JP2017178818A - 遺伝子導入リンパ球の移植による細胞療法における治療効果及びgvhdを可視化するpetイメージング技術 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を組込んだアデノウイルスベクター及びFEAUを組合せて含む、細胞療法の際のGVHDをモニタリングするための試薬。
[2] 単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を組込んだアデノウイルスベクターを導入した細胞療法用細胞及びFEAUを組合せて含む、細胞療法の際のGVHDをモニタリングするための試薬。
[3] アデノウイルスベクターが、(i) 第1のプロモーター、発現させようとする単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物、(ii) エンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーであって、hTERTエンハンサーを含むエンハンサーを、(i)及び(ii)の順で含み、ポリA付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーが連結した、単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子のタンパク質発現を増強し得るアデノウイルスベクターである、[1]又は[2]の試薬。
[4] GVHDのモニタリングをPETイメージングにより行う、[1]〜[3]のいずれかの試薬。
[5] 単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を組込んだアデノウイルスベクター及びFDGを組合せて含む、細胞療法による癌治療効果をモニタリングするための試薬。
[6] HSV-TK遺伝子を組込んだアデノウイルスベクターを導入した細胞療法用細胞及びFDGを組合せて含む、細胞療法による癌治療効果をモニタリングするための試薬。
[7] アデノウイルスベクターが、(i) 第1のプロモーター、発現させようとする単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物、(ii) エンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーであって、hTERTエンハンサーを含むエンハンサーを、(i)及び(ii)の順で含み、ポリA付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーが連結した、単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子のタンパク質発現を増強し得るアデノウイルスベクターである、[5]又は[6]の試薬。
[8] 細胞療法による癌治療効果のモニタリングをPETイメージングにより行う、[5]〜[7]のいずれかの試薬。
(i) 外来タンパク質をコードするDNAの直ぐ上流に連結されたRU5';
(ii) エンハンサー及び/又はプロモーターの直ぐ上流に連結されたUAS;及び
(iii) 発現用カセットの最上流に連結されたSV40-ori。
(i) 発現させようとする遺伝子の直ぐ上流に連結されたRU5';及び
(ii) 発現用カセットの最上流に連結されたSV40-ori。
上記のアデノウイルスベクターは、導入した外来遺伝子の発現効率に優れており、例えば、他の発現ベクター(例えば、pTracer(登録商標)-EFベクター)と比較した場合、5〜10倍の量の単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)タンパク質を生産することができる。
(1) 組換えAdVの発生、純化、及び継代
組換えAdV(Ad-SGEpro-HSV1-TK)の基となるコスミドDNAを用意した。これらのコスミドDNAを遺伝子導入した293AD細胞を20日間培養し、細胞変性を確認できた培養容器内の感染細胞を-80℃に保存した。感染細胞を3回凍結融解した後、限界希釈法によりAdVを純化した。1つの培養容器内の感染細胞から得るAdVクローンは1種類に限定した。
5mlの4.0M CsCl2溶液{10mM Tris-HCl (pH8.0)含有}の上に5mlの2.2M CsCl2溶液{10 mM Tris-HCl (pH8.0)含有}を重層した。5次感染細胞を3回凍結融解した後、その遠心(3000rpm、4℃、30分間)上清(30 ml)をCsCl2溶液の上に重層し、スイングローターで1次遠心(10000rpm、4℃、15時間)した。4.0Mと2.2MのCsCl2層の境界面に集積したAdV粒子を採取して、2次遠心の材料とした。2次遠心では、最初に2次遠心材料(5ml)に等量の6.5M CsCl2溶液{10mM Tris-HCl (pH8.0)含有}を混和して遠心管に入れ、その上に5mlの4.0M CsCl2溶液{10 mM Tris-HCl (pH8.0)含有}、5 mlの2.2M CsCl2溶液{10mM Tris-HCl (pH8.0)含有}、10mlの10mM Tris-HCl (pH8.0)溶液をこの順に重層し、スイングローターで2次遠心(10000rpm、4℃、23時間)した。4.0Mと2.2MのCsCl2層の境界面に集積したAdV粒子を採取して、10% Glycerol添加10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液を用いて透析した後、分注して-80℃に保存した。
精製組換えAdVを段階希釈した後、96ウェルプレートに用意した293AD細胞に接種し、37℃で培養した。5日間の培養の後、96ウェルプレートごと293AD細胞を3回凍結融解し、その遠心(3000rpm、4℃、15分)上清を新たに96ウェルプレートに用意した293AD細胞に接種して5日間培養した。細胞変性の認められたウェルを陽性と判定し、Behrens-Karber の方法で50%組織培養感染量(TCID50)を算出した。
(1) GVHDモデルマウスの作製
C57BL/6マウスの骨髄、脾臓、及び末梢血から採取したリンパ球に対して、上記の手法で作製したHSV1-tk遺伝子をコードする非増殖型アデノウイルスベクターを導入し、HSV1-TK遺伝子導入ドナーリンパ球を得た。得られた遺伝子導入リンパ球をBALB/cマウスに対して尾静脈より投与することで、GVHDモデルマウスとした。
GVHDモデルマウス及び正常マウスを用いて、PET/CTイメージングを実施した。FDGについては約8MBqを各マウスの尾静脈より投与し1時間後に、また、FEAUについては約10MBqを尾静脈より投与し2時間後にイソフルラン吸入麻酔により不動化し、5〜10分間のスタティックPET撮像を行った。PET撮像に次いでCT撮像を行った。FDGについてはPET/CT撮像終了後に正常及びモデルマウスの腸管を摘出しオートラジオグラフィー撮像を行うことで、その詳細な放射能分布を比較・検討した。
Claims (8)
- 単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を組込んだアデノウイルスベクター及びFEAUを組合せて含む、細胞療法の際のGVHDをモニタリングするための試薬。
- 単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を組込んだアデノウイルスベクターを導入した細胞療法用細胞及びFEAUを組合せて含む、細胞療法の際のGVHDをモニタリングするための試薬。
- アデノウイルスベクターが、(i) 第1のプロモーター、発現させようとする単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物、(ii) エンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーであって、hTERTエンハンサーを含むエンハンサーを、(i)及び(ii)の順で含み、ポリA付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーが連結した、単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子のタンパク質発現を増強し得るアデノウイルスベクターである、請求項1又は2に記載の試薬。
- GVHDのモニタリングをPETイメージングにより行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の試薬。
- 単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を組込んだアデノウイルスベクター及びFDGを組合せて含む、細胞療法による癌治療効果をモニタリングするための試薬。
- HSV-TK遺伝子を組込んだアデノウイルスベクターを導入した細胞療法用細胞及びFDGを組合せて含む、細胞療法による癌治療効果をモニタリングするための試薬。
- アデノウイルスベクターが、(i) 第1のプロモーター、発現させようとする単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物、(ii) エンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーであって、hTERTエンハンサーを含むエンハンサーを、(i)及び(ii)の順で含み、ポリA付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーが連結した、単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子のタンパク質発現を増強し得るアデノウイルスベクターである、請求項5又は6に記載の試薬。
- 細胞療法による癌治療効果のモニタリングをPETイメージングにより行う、請求項5〜7のいずれか1項に記載の試薬。
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