JP2017086043A - Methods and kits for detecting pancreatic cancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、膵臓癌の鑑別診断の支援を可能とするDNAメチル化異常の検出のための方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and kit for detection of DNA methylation abnormality that can support differential diagnosis of pancreatic cancer.
膵臓癌は、半世紀に亘る研究や治療開発にも関わらず５年生存率が５％に満たない難治性癌のひとつであり、症状が判明したのち診断の時にすでに進行していることが多いため、早期診断マーカーの確立に対するニーズが高い。この癌では、KRASの変異による活性化がほぼ偏在的に存在することが知られている（非特許文献１）。 Pancreatic cancer is one of the intractable cancers with a 5-year survival rate of less than 5% despite research and treatment development for half a century. Therefore, there is a high need for the establishment of early diagnosis markers. In this cancer, it is known that activation by mutation of KRAS exists almost ubiquitously (Non-patent Document 1).
膵臓癌を検出するためのマーカーについては、特定の遺伝子やタンパク質の高発現若しくは低発現、特定のmiRNAの存在の有無、特定の遺伝子のプロモーターCpGアイランドの異常な高DNAメチル化若しくは低DNAメチル化などの面から研究されており、多くのマーカーが報告されている。このうち異常なDNAメチル化若しくは非メチル化は、例えば発癌における遺伝子の発現の抑制若しくは亢進と関係するエピジェネティックス事象として癌の診断への利用が検討されている。 Markers for detecting pancreatic cancer include high or low expression of specific genes and proteins, presence or absence of specific miRNAs, abnormal high or low DNA methylation of promoter CpG islands of specific genes Many markers have been reported. Among these, abnormal DNA methylation or non-methylation has been studied for use in cancer diagnosis as an epigenetic event related to, for example, suppression or enhancement of gene expression in carcinogenesis.
膵臓癌を診断若しくは検出するための異常DNAメチル化の分析に関して、例えば、論文等で報告されたデータを基にして作成された膵臓癌の多数の遺伝子に関するメチル化データベース（http://crdd.osdd.net/raghava/pcmdb/）が提供されている（非特許文献２）。また、文献が提案する異常DNAメチル化遺伝子マーカーが異なるいくつかの例を以下に紹介する。 Regarding the analysis of abnormal DNA methylation for diagnosing or detecting pancreatic cancer, for example, a methylation database (http: // crdd. osdd.net/raghava/pcmdb/) is provided (Non-Patent Document 2). In addition, some examples of different aberrant DNA methylation gene markers proposed in the literature are introduced below.
非特許文献３には、膵臓癌に関係する高頻度の異常DNAメチル化標的としてDLX4、ELAVL2、IRX1、PITX2、SIM2、TBX5及びTFAP2C遺伝子などが記載されている。 Non-Patent Document 3 describes DLX4, ELAVL2, IRX1, PITX2, SIM2, TBX5, TFAP2C genes and the like as high-frequency abnormal DNA methylation targets related to pancreatic cancer.
非特許文献４には、膵臓癌に関係する高DNAメチル化遺伝子としてp16、RASSF1A、MDFI、ZNF415、CNTNAP2、ELOVL4、SOX15、HOPX、KLF10、MLH1、SPARC、NPTX2、UCHL1遺伝子などが記載されている。 Non-patent document 4 describes p16, RASSF1A, MDFI, ZNF415, CNTNAP2, ELOVL4, SOX15, HOPX, KLF10, MLH1, SPARC, NPTX2, UCHL1 genes and the like as high DNA methylation genes related to pancreatic cancer. .
非特許文献５には、膵臓癌に関係する高DNAメチル化遺伝子としてGSTM2、NGFB、ALK、DES、CASP3、FLT4、ESR1、Cyclin D2(CCND2)遺伝子など多数が記載されている。
非特許文献６には、膵液中のDNAメチル化を１％より大のカットオフで定量MSPを用いて測定するとき膵臓癌を予測できることが記載されており、このときメチル化マーカーとしてFOXE1、NPTX2、ppENK、TEPI2、CCND2、p16遺伝子を使用し、特にFOXE1及びNPTX2は100％の陽性率を与えたことが記載されている。 Non-Patent Document 6 describes that pancreatic cancer can be predicted when DNA methylation in pancreatic juice is measured using quantitative MSP with a cut-off greater than 1%. At this time, FOXE1, NPTX2 are used as methylation markers. PpENK, TEPI2, CCND2, and p16 genes are used, and in particular, FOXE1 and NPTX2 are described as giving 100% positive rates.
特許文献１には、膵臓癌を検出することを可能にするメチル化サイレンシング（発現抑制）を受ける遺伝子として、CDH3、reprimo、CLDN5、DR3、FOXE1、LDOC1、LHX1、NEFH、NPTX2、PIG11、SARP2、ST14、SMRCA1、TJP2、UCHL1、WNT7Aなど多数が記載されている。 In Patent Document 1, CDH3, reprimo, CLDN5, DR3, FOXE1, LDOC1, LHX1, NEFH, NPTX2, PIG11, SARP2 are genes that undergo methylation silencing (expression suppression) to enable detection of pancreatic cancer. , ST14, SMRCA1, TJP2, UCHL1, WNT7A and many others are described.
特許文献２には、RASGRF1遺伝子の定量メチル化測定法を用いて発癌リスクを予測することが記載されており、癌は、ras遺伝子変異をもつ、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、膵癌及び肺癌であるとしているが、実施例では胃癌のみについて測定されている。 Patent Document 2 describes that carcinogenic risk is predicted using the quantitative methylation measurement method of the RASGRF1 gene, and cancer is gastric cancer, duodenal cancer, colon cancer, pancreatic cancer and lung cancer having a ras gene mutation. In the examples, only gastric cancer is measured.
非特許文献７、８及び９には、血液中のDNAメチル化を測定して膵臓癌を予測することが記載されている。具体的には、非特許文献７には、膵臓癌を予測するためのメチル化マーカーとしてVHL、MYF3、TMS、GPC3及びSRBC遺伝子が記載されており、また、この５種のマーカーを組み合わせたときAUC0.848、感度0.807、特異度0.666であることが記載されている。非特許文献８には、血清DNAメチル化マーカーとして、膵臓癌と正常膵臓とを識別する６種の候補遺伝子、すなわちUCHL1、NPTX2、SARP2、ppENK、CDKN2A及びRASSF1Aが記載されている。非特許文献９には、血清DNAメチル化マーカーとして、BNC1とADAMTS1遺伝子が記載されており、早期癌の検出も可能であることが示されている。 Non-patent documents 7, 8 and 9 describe that pancreatic cancer is predicted by measuring DNA methylation in blood. Specifically, Non-Patent Document 7 describes VHL, MYF3, TMS, GPC3, and SRBC genes as methylation markers for predicting pancreatic cancer, and when these five markers are combined. AUC 0.848, sensitivity 0.807, specificity 0.666 are described. Non-Patent Document 8 describes six candidate genes for distinguishing pancreatic cancer from normal pancreas, that is, UCHL1, NPTX2, SARP2, ppENK, CDKN2A, and RASSF1A as serum DNA methylation markers. Non-Patent Document 9 describes BNC1 and ADAMTS1 genes as serum DNA methylation markers, indicating that early cancer can be detected.
本発明の目的は、被験体における膵臓癌を、特定の遺伝子のDNAメチル化異常に基づいて、かつ、約90％以上の感度と特異度で、すなわち高い正診率で、検出若しくは検出支援（或いは、検査、又は判定支援）する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、上記方法に使用するための膵臓癌を検出若しくは検出支援（或いは、検査、又は判定支援）するためのキットを提供することである。
An object of the present invention is to detect or support pancreatic cancer in a subject based on abnormal DNA methylation of a specific gene and with a sensitivity and specificity of about 90% or more, that is, at a high accuracy rate ( Alternatively, an inspection or determination support method is provided.
Another object of the present invention is to provide a kit for detecting or supporting detection (or examination or determination support) of pancreatic cancer for use in the above method.
本発明者らは、上記の課題を解決するために、被験体における膵臓癌の発症及び罹患を、従来法と比べて、並びに、他の癌（例えば、大腸癌、胃癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、急性骨髄性白血病及び皮膚癌）と比べて膵臓癌で高頻度にDNAメチル化している遺伝子セットを選択することによって、より精確に検出（若しくは検出支援）することを可能にする特定の遺伝子の異常なメチル化の存在を見出し、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明は、以下の特徴を含む。
In order to solve the above problems, the present inventors have compared the onset and morbidity of pancreatic cancer in a subject as compared with conventional methods, and other cancers (for example, colon cancer, stomach cancer, lung adenocarcinoma, lung More accurate detection (or detection support) by selecting a gene set that is frequently DNA methylated in pancreatic cancer compared to squamous cell carcinoma, breast cancer, kidney cancer, bladder cancer, acute myeloid leukemia and skin cancer) The present invention has been completed by finding the presence of abnormal methylation of a specific gene that makes it possible to
Accordingly, the present invention includes the following features.
（１）被験体の生物学的検体において、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4及びC13orf18遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を測定し、該少なくとも１種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドがDNAメチル化されている場合、被験体は膵臓癌を発症していると決定することを含む、該被験体の膵臓癌の発症をインビトロで検出若しくは検出支援する方法。
（２）前記遺伝子のうち少なくとも２種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を測定することを含む、上記（１）に記載の方法。
（３）HOXA1遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化を測定する、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）PCDH10遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化をさらに測定する、上記（３）に記載の方法。
（５）CCND2遺伝子及び／又はBMP3遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化を測定することをさらに含む、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）生物学的検体が、血液、血漿、血清、唾液、尿、膵液、糞便、腹水又は膵臓組織である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）上記遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化をパイロシークエンス法、メチル化特異的PCR法、定量的メチル化特異的PCR法、高感度DNAメチル化検出法、又はそれらの組み合わせによって測定する、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
(1) measuring the presence or absence of DNA methylation in the promoter CpG island of at least one gene selected from the group consisting of HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4 and C13orf18 genes in a biological specimen of a subject; Detecting or detecting in vitro the onset of pancreatic cancer in the subject, comprising determining that the subject has developed pancreatic cancer if the promoter CpG island of the at least one gene is DNA methylated How to help.
(2) The method according to (1) above, comprising measuring the presence or absence of DNA methylation of promoter CpG islands of at least two genes among the genes.
(3) The method according to (1) or (2) above, wherein DNA methylation of the promoter CpG island of the HOXA1 gene is measured.
(4) The method according to (3) above, wherein DNA methylation of the promoter CpG island of PCDH10 gene is further measured.
(5) The method according to any one of (1) to (4), further comprising measuring DNA methylation of a promoter CpG island of CCND2 gene and / or BMP3 gene.
(6) The method according to any one of (1) to (5) above, wherein the biological specimen is blood, plasma, serum, saliva, urine, pancreatic juice, feces, ascites, or pancreatic tissue.
(7) DNA methylation of the promoter CpG island of the above gene is measured by a pyrosequencing method, a methylation-specific PCR method, a quantitative methylation-specific PCR method, a highly sensitive DNA methylation detection method, or a combination thereof. The method according to any one of (1) to (6) above.
（８）HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4及びC13orf18遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を検出するための試薬を含む膵臓がん検査用キット。
（９）CCND2遺伝子及び／又はBMP3遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を検出するための試薬をさらに含む、上記（８）に記載のキット。
（１０）試薬が、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4、BMP3、C13orf18及びCCND2遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化領域を特異的に増幅するためのプライマーである、上記（８）又は（９）に記載のキット。
（１１）試薬が、バイサルファイト試薬及びPCR反応試薬をさらに含む、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載のキット。
(8) For pancreatic cancer test comprising a reagent for detecting the presence or absence of DNA methylation of promoter CpG island of at least one gene selected from the group consisting of HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4 and C13orf18 genes kit.
(9) The kit according to (8), further comprising a reagent for detecting the presence or absence of DNA methylation of the promoter CpG island of the CCND2 gene and / or BMP3 gene.
(10) The above (8) or (9), wherein the reagent is a primer for specifically amplifying the DNA methylation region of the promoter CpG island of HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4, BMP3, C13orf18 and CCND2 genes ) Kit.
(11) The kit according to any one of (8) to (10), wherein the reagent further comprises a bisulfite reagent and a PCR reaction reagent.
本発明は、低侵襲性（血液、血清若しくは血漿検体使用可能）及び高陽性率（かつ、偽陽性率がかなり低い）で膵臓癌を（他の癌種と区別して）特異的に、かつ、早期膵臓癌（ステージI/II）でさえも、検出（又は検出支援）することを可能にするという優れた作用効果を提供する。 The present invention is specific to pancreatic cancer (as distinguished from other cancer types) with low invasiveness (blood, serum or plasma specimens can be used) and high positive rate (and false positive rate is quite low), and Even an early stage pancreatic cancer (stage I / II) provides an excellent effect of enabling detection (or detection support).
本発明をさらに詳細に説明する。 The present invention will be described in further detail.
１．膵臓癌の検出方法
本発明は、第１の態様において、被験体の生物学的検体において、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4及びC13orf18遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を測定し、該少なくとも１種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドがDNAメチル化されている場合、被験体は膵臓癌を発症していると決定することを含む、該被験体の膵臓癌の発症をインビトロで検出若しくは検出支援する方法を提供する。
1. In the first aspect, the present invention provides a promoter for at least one gene selected from the group consisting of HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4 and C13orf18 genes in a biological specimen of a subject. Measuring the presence or absence of DNA methylation of a CpG island, and determining that the subject has developed pancreatic cancer if the promoter CpG island of the at least one gene is DNA methylated A method for detecting or supporting the development of pancreatic cancer in a body in vitro is provided.
本明細書において使用する「膵臓癌」は、膵臓の癌腫を指し、例えば、膵管腺癌、膵内分泌腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍などを含む。 As used herein, “pancreatic cancer” refers to carcinoma of the pancreas and includes, for example, pancreatic ductal adenocarcinoma, pancreatic endocrine tumor, intraductal papillary mucinous tumor, mucinous cystic tumor, and the like.
本明細書において使用する「被験体」は、ヒトを含む哺乳動物であり、例えば、ヒト、ペット動物、動物園で飼育する動物など、好ましくはヒトである。 As used herein, a “subject” is a mammal including a human, and is preferably a human, such as a human, a pet animal, or an animal raised in a zoo.
本明細書において使用する「生物学的検体」は、被験体において膵臓癌の発症若しくは罹患を検出することができる限り制限はないが、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、膵液、糞便、腹水又は膵臓組織を挙げることができる。とりわけ、低侵襲性の検査が可能な検体が好ましく、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、及び糞便が挙げられる。本発明の実施形態によれば、好ましい生物学的検体は、血液、血漿又は血清である。 The “biological specimen” used in the present specification is not particularly limited as long as it can detect the onset or morbidity of pancreatic cancer in a subject. For example, blood, plasma, serum, saliva, urine, pancreatic juice, feces Ascites or pancreatic tissue. In particular, a specimen capable of a minimally invasive test is preferable, and examples thereof include blood, plasma, serum, saliva, urine, and feces. According to an embodiment of the invention, the preferred biological specimen is blood, plasma or serum.
本明細書において使用する「DNAメチル化」は、学術的に一般的な意味を有し、哺乳動物ゲノム上の上記遺伝子の非翻訳領域、特にプロモーター領域のCpGアイランド（「プロモーターCpGアイランド」とも称する。）配列においてシトシン(C)の5位炭素原子が高メチル化(hypermethylation)されている現象を指す。CpGアイランドは、哺乳動物のゲノム配列において非翻訳領域に存在するシトシン(C)グアニン(G)含量が多い領域であり、CGからなるジヌクレオチドの繰り返し配列をしばしば含む。癌組織でのDNAメチル化異常においても、特定の遺伝子のプロモーター領域が高頻度にメチル化され遺伝子発現が低下している。 As used herein, “DNA methylation” has a scientifically common meaning and is a CpG island of the untranslated region of the above gene, particularly the promoter region (also referred to as “promoter CpG island”) on the mammalian genome. .) This refers to a phenomenon in which the 5-position carbon atom of cytosine (C) is hypermethylated in the sequence. A CpG island is a region having a high cytosine (C) guanine (G) content present in an untranslated region in a mammalian genome sequence, and often contains a repetitive sequence of dinucleotides consisting of CG. Even in the case of abnormal DNA methylation in cancer tissue, the promoter region of a specific gene is frequently methylated and gene expression is reduced.
本発明の方法で標的となる遺伝子は、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4及びC13orf18の6種の遺伝子、並びに、場合によりCCND2（cyclin D2）遺伝子及び／又はBMP3遺伝子を含む。 Genes targeted by the method of the present invention include six genes HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4 and C13orf18, and optionally CCND2 (cyclin D2) gene and / or BMP3 gene.
膵臓癌でのこれらの遺伝子のCpGアイランドの高メチル化異常は、膵臓癌において該遺伝子のサイレンシング（発現抑制）を起こすと推定される。正常組織の該遺伝子では非メチル化状態である（ただし、老化等に起因してメチル化される場合も知られている。）ことを考慮すると、上記遺伝子のサイレンシングは癌抑制遺伝子の発現低下と関連する可能性も推定される。 Abnormal hypermethylation of CpG islands of these genes in pancreatic cancer is presumed to cause silencing (inhibition of expression) of these genes in pancreatic cancer. Considering that the normal tissue gene is unmethylated (but known to be methylated due to aging, etc.), silencing of the above gene results in decreased expression of tumor suppressor genes. The possibility of being related to is also estimated.
上記８種の遺伝子のうちCCND2遺伝子は、例えば上記非特許文献６のなかで膵管腺癌において膵液DNAメチル化が検出された標的のひとつとして記載されている。本発明者らは、CCND2遺伝子について血液DNAメチル化を検討したときには、後述の表２（学習セット）及び表３（検証セット）に示されるように65％以上の検体で非メチル化という結果となった。膵液と血液の検体の違いとメチル化の有無との関係は不明である。 Among the above eight genes, the CCND2 gene is described as one of the targets in which pancreatic juice DNA methylation was detected in pancreatic ductal adenocarcinoma, for example, in Non-Patent Document 6 described above. When the present inventors examined blood DNA methylation for the CCND2 gene, as shown in Table 2 (learning set) and Table 3 (validation set) to be described later, the results indicate that 65% or more of the samples were unmethylated. became. The relationship between the difference between pancreatic juice and blood samples and the presence or absence of methylation is unknown.
本発明の方法で標的となる遺伝子は、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4、BMP3、C13orf18及びCCND2の８種の遺伝子のうち、特に２種以上の遺伝子のCpGアイランドでDNAメチル化を検出する場合には、検証セットで感度94.7％及び特異度100％となり、非常に高い陽性率（偽陽性率０％）が達成できる（後述実施例の表３参照）。 Among the eight genes of HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4, BMP3, C13orf18 and CCND2, the genes targeted by the method of the present invention detect DNA methylation, particularly in CpG islands of two or more genes. In some cases, the sensitivity of the validation set is 94.7% and the specificity is 100%, and a very high positive rate (false positive rate of 0%) can be achieved (see Table 3 in Examples below).
上記８種の遺伝子のうち、HOXA1遺伝子は、膵臓癌検出のための特に優れたDNAメチル化マーカーであり、この遺伝子をPCDH10遺伝子と組み合わせるとき、膵臓癌において、一方又は両方の遺伝子のCpGアイランドがDNAメチル化される（表３）。それゆえ、上記２種以上の遺伝子として、少なくともHOXA1及びPCDH10遺伝子を含むことが好ましい。 Of the above 8 genes, the HOXA1 gene is a particularly excellent DNA methylation marker for pancreatic cancer detection. When this gene is combined with the PCDH10 gene, CpG islands of one or both genes are present in pancreatic cancer. DNA methylated (Table 3). Therefore, it is preferable that at least the HOXA1 and PCDH10 genes are included as the two or more genes.
以下に、各遺伝子のプロモーター領域のCpGアイランドを含む周辺配列として、ヒト遺伝子の例を示す。なお、ヒト以外の哺乳動物種の該当する遺伝子の配列については、例えばGenBank（米国NCBI）のデータベース等から入手することができる。 Examples of human genes are shown below as peripheral sequences including CpG islands in the promoter region of each gene. In addition, about the arrangement | sequence of the applicable gene of mammalian species other than a human, it can obtain from the database of GenBank (US NCBI) etc., for example.
HOXA1は、homeobox A1の遺伝子名であり、そのヒト塩基配列は「NG_011813」の登録番号でGenBank（米国NCBI）に登録されている。ヒトHOXA1遺伝子のプロモーターCpGアイランドを含む周辺配列の例を以下に示す。
[配列番号１]（配列中、下線部はプライマーを示し、陰影部はSeqプライマーを示す。また、太字ATGは開始コドンを示す。）
HOXA1 is the gene name of homeobox A1, and its human base sequence is registered in GenBank (US NCBI) with a registration number of “NG — 011813”. Examples of peripheral sequences including the promoter CpG island of human HOXA1 gene are shown below.
[SEQ ID NO: 1] (In the sequence, the underlined portion indicates the primer, the shaded portion indicates the Seq primer, and the bold ATG indicates the start codon.)
ADAMTS2は、ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 2 の遺伝子名であり、そのヒト塩基配列は「NG_023212」の登録番号でGenBank（米国NCBI）に登録されている。ヒトADAMTS2遺伝子のプロモーターCpGアイランドを含む周辺配列の例を以下に示す。
[配列番号２]（配列中、下線部はプライマーを示す。また、太字AGCはプローブを示す。）
ADAMTS2 is the gene name of ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 2, and its human base sequence is registered in GenBank (NCBI, USA) with the registration number “NG — 023212”. Examples of peripheral sequences including the promoter CpG island of the human ADAMTS2 gene are shown below.
[SEQ ID NO: 2] (In the sequence, the underlined portion indicates a primer. Bold AGC indicates a probe.)
PCDH10は、protocadherin 10の遺伝子名であり、そのヒト塩基配列は「NM_020815」の登録番号でGenBank（米国NCBI）に登録されている。ヒトPCDH10遺伝子のプロモーターCpGアイランドを含む周辺配列の例を以下に示す。
[配列番号３]（配列中、下線部はプライマーを示す。また、太字CAGは転写開始点を示す。）
PCDH10 is the gene name of
[SEQ ID NO: 3] (In the sequence, the underlined portion indicates a primer. Bold CAG indicates a transcription start point.)
SEMA5Aは、Sema Domain, Seven Thrombospondin Repeats (Type 1 And Type 1-Like), Transmembrane Domain (TM) And Short Cytoplasmic Domain, (Semaphorin) 5Aの遺伝子名であり、そのヒト塩基配列は「NG_016410.1」の登録番号でGenBank（米国NCBI）に登録されている。ヒトSEMA5A遺伝子のプロモーターCpGアイランドを含む周辺配列の例を以下に示す。
[配列番号４]（配列中、下線部はプライマーを示す。また、太字GCTは転写開始点を示す。）
SEMA5A is the gene name of Sema Domain, Seven Thrombospondin Repeats (Type 1 And Type 1-Like), Transmembrane Domain (TM) And Short Cytoplasmic Domain, (Semaphorin) 5A, and its human base sequence is `` NG_016410.1 '' It is registered in GenBank (US NCBI) with a registration number. An example of the peripheral sequence including the promoter CpG island of the human SEMA5A gene is shown below.
[SEQ ID NO: 4] (In the sequence, the underlined portion represents a primer. Bold GCT represents the transcription start point.)
SPSB4は、splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 4の遺伝子名であり、そのヒト塩基配列は「NC_000003.12」の登録番号でGenBank（米国NCBI）に登録されている。ヒトSPSB4遺伝子のプロモーターCpGアイランドを含む周辺配列の例を以下に示す。
[配列番号５]（配列中、下線部はプライマーを示す。また、太字GGCGは転写開始点を示す。）
SPSB4 is the gene name of splA / ryanodine receptor domain and SOCS box containing 4, and its human base sequence is registered in GenBank (NCBI, USA) with the registration number “NC — 000003.12”. Examples of peripheral sequences containing the promoter CpG island of the human SPSB4 gene are shown below.
[SEQ ID NO: 5] (In the sequence, the underlined portion indicates a primer. Bold GGCG indicates a transcription start point.)
BMP3は、bone morphogenetic protein 3の遺伝子名であり、そのヒト塩基配列は「NC_000004.12」の登録番号でGenBank（米国NCBI）に登録されている。ヒトBMP3遺伝子のプロモーターCpGアイランドを含む周辺配列の例を以下に示す。
[配列番号６]（配列中、下線部はプライマーを示し、陰影部はSeqプライマーを示す。）
BMP3 is the gene name of bone morphogenetic protein 3, and its human base sequence is registered in GenBank (NCBI, USA) with the registration number “NC_000004.12”. Examples of peripheral sequences including the promoter CpG island of the human BMP3 gene are shown below.
[SEQ ID NO: 6] (In the sequence, the underlined portion indicates the primer, and the shaded portion indicates the Seq primer.)
C13orf18は、KIAA0226-likeの遺伝子名であり、そのヒト塩基配列は「NC_000013.11」の登録番号でGenBank（米国NCBI）に登録されている。ヒトC13orf18遺伝子のプロモーターCpGアイランドを含む周辺配列の例を以下に示す。
[配列番号７]（配列中、下線部はプライマーを示す。）
C13orf18 is a gene name of KIAA0226-like, and its human base sequence is registered in GenBank (NCBI, USA) with a registration number of “NC_000013.11”. Examples of peripheral sequences including the promoter CpG island of the human C13orf18 gene are shown below.
[SEQ ID NO: 7] (In the sequence, the underlined portion indicates a primer.)
CCND2は、cyclin D2の遺伝子名であり、そのヒト塩基配列は「NG_034254.1」の登録番号でGenBank（米国NCBI）に登録されている。ヒトCCND2遺伝子のプロモーターCpGアイランドを含む周辺配列の例を以下に示す。
[配列番号８]（配列中、下線部はプライマーを示し、陰影部はProbeを示す。）
CCND2 is the gene name of cyclin D2, and its human base sequence is registered with GenBank (US NCBI) with the registration number of “NG_034254.1”. Examples of peripheral sequences including the promoter CpG island of human CCND2 gene are shown below.
[SEQ ID NO: 8] (In the sequence, the underlined portion indicates a primer, and the shaded portion indicates Probe.)
DNAメチル化の測定は、例えば以下のように行うことができる。
上記の生物学的検体を、体液の場合、例えばフィルター濾過、遠心分離などの分離手段にかけて固形分を除いたのち、或いは、糞便の場合、精製水を加えて、同様に分離手段にかけて固形分を除いたのち、或いは、組織の場合、精製水を加えてホモゲナイズし、同様に分離手段にかけて固形分を除いたのち、上清をフェノール/クロロホルム法などの公知の手法によるか又は市販キットを用いてゲノムDNAを抽出する。
The DNA methylation can be measured as follows, for example.
In the case of a biological fluid, the above biological specimen is subjected to separation means such as filtration and centrifugation, for example, to remove the solid content, or in the case of feces, purified water is added and the solid content is similarly applied to the separation means. After removal, or in the case of tissue, homogenize by adding purified water, and after removing the solid content in the same way by separation means, the supernatant is obtained by a known method such as the phenol / chloroform method or using a commercially available kit. Extract genomic DNA.
DNAメチル化を解析する方法には、バイサルファイトシークエンス法、メチル化特異的PCR(MSP; Methylation Specific PCR)法、定量的MSP法、COBRA(Combined Bisulfite Restriction Analysis)法、パイロシークエンス法などの方法があり、それぞれ解析範囲、感度、精度、必要な機器が大きく異なる。これらは全てバイサルファイト(bisulfite)処理によってメチル化していないシトシンのみをウラシルに変換するという原理を利用している（牛島俊和ら編、エピジェネティクス実験プロトコール、羊土社（2008年））。 Methods for analyzing DNA methylation include bisulfite sequencing, methylation specific PCR (MSP), quantitative MSP, COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis), and pyrosequencing. Yes, the analysis range, sensitivity, accuracy, and required equipment differ greatly. These all use the principle that only cytosine that is not methylated by bisulfite treatment is converted to uracil (edited by Toshikazu Ushijima et al., Epigenetics Experimental Protocol, Yodosha (2008)).
以下にDNAメチル化測定法の例を示す。
(a) パイロシークエンス法
ポリメラーゼ塩基伸長反応によるルシフェラーゼ発光反応を検出することで塩基配列を解読する方法であり、伸長反応の際に生成されるピロリン酸と発光強度が完全に比例関係にあるため高精度な定量解析を行うことができる。この原理により、バイサルファイト処理を行ったDNAのCpGサイトのT%/C%を解読してDNAメチル化比率を決定する(Alliance Biosystems)。
Examples of DNA methylation measurement methods are shown below.
(a) Pyrosequencing method This is a method of deciphering the base sequence by detecting the luciferase luminescence reaction due to the polymerase base extension reaction, and the pyrophosphoric acid produced during the extension reaction is completely proportional to the luminescence intensity. Accurate quantitative analysis can be performed. Based on this principle, the DNA methylation ratio is determined by decoding T% / C% of CpG sites of DNA subjected to bisulfite treatment (Alliance Biosystems).
(b) バイサルファイトシークエンス法
DNAをバイサルファイト処理することによってDNA中のメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）はウラシルに変換される。一方、メチル化シトシンはバイサルファイト処理で変換されない。それゆえ、このような処理によってメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別できるので、PCR増幅したのち、塩基配列を決定するとか、制限酵素処理などの手法によってDNAメチル化を解析することができる（特表2002-535998号公報）。
PCR増幅は、PCRバッファー中、dNTP mixture、プライマー、DNA、耐熱性DNAポリメラーゼの存在下で行う。耐熱性DNAポリメラーゼは、TaKaRa Taq HS（タカラバイオ）などの市販の酵素を使用できる。PCR条件として、例えば95〜98℃、5〜60秒の変性反応、50〜55℃、30〜60秒のアニーリング反応、及び72℃、20秒〜60秒の伸長反応を1サイクルとし、これを30〜40サイクル行うことができる。
(b) Bisulfite sequence method
By bisulfite treatment of DNA, unmethylated cytosine (unmethylated cytosine) in DNA is converted to uracil. On the other hand, methylated cytosine is not converted by bisulfite treatment. Therefore, since methylated cytosine and unmethylated cytosine can be distinguished by such treatment, DNA methylation can be analyzed by techniques such as determining the nucleotide sequence after PCR amplification or restriction enzyme treatment ( Special table 2002-535998 gazette).
PCR amplification is performed in a PCR buffer in the presence of a dNTP mixture, primers, DNA, and heat-resistant DNA polymerase. A commercially available enzyme such as TaKaRa Taq HS (Takara Bio) can be used as the thermostable DNA polymerase. PCR conditions include, for example, a denaturation reaction of 95 to 98 ° C. for 5 to 60 seconds, an annealing reaction of 50 to 55 ° C. and 30 to 60 seconds, and an extension reaction of 72 ° C. and 20 seconds to 60 seconds as one cycle. 30-40 cycles can be performed.
(c) メチル化特異的PCR(MSP)法
DNAをバイサルファイト変換し、このDNAを鋳型にして、メチル化DNAを特異的に増幅するプライマーと、非メチル化DNAを特異的に増幅するプライマーを用いて別々にPCRを行い、PCR産物の有無によりDNAメチル化の有無を判定する（特表2002-535998号公報）。
(c) Methylation specific PCR (MSP) method
Perform bisulfite conversion of DNA, perform PCR separately using primers that specifically amplify methylated DNA and primers that specifically amplify unmethylated DNA using this DNA as a template. Is used to determine the presence or absence of DNA methylation (JP-T 2002-535998).
(d) 定量的MSP法
MSP法は、methylation specific PCR技術であり、Na bisulfiteで処理したDNAを、目的遺伝子内部のメチル化領域及び非メチル化領域に特異的な予想配列のプライマーを用いてPCR増幅することを基本としている（上記(c)）。
複数の蛍光団(fluorophore)を使用することによってリアルタイム定量MSPを行うことが可能であり、この場合メチル化領域特異的プライマーと非メチル化領域特異的プライマーを使用する(T. Swift-Scanlan et al., BioTechniques 2006, 40: 210-219)。
(d) Quantitative MSP method
The MSP method is a methylation specific PCR technology, and is based on PCR amplification of Na bisulfite-treated DNA using primers with predicted sequences specific to the methylated and unmethylated regions inside the target gene. (Above (c)).
Real-time quantitative MSP can be performed by using multiple fluorophores, using methylated region-specific primers and unmethylated region-specific primers (T. Swift-Scanlan et al ., BioTechniques 2006, 40: 210-219).
(e) COBRA法
バイサルファイト処理後にメチル化DNAと非メチル化DNAに共通のプライマーを用いて目的のDNAをPCR増幅後、メチル化DNAと非メチル化DNAで配列が異なる箇所を認識する制限酵素で処理し、断片をエタノール沈殿して濃縮し、電気泳動でメチル化DNAと非メチル化DNAを識別できる。PCR増幅は、バイサルファイトシークエンス法と同様に行うことができる（Z. Xiong and P.W. Laird, Nucleic Acids Res. 25(1): 2532-2534, 1997）。
(e) COBRA method After bisulfite treatment, PCR amplification of the target DNA using primers common to methylated DNA and unmethylated DNA, followed by a restriction enzyme that recognizes a difference in sequence between methylated DNA and unmethylated DNA The fragments can be ethanol precipitated and concentrated, and electrophoresis can discriminate between methylated and unmethylated DNA. PCR amplification can be performed in the same manner as the bisulfite sequencing method (Z. Xiong and PW Laird, Nucleic Acids Res. 25 (1): 2532-2534, 1997).
本発明の方法で使用可能な上記遺伝子のDNAメチル化を測定するためのプライマーセットの例は、以下のとおりである。ここで、Fはフォワードプライマー、Rはリバースプライマーであり、これらのそれぞれの遺伝子のプライマーセットのうち1つもしくは２つ以上のセット〜全セットを用いてPCR増幅を行うことができる。Seqはパイロシークエンスに用いるシークエンスプライマーを示し、また、probeは定量的メチル化特異的PCR法に用いるプローブを示す。 Examples of primer sets for measuring DNA methylation of the above gene that can be used in the method of the present invention are as follows. Here, F is a forward primer, and R is a reverse primer, and PCR amplification can be performed using one or more to all sets of primer sets of these respective genes. Seq indicates a sequence primer used for pyrosequencing, and probe indicates a probe used for quantitative methylation-specific PCR.
HOXA1のプライマーセットを以下に例示する。
HOXA1-PY-F: TTTTATGGAGGAAGTGAGAAAGT（配列番号９）
HOXA1-PY-RU: GGGACACCGCTGATCGTTTATCCAAAAAAAAATTCATTCTTACA（配列番号10）
HOXA1-PY-Seq: AAGTGAGAAAGTTGGTATAG（配列番号11）
SPSB4のプライマーセットを以下に例示する。
SPSB4-MSP-MF: GGCGTTTGAGCGTTAATTTC（配列番号12）
SPSB4-MSP-MR: CGCAAATACCGACTCTCTCC（配列番号13）
ADMTS2のプライマーセットを以下に例示する。
ADMTS2-MSP-MF: TTTCGGGGTGTTTTTGTTTC（配列番号14）
ADMTS2-MSP-MR: TAACCCGACGCATCTTAACG（配列番号15）
ADMTS2-MSP-probe: CGAGTTCGGTATCGCGGCGAC（配列番号16）
C13orf18のプライマーセットを以下に例示する。
C13orf18-MSP-MF: GGTATTTGGGGTTGGGAAGT（配列番号17）
C13orf18-MSP-MR: TCCTAAAAATCCCGCCCTAC（配列番号18）
C13orf18-MSP-Probe: TTTGAAAGCGTCGTTGCGTTTCGC（配列番号19）
CCND2のプライマーセットを以下に例示する。
CCND2-MSP-MF: TATTTCGGGCGGTTTGTTAG（配列番号20）
CCND2-MSP-MR: CTCTTCGAACGCCGTAAAAC（配列番号21）
CCND2-MSP-Probe: CGGTTTTAGACGTTGTATCGCGTCG（配列番号22）
PCDH10のプライマーセットを以下に例示する。
PCDH10-MSP-MF: TTGGGGATTGGGAATTTTTC（配列番号23）
PCDH10-MSP-MR: ACAACCGAACGAAACGAAAC（配列番号24）
SEMA5Aのプライマーセットを以下に例示する。
SEMA5A-MSP-MF: GGTTTCGTAGTTTTAGGTTAGTCGC（配列番号25）
SEMA5A-MSP-MR: GAAATAAACGACACTAACCGAACCG（配列番号26）
BMP3のプライマーセットを以下に例示する。
BMP3-PY-F: AGTTGTTTTAATTTTTGGAAAAGG（配列番号27）
BMP3-PY-RU: GGGACACCGCTGATCGTTTAAAATCTATCTATACCTTCCCTCCTC（配列番号28）
BMP3-PY-Seq: TAATTTTTGGAAAAGGTAA（配列番号29）
The HOXA1 primer set is exemplified below.
HOXA1-PY-F: TTTTATGGAGGAAGTGAGAAAGT (SEQ ID NO: 9)
HOXA1-PY-RU: GGGACACCGCTGATCGTTTATCCAAAAAAAAATTCATTCTTACA (SEQ ID NO: 10)
HOXA1-PY-Seq: AAGTGAGAAAGTTGGTATAG (SEQ ID NO: 11)
The SPSB4 primer set is exemplified below.
SPSB4-MSP-MF: GGCGTTTGAGCGTTAATTTC (SEQ ID NO: 12)
SPSB4-MSP-MR: CGCAAATACCGACTCTCTCC (SEQ ID NO: 13)
The primer set of ADMTS2 is illustrated below.
ADMTS2-MSP-MF: TTTCGGGGTGTTTTTGTTTC (SEQ ID NO: 14)
ADMTS2-MSP-MR: TAACCCGACGCATCTTAACG (SEQ ID NO: 15)
ADMTS2-MSP-probe: CGAGTTCGGTATCGCGGCGAC (SEQ ID NO: 16)
The primer set of C13orf18 is exemplified below.
C13orf18-MSP-MF: GGTATTTGGGGTTGGGAAGT (SEQ ID NO: 17)
C13orf18-MSP-MR: TCCTAAAAATCCCGCCCTAC (SEQ ID NO: 18)
C13orf18-MSP-Probe: TTTGAAAGCGTCGTTGCGTTTCGC (SEQ ID NO: 19)
The CCND2 primer set is exemplified below.
CCND2-MSP-MF: TATTTCGGGCGGTTTGTTAG (SEQ ID NO: 20)
CCND2-MSP-MR: CTCTTCGAACGCCGTAAAAC (SEQ ID NO: 21)
CCND2-MSP-Probe: CGGTTTTAGACGTTGTATCGCGTCG (SEQ ID NO: 22)
The primer set of PCDH10 is illustrated below.
PCDH10-MSP-MF: TTGGGGATTGGGAATTTTTC (SEQ ID NO: 23)
PCDH10-MSP-MR: ACAACCGAACGAAACGAAAC (SEQ ID NO: 24)
The SEMA5A primer set is exemplified below.
SEMA5A-MSP-MF: GGTTTCGTAGTTTTAGGTTAGTCGC (SEQ ID NO: 25)
SEMA5A-MSP-MR: GAAATAAACGACACTAACCGAACCG (SEQ ID NO: 26)
The primer set for BMP3 is exemplified below.
BMP3-PY-F: AGTTGTTTTAATTTTTGGAAAAGG (SEQ ID NO: 27)
BMP3-PY-RU: GGGACACCGCTGATCGTTTAAAATCTATCTATACCTTCCCTCCTC (SEQ ID NO: 28)
BMP3-PY-Seq: TAATTTTTGGAAAAGGTAA (SEQ ID NO: 29)
上記のプライマーセットの他に、配列番号１〜配列番号８の塩基配列においてCpG、すなわち5'-CG-3'配列、を複数個含む領域を増幅するためのプライマーセットを適宜選択することができる。プライマーの各塩基配列のヌクレオチド数は、通常、17〜30ヌクレオチド、好ましくは20〜25ヌクレオチドである。さらなるプライマーセットの例は、以下のとおりである。 In addition to the above primer set, a primer set for amplifying a region containing a plurality of CpGs, that is, 5′-CG-3 ′ sequences in the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8, can be appropriately selected. . The number of nucleotides of each base sequence of the primer is usually 17 to 30 nucleotides, preferably 20 to 25 nucleotides. Examples of additional primer sets are as follows:
HOXA1遺伝子について、TTTTATGGAGGAAGTGAGAAAGT（配列番号９；HOXA1-PY-Fと同じ）及びTCCAAAAAAAAATTCATTCTTACA（配列番号30）である。
ADAMTS2遺伝子について、TGTTTTAGAGTATAGAGATAGGGGGAT（配列番号31）及びAACCACCCCAAAAACACAAC（配列番号32）である。
PCDH10遺伝子について、TTTTAAAGGAAAAAGAATGTTAGTATTATT（配列番号33）及びAAAAATTCCCAATCCCCAAC（配列番号34）である。
SEMA5A遺伝子について、GGGGTGGGTTTAGGTTGTTT（配列番号35）及びCTAACCRAACCRCCCCTAC（配列番号36）である。
SPSB4遺伝子について、TGGTTTTTAGGGATGAGTTTAGTTAGA（配列番号37）及びCCCTCCCCTAAAACTAAATACTTTTATAC（配列番号38）である。
BMP3遺伝子について、GGAGAGATTGGTTGAGGATTTTATAG（配列番号39）及びCCTTTTCCAAAAATTAAAACAACTAC（配列番号40）である。
C13orf18遺伝子について、GTGAAGTAGTTAGTAGAGGTTAGAGAGAGA（配列番号41）及びATACCCCCAACAACAATATTTAACA（配列番号42）である。
CCND2遺伝子について、TTTTTTGTATATATTTTGTAGGGGG（配列番号43）及びCATACCCAAAAATAAAAATCATATCC（配列番号44）である。
Regarding the HOXA1 gene, they are TTTTATGGAGGAAGTGAGAAAGT (SEQ ID NO: 9; the same as HOXA1-PY-F) and TCCAAAAAAAAATTCATTCTTACA (SEQ ID NO: 30).
Regarding ADAMTS2 gene, they are TGTTTTAGAGTATAGAGATAGGGGGAT (SEQ ID NO: 31) and AACCACCCCAAAAACACAAC (SEQ ID NO: 32).
For the PCDH10 gene, they are TTTTAAAGGAAAAAGAATGTTAGTATTATT (SEQ ID NO: 33) and AAAAATTCCCAATCCCCAAC (SEQ ID NO: 34).
For the SEMA5A gene, they are GGGGTGGGTTTAGGTTGTTT (SEQ ID NO: 35) and CTAACCRAACCRCCCCTAC (SEQ ID NO: 36).
For the SPSB4 gene, they are TGGTTTTTAGGGATGAGTTTAGTTAGA (SEQ ID NO: 37) and CCCTCCCCTAAAACTAAATACTTTTATAC (SEQ ID NO: 38).
For the BMP3 gene, they are GGAGAGATTGGTTGAGGATTTTATAG (SEQ ID NO: 39) and CCTTTTCCAAAAATTAAAACAACTAC (SEQ ID NO: 40).
Regarding the C13orf18 gene, they are GTGAAGTAGTTAGTAGAGGTTAGAGAGAGA (SEQ ID NO: 41) and ATACCCCCAACAACAATATTTAACA (SEQ ID NO: 42).
Regarding the CCND2 gene, they are TTTTTTGTATATATTTTGTAGGGGG (SEQ ID NO: 43) and CATACCCAAAAATAAAAATCATATCC (SEQ ID NO: 44).
さらにまた、検体が、血液、唾液、尿などの体液、或いは糞便であるときには、遊離DNAを回収し、DNAメチル化状態を解析する。体液中の癌由来のDNAは微量であるため、高感度DNAメチル化検出法、例えば次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法、デジタルPCRを用いたMSP法などを使用することによって、DNAメチル化の検出が可能である。 Furthermore, when the specimen is a body fluid such as blood, saliva, urine, or feces, free DNA is collected and the DNA methylation state is analyzed. Since the amount of cancer-derived DNA in body fluids is very small, DNA methylation can be achieved by using highly sensitive DNA methylation detection methods such as the bisulfite sequencing method using next-generation sequencers and the MSP method using digital PCR. Can be detected.
次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法及びデジタルPCRを用いたMSP法の手法について以下に説明する。 The bisulfite sequencing method using the next-generation sequencer and the MSP method using digital PCR are described below.
(f) 次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法
DNAをバイサルファイト変換し、このDNAを鋳型にして、標的遺伝子領域のPCR増幅を行う。得られたサンプルを精製後、ライブラリー作成とサンプルIDがわかるようにIDを付加したのち、次世代シークエンサーでシークエンスを行う。得られたデータをバイサルファイト変換後のリファレンスシークエンスにマッピングし、メチル化Cと非メチル化Cを算出しDNAメチル化率を計算する。
(f) Bisulfite sequencing method using next-generation sequencer
Bisulfite conversion of DNA is performed, and PCR amplification of the target gene region is performed using this DNA as a template. After purifying the obtained sample, add the ID so that the library creation and sample ID can be identified, and then sequence with the next-generation sequencer. The obtained data is mapped to the reference sequence after bisulfite conversion, methylated C and unmethylated C are calculated, and the DNA methylation rate is calculated.
(g) デジタルPCRを用いたMSP法
DNAをバイサルファイト変換し、このDNAを鋳型にして、メチル化DNAを特異的に増幅するプライマー、プローブセットと、非メチル化DNAを特異的に増幅するプライマー、プローブセットを用いてPCRを行う。それぞれのPCR反応で得られる蛍光をデジタルPCR法で検出することでメチル化DNAと非メチル化DNAのコピー数を算出する。デジタルPCRは通常のリアルタイムPCRよりも検出感度が高く、0.01％の感度を持つと報告されている。
(g) MSP method using digital PCR
Bisulfite conversion of DNA is performed, and PCR is performed using this DNA as a template and a primer and probe set for specifically amplifying methylated DNA and a primer and probe set for specifically amplifying unmethylated DNA. The number of copies of methylated DNA and unmethylated DNA is calculated by detecting the fluorescence obtained in each PCR reaction by digital PCR. Digital PCR has been reported to have higher detection sensitivity than normal real-time PCR, with a sensitivity of 0.01%.
２．膵臓癌検査用キット
本発明はさらに第２の態様において、膵臓癌の発症又は罹患を検査するためのキットを提供する。
2. In the second aspect, the present invention further provides a kit for examining the onset or morbidity of pancreatic cancer.
具体的には、本発明は、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4及びC13orf18遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を検出するための試薬を含む膵臓癌検査用キットを提供する。 Specifically, the present invention relates to the presence or absence of DNA methylation of promoter CpG islands of at least one, preferably at least two genes selected from the group consisting of HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4 and C13orf18 genes. A kit for testing pancreatic cancer comprising a reagent for detection is provided.
本発明のキットにはさらに、CCND2遺伝子及び／又はBMP3遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を検出するための試薬を含むことができる。 The kit of the present invention may further contain a reagent for detecting the presence or absence of DNA methylation of the promoter CpG island of CCND2 gene and / or BMP3 gene.
上記のHOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4、BMP3、C13orf18及びCCND2遺伝子、該遺伝子のプロモーターCpGアイランド、並びにCpGアイランドのメチル化については、上で説明したとおりである。 The above HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4, BMP3, C13orf18 and CCND2 genes, the promoter CpG island of the gene, and methylation of the CpG island are as described above.
本発明のキットは、上記遺伝子のそれぞれのDNAメチル化を測定するための上記の方法に使用するための少なくとも1つの、好ましくは複数のプライマーセット、及び、場合により、非メチル化特異的プライマーセットを含み、これに加えてバイサルファイト試薬、PCR反応試薬ならびに使用説明書などを含むことができる。 The kit of the present invention comprises at least one, preferably a plurality of primer sets, and optionally an unmethylated specific primer set for use in the above method for measuring the DNA methylation of each of said genes In addition to this, a bisulfite reagent, a PCR reaction reagent, and instructions for use can be included.
上記遺伝子のそれぞれのパイロシークエンス法、MSP法、定量MSP法、パイロシークエンス法、COBRA法、高感度DNAメチル化検出法などの方法に使用可能なプライマーは、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4、BMP3、C13orf18及びCCND2遺伝子の配列番号１〜配列番号８の塩基配列によって示されたプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化領域を特異的に増幅するためのプライマーである。具体的には、各遺伝子のDNAメチル化領域を特異的に増幅するためのプライマーセット（フォワードプライマーとリバースプライマー）の例は、非限定的に、上記の配列番号９から配列番号29の配列のプライマーのうち、HOXA1遺伝子について配列番号９と配列番号10のプライマーセット、SPSB4遺伝子について配列番号12と配列番号13のプライマーセット、ADMTS2遺伝子について配列番号14と配列番号15のプライマーセット、C13orf18遺伝子について配列番号17と配列番号18のプライマーセット、CCND2遺伝子について配列番号20と配列番号21のプライマーセット、PCDH10遺伝子について配列番号23と配列番号24のプライマーセット、SEMA5A遺伝子について配列番号25と配列番号26のプライマーセット、並びに、BMP3遺伝子について配列番号27と配列番号28のプライマーセットである。 Primers that can be used in methods such as the pyrosequencing method, MSP method, quantitative MSP method, pyrosequencing method, COBRA method, and high-sensitivity DNA methylation detection method for the above genes are HOXA1, ADAMTS2, PCDH10, SEMA5A, SPSB4, It is a primer for specifically amplifying the DNA methylation region of the promoter CpG island represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 of BMP3, C13orf18 and CCND2 genes. Specifically, examples of primer sets (forward primer and reverse primer) for specifically amplifying the DNA methylation region of each gene include, but are not limited to, the sequences of SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 29 described above. Among the primers, the primer set of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for the HOXA1 gene, the primer set of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 for the SPSB4 gene, the primer set of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 for the ADMTS2 gene, and the sequence of the C13orf18 gene SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 primer set, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 primer set for the CCND2 gene, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 primer set for the PCDH10 gene, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 primer for the SEMA5A gene Sets and primer sets of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 for the BMP3 gene It is a door.
或いは、別のプライマーセットとして、HOXA1遺伝子について配列番号９と配列番号30のプライマーセット、SPSB4遺伝子について配列番号37と配列番号38のプライマーセット、ADMTS2遺伝子について配列番号31と配列番号32のプライマーセット、C13orf18遺伝子について配列番号41と配列番号42のプライマーセット、CCND2遺伝子について配列番号43と配列番号44のプライマーセット、PCDH10遺伝子について配列番号33と配列番号34のプライマーセット、SEMA5A遺伝子について配列番号35と配列番号36のプライマーセットなどである。 Alternatively, as another primer set, the primer set of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 30 for the HOXA1 gene, the primer set of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 for the SPSB4 gene, the primer set of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 for the ADMTS2 gene, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 for the C13orf18 gene, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 for the CCND2 gene, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 for the PCDH10 gene, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 35 for the SEMA5A gene No. 36 primer set.
これらのプライマーセットの他に、配列番号１〜配列番号８の塩基配列においてCpG、すなわち5'-CG-3'配列、を複数個含む領域を増幅するためのプライマーセットを適宜選択することができる。プライマーの各塩基配列のヌクレオチド数は、通常、17〜30ヌクレオチド、好ましくは20〜25ヌクレオチドである。 In addition to these primer sets, a primer set for amplifying a region containing a plurality of CpGs, that is, 5′-CG-3 ′ sequences in the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 can be appropriately selected. . The number of nucleotides of each base sequence of the primer is usually 17 to 30 nucleotides, preferably 20 to 25 nucleotides.
本発明のキットには、各遺伝子あたり、少なくとも1つのセット、好ましくは少なくとも２つのセットが含まれる。 The kit of the present invention contains at least one set, preferably at least two sets, for each gene.
バイサルファイト試薬は非メチル化シトシンをウラシルに変換するための試薬であり、この試薬には、重亜硫酸ナトリウム（Na bisulfite）、スカベンジャー（ハイドロキノン等）などを含むことができる。 A bisulfite reagent is a reagent for converting unmethylated cytosine into uracil, and this reagent can contain sodium bisulfite, scavenger (hydroquinone, etc.), and the like.
PCR反応試薬には、dNTP mixture、PCRバッファー、耐熱性ポリメラーゼなどを含むことができる。 PCR reaction reagents can include dNTP mixtures, PCR buffers, thermostable polymerases, and the like.
上記プライマー及び上記試薬の他に、DNA抽出及び制限消化のための、フェノール/クロロホルム溶液又はフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液、制限酵素などを含むことができる。
使用説明書には、DNAメチル化検査のためのプロトコールなどが記載されうる。
In addition to the primer and the reagent, a phenol / chloroform solution or a phenol / chloroform / isoamyl alcohol solution, a restriction enzyme and the like for DNA extraction and restriction digestion can be included.
The instructions for use may include a protocol for DNA methylation testing.
以下に実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。 EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
＜膵臓癌検査用遺伝子マーカーの選択とDNAメチル化＞
愛知県がんセンター中央病院消化器内科（名古屋、愛知）において、内視鏡下生検(EUS-FNA)で得られたサンプルでKRAS変異を有するステージIII及びステージVIの症例38例を用いてIllumina Infinium HumanMethylation 450（イルミナ）による網羅的DNAメチル化解析を行った。膵臓癌では90％以上の症例でKRAS変異を有することが報告されているため、KRAS変異陽性（Mt）のサンプルを用いた。
<Selection of genetic markers for pancreatic cancer testing and DNA methylation>
Samples obtained by endoscopic biopsy (EUS-FNA) at Aichi Cancer Center Central Hospital (Nagoya, Aichi) using 38 cases of stage III and stage VI with KRAS mutation Comprehensive DNA methylation analysis was performed using Illumina Infinium HumanMethylation 450 (Illumina). Since pancreatic cancer has been reported to have a KRAS mutation in more than 90% of cases, a KRAS mutation positive (Mt) sample was used.
これらの結果と、The Cancer Genome Atlas（TCGA）（NIH、米国）に登録されている各種癌のDNAメチル化プロファイルとを比較解析を行い、膵臓癌症例の12例（約30％）以上でメチル化されており、他の癌種ではメチル化頻度が低い遺伝子を13遺伝子選択した（表１）。 These results were compared with DNA methylation profiles of various cancers registered in The Cancer Genome Atlas (TCGA) (NIH, USA), and methylation was performed in more than 12 cases (about 30%) of pancreatic cancer cases. In other cancer types, 13 genes with low methylation frequency were selected (Table 1).
［表１］
膵臓癌のメチル化データとTCGAの各種癌のメチル化データとの比較
（メチル化陽性症例数の％）
Comparison of pancreatic cancer methylation data and TCGA cancer methylation data (% of methylation positive cases)
これらの遺伝子のメチル化状態をメチル化特異的PCR法（MSP法）、パイロシークエンス法または定量的MSP法で解析した。メチル化検出用プライマーは、各遺伝子について上記の配列番号９〜29の配列を使用した。 The methylation status of these genes was analyzed by methylation-specific PCR (MSP), pyrosequencing, or quantitative MSP. As the methylation detection primer, the sequences of SEQ ID NOs: 9 to 29 were used for each gene.
学習セット(n=22)の検体を用いるとき、22遺伝子のうち8遺伝子（ADAMTS2、HOXA1、PCDH10、SEMA5A、SPSB4、BMP3、C13orf18、CCND2）を選択し、そのうち２遺伝子以上メチル化がある場合を陽性とすると、感度90.9％、特異度100％であった（表２）。 When using samples from the learning set (n = 22), select 8 genes out of 22 (ADAMTS2, HOXA1, PCDH10, SEMA5A, SPSB4, BMP3, C13orf18, CCND2) When positive, the sensitivity was 90.9% and the specificity was 100% (Table 2).
［表２］
学習セット(n=22)の８遺伝子のDNAメチル化状態
（M：メチル化陽性、UM：メチル化陰性）
DNA methylation status of 8 genes in the learning set (n = 22) (M: methylation positive, UM: methylation negative)
検証セット(n=19)において、８遺伝子中２遺伝子以上メチル化がある場合を陽性とすると、感度94.7％、特異度100％であった。また、これら8遺伝子のうちADAMTS2、HOXA1、PCDH10、SEMA5A、SPSB4の5遺伝子に絞った場合、検証セット(n=19)において、２遺伝子以上メチル化がある場合を陽性とすると、感度89.5％、特異度100％、AUC 0.947であった。合計8遺伝子を評価することで感度の増加が認められた。 In the verification set (n = 19), when 2 or more of 8 genes were methylated, the sensitivity was 94.7% and the specificity was 100%. In addition, when focusing on 5 genes ADAMTS2, HOXA1, PCDH10, SEMA5A, and SPSB4 among these 8 genes, the sensitivity set to 99.5% or more in the validation set (n = 19), the sensitivity is 89.5%, Specificity was 100% and AUC 0.947. An increase in sensitivity was observed by evaluating a total of 8 genes.
［表３］
検証セット(n=19)の８遺伝子のDNAメチル化状態
（M：メチル化陽性、UM：メチル化陰性）
DNA methylation status of 8 genes in the validation set (n = 19) (M: methylation positive, UM: methylation negative)
さらに、TCGA(The Cancer Genome Atlas)の膵臓癌のDNAメチル化データからの膵臓癌のステージI及びステージIIの症例について、上記８遺伝子中２遺伝子以上でメチル化がある場合を陽性とすると、感度66.7％、特異度98％、AUC0.97となり、本発明の方法はまた、膵臓癌の早期診断にも用いることができると考えられる。 Furthermore, regarding cases of pancreatic cancer stage I and stage II from TCGA (The Cancer Genome Atlas) pancreatic cancer DNA methylation data, the sensitivity was determined to be positive when 2 or more of the 8 genes had methylation. 66.7%, specificity 98%, AUC 0.97, it is considered that the method of the present invention can also be used for early diagnosis of pancreatic cancer.
さらにまた、膵臓癌患者由来の血液から遊離DNAを回収し、DNAメチル化状態を解析するための予備実験において、血液中の膵臓癌由来のDNAは微量であるが、高感度DNAメチル化検出法として、デジタルPCRを用いたMSP法、次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法によってDNAメチル化の検出が可能であることを確認した。 Furthermore, in preliminary experiments to collect free DNA from blood from pancreatic cancer patients and analyze DNA methylation status, the amount of pancreatic cancer-derived DNA in the blood is very small, but a highly sensitive DNA methylation detection method. As a result, it was confirmed that DNA methylation can be detected by the MSP method using digital PCR and the bisulfite sequence method using a next-generation sequencer.
＜膵臓癌組織及び血液検体でのDNAメチル化検出＞
膵臓癌患者からの膵臓癌組織(FNA)と血液（血清）を検体としてDNAを回収し、パイロシークエンス法を用いてHOXA1遺伝子のCpGアイランドのDNAメチル化を測定した。標的配列は、配列番号１の塩基配列中のtcaCGcCGggcttCGcaggaccaggtcac（配列番号45）の配列である。大文字の「C」を含む部分についてメチル化を評価する。
<Detection of DNA methylation in pancreatic cancer tissues and blood samples>
DNA was collected using pancreatic cancer tissue (FNA) and blood (serum) from pancreatic cancer patients as samples, and DNA methylation of the CpG island of the HOXA1 gene was measured using the pyrosequencing method. The target sequence is the sequence of tcaCGcCGggcttCGcaggaccaggtcac (SEQ ID NO: 45) in the base sequence of SEQ ID NO: 1. Assess methylation for the part containing the uppercase “C”.
配列決定するとメチル化Cの場合はC、非メチル化Cの場合はTと判定されるので、それぞれのシグナル強度を計算しC/C+Tからメチル化レベルを計算した。
測定手順は次のとおりであった。
When the sequence was determined, C was determined for methylated C, and T for unmethylated C. Therefore, each signal intensity was calculated, and the methylation level was calculated from C / C + T.
The measurement procedure was as follows.
腫瘍組織からはキアゲンDNeasy Blood & Tissue kitでDNAを回収し、一方、血清DNAは血清からキアゲンCirculating Nucleic Acid kitにてDNAを回収した。DNAをキアゲンEpiTect Plus bisulfite kitを用いてバイサルファイト変換後、HOXA1遺伝子のプロモーター部位でPCRを行い、PCR産物をパイロシークエンスにて解析した。 DNA was collected from tumor tissue with Qiagen DNeasy Blood & Tissue kit, while serum DNA was collected from serum with Qiagen Circulating Nucleic Acid kit. After bisulfite conversion of DNA using Qiagen EpiTect Plus bisulfite kit, PCR was performed at the promoter site of HOXA1 gene, and the PCR product was analyzed by pyrosequencing.
結果を、図１のA（腫瘍組織検体）とB（血清DNA検体）に示した。バイサルファイト処理後のHOXA1標的部分の配列は、TTA(5mc)GT(5mc)GGGTTT(5mc)GTAGGATTAGGTTAT（配列番号46；ここで、5mcは5-メチル化シトシンを表す。）となり、5mc部位に相当するCが5-メチル化されていた。(ES)A,C,T,G,A,T,C,T,G,T,C,A,G,T,T,C,G,T,A（ここで、ESは試薬を表し、Eはenzyme（酵素）を表し、Sはsubstrate（基質）を表す。）という順番で塩基を入れるとT2個分のピーク、A1個分のピーク、CかTのピーク、G1個分のピーク、T1個分、CかTのピーク、G3個分、T3個分、CかTのピーク、G1個分、T1個分、A1個分のピークというようになり、図のA及びBにおいて、例えば、初めから数えて3塩基目Tのところでピークが出ているのは、T塩基を入れたときにTが結合したことを示し、その次のGでピークが出ていないのは、実際にはTの次はAであり、この部分にGがないはずであるので、ピークが出ないことを示している。図に示すようにCかTのピークのところで、C/C+Tを計算してメチル化率を求めたところ、図に示すように、配列番号45の塩基配列中の大文字C部位のメチル化率は、5'側から図のA及びBに示すとおりであった。 The results are shown in A (tumor tissue specimen) and B (serum DNA specimen) in FIG. The sequence of the HOXA1 target portion after bisulfite treatment is TTA (5mc) GT (5mc) GGGTTT (5mc) GTAGGATTAGGTTAT (SEQ ID NO: 46; where 5mc represents 5-methylated cytosine) and corresponds to the 5mc site. C was 5-methylated. (ES) A, C, T, G, A, T, C, T, G, T, C, A, G, T, T, C, G, T, A (where ES represents a reagent, E represents enzyme (enzyme), S represents substrate (substrate), and when bases are added, T2 peak, A1 peak, C or T peak, G1 peak, T1 peak, C or T peak, G3 peak, T3 peak, C or T peak, G1 peak, T1 peak, A1 peak, etc. The peak at the third base T from the beginning indicates that T was bound when the T base was added, and the fact that the peak did not appear at the next G was actually Next to T is A, and there should be no G in this part, indicating that no peak appears. As shown in the figure, at the peak of C or T, C / C + T was calculated to obtain the methylation rate. As shown in the figure, methylation of the capital C site in the base sequence of SEQ ID NO: 45 The rate was as shown in FIGS. A and B from the 5 ′ side.
したがって、HOXA1遺伝子マーカーにおいては、腫瘍組織サンプルで高メチル化を示す症例では、血液由来のDNAにおいても、（メチル化陽性を10％以上とするとき）メチル化レベルは低いもののメチル化が検出された。 Therefore, in the case of HOXA1 gene marker, in cases showing high methylation in tumor tissue samples, methylation was detected even in blood-derived DNA, although the methylation level was low (when methylation positive was 10% or higher) It was.
膵臓癌の診断マーカーとしてCA19-9がよく使用されているが、その他の消化器腫瘍でも検出されることが多く、特異性が低い点が問題となっている。本発明者らは今回、EUS-FNAで得られたサンプルの解析から膵臓癌診断を可能とするDNAメチル化遺伝子セット（８遺伝子）を同定した。これらのマーカーの中には膵臓癌でより特異的にDNAメチル化される遺伝子を含んでいる点が特徴である。これら８遺伝子はEUS-FNAサンプルの検証セットでも高感度で膵臓癌の診断を行うことが可能であった。さらに公共のデータベースであるTCGAのメチル化データの解析から、本発明の方法はまた、早期の膵臓癌の診断にも使用できることを確認した。上記の遺伝子マーカーを用いて、低侵襲性の血液を検体とすることによって、膵臓癌の検出が可能である。 CA19-9 is often used as a diagnostic marker for pancreatic cancer, but it is often detected in other gastrointestinal tumors and has a problem of low specificity. The present inventors have now identified a DNA methylation gene set (8 genes) that enables pancreatic cancer diagnosis from analysis of samples obtained with EUS-FNA. These markers are characterized in that they contain genes that are more specifically DNA methylated in pancreatic cancer. These 8 genes were able to diagnose pancreatic cancer with high sensitivity even in the EUS-FNA sample validation set. Furthermore, analysis of TCGA methylation data, a public database, confirmed that the method of the present invention can also be used for early diagnosis of pancreatic cancer. By using minimally invasive blood as a specimen using the above gene marker, pancreatic cancer can be detected.
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