰ＿０５５２９７）：

全長ヒトＢＭＰ１０プロタンパク質（シグナル配列が除去されているがプロドメインを含み、配列番号４のアミノ酸２２〜４２４に相当する）：

成熟ヒトＢＭＰ１０（シグナル配列およびプロドメインの両方が除去されており、配列番号４のアミノ酸３１７〜４２４に相当する）：

ある特定の態様において、本開示は、本明細書に開示されているＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドのいずれかをコードする、単離されたおよび／または組換えによる核酸を提供する。このような核酸は、ＤＮＡ分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。このような核酸は、例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを作製するための方法において、あるいは直接的な治療剤として（例えば、遺伝子療法アプローチにおいて）使用することができる。

ヒトＢＭＰ９前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下のとおりである：（ＧｅｎｂａｎｋＮＭ＿０１６２０４）

ＢＭＰ９（シグナルペプチド、プロドメインおよび成熟部分）のコード領域は、配列番号１１の１６４位〜１４５３位に存在する。シグナルペプチドはヌクレオチド１６４〜２２９によって、プロドメインはヌクレオチド２３０〜１１２０によって、成熟ペプチドは１１２１位〜１４５０位によってコードされる。

ヒトＢＭＰ１０前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下のとおりである（ＧｅｎｂａｎｋＮＭ＿０１４４８２）：

ＢＭＰ１０（シグナルペプチド、プロドメインおよび成熟部分）のコード領域は、配列番号１２の１６０位〜１４３４位に存在する。シグナルペプチドはヌクレオチド１６０〜２２２によって、プロドメインはヌクレオチド２２３〜１１０７によって、成熟ペプチドは１１０８位〜１４３１位によってコードされる。

ある特定の態様において、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをコードする対象核酸は、配列番号１１または配列番号１２のバリアントである核酸を含むことがさらに理解される。バリアントヌクレオチド配列は、アレルバリアント等、１個または複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失により異なる配列を含み、従って、配列番号１１または１２において指定されているコード配列のヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含む。

ある特定の実施形態において、本開示は、配列番号１１もしくは配列番号１２またはプロドメインもしくは成熟部分をコードするこれらの部分に対して、少なくとも、６３％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の、単離されたかまたは組換えの核酸配列を提供する。当業者であれば、配列番号１１または１２および配列番号１１または１２のバリアントに相補的な核酸配列もまた、本発明の範囲内に収まることを認められよう。さらなる実施形態において、本発明の核酸配列は、単離されても、組換えであってもおよび／または異種ヌクレオチド配列と融合されてもよいか、あるいはＤＮＡライブラリーに存在してもよい。

他の実施形態において、本発明の核酸は、プロドメインまたは成熟部分をコードするその部分を含む配列番号１１または１２において指定されているヌクレオチド配列、そのプロドメインまたは成熟部分をコードするその部分を含む配列番号１１または１２の相補体配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。特定の実施形態において、本開示は、配列番号１１の１１２１〜１４５０の核酸の相補体または配列番号１２の１１０８〜１４３１の核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸と、前述によってコードされるＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドとを提供する。上に記す通り、当業者であれば、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変動し得ることを容易に理解することができよう。例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃にてハイブリダイゼーションを、続いて２．０×ＳＳＣ、５０℃にて洗浄を行うことができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ、５０℃の低ストリンジェンシーから約０．２×ＳＳＣ、５０℃の高ストリンジェンシーまでから選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度は、室温約２２℃の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増大させることができる。温度および塩の両方が変動されてよいか、あるいは温度または塩濃度を一定に維持しつつ、もう一方の変数を変化させてもよい。一実施形態において、本開示は、６×ＳＳＣ、室温、続いて２×ＳＳＣ、室温の洗浄という低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。

遺伝暗号における縮重により配列番号１１または１２に表記されている核酸とは異なる単離された核酸もまた、本発明の範囲内に収まる。例えば、多くのアミノ酸は、１個より多くのトリプレットにより指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、即ち同義（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンについて同義である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」変異をもたらすことができる。ある特定の実施形態において、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、代替ヌクレオチド配列にコードされる。代替ヌクレオチド配列は、ネイティブなＢＭＰ９またはＢＭＰ１０の核酸配列に関して縮重であるが、依然として同じ融合タンパク質をコードする。

ある特定の実施形態において、本発明の組換え核酸は、発現構築物において１種または複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適切である。多くの種類の適切な発現ベクターおよび適した調節配列が、種々の宿主細胞に対し本技術分野において公知である。典型的には、前記１種または複数の調節ヌクレオチド配列として、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げることができるがこれらに限定されない。本技術分野において公知のとおりの恒常プロモーターまたは誘導性プロモーターが、本発明によって企図されている。プロモーターは、天然に存在するプロモーターであっても、あるいは２種以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターであってもよい。発現構築物は、細胞内でプラスミド等のエピソームに存在していてもよく、あるいは発現構築物は染色体に挿入されていてもよい。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含有する。選択可能マーカー遺伝子は、本技術分野において周知であり、使用されている宿主細胞によって変動する。

本開示のある特定の態様において、対象核酸は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをコードし、少なくとも１種の調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節配列は、本技術分野において認識されており、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの直接的な発現に対して選択される。従って、用語調節配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを包含する。例示的な調節配列は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology、Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（１
９９０年）に記載されている。例えば、これに作動可能に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する幅広い種類の発現制御配列のいずれかをこれらのベクターにおいて使用して、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させてもよい。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系またはＴＲＣ系、その発現がＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより方向づけられるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体（polyhedron）プロモーターならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにこれらの様々な組合せが挙げられる。発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質の種類等の要因に依存し得ることを理解されたい。さらに、ベクターのコピー数、該コピー数を制御する能力および抗生物質マーカー等のベクターによってコードされる任意のその他のタンパク質の発現も考慮されるべきである。

ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの産生のための組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物）のいずれか一方またはその両方における発現に適したベクター中にライゲーションすることにより産生することができる。組換えＢＭＰ９ポリペプチドまたは組換えＢＭＰ１０ポリペプチドの産生のための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、適したベクターは、次の種類のプラスミド：Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミドを含む。

一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの繁殖を容易にするための原核生物配列と、真核細胞において発現される１種または複数の真核生物転写単位の両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇに由来するベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物抵抗性選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２等、細菌プラスミド由来の配列により改変されている。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）等、ウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現のために使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、後述する遺伝子療法送達系の説明に見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられている様々な方法は、本技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適した発現系ならびに一般組換え手順に関して、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第２版、Sambrook, Fritsch and Maniatis編（Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年）、第１６章および第１７章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現することが所望され得る。このようなバキュロウイルス発現系の例として、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１等）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１等）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ等）が挙げられる。

好ましい実施形態において、ベクターは、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）等、ＣＨＯ細胞における対象のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの産生のために設計される。明らかとなる通り、対象遺伝子構築物を使用して、培養において繁殖させた細胞における対象のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの発現をもたらして、例えば、精製のためのタンパク質（融合タンパク質またはバリアントタンパク質が挙げられる）を産生させることができる。

本開示はまた、対象のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドのうち１種または複数についてのコード配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞に関する。宿主細胞は、いかなる原核細胞であっても真核細胞であってもよい。例えば、本発明のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母または哺乳動物細胞において発現させることができる。他の適した宿主細胞は、当業者に公知である。

上述の核酸を使用して、例えば、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞を包含する、適した細胞において、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを発現させることができる。シグナル配列は、ＢＭＰ９もしくはＢＭＰ１０のネイティブシグナル配列、または組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列もしくはミツバチメリチン（ＨＢＭ）シグナル配列等の別のタンパク質由来のシグナル配列であり得る。ＢＭＰ１０成熟部分がＢＭＰ９プロドメインと共に発現されるように（またはその逆も可）、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のプロドメイン配列は交換することができる。タンパク質ＰＡＣＥ（またはフューリン）は、プロタンパク質を２個のペプチド（プロタンパク質および成熟部分）とする切断を媒介し、よって、このような切断が望まれる場合、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの産生が企図されている細胞においてＰＡＣＥ導入遺伝子を発現させることは有用である。ＧＤＦまたはＢＭＰファミリーのメンバーは、完全に活性となるためにそのプロドメインから解離する必要があることが一般に容認されている。ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０の場合、プロドメインは成熟部分と会合し続け、よって、投与できる医薬品形態を生成するために成熟部分を分離することが所望され得る。あるいは、本明細書において、プロドメインは、例えば、より長い血清半減期およびより優れたバイオアベイラビリティを含めた望ましい医薬品特性を付与し得ることが認識され、よって、ある特定の実施形態において、本開示は、プロドメインポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合したＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの成熟部分を含む医薬品調製物を提供する。「プロドメインポリペプチド」は、配列番号１のアミノ酸２３〜３１９または配列番号４のアミノ酸２２〜３１６等、天然に存在するＢＭＰ９プロドメイン配列またはＢＭＰ１０プロドメインの配列に対して少なくとも、６３％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるかまたはこれからなるポリペプチドである。プロドメインポリペプチドは、相当する成熟部分の３０、２０、１０または５個よりも多くのアミノ酸を一般に含むべきではないことが明らかである。ある特定の実施形態において、プロドメインポリペプチドは、１０^−６Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下もしくは１０^−９Ｍ以下の、またはそれら未満のＫＤで、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの成熟部分に結合する。

ある特定の実施形態において、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、ｅｘｖｉｖｏ有効保存期間およびｉｎｖｉｖｏにおけるタンパク質分解に対する抵抗性）の増強等の目的で、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの構造を改変することによる機能的バリアントの作製を企図する。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失または付加により生成することもできる。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるスレオニンの単離された置き換えまたは構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置き換え（例えば、保存的変異）は、その結果得られる分子の生物活性に大した効果を持たないであろうと予想することは理にかなう。保存的置き換えは、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で行われる置き換えである。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的バリアントをもたらすか否かは、未改変のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドと比べた、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドが細胞において応答を生じる能力、または１種もしくは複数の受容体に結合する能力を評価することにより、容易に決定することができる。プロドメインポリペプチドにおけるバリエーションの場合、バリアントの機能活性は、プロドメインが成熟ＢＭＰ９ポリペプチドまたは成熟ＢＭＰ１０ポリペプチドに結合する能力を測定することにより評価することができる。

ある特定の実施形態において、本発明は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドのグリコシル化を変更するような特異的な変異を有するＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを企図する。アミノ酸配列の変更は、一般にＮＸＳ配列またはＮＸＴ配列である１個または複数のＮ結合型グリコシル化部位を導入するように為すことができる。変異は、Ｏ結合型またはＮ結合型のグリコシル化部位等、１個または複数のグリコシル化部位を排除するように選択することもできる。変更は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの配列に対する１個または複数のアスパラギン残基、セリン残基またはスレオニン残基の付加またはこれとの置換により為すこともできる。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドにおける糖鎖部分の数を増加させる別の手段は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。使用されているカップリングモードに応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインの遊離スルフヒドリル基等の遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基等の遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンの芳香族残基等の芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させることができる。これらの方法は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する、国際公開第８７／０５３３０号パンフレットおよびAplin and Wriston（１９８１年）CRC Crit. Rev. Biochem.、２５９〜３０６頁に記載されている。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドに存在する１個または複数の糖鎖部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または均等な化合物へのＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの曝露を伴い得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトに保ちつつ、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分または全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddinら（１９８７年）Arch. Biochem. Biophys.２５９巻：５２頁およびEdgeら（１９８１年）Anal. Biochem.１１８巻：１３１頁によってさらに記載されている。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドにおける糖鎖部分の酵素的切断は、Thotakuraら（１９８７年）Meth. Enzymol.１３８巻：３５０頁によって記載されている通り、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入することができるため、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの配列は、使用されている発現系の種類に応じて、必要に応じて調整することができる。一般に、ヒトにおける使用のためのＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株等、適切なグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞株において発現されるが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であると予想される。

本開示は、場合によって切断バリアントを含む、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドのバリアント、特に、コンビナトリアルバリアントのセットを作製する方法をさらに企図する。コンビナトリアル変異体のプールは、ＢＭＰ９配列またはＢＭＰ１０配列を同定するために特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングの目的は、例えば、変更された薬物動態または変更された受容体結合等、変更された特性を有するＢＭＰ９ポリペプチドバリアントまたはＢＭＰ１０ポリペプチドバリアントを作製することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが後述されており、このようなアッセイを使用して、バリアントを評価することができる。例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドバリアントまたはＢＭＰ１０ポリペプチドバリアントは、ＡＬＫ１ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する能力に関してスクリーニングすることができる。

ＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドまたはそれらのバリアントの活性は、細胞ベースのアッセイまたはｉｎｖｉｖｏアッセイにおいて試験することもできる。例えば、造血に関与する遺伝子の発現におけるＢＭＰ９ポリペプチドバリアントまたはＢＭＰ１０ポリペプチドバリアントの効果を評価することができる。同様に、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをマウスまたは他の動物に投与し、ＲＢＣ数、ヘモグロビンレベル、ヘマトクリットレベル、鉄貯蔵または網状赤血球数等、１種または複数の血液測定値を、本技術分野において認識されている方法を使用して評価することができる。一般に、ＩＤ１遺伝子のプロモーター領域から得られるＢＭＰ応答性エレメント（ＢＲＥ）エレメントは、ＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達を刺激するＢＭＰ／ＧＤＦファミリーのメンバーの適切なレポーター遺伝子として広く認識されている。例えば、Logeart-Avramoglou Dら、Anal Biochem.２００６年２月１日；３４９巻（１号）：７８〜８６頁を参照されたい。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、ＡＴＤＣ５マウス軟骨形成細胞またはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス骨芽細胞によるアルカリホスファターゼの誘導により測定することもできる。Nakamura, K.ら（１９９９年）Exp. Cell Res.２５０巻：３５１頁。

ある特定の実施形態において、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドに天然に存在するいずれかの修飾に加えて、翻訳後修飾をさらに含むことができる。このような修飾として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、アシル化およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による修飾が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖およびホスフェート等、非アミノ酸エレメントを含有することができる。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの機能性に対するこのような非アミノ酸エレメントの効果は、他のＢＭＰ９ポリペプチドバリアントまたはＢＭＰ１０ポリペプチドバリアントに関して本明細書に記載されている通りに試験することができる。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドが、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの新生型を切断することにより細胞において産生される場合、翻訳後プロセシングは、タンパク質の正確なフォールディングおよび／または機能にも重要となり得る。異なる細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３等）は、このような翻訳後活性の特異的な細胞機構および特徴的な機序を有するため、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするよう選択され得る。

ある特定の態様において、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの少なくとも一部分と、１種または複数の融合ドメインとを有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例として、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択することができる。例えば、一部の融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的のためには、グルタチオン、アミラーゼおよびニッケルまたはコバルトにコンジュゲートされた樹脂等、親和性クロマトグラフィー用の適したマトリックスが使用される。このようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ_６）融合パートナーと共に有用なＰｈａｒｍａｃｉａＧＳＴ精製系およびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）系（Ｑｉａｇｅｎ）等、「キット」形態において入手可能である。別の例として、融合ドメインは、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの検出を容易にするように選択することができる。このような検出ドメインの例として、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）と共に、通常、特異的な抗体が入手可能である短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的なモノクローナル抗体を容易に入手可能である周知のエピトープタグとして、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。一部の場合において、融合ドメインは、適切なプロテアーゼに融合タンパク質を部分的に消化させ、これにより融合タンパク質から組換えタンパク質を遊離させることのできる、第Ｘａ因子またはトロンビン等のための、プロテアーゼ切断部位を有する。続いて、遊離されたタンパク質は、その後のクロマトグラフィー分離により融合ドメインから単離することができる。ある特定の好ましい実施形態において、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、ｉｎｖｉｖｏにおいてＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを安定化させるドメイン（「スタビライザー（stabilizer）」ドメイン）と融合される。「安定化」は、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少または他の薬物動態効果のいずれによるものであるかにかかわらず、血清半減期を増大させる任意のことを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に望ましい薬物動態特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を付与することができる。選択され得る他の種類の融合ドメインは、多量体形成（例えば、二量体形成、四量体形成）ドメインおよび機能ドメイン（赤血球レベルのさらなる増大等の追加的な生物機能を付与する）を含む。

所望の機能性と一貫した任意の様式で、融合タンパク質の異なるエレメントを配置してよいことが理解される。例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、異種ドメインに対してＣ末端側に置くことができるか、あるいは異種ドメインは、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドに対してＣ末端側に置くことができる。ＢＭＰ９ポリペプチドドメインまたはＢＭＰ１０ポリペプチドドメインと異種ドメインは、融合タンパク質において隣接している必要はなく、追加的なドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端側もしくはＮ末端側にまたは両ドメイン間に含まれていてよい。

ある特定の実施形態において、本発明は、単離された形態である、あるいは他の仕方により他のタンパク質を実質的に含まない、単離および／または精製された形態のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを利用できるようにする。

ある特定の実施形態において、本発明のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチド（未修飾または修飾）は、本技術分野において公知の種々の技法により産生することができる。例えば、ポリペプチドは、Bodansky, M.、Principles of Peptide Synthesis、Springer Verlag、ベルリン（１９９３年）およびGrant G. A.（編）、Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company、ニューヨーク（１９９２年）に記載されている技法等の標準タンパク質化学技法を使用して合成することができる。加えて、自動ペプチド合成機は市販されている（例えば、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈＭｏｄｅｌ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００）。あるいは、ＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチド、それらの断片またはバリアントは、本技術分野において周知の通り、様々な発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用して組換えにより産生し、続いてタンパク質精製することができる。ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）からも市販されている。

従って、本開示は、対象のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを産生する方法を提供する。例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を適切な条件下で培養して、ポリペプチドの発現を行わせることができる。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを含有する細胞および培地の混合物から、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを分泌させ、単離することができる。あるいは、これらのポリペプチドは、細胞質においてまたは膜画分に保持され得るため、細胞を収集し、溶解し、これらのタンパク質を単離し得る。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、本技術分野において周知である。対象のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫親和性精製を含め、タンパク質を精製するための本技術分野において公知の技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離することができる。

本開示は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＢＭＰＲ２、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢを含めたそれらの受容体のうち１種または複数に対するこれらのタンパク質の親和性を使用することにより、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの精製のための新規方法をさらに提供する。固体マトリックス（例えば、クロマトグラフィー樹脂）を前述のいずれかのリガンド結合部分に接合して、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドに選択的に結合する親和性マトリックスを作製することができる。受容体の細胞外ドメインを免疫グロブリンのＦｃ部分に融合し、プロテインＡ等のＦｃ結合タンパク質を含有するマトリックスに接合することができる。驚くべきことに、７９位にロイシンではなくアスパラギン酸またはグルタミン酸を含有するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのバリアントは、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの親和性精製に特に有効な試薬である。特に、このバリアントは、野生型ＡｃｔＲＩＩＢと比べてＢＭＰ９またはＢＭＰ１０に対し低下した親和性を有する。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの産生において有用な受容体および受容体−Ｆｃ融合体構築物の例に関して、その受容体および受容体−Ｆｃ配列をここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する次の公開されたＰＣＴ特許出願：国際公開第２０１１／０２００４５号、国際公開第２０１０／１５１４２６号、国際公開第２０１０／０１９２６１号、国際公開第２００９／１３９８９１号、国際公開第２００９／１３４４２８号、国際公開第２００８／０９７５４１号、国際公開第２００８／０７６４３７号、国際公開第２００７／０６２１８８号および国際公開第２００６／０１２６２７号を参照されたい。ＡｃｔＲＩＩＡ試薬、ＢＭＰＲ２試薬およびＡｃｔＲＩＩＢ試薬は、成熟部分との結合に関してプロペプチドと競合するため、ＢＭＰ９成熟タンパク質またはＢＭＰ１０成熟タンパク質を精製するために有用である。ＡＬＫ１試薬またはＡＬＫ２試薬は、プロペプチドと比べて別個でかつ非競合性の部位において結合するため、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをプロドメインとの複合体として精製するために有用である。

別の実施形態において、組換えＢＭＰ９ポリペプチドまたは組換えＢＭＰ１０ポリペプチドの所望の部分のＮ末端におけるポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列等の精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ^２＋金属樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーによる発現された融合タンパク質の精製を可能にする。続いて、エンテロキナーゼ処理により精製リーダー配列をその後に除去して、精製されたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをもたらすことができる（例えば、Hochuliら（１９８７年）J.Chromatography ４１１巻：１７７頁；およびJanknechtら、PNAS USA ８８巻：８９７２頁を参照）。

融合遺伝子を作製するための技法は周知である。基本的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の接合は、ライゲーションのための平滑末端または突出末端、適切な末端を生じるための制限酵素消化、必要に応じた付着末端のフィルイン、望まれない接合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素によるライゲーションを用いる従来の技法に従って行われる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、その後にアニーリングしてキメラ遺伝子配列を作製することのできる２個の連続した遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して行うことができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons：１９９２年を参照）。

３．例示的な治療使用
ある特定の実施形態において、本開示のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを使用して、齧歯類および霊長類、特にヒト患者等の哺乳動物における赤血球レベルを増大させることができる。その上、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをＥＰＯ受容体アクチベーターと組み合わせて使用して、より低い用量範囲で赤血球の増加を達成することができるか、あるいは全体により高いレベルのＲＢＣまたはより優れた奏効率を達成することができる。これは、高用量のＥＰＯ受容体アクチベーターに伴う公知のオフターゲット効果およびリスクの低下において有益であり得る。ある特定の実施形態において、本発明は、治療有効量のＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドまたはＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドとＥＰＯ受容体アクチベーターとの組合せ（または併用療法）を個体に投与することにより、貧血の処置または予防を必要とする個体における貧血を処置または予防する方法を提供する。これらの方法は、哺乳動物、特にヒトの治療的および予防的な処置に使用することができる。

ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドをＥＰＯ受容体アクチベーターと組み合わせて使用して、ＥＰＯの有害効果に対し感受性の患者におけるこのようなアクチベーターの必要とされる用量を低下させることができる。ＥＰＯの主要な有害効果は、ヘマトクリットまたはヘモグロビンのレベルの過剰な増大および赤血球増加症である。ヘマトクリットレベルの上昇は、高血圧（より詳細には、高血圧の増悪）および血管血栓症をもたらし得る。その一部が高血圧に関係する、報告されたことのあるＥＰＯの他の有害効果は、血栓症、高血圧性脳症および赤血球形成不全（red cell blood cell applasia）による頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞および脳痙攣である（Singibarti（１９９４年）J. Clin Investig ７２巻（増補６号）、Ｓ３６〜Ｓ４３頁；Horlら（２０００年）Nephrol Dial Transplant １５巻（増補４号）、５１〜５６頁；Delantyら（１９９７年）Neurology ４９、６８６〜６８９頁；Bunn（２００２）N Engl J Med ３４６巻（７号）、５２２〜５２３頁）。

本明細書に開示されているＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの赤血球レベルにおける迅速な効果は、このような薬剤がＥＰＯとは異なる機序により作用することを示す。従って、このようなアンタゴニストは、ＥＰＯに十分に応答しない患者における赤血球およびヘモグロビンのレベルの増大に有用であり得る。例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、正常から増加（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）用量のＥＰＯの投与により、標的レベルへのヘモグロビンレベルの増大がもたらされない患者に有益であり得る。不適切なＥＰＯ応答を有する患者は、あらゆる種類の貧血に見出されるが、より多数のノンレスポンダーががん患者および末期腎疾患患者において特に頻繁に観察された。ＥＰＯに対する不適切な応答は、構成的（即ち、最初のＥＰＯ処置の際に観察される）または獲得的（例えば、反復的なＥＰＯ処置の際に観察される）のいずれかであり得る。

本明細書において使用する場合、障害または状態を「予防」する治療剤は、統計学的試料において、未処置対照試料と比べて処置された試料における障害または状態の発生を低減させるか、あるいは未処置対照試料と比べて障害または状態の１種または複数の症状の発生を遅延させるかまたは重症度を低下させる化合物を指す。本明細書における用語「処置」は、指名された状態が確立された後における、指名された状態の予防法または状態の改善もしくは排除を含む。いずれの場合においても、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって為される診断ならびに治療剤投与の企図される結果において識別することができる。

本明細書に示されている通り、ＥＰＯ受容体アクチベーターと場合によって組み合わされたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを使用して、健康な個体における赤血球、ヘモグロビンまたは網状赤血球のレベルを増大させることができ、このようなＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、選択される患者集団において使用することができる。適切な患者集団の例として、貧血の患者、および相当量の失血を生じ得る大手術または他の手順を受けようとしている患者等の望ましくない程低い赤血球またはヘモグロビンレベルを発症するリスクがある患者等の、望ましくない程低い赤血球またはヘモグロビンのレベルを有する患者集団が挙げられる。一実施形態において、適切な赤血球レベルを有する患者は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドで処置されて赤血球レベルを増大させ、続いて血液を採取し、輸血における後での使用のために貯蔵する。

本明細書に開示されている、ＥＰＯ受容体アクチベーターと場合によって組み合わされたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを使用して、貧血の患者における赤血球レベルを増大させることができる。ヒトにおけるヘモグロビンレベルを観察すると、適切な年齢および性別カテゴリーに対して正常に満たないレベルは（個々のバリエーションも考慮に入れられるが）、貧血を示すことができる。例えば、１２ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、一般に、一般成人集団における正常の下限と考えられる。潜在的原因は、失血、栄養欠乏、薬物療法反応、骨髄に伴う様々な問題および多くの疾患を含む。より詳細には、貧血は、例えば、慢性腎不全、骨髄異形成症候群、関節リウマチ、骨髄移植を含む、種々の障害に関連付けられてきた。貧血は、次の状態にも関連付けられてきた：固体腫瘍（例えば、乳がん、肺がん、結腸がん）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ球白血病、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫）；放射線療法；化学療法（例えば、白金含有レジメン）；関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、急性または慢性皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）等が挙げられるがこれらに限定されない、炎症性および自己免疫性の疾患；特発性または先天性の状態を含む急性または慢性の腎疾患または腎不全；急性または慢性の肝臓疾患；急性または慢性の出血；患者の同種異系抗体もしくは自己抗体および／または宗教上の理由（例えば、一部のエホバの証人）により赤血球の輸血が不可能な状況；感染症（例えば、マラリア、骨髄炎）；例えば、鎌状赤血球疾患、サラセミアを含む異常ヘモグロビン症；薬物使用または乱用、例えば、アルコール誤用；輸血を回避する何らかの原因による貧血の小児患者；および循環過負荷に関する懸念により輸血を受けることのできない高齢患者または貧血を伴う根底にある心肺疾患を有する患者。

ＥＰＯ受容体アクチベーターと場合によって組み合わされたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、典型的には赤血球（ＲＢＣ）形態の変化を殆ど伴わない、低増殖性骨髄（bone marrrow）の貧血の処置に適切なものとなろう。低増殖性貧血は、１）慢性疾患の貧血、２）腎臓疾患の貧血および３）低代謝状態に関連する貧血を含む。これらの種類のそれぞれにおいて、内在性エリスロポエチンレベルは、観察された貧血の程度に対し不適切に低い。他の低増殖性貧血は、４）初期鉄欠乏性貧血および５）骨髄への損傷が原因の貧血を含む。これらの種類において、内在性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対し適切に上昇する。

最も一般的な種類の貧血は、炎症、感染症、組織傷害およびがん等の状態を包含する慢性疾患の貧血であり、骨髄における低いエリスロポエチンレベルおよびエリスロポエチンに対する不適切な応答の両方により区別される（Adamson、２００８年、Harrison's Principles of Internal Medicine、第１７版；McGraw Hill、ニューヨーク、６２８〜６３４頁）。多くの因子が、がん関連の貧血に寄与し得る。その一部は、疾患過程それ自体ならびにインターロイキン−１、インターフェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子等の炎症性（inflamatory）サイトカインの生成に関連する（Bronら、２００１年、Semin Oncol ２８巻（増補８号）：１〜６頁）。その効果の中でも、炎症は、重要な鉄調節性ペプチドであるヘプシジンを誘導し、これによりマクロファージからの鉄搬出を阻害し、一般に、赤血球生成のための鉄利用能を限定する（Ganz、２００７年、J Am Soc Nephrol １８巻：３９４〜４００頁）。様々な経路による失血も、がん関連貧血に寄与し得る。がん進行による貧血の罹患率は、がんの種類により変動し、前立腺がんにおける５％から、多発性骨髄腫における９０％までに及ぶ。がん関連貧血は、疲労およびクオリティ・オブ・ライフの低下、処置有効性の低下および死亡率の増加を含む、患者にとって著明な結果を有する。

慢性腎臓疾患は、腎臓損傷の程度により重症度が変動する低増殖性貧血に関連する。このような貧血は、主として、エリスロポエチンの不適切な産生および赤血球の生存低下によるものである。慢性腎臓疾患は通常、数年間または数十年間の期間をかけて末期（ステージ５）疾患に徐々に進行し、この時点において、患者の生存のために透析または腎臓移植が必要とされる。貧血は多くの場合、この過程における初期に発症し、疾患が進行するにつれ悪化する。腎臓疾患の貧血の臨床結果は、十分に裏付けされており、左室肥大の発症、認知機能の損傷、クオリティ・オブ・ライフの低下および免疫機能の変更を含む（Levinら、１９９９年、Am J Kidney Dis ２７巻：３４７〜３５４頁；Nissenson、１９９２年、Am J Kidney Dis ２０（増補１号）：２１〜２４頁；Revickiら、１９９５年、Am J Kidney Dis ２５巻：５４８〜５５４頁；Gafterら、１９９４年、Kidney Int ４５巻：２２４〜２３１頁）。ＥＰＯ受容体アクチベーターと場合によって組み合わされたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを使用して、腎臓疾患の貧血を処置することができる。

低代謝速度をもたらす多くの状態は、軽度から中等度の低増殖性貧血を生じ得る。このような状態の中でも、内分泌欠乏状態が挙げられる。例えば、貧血は、アジソン病、甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進、または去勢されたかもしくはエストロゲンで処置された男性において起こり得る。軽度から中等度の貧血は、タンパク質の食事摂取の低下によって起こる場合もあり、これは高齢者において特に蔓延している状態である。最後に、貧血は、殆どあらゆる原因による慢性肝臓疾患の患者において発症し得る（Adamson、２００８年、Harrison's Principles of Internal Medicine、第１７版；McGraw Hill、ニューヨーク、６２８〜６３４頁）。

外傷または分娩後出血等、十分な容量の急性失血による貧血は、急性出血後貧血として公知である。他の血液成分とＲＢＣとの比例的枯渇が存在するため、急性失血は最初に、貧血なしの血液量減少を引き起こす。しかし、血液量減少は、血管外区画から血管区画に体液をシフトさせる生理学的機序を急速に誘発し、これが血液希釈および貧血をもたらす。慢性であれば、失血は、体内の鉄貯蔵を徐々に枯渇させ、最終的に鉄欠乏をもたらす。ＥＰＯ受容体アクチベーターと場合によって組み合わされたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを使用して、急性失血の貧血からの回復速度を上げることができる。

鉄欠乏性貧血は、中間段階として負の鉄バランスおよび鉄欠乏性赤血球生成を含む、増加する鉄欠乏の段階的な進行における最終段階である。鉄欠乏は、妊娠、不適切な食事、腸吸収不良、急性または慢性の炎症および急性または慢性の失血等の状態において例証される通り、鉄需要の増加、鉄摂取の減少または鉄損失の増加に起因し得る。この種の軽度から中等度の貧血により、骨髄は低増殖性を維持し、ＲＢＣ形態は大部分が正常である。しかし、軽度の貧血であっても、いくつかの小球性低色素性ＲＢＣをもたらすことがあり、重症鉄欠乏性貧血への移行は、骨髄の過剰増殖ならびにますます蔓延する小球性および低色素性ＲＢＣを伴う（Adamson、２００８年、Harrison's Principles of Internal Medicine、第１７版；McGraw Hill、ニューヨーク、６２８〜６３４頁）。鉄欠乏性貧血に適切な治療法は、その原因および重症度に依存し、主要な従来の選択肢として経口鉄調製物、非経口的鉄製剤およびＲＢＣ輸血が挙げられる。ＥＰＯ受容体アクチベーターと場合によって組み合わされたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを使用して、単独でまたは従来の治療的アプローチと組み合わせて慢性鉄欠乏性貧血を処置、特に多因子起源の貧血を処置することができる。

低増殖性貧血は、炎症、感染症またはがん進行に続発する機能障害の代わりに、骨髄の原発性の機能障害または不全に起因し得る。顕著な例は、がん化学療法薬またはがん放射線療法が原因の骨髄抑制である。臨床治験の広範な総説は、軽度の貧血が、化学療法後の患者の１００％において起こり得るが、より重症な貧血が、このような患者の最大８０％において起こり得ることを見出した（Groopmanら、１９９９年、J Natl Cancer Inst ９１巻：１６１６〜１６３４頁）。骨髄抑制薬は、１）ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン）およびニトロソウレア（例えば、ストレプトゾシン）等のアルキル化剤；２）葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）、プリンアナログ（例えば、チオグアニン）およびピリミジンアナログ（例えば、ゲムシタビン）等の代謝拮抗物質；３）アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）等の細胞傷害性抗生物質（antibotics）；４）キナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ）；５）タキサン（例えば、パクリタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン）等の有糸分裂阻害剤；６）モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）；ならびに７）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカンおよびエトポシド）を含む。ＥＰＯ受容体アクチベーターと場合によって組み合わされたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを使用して、化学療法剤および／または放射線療法が原因の貧血を処置することができる。

ＥＰＯ受容体アクチベーターと場合によって組み合わされたＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、一部には小振りの（小球性）、大振りの（大球性）、奇形のまたは異常な色の（低色素性）ＲＢＣによって特徴付けられる混乱したＲＢＣ成熟の貧血の処置にも適切である。

患者は、通常、約１０ｇ／ｄｌ〜約１２．５ｇ／ｄｌの間、典型的には、約１１．０ｇ／ｄｌ（Jacobsら（２０００年）Nephrol Dial Transplant １５巻、１５〜１９頁も参照）である標的ヘモグロビンレベルに患者を回復させることが企図される投薬レジメンで処置することができるが、より低い標的レベルは、より少ない心血管副作用をもたらし得る。あるいは、ヘマトクリットレベル（細胞に占有される血液試料の容量のパーセンテージ）は、赤血球の状態の尺度として使用することができる。健康な個体のヘマトクリットレベルは、成人男性で４１〜５１％、成人女性で３５〜４５％に及ぶ。標的ヘマトクリットレベルは通常、３０〜３３％前後である。さらに、ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、個人間で変動する。よって、最適には、標的ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、患者毎に個別化することができる。

ある特定の実施形態において、本発明は、患者における１種または複数の血液学的パラメータを測定することにより、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドで処置したことがあるか、あるいはこれで処置するための候補である、患者を管理するための方法を提供する。血液学的パラメータを使用して、ＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドで処置する候補である患者に適切な投薬を評価する、ＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドによる処置の間の血液学的パラメータをモニターする、ＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドによる処置の間の投薬量を調整するか否かを評価する、および／またはＢＭＰ９ポリペプチドもしくはＢＭＰ１０ポリペプチドの適切な維持用量を評価することができる。血液学的パラメータのうち１種または複数が、正常レベル外である場合、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドによる投薬を低下、遅延または終結させることができる。

本明細書に提示されている方法に従って測定することのできる血液学的パラメータは、例えば、本技術分野において認識される方法を使用する、赤血球レベル、血圧、鉄貯蔵、および赤血球レベルの増大と相関する体液中に存在する他の作用因子を含む。このようなパラメータは、患者由来の血液試料を使用して決定することができる。赤血球レベル、ヘモグロビンレベルおよび／またはヘマトクリットレベルの増大は、血圧の増加を引き起こすことができる。

一実施形態において、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドで処置する候補である患者において、１種または複数の血液学的パラメータが、正常範囲外であるかまたは正常の高め（high side）である場合、血液学的パラメータが自然にまたは治療介入のいずれかにより正常または許容できるレベルに戻るまで、ポリペプチドの投与の開始を遅延させることができる。例えば、候補患者が、高血圧または前高血圧症である場合、患者の血圧を低下させるために、患者を血圧降下剤で処置することができる。例えば、利尿薬、アドレナリン作動性阻害剤（アルファ遮断薬およびベータ遮断薬を含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬を含む、個々の患者の状態に適切ないかなる血圧降下剤を使用してもよい。あるいは、血圧は、食事および運動レジメンを使用して処置することができる。同様に、候補患者が、正常よりも低いかまたは正常の低め（low side）である鉄貯蔵を有する場合、患者の鉄貯蔵が正常または許容できるレベルに戻るまで、食事および／または鉄サプリメントの適切なレジメンで患者を処置することができる。正常赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルよりも高いレベルを有する患者に対しては、レベルが正常または許容できるレベルに戻るまで、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの投与を遅延させることができる。

ある特定の実施形態において、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドで処置する候補である患者において、１種または複数の血液学的パラメータが、正常範囲外であるかまたは正常の高めである場合、投与の開始を遅延させることができる。しかし、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの投薬量または投薬頻度は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの投与の際に生じる血液学的パラメータの許容されない増加のリスクを低下させる量に設定することができる。あるいは、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを、望ましくないレベルの血液学的パラメータに取り組む治療剤と組み合わせる治療レジメンを患者に対し開発することができる。例えば、患者が上昇した血圧を有するか、あるいはＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドが血圧上昇を引き起こすと考えられる場合、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドおよび血圧降下剤の投与に関与する治療レジメンを設計することができる。所望の鉄貯蔵よりも低い鉄貯蔵を有する患者に対しては、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドおよび鉄補充の治療レジメンを開発することができる。

一実施形態において、１種または複数の血液学的パラメータのベースラインパラメータ（複数可）は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドで処置する候補である患者に対して確立することができ、適切な投薬レジメンは、ベースライン値（複数可）に基づき該患者に対し確立する。あるいは、患者の病歴に基づき確立されたベースラインパラメータを使用して、患者に適切なＢＭＰ９ポリペプチド投薬レジメンまたはＢＭＰ１０ポリペプチド投薬レジメンを知らせることができる。例えば、健康な患者が、定義された正常範囲を上回る確立されたベースライン血圧読み取り値を有する場合、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドによる処置前に一般集団に対して正常と考えられる範囲に患者の血圧を収める必要がない可能性がある。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドによる処置前の１種または複数の血液学的パラメータに関する患者のベースライン値は、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドによる処置の間の血液学的パラメータに対するいずれかの変化をモニターするための適切な比較値として使用することもできる。

ある特定の実施形態において、１種または複数の血液学的パラメータは、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０ポリペプチドにより処置しようとしている患者において測定される。血液学的パラメータを使用して、処置の間に患者をモニターし、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０ポリペプチドによる投薬または別の治療剤による追加的な投薬の調整または終結を許可することができる。例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの投与が、血圧、赤血球レベルもしくはヘモグロビンレベルの増大または鉄貯蔵の低下をもたらす場合、１種または複数の血液学的パラメータに対するＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの効果を減少させるために、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの用量は、量または頻度を低下させることができる。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの投与が、患者に有害な１種または複数の血液学的パラメータの変化をもたらす場合、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの投薬は、血液学的パラメータ（複数可）が許容できるレベルに戻るまで一時的に、あるいは永続的に終結させることができる。同様に、１種または複数の血液学的パラメータが、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの投与の用量または頻度を低下させた後に許容できる範囲内に収まらない場合、投薬を終結させることができる。ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドによる投薬の低下または終結の代替として、あるいはこれに加えて、例えば、血圧降下剤または鉄サプリメント等、血液学的パラメータ（複数可）における望ましくないレベルに取り組む追加的な治療剤を用いて患者に投薬することができる。例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドにより処置される患者が、上昇した血圧を有する場合、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドによる投薬を同じレベルで継続することができ、かつ血圧降下剤を処置レジメンに加えるか、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドによる投薬を（例えば、量および／または頻度を）低下させることができ、かつ血圧降下剤を処置レジメンに加えるか、あるいはＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドによる投薬を終結して、患者を血圧降下剤で処置することができる。

４．医薬品調製物
ある特定の実施形態において、本発明のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、薬学的に許容できる担体と共に製剤化される。例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドは、単独でまたは医薬品調製物の構成成分として投与することができる。対象化合物は、ヒトまたは獣医学医薬における使用のためのいずれかの簡便な仕方における投与のために製剤化することができる。上に記す通り、プロドメインポリペプチドを含む製剤においてＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを調製することが所望され得る。

ある特定の実施形態において、本発明の治療方法は、全身的にまたはインプラントもしくは装置として局所的に調製物を投与することを含む。投与される場合、本発明における使用のための医薬品調製物は、当然ながら、パイロジェン・フリーで生理学的に許容できる形態である。上述の調製物に場合によって含まれていてよい、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチド以外の治療的に有用な薬剤は、対象のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドと同時にまたは逐次的に投与することができる。

典型的には、化合物は非経口的に投与される。非経口的投与に適した医薬品調製物は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、製剤に企図されているレシピエントの血液との等張性を付与する溶質、または懸濁もしくは増粘剤を含有することのできる、１種または複数の薬学的に許容できる無菌等張性の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョンまたは直前使用に無菌注射用溶液もしくは分散液に再構成することのできる無菌粉末（例えば、凍結乾燥物（lyophilate））と組み合わせた、１種または複数のＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドを含むことができる。本発明の医薬組成物において用いることのできる適した水性および非水性の担体の例として、水、糖、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールその他等）およびこれらの適した混合物、オリーブ油等の植物油ならびにオレイン酸エチル等の注射可能有機エステルが挙げられる。

さらに、調製物は、標的組織部位に送達するための形態においてカプセルに包むかまたは注射することができる。ある特定の実施形態において、本発明の調製物は、組織発達のための構造を提供し、最適には、体内に再吸収されることができる、標的組織部位に１種または複数の治療化合物（例えば、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチド）を送達することのできるマトリックスを含むことができる。例えば、マトリックスは、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドのゆっくりとした放出をもたらすことができる。このようなマトリックスは、他の植え込み型医療適用のために現在使用されている材料から形成することができる。

マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面特性に基づく。対象組成物の特定の適用は、適切な製剤を規定する。組成物のための潜在的なマトリックスは、生分解性かつ化学的に規定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物となり得る。他の潜在的な材料は、骨または真皮コラーゲン等、生分解性であり、かつ生物学的に十分に規定されている。さらに別のマトリックスは、純粋タンパク質または細胞外マトリックス構成成分で構成される。他の潜在的なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネート（aluminate）または他のセラミックス等、非生分解性であってかつ化学
的に規定されている。マトリックスは、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンとリン酸三カルシウム等、上述の種類の材料のいずれかの組合せで構成され得る。バイオセラミックスは、カルシウム−アルミネート−ホスフェートのように、組成を変更させ、孔径、粒子径、粒子形状および生分解性を変更するよう加工することができる。

投薬量レジメンが、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの作用を変更する様々な因子を考慮しつつ、担当医によって決定されることが理解される。様々な因子として、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、収縮期もしくは拡張期の血圧または他の診断評価、所望の標的赤血球数、患者の年齢、性別および食事、抑制された赤血球レベルに寄与し得るいずれかの疾患の重症度、投与の時間ならびに他の臨床因子が挙げられるがこれらに限定されない。最終組成物への他の公知の増殖因子の添加は、投薬量にも影響を与え得る。進行は、赤血球およびヘモグロビンレベルの定期的評価ならびに網状赤血球レベルおよび造血過程の他の指標の評価によりモニターすることができる。

ある特定の実施形態において、本発明はまた、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ産生のための遺伝子療法を提供する。このような治療法は、上に収載する障害を有する細胞または組織へのＢＭＰ９ポリヌクレオチド配列またはＢＭＰ１０ポリヌクレオチド配列の導入により、その治療効果を達成する。ＢＭＰ９ポリヌクレオチド配列またはＢＭＰ１０ポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスまたはコロイド分散系等の組換え発現ベクターを使用して達成することができる。標的化リポソームの使用が、ＢＭＰ９ポリヌクレオチド配列またはＢＭＰ１０ポリヌクレオチド配列の治療送達に好ましい。

本明細書に教示されている通りに遺伝子療法に利用することのできる様々なウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアまたはレトロウイルス等のＲＮＡウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子を挿入することのできるレトロウイルスベクターの例として、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるがこれらに限定されない。数多くの追加的なレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組み入れることができる。形質導入された細胞を同定および作製することができるように、このようなベクターの全てが、選択可能マーカーの遺伝子を伝達または組み入れることができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることにより、標的特異的にされることができる。好ましい標的化は、抗体の使用により達成される。当業者であれば、特異的なポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに挿入するかまたはウイルスエンベロープに付着させて、ＢＭＰ９ポリヌクレオチドまたはＢＭＰ１０ポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にすることができることを認識する。

例証
本発明をここで概説してきたが、本発明は、次の実施例を参照することによりさらに容易に理解される。実施例は、単にある特定の実施形態および本発明の実施形態の説明目的のために含まれており、本発明の限定を企図していない。

（実施例１）
ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ１０ポリペプチドの作製
ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）等の商業的供給業者から購入することができる。あるいは、後述等のプロトコールに従うことができる：
ＢＭＰ−９のネイティブシグナル配列を組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のシグナル配列または別のシグナル配列に置き換えることにより、ヒトＢＭＰ−９（ｂＢＭＰ９）ｃＤＮＡ構築物を作製した。リーダー配列の例：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１４）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１５）

ｔＰＡシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を、ＢＭＰ−９のプロペプチド／成熟領域をコードするＤＮＡ配列とインフレームで融合した。このｃＤＮＡ配列をｐＡＩＤ４ベクターにクローニングし、次のプロセシングされていない配列を有するタンパク質をコードさせた：

ＢＭＰ１０ポリペプチド発現カセットを同様に産生することができる：

ＰＡＣＥ（フューリン）（ＧｅｎｂａｎｋＮｏ．Ｐ０９９５８）の可溶性（分泌）型を発現するよう操作されたＣＨＯＤＵＫＸＢ１１細胞株に、ＢＭＰ−９構築物をトランスフェクトした。ＰＡＣＥの同時発現は、ＢＭＰのプロペプチド切断を容易にする。１０ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）においてクローンを選択し、続いて５０ｎＭＭＴＸにおいて増幅させて、発現を増加させた。希釈クローニングにより高発現クローンを同定し、無血清懸濁増殖に適応させて、精製のための馴化培地を作製した。場合によって、遍在性クロマチンオープニングエレメント（ubiquitous chromatin opening element）（ＵＣＯＥ）をベクターに含ませて、発現を容易にすることができる。例えば、Cytotechnology.２００２年１月；３８巻（１〜３号）：４３〜６頁を参照されたい。

次の配列を有する変更ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合タンパク質をプロテインＡカラム（ＭＡｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）に充填し、架橋することにより調製した親和性カラムに通すことにより、親和性精製を達成した：

０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いて、カラムからＢＭＰ−９タンパク質を溶出させた。ＢＭＰ１０を同じ様式で調製することができる。共有結合二量体と非共有結合二量体との混合溶液としてＢＭＰ９またはＢＭＰ１０が精製される場合、共有結合型と非共有結合型とは、０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で０〜１００％アセトニトリルの勾配により溶出するＶｙｄａｃＣ４カラム等の逆相ＨＰＬＣを使用して分離することができる。共有結合／非共有結合二量体含量は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとの比較により評価することができる。

（実施例２）
野生型マウスへのＢＭＰ９の投与
赤血球生成に対するＢＭＰ９の効果を探索するため、１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを無作為化して（２群、１群当たり５匹の動物）、ビヒクル（vehicle）対照（０．８ｍＭＨＣｌおよび０．１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ）またはＢＭＰ９（１０ｍｇ／ｋｇ）の２用量を１日１回、２日間腹腔内注射により与えた。試験終了日に尾静脈から血液試料を採取した。処置後４８時間目に全血を得て、全血球数（ＣＢＣ）を決定した。

ＢＭＰ９は、ビヒクル対照と比較して、ＲＢＣ数、ヘモグロビン（ＨＧＢ）レベルおよびヘマトクリット（ＨＣＴ）をそれぞれ３２％、３４％および３１％増加させた。このことは、ＢＭＰ９処置が赤血球増加をもたらすことを示唆した。白血球または他の血液パラメータに対する実質的な効果はなかった。

本試験は、エリスロサイト数、ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットによって測定される通り、ＢＭＰ９が、血流における赤血球のレベルの増大において著明で選択的かつ迅速な効果を有することを実証した。

参照による援用
本明細書に言及されているあらゆる刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許が参照により援用されていると具体的にかつ個々に示されているかのように、これによりここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を援用する。

主題の特定の実施形態について記述してきたが、上の明細書は、説明目的であって制限目的ではない。本明細書および後述する特許請求の範囲を概観すると、当業者であれば多くのバリエーションが明らかになるであろう。特許請求の範囲と共にその均等物の全範囲と、本明細書と共にこのようなバリエーションを参照することにより、本発明の全範囲を決定するべきである。

Claims

本明細書に記載の発明。