JP2017067510A - Method for analyzing mass of lipid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、脂質を質量分析する方法、及びそのためのイオン化促進剤に関する。 The present invention relates to a method for mass spectrometry of lipids, and an ionization accelerator for the same.
角質層は表皮の最表面に位置し、皮膚のバリア機能や保湿機能に寄与している。ヒト角質層の細胞間脂質は、主にセラミド、コレステロール、遊離脂肪酸、硫酸コレステロールなどから構成されている。ヒト角質層のセラミドは、従来、皮膚のバリア機能や保湿機能に関与する主因子として報告されている。セラミド以外の細胞間脂質についても、皮膚機能との関連が報告されている。 The stratum corneum is located on the outermost surface of the epidermis and contributes to the skin barrier function and moisturizing function. The intercellular lipid in the human stratum corneum is mainly composed of ceramide, cholesterol, free fatty acid, cholesterol sulfate and the like. Ceramide of the human stratum corneum has been reported as a main factor related to the skin barrier function and moisturizing function. Intercellular lipids other than ceramide have also been reported to be associated with skin function.
生体試料の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）においては、主にエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）又は大気圧化学イオン化質量分析法（ＡＰＣＩ−ＭＳ）が用いられている。質量分析法では、目的分子をイオン化し、生じたイオンを、真空中でｍ／ｚ（質量数／電荷）に応じて分離及び検出する。生成されるイオンとしてはプロトン付加分子（［Ｍ＋Ｈ］+）や脱プロトン分子（［Ｍ−Ｈ］-）などが挙げられる。当該イオン化処理で生成するイオンの種類は、イオン化の条件や、検体又は移動相中に含まれる溶媒や添加剤の影響を受ける。例えば、正イオンモードでは、検体又は移動相中にアンモニウム塩やアンモニアが存在するとアンモニウムイオン付加分子（［Ｍ＋ＮＨ4］+）が、ナトリウム塩が存在するとナトリウムイオン付加分子（［Ｍ＋Ｎａ］+）が生成される場合がある。また負イオンモードでは、検体又は移動相中に酢酸や酢酸アンモニウムが存在すると酢酸イオン付加分子（［Ｍ＋ＣＨ3ＣＯＯ］-）が、ギ酸やギ酸アンモニウムが存在するとギ酸イオン付加分子（［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-）が、塩化物イオンが存在すると塩化物イオン付加分子（［Ｍ＋Ｃｌ］-）が生成される場合がある。 In liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of biological samples, electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) or atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (APCI-MS) is mainly used. In mass spectrometry, target molecules are ionized, and the generated ions are separated and detected in vacuum according to m / z (mass number / charge). Produced ions include protonated molecules ([M + H] + ) and deprotonated molecules ([M−H] − ). The type of ions generated by the ionization treatment is affected by the ionization conditions and the solvent or additive contained in the specimen or mobile phase. For example, in the positive ion mode, ammonium ion adduct molecules when an ammonium salt or ammonia is present in the sample or the mobile phase ([M + NH 4] + ) is a sodium ion adduct molecules when the sodium salt present ([M + Na] +) product May be. In the negative ion mode, analytes or mobile phase to acetic acid or ammonium acetate when there acetate ion adduct molecules ([M + CH 3 COO] -) is, formate ions added molecules when ammonium formate and formic acid is present ([M + HCOO] -) However, in the presence of chloride ions, chloride ion addition molecules ([M + Cl] − ) may be generated.
目的分子のイオン化の過程で多種のイオン種が生成されると、各イオンの信号強度が分散し、検出感度の低下に繋がる場合がある。また、目的分子が多種類存在する際には、各目的分子において生成されたイオンのｍ／ｚが重なることにより、目的分子の検出が困難になる場合がある。さらに、質量分析では各イオンの同位体も同時に検出されるため、ｍ／ｚの差が近接する場合にも、目的分子の検出が困難になることがある。 If various ion species are generated in the process of ionization of the target molecule, the signal intensity of each ion may be dispersed, leading to a decrease in detection sensitivity. In addition, when there are many types of target molecules, it may be difficult to detect the target molecules due to the overlap of m / z of ions generated in each target molecule. Furthermore, since the isotopes of each ion are detected at the same time in mass spectrometry, it may be difficult to detect the target molecule even when the m / z difference is close.
炭酸水素アンモニウム（又は炭酸アンモニウム）は、従来、液体クロマトグラフィーにおいて、試料中の目的分子を分離するための緩衝剤として移動相に添加されていた。非特許文献１には、炭酸アンモニウム水溶液／アセトニトリルの混合溶媒を用いたＬＣにより、胆汁酸からコール酸誘導体を分離したことが記載されている。非特許文献２には、メタノール／炭酸水素アンモニウムバッファーの混合溶媒からなる移動相でグルコサミンをＬＣ分離した後、ＥＳＩ−ＭＳ分析したことが記載されている。一方、非特許文献３には、植物油中のトリアシルグリセリドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析において、ＭＡＬＤＩマトリックスであるジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）への添加剤として炭酸水素アンモニウムを用いたことが記載されている。しかしながら、これまで、炭酸水素アンモニウムをＥＳＩ−ＭＳやＡＰＣＩ−ＭＳにおけるイオン化促進のために用いたという報告はない。
Ammonium bicarbonate (or ammonium carbonate) has been conventionally added to a mobile phase as a buffering agent for separating a target molecule in a sample in liquid chromatography. Non-Patent
本発明は、質量分析用検体のＥＳＩ、ＡＰＣＩ、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化におけるイオン化処理において、該検体中の脂質が特定のイオン種にイオン化することを促進するイオン化促進剤、ならびに、該イオン化促進剤を用いた、脂質を高精度に質量分析する方法を提供する。 The present invention relates to an ionization accelerator that promotes ionization of lipids in a specimen to a specific ionic species in ionization processing in a multiion source that induces ESI, APCI, or both of a specimen for mass spectrometry. And a method of mass-analyzing lipids with high accuracy using the ionization promoter.
本発明者は、種々検討した結果、脂質を含む検体を、炭酸水素アンモニウム存在下でＥＳＩ、ＡＰＣＩ、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化などのイオン化処理に供することにより、生成される脂質分子のイオン種を特定の種類に限定することができることを見出した。したがって、炭酸水素アンモニウムをイオン化促進剤として用いることにより、脂質の質量分析の精度を向上させることができる。 As a result of various studies, the present inventor has produced a lipid-containing specimen by subjecting it to an ionization treatment such as ionization with a multi-ion source that induces ESI, APCI, or both in the presence of ammonium bicarbonate. It has been found that the ionic species of lipid molecules can be limited to specific types. Therefore, the accuracy of lipid mass spectrometry can be improved by using ammonium hydrogen carbonate as an ionization accelerator.
したがって、本発明は、
脂質を含む検体を、炭酸水素アンモニウム存在下で、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化に供すること；及び、
イオン化した脂質を質量分析により検出すること、
を含む、脂質の質量分析方法を提供する。
Therefore, the present invention
Subjecting the lipid-containing analyte to ionization with a multi-ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both in the presence of ammonium bicarbonate; and
Detecting ionized lipids by mass spectrometry,
A method for mass spectrometry of lipids is provided.
また本発明は、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化を促進するための方法であって、該検体に炭酸水素アンモニウムを添加することを含む方法を提供する。 The present invention also relates to a method for promoting ionization of lipids in a mass spectrometric sample in ionization by a multi-ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both. A method is provided that includes adding ammonium hydrogen.
さらに本発明は、炭酸水素アンモニウムを含有する、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化促進剤を提供する。 The present invention further provides an ionization enhancer for lipids in a mass spectrometric analyte in ionization with a multi ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both, containing ammonium bicarbonate.
本発明のイオン化促進剤は、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化による質量分析用検体のイオン化処理において生成される脂質分子のイオン種を、特定の種類に限定することができる。したがって、本発明のイオン化促進剤を用いることで、質量分析における目的分子からの複数種イオンの生成が抑制され、目的とする脂質の検出の感度が向上する。また、目的分子が多種類存在する際に、各目的分子において生成されたイオンのｍ／ｚの重複が解消され、各目的分子の検出が容易になる。したがって、本発明によれば、高精度な脂質の質量分析を実現することができる。 The ionization enhancer of the present invention can be used to identify ionic species of lipid molecules generated in the ionization treatment of a mass spectrometric specimen by ionization with a multi-ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both. Can be limited to types. Therefore, by using the ionization accelerator of the present invention, the generation of plural kinds of ions from the target molecule in mass spectrometry is suppressed, and the sensitivity for detecting the target lipid is improved. Further, when there are many types of target molecules, m / z overlap of ions generated in each target molecule is eliminated, and detection of each target molecule becomes easy. Therefore, according to the present invention, highly accurate lipid mass spectrometry can be realized.
本発明は、脂質の質量分析方法を提供する。該本発明の方法で分析される脂質の例としては、動物又は植物由来の脂質、食品由来の脂質、化粧品等の油脂含有組成物由来の脂質などが挙げられ、好ましくは皮膚角質層及び毛に含まれる脂質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法で分析される脂質のより詳細な例としては、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、モノアシルグリセリド（ＭＡＧ）、ジアシルグリセリド（ＤＡＧ）、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）、セラミド等の脂肪酸含有化合物、ならびにコレステロール、硫酸コレステロール等のコレステロール及びその誘導体が挙げられ、好ましい例としては、ＦＦＡ、ＴＡＧ及びセラミド等の脂肪酸含有化合物が挙げられる。本発明の質量分析方法において、上記に挙げた脂質は、いずれか１種が分析されてもよいが、２種以上、好ましくは全てが網羅的に分析されてもよい。好ましくは、本発明の質量分析方法において分析される脂質は、ＦＦＡ、ＴＡＧ及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である。 The present invention provides a lipid mass spectrometry method. Examples of lipids analyzed by the method of the present invention include animal or plant-derived lipids, food-derived lipids, lipids derived from oils and fats-containing compositions such as cosmetics, and preferably the skin stratum corneum and hair. Examples include, but are not limited to, lipids included. More detailed examples of lipids analyzed by the method of the present invention include fatty acid-containing compounds such as free fatty acids (FFA), monoacylglycerides (MAG), diacylglycerides (DAG), triacylglycerides (TAG), ceramides, In addition, cholesterol such as cholesterol and cholesterol sulfate and derivatives thereof may be mentioned, and preferred examples include fatty acid-containing compounds such as FFA, TAG and ceramide. In the mass spectrometry method of the present invention, any one of the lipids listed above may be analyzed, but two or more, preferably all may be comprehensively analyzed. Preferably, the lipid analyzed in the mass spectrometry method of the present invention is at least one selected from the group consisting of FFA, TAG and ceramide.
本発明の質量分析方法の検体は、上記脂質を含む検体である。好ましくは、該検体は、液体クロマトグラフィー分離で得られた生成物である。したがって、好ましくは本発明の質量分析方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−質量分析（ＭＳ）法である。 The sample of the mass spectrometric method of the present invention is a sample containing the lipid. Preferably, the analyte is a product obtained by liquid chromatography separation. Therefore, preferably, the mass spectrometry method of the present invention is a liquid chromatography (LC) -mass spectrometry (MS) method.
本発明の方法がＬＣ−ＭＳ法の場合、動物、植物、食品、化粧品等の油脂含有組成物、などの試料から脂質を含む抽出液を調製し、これをＬＣに供することができる。該試料の好ましい例としては、皮膚角質層や毛が挙げられる。好ましくは、上記試料は溶媒抽出に供され、脂質を含む抽出液へと調製される。溶媒抽出のための溶媒には、標的脂質の溶解性が高い溶媒を用いる。好ましい溶媒の例としては、メタノール、エタノール、２−プロパノール、クロロホルムなどが挙げられる。さらに、脂質解析が夾雑成分の影響を受ける可能性がある場合、夾雑物を除去するための前処理を試料に施してもよい。あるいは、上記試料から脂質を含む溶媒抽出液を調製する方法として、生体試料から脂質成分を分離精製するための公知の手法、例えば、Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ法（Ｅ．Ｇ．Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｗ．Ｊ．Ｄｙｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｖｏｌ．３７，９１１−９１７，１９５９）又はＦｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｆｏｌｃｈ，Ｍ．Ｌｅｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｈ．Ｓ．Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２２６，４９７−５０９，１９５７）を適用することができる。 When the method of the present invention is an LC-MS method, an extract containing lipids can be prepared from a sample such as an oil-and-fat-containing composition such as animals, plants, foods, and cosmetics, and this can be subjected to LC. Preferable examples of the sample include skin stratum corneum and hair. Preferably, the sample is subjected to solvent extraction and prepared into an extract containing lipids. As the solvent for solvent extraction, a solvent having high solubility of the target lipid is used. Examples of preferred solvents include methanol, ethanol, 2-propanol, chloroform and the like. Furthermore, if the lipid analysis may be affected by contaminant components, a pretreatment for removing contaminants may be applied to the sample. Alternatively, as a method for preparing a solvent extract containing lipid from the above sample, a known method for separating and purifying lipid components from a biological sample, for example, the Bligh and Dyer method (EG Bligh and WJ Dyer). , Can. J. Biochem. Physiol., Vol. 37, 911-917, 1959) or the Folch method (J. Folch, M. Lees and GH S. Stanley, J. Biol. Chem. Vol. 226, 497). -509, 1957) can be applied.
次いで、上記手順で調製した脂質を含む抽出液をクロマトグラフィー分離する。クロマトグラフィーは、順相液体クロマトグラフィー（ＮＰＬＣ）であっても、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）であってもよい。本発明の方法においては、標的脂質ごとにＮＰＬＣとＲＰＬＣを使い分けてもよいが、全ての試料をまとめてＮＰＬＣ又はＲＰＬＣのいずれかにかけてもよい。本発明の方法において好ましいＬＣは、ＲＰＬＣである。 Next, the extract containing the lipid prepared by the above procedure is chromatographed. The chromatography may be normal phase liquid chromatography (NPLC) or reverse phase liquid chromatography (RPLC). In the method of the present invention, NPLC and RPLC may be properly used for each target lipid, but all samples may be collected and applied to either NPLC or RPLC. A preferred LC in the method of the present invention is RPLC.
ＮＰＬＣ用の充填剤としては、シリカゲルやシリカゲルに極性官能基を結合した充填剤が挙げられる。ＲＰＬＣ用の充填剤としては、シリカゲルやポリマーゲル基材に炭化水素鎖を結合した充填剤が挙げられる。好ましくは、シリカゲル基材にオクタデシル基を結合した充填剤（ＯＤＳ又はＣ１８充填剤とも称する）が挙げられる。 Examples of the filler for NPLC include silica gel and a filler having a polar functional group bonded to silica gel. Examples of the filler for RPLC include a filler in which a hydrocarbon chain is bonded to silica gel or a polymer gel base material. Preferably, a filler (also referred to as ODS or C18 filler) in which an octadecyl group is bonded to a silica gel base material is used.
クロマトグラフィーの移動相は、標的脂質を適度に保持して分子種別に分離することが可能であり、かつ不揮発性の酸や塩を高濃度に含まないものが好ましい。例えば、移動相ａはメタノール/水の混合液、移動相ｂは２−プロパノールとし、移動相ａとｂで１００：０〜０：１００（体積比）のグラジエントをかけることができる。 The mobile phase for chromatography is preferably one that can appropriately retain the target lipid and can be separated into molecular types, and does not contain a non-volatile acid or salt at a high concentration. For example, the mobile phase a is a methanol / water mixture, the mobile phase b is 2-propanol, and a gradient of 100: 0 to 0: 100 (volume ratio) can be applied between the mobile phases a and b.
斯くして得られたクロマトグラフィー分離の生成物は、質量分析のための検体として使用される。すなわち、該クロマトグラフィー分離の生成物はイオン化に供され、その中に含まれる脂質がイオン化される。イオン化の手段としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、及びＥＳＩとＡＰＣＩの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化が挙げられる。 The product of the chromatographic separation thus obtained is used as an analyte for mass spectrometry. That is, the product of the chromatographic separation is subjected to ionization, and the lipid contained therein is ionized. Means of ionization include electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), and ionization with a multi-ion source that induces both ESI and APCI.
本明細書において、「ＥＳＩとＡＰＣＩの両方を誘起するマルチイオン源」（または単に「マルチイオン源」）とは、ＥＳＩとＡＰＣＩを同時に行う複合イオン化法を実行できるか、又はＥＳＩとＡＰＣＩそれぞれの単独イオン化法をデッドタイム無く切換えて実行可能であり、それによって、１回の質量分析でＥＳＩとＡＰＣＩにより生成されたイオンを同時に検出することができるように検体をイオン化することができるイオン源を意味している。このようなマルチイオン源は、マルチモードイオンソース、デュアルイオンソース、ＥＳＣｉマルチモードイオン源、デュオスプレーイオンソース、ハイブリッドイオン源などと称され、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、島津製作所、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、株式会社日立ハイテクノロジーズなどから販売又は公開されている（例えば、米国特許第６６４６２５７号、国際公開公報第２００３／１０２５３７号、国際公開公報第２００７／０３２０８８号、国際公開公報第２０１４／０８４０１５号）。マルチイオン源によるイオン化により、検体中の脂質を、その極性や構造特異性にかかわらずイオン化することができる。 In this specification, “multi-ion source that induces both ESI and APCI” (or simply “multi-ion source”) means that a composite ionization method in which ESI and APCI are performed simultaneously can be performed, or each of ESI and APCI can be performed. A single ionization method can be performed with no dead time, and an ion source capable of ionizing an analyte so that ions generated by ESI and APCI can be detected simultaneously in one mass analysis. I mean. Such a multi-ion source is called a multi-mode ion source, a dual ion source, an ESCi multi-mode ion source, a duo spray ion source, a hybrid ion source, or the like. Agilent Technologies, Shimadzu Corporation, Waters Corporation, AB Sciex, Inc. It is sold or disclosed by Hitachi High-Technologies Corporation (for example, US Pat. No. 6,646,257, International Publication No. 2003/102537, International Publication No. 2007/032088, International Publication No. 2014/084015). By ionization with a multi-ion source, lipids in a specimen can be ionized regardless of their polarity or structure specificity.
本発明において、上記脂質のイオン化は、炭酸水素アンモニウムの存在下で行われる。本発明において、炭酸水素アンモニウムは、検体中の標的脂質のイオン化効率の向上のために使用される、イオン化促進剤である。さらに本発明において、炭酸水素アンモニウムは、検体中の標的脂質のイオン化で生成される標的脂質イオンの種類を、特定のイオン種に限定させる作用を有する。すなわち、本発明において、炭酸水素アンモニウムは、標的脂質の種類に依存して、特定のイオン種の生成を促進するイオン化促進剤である。 In the present invention, the ionization of the lipid is performed in the presence of ammonium bicarbonate. In the present invention, ammonium bicarbonate is an ionization accelerator used for improving the ionization efficiency of the target lipid in the specimen. Furthermore, in the present invention, ammonium hydrogen carbonate has the effect of limiting the type of target lipid ion generated by ionization of the target lipid in the specimen to a specific ionic species. That is, in the present invention, ammonium hydrogen carbonate is an ionization accelerator that promotes the production of specific ionic species depending on the type of target lipid.
より詳細には、本発明で用いられる炭酸水素アンモニウムは、脂質分子種依存的に、正イオンモードでのイオン化においては［Ｍ＋Ｈ］+又は［Ｍ＋ＮＨ4］+の生成を促進し、負イオンモードでのイオン化においては［Ｍ−Ｈ］-の生成を促進する（ここで、Ｍは、質量分析での検出対象である脂質分子種の中性分子を表す）。例えば、炭酸水素アンモニウムは、正イオンモードにおいて、ＴＡＧを［Ｍ＋ＮＨ4］+の形態にイオン化されるよう促し、一方、セラミドを［Ｍ＋Ｈ］+の形態にイオン化されるよう促す。また例えば、炭酸水素アンモニウムは、負イオンモードにおいて、セラミド及びＦＦＡを［Ｍ−Ｈ］-の形態にイオン化されるよう促す。 More specifically, ammonium hydrogen carbonate used in the present invention promotes the production of [M + H] + or [M + NH 4 ] + in the ionization in the positive ion mode, and in the negative ion mode, depending on the lipid molecular species. Promotes the production of [M−H] − (where M represents a neutral molecule of a lipid molecular species to be detected by mass spectrometry). For example, ammonium bicarbonate promotes TAG to be ionized to the [M + NH 4 ] + form in positive ion mode, while ceramide is ionized to the [M + H] + form. Also, for example, ammonium bicarbonate encourages ceramide and FFA to be ionized to the [MH] − form in the negative ion mode.
本発明の方法において、炭酸水素アンモニウムは、イオン化に供するための検体、例えばクロマトグラフィー分離後の生成物に添加することができる。クロマトグラフィー分離生成物への炭酸水素アンモニウムの添加濃度は、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。 In the method of the present invention, ammonium bicarbonate can be added to a sample for ionization, for example, a product after chromatographic separation. The concentration of ammonium bicarbonate added to the chromatographic separation product is preferably 0.1 mmol / L or more and 1000 mmol / L or less, more preferably 1 mmol / L or more and 100 mmol / L or less.
あるいは、本発明の方法においては、クロマトグラフィー分離の過程で炭酸水素アンモニウムを添加し、炭酸水素アンモニウムを含有するクロマトグラフィー分離生成物を調製してもよい。クロマトグラフィー分離の過程で炭酸水素アンモニウムを添加する場合、クロマトグラフィーの移動相に添加することが好ましい。例えば、炭酸水素アンモニウム含有メタノール溶液／水の１／１溶液を移動相に用いたクロマトグラフィー分離を行うことによって、炭酸水素アンモニウムを含有するクロマトグラフィー分離生成物を得ることができる。該移動相への炭酸水素アンモニウムの添加濃度は、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
Alternatively, in the method of the present invention, ammonium bicarbonate may be added in the course of chromatographic separation to prepare a chromatographic separation product containing ammonium bicarbonate. When ammonium hydrogen carbonate is added during the chromatographic separation process, it is preferably added to the mobile phase of chromatography. For example, a chromatographic separation product containing ammonium hydrogen carbonate-containing methanol solution /
本発明の方法において、上記炭酸水素アンモニウムの作用を阻害しないためには、クロマトグラフィーの移動相には、従来使用されている緩衝剤、例えばギ酸、酢酸、及びそれらの塩（例えば、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム）などを添加しないことが望ましい。また本発明の方法においては、炭酸水素アンモニウム以外のイオン化促進剤を使用しないことが望ましい。 In the method of the present invention, in order not to inhibit the action of the ammonium hydrogen carbonate, the chromatographic mobile phase contains conventionally used buffers such as formic acid, acetic acid, and salts thereof (for example, ammonium formate, It is desirable not to add ammonium acetate). In the method of the present invention, it is desirable not to use an ionization accelerator other than ammonium hydrogen carbonate.
好ましくは、本発明の方法においては、炭酸水素アンモニウムと検体との混液が調製されてイオン化に供される。 Preferably, in the method of the present invention, a mixed solution of ammonium hydrogen carbonate and a specimen is prepared and subjected to ionization.
上記の手順にて炭酸水素アンモニウム存在下でイオン化された標的脂質は、質量分析（ＭＳ）にかけられ、質量数／電荷（ｍ／ｚ）ごとに分離されて検出される。本発明で使用されるＭＳとしては、ＥＳＩ−ＭＳ、ＡＰＣＩ−ＭＳ、及びＥＳＩとＡＰＣＩの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化を用いて質量分析を行う方法が挙げられる。 The target lipid ionized in the presence of ammonium bicarbonate in the above procedure is subjected to mass spectrometry (MS), and separated and detected by mass number / charge (m / z). MS used in the present invention includes ESI-MS, APCI-MS, and a method of performing mass spectrometry using ionization with a multi-ion source that induces both ESI and APCI.
イオン化した脂質の質量分析には、四重極型質量分析装置（Ｑ−ＭＳ）、飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）、イオントラップ型質量分析装置（ＩＴ−ＭＳ）、フーリエ変換型質量分析装置（ＦＴ−ＭＳ）等のシングル型の質量分析装置、Ｑ−ＴＯＦ、ＩＴ−ＴＯＦ等のハイブリッド型質量分析装置、又はトリプル四重極型等のタンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ等）などの公知の質量分析装置を用いることができる。質量分析におけるイオン化された脂質の検出は、正イオンモード及び負イオンモードのいずれで行ってもよく、標的脂質分子種に応じて正又は負のイオンモードを選択すればよい。例えば、コレステロールならびにＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧは、正イオンモードで検出することが好ましく、遊離脂肪酸及び硫酸コレステロールは、負イオンモードで検出することが好ましい。セラミドは、正負いずれのイオンモードでも検出することができるが、夾雑物の影響を回避するためには負イオンモードで検出することが好ましい。検出された分子種は、ｍ／ｚに基づいて同定することができる。 For mass analysis of ionized lipid, quadrupole mass spectrometer (Q-MS), time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS), ion trap mass spectrometer (IT-MS), Fourier transform mass Single-type mass spectrometers such as analyzers (FT-MS), hybrid-type mass spectrometers such as Q-TOF and IT-TOF, or tandem mass spectrometers such as triple quadrupole type (MS / MS, etc.), etc. A known mass spectrometer can be used. Detection of ionized lipids in mass spectrometry may be performed in either the positive ion mode or the negative ion mode, and the positive or negative ion mode may be selected depending on the target lipid molecular species. For example, cholesterol and MAG, DAG and TAG are preferably detected in the positive ion mode, and free fatty acid and cholesterol sulfate are preferably detected in the negative ion mode. Ceramide can be detected in either positive or negative ion mode, but detection in negative ion mode is preferred in order to avoid the influence of impurities. The detected molecular species can be identified based on m / z.
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。 As exemplary embodiments of the present invention, the following substances, production methods, uses or methods are further disclosed herein. However, the present invention is not limited to these embodiments.
〔１〕脂質を含む検体を、炭酸水素アンモニウム存在下で、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化に供すること；及び、
イオン化した脂質を質量分析により検出すること、
を含む、脂質の質量分析方法。
[1] subjecting the lipid-containing analyte to ionization with a multi-ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both in the presence of ammonium bicarbonate; and
Detecting ionized lipids by mass spectrometry,
A method for lipid mass spectrometry.
〔２〕上記脂質が、
好ましくは、脂肪酸含有化合物、コレステロール及びコレステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、セラミド、コレステロール及び硫酸コレステロールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１〕記載の方法。
[2] The lipid is
Preferably, it is at least one selected from the group consisting of fatty acid-containing compounds, cholesterol and cholesterol derivatives,
More preferably, it is at least one selected from the group consisting of free fatty acids, monoacyl glycerides, diacyl glycerides, triacyl glycerides, ceramides, cholesterol and cholesterol sulfate,
More preferably, it is at least one selected from the group consisting of free fatty acids, triacylglycerides and ceramides.
[1] The method according to [1].
〔３〕好ましくは、上記質量分析方法が液体クロマトグラフィー−質量分析方法であり、かつ上記脂質を含む検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。 [3] The method according to [1] or [2], wherein the mass spectrometry method is preferably a liquid chromatography-mass spectrometry method, and the specimen containing the lipid is a product of liquid chromatography separation.
〔４〕好ましくは、上記脂質を含む検体が、以下を液体クロマトグラフィー分離して得られた生成物である、〔３〕記載の方法：
好ましくは、動物、植物、食品又は化粧品から調製した脂質を含む抽出液、
より好ましくは、皮膚角質層又は毛から調製した脂質を含む抽出液。
[4] The method according to [3], wherein the lipid-containing specimen is preferably a product obtained by liquid chromatography separation of the following:
Preferably, an extract containing lipids prepared from animals, plants, food or cosmetics,
More preferably, an extract containing lipids prepared from the skin stratum corneum or hair.
〔５〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーが、順相液体クロマトグラフィー又は逆相液体クロマトグラフィーである、〔３〕又は〔４〕記載の方法。 [5] The method according to [3] or [4], wherein the liquid chromatography is preferably normal phase liquid chromatography or reverse phase liquid chromatography.
〔６〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、上記液体クロマトグラフィーの移動相に添加され、該炭酸水素アンモニウムを含有するクロマトグラフィー分離生成物が調製される、〔３〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
[6] Preferably, the ammonium hydrogen carbonate is added to the mobile phase of the liquid chromatography to prepare a chromatographic separation product containing the ammonium hydrogen carbonate, any one of [3] to [5] The method according to
〔７〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、上記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、〔３〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。 [7] The method according to any one of [3] to [5], wherein the ammonium hydrogen carbonate is preferably added to the product of the liquid chromatography separation.
〔８〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムと上記脂質を含む検体との混液がイオン化に供される、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。 [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein a mixed solution of the ammonium hydrogen carbonate and the specimen containing the lipid is preferably subjected to ionization.
〔９〕好ましくは、上記質量分析において、
トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+イオンを検出するか、
遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-イオンを検出するか、又は
セラミドの［Ｍ−Ｈ］-イオン又は［Ｍ＋Ｈ］+を検出する、
〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。
[9] Preferably, in the mass spectrometry,
Detecting the [M + NH 4 ] + ion of the triacylglyceride,
Detecting [M−H] − ions of free fatty acids or detecting [M−H] − ions or [M + H] + of ceramides,
The method according to any one of [1] to [8].
〔１０〕エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化を促進するための方法であって、該検体に炭酸水素アンモニウムを添加することを含む、方法。 [10] A method for promoting ionization of lipids in a sample for mass spectrometry in ionization by a multi-ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both, Adding.
〔１１〕上記脂質が、
好ましくは、脂肪酸含有化合物、コレステロール及びコレステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、セラミド、コレステロール及び硫酸コレステロールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１０〕記載の方法。
[11] The lipid is
Preferably, it is at least one selected from the group consisting of fatty acid-containing compounds, cholesterol and cholesterol derivatives,
More preferably, it is at least one selected from the group consisting of free fatty acids, monoacyl glycerides, diacyl glycerides, triacyl glycerides, ceramides, cholesterol and cholesterol sulfate,
More preferably, it is at least one selected from the group consisting of free fatty acids, triacylglycerides and ceramides.
[10] The method according to [10].
〔１２〕好ましくは、上記検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。 [12] The method according to [10] or [11], wherein the specimen is preferably a product of liquid chromatography separation.
〔１３〕好ましくは、上記検体が、以下を液体クロマトグラフィー分離して得られた生成物である、〔１２〕記載の方法：
好ましくは、動物、植物、食品又は化粧品から調製した脂質を含む抽出液、
より好ましくは、皮膚角質層又は毛から調製した脂質を含む抽出液。
[13] The method according to [12], wherein the specimen is preferably a product obtained by liquid chromatography separation of the following:
Preferably, an extract containing lipids prepared from animals, plants, food or cosmetics,
More preferably, an extract containing lipids prepared from the skin stratum corneum or hair.
〔１４〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーが、順相液体クロマトグラフィー又は逆相液体クロマトグラフィーである、〔１２〕又は〔１３〕記載の方法。 [14] The method according to [12] or [13], wherein the liquid chromatography is preferably normal phase liquid chromatography or reverse phase liquid chromatography.
〔１５〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、上記液体クロマトグラフィーの移動相に添加され、該炭酸水素アンモニウムを含有するクロマトグラフィー分離生成物が調製される、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
[15] Preferably, the ammonium hydrogen carbonate is added to the mobile phase of the liquid chromatography to prepare a chromatographic separation product containing the ammonium hydrogen carbonate, any one of [12] to [14] The method according to
〔１６〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、上記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。 [16] The method according to any one of [12] to [14], wherein the ammonium hydrogen carbonate is preferably added to the product of the liquid chromatography separation.
〔１７〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムと上記検体との混液を調製することを含む、〔１０〕〜〔１６〕のいずれか１項記載の方法。 [17] The method according to any one of [10] to [16], preferably comprising preparing a mixed solution of the ammonium hydrogen carbonate and the specimen.
〔１８〕好ましくは、上記質量分析が、
トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+イオンを検出するための質量分析であるか、
遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-イオンを検出するための質量分析であるか、又は
セラミドの［Ｍ−Ｈ］-イオン又は［Ｍ＋Ｈ］+を検出するための質量分析である、
〔１０〕〜〔１７〕のいずれか１項記載の方法。
[18] Preferably, the mass spectrometry is
Is mass spectrometry for detecting [M + NH 4 ] + ions of triacylglycerides,
Mass spectrometry for detecting [M−H] − ions of free fatty acids, or mass spectrometry for detecting [M−H] − ions or [M + H] + of ceramides.
[10] The method according to any one of [17].
〔１９〕炭酸水素アンモニウムを含有する、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化促進剤。 [19] An ionization promoter for lipids in a mass spectrometric sample in ionization with a multi-ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both, containing ammonium bicarbonate.
〔２０〕上記脂質が、
好ましくは、脂肪酸含有化合物、コレステロール及びコレステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、セラミド、コレステロール及び硫酸コレステロールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１９〕記載の脂質のイオン化促進剤。
[20] The lipid is
Preferably, it is at least one selected from the group consisting of fatty acid-containing compounds, cholesterol and cholesterol derivatives,
More preferably, it is at least one selected from the group consisting of free fatty acids, monoacyl glycerides, diacyl glycerides, triacyl glycerides, ceramides, cholesterol and cholesterol sulfate,
More preferably, it is at least one selected from the group consisting of free fatty acids, triacylglycerides and ceramides.
[19] The lipid ionization promoter according to [19].
〔２１〕好ましくは、上記検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、〔１９〕又は〔２０〕記載の脂質のイオン化促進剤。 [21] Preferably, the lipid ionization promoter according to [19] or [20], wherein the specimen is a product of liquid chromatography separation.
〔２２〕好ましくは、上記検体が、以下を液体クロマトグラフィー分離して得られた生成物である、〔２１〕記載の脂質のイオン化促進剤：
好ましくは、動物、植物、食品又は化粧品から調製した脂質を含む抽出液、
より好ましくは、皮膚角質層又は毛から調製した脂質を含む抽出液。
[22] The lipid ionization promoter according to [21], wherein the specimen is preferably a product obtained by liquid chromatography separation of the following:
Preferably, an extract containing lipids prepared from animals, plants, food or cosmetics,
More preferably, an extract containing lipids prepared from the skin stratum corneum or hair.
〔２３〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーが、順相液体クロマトグラフィー又は逆相液体クロマトグラフィーである、〔２１〕又は〔２２〕記載の脂質のイオン化促進剤。 [23] The lipid ionization promoter according to [21] or [22], wherein the liquid chromatography is preferably normal phase liquid chromatography or reverse phase liquid chromatography.
〔２４〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーの移動相に添加される、〔２１〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。 [24] The lipid ionization promoter according to any one of [21] to [23], which is preferably added to the mobile phase of the liquid chromatography.
〔２５〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、〔２１〕〜〔２４〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。 [25] The lipid ionization promoter according to any one of [21] to [24], which is preferably added to the product of the liquid chromatography separation.
〔２６〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムと上記検体との混液である、〔１９〕〜〔２５〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。 [26] The lipid ionization promoter according to any one of [19] to [25], which is preferably a mixed solution of the ammonium hydrogen carbonate and the specimen.
〔２７〕好ましくは、正イオンモードでのイオン化において［Ｍ＋Ｈ］+又は［Ｍ＋ＮＨ4］+の生成を促進する、〔１９〕〜〔２６〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。 [27] The lipid ionization promoter according to any one of [19] to [26], which preferably promotes the production of [M + H] + or [M + NH 4 ] + in ionization in a positive ion mode.
〔２８〕好ましくは、正イオンモードでのイオン化において、トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+へのイオン化を促すか、あるいはセラミドの［Ｍ＋Ｈ］+へのイオン化を促す、〔２７〕記載の脂質のイオン化促進剤。 [28] Preferably, in ionization in positive ion mode, ionization of triacylglyceride to [M + NH 4 ] + or ionization of ceramide to [M + H] + is promoted. Ionization accelerator.
〔２９〕好ましくは、負イオンモードでのイオン化において［Ｍ−Ｈ］-の生成を促進する、〔１９〕〜〔２６〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。 [29] The lipid ionization promoter according to any one of [19] to [26], which preferably promotes the formation of [M−H] − in ionization in a negative ion mode.
〔３０〕好ましくは、負イオンモードでのイオン化において、セラミド又は遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-へのイオン化を促す、〔２９〕記載の脂質のイオン化促進剤。 [30] Preferably, the ionization promoter for lipids according to [29], which promotes ionization of ceramide or free fatty acid to [MH] − in ionization in a negative ion mode.
〔３１〕好ましくは、上記質量分析が、
トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+イオンを検出するための質量分析であるか、
遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-イオンを検出するための質量分析であるか、又は
セラミドの［Ｍ−Ｈ］-イオン又は［Ｍ＋Ｈ］+を検出するための質量分析である、
〔１９〕〜〔３０〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。
[31] Preferably, the mass spectrometry is
Is mass spectrometry for detecting [M + NH 4 ] + ions of triacylglycerides,
Mass spectrometry for detecting [M−H] − ions of free fatty acids, or mass spectrometry for detecting [M−H] − ions or [M + H] + of ceramides.
[19] The ionization promoter for lipids according to any one of [30].
〔３２〕エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化促進のための炭酸水素アンモニウムの使用。 [32] Use of ammonium bicarbonate to promote ionization of lipids in a mass spectrometric sample in ionization with a multi-ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both.
〔３３〕上記脂質が、
好ましくは、脂肪酸含有化合物、コレステロール及びコレステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、セラミド、コレステロール及び硫酸コレステロールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔３２〕記載の使用。
[33] The lipid is
Preferably, it is at least one selected from the group consisting of fatty acid-containing compounds, cholesterol and cholesterol derivatives,
More preferably, it is at least one selected from the group consisting of free fatty acids, monoacyl glycerides, diacyl glycerides, triacyl glycerides, ceramides, cholesterol and cholesterol sulfate,
More preferably, it is at least one selected from the group consisting of free fatty acids, triacylglycerides and ceramides.
[32] Use of description.
〔３４〕好ましくは、上記検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、〔３２〕又は〔３３〕記載の使用。 [34] The use according to [32] or [33], wherein the specimen is preferably a product of liquid chromatography separation.
〔３５〕好ましくは、上記検体が、以下を液体クロマトグラフィー分離して得られた生成物である、〔３４〕記載の使用：
好ましくは、動物、植物、食品又は化粧品から調製した脂質を含む抽出液、
より好ましくは、皮膚角質層又は毛から調製した脂質を含む抽出液。
[35] The use according to [34], wherein the specimen is preferably a product obtained by liquid chromatography separation of the following:
Preferably, an extract containing lipids prepared from animals, plants, food or cosmetics,
More preferably, an extract containing lipids prepared from the skin stratum corneum or hair.
〔３６〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーが、順相液体クロマトグラフィー又は逆相液体クロマトグラフィーである、〔３４〕又は〔３５〕記載の使用。 [36] The use according to [34] or [35], wherein the liquid chromatography is preferably normal phase liquid chromatography or reverse phase liquid chromatography.
〔３７〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが上記液体クロマトグラフィーの移動相に添加される、〔３４〕〜〔３６〕のいずれか１項記載の使用。 [37] The use according to any one of [34] to [36], wherein the ammonium hydrogen carbonate is preferably added to the mobile phase of the liquid chromatography.
〔３８〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが上記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、〔３４〕〜〔３６〕のいずれか１項記載の使用。 [38] The use according to any one of [34] to [36], wherein the ammonium hydrogen carbonate is preferably added to the product of the liquid chromatography separation.
〔３９〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、該炭酸水素アンモニウムと上記検体との混液として使用される、〔３２〕〜〔３８〕のいずれか１項記載の使用。 [39] The use according to any one of [32] to [38], wherein the ammonium hydrogen carbonate is preferably used as a mixed solution of the ammonium hydrogen carbonate and the specimen.
〔４０〕好ましくは、上記イオン化促進が、正イオンモードでのイオン化における［Ｍ＋Ｈ］+又は［Ｍ＋ＮＨ4］+の生成の促進である、〔３２〕〜〔３９〕のいずれか１項記載の使用。 [40] The use according to any one of [32] to [39], wherein preferably the ionization promotion is promotion of formation of [M + H] + or [M + NH 4 ] + in ionization in a positive ion mode. .
〔４１〕好ましくは、上記イオン化促進が、正イオンモードでのイオン化におけるトリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+へのイオン化の促進であるか、あるいはセラミドの［Ｍ＋Ｈ］+へのイオン化の促進である、〔４０〕記載の使用。 [41] Preferably, the ionization promotion is promotion of ionization of triacylglyceride to [M + NH 4 ] + in ionization in a positive ion mode, or promotion of ionization of ceramide to [M + H] + . [40] use.
〔４２〕好ましくは、上記イオン化促進が、負イオンモードでのイオン化における［Ｍ−Ｈ］-の生成の促進である、〔３２〕〜〔３９〕のいずれか１項記載の使用。 [42] The use according to any one of [32] to [39], wherein the ionization promotion is preferably promotion of formation of [MH] − in ionization in a negative ion mode.
〔４３〕好ましくは、上記イオン化促進が、負イオンモードでのイオン化におけるセラミド又は遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-へのイオン化の促進である、〔４２〕記載の使用。 [43] The use according to [42], wherein preferably the ionization promotion is promotion of ionization of ceramide or free fatty acid to [M−H] − in ionization in a negative ion mode.
〔４４〕好ましくは、上記質量分析が、
トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+イオンを検出するための質量分析であるか、
遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-イオンを検出するための質量分析であるか、又は
セラミドの［Ｍ−Ｈ］-イオン又は［Ｍ＋Ｈ］+を検出するための質量分析である、
〔３２〕〜〔４３〕のいずれか１項記載の使用。
[44] Preferably, the mass spectrometry is
Is mass spectrometry for detecting [M + NH 4 ] + ions of triacylglycerides,
Mass spectrometry for detecting [M−H] − ions of free fatty acids, or mass spectrometry for detecting [M−H] − ions or [M + H] + of ceramides.
[32] Use of any one of [43].
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。 EXAMPLES Hereinafter, an Example is shown and this invention is demonstrated more concretely.
（試料）
ＴＡＧ−Ｃ４８：３及びＦＦＡ−Ｃ２４：０を各１０μｍｏｌ／Ｌ、及びＮ−アシル−ジヒドロスフィンゴシン・セラミド（以下、セラミドＮＤＳ）Ｃ４６を１μｍｏｌ／Ｌ含む、メタノール／２−プロパノール／クロロホルム＝４５／４５／１０溶液を調製した。この試料を下記実施例１又は２の条件でＬＣ−ＭＳ分析した。
(sample)
TAG-C48: 3 and FFA-C24: 0 each 10 μmol / L and N-acyl-dihydrosphingosine ceramide (hereinafter referred to as ceramide NDS)
（実施例１）
ＬＣ−Ｑ−ＭＳ分析
（装置）
６１３０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
（クロマトグラフィー分離）
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ ２．１ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（化学物質評価研究機構）（４０℃）
移動相：Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌイオン化促進剤含有メタノール／水＝１／１溶液
移動相：Ｂ）２−プロパノール
グラジエント：Ａ１００％（０ｍｉｎ）→Ｂ５０％（５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（３５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（４５ｍｉｎ）
移動相流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
平衡化時間：１０ｍｉｎ
イオン化促進剤：炭酸水素アンモニウム
（質量分析）
イオン化法：ＥＳＩ（Ｇ１９５８−６５５３８）
測定：Ｓｃａｎ
極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ＆Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
質量範囲：２００−１２００
フラグメンター電圧：２００Ｖ
キャピラリー電圧：３５００Ｖ
ネブライザー圧力：２０ｐｓｉｇ
乾燥ガス温度：３５０℃
乾燥ガス流量：１０Ｌ／ｍｉｎ
Example 1
LC-Q-MS analysis (apparatus)
6130 Quadrupole LC / MS (Agilent Technologies)
(Chromatographic separation)
Column: L-column ODS 2.1 mmi. d. × 150mm (Chemical Substance Evaluation and Research Organization) (40 ℃)
Mobile phase: A) 10 mmol / L ionization promoter-containing methanol / water = 1/1 solution Mobile phase: B) 2-propanol Gradient: A 100% (0 min) → B 50% (5 min) → B 100% (35 min) → B 100% (45min)
Mobile phase flow rate: 0.2 mL / min
Equilibration time: 10 min
Ionization accelerator: ammonium bicarbonate (mass spectrometry)
Ionization method: ESI (G1958-65538)
Measurement: Scan
Polarity: Negative & Positive
Mass range: 200-1200
Fragmentor voltage: 200V
Capillary voltage: 3500V
Nebulizer pressure: 20 psig
Drying gas temperature: 350 ° C
Dry gas flow rate: 10 L / min
（比較例１）
実施例１と同様の条件で、ただしイオン化促進剤として酢酸アンモニウムを用いて、試料をＬＣ−ＭＳ分析した。
(Comparative Example 1)
The sample was subjected to LC-MS analysis under the same conditions as in Example 1, except that ammonium acetate was used as the ionization accelerator.
（実施例２）
ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ分析
（装置）
ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
（クロマトグラフィー分離）
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ ２．１ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（化学物質評価研究機構）（４０℃）
移動相：Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌイオン化促進剤含有メタノール／水＝１／１溶液
移動相：Ｂ）２−プロパノール
グラジエント：Ａ１００％（０ｍｉｎ）→Ｂ５０％（５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（３５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（４５ｍｉｎ）
移動相流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
平衡化時間：１０ｍｉｎ
イオン化促進剤：炭酸水素アンモニウム
（質量分析）
イオン化法：ＥＳＩ
測定：Ｓｃａｎ
極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ＆Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
質量範囲：２００−１２００
コーン電圧：２０Ｖ
Ａｐｅｒｔｕｒｅ電圧：１０Ｖ
キャピラリー電圧：２０００Ｖ
脱溶媒ガス＝６００Ｌ／Ｈｒ（３５０℃）
コーンガス＝５０Ｌ／Ｈｒ
イオン源ヒーター＝１２０℃
(Example 2)
LC-TOF-MS analysis (apparatus)
LCT Premier XE (Waters Corporation)
(Chromatographic separation)
Column: L-column ODS 2.1 mmi. d. × 150mm (Chemical Substance Evaluation and Research Organization) (40 ℃)
Mobile phase: A) 10 mmol / L ionization promoter-containing methanol / water = 1/1 solution Mobile phase: B) 2-propanol Gradient: A 100% (0 min) → B 50% (5 min) → B 100% (35 min) → B 100% (45min)
Mobile phase flow rate: 0.2 mL / min
Equilibration time: 10 min
Ionization accelerator: ammonium bicarbonate (mass spectrometry)
Ionization method: ESI
Measurement: Scan
Polarity: Negative & Positive
Mass range: 200-1200
Cone voltage: 20V
Aperture voltage: 10V
Capillary voltage: 2000V
Desolvation gas = 600 L / Hr (350 ° C)
Corn gas = 50L / Hr
Ion source heater = 120 ° C
（比較例２）
実施例２と同様の条件で、ただしイオン化促進剤として酢酸アンモニウムを用いて、試料をＬＣ−ＭＳ分析した。
(Comparative Example 2)
The sample was subjected to LC-MS analysis under the same conditions as in Example 2, except that ammonium acetate was used as the ionization accelerator.
実施例１における試料のクロマトグラフィー分離で検出されたトリグリセリドとセラミドＮＤＳの抽出イオンクロマトグラムを図１に示す。図２〜４は、実施例１及び比較例１における質量分析結果を表す。図２は、トリグリセリド（正イオンモード）、図３はセラミドＮＤＳ（正イオンモード）、図４はセラミドＮＤＳ（負イオンモード）のスペクトルデータを表す。各図とも、Ａは比較例１（イオン化促進剤に酢酸アンモニウムを使用）、Ｂは実施例１（イオン化促進剤に炭酸水素アンモニウムを使用）を表し、各スペクトルの横には検出されたイオン種とｍ／ｚ値が、括弧内にはスペクトル強度が記載されている。 FIG. 1 shows an extracted ion chromatogram of triglyceride and ceramide NDS detected by chromatographic separation of the sample in Example 1. 2 to 4 show mass analysis results in Example 1 and Comparative Example 1. FIG. FIG. 2 shows triglyceride (positive ion mode), FIG. 3 shows ceramide NDS (positive ion mode), and FIG. 4 shows ceramide NDS (negative ion mode) spectral data. In each figure, A represents Comparative Example 1 (using ammonium acetate as an ionization accelerator) and B represents Example 1 (using ammonium hydrogen carbonate as an ionization accelerator), and the detected ion species beside each spectrum. And the m / z value, and the spectral intensity is described in parentheses.
また、実施例２における試料のクロマトグラフィー分離で検出されたトリグリセリド、セラミドＮＤＳ及び遊離脂肪酸の抽出イオンクロマトグラムを図５に示す。図６〜９は、実施例２及び比較例２における質量分析結果を表す。図６は、トリグリセリド（正イオンモード）、図７はセラミドＮＤＳ（正イオンモード）、図８はセラミドＮＤＳ（負イオンモード）、図９は遊離脂肪酸（負イオンモード）のスペクトルデータを表す。各図とも、Ａは比較例２（イオン化促進剤に酢酸アンモニウムを使用）、Ｂは実施例２（イオン化促進剤に炭酸水素アンモニウムを使用）を表し、各スペクトルの横には検出されたイオン種とｍ／ｚ値が、括弧内にはスペクトル強度が記載されている。 Further, FIG. 5 shows extracted ion chromatograms of triglyceride, ceramide NDS and free fatty acid detected by chromatographic separation of the sample in Example 2. 6 to 9 show mass spectrometry results in Example 2 and Comparative Example 2. FIG. FIG. 6 shows triglyceride (positive ion mode), FIG. 7 shows ceramide NDS (positive ion mode), FIG. 8 shows ceramide NDS (negative ion mode), and FIG. 9 shows free fatty acid (negative ion mode) spectral data. In each figure, A represents Comparative Example 2 (using ammonium acetate as an ionization accelerator), B represents Example 2 (using ammonium hydrogen carbonate as an ionization accelerator), and the detected ion species beside each spectrum. And the m / z value, and the spectral intensity is described in parentheses.
実施例１及び２では、比較例１及び２と比較して、検出対象の各脂質分子種が特定の１種類のイオン種に限定してイオン化されており、かつそのスペクトル強度も増加していた。さらに、エレクトロスプレーイオン化及び大気圧化学イオン化の両方を誘起するマルチイオン源を用いた試験〔カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ ２．１ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、移動相：Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ 炭酸水素アンモニウム含有メタノール／水＝１／１溶液、移動相：Ｂ）２−プロパノール、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍｕｌｔｉ ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ（６１３０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇ１９７８Ｂ）：ＥＳＩ／Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ：ＡＰＣＩ／Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ〕においても、特定の１種類のイオン種に限定したイオン化、およびそのスペクトル強度の増加が観察された。したがって、イオン化促進剤として炭酸水素アンモニウムを使用することで、質量分析における目的分子からの複数種のイオンの生成が抑制され、目的とする脂質の検出の感度が向上する。また、目的分子が多種類存在する際に、各目的分子において生成されたイオンのｍ／ｚの重複が解消され、各目的分子の検出が容易になる。 In Examples 1 and 2, as compared with Comparative Examples 1 and 2, each lipid molecular species to be detected was limited to one specific ion species, and its spectral intensity was also increased. . Furthermore, a test using a multi-ion source that induces both electrospray ionization and atmospheric pressure chemical ionization [column: L-column ODS 2.1 mm i. d. × 150 mm, mobile phase: A) 10 mmol / L ammonium hydrogen carbonate-containing methanol / water = 1/1 solution, mobile phase: B) 2-propanol, flow rate: 0.2 mL / min, Multiion source (6130 Quadrupole LC / MS) (Agilent Technologies, G1978B): ESI / Negative ion mode: APCI / Positive ion mode], ionization limited to one specific ion species and an increase in its spectral intensity were also observed. Therefore, by using ammonium hydrogen carbonate as an ionization accelerator, the generation of plural types of ions from the target molecule in mass spectrometry is suppressed, and the sensitivity of detection of the target lipid is improved. Further, when there are many types of target molecules, m / z overlap of ions generated in each target molecule is eliminated, and detection of each target molecule becomes easy.
Claims (17)
イオン化した脂質を質量分析により検出すること、
を含む、脂質の質量分析方法。 Subjecting the lipid-containing analyte to ionization with a multi-ion source that induces electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, or both in the presence of ammonium bicarbonate; and
Detecting ionized lipids by mass spectrometry;
A method for lipid mass spectrometry.
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