JP2017086040A6 - Efficiently degrading biodegradable plastics - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、生分解性プラスチックを効率的に分解する方法を提供することを目的としている。
【解決手段】生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを、生分解性プラスチックに添加することにより、生分解性プラスチックを効率的に分解する。
【選択図】図３An object of the present invention is to provide a method for efficiently degrading a biodegradable plastic.
A biodegradable plastic is efficiently decomposed by adding a biodegradable plastic degrading enzyme and esterase to the biodegradable plastic.
[Selection] Figure 3
Description
本発明は、生分解性プラスチックを効率良く分解する方法に関し、特に生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを組み合わせて生分解性プラスチックを分解することに関する。 The present invention relates to a method for efficiently degrading a biodegradable plastic, and more particularly to decomposing a biodegradable plastic by combining a biodegradable plastic degrading enzyme and an esterase.
地球環境保全の観点から、世界中で生分解性プラスチックの研究が進められており、それは様々な製品に実用化されてきている。プラスチックは農業現場において必要不可欠な資材の原料であるが、使用後の回収と廃棄に多大な労力とコストがかかるだけでなく、燃焼による二酸化炭素やダイオキシンの排出が懸念されるため、生分解性プラスチックの使用による作業コストの低減や温室効果ガス排出の削減が期待されている。
農業用資材の原料として生分解性プラスチックを普及させるための課題は、使用中は強度を保ち、使用後は速やかに分解して圃場に鋤き込み可能にすることであり、すなわち、使用後に生分解性プラスチックを速やかに分解処理できる技術の開発と考えられている。現在、生分解性プラスチック分解酵素の開発が進められており、例えば、酵母や糸状菌が生産する生分解性プラスチック分解酵素とその利用について研究が報告されている（特許文献１〜４）。
From the viewpoint of global environmental conservation, biodegradable plastics are being researched all over the world and have been put into practical use in various products. Plastic is an essential raw material in the agricultural field, but it is not only costly to collect and dispose of after use, but it is also biodegradable due to concerns over carbon dioxide and dioxin emissions from combustion. The use of plastic is expected to reduce work costs and greenhouse gas emissions.
The challenge for disseminating biodegradable plastics as raw materials for agricultural materials is to maintain strength during use and to quickly break down after use so that it can be poured into the field. It is considered to be the development of technology that can quickly decompose degradable plastics. Currently, development of biodegradable plastic degrading enzymes is underway. For example, research has been reported on biodegradable plastic degrading enzymes produced by yeasts and filamentous fungi and their use (
生分解性プラスチックを広く普及させるためには、その強度と生分解性とのバランスを制御する必要があるが、製品の強度を上げると生分解性が低下するため、実用性の高い分解処理技術を開発するために、より高い生分解性プラスチック分解活性を有する酵素の開発や、生分解性プラスチックの分解を促進するための補助剤などの開発が求められている。
また、圃場で生分解性プラスチック分解酵素を使用する際には、塩分濃度の高い緩衝液を使用することはできないため、生分解性プラスチック分解酵素の溶媒には水を使用することになる。しかしながら、緩衝液中の場合と比較して、生分解性プラスチック分解酵素の活性は水中で低下してしまうため、圃場でも生分解性プラスチックを効率的に分解する方法の開発が求められている。
In order to spread biodegradable plastics widely, it is necessary to control the balance between strength and biodegradability. However, increasing the strength of the product reduces biodegradability, so highly practical decomposition treatment technology. Therefore, the development of an enzyme having higher biodegradable plastic degrading activity and the development of an auxiliary agent for promoting the degradation of the biodegradable plastic are required.
Moreover, when using a biodegradable plastic-degrading enzyme in a field, since a buffer solution with a high salt concentration cannot be used, water is used as a solvent for the biodegradable plastic-degrading enzyme. However, since the activity of the biodegradable plastic degrading enzyme is reduced in water as compared with the case in the buffer solution, development of a method for efficiently degrading the biodegradable plastic is required even in the field.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、生分解性プラスチック分解酵素にエステラーゼを組み合わせて使用すると、水媒体で使用する場合であっても、生分解性ブラスチックを効率よく分解できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下に示す生分解性プラスチックを分解する方法、生分解性プラスチック分解剤、生分解性プラスチックを分解するためのキット、及び、生分解性プラスチック分解酵素の分解活性増強剤を提供するものである。
〔１〕生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを、生分解性プラスチックに添加する工程を含むことを特徴とする、生分解性プラスチックを分解する方法。
〔２〕前記生分解性プラスチックが、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリ（ブチレンサクシネート／アジペート）（ＰＢＳＡ）、ポリ（エチレンテレフタレート／サクシネート）（ＰＥＴＳ）、ポリ（ブチレンアジペート／テレフタレート）（ＰＢＡＴ）、ポリ（テトラメチレンアジペート／テレフタレート）（ＰＴＭＡＴ）、及び、それらの混合物から成る群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記生分解性プラスチックが、芳香環構造を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記生分解性プラスチック分解酵素が、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、パラフォーマ（Ｐａｒａｐｈｏｍａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、テルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、マルブランケア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、及び、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属から成る群から選択される微生物により産生される酵素である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕前記エステラーゼが、ブタ肝臓由来エステラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来エステラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼ、及び、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来エステラーゼから成る群から選択される、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを含むことを特徴とする、生分解性プラスチック分解剤。
〔７〕生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを含むことを特徴とする、生分解性プラスチックを分解するためのキット。
〔８〕エステラーゼを含むことを特徴とする、生分解性プラスチック分解酵素の分解活性増強剤。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have efficiently used a biodegradable plastic even when used in an aqueous medium when used in combination with an esterase in combination with a biodegradable plastic-degrading enzyme. The present invention was completed by finding that it can be decomposed.
That is, the present invention comprises a method for decomposing a biodegradable plastic, a biodegradable plastic decomposing agent, a kit for degrading a biodegradable plastic, and a biodegradable plastic degrading enzyme degrading activity enhancer as described below. It is to provide.
[1] A method for degrading a biodegradable plastic, comprising a step of adding a biodegradable plastic degrading enzyme and esterase to the biodegradable plastic.
[2] The biodegradable plastic is polyhydroxybutyrate (PHB), polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polybutylene succinate (PBS), poly (butylene succinate / adipate) (PBSA), [1] selected from the group consisting of poly (ethylene terephthalate / succinate) (PETS), poly (butylene adipate / terephthalate) (PBAT), poly (tetramethylene adipate / terephthalate) (PTMAT), and mixtures thereof. ] The method of description.
[3] The method according to [1], wherein the biodegradable plastic has an aromatic ring structure.
[4] The biodegradable plastic-degrading enzyme is selected from the group consisting of Pseudozyma, Paraforma, Cryptococcus, Mucor, Humicola, Thermomyces, and Thermomyces. (Talaromyces), Ketomium, Torula, Sporotrichum, Malbranchea, Pseudomonas, Bacteroides, Bacteroides, Bacteroides A) an enzyme produced by a microorganism selected from the group consisting of ] The method according to any one of to [3].
[5] The esterase comprises a pig liver-derived esterase, a Saccharomyces cerevisiae esterase, a Bacillus stearothermophilus esterase, and a Bacillus subtilis group. The method according to any one of [1] to [4], wherein the method is selected from:
[6] A biodegradable plastic decomposing agent comprising a biodegradable plastic degrading enzyme and esterase.
[7] A kit for degrading a biodegradable plastic, comprising a biodegradable plastic degrading enzyme and an esterase.
[8] A biodegradable plastic-degrading enzyme degradation activity enhancer comprising esterase.
本発明に従えば、生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを混合した酵素液を散布して、使用後の生分解性プラスチック製農業用資材を、圃場に鋤き込み可能な状態まで速やかに分解することが可能となる。それによって、産業廃棄物として処理するために必要であった労力とコストの大幅な軽減が期待される。また、分解活性が大幅に向上した生分解性プラスチック分解酵素を含む酵素液を用いれば、通常は分解されにくい強度の高い生分解性プラスチック製資材の分解速度を速めることもできるので、強度の高い生分解性プラスチック製資材の実用化が大いに進展することが期待される。 According to the present invention, a biodegradable plastic-degrading enzyme and esterase mixed enzyme solution is sprayed to quickly decompose the biodegradable plastic agricultural material after use to a state where it can be poured into the field. It becomes possible. As a result, it is expected that labor and cost required for processing as industrial waste will be greatly reduced. In addition, if an enzyme solution containing a biodegradable plastic-degrading enzyme with greatly improved degradation activity is used, it is possible to accelerate the degradation of high-strength biodegradable plastic materials that are normally difficult to be decomposed. The practical application of biodegradable plastic materials is expected to make great progress.
本発明のある態様は、生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを、生分解性プラスチックに添加する工程を含む、生分解性プラスチックを分解する方法に関するものである。
本明細書に記載の「生分解性プラスチック」とは、石油由来のプラスチックと同じように使用されるが、使用後は自然界の土中や水中の微生物により、最終的に水や二酸化炭素まで分解されるプラスチックのことをいう。本発明の方法は、本技術分野において通常知られている種々の生分解性プラスチックに対して適用することができる。前記生分解性プラスチックは、例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリ（ブチレンサクシネート／アジペート）（ＰＢＳＡ）、ポリ（エチレンテレフタレート／サクシネート）（ＰＥＴＳ）、ポリ（ブチレンアジペート／テレフタレート）（ＰＢＡＴ）、ポリ（テトラメチレンアジペート／テレフタレート）（ＰＴＭＡＴ）、及び、それらの混合物から成る群から選択してもよく、特に、ポリ（エチレンテレフタレート／サクシネート）（ＰＥＴＳ）、ポリ（ブチレンアジペート／テレフタレート）（ＰＢＡＴ）及びポリ（テトラメチレンアジペート／テレフタレート）（ＰＴＭＡＴ）などの芳香環構造を有するものであってもよい。一般的に、テレフタレートなどの芳香環構造を有する生分解性プラスチックは、強度は高いが分解されにくいものと考えられている。しかしながら、本発明の方法によれば、このような分解されにくい生分解性プラスチックであっても、効率よく分解することが可能となる。
One embodiment of the present invention relates to a method for degrading a biodegradable plastic, comprising adding a biodegradable plastic degrading enzyme and esterase to the biodegradable plastic.
The "biodegradable plastic" described in this specification is used in the same way as petroleum-derived plastic, but after use, it is eventually decomposed into water and carbon dioxide by natural soil and water microorganisms. It refers to plastic. The method of the present invention can be applied to various biodegradable plastics commonly known in the art. Examples of the biodegradable plastic include polyhydroxybutyrate (PHB), polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polybutylene succinate (PBS), poly (butylene succinate / adipate) (PBSA), poly It may be selected from the group consisting of (ethylene terephthalate / succinate) (PETS), poly (butylene adipate / terephthalate) (PBAT), poly (tetramethylene adipate / terephthalate) (PTMAT), and mixtures thereof, in particular It may have an aromatic ring structure such as poly (ethylene terephthalate / succinate) (PETS), poly (butylene adipate / terephthalate) (PBAT) and poly (tetramethylene adipate / terephthalate) (PTMAT). In general, a biodegradable plastic having an aromatic ring structure such as terephthalate is considered to have high strength but is difficult to be decomposed. However, according to the method of the present invention, even such a biodegradable plastic that is difficult to be decomposed can be efficiently decomposed.
前記生分解性プラスチックから形成された資材を、生分解性プラスチック製資材という。本発明の方法は、本技術分野において通常知られている種々の生分解性プラスチック製資材に対して適用することができる。前記生分解性プラスチック製資材は、例えば、マルチフィルム、ポット、シート、紐、ネット、トンネルフィルム、ハウスフィルム、畦シート、発芽シート、植生マット、育苗床、植木鉢及び苗用クリップなどの生分解性プラスチック製農業用資材であってもよく、食器、食品系の容器、若しくは袋などであってもよく、又は、これらの資材の製造過程で製造される端材であってもよい。前記生分解性プラスチック製資材は、好ましくは、生分解性プラスチック製農業用資材である。 The material formed from the biodegradable plastic is referred to as biodegradable plastic material. The method of the present invention can be applied to various biodegradable plastic materials commonly known in the art. The biodegradable plastic material is, for example, biodegradable such as multi-film, pot, sheet, string, net, tunnel film, house film, cocoon sheet, germination sheet, vegetation mat, nursery bed, flower pot and seedling clip. It may be a plastic agricultural material, may be a tableware, a food-based container, a bag, or the like, or may be an end material manufactured in the manufacturing process of these materials. The biodegradable plastic material is preferably a biodegradable plastic agricultural material.
本明細書に記載の「生分解性プラスチック分解酵素」とは、前記生分解性プラスチックを分解する活性を有する酵素のことをいう。本発明の方法には、生分解性プラスチックを分解する活性を有する酵素であれば、種々の酵素を制限なく使用することができる。前記生分解性プラスチック分解酵素は、微生物によって産生され得る。本発明の方法には、当該微生物から単離精製した生分解性プラスチック分解酵素を使用してもよく、当該微生物自体又はその培養液を生分解性プラスチック分解酵素として使用してもよい。前記生分解性プラスチック分解酵素を産生する微生物は、特に限定されるものではないが、例えば、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、パラフォーマ（Ｐａｒａｐｈｏｍａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、テルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、マルブランケア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、及び、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属から成る群から選択される微生物であってもよい。前記生分解性プラスチック分解酵素は、好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａにより産生される酵素（ＰａＥ）、Ｐａｒａｐｈｏｍａ属類縁菌クチナーゼ様酵素（ＰＣＬＥ）、又は、クチナーゼ様酵素１（ＣｍＣｕｔ１）である。ＰＣＬＥは、Ｐａｒａｐｈｏｍａ属類縁菌Ｂ４７−９株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された糸状菌；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−５７３；要すれば特許第５０８２１２５号参照）などのＰａｒａｐｈｏｍａ属類縁菌により産生される酵素であり、ＣｍＣｕｔ１は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ類縁菌ＢＰＤ１Ａ株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２１３４）などのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ又はその類縁菌により産生される酵素である。前記生分解性プラスチック分解酵素の溶媒には、緩衝液を使用してもよく、水を使用してもよいが、圃場で使用する場合には、前記溶媒として水を使用するのが好ましい。 The “biodegradable plastic degrading enzyme” described in the present specification refers to an enzyme having an activity of degrading the biodegradable plastic. In the method of the present invention, various enzymes can be used without limitation as long as they have an activity of degrading biodegradable plastics. The biodegradable plastic degrading enzyme can be produced by a microorganism. In the method of the present invention, a biodegradable plastic degrading enzyme isolated and purified from the microorganism may be used, or the microorganism itself or a culture solution thereof may be used as the biodegradable plastic degrading enzyme. The microorganism that produces the biodegradable plastic-degrading enzyme is not particularly limited. For example, the genus Pseudozyma, the genus Paraforma, the genus Cryptococcus, the genus Mucor, and Fumicola. (Humicola), Thermomyces, Talaromyces, Keetomium, Torula, Sporotrichum, Malbranemo Selected from the group consisting of the genus (Bacteroides) and the Acidborax It may be a microorganism to be. The biodegradable plastic-degrading enzyme is preferably an enzyme produced by Pseudozyma antarctica (PaE), a Paraphoma-related fungus cutinase-like enzyme (PCLE), or a cutinase-like enzyme 1 (CmCut1). PCLE is a Paraphoma such as Paraphoma genus related strain B47-9 (filamentous fungi deposited at the National Institute of Technology and Evaluation of Microorganisms of the National Institute of Technology and Evaluation; Accession Number NITE P-573; refer to Japanese Patent No. 5082125 if necessary). CmCut1 is a Cryptococcus magnus such as Cryptococcus magnus Bacteria BPD1A strain (yeast deposited in the National Institute of Technology and Evaluation of Microorganisms; Accession Number NITE P-02134). Or it is an enzyme produced by its related bacteria. As the solvent for the biodegradable plastic degrading enzyme, a buffer solution or water may be used. However, when used in a field, water is preferably used as the solvent.
本明細書に記載の「エステラーゼ」とは、エステルを水との化学反応で酸とアルコールに分解する加水分解酵素のことをいう。本発明の方法には、エステルを加水分解する活性を有する酵素であれば、種々の酵素を制限なく使用することができる。前記エステラーゼは、前記生分解性プラスチック分解酵素として一般的に使用されているものでなくてもよく、オリゴマーレベルの低分子エステルの分解酵素であってもよい。前記エステラーゼは、特に限定されるものではないが、例えば、ブタ肝臓由来エステラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来エステラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼ、又は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来エステラーゼ、又は、シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来リパーゼであってもよい。前記エステラーゼは、好ましくは、ブタ肝臓由来エステラーゼである。前記エステラーゼの溶媒には、緩衝液を使用してもよく、水を使用してもよいが、圃場で使用する場合には、前記溶媒として水を使用するのが好ましい。 As used herein, “esterase” refers to a hydrolase that decomposes an ester into an acid and an alcohol by a chemical reaction with water. In the method of the present invention, various enzymes can be used without limitation as long as they have an activity of hydrolyzing an ester. The esterase may not be one generally used as the biodegradable plastic degrading enzyme, and may be a degrading enzyme of an oligomer level low molecular ester. The esterase is not particularly limited, and examples thereof include porcine liver-derived esterase, Saccharomyces cerevisiae esterase, Bacillus stearothermophilus-derived esterase, or Bacillus subtilis (Bacillus subtilis). It may be an esterase derived from Bacillus subtilis or a lipase derived from Pseudozyma antarctica. The esterase is preferably a porcine liver-derived esterase. As the esterase solvent, a buffer solution or water may be used, but when used in a field, water is preferably used as the solvent.
本発明の生分解性プラスチックを分解する方法は、生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを、生分解性プラスチックに添加する工程を含む。前記添加工程においては、前記生分解性プラスチック分解酵素及び前記エステラーゼを予め混合した溶液を添加してもよく、それらを別々に調製した溶液を、同時又は連続的に添加してもよい。また、前記添加工程は、屋内で実施してもよく、屋外（特に圃場）で実施してもよい。 The method for decomposing a biodegradable plastic of the present invention includes a step of adding a biodegradable plastic degrading enzyme and esterase to the biodegradable plastic. In the addition step, a solution in which the biodegradable plastic degrading enzyme and the esterase are mixed in advance may be added, or solutions prepared separately may be added simultaneously or successively. Moreover, the said addition process may be implemented indoors and may be implemented outdoors (especially field).
本発明の別の態様は、生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを含む生分解性プラスチック分解剤に関するものである。本発明の生分解性プラスチック分解剤は、生分解性プラスチック分解酵素に加えて、その分解活性を増強するエステラーゼを含んでいるため、生分解性プラスチックを効率よく分解することができる。
本発明のまた別の態様は、生分解性プラスチック分解酵素及びエステラーゼを含む生分解性プラスチックを分解するためのキットに関するものである。本発明のキットは、生分解性プラスチック分解酵素又はそれを含む溶液と、エステラーゼ又はそれを含む溶液とを備えており、生分解性プラスチックに適用する前に両者を予め混合して使用してもよく、それらを別々に含む溶液を同時又は連続的に使用してもよい。
本発明のさらに別の態様は、エステラーゼを含む、生分解性プラスチック分解酵素の分解活性増強剤に関するものである。本発明の分解活性増強剤は、生分解性プラスチック分解酵素と併せて使用することで、生分解性プラスチックを効率よく分解することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
Another aspect of the present invention relates to a biodegradable plastic degrading agent comprising a biodegradable plastic degrading enzyme and an esterase. Since the biodegradable plastic decomposing agent of the present invention contains an esterase that enhances its degrading activity in addition to the biodegradable plastic degrading enzyme, the biodegradable plastic can be efficiently decomposed.
Yet another aspect of the present invention relates to a kit for degrading a biodegradable plastic comprising a biodegradable plastic degrading enzyme and an esterase. The kit of the present invention comprises a biodegradable plastic-degrading enzyme or a solution containing the same and an esterase or a solution containing the same, and may be used by mixing both in advance before applying to the biodegradable plastic. Often, solutions containing them separately may be used simultaneously or sequentially.
Yet another embodiment of the present invention relates to a biodegradable plastic-degrading enzyme-degrading activity enhancer comprising esterase. The biodegradable plastic can be efficiently decomposed by using the biodegradable plasticizer of the present invention in combination with a biodegradable plastic degrading enzyme.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, the scope of the present invention is not limited to these Examples.
＜試験例１＞
本試験例では、生分解性プラスチック分解酵素について、緩衝液中での分解活性と水中での分解活性とを比較した。
生分解性プラスチック分解酵素であるＰａＥ、ＰＣＬＥ又はＣｍＣｕｔ１を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）又は水に溶解し、１ｎＭ又は１０ｎＭの生分解性プラスチック分解酵素溶液を調製した。１ｍＬの生分解性プラスチック分解酵素溶液（１ｎＭ）及び１ｃｍ×１ｃｍのＰＢＡＴフィルムをガラス管に入れ、４時間、室温で静置した。また、２ｍＬの生分解性プラスチック分解酵素溶液（１０ｎＭ）、１ｃｍ×１ｃｍのＰＢＡＴフィルム、及び、撹拌子を石英セルに入れ、４０００秒間（約１時間）、３０℃で撹拌した。ＰＢＡＴは、その化学構造中に芳香環を含むテレフタル酸ユニットを有している。ＰＢＡＴが分解されると、このテレフタル酸ユニットを含む水溶性分解産物が放出されるので、これを２４０ｎｍの波長におけるＵＶ測定によって検出した。結果を図１に示す。
<Test Example 1>
In this test example, the biodegradable plastic degrading enzyme was compared with the decomposing activity in a buffer solution and the degrading activity in water.
Biodegradable plastic degrading enzymes PaE, PCLE or CmCut1 were dissolved in HEPES buffer (pH 7.3) or water to prepare 1 nM or 10 nM biodegradable plastic degrading enzyme solution. 1 mL of a biodegradable plastic degrading enzyme solution (1 nM) and a 1 cm × 1 cm PBAT film were placed in a glass tube and allowed to stand at room temperature for 4 hours. Further, 2 mL of a biodegradable plastic degrading enzyme solution (10 nM), a 1 cm × 1 cm PBAT film, and a stirring bar were placed in a quartz cell and stirred at 30 ° C. for 4000 seconds (about 1 hour). PBAT has a terephthalic acid unit containing an aromatic ring in its chemical structure. When PBAT was decomposed, a water-soluble decomposition product containing this terephthalic acid unit was released, and this was detected by UV measurement at a wavelength of 240 nm. The results are shown in FIG.
図１に示されているＯＤ240の値から理解できるように、ＨＥＰＥＳ緩衝液中では、ＰＣＬＥを１ｎＭという低濃度で使用した場合を除き、すべての実験条件下でＰＢＡＴの水溶性分解産物が検出された。一方、水中では、どの酵素を使用した場合でも、ＯＤ240の値がＨＥＰＥＳ緩衝液中で得られた値よりも低くなった。
この結果より、生分解性プラスチック分解酵素の活性は、緩衝液中に比べて水中で低下することがわかった。これは、水中で生分解性プラスチックと酵素とを反応させると、酵素反応中に反応液のｐＨが変化し、それが酵素の至適ｐＨの範囲からはずれるためであると考えられる。
As can be seen from the OD 240 values shown in FIG. 1, water-soluble degradation products of PBAT were detected in HEPES buffer under all experimental conditions except when PCLE was used at a low concentration of 1 nM. It was done. On the other hand, in water, the OD 240 value was lower than that obtained in the HEPES buffer regardless of which enzyme was used.
From this result, it was found that the activity of the biodegradable plastic degrading enzyme was reduced in water compared to the buffer solution. This is considered to be because when the biodegradable plastic and the enzyme are reacted in water, the pH of the reaction solution changes during the enzyme reaction, which is out of the optimum pH range of the enzyme.
＜試験例２＞
本試験例では、エステラーゼの生分解性プラスチック分解活性を測定した。
生分解性プラスチック分解酵素に代えて、ブタ肝臓由来エステラーゼ（シグマ・アルドリッチ社製）を１０ｍｇ／Ｌの濃度で使用した以外は、試験例１と同様の方法でＰＢＡＴの水溶性分解産物を検出した。室温で４時間反応させた後のＯＤ240を図２に示す。
<Test Example 2>
In this test example, the biodegradable plastic degradation activity of esterase was measured.
A water-soluble degradation product of PBAT was detected in the same manner as in Test Example 1 except that porcine liver-derived esterase (manufactured by Sigma-Aldrich) was used at a concentration of 10 mg / L instead of the biodegradable plastic degradation enzyme. . FIG. 2 shows OD 240 after the reaction at room temperature for 4 hours.
図２から理解できるように、ブタ肝臓由来エステラーゼは、ＨＥＰＥＳ中でＰＢＡＴをわずかにしか分解しなかった。また、ブタ肝臓由来エステラーゼの分解活性は、水中でも低下しなかった。 As can be seen from FIG. 2, porcine liver-derived esterase only slightly degraded PBAT in HEPES. Moreover, the degradation activity of porcine liver-derived esterase was not lowered even in water.
＜試験例３＞
本試験例では、公知の生分解性プラスチック分解酵素の分解活性に対するエステラーゼの影響を検討した。
生分解性プラスチック分解酵素であるＰａＥ、ＰＣＬＥ又はＣｍＣｕｔ１を、単独で又はブタ肝臓由来エステラーゼ（シグマ・アルドリッチ社製）と組み合わせて水に溶解し、１ｎＭの生分解性プラスチック分解酵素を含む生分解性プラスチック分解酵素溶液、及び、１ｎＭの生分解性プラスチック分解酵素と１０ｍｇ／Ｌのブタ肝臓由来エステラーゼとを含むブレンド酵素溶液を調製した。また、１０ｍｇ／Ｌのブタ肝臓由来エステラーゼ溶液も調製した。１ｍＬの生分解性プラスチック分解酵素溶液、ブタ肝臓由来エステラーゼ溶液、又は生分解性プラスチック分解酵素及びブタ肝臓由来エステラーゼを混合したブレンド酵素溶液と、１ｃｍ×１ｃｍのＰＢＡＴフィルムとをガラス管に入れ、４時間、室温で静置した。ＯＤ240の実測値と、各酵素を単独で使用したときの結果を足し合わせたＯＤ240の推定値（ブレンド酵素の推定値）とを図３に示す。
<Test Example 3>
In this test example, the effect of esterase on the degradation activity of known biodegradable plastic-degrading enzymes was examined.
A biodegradable plastic-degrading enzyme, PaE, PCLE or CmCut1, dissolved in water alone or in combination with porcine liver-derived esterase (manufactured by Sigma-Aldrich) and biodegradable containing 1 nM biodegradable plastic-degrading enzyme A plastic degrading enzyme solution and a blended enzyme solution containing 1 nM biodegradable plastic degrading enzyme and 10 mg / L porcine liver-derived esterase were prepared. A 10 mg / L porcine liver-derived esterase solution was also prepared.
図３に示されているように、生分解性プラスチック分解酵素にブタ肝臓由来エステラーゼを混合したブレンド酵素におけるＯＤ240の実測値は、各酵素を単独で使用したときの結果の和である推定値を上回った。すなわち、生分解性プラスチック分解酵素とブタ肝臓由来エステラーゼとを併用すると、それぞれを単独で使用したときに分解されるＰＢＡＴの量の和を上回る量のＰＢＡＴを分解することができた。
この結果より、エステラーゼは、生分解性プラスチック分解酵素の分解活性を増強できることがわかる。この増強作用については、特定の理論に拘束される必要はないが、例えば次のような機序が考えられる。上述の試験例で使用した生分解性プラスチック分解酵素は、生分解性プラスチックをランダムに分解するエンド型の分解酵素であり、生分解性プラスチックをモノマーまで分解することもできるが、その主要な分解産物はオリゴマーであって、モノマーではない。この分解産物であるオリゴマーが多数存在すると、生分解性プラスチック分解酵素はオリゴマーをさらにモノマーまで分解する反応を触媒する必要があるため、生分解性プラスチックからオリゴマーを生成する反応速度が低下し得る。一方、エステラーゼは、生分解性プラスチック分解酵素の作用で生じたオリゴマーを、速やかにモノマーまで分解することができる。エステラーゼの働きによって分解反応液中からオリゴマーが除去されれば、生分解性プラスチック分解酵素による生分解性プラスチックからオリゴマーを生成する分解反応の分解速度は高いまま維持されるので、生分解性プラスチックを効率よく分解することができる。また、水中で低下する生分解性プラスチック分解酵素の反応をエステラーゼが補うことができるため、水中で生分解性プラスチックを効率よく分解することができる。
As shown in FIG. 3, the actual measured value of OD 240 in the blend enzyme obtained by mixing the biodegradable plastic-degrading enzyme with the porcine liver-derived esterase is an estimated value that is the sum of the results when each enzyme is used alone. Exceeded. That is, when a biodegradable plastic-degrading enzyme and porcine liver-derived esterase were used in combination, it was possible to decompose PBAT in an amount exceeding the sum of the amounts of PBAT decomposed when each was used alone.
From this result, it can be seen that esterase can enhance the degradation activity of the biodegradable plastic degradation enzyme. The enhancing action need not be bound by a specific theory, but for example, the following mechanism can be considered. The biodegradable plastic degrading enzyme used in the above test example is an endo-type degrading enzyme that randomly decomposes the biodegradable plastic. The product is an oligomer, not a monomer. When a large number of oligomers which are the degradation products are present, the biodegradable plastic degrading enzyme needs to catalyze a reaction for further decomposing the oligomer into monomers, so that the reaction rate for producing the oligomer from the biodegradable plastic can be reduced. On the other hand, esterase can quickly decompose an oligomer produced by the action of a biodegradable plastic degrading enzyme into a monomer. If oligomers are removed from the degradation reaction solution by the action of esterase, the degradation rate of the degradation reaction that produces oligomers from the biodegradable plastics by the biodegradable plastic degradation enzyme is maintained at a high level. It can be decomposed efficiently. In addition, since the esterase can compensate for the reaction of the biodegradable plastic degrading enzyme that decreases in water, the biodegradable plastic can be efficiently decomposed in water.
以上より、生分解性プラスチック分解酵素とエステラーゼとを併用すると、相乗的な生分解性プラスチック分解活性が得られることがわかった。一般的に分解されにくいと考えられている芳香環構造を有する生分解性プラスチックを対象とし、かつ、生分解性プラスチック分解酵素の分解活性が低下する水中で反応を行うという過酷な試験条件下であっても、エステラーゼは、生分解性プラスチック分解酵素の分解活性を増強し、分解活性の低下を補うことができる。そうすると、塩分濃度の高い緩衝液を使用することができない圃場において強度の高い生分解性プラスチックを分解する場合であっても、生分解性プラスチック分解酵素とエステラーゼとを併用すれば、生分解性プラスチックを効率よく分解することが可能となる。 From the above, it has been found that when a biodegradable plastic degrading enzyme and esterase are used in combination, a synergistic biodegradable plastic degrading activity can be obtained. Targeting biodegradable plastics with aromatic ring structures that are generally considered to be difficult to degrade, and under severe test conditions in which the reaction is carried out in water where the degradation activity of the biodegradable plastic-degrading enzyme is reduced Even if it exists, esterase can enhance the degradation activity of a biodegradable plastic degradation enzyme, and can compensate the fall of degradation activity. Then, even when biodegradable plastic with high strength is decomposed in a field where a buffer solution with high salt concentration cannot be used, if biodegradable plastic degrading enzyme and esterase are used in combination, biodegradable plastic Can be efficiently decomposed.
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