JP2017043595A - Monoclonal anti-ages antibody and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、最終糖化産物（AGEs）の１種であるメチルグリオキサール−ハイドロイミダゾロン（MG-H1）に特異的に結合するモノクローナル抗AGEs抗体及びその製造方法に関し、より詳細には、MG-H1に特異的に結合するモノクローナル抗AGEs抗体及びその製造方法、並びにその抗体を産生するハイブリドーマ、並びにその抗体の使用方法に関する。 The present invention relates to a monoclonal anti-AGE antibody that specifically binds to methylglyoxal-hydroimidazolone (MG-H1), which is one of the final glycation products (AGEs), and a method for producing the same, and more particularly to MG-H1. The present invention relates to a monoclonal anti-AGE antibody that specifically binds to A, and a method for producing the same, a hybridoma that produces the antibody, and a method for using the antibody.
タンパク質中に存在するアミノ基とグルコース等の還元糖のアルデヒド基とが、非酵素的に反応すると糖化産物が形成される。この反応は、非酵素的糖化反応又はメイラード反応と称される。非酵素的糖化反応は、生体内においても起きている。非酵素的糖化反応は、シッフ塩基を経てアマドリ転位生成物が形成される前期反応と、複雑な開裂や縮合等が起こる後期反応との２段階で起こると考えられ、後期反応では、最終糖化産物(=AGEs:Advanced Glycation End Products)と呼ばれる、単一ではない様々な物質が生成する。 When an amino group present in a protein and an aldehyde group of a reducing sugar such as glucose react non-enzymatically, a glycated product is formed. This reaction is referred to as a non-enzymatic saccharification reaction or Maillard reaction. Non-enzymatic saccharification occurs also in vivo. The non-enzymatic saccharification reaction is considered to occur in two stages, a first reaction in which an Amadori rearrangement product is formed via a Schiff base and a second reaction in which complex cleavage or condensation occurs. In the second reaction, the final glycation product Various non-single substances called (= AGEs: Advanced Glycation End Products) are generated.
AGEsについては、糖尿病や老化に伴う各種の症状や疾患等との関連性が報告されている。例えば、AGEsが、糖尿病における腎障害や網膜症にAGEsの蓄積が関係していることや、加齢で認められる種々の組織障害、例えば、皮膚、血管壁、関節等の結合組織の硬化に関連し、皮膚の肥厚、しわの形成、動脈硬化、関節炎等の原因になり得ることや、アルツハイマー病におけるβ−アミロイドペプチドの脳内蓄積にAGEsが関与していること等が報告されている。また、骨粗鬆症等の骨の強度の低下において、骨中のコラーゲンの糖化（AGEs化）が原因の一つであることが報告されている。さらに、AGEsが癌疾患、例えばその増殖や転移に関与していることも示唆されている。 About AGEs, the relationship with various symptoms, diseases, etc. accompanying diabetes and aging has been reported. For example, AGEs are related to the accumulation of AGEs in renal disorders and retinopathy in diabetes, and to various tissue disorders observed with aging, such as hardening of connective tissues such as skin, blood vessel walls, and joints. However, it has been reported that it can cause skin thickening, wrinkle formation, arteriosclerosis, arthritis, and that AGEs are involved in the accumulation of β-amyloid peptide in the brain in Alzheimer's disease. In addition, it has been reported that glycation (AGEs) of collagen in bone is one of the causes in the reduction of bone strength such as osteoporosis. Furthermore, it has been suggested that AGEs are involved in cancer diseases such as their proliferation and metastasis.
AGEsと各種の疾患との関連性の究明やその予防や治療法の開発には、多様なAGEsのなかから着目した特定のAGEsを検出又は定量する技術が必要である。AGEsを検出又は定量する方法としては、高速液体クロマトグラフィー(HPLC法)やガスクロマトグラフィー質量分析法(GC/MS)法、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)法、AGEsを特異的に認識する抗AGEs抗体を用いる方法が知られている。これらの中でも、抗AGEs抗体を用いる方法は大型で高価な機器を使用しなくてもよい点で優れている。
抗AGEs抗体を用いる方法としては、例えば、特許文献１には、３，４−ジオキシグルコソン-3-エン(DGE)に由来するAGEsに特異的に反応する抗体及びそれを用いたAGEsの検出方法が記載され、特許文献２には、生体サンプル内におけるグアニジノ基由来のAGEsに特異的なモノクローナル抗体及びそれを用いたAGEsの検出方法が記載されている。また、特許文献３には、フルクトース由来のAGEに対する抗体及びそれを用いたフルクトース由来のAGEの測定方法が記載されている。
In order to investigate the relationship between AGEs and various diseases, and to develop their prevention and treatment methods, a technique for detecting or quantifying specific AGEs focused on from various AGEs is required. Methods for detecting or quantifying AGEs include high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography mass spectrometry (GC / MS), liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS / MS), and specific AGEs. There is known a method using an anti-AGE antibody that is recognized by the human body. Among these, the method using an anti-AGE antibody is excellent in that it is not necessary to use a large and expensive device.
As a method using an anti-AGE antibody, for example, Patent Document 1 discloses an antibody specifically reacting with AGEs derived from 3,4-dioxyglucosone-3-ene (DGE) and AGEs using the same. A detection method is described, and Patent Document 2 describes a monoclonal antibody specific for AGEs derived from guanidino groups in a biological sample and a method for detecting AGEs using the same. Patent Document 3 describes an antibody against fructose-derived AGE and a method for measuring fructose-derived AGE using the same.
ところで、AGEsの１種としてMG-H1が知られており、このMG-H1についても糖尿病や老化に伴う症状や疾患との関連性が報告されている。例えば、特許文献４には、糖尿病性の腎症、眼疾患、又は心血管合併症を発症するリスク又は割合の指標として、血漿から生成された２つ以上のバイオマーカーのレベルを使用するに当たり、その一つのバイオマーカーとしてMG-H1を使用することが記載されている。また、非特許文献１は、可溶性ヒト水晶体タンパク質中のメチルグリオキサール−ハイドロイミダゾロンに関し、２種の構造異性体(MG-H1,MG-H2)の濃度を測定し、他のAGEsの濃度と比較することによって、MG-H1又はMG-H2と老化や白内障との間に関連性があることを明らかにしている。 By the way, MG-H1 is known as one kind of AGEs, and this MG-H1 has also been reported to be associated with symptoms and diseases associated with diabetes and aging. For example, in US Pat. No. 6,099,096, in using the levels of two or more biomarkers generated from plasma as an indicator of the risk or rate of developing diabetic nephropathy, eye disease, or cardiovascular complications, The use of MG-H1 as one of the biomarkers is described. Non-patent document 1 relates to methylglyoxal-hydroimidazolone in soluble human lens protein and measures the concentration of two structural isomers (MG-H1, MG-H2) and compares it with the concentrations of other AGEs. It has been clarified that there is a relationship between MG-H1 or MG-H2 and aging and cataract.
しかし、このMG-H1については、抗AGEs抗体を用いて検出や定量等を行うことに言及した文献は少なく、上述した特許文献１〜３にも記載されていない。上述した特許文献４においても、個体から得た生体試料を、液体クロマトグラフィー／四重極質量分析法(LC-MS/MS)を使用した分析によりバイオマーカーのレベルを決定することが記載されている一方、抗AGEs抗体を用いて分析することは記載されていない。また、非特許文献１にも、メチルグリオキサール(MG)イミダゾロン(MG-HI,MG-H2)を、それらを特異的に認識する抗体を用いて分析することは記載されていない。
一方、非特許文献２には、メチルグリオキサール(MG)で修飾したタンパク質をマウスに免疫して得られた抗体に、エピトープがイミダゾロンである抗体が含まれることを開示されている。しかし、非特許文献２には、タンパク質に結合していないイミダゾロンを合成した後、それをタンパク質と結合して免疫原として用いることは記載されておらず、MG-H1に対する特異性や遊離体のMG-H1に対する結合能が高いモノクローナル抗体は記載されていない。
However, regarding MG-H1, there are few documents that mention detection and quantification using an anti-AGE antibody, and they are not described in Patent Documents 1 to 3 described above. Patent Document 4 described above also describes that the level of a biomarker is determined by analyzing a biological sample obtained from an individual using liquid chromatography / quadrupole mass spectrometry (LC-MS / MS). On the other hand, analysis using an anti-AGE antibody is not described. Further, Non-Patent Document 1 does not describe that methylglyoxal (MG) imidazolone (MG-HI, MG-H2) is analyzed using an antibody that specifically recognizes them.
On the other hand, Non-Patent Document 2 discloses that an antibody obtained by immunizing a mouse with a protein modified with methylglyoxal (MG) includes an antibody whose epitope is imidazolone. However, Non-Patent Document 2 does not describe that imidazolone that is not bound to a protein is synthesized and then bound to the protein and used as an immunogen. Monoclonal antibodies with high binding ability to MG-H1 are not described.
なお、特許文献５には、糖尿病で特徴的な高血糖状態により形成される糖化タンパク質が、動脈硬化症等の心血管疾患、アルツハイマー、がんの増殖及び転移、炎症反応などの合併症の重要な原因となり得ることが記載されており、また、そのような糖化タンパク質を、ガレクチンと呼ばれるレクチンの糖鎖に対する結合活性を用いて検出することが記載されている。 In Patent Document 5, a glycated protein formed by a hyperglycemic state characteristic of diabetes is important for complications such as cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, Alzheimer's, cancer growth and metastasis, and inflammatory reaction. It is described that such a glycated protein can be detected using the binding activity of a lectin called a galectin to a sugar chain.
本発明の課題は、MG-H1に対して高い特異性を有するモノクローナル抗AGEs抗体を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a monoclonal anti-AGE antibody having high specificity for MG-H1.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、タンパク質に結合していないMG-H1を合成した後、それをタンパク質と結合して抗原として用いることにより、MG-H1に対する特異性や結合能の高いモノクローナル抗体が得られることを知見した。
本発明は、上記の知見に基づきなされたもので、最終糖化産物（AGEs）に対するモノクローナル抗体であって、MG-H1に対して特異的に結合する、モノクローナル抗AGEs抗体を提供するものである。
また、本発明は、タンパク質に結合していない遊離体のMG-H1を合成する工程、
合成したMG-H1を、クロスリンカーを用いてタンパク質に結合する工程、及び、
MG-H1が結合したタンパク質を抗原として動物を免疫する工程を具備する、モノクローナル抗AGEs抗体の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記のモノクローナル抗AGEs抗体を産生するハイブリドーマを提供するものである。
また、本発明は、前記のモノクローナル抗AGEs抗体を使用して、AGEsであるMG-H1を検出及び／又は定量するモノクローナル抗AGEs抗体の使用方法を提供するものである。
As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventors have synthesized MG-H1 that is not bound to a protein, and then bound it to a protein and used it as an antigen. It was found that a monoclonal antibody having high ability and binding ability can be obtained.
The present invention has been made based on the above findings and provides a monoclonal anti-AGE antibody that specifically binds to MG-H1, which is a monoclonal antibody against the final glycation products (AGEs).
The present invention also includes a step of synthesizing a free MG-H1 that is not bound to a protein,
Binding the synthesized MG-H1 to a protein using a crosslinker; and
The present invention provides a method for producing a monoclonal anti-AGE antibody comprising a step of immunizing an animal using a protein to which MG-H1 is bound as an antigen.
The present invention also provides a hybridoma that produces the monoclonal anti-AGE antibody.
The present invention also provides a method for using a monoclonal anti-AGE antibody that detects and / or quantifies MG-H1, which is an AGE, using the monoclonal anti-AGE antibody described above.
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、MG-H1に対する高い特異性及び結合能を有しており、MG-H1の検出又は定量に好ましく用いられ、例えばMG-H1に関係して生じる各種の症状や疾患の、研究、予防及び治療等に有用である。また、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、遊離体のMG-H1に対しても高い結合能を示し、例えば血清中の遊離体のMG-H1の検出又は定量への適用の可能性も有している。 The monoclonal anti-AGE antibody of the present invention has high specificity and binding ability to MG-H1, and is preferably used for detection or quantification of MG-H1, for example, various symptoms or symptoms caused by MG-H1 Useful for research, prevention and treatment of diseases. In addition, the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention exhibits high binding ability to free MG-H1, and has a possibility of application to detection or quantification of free MG-H1 in serum, for example. ing.
以下、本発明をその好ましい実施形態（態様）に基づいて説明する。
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、最終糖化産物（AGEs）に対する抗体であって、MG-H1に対して特異的に結合するものである。本発明における「MG-H1」は、AGEsの前駆体であるメチルグリオキサール(MG)が、タンパク質中のアルギニン残基等の非遊離のアルギニン又は遊離のアルギニンと反応して生じた非遊離体又は遊離体のMG-H1であり、「MG-H1に対して特異的に結合する」とは、少なくとも非遊離体のMG-H1を認識して反応する一方、MG-H1以外のAGEであって既知のAGEs構造である、カルボキシメチルアルギニン(CMA：Nω-(carboxymethyl)arginine)、カルボキシメチルリジン(CML：Nε-(Carboxymethyl)lysine)及びカルボキシエチルリジン(CEL：Nε-(carboxyethyl)lysine)のいずれとも反応しないか、それらに対する反応性がいずれも非遊離体のMG-H1に対する反応性に対して有意に低いことを意味する。
Hereinafter, the present invention will be described based on preferred embodiments (modes).
The monoclonal anti-AGE antibody of the present invention is an antibody against final glycation products (AGEs) and specifically binds to MG-H1. In the present invention, “MG-H1” is a non-free product or a free product produced by the reaction of methylglyoxal (MG), which is a precursor of AGEs, with non-free arginine or free arginine such as arginine residues in proteins. MG-H1 of the body, and “specifically binds to MG-H1” means that it reacts by recognizing at least non-free MG-H1 while it is AGE other than MG-H1 Any of carboxymethylarginine (CMA: Nω- (carboxymethyl) arginine), carboxymethyllysine (CML: Nε- (carboxyethyl) lysine) and carboxymethyllysine (CEL) It means no reaction or any reactivity to them is significantly lower than the reactivity to non-free MG-H1.
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、タンパク質に結合していない遊離体のMG-H1に対する結合能を有する。遊離体のMG-H1に対する結合能を有すると、例えば競合ELISAで使用可能となる。競合的阻害アッセイにおいては、例えばマイクロプレートのウェル（穴）に非遊離体のMG-H1が結合した蛋白を固定しておき、そのMG-H1に対する抗体の結合が遊離体のMG-H1を共存させることにより阻害されるか否かを調べ、阻害される場合には遊離体のMG-H1に対する結合能を有し、阻害されない場合にはMG-H1に対する結合能を有しないと判断する。 The monoclonal anti-AGE antibody of the present invention has a binding ability to free MG-H1 which is not bound to a protein. If the free form has the ability to bind to MG-H1, it can be used, for example, in competitive ELISA. In competitive inhibition assays, for example, a protein bound to non-free MG-H1 is immobilized in a well (well) of a microplate, and the binding of the antibody to MG-H1 coexists with free MG-H1. It is determined whether or not it is inhibited, and if it is inhibited, it has a binding ability to free MG-H1, and if it is not inhibited, it is judged not to have a binding ability to MG-H1.
タンパク質に結合していない遊離体のMG-H1は、ペプチドを含めてタンパク質に結合していないMG-H1を意味し、ペプチド結合を有しないアルギニンのメチルグリオキサール(MG)修飾物である。即ち、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、好ましくは、タンパク質に結合したMG-H1のみならず、ペプチド及び蛋白の何れにも結合していない遊離体のMG-H1に対する反応性も有している。 Free MG-H1 not bound to protein means MG-H1 not bound to protein including peptide, and is a methylglyoxal (MG) modified product of arginine having no peptide bond. That is, the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention preferably has reactivity not only with MG-H1 bound to protein but also with free MG-H1 not bound to any peptide or protein. .
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、タンパク質に結合していない遊離体のMG-H1を合成した後、その合成したMG-H1をタンパク質に結合して得られる付加体を、免疫原として動物に免疫することにより得られる。本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、斯かる方法で調製することにより、タンパク質をメチルグリオキサールと反応させて得た免疫原で同動物を免疫する場合に比べて、MG-H1に対する特異性及び／又は遊離体のMG-H1に対する結合能が高いものとなる。 The monoclonal anti-AGE antibody of the present invention synthesizes free MG-H1 that is not bound to a protein, and then immunizes an animal with an adduct obtained by binding the synthesized MG-H1 to the protein as an immunogen. Can be obtained. The monoclonal anti-AGE antibody of the present invention is prepared by such a method, and thus has specificity for MG-H1 and / or compared with the case of immunizing the same animal with an immunogen obtained by reacting the protein with methylglyoxal. The binding capacity of the free form to MG-H1 is high.
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、クラスがIgGである。
また、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体としては、本明細書の実施例に記載した抗体１〜３が挙げられる。抗体１及び２を産生するハイブリドーマは、２０１４年７月１５日付け、抗体３を産生するハイブリドーマは、２０１５年６月５日付けで、独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託されており、それぞれの受託番号は下記の通りである。
抗体１を産生するハイブリドーマ（ＯＹＣ１１１）：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１８９８
抗体２を産生するハイブリドーマ（ＯＹＣ１１２）：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１８９９
抗体３を産生するハイブリドーマ（ＯＹＣ１１３）：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２０６４
The monoclonal anti-AGE antibody of the present invention has an IgG class.
Examples of the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention include antibodies 1 to 3 described in Examples of the present specification. The hybridoma producing antibodies 1 and 2 was deposited on July 15, 2014, and the hybridoma producing antibody 3 was deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation on June 5, 2015. The respective accession numbers are as follows.
Hybridoma producing antibody 1 (OYC111): accession number NITE P-1898
Hybridoma producing antibody 2 (OYC112): accession number NITE P-1899
Hybridoma producing antibody 3 (OYC113): accession number NITE P-2064
以下、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体の好ましい製造方法について説明する。
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体の好ましい製造方法は、下記工程（１）〜（３）を具備するとともに、モノクローナル抗体の製法において常法である下記工程（４）を具備する。
（１）タンパク質に結合していない遊離体のMG-H1を合成する工程
（２）合成したMG-H1を、クロスリンカーを用いてタンパク質に結合する工程
（３）MG-H1が結合したタンパク質を抗原として動物を免疫する工程
（４）免疫した動物の抗体産生細胞を用いて、モノクローナル抗AGEs抗体を産生するハイブリドーマを作製する工程
Hereinafter, a preferred method for producing the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention will be described.
A preferred method for producing a monoclonal anti-AGE antibody of the present invention comprises the following steps (1) to (3), and further comprises the following step (4) which is a conventional method for producing a monoclonal antibody.
(1) Step of synthesizing free MG-H1 not bound to protein (2) Step of binding synthesized MG-H1 to protein using crosslinker (3) Protein bound to MG-H1 Step of immunizing animal as antigen (4) Step of producing a hybridoma that produces monoclonal anti-AGE antibody using antibody-producing cells of the immunized animal
以下、工程（１）〜（４）について説明する。
〔工程（１）：遊離体のMG-H1の調製工程〕
前記工程（１）は、遊離体のMG-H1の調製工程であり、好ましくは、メチルグリオキサールとアルギニンとを混合し、非酵素的糖化反応により下記式（１）で表される遊離体のMG-H1を生成させる。
[Step (1): Preparation of free MG-H1]
The step (1) is a step of preparing a free MG-H1, preferably a mixture of methylglyoxal and arginine, and a free MG represented by the following formula (1) by a non-enzymatic saccharification reaction. -H1 is generated.
より具体的には、メチルグリオキサールとアルギニンとを混合し、例えば水酸化ナトリウム等のアルカリでｐＨを１０以上に調整して、３７℃の温度で、１時間インキュベートすることにより、上記構成の遊離体のMG-H1を生じさせることができる。 More specifically, by mixing methylglyoxal and arginine, adjusting the pH to 10 or more with an alkali such as sodium hydroxide, and incubating for 1 hour at a temperature of 37 ° C. MG-H1 can be produced.
メチルグリオキサール(MG)とアルギニンとを反応させて得られる、メチルグリオキサール由来のハイドロイミダゾロンは、以下の３つの構造異性体を有する。MG-H1は、他の構造異性体が混在した状態で用いることもできるが、MG-H1を単独で用いることが、製造効率や遊離体のMG-H1に対する特異性の向上の点から好ましい。MG-H1の構造は、例えば、液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS)により確認することができる。
MG-H1：Ｎδ-(5-ヒドロ-5-メチル-4-イミダゾロン-2-イル)-オルニチン
MG-H2：2-アミノ-5-(2-アミノ-5-ヒドロ-5-メチル-4-イミダゾロン-1-イル)ヘ゜ンタン酸
MG-H3：2-アミノ-5-(2-アミノ-4-ヒドロ-4-メチル-5-イミダゾロン-1-イル)ヘ゜ンタン酸
Methylglyoxal-derived hydroimidazolone obtained by reacting methylglyoxal (MG) with arginine has the following three structural isomers. MG-H1 can be used in a state where other structural isomers are mixed, but it is preferable to use MG-H1 alone from the viewpoint of improvement in production efficiency and specificity of free form to MG-H1. The structure of MG-H1 can be confirmed by, for example, a liquid chromatograph mass spectrometer (LC-MS).
MG-H1: Nδ- (5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl) -ornithine
MG-H2: 2-amino-5- (2-amino-5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-1-yl) heptanoic acid
MG-H3: 2-amino-5- (2-amino-4-hydro-4-methyl-5-imidazolon-1-yl) heptanoic acid
合成した遊離体のMG-H1は、適宜の手段により精製する。
合成した遊離体のMG-H1を高純度のものとすることは、得られるモノクローナル抗体のMG-H1に対する特異性及び／又は遊離体のMG-H1に対する結合能を向上させる観点から好ましい。精製の方法は、各種公知の方法を採用することができ、例えば、液体クロマトグラフィーが好ましく用いられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、分子排斥クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられ、これらは１種を単独で行っても良いし同種又は異種の２種以上を順次行っても良い。
合成した遊離体のMG-H1は、純度が９９質量％以上、より好ましくは９９．９質量％となるまで精製して次工程に用いることが好ましい。なお、本発明において、MG-H1は、ナトリウム塩、塩酸塩等の塩であっても良いし、塩でなくても良い。
The synthesized free MG-H1 is purified by an appropriate means.
Making the synthesized free form MG-H1 highly pure is preferable from the viewpoint of improving the specificity of the obtained monoclonal antibody for MG-H1 and / or the binding ability of the free form to MG-H1. Various known methods can be employed as the purification method, and for example, liquid chromatography is preferably used. Examples of liquid chromatography include ion exchange chromatography, adsorption chromatography, distribution chromatography, molecular exclusion chromatography, affinity chromatography and the like, and these may be performed alone or in the same or different types. The above may be performed sequentially.
The synthesized free MG-H1 is preferably purified to 99% by mass or more, more preferably 99.9% by mass, and used in the next step. In the present invention, MG-H1 may be a salt such as sodium salt or hydrochloride, or may not be a salt.
〔工程（２）：抗原の調製工程〕
前記工程（２）は、免疫原の調製工程であり、単独では免疫原性（免疫誘導能）が低い遊離体のMG-H1をタンパク質に結合して充分な免疫原性を有する抗原とする。MG-H1を結合させるタンパク質としては、キャリアタンパク質として公知の各種のものを特に制限なく用いることができ、例えば血清アルブミン等のアルブミンや、ヘモシアニン、ミオグロビン等が挙げられる。また、タンパク質は、ウシ、ウサギ、ヒト等の哺乳動物、スカシ貝等の貝類、鶏等の鳥類等に由来するもの等を用いることができる。これらの中でも、スカシ貝ヘモシアニン(KLH)及びウシ血清アルブミン(BSA)が好ましい。これらのタンパク質は、一種を単独で又は二種以上を組み合わせて用いることもできる。
MG-H1のキャリア蛋白への結合には、クロスリンカーを用いることが好ましい。クロスリンカーとしては、各種公知のものを用いることができ、例えば、グルタルアルデヒド、EDC(1-ethy-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)、SPDP、DST、DSGなどを用いることができる。これらの中でも、グルタルアルデヒド、又はEDCを用いることが好ましい。クロスリンカーは、一種を単独で又は二種以上を組み合わせて用いることもできる。
[Step (2): Antigen preparation step]
The step (2) is a step of preparing an immunogen, and by itself, free MG-H1 having low immunogenicity (immunity induction ability) is bound to a protein to give an antigen having sufficient immunogenicity. As a protein to which MG-H1 is bound, various known proteins can be used without particular limitation, and examples thereof include albumin such as serum albumin, hemocyanin, myoglobin, and the like. Proteins derived from mammals such as cows, rabbits and humans, shells such as squash shells, birds such as chickens, and the like can be used. Among these, squash hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin (BSA) are preferable. These proteins can be used singly or in combination of two or more.
A crosslinker is preferably used for binding of MG-H1 to the carrier protein. As the crosslinker, various known ones can be used. For example, glutaraldehyde, EDC (1-ethy-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), SPDP, DST, DSG and the like can be used. Among these, it is preferable to use glutaraldehyde or EDC. A crosslinker can also be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
〔工程（３）：動物の免疫工程〕
前記工程（３）は、動物を免疫する工程であり、上述のようにして調製した、MG-H1が結合したタンパク質（付加体）を抗原としてヒト以外の動物を免疫し、その動物体内に抗体産生細胞を産生させる。本工程（３）は、上述のようにして調製した、MG-H1が結合したタンパク質（付加体）を抗原として用いる以外は、モノクローナル抗体の製法の常法に従って行うことができる。
動物の種類は、特に限定されないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類が挙げられる。マウスは、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスを用いることが、ハイブリドーマの作製に用いる骨髄腫由来の細胞株が確立している点から好ましい。免疫は、各種公知の方法により行うことができ、例えば、哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射する。免疫は、初回の免疫後に何度か繰り返し行うことが好ましく、免疫のスケジュールは、免疫する動物の種類や系統に応じて適宜に決定することができる。また、免疫応答を増強させるために、MG-H1が結合したタンパク質は、投与前又は投与時にアジュバントと混合して投与することが好ましい。アジュバントとしては、各種公知のものを用いることができる。また、例えば、初回免疫時には完全フロイントアジュバント(CFA:Complete Freund's adjuvant)を用い、２回目以降は不完全フロイントアジュバント(IFA:Incomplete Freund's adjuvant)を用いる等、２種以上のアジュバントを用いることもできる。
[Step (3): Animal immunization step]
The step (3) is a step of immunizing an animal. An animal other than a human is immunized with the protein (adduct) bound to MG-H1 prepared as described above as an antigen, and an antibody is injected into the animal body. Producing production cells. This step (3) can be performed according to a conventional method for producing a monoclonal antibody, except that a protein (adduct) bound with MG-H1 prepared as described above is used as an antigen.
Although the kind of animal is not specifically limited, A mammal is preferable. Examples of mammals include rodents such as mice, rats, and rabbits. As the mouse, it is preferable to use a BALB / C strain mouse because a cell line derived from myeloma used for producing a hybridoma has been established. Immunization can be performed by various known methods, for example, by subcutaneous, intradermal, intravenous, or intraperitoneal injection of mammals. Immunization is preferably repeated several times after the initial immunization, and the immunization schedule can be appropriately determined according to the type and strain of the animal to be immunized. In order to enhance the immune response, it is preferable to administer the protein to which MG-H1 has been bound mixed with an adjuvant before or at the time of administration. As the adjuvant, various known ones can be used. In addition, for example, complete Freund's adjuvant (CFA) can be used for the first immunization, and incomplete Freund's adjuvant (IFA) can be used for the second and subsequent times.
〔工程（４）：モノクローナル抗AGEs抗体を産生するハイブリドーマの作製工程〕
前記工程（４）においては、免疫した動物の抗体産生細胞を用いて、モノクローナル抗AGEs抗体の産生能を有するハイブリドーマを作製する。
上記の免疫後の動物は、適宜の間隔で採血し、MG-H1に対する抗体が産生されていることを確認する。抗体産生の確認には、酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫アッセイ法(RIA)、蛍光免疫測定法等の公知の分析方法を用いることができる。抗体産生の確認後、ブースト（免疫原の追加注射）を行うことも好ましい。最終免疫後、免疫した動物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞と細胞融合させる。細胞融合の方法は、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いる方法、電気刺激を与える方法等の公知の方法を用いることができる。融合細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含むＨＡＴ培地等で選択可能である。また、得られた融合細胞から、酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫アッセイ法(RIA)、蛍光免疫測定法等の公知の分析方法により、MG-H1に対する結合能を有する抗体の産生能が高い融合細胞を選択する。そして、選択した細胞を用いて、限界希釈法、軟寒天法等の公知の方法によりクローニングを行う。このようにして、MG-H1に対する特異性や遊離体のMG-H1に対する結合能の高いモノクローナル抗AGEs抗体を産生するハイブリドーマが得られる。
[Step (4): Production Step of Hybridoma Producing Monoclonal Anti-AGEs Antibody]
In the step (4), a hybridoma having the ability to produce monoclonal anti-AGE antibodies is prepared using antibody-producing cells of the immunized animal.
The immunized animals are bled at appropriate intervals to confirm that antibodies against MG-H1 are produced. For confirmation of antibody production, known analysis methods such as enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescent immunoassay can be used. It is also preferable to perform boost (additional injection of immunogen) after confirmation of antibody production. After the final immunization, spleen cells are removed from the immunized animal and fused with cells derived from myeloma. As a method for cell fusion, for example, a known method such as a polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, or a method of applying electrical stimulation can be used. The fused cells can be selected using a HAT medium containing hypoxanthine, aminopterin, thymidine, or the like. Further, from the obtained fused cells, the ability to produce an antibody capable of binding to MG-H1 by a known analysis method such as enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), or fluorescence immunoassay. Select highly fused cells. Then, using the selected cells, cloning is performed by a known method such as a limiting dilution method or a soft agar method. In this way, a hybridoma that produces a monoclonal anti-AGE antibody having high specificity for MG-H1 and binding ability to free MG-H1 can be obtained.
上記のようにして得られたハイブリドーマは、培養して増殖させ、その培養液等からモノクローナル抗AGEs抗体を分離精製することにより、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体が大量に得られる。ハイブリドーマの培養方法としては、哺乳動物の腹腔内に注射し腹水内で増殖させる方法や動物の体外で適切な培地を用いて培養する方法等の各種公知の方法を採用可能である。また、腹水や培養液または培養上清から得た抗体の精製には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を特に制限なく使用可能である。 The hybridoma obtained as described above is cultured and proliferated, and the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention is obtained in a large amount by separating and purifying the monoclonal anti-AGE antibody from the culture solution or the like. As a method for culturing the hybridoma, various known methods such as a method of injecting into the abdominal cavity of a mammal and growing it in ascites and a method of culturing using an appropriate medium outside the animal body can be adopted. In addition, for purification of antibodies obtained from ascites, culture solution or culture supernatant, known methods such as ion exchange chromatography and affinity chromatography can be used without any particular limitation.
なお、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体には、このようにして得られた抗体のほか、MG-H1の識別部位を含む該抗体の断片も含まれる。また、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、MG-H1の識別部位を含むように遺伝子組換え技術を用いて製造したキメラ抗体やヒト化抗体であっても良い。 The monoclonal anti-AGE antibody of the present invention includes not only the antibody thus obtained but also a fragment of the antibody containing the MG-H1 identification site. In addition, the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention may be a chimeric antibody or a humanized antibody produced using a gene recombination technique so as to include an MG-H1 identification site.
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、MG-H1に対する特異性及び／又は遊離体のMG-H1に対する結合能に優れているため、各種の試料（特に生体試料）中のMG-H1を高感度あるいは高精度に検出及び／又は定量可能である。本発明のモノクローナル抗AGEs抗体を用いてMG-H1を検出及び／又は定量する方法としては、モノクローナル抗体を用いた各種公知の検出及び／又は定量方法を特に制限なく採用でき、例えば、酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫アッセイ法(RIA)、発光免疫測定法、沈降法、凝集法、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリー等が挙げられる。酵素免疫測定法としては、競合阻害アッセイや競合結合アッセイを行うこともできる。 Since the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention is excellent in specificity for MG-H1 and / or binding ability to MG-H1 of a free form, MG-H1 in various samples (particularly biological samples) is highly sensitive or It can be detected and / or quantified with high accuracy. As a method for detecting and / or quantifying MG-H1 using the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention, various known detection and / or quantification methods using monoclonal antibodies can be employed without particular limitation, for example, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, precipitation, agglutination, Western blot analysis, flow cytometry and the like. As an enzyme immunoassay, a competitive inhibition assay or a competitive binding assay can also be performed.
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体を用いたMG-H1の検出や定量方法は、AGEsと各種の疾患との関連性の究明や、AGEsと関連のある疾患の診断、予防や治療法の開発等に利用することができ、例えば、検出又は定量したMG-H1を、糖尿病に伴う腎症、眼疾患、心血管合併症、前立腺癌やその他のAGEsが関連する癌疾患、又は骨粗鬆症等の骨疾患等の、発症や発症するリスクの判断の指標としたり、老化に伴い進行する各種の症状や疾患の発症や発症するリスクの判断の指標としたりすることができる。また、AGEsと関連のある各種の症状や疾患の発症や発症するリスクの判定・診断、及びそのための情報の提供、それらの症状や疾患の予防や治療法の開発にも利用可能である。 The detection and quantification method of MG-H1 using the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention is used for investigation of the relationship between AGEs and various diseases, diagnosis of diseases related to AGEs, development of prevention and treatment methods, etc. For example, detected or quantified MG-H1 can be used to treat nephropathy associated with diabetes, eye diseases, cardiovascular complications, cancer diseases related to prostate cancer and other AGEs, or bone diseases such as osteoporosis, etc. It can be used as an index for determining the risk of onset or onset, or as an index for determining the risk of developing or developing various symptoms or diseases that progress with aging. It can also be used to determine and diagnose the onset and risk of various symptoms and diseases related to AGEs, to provide information for that, and to develop prevention and treatment methods for those symptoms and diseases.
また、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体は、公知の抗体アッセイ法を行うための材料等と組合せて、生体試料中のMG-H1を検出・定量するためのキットとすることができる。このキットは、前述の各種の症状や疾患の発症やそのリスクの判断のために利用することができ、例えば前述の各種の症状や疾患の発症やそのリスクの指標・診断のために利用することができる。
本発明のモノクローナル抗AGEs抗体やそれを含むキットで検出及び／又は定量するMG-H1は、遊離体でも非遊離体でも良く、その両者であっても良い。
キットは、少なくとも本発明のモノクローナル抗AGEs抗体と、MG-H1と結合した抗体を検出する試薬を含むことが好ましい。
生体試料としては、生体から採取されたあらゆる細胞、組織、及び体液等が挙げられ、例えば、皮膚、筋肉、骨、脂肪組織、脳神経系、心臓及び血管等の循環器系、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、消化器系、胸腺、リンパ、血液、全血、血清、血漿、リンパ液、唾液、尿、腹水、喀痰等、並びにそれらの培養液物が挙げられる。生体試料は、必要に応じて、生理食塩水や水等の液体による希釈、濾過処理、ホモジネート処理等の任意の処理を行ったものを用いる。
In addition, the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention can be combined with a material for performing a known antibody assay or the like to form a kit for detecting and quantifying MG-H1 in a biological sample. This kit can be used to determine the onset and risk of the various symptoms and diseases described above. For example, the kit can be used for the onset of the above various symptoms and diseases and the indicators and diagnosis of the risks. Can do.
MG-H1 to be detected and / or quantified with the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention or a kit containing the same may be free or non-free, or both.
The kit preferably includes at least a monoclonal anti-AGE antibody of the present invention and a reagent for detecting an antibody bound to MG-H1.
Examples of the biological sample include all cells, tissues, and body fluids collected from the living body. For example, circulatory system such as skin, muscle, bone, adipose tissue, cranial nervous system, heart and blood vessels, lung, liver, spleen , Pancreas, kidney, digestive system, thymus, lymph, blood, whole blood, serum, plasma, lymph, saliva, urine, ascites, sputum and the cultures thereof. As the biological sample, a biological sample subjected to any treatment such as dilution with a liquid such as physiological saline or water, filtration treatment, homogenate treatment, or the like is used.
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited at all by these Examples.
〔遊離体のMG-H1の調製〕
（１）遊離体のMG-H1を下記方法により合成した。
1N NaOH 49mLと40%Methyl glyoxal(5.8M)862μlとを混合し、次いで、それに871mgのL-Arginine(MW=174.2)を混合して、100mM(final)L-Argineと100mM(final)Methylglyoxalの混合液50mLを調製した。その混合液を振盪させながら、37℃で1時間インキュベートした後、HClで中性にした。その後、即エバポレーターで濃縮後、水に再溶解して凍結乾燥した。
（２）合成したMG-H1の精製
合成した遊離体のMG-H1について、下記方法による２段階の精製を行った。
精製１（Dowex50カラムによる精製)
陽イオン交換樹脂を充填したカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、合成したMG-H1サンプルの１回目の精製を行った。カラムは、樹脂を充填したカラム（内径20mm、樹脂充填部の高さ20cm)を、カラムの約５倍量の10％ピリジン（超純水で調製）で洗浄した後、カラム５倍量のイオン交換水で洗浄し、次いでカラム５倍量の10％HClで洗浄した後、カラム５倍量のイオン交換水で洗浄して用いた。
このカラムに、合成したMG-H1サンプルを少量の超純水に溶かしてアプライし、カラムの３倍量の超純水を流した。次いで、10％ピリジンで溶出し、約3mlずつ分取した。ろ紙に各フラクションを10回ずつキャピラリーでスポットし0.5％ニンヒドリン溶液で検出した。ニンヒドリンで発色したフラクションでのMG-H1の存在をTLCで確認した。TLCは、シリカゲルプレートにスポットし純品もスポットして、展開溶媒（クロロホルム：MeOH:水＝2：3：1）で展開し、ドライヤーで乾燥後、ニンヒドリン試薬で発色させた。発色した部分を集めエバポレーターでピリジンをとばした後-80℃で凍らせ、凍結乾燥した。
イオン交換樹脂としては、DowexTM50(ダウ・ケミカル社)を用い、超純水としてはmilliQ水を用いた。milliQ水は、ミリポア社の超純水製造装置MilliQで製造した超純水である。
[Preparation of free MG-H1]
(1) Free MG-H1 was synthesized by the following method.
Mix 49 mL of 1N NaOH and 862 μl of 40% Methyl glyoxal (5.8 M), then mix 871 mg of L-Arginine (MW = 174.2) with 100 mM (final) L-Argine and 100 mM (final) Methylglyoxal. 50 mL of a mixed solution was prepared. The mixture was incubated for 1 hour at 37 ° C. with shaking and then neutralized with HCl. After that, it was immediately concentrated by an evaporator, redissolved in water and freeze-dried.
(2) Purification of synthesized MG-H1 The synthesized free MG-H1 was purified in two steps by the following method.
Purification 1 (purification by Dowex50 column)
The synthesized MG-H1 sample was first purified by ion exchange chromatography using a column packed with a cation exchange resin. The column was washed with a resin-filled column (inner diameter 20 mm, resin-filled portion height 20 cm) with 10% pyridine (prepared with ultrapure water), about 5 times the amount of the column, and then 5 times the amount of ion. The column was washed with exchanged water, then washed with 10% HCl in 5 times the column, and then washed with 5 times the amount of ion-exchanged water.
The synthesized MG-H1 sample was dissolved in a small amount of ultrapure water and applied to the column, and 3 times the amount of ultrapure water was poured. Next, elution was carried out with 10% pyridine, and about 3 ml each was collected. Each fraction was spotted on a filter paper 10 times with a capillary and detected with a 0.5% ninhydrin solution. The presence of MG-H1 in the fraction developed with ninhydrin was confirmed by TLC. The TLC was spotted on a silica gel plate, and a pure product was spotted, developed with a developing solvent (chloroform: MeOH: water = 2: 3: 1), dried with a drier, and developed with a ninhydrin reagent. The colored portions were collected, pyridine was removed with an evaporator, frozen at -80 ° C, and lyophilized.
As the ion exchange resin, Dowex ™ 50 (Dow Chemical Co.) was used, and milliQ water was used as the ultrapure water. milliQ water is ultrapure water produced by MilliQ ultrapure water production equipment manufactured by Millipore.
精製２（シリカゲルオープンカラムによる精製)
精製１による精製後のMG-H1サンプルについて、シリカゲルカラムを用いた液体クロマトグラフィーにより２回目の精製を行った。
シリカゲルカラムは、内径20mm、長さ50cmのガラス製カラムの底部に脱脂綿をほぐして詰め、次いで、シリカゲル（関東化学社製「シリカゲル60」）を上端からロートを用いて注入し床に軽く数回当てて空気を抜いて調製した。シリカゲル充填部の高さは44cmであった。
このシリカゲルカラムに、凍結乾燥後（１回目の精製後）のMG-H1サンプルを少量（約1mL）の超純水に溶かしてロードし、更に超純水0.5mlで容器を洗浄し、その洗浄水もロードした。そして、クロロホルム：MeOH:水＝2：3：1を注入して溶出を開始し、溶出液を分取した。各フラクションの液を、紙にスポットし、0.5％ニンヒドリンで発色させた。ニンヒドリンで発色したフラクションでのMG-H1の存在をＴＬＣで確認した。また、ＴＬＣは、シリカゲルプレートにスポットし純品もスポットし、展開溶媒（クロロホルム：MeOH:水＝2：3：1）で展開し、ドライヤーで乾燥後、ニンヒドリン試薬で発色させた。MG-H1が確認されたフラクションを集め、エバポレーターで濃縮後に-80℃で凍らせ凍結乾燥した。精製２においても超純水としては、milliQ水を用いた。
Purification 2 (Purification by silica gel open column)
The MG-H1 sample after purification by purification 1 was purified a second time by liquid chromatography using a silica gel column.
The silica gel column is packed with loose cotton padded at the bottom of a glass column with an inner diameter of 20 mm and a length of 50 cm, and then silica gel (“silica gel 60” manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) is injected from the top using a funnel and lightly applied to the floor several times. Prepared by applying air to remove air. The height of the silica gel packed part was 44 cm.
The silica gel column is loaded with the MG-H1 sample after freeze-drying (after the first purification) dissolved in a small amount (about 1 mL) of ultrapure water, and the container is further washed with 0.5 ml of ultrapure water. Water was also loaded. Then, chloroform: MeOH: water = 2: 3: 1 was injected to start elution, and the eluate was collected. The liquid of each fraction was spotted on paper and developed with 0.5% ninhydrin. The presence of MG-H1 in the fraction developed with ninhydrin was confirmed by TLC. In addition, TLC was spotted on a silica gel plate to spot a pure product, developed with a developing solvent (chloroform: MeOH: water = 2: 3: 1), dried with a drier, and developed with a ninhydrin reagent. Fractions in which MG-H1 was confirmed were collected, concentrated with an evaporator, frozen at −80 ° C. and lyophilized. Also in purification 2, milliQ water was used as ultrapure water.
（３）構造の確認
精製１及び精製２により精製したMG-H1サンプルについて、液体クロマトグラフィー／四重極質量分析(LC-MS/MS)により分析した。条件は下記の通りである。
試料インジェクション量：1μg/mlを10 μl
LC部：Accela Pump + Thermo PAL (Thermo Scientific)
カラム：ZIC(R)-HILIC 150 x 2.1 mm, 5 μm (Merck Millipore)
移動相：0.1%ギ酸水溶液および0.1%ギ酸アセトニトリルによるグラジュエント
流速： 200 μl/min
MS部：高感度定量分析用トリプル四重極質量分析計 TSQ Vantage (Thermo Scientific)
イオン化法 : Positive ESI
スプレー電圧 : 3500 Ｖ
ベポライザー温度: 200 ℃
イオントランスファーチューブ温度 : 300 ℃
コリジョンガス、圧力 : Argon、1.2 mTorr
上記分析の結果、単離された化合物は、MG-H1であることが確認された。
(3) Confirmation of structure The MG-H1 sample purified by purification 1 and purification 2 was analyzed by liquid chromatography / quadrupole mass spectrometry (LC-MS / MS). The conditions are as follows.
Sample injection volume: 10 μl of 1 μg / ml
LC section: Accela Pump + Thermo PAL (Thermo Scientific)
Column: ZIC (R) -HILIC 150 x 2.1 mm, 5 μm (Merck Millipore)
Mobile phase: gradient with 0.1% aqueous formic acid solution and 0.1% acetonitrile formic acid Flow rate: 200 μl / min
MS section: Triple quadrupole mass spectrometer for high-sensitivity quantitative analysis TSQ Vantage (Thermo Scientific)
Ionization method: Positive ESI
Spray voltage: 3500 V
Vaporizer temperature: 200 ° C
Ion transfer tube temperature: 300 ° C
Collision gas, pressure: Argon, 1.2 mTorr
As a result of the above analysis, it was confirmed that the isolated compound was MG-H1.
〔抗原の調製〕
抗原（免疫原）を調製するために、上記のようにして調製した高純度のMG-H1を、キャリアタンパク質として利用するスカシ貝ヘモシアニン（KLH）と結合させて、MG-H1結合KLHを作製した。結合方法としては、クロスリンカーとして前述したEDCを用いたEDC法を用いた。具体的方法は下記の通りである。
（MG-H1結合KLHの調製）
下記成分を下記の量ずつ上の成分から順に混和して合計1000μLの混合液に調製した。
KLH(10mg/mL) 300μL
PBS 445μL
MG-H1(1mg/100μL) 150μL (1.5mg/150μL)
NHS (5.4mg/50μL) 5μL
EDC (100mg/100μL) 100μL
各成分の詳細を以下に示す。
KLH: SIGMA社製KLH
PBS: リン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.2）
MG-H1：合成した遊離体のMG-H1（純度99％以上）
NHS: N-ヒドロキシコハク酸イミド（縮合剤）
EDC: 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド「PIERCE」
上記のようにして調製した混合液を、１時間、振盪しながらインキュベートした後、3μLの2-Mercaptoethanolを加え未反応のNHSを不活化した。そして、2LのPBSで一晩透析した。
透析後、蛋白濃度をBCA蛋白定量キット（PIERCE(登録商標）サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）で測定した。
(Preparation of antigen)
In order to prepare an antigen (immunogen), MG-H1 binding KLH was prepared by binding the high purity MG-H1 prepared as described above with mussel hemocyanin (KLH) used as a carrier protein. . As a binding method, the EDC method using the EDC described above as a crosslinker was used. The specific method is as follows.
(Preparation of MG-H1 binding KLH)
The following components were mixed in order from the above components in the following amounts in order to prepare a mixed solution of 1000 μL in total.
KLH (10mg / mL) 300μL
PBS 445μL
MG-H1 (1mg / 100μL) 150μL (1.5mg / 150μL)
NHS (5.4mg / 50μL) 5μL
EDC (100mg / 100μL) 100μL
Details of each component are shown below.
KLH: SIGMA KLH
PBS: phosphate buffered saline (pH 7.2)
MG-H1: MG-H1 of the synthesized free form (purity 99% or more)
NHS: N-hydroxysuccinimide (condensation agent)
EDC: 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide "PIERCE"
The mixture prepared as described above was incubated with shaking for 1 hour, and then 3 μL of 2-Mercaptoethanol was added to inactivate unreacted NHS. Then, it was dialyzed overnight against 2 L of PBS.
After dialysis, the protein concentration was measured with a BCA protein determination kit (PIERCE (registered trademark) Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.).
（MG-H1結合BSA、MG-H1結合HSAの調製）
KLH(10mg/mL)に代えてウシ血清アルブミン（BSA）(10mg/mL)又はヒト血清アルブミン（HSA）(10mg/mL)を用いる以外は、MG-H1結合KLHの調製と同様にして、MG-H1結合BSA（MG-BSA）及びMG-H1結合HSA（MG-HSA）を調製した。
(Preparation of MG-H1 binding BSA, MG-H1 binding HSA)
Except for using bovine serum albumin (BSA) (10 mg / mL) or human serum albumin (HSA) (10 mg / mL) instead of KLH (10 mg / mL), -H1-bound BSA (MG-BSA) and MG-H1-bound HSA (MG-HSA) were prepared.
〔皮下免疫法による免疫及びハイブリドーマの作製〕
上述のようにして調製したMG-H1結合KLHを、アジュバントとそれぞれ混合したエマルジョンを用意し6〜8週齢メスのBALB/cマウス(日本チャールス・リバー)の背部皮下に50〜100μg/匹/回で免疫した。免疫間隔は２週間に１回で合計５回実施した。アジュバントとして初回は完全フロイントアジュバント(CFA)、2回目以降は不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用した。3回目・4回目免疫の翌週に採血し、タイターチェックを実施した。タイターチェックはMG-H1結合BSAを固相にして行った。最終免疫としてリン酸緩衝生理食塩水（PBS, Phosphate buffered saline ）(-)で希釈した抗原を腹腔内に投与した。
最終免疫3〜4日後にマウスより摘出した脾臓細胞をミエローマと混合してPEG法により
細胞融合を実施した。脾臓細胞数として0.5〜1.0×105 cells/wellで96 well plateに播
種し、RPMI 1640 +10% FBS + hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) + hybridoma
cloning supplement (HCS)で培養した。
細胞融合後約2週間HAT培地により選択培養を行った。融合細胞を選択後、各ウェルから一部の培養上清をサンプリングし、MG-H1結合BSAを1μg/wellで固相したELISAによりスクリーニングを行った。二次スクリーニングとしてメチルグリオキサール修飾BSAを固相したELISAを行い、免疫抗原、メチルグリオキサール修飾BSAそれぞれで陽性のウェルを確認した。
ELISAの結果を元に選択された10ウェルの細胞を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。陽性のシングルコロニーを形成した10個のウェルを選択し、増殖能を加味して最終的に３クローンに絞った。樹立過程において使用した各種添加剤含有培養から馴化培地（RPMI1640 + 10% FBS）で増殖するよう馴化培養を行った。
[Immunization by subcutaneous immunization and preparation of hybridoma]
Prepare MG-H1-conjugated KLH prepared as described above and an emulsion each mixed with an adjuvant, and prepare 50-100 μg / mouse / back of 6-8 week old female BALB / c mice (Charles River Japan) in the back. Immunized at times. The immunization interval was performed once every two weeks for a total of 5 times. As an adjuvant, complete Freund's adjuvant (CFA) was used for the first time, and incomplete Freund's adjuvant (IFA) was used for the second and subsequent times. Blood was collected in the week following the third and fourth immunizations, and a titer check was performed. The titer check was performed using MG-H1 binding BSA as a solid phase. As the final immunization, an antigen diluted with phosphate buffered saline (PBS) (-) was intraperitoneally administered.
Spleen cells excised from mice 3 to 4 days after the final immunization were mixed with myeloma and cell fusion was performed by the PEG method. RPMI 1640 + 10% FBS + hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) + hybridoma seeded in 96-well plate at 0.5-1.0 × 10 5 cells / well as spleen cells
Cultured with cloning supplement (HCS).
About 2 weeks after cell fusion, selective culture was performed in HAT medium. After selecting the fused cells, a part of the culture supernatant was sampled from each well and screened by ELISA in which MG-H1-binding BSA was solid-phased at 1 μg / well. As a secondary screening, ELISA using a solid phase of methylglyoxal-modified BSA was performed, and positive wells were confirmed for each of the immunizing antigen and methylglyoxal-modified BSA.
Cloning was performed by limiting dilution using 10-well cells selected based on the ELISA results. Ten wells that formed a positive single colony were selected, and were finally narrowed down to 3 clones in consideration of growth ability. Conditioned culture was performed so as to grow in the conditioned medium (RPMI1640 + 10% FBS) from the various additive-containing cultures used in the establishment process.
〔マウス腹腔法によるモノクローナル抗AGEs抗体の生産〕
クローニング、馴化したハイブリドーマを馴化培地で培養し、生細胞率が上昇するように10ｃｍディッシュで２〜３継代の培養を行った。生細胞の状態を確認しながら培養スケールをあげ、移植当日に対数増殖期のハイブリドーマを必要量（2x107cells）確保した。ハイブリドーマ懸濁液から遠心操作（1000rpm, 5min）によりハイブリドーマを回収した。PBS(-)で細胞を洗浄後、細胞数を測定し、4x106cells/mlにRPMI 1640(FBS free)にて調製した。0.5ml/匹（2x106cells/匹）で１０匹のBALB/c雄マウス腹腔内に移植した。腹水の貯留具合を確認し、18Gの注射針を用いて腹水を採取した。採取腹水を遠心分離（3000rpm, 5min）し、腹水上清を回収した。
腹水を平衡化・吸着バッファー（PBS(-), pH 7.4）で３倍希釈した。次にプロテインAカラムを５〜１０bed volの平衡化・吸着バッファーで洗浄し、希釈した腹水をアプライした。その後、プロテインAカラムを再度５〜１０bed volの平衡化・吸着バッファーで洗浄した。次に３〜５bed volの溶出バッファー（100mM クエン酸バッファー, pH3.0）で吸着蛋白質を溶出させ、A280=0.1以上を集め、中和液（2M Tris-HCl, pH9.0）を1/10〜1/20倍添加し、溶出画分を素早くpH7.0〜7.5にした。中和した溶出画分を最終バッファー（50mM Tris-HCl, pH8.0, 0.15M NaCl）にて透析し、その後0.22μmフィルターで濾過滅菌した。
このようにして、MG-H1に特異的に結合するモノクローナル抗AGEs抗体を得た。
[Production of monoclonal anti-AGEs antibody by mouse peritoneal method]
The cloned and conditioned hybridoma was cultured in a conditioned medium, and cultured for 2 to 3 passages in a 10 cm dish so that the viable cell ratio increased. While confirming the state of living cells, the culture scale was increased, and the required amount (2 × 10 7 cells) of the logarithmic growth phase hybridoma was secured on the day of transplantation. Hybridomas were recovered from the hybridoma suspension by centrifugation (1000 rpm, 5 min). After washing the cells with PBS (−), the number of cells was measured, and 4 × 10 6 cells / ml were prepared with RPMI 1640 (FBS free). 0.5 ml / animal (2 × 10 6 cells / animal) was transplanted into the abdominal cavity of 10 BALB / c male mice. Ascites was confirmed to be collected, and ascites was collected using an 18G needle. The collected ascites was centrifuged (3000 rpm, 5 min), and the ascites supernatant was collected.
Ascites was diluted 3-fold with equilibration / adsorption buffer (PBS (-), pH 7.4). The protein A column was then washed with 5-10 bed vol equilibration and adsorption buffer and diluted ascites was applied. Thereafter, the protein A column was washed again with 5-10 bed vol equilibration / adsorption buffer. Next, elute the adsorbed protein with 3-5 bed vol elution buffer (100 mM citrate buffer, pH 3.0), collect A280 = 0.1 or more, and neutralize with 2/10 Tris-HCl, pH 9.0. ˜1 / 20 times was added, and the eluted fraction was rapidly adjusted to pH 7.0 to 7.5. The neutralized elution fraction was dialyzed against the final buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.15 M NaCl), and then sterilized by filtration through a 0.22 μm filter.
In this way, a monoclonal anti-AGE antibody that specifically binds to MG-H1 was obtained.
〔MG修飾蛋白に対する結合能の確認試験〕
前述した３クローンを用いて上記の方法により作製した抗MG-H1抗体である抗体１、抗体２及び抗体３について、ELISAを行いMG修飾蛋白に対する結合能を評価した。即ち、マイクロプレートのウェル（穴）に、MG修飾蛋白としてMG-BSA又はMG-HSAを固定しておき、これに１次抗体として試験対象の抗体（抗体１、２又は３）及び酵素標識抗体である２次抗体を順次作用させた後、発色剤を注入して発色させ、マイクロプレートリーダーによる吸光度の測定を行った。図１は、その結果を示すグラフである。
具体的には、ELISAプレート上に、MG-BSA又はMG-HSAのPBSによる希釈液(0.3μg/mL)を100μL/well加え２時間室温においてコーティングした後、ELISAプレート内の溶液を捨て、200μL/wellの洗浄液による洗浄を３回行った。そして、各ウェルに１次抗体を100μLずつ分注し、室温で１時間静置し、次いで、各ウェルを洗浄液で３回洗浄後、各ウェルに、洗浄液で10,000倍希釈した２次抗体を100μLずつ分注し、室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄液で３回洗浄後、各ウェルに発色剤を100μLずつ分注し、室温で発色させた。所定の時間ごとに、ウェルに反応停止液を100μLずつ分注して反応停止させ、発色剤としてOPDを用いた場合は492nm、TMBを用いた場合は450nm/Reference630nmの吸光度を測定した。
なお、上記試験は、１次抗体の濃度を代えて複数群について行った。また、MG-BSA又はMG-HSAに代えて、MG修飾していないBSA及びHSAを用いた場合についても同様の試験を同様に行った。図１の縦軸の吸光度は、発色開始3分後のサンプルの吸光度であり、横軸の抗体（１次抗体）の濃度は、ELISAプレートに加えた際の最終濃度である。
[Confirmation test of binding ability to MG modified protein]
The antibody 1, antibody 2 and antibody 3, which are anti-MG-H1 antibodies prepared by the above method using the above-mentioned 3 clones, were subjected to ELISA to evaluate the binding ability to the MG-modified protein. That is, MG-BSA or MG-HSA is fixed as an MG-modified protein in a well (hole) of a microplate, and the antibody to be tested (antibody 1, 2 or 3) and enzyme-labeled antibody as primary antibodies The secondary antibodies were sequentially applied, and then a color former was injected to develop color, and the absorbance was measured with a microplate reader. FIG. 1 is a graph showing the results.
Specifically, a diluted solution of MG-BSA or MG-HSA in PBS (0.3 μg / mL) was added at 100 μL / well on the ELISA plate and coated at room temperature for 2 hours, and then the solution in the ELISA plate was discarded and 200 μL Washing with a washing solution of / well was performed 3 times. Then, 100 μL of the primary antibody is dispensed into each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then each well is washed three times with the washing solution, and then 100 μL of the secondary antibody diluted 10,000 times with the washing solution is added to each well. It dispensed at a time and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, each well was washed three times with a washing solution, and then 100 μL of a color former was dispensed into each well and allowed to develop color at room temperature. At predetermined time intervals, 100 μL of the reaction stop solution was dispensed into the wells to stop the reaction, and absorbance at 492 nm was measured when OPD was used as the color former and 450 nm / Reference 630 nm was measured when TMB was used.
In addition, the said test was done about several groups, changing the density | concentration of a primary antibody. In addition, the same test was performed in the same manner when BSA and HSA not modified with MG were used instead of MG-BSA or MG-HSA. The absorbance on the vertical axis in FIG. 1 is the absorbance of the sample 3 minutes after the start of color development, and the concentration of the antibody (primary antibody) on the horizontal axis is the final concentration when added to the ELISA plate.
上記試験において、使用した試薬等の詳細は次の通り。
・MG-BSA(MG修飾BSA):40% Methylglyoxal solution (SIGMA)を2mMに希釈したものとBSA(2mg/mL)を等量混ぜ、12時間インキュベートを行い、MG-BSAを作製した。作製後PBSで透析したものを、タンパク質濃度を調製して用いた。
・MG-HSA(MG修飾HSA):40% Methylglyoxal solution (SIGMA)を2mMに希釈したものとHSA(ヒト血清アルブミン,2mg/mL)を等量混ぜ、12時間インキュベートを行い、MG-HSAを作製した。作製後PBSで透析したものを、タンパク質濃度を調製して用いた。
・一次抗体:抗MG-H1抗体を洗浄液（PBS+0.05% tween 20）で最終濃度0.3μg/mLに希釈して使用。
・二次抗体:Peroxidase-Labeled Antibody to Mouse IgG(H+L)(KPL 074-1806)。バイアル(1mg)に水500μlを添加して廻しながら溶解させた後、更にグリセロール500μLを添加してピペッティングで混合し、濃度1mg/mLとしたものを使用。
・発色剤:次の手順で調製したものを使用。100mMクエン酸100ml及び100mMリン酸水素二ナトリウム200mlをそれぞれ別途調製し、前者に後者を添加しながらpHを5.0に調製し、クエン酸緩衝液を得る。室温下、このクエン酸緩衝液10mlとOPDタブレット(和光純薬158-02151)1粒とを混合し、更に、発色試験の直前に、32%過酸化水素水6μL(関東化学18084-00)を添加し、目的とする発色剤を調製し、使用。
・反応停止液:36N H2SO4(和光純薬 199-15995)をイオン交換水で2N H2SO4に調製して使用。
・洗浄液:PBS(ダルベッコの組成:日水製薬 08190)+0.5%Tween 20 (ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、東京化成工業 9005-64-5)を使用。
・ELISAプレート:NUNC MAXISORP(NUNC 439454)を使用。
Details of the reagents used in the above test are as follows.
MG-BSA (MG-modified BSA): 40% Methylglyoxal solution (SIGMA) diluted to 2 mM and BSA (2 mg / mL) were mixed in equal amounts and incubated for 12 hours to prepare MG-BSA. After preparation, dialyzed with PBS, the protein concentration was adjusted and used.
MG-HSA (MG modified HSA): 40% Methylglyoxal solution (SIGMA) diluted to 2 mM and HSA (human serum albumin, 2 mg / mL) are mixed in equal amounts and incubated for 12 hours to produce MG-HSA did. After preparation, dialyzed with PBS, the protein concentration was adjusted and used.
Primary antibody: Anti-MG-H1 antibody diluted with a washing solution (PBS + 0.05% tween 20) to a final concentration of 0.3 μg / mL.
Secondary antibody: Peroxidase-Labeled Antibody to Mouse IgG (H + L) (KPL 074-1806). Add 500 μl of water to a vial (1 mg) and dissolve while spinning, then add 500 μL of glycerol and mix by pipetting to a concentration of 1 mg / mL.
Coloring agent: Use the one prepared by the following procedure. 100 ml of 100 mM citric acid and 200 ml of 100 mM disodium hydrogen phosphate are separately prepared, and the pH is adjusted to 5.0 while adding the latter to the former to obtain a citrate buffer. At room temperature, 10 ml of this citrate buffer solution and 1 OPD tablet (Wako Pure Chemicals 158-02151) were mixed, and 6 μL of 32% hydrogen peroxide solution (Kanto Chemical 18084-00) was added immediately before the color development test. Add the desired color former and use it.
-Reaction stop solution: 36N H 2 SO 4 (Wako Pure Chemical 199-15995) is prepared to 2N H 2 SO 4 with ion-exchanged water and used.
-Cleaning solution: PBS (Dulbecco's composition: Nissui Pharmaceutical 08190) + 0.5% Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tokyo Chemical Industry 9005-64-5) was used.
・ ELISA plate: NUNC MAXISORP (NUNC 439454) is used.
図１から明らかなように、抗体１〜抗体３は、何れも、MG-BSA及びMG-HSAに結合する一方、MG修飾していないBSA及びHSAに対して結合しておらず、MG修飾蛋白（換言すれば非遊離体のMG-H1）に対する高い特異的結合能を有することが判る。 As is clear from FIG. 1, antibody 1 to antibody 3 all bind to MG-BSA and MG-HSA, but not to MG-modified BSA and HSA, and MG-modified protein It can be seen that it has a high specific binding ability to (in other words, non-free MG-H1).
〔MG-H1に対する特異的結合能の評価試験〕
上記の抗体１について、競合的阻害アッセイとしての競合ELISAにより、MG-H1に対する特異的結合能の評価を行った。具体的な方法は下記の通りである。
（方法）
(1) 上記の試験におけるのと同様にして調製したMG-BSAの希釈液(0.3μg/mL)を、ELISAプレート上に100μL/well加え、２時間室温に置いてコーティングを行った。
(2) コーティングを行ったELISAプレート内の溶液を捨て、洗浄液を200μL/well加え、すぐに液を捨てた。
(3) 上記(2)の操作を３回繰り返し、３回目には中の液を出した。
(4) 0.5% Gelatin PBS(PBSにGelatinを加え0.5%にした溶液)を200μL/well加え、１時間室温に置き、ブロッキングを行った。
(5) 上記(2)及び(3)の操作を行った。
(6) 洗浄液にて2mMに希釈した各競合物を所定のウェルに50μL/well加えた。
(7) 洗浄液にて2μg/mlに希釈した抗MG-H1抗体を、上記(6)のウェルに50μL加えた。
(8) ELISAプレートにラップをかけ、ウェル内の液がこぼれないように5分混和した後、室温に1時間置いた。
(9) 上記(2)及び(3)の操作を行った。
(10) 二次抗体（抗マウスIgGγ抗体）を洗浄液で5000倍希釈したものを100μL/well加え、1時間室温に置いた。
(11) 上記(2)及び(3)の操作を行った。
(12) OPDで発色を行い、2N硫酸で発色を止めた。
[Evaluation test of specific binding ability to MG-H1]
The antibody 1 was evaluated for its specific binding ability to MG-H1 by competitive ELISA as a competitive inhibition assay. The specific method is as follows.
(Method)
(1) A diluted solution of MG-BSA (0.3 μg / mL) prepared in the same manner as in the above test was added to an ELISA plate at 100 μL / well, and the coating was performed at room temperature for 2 hours.
(2) The solution in the coated ELISA plate was discarded, 200 μL / well of washing solution was added, and the solution was immediately discarded.
(3) The above operation (2) was repeated 3 times, and the third solution was taken out the third time.
(4) 200 μL / well of 0.5% Gelatin PBS (a solution obtained by adding Gelatin to PBS to 0.5%) was added, and placed at room temperature for 1 hour for blocking.
(5) The above operations (2) and (3) were performed.
(6) Each competitor diluted to 2 mM with a washing solution was added to a predetermined well at 50 μL / well.
(7) 50 μL of anti-MG-H1 antibody diluted to 2 μg / ml with the washing solution was added to the well of (6) above.
(8) The ELISA plate was wrapped and mixed for 5 minutes so that the liquid in the well did not spill, and then placed at room temperature for 1 hour.
(9) The above operations (2) and (3) were performed.
(10) A secondary antibody (anti-mouse IgGγ antibody) diluted 5000-fold with a washing solution was added at 100 μL / well and left at room temperature for 1 hour.
(11) The above operations (2) and (3) were performed.
(12) Color was developed with OPD, and color development was stopped with 2N sulfuric acid.
使用した洗浄液、一次抗体、二次抗体、OPD、ELISAプレート等は、上述の〔MG修飾蛋白に対する結合能の確認試験〕と同様のものを用いた。
また、競合物としてのMG-H1としては、前述の方法により合成し精製したタンパク質に未結合のMG-H1（遊離体）を用いた。
The washing solution, primary antibody, secondary antibody, OPD, ELISA plate and the like used were the same as those used in the above-mentioned [Confirmation test for binding ability to MG-modified protein].
In addition, as MG-H1 as a competitor, MG-H1 (free form) that was not bound to the protein synthesized and purified by the method described above was used.
（結果）
図２は、抗体１についての、競合ELISAの結果を示すグラフである。図２（ａ）に示すように、競合物として遊離体のMG-H1が存在すると、その量に応じてMG-BSAに対する抗体の結合量が減少する一方、カルボキシエチルリジン(CML)、遊離のアミノ酸であるArg又はLysを存在させた場合には、MG-BSAに対する抗体の結合量に変化は生じていない。図２（ｂ）に示すように、競合物としてカルボキシメチルアルギニン(CMA)を存在させた場合にも、MG-BSAに対する抗体の結合量に変化は生じていない。
このことから、本発明の実施形態である抗体は、遊離体のMG-H1に対して高い特異的結合能を有していることが判る。
また、図２に示すように、競合物であるMG-H1の濃度が０．００１から０．３ｍＭという低い濃度でも競合がかかっていることから、従来困難であった、腎症患者、糖尿病患者、健常者等のヒトの血清中のMG-H1の検出が可能であることが判る。また、同一のELISAプレート上で、濃度等が既知のMG-H1とともにヒトの血清サンプルについて、競合ELISAを行うことで、ヒトの血清中のMG-H1の定量も可能となる。
(result)
FIG. 2 is a graph showing the results of competitive ELISA for antibody 1. As shown in FIG. 2 (a), when free MG-H1 is present as a competitor, the amount of antibody bound to MG-BSA is decreased according to the amount, while carboxyethyllysine (CML), free When Arg or Lys, which is an amino acid, is present, there is no change in the amount of antibody bound to MG-BSA. As shown in FIG. 2 (b), even when carboxymethylarginine (CMA) was present as a competitor, there was no change in the amount of antibody bound to MG-BSA.
From this, it can be seen that the antibody according to the embodiment of the present invention has a high specific binding ability to free MG-H1.
In addition, as shown in FIG. 2, since the competition is applied even when the concentration of the competitor MG-H1 is as low as 0.001 to 0.3 mM, nephropathy patients and diabetic patients, which have been difficult in the past. It can be seen that it is possible to detect MG-H1 in the serum of humans such as healthy individuals. In addition, MG-H1 in human serum can be quantified by performing competitive ELISA on human serum samples together with MG-H1 having a known concentration and the like on the same ELISA plate.
このように、本発明によれば、競合ELISA又は他の競合阻害アッセイを用いた生体試料中のMG-H1の検出又は定量方法も提供される。生体試料としては、血清のほか、尿、髄液などの体液、組織から抽出したサンプル等が挙げられる。 Thus, the present invention also provides a method for detecting or quantifying MG-H1 in a biological sample using a competitive ELISA or other competitive inhibition assay. Examples of biological samples include serum, body fluids such as urine and spinal fluid, and samples extracted from tissues.
〔ウェスタンブロッティングによる抗MG-H1抗体の評価試験〕
上記の抗体１〜３について、ウェスタンブロッティングにより、遊離体のMG-H1に対する特異的結合能の評価を行った。具体的な方法は下記の通りである。
1.以下の要領でゲルを作製し、電気泳動を行った。
（方法）
１．電気泳動
(1) 分離ゲル（10％）H2O 4.0ml , 30% acrylamide 3.3ml , 1.5M Tris(pH8.8) 2.5ml , 10%SDS 100μl , 過硫酸アンモニウム 100μl , TEMED 4μl
アッパーゲル H2O 1.4ml , 30% acrylamide 330μl , 1.0M Tris(pH6.8) 250μl , 10%SDS 20μl , aps 20μl , TEMED 2μl
メルカプトエタノール入りSDS化剤（SDS化剤95μl＋メルカプトエタノール5μl）を作製し、サンプル：メルカプトエタノール入りSDS化剤＝4：1の比率で混和する。
(2) ウェルにサンプルを10μl加え、電気泳動を行う。
２．転写
(1) アッパーゲルを切り取り、分離ゲルのみとし、転写機を用意し、ろ紙二枚を1×Towbin’s bufferに浸して置き、PVDF膜はメタノールに浸したのちに1×Towbin’s bufferに浸す。
(2) 転写機上に下からろ紙、PVDF膜、ゲル、ろ紙の順で重ね、試験管などで内部の空気を抜く。
(3) 100V、PVDF膜の面積×0.8mA、10.0W , 60min を設定し、通電する。転写後、分子量マーカーを流した場合には、分子量マーカーの線をボールペンでなぞる。
３．ブロッキング
(1) 転写後のPVDF膜をブロッキング液（5％スキムミルクTBS）が入った容器に入れ、1
時間シェイカー上で軽く振盪。(2) ．ブロッキング液をしっかりとTBST(0.05％Tween TBS
)で洗い流し、シェイカー上で5分振盪。
(3) 上記(2)の操作を再度行う。
(4) 一次抗体希釈(1%Gelatin Hydrolysate TBST)を作製し、一次抗体希釈液で抗MG-H1抗体を5μg/mlに希釈する。
(5) (4)を容器に入れ、PVDF膜を浸す。一時間室温に置く。
(6) (3)及び(4)の操作を行う。
(7) 二次抗体希釈液（1％スキムミルクTBST）でHRP標識抗マウスIgGγ抗体を5000倍希釈する。
(8) (7)を容器に入れ6で洗ったPVDF膜を入れ、一時間室温に置く。
(9) (3)及び(4)の操作を再度行う。
(10) 最後にPVDF膜をTBSに浸し、5分シェイカー上に置く。
(11) (10)の操作を再度行う。
(12) 発色液（ECL Prime, GEヘルスケア）をPVDF膜にまんべんなくかけ、発色の具合を化学発光検出器で検出する。
[Evaluation test of anti-MG-H1 antibody by Western blotting]
About the said antibodies 1-3, the specific binding ability with respect to MG-H1 of a free body was evaluated by Western blotting. The specific method is as follows.
1. A gel was prepared and electrophoresed as follows.
(Method)
1. Electrophoresis
(1) Separation gel (10%) H 2 O 4.0ml, 30% acrylamide 3.3ml, 1.5M Tris (pH8.8) 2.5ml, 10% SDS 100μl, ammonium persulfate 100μl, TEMED 4μl
Upper gel H2O 1.4ml, 30% acrylamide 330μl, 1.0M Tris (pH6.8) 250μl, 10% SDS 20μl, aps 20μl, TEMED 2μl
Prepare a mercaptoethanol-containing SDS agent (SDS agent 95 μl + mercaptoethanol 5 μl) and mix in a ratio of sample: mercaptoethanol-containing SDS agent = 4: 1.
(2) Add 10 μl of sample to the well and perform electrophoresis.
2. Transcription
(1) Cut the upper gel, use only the separated gel, use a transfer machine, place two filter papers in 1 × Towbin's buffer and place the PVDF membrane in 1 × Towbin's buffer after soaking in methanol.
(2) Stack the filter paper, PVDF membrane, gel, and filter paper in this order on the transfer machine, and remove the air inside with a test tube.
(3) Set 100V, PVDF membrane area x 0.8mA, 10.0W, 60min. When the molecular weight marker is flowed after the transfer, the molecular weight marker line is traced with a ballpoint pen.
3. blocking
(1) Place the PVDF membrane after transfer in a container containing blocking solution (5% skim milk TBS).
Shake gently on the time shaker. (2). Tightly blocking solution with TBST (0.05% Tween TBS
) And shake on a shaker for 5 minutes.
(3) Repeat step (2) above.
(4) Prepare a primary antibody dilution (1% Gelatin Hydrolysate TBST), and dilute the anti-MG-H1 antibody to 5 μg / ml with the primary antibody diluent.
(5) Put (4) in a container and immerse the PVDF membrane. Place at room temperature for 1 hour.
(6) Perform operations (3) and (4).
(7) Dilute HRP-labeled anti-mouse IgGγ antibody 5000 times with secondary antibody diluent (1% skim milk TBST).
(8) Put (7) in a container and put the PVDF membrane washed in 6. Put it at room temperature for 1 hour.
(9) Repeat steps (3) and (4).
(10) Finally, immerse the PVDF membrane in TBS and place it on the shaker for 5 minutes.
(11) Repeat step (10).
(12) Apply the coloring solution (ECL Prime, GE Healthcare) evenly to the PVDF membrane, and detect the color development with a chemiluminescence detector.
（結果）
図３は、抗体１〜抗体３についてのウェスタンブロッティングの結果を示す図である。いずれの抗体も、MG-BSAのみに反応し、BSAには反応しなかった。これらの結果から本発明の抗体はMG-H1に対する特異性が高いことが確認された。
(result)
FIG. 3 is a diagram showing the results of Western blotting for antibody 1 to antibody 3. None of the antibodies reacted only with MG-BSA and did not react with BSA. From these results, it was confirmed that the antibody of the present invention has high specificity for MG-H1.
〔競合ELISA法による動物血清中MG-H1の測定〕
上記の抗体３を用いて、糖尿病誘発ラット又は前立腺癌モデルラットの血清（生体試料）中のMG-H1の量と、正常なラットの血清中のMG-H1の量を測定し、それらの量の対比を行った。
１．使用したラット
糖尿病誘発ラット及び前立腺癌モデルラットは、下記を用いた。
糖尿病誘発ラット(DM)：ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット。
前立腺癌ラット(TG)：ＳＶ４０ラット（バックグラウンドＳＤ，オリエンタルバイオサービス株式会社 ）
[Measurement of MG-H1 in animal serum by competitive ELISA]
Using the above antibody 3, the amount of MG-H1 in the serum (biological sample) of diabetes-induced rat or prostate cancer model rat and the amount of MG-H1 in the serum of normal rat were measured, and these amounts Contrast was performed.
1. Rats used The following were used for diabetes-induced rats and prostate cancer model rats.
Diabetes-induced rats (DM): Streptozotocin-induced diabetic rats.
Prostate cancer rat (TG): SV40 rat (background SD, Oriental Bioservice Co., Ltd.)
２．方法
(1) -20℃保存していた、12時間インキュベートした1mM MG-BSA溶液を室温で解凍した。
(2) 1μg/mL MG-BSAをPBSで調製した後、96穴ELISAプレートに100μL/well加え、ラップでふたをして2時間室温で静置した。
(3) ELISAプレート内の液を除去し、洗浄液(PBS+0.5%Tween20)を200μL/well加え、そのまま液を除去する工程を3回実施した。
(4) 0.5%Gelatin(PBSにGelatinを加え0.5%にした溶液)を200μL/well加え、１時間室温に置き、ブロッキングを行った。
(5) 上記(3)の操作を行った。
(6) 検量線作成のため、まず2mM MG-H1を洗浄液にて作製後、1mMに希釈し、その後3倍ずつ順に希釈し、12段階調製した。
(7) 血清を洗浄液で2倍希釈して十分撹拌した後、上記(6)で調製したMG-H1とともに所定のウェルに50μL/wellで加えた。
(8) 洗浄液にて2μg/mLに希釈した抗MG-H1抗体を、ウェルに50μLずつ加えた後、1時間室温で反応させた。
(9) 上記(3)の操作を行った。
(10) 洗浄液にて0.1 μg/mLに調製したGoat anti-Mouse IgG (γ)-HRP抗体 (KPL, 214-1802) を100 μL/well加えた後、1 時間室温で反応させた。
(11) 上記(3)の操作を行った。
(12) TMB試薬(株式会社ビークル,BCL-TMB-01)をプレート1列ごとに5秒間隔で100 μL/well加え、発色確認後0.6 Nの硫酸を5 秒間隔で100 μL/well加えて反応を止めた。
(13) マイクロプレートリーダーTECAN RAINBOW THERMO RC (sunrise)で450nm、レファレンス630 nmの吸光度で測定した。
2. Method
(1) A 1 mM MG-BSA solution that had been stored at −20 ° C. and incubated for 12 hours was thawed at room temperature.
(2) 1 μg / mL MG-BSA was prepared in PBS, added to a 96-well ELISA plate at 100 μL / well, covered with a wrap, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
(3) The liquid in the ELISA plate was removed, the washing liquid (PBS + 0.5% Tween20) was added at 200 μL / well, and the liquid was removed as it was three times.
(4) 200 μL / well of 0.5% Gelatin (a solution obtained by adding Gelatin to PBS to 0.5%) was added and left at room temperature for 1 hour for blocking.
(5) The above operation (3) was performed.
(6) In order to prepare a calibration curve, 2 mM MG-H1 was first prepared with a washing solution, diluted to 1 mM, and then diluted three times in order to prepare 12 steps.
(7) Serum was diluted 2-fold with a washing solution and stirred sufficiently, and then added to a predetermined well at 50 μL / well together with MG-H1 prepared in (6) above.
(8) Anti-MG-H1 antibody diluted to 2 μg / mL with a washing solution was added to each well at 50 μL, followed by reaction at room temperature for 1 hour.
(9) The above operation (3) was performed.
(10) After adding 100 μL / well of Goat anti-Mouse IgG (γ) -HRP antibody (KPL, 214-1802) prepared to 0.1 μg / mL in the washing solution, the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
(11) The above operation (3) was performed.
(12) Add TMB reagent (vehicle, BCL-TMB-01) at 100 μL / well at 5 second intervals per plate, and after color development, add 0.6 N sulfuric acid at 100 μL / well at 5 second intervals. The reaction was stopped.
(13) Measurement was performed with a microplate reader TECAN RAINBOW THERMO RC (sunrise) at an absorbance of 450 nm and a reference of 630 nm.
３．使用した試薬・備品は以下の通り
・96穴ELISAプレート：NUNC MAXISORP(NUNC 439454)
・PBS：市販の試薬にて10×PBS作製後、超純水で希釈した
・Tween 20:和光純薬工業（株）, Polyoxyethylene (20) sorbitan Monolaurate
・Gelatin：Sigma, G-0262
・MG-H1：前述した方法により、合成した後、２段階の精製を行った前記の遊離体のMG-H1
・一次抗体（抗MG-H1抗体）：抗体３（プロテインGカラムで精製したもの）592.8 μg/mL
・二次抗体：KPL, 214-1802 Goat Anti-Mouse IgG (gamma) Antibody, F(ab')2 fragment, Human Serum Adsorbed and Peroxidase labeled
・H2SO4：和光純薬工業（株）
・血清試料：上記の各ラットの血清
3. Reagents and equipment used are as follows: 96-well ELISA plate: NUNC MAXISORP (NUNC 439454)
・ PBS: 10 × PBS prepared with commercially available reagents and diluted with ultrapure water ・ Tween 20: Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Polyoxyethylene (20) sorbitan Monolaurate
・ Gelatin: Sigma, G-0262
MG-H1: MG-H1 of the above-mentioned free form that has been synthesized by the method described above and then purified in two steps
Primary antibody (anti-MG-H1 antibody): Antibody 3 (purified with protein G column) 592.8 μg / mL
Secondary antibody: KPL, 214-1802 Goat Anti-Mouse IgG (gamma) Antibody, F (ab ') 2 fragment, Human Serum Adsorbed and Peroxidase labeled
・ H 2 SO 4 : Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
Serum sample: serum from each of the above rats
４．結果
図４に、糖尿病のラットと正常なラットの各血清中のMG-H1量を示すグラフ、図５に、前立腺癌のラットと正常なラットの各血清中のMG-H1量を示すグラフを示した。
図４及び図５に示す結果から、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体やそれを用いた競合ELISA等の免疫学的測定法によれば、血清中のMG-H1量を測定することができ、糖尿病や前立腺癌については、疾患の有無がMG-H1量に影響することが確認された。
4). Results FIG. 4 is a graph showing the amount of MG-H1 in each serum of diabetic rats and normal rats, and FIG. 5 is a graph showing the amount of MG-H1 in each serum of prostate cancer rats and normal rats. Indicated.
From the results shown in FIG. 4 and FIG. 5, according to the immunoassay such as the monoclonal anti-AGE antibody of the present invention and competitive ELISA using the same, the amount of MG-H1 in the serum can be measured. For prostate cancer and prostate cancer, it was confirmed that the presence or absence of the disease affected the amount of MG-H1.
〔競合ELISA法による前立腺癌患者血清中MG-H1の測定〕
上記の抗体３を用いて、前立腺癌患者及び男性健常者の血清中のMG-H1の量を測定し、それらの量の対比を行った。
１．使用したヒト血清
前立腺癌患者及び男性健常者の血清は、PROMEDDX社から各１０検体（平均年齢：前立腺癌患者６７．３歳、男性健常者６５．７歳）入手した。
[Measurement of MG-H1 in serum of prostate cancer patients by competitive ELISA]
Using the antibody 3, the amount of MG-H1 in the serum of prostate cancer patients and healthy male subjects was measured, and the amounts were compared.
1. Human sera used Serums from prostate cancer patients and healthy male subjects were obtained from PROMEDDX (10 samples each) (average age: prostate cancer patients 67.3 years old, healthy male subjects 65.7 years old).
２．方法
(1) -20℃保存していた、12時間インキュベートした1mM MG-BSA溶液を室温で解凍した。
(2) 0.5 μg/mL MG-BSAをPBSで調製した後、96穴ELISAプレートに100μL/well加え、ラップでふたをして2時間室温で静置した。
(3) ELISAプレート内の液を除去し、洗浄液(PBS+0.5%Tween20)を200μL/well加え、そのまま液を除去する工程を3回実施した。
(4) 0.5%Gelatin(PBSにGelatinを加え0.5%にした溶液)を200μL/well加え、１時間室温に置き、ブロッキングを行った。
(5) 上記(3)の操作を行った。
(6) 検量線作成のため、まず2mM MG-H1を洗浄液にて作製後、1mMに希釈し、その後3倍ずつ順に希釈し、12段階調製した。
(7) 血清を洗浄液で2倍希釈して十分撹拌した後、上記(6)で調製したMG-H1とともに所定のウェルに50μL/wellで加えた。
(8) 洗浄液にて2μg/mLに希釈した抗MG-H1抗体を、ウェルに50μLずつ加えた後、1時間室温で反応させた。
(9) 上記(3)の操作を行った。
(10) 洗浄液にて0.1 μg/mLに調製したGoat anti-Mouse IgG (γ)-HRP抗体 (KPL, 214-1802) を100 μL/well加えた後、1 時間室温で反応させた。
(11) 上記(3)の操作を行った。
(12) TMB試薬をプレート1列ごとに5秒間隔で100 μL/well加え、発色確認後2 Nの硫酸を5 秒間隔で100 μL/well加えて反応を止めた。
(13) マイクロプレートリーダーFLUO star OPTIMA (BMG LABTECH)で450nm、レファレンス595 nmの吸光度で測定した。
2. Method
(1) A 1 mM MG-BSA solution that had been stored at −20 ° C. and incubated for 12 hours was thawed at room temperature.
(2) 0.5 μg / mL MG-BSA was prepared in PBS, added to a 96-well ELISA plate at 100 μL / well, covered with a wrap, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
(3) The liquid in the ELISA plate was removed, the washing liquid (PBS + 0.5% Tween20) was added at 200 μL / well, and the liquid was removed as it was three times.
(4) 200 μL / well of 0.5% Gelatin (a solution obtained by adding Gelatin to PBS to 0.5%) was added and left at room temperature for 1 hour for blocking.
(5) The above operation (3) was performed.
(6) In order to prepare a calibration curve, 2 mM MG-H1 was first prepared with a washing solution, diluted to 1 mM, and then diluted three times in order to prepare 12 steps.
(7) Serum was diluted 2-fold with a washing solution and stirred sufficiently, and then added to a predetermined well at 50 μL / well together with MG-H1 prepared in (6) above.
(8) Anti-MG-H1 antibody diluted to 2 μg / mL with a washing solution was added to each well at 50 μL, followed by reaction at room temperature for 1 hour.
(9) The above operation (3) was performed.
(10) After adding 100 μL / well of Goat anti-Mouse IgG (γ) -HRP antibody (KPL, 214-1802) prepared to 0.1 μg / mL in the washing solution, the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
(11) The above operation (3) was performed.
(12) TMB reagent was added at 100 μL / well at 5 second intervals per plate, and after confirming color development, 2 N sulfuric acid was added at 100 μL / well at 5 second intervals to stop the reaction.
(13) Measurement was carried out with a microplate reader FLUO star OPTIMA (BMG LABTECH) at an absorbance of 450 nm and a reference of 595 nm.
３．使用した試薬・備品は以下の通り
・96穴ELISAプレート：NUNC MAXISORP(NUNC 439454)
・PBS：市販の試薬にて10×PBS作製後、超純水で希釈した
・Tween 20：和光純薬工業（株）, Polyoxyethylene (20) sorbitan Monolaurate
・Gelatin：ナカライテスク（株）,Gelatin精製粉末 16631-92
・MG-H1：前述した方法により、合成した後、２段階の精製を行った前記の遊離体のMG-H1
・一次抗体（抗MG-H1抗体）：抗体３(5.2 mg/mL)
・二次抗体：KPL, 214-1802 Goat Anti-Mouse IgG (gamma) Antibody, F(ab')2 fragment, Human Serum Adsorbed and Peroxidase labeled
・硫酸：ナカライテスク（株）, Cat. 16631-92
・TMB試薬：BD, BD OptEIA TMB Substrate Reagent Set, 555214
3. Reagents and equipment used are as follows: 96-well ELISA plate: NUNC MAXISORP (NUNC 439454)
・ PBS: 10 × PBS prepared with commercially available reagents, diluted with ultrapure water ・ Tween 20: Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Polyoxyethylene (20) sorbitan Monolaurate
・ Gelatin: Nacalai Tesque, Gelatin purified powder 16631-92
MG-H1: MG-H1 of the above-mentioned free form that has been synthesized by the method described above and then purified in two steps
・ Primary antibody (anti-MG-H1 antibody): Antibody 3 (5.2 mg / mL)
Secondary antibody: KPL, 214-1802 Goat Anti-Mouse IgG (gamma) Antibody, F (ab ') 2 fragment, Human Serum Adsorbed and Peroxidase labeled
・ Sulfuric acid: Nacalai Tesque, Cat. 16631-92
・ TMB reagent: BD, BD OptEIA TMB Substrate Reagent Set, 555214
４．結果
図６に、前立腺癌患者及び男性健常者血清中のMG-H1量を示すグラフを示した。
この結果から、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体やそれを用いた競合ELISA等の免疫学的測定法によれば、病態モデル動物と同様、血清中のMG-H1量を測定することができ、疾患の有無がMG-H1量に影響することが確認された。このことは、本発明のモノクローナル抗AGEs抗体や、それを用いた競合ELISA等の免疫学的測定法によれば、糖尿病や前立腺癌等の疾患や特定の症状と、血清等の生体試料中のMG-H1量との間の相関関係の有無を調べることができることを意味し、また、その相関関係に基づき、疾患や特定の症状の有無、疾患や症状が生じるリスクの判定にも応用可能であることを示している。
特にMG-H1の濃度が非常に低く、例えば図４から図６に示すようにMG-H1の濃度が０．１ｍＭ以下（好ましくは0.001〜0.01mM）であるにも拘わらずに、MG-H1の検出や定量、量の対比を行うことができることは、血清等の生体試料を、そのまま、あるいは簡単な処理のみで測定試料とすることができることにもなり、MG-H1と関係する各種の疾患や症状、又はそれらのリスク等の短時間での診断も可能となる。
4). Results FIG. 6 shows a graph showing the amount of MG-H1 in the serum of prostate cancer patients and healthy male subjects.
From this result, according to immunoassay methods such as monoclonal anti-AGEs antibody of the present invention and competitive ELISA using the same, it is possible to measure the amount of MG-H1 in the serum, as in the disease model animal, It was confirmed that the presence or absence of MG affected the amount of MG-H1. This is because the monoclonal anti-AGEs antibody of the present invention and the immunoassay such as competitive ELISA using the same are used in diseases such as diabetes and prostate cancer and specific symptoms, and in biological samples such as serum. This means that the presence or absence of a correlation with the amount of MG-H1 can be examined, and based on that correlation, it can also be applied to determine the presence or absence of a disease or specific symptom, or the risk of developing a disease or symptom. It shows that there is.
In particular, the concentration of MG-H1 is very low. For example, as shown in FIGS. 4 to 6, the concentration of MG-H1 is 0.1 mM or less (preferably 0.001 to 0.01 mM). The ability to detect, quantify, and compare the amount of serum can also be used as a measurement sample for a biological sample such as serum as it is or by simple treatment. Various diseases related to MG-H1 Diagnosis can be made in a short time such as symptom, symptom, or risk thereof.
Claims (13)
メチルグリオキサール−ハイドロイミダゾロン（MG-H1）に対して特異的に結合する、モノクローナル抗AGEs抗体。 Monoclonal antibodies against final glycation products (AGEs),
A monoclonal anti-AGE antibody that specifically binds to methylglyoxal-hydroimidazolone (MG-H1).
合成したMG-H1を、クロスリンカーを用いてタンパク質に結合する工程、及び、
MG-H1が結合したタンパク質を抗原として動物を免疫する工程を具備する、モノクローナル抗AGEs抗体の製造方法。 Synthesizing free MG-H1 which is not bound to protein,
Binding the synthesized MG-H1 to a protein using a crosslinker; and
A method for producing a monoclonal anti-AGE antibody comprising a step of immunizing an animal using a protein to which MG-H1 is bound as an antigen.
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