JP2017012203A - 細菌中の接合性プラスミドの低減方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年3月10日に出願した米国特許出願第61/035,304号の優先権を主張する。
本発明は、細菌感染を含む微生物コロニー中に見出される様々なプラスミドの数または質量としての量を減少させるための方法および組成物を提供し、コロニーを処理するための組成物、方法、およびさらなるそのような組成物を同定するための方法を含む。種々の態様において、本発明は、標的細菌培養物中に保有される抗生物質耐性マーカーの蔓延を有意に減少させることを提供する。
細菌は遍在性であり、これまで生息に適さないと考えられていた環境において見出される。細菌は生態学的に共通性および多様性があり、生存のために独自のおよび共通の生態的適所を見出す。細菌は環境の至る所に存在し、土壌中、粉塵中、水中、および実質的にあらゆる自然表面上に存在する。多くは正常かつ有益な細菌株であり、宿主と共に相乗関係を提供する。それほど有益ではないか、または特定の条件下で利点と共に問題を引き起こすものもある。
本発明は、多くの異なる宿主に感染することができる様々な広宿主域ファージが存在するという認識に一部基づく。例えば、Grahn, et al. (2006) 「PRD1: Dissecting the Genome, Structure and Entry」 Calendar (ed.) The Bacteriophages (2d ed.) Oxford Univ. Press, ISBN-13: 9780195148503を参照されたい。PRD1は、構造的および機能的に明らかにされている属テクティウイルス科(Tectiviridae)の例示的なメンバーである。しかしながら、分類表が発展していき、高等動物アデノウイルス機能に対するファージの類似性が認識されている。このことから、ある種の基本的構造特性が共有され、これらのファージが、多種多様な宿主細菌種において感染および複製するという共通の目的を達成するためにこれを利用することが示される。特に、これらの広宿主域はグラム陰性とグラム陽性の区別にまたがり、これによって、結合および感染の過程においてある種の構造特性が共有されることが示唆される。抗生物質耐性の機構をコードする多くの遺伝子エレメントは、そのような遺伝子エレメントを含む細胞の脆弱性のための手段を含み得る。例えば、抗生物質耐性遺伝子をコードするある種の細菌プラスミドは、宿主細胞をバクテリオファージによる結合(および死滅)に対して脆弱にし得る受容体もまたコードする。あるいは、プラスミドは、さもなければプラスミドを欠いている細胞に伝達され得る遺伝子または構造をコードしてよく、それによって耐性遺伝子および連結されている脆弱性マーカーが伝達される。この機構は、耐性または毒性コードプラスミドを、耐性マーカーを欠いている類似の宿主に平行伝達するための手段として役立ち得る。脆弱性遺伝子も同様に伝達されると、これらの宿主は排除のための手段に対して感受性を示すようになる。
[請求項1001]
以下の段階を含む、ファージ受容体に連結された抗生物質マーカーまたは毒性マーカーをコードするプラスミドの蔓延を減少させる方法であって、該プラスミドが不均一な細菌培養物中の細胞内に保有されている、方法:
a) 該細菌培養物を、ファージ受容体に結合し得る十分なファージ受容体特異的殺傷剤と接触させる段階であって、該接触段階により、該受容体特異的殺傷剤の該ファージ受容体への結合、および接合性の該プラスミドを含む宿主細菌の死滅が可能になり、それによって、不均一な細菌培養物中の、抗生物質または毒性因子をコードする接合性プラスミドの蔓延が減少する、段階。
[請求項1002]
蔓延の減少が
a) 細菌培養物中の接合性プラスミドの絶対数の減少;または
b) 細菌培養物のメンバー当たりの接合性プラスミドの数の減少
である、請求項1001記載の方法。
[請求項1003]
蔓延の減少が少なくとも2分の1である、請求項1001記載の方法。
[請求項1004]
細菌培養物が
a) 対数増殖期にある;
b) 定常状態増殖期にある;
c) ラクトバチルス培養物もしくは乳製品加工培養物である;
d) 水処理施設中に存在する;
e) 真核細胞もしくは器官培養物中に存在する;
f) 真核生物宿主中に存在する;
g) 脊椎動物生物中もしくは脊椎動物生物上に存在する;または
h) 哺乳動物中もしくは哺乳動物上に存在する、
請求項1001記載の方法。
[請求項1005]
ファージ受容体特異的殺傷剤が
a) テクティウイルス(tectivirus)である;
b) 広宿主域脂質含有ファージである;
c) RPD1ファージ群のメンバーである;
d) プラスミド依存性広宿主域バクテリオファージである;
e) テクティウイルス科(tectiviridae)である、
f) 正二十面体形態、脂質含量、直径55〜65 nmの頭部、および12〜130 nmの尾部のうちの少なくとも1つまたは複数を特徴とするファージである;
g) PRD1、PRR1、PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GILO1、pGILO1、BAM35、またはGIL 16と称されるファージの群より選択される、
請求項1001記載の方法。
[請求項1006]
細菌培養物を、前記受容体をコードする少なくとも1つの接合性プラスミドを細菌培養物のドナーメンバーからレシピエントメンバーへ伝達することを提供する接合対形成システムに曝露し、該システムによる、該接合性プラスミドの、該細菌培養物の該ドナーメンバーから該レシピエントメンバーへ伝達の達成を可能にすることによって、該接合性プラスミドを含みかつ該ファージ受容体を発現する宿主細菌を生成する段階をさらに含む、請求項1001記載の方法。
[請求項1007]
接合性プラスミドが
a) 不和合性群N、P、もしくはWプラスミドより選択される;
b) ファージの複製に重要な1つもしくは複数の付加的遺伝子をコードする;
c) 1つもしくは複数の抗生物質耐性マーカーもしくは毒性マーカーをコードする;
d) 前記メンバーの染色体とは別のDNAの形態である;または
e) 1つもしくは複数の線毛遺伝子をコードする、
請求項1006記載の方法。
[請求項1008]
接合対形成システムが
a) 少なくとも1つの線毛接合遺伝子;
b) 別の移動性エレメント伝達系
を含む、請求項1006記載の方法。
[請求項1009]
a) 前記可能にすることが、少なくとも摂氏30度の温度で起こる;
b) 前記可能にすることが、複数の線毛遺伝子が発現される温度で起こる;
c) 前記達成が、少なくとも2時間という時間で起こる;
d) ドナーがF+細菌細胞である;
e) レシピエントがF-細菌細胞である;
f) 前記可能にすることが、接合性プラスミドを含む細菌培養物のメンバーの増加をもたらす、
g) ドナーが非病原菌株である;または
h) ドナーとレシピエントが1:1の2対数単位内の比である、
請求項1006記載の方法。
[請求項1010]
接触段階が
a) 前記受容体をコードする接合性プラスミドを含む各細菌細胞に対して少なくとも10個のファージ;
b) 接合性プラスミドの数を減少させ得るファージ;
c) 該プラスミドを含む前記メンバー中で複製ができないファージ;または
d) 接合性プラスミドを含む前記培養物のメンバー中で、その核酸を複製することができないファージ
との接触である、請求項1006記載の方法。
[請求項1011]
不均一な細菌培養物内で、ファージ結合に対する感受性を付与する移動性遺伝子エレメントを伝達する方法であって、該不均一な細菌細胞が、該ファージ結合に感受性のあるドナー細菌細胞、および該ファージ結合に非感受性のレシピエント細菌細胞を含み、該ドナー細菌細胞が、該移動性遺伝子エレメントが該ドナー細胞から該レシピエント細胞に伝達され得る条件下にあり、それによって、該移動性エレメントがレシピエント細胞に伝達されて、ドナー細胞上のテクティウイルスファージの結合に対する感受性が付与される、方法。
[請求項1012]
a) 移動性エレメントが、
i) テクティウイルスファージ受容体遺伝子;または
ii) 線毛遺伝子
の少なくとも1つをコードするプラスミドである;
b) プラスミドが
i) F、R386、R1、Col B-K99、Col B-K166、R124、R62、R64、R483、R391、R46、R724、RP4、RK2、R751、RSF1010、R401、R388、もしくはS-aより選択される;または
ii) Inc群N、P、もしくはWの中にある;または
iii) Inc群D、M、X、P1、U、W、C、もしくはJの中にある;
c) ファージに感受性のあるドナー細胞が
i) F+細胞である;または
ii) グラム陰性菌種に由来する;または
iii) エシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、プロテウス属(Proteus)、ビブリオ属(Vibrio)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、バチルス属(Bacillus)、もしくはミクロコッカス属(Micrococcus)より選択される属に由来する;
d) レシピエント細菌細胞が
i) F-細胞である;
ii) グラム陰性菌種に由来する;
iii) エシェリキア属、シュードモナス属、サルモネラ属、プロテウス属、ビブリオ属、アシネトバクター属、バチルス属、もしくはミクロコッカス属より選択される属に由来する;または
iv) 抗生物質耐性遺伝子もしくは毒性遺伝子の運搬体である;
e) 方法によって、コロニーまたは感染物中のファージ結合細胞の割合が増加する;
f) ファージが、PRD1、AP50、Bam35、NS11、PR3、PR4、PR5、PR722、L17、もしくはP37-14より選択される1つを含むテクティウイルスである;あるいは
g) 条件によって、ドナー細胞からレシピエント細胞への線毛タンパク質発現表現型の伝達が可能になる、
請求項1011記載の方法。
[請求項1013]
ドナー細胞とレシピエント細胞が異なる細菌種に由来する、請求項1011記載の方法。
[請求項1014]
ファージを投与して、受容体発現細胞に感染させる段階をさらに含む方法であって、
a) 該感染によって感受性細胞の死滅が起こる;
b) 該方法によって、抗生物質耐性遺伝子または細菌毒性遺伝子をコードする移動性エレメントの数が減少する;または
c) 該方法が、細菌細胞を、抗生物質、またはF線毛形成を誘導する化合物に曝露する段階をさらに含む、
請求項1011記載の方法。
[請求項1015]
テクティウイルス受容体を用いて、テクティウイルスの宿主として役立ち得る標的細菌内で機能的である強力な異種プロモーターによって駆動される、テクティウイルス受容体成分をコードするセグメントを含む遺伝子構築物。
[請求項1016]
a) 前記強力なプロモーターが前記成分の高発現を誘導し、これによって、宿主に対するテクティウイルスの結合が少なくとも5倍増加する;
b) 前記プロモーターが誘導性プロモーターである;
c) 前記構築物が、前記受容体成分に密接に連結された選択可能マーカーをさらに含む;
d) 前記標的細菌がグラム陰性菌である;または
e) 前記構築物により、感染において細菌がトランスフェクションされ得る、
請求項1015記載の方法。
[請求項1017]
溶菌ファージに結合するファージ受容体をコードする伝達性DNA、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物であって、該溶菌ファージが、該ファージ受容体を発現する細菌細胞を死滅させる、薬学的組成物。
[請求項1018]
a) 前記伝達性DNAが、N、P、W、D、M、X、P1、U、W、C、もしくはJより選択されるIncプラスミドである;または
b) 前記溶菌ファージが、PRD1、PRR1、PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GIL01、pGIL01、BAM35、もしくはGIL16と称されるファージである、
請求項1017記載の薬学的組成物。
[請求項1019]
請求項1016記載の溶菌ファージおよび前記薬学的組成物を伴う1つまたは複数の区画を含むキット。
[請求項1020]
以下の段階を含む、接合性プラスミドをドナー細菌細胞からレシピエント細菌細胞に伝達する方法であって、接合性プラスミドがファージ受容体成分をコードし、ドナー細菌細胞が脊椎動物に感染し、かつレシピエント細菌細胞が昆虫または植物に感染する、方法:
レシピエント細菌細胞をドナー細菌細胞と接触させる段階であって、それによって、接合性プラスミドのレシピエント細菌細胞への伝達が可能になる、段階。
[請求項1021]
ファージ受容体がテクティウイルス受容体である、請求項1020記載の方法。
[請求項1022]
接合性プラスミドを含むレシピエント細菌細胞を、前記受容体成分に結合するファージと接触させる段階をさらに含み、
該接触段階により、ファージのファージ受容体成分への結合、および接合性プラスミドを含むレシピエント細菌細胞の死滅が可能になる、
請求項1020記載の方法。
I. 序論
世界の多様な地域から単離されたファージの特異な群は、接合性プラスミドを有するグラム陰性細菌に感染することが特徴づけられた。Grahn, et al. (2006) 「PRD1: Dissecting the Genome, Structure and Entry」 Calendar (ed.) The Bacteriophages (2d ed.) Oxford Univ. Press, ISBN-13: 9780195148503を参照されたい。非常によく似た分離株はまた、グラム陽性宿主細菌に感染する。これらの密接に関連したファージは共にテクティウイルス科に分類され、これには、例えば、PR3、PR4、PR5、PR772、L17、AP50、NS11、およびP37-14と称されるファージが含まれる。これらのファージの様々な興味深い特徴の中には、ヒトアデノウイルスのものと非常によく似た複製機構、キャプシド構造、主要コートタンパク質折りたたみ、および頂点構造がある。このことから、これらのウイルスが、生命の細菌領域と真核生物領域の分岐に先行する共通の祖先を有する独自の系統に属するという示唆がもたらされた。テクティウイルス科(以下、テクティウイルスと称する)の構造特性から、これらのファージが、グラム陰性宿主細菌およびグラム陽性宿主細菌の両方に機能的に適用可能な結合および感染の機構を有することと一致するいくつかの基本原理が示唆される。したがって、宿主結合および感染における高選択性に関する一般的なファージ生物学教義は、記載の通り、これらの特定の広宿主域ファージに、およびおそらくはその他のものに当てはまらないようである。
「細菌培養物」とは、その一部またはすべてが細菌である細胞の集団である。実験の状況においては、典型的に培養物は均一であり、多くの場合はクローンである。臨床の状況においては、「不均一な細菌培養物」が存在する場合が多い。培養物は、それぞれがしばしば遺伝子変種を含む、複数の細菌種を含む場合が多く、これらは相互作用し、共同集団において体系的な生物学効果を示し得る。不均一な細菌培養物は、2つ以上の細菌種を含み得る。いくつかの態様においては、不均一な細菌培養物中に、2、3、5、または10を超える細菌種が見出される。不均一な細菌培養物の動的局面により、培養物中の異なる亜集団の相対量および蔓延、ならびに結果として生じる集団動向の方向に変化が生じ得る。他の状況において、特定の分離株はクローンであってよく、ある種の亜集団は異なる感染症症状の中心または原因であってよい。培養物の異なるメンバーはクローンであってよく、多クローン性であってもよく、または培養物は混合種を含んでもよい。集団は相乗的な集団成分を有してよく、この成分はしばしばバイオフィルム構造を形成する。例えば、Talsma (2007) 「Biofilms on medical devices」 Home Healthc. Nurse 25(9):589-94 PMID: 18049256;Paju and Scannapieco 「Oral biofilms, periodontitis, and pulmonary infections」 Oral Dis. 13(6):508-512 PMID: 17944664;Visai, et al. (2007) 「Staphylococcus biofilm components as targets for vaccines and drugs」 Int. J. Artif. Organs 30(9):813-819 PMID: 17918127;del Pozo and Patel (2007) 「The challenge of treating biofilm-associated bacterial infections」 Clin. Pharmacol. Ther. 82(2):204-209 PMID: 17538551;およびRyan (2007) 「Infection following soft tissue injury: its role in wound healing」 Curr. Opin. Infect. Dis. 220(2):124-128 PMID: 17496569、ならびに一般的な臨床微生物学の教科書を参照されたい。不均一な細菌培養物には、バイオフィルムなどの相乗的な/共生生物の培養物が含まれる。この種の不均一な細菌培養物では、培養物の成分を1つ排除すると、培養物は全体として生存不能となる可能性がある。例えば、Colin and Moran (2006) 「Molecular Interactions between Bacterial Symbionts and Their Hosts」 Cell 126: 453-465を参照されたい。
上記のように、抗生物質は、感染症によって示される問題の多くを回避することに関して、医学の実践に大変革をもたらした。ペニシリンの発見によってこのアプローチが始まり、微生物叢の増殖を妨げるための多くの異なる作用機序が活用されてきた。それに応じて、多くの細菌機構が抗生物質の活性を逃れるように進化し、実質的にすべての抗生物質によって、宿主標的が採用する耐性戦略が導かれた。多くの作用機序の中でも、細胞壁合成、細胞膜機能、タンパク質合成、核酸合成、および代謝作用を破壊する抗生物質が開発されてきた。さらに、多くの耐性手段は、しばしば染色体外に、遺伝的に共にクラスター化されるかまたは連鎖している場合が多く、効率的な様式で宿主間を伝達できるようになる。一般に、染色体外クラスターはRプラスミド上に存在するが、例えばFプラスミドまたはファージといった他の関連遺伝子形態上に存在してもよい。例えば、Torres, et al. (2007) 「Current concepts in antibiotic-resistant gram-negative bacteria」 Expert Rev. Anti Infect. Ther. 5(5):833-43を参照されたい。
プラスミドは典型的に、染色体外状態で安定して受け継がれる、レプリコンまたはDNAの複製断片である。古い文献では、エピソームという用語は、染色体に組み込まれ得るプラスミドに用いられたが、この用語はほとんど使用されなくなった。プラスミドは典型的に、自律的に複製する能力を有する二本鎖DNAの共有結合閉環断片として存在し、この性質のために、その単離および物理的認識がもたらされる。それらの構造の閉環共有結合性質のために、ゲル電気泳動または塩化セシウム浮遊密度勾配によって、それらを染色体DNAから分離することが可能となる。例えば、bact.wisc.edu、または微生物学もしくは分子生物学に関する基本的な教科書もしくは研究書を参照されたい。
古典的なファージ教義では、ファージの結合および感染は極めて狭い宿主域過程であること、ならびに大部分のファージは、多数の異なる宿主において結合するおよび/または複製する能力を欠いていることを述べている。テクティウイルス科のファージの記載から、広宿主域の特異な性質が並はずれていることが示唆される。狭宿主域の特異的機構は、選択的観察、ならびに宿主細胞結合機能、感染機能、複製機能、および溶解機能の典型的に高度に特殊化した相互作用の組み合わせに起因すると考えられる。
本発明の方法は、結果を達成するために天然の分離株を用いる代わりに人為的構築物を作製することによって、多くの場合に、より効率的に達成され得る。例えば、プラスミドまたはファージの天然分離株を向上させる特定の型を構築することができる。耐性マーカーまたは毒性マーカーに、改変を組み入れることができる。例えば治療的に有用な抗生物質に対抗するために天然で進化したマーカーからの変種操作型を用いて、別の関連選択手段に対する耐性に関して、選択性の増大を提供することができる。異なる抗生物質、例えば関連成分を用いて、発現のために1つまたは複数の所望の受容体により密接に連結され得る変種マーカーをコードするプラスミドを選択することができる。細菌の集団を別の選択マーカーに供して、広域スペクトルファージによる宿主破壊のより良い効率を提供する所望の型の移動性エレメントをより強力に選択することができる。あるいは、変種マーカーを、より高い発現レベルの受容体に、または対応するファージによる宿主死滅においてより高い親和性もしくは効率を示す受容体に連結することができる。所定の受容体を発現している宿主の死滅に際して、より良い効率または特徴を有するファージを構築してもよい。
本発明の実用的適用には、例えば、公衆衛生上の水処理および廃棄物処理、病院設定における細菌の処理、食品加工処理、耐性または毒性コードプラスミドの治療的または環境的排除、感染の効率的な感作または評価/検出、ならびにプラスミドを獲得するための選択圧およびその後のプラスミド含有細胞を死滅させるための段階が含まれる。プラスミドを有する細菌種の低減を含む他の適用は、動物施設において、例えば有害な細菌の存在が望ましくない建物および設備の適切な表面上で、行うことができる。加えて、本方法は、望ましくないプラスミドエレメントを含む細菌の全存在を除去するために、家畜、例えば(乳牛および肉牛、ブタ、ニワトリ、魚、エビ等)に対する適用にも適用することができる。
適用する方法または投与経路および投与量は、感染させる細菌株、感染の部位および程度(例えば、局所または全身)、用いるマーカーまたは受容体、ならびに治療を受ける対象によって異なる。プラスミドであろうとファージであろうと、その投与経路には、経口、エアロゾルまたは肺に送達するための他の装置、点鼻用スプレー、静脈内(IV)、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、眼内、腟内、直腸内、局所、腰椎穿刺、くも膜下腔内、ならびに脳および/または髄膜への直接適用が含まれるが、これらに限定されない。治療物質を送達するための媒体として用いることができる賦形剤は、当業者には明らかであろう。例えば、プラスミドまたはファージは凍結乾燥形態であってよく、静脈内注射による投与の直前に溶解することができる。投与用量は、宿主感染において細菌当たり約0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000、10000、またはそれ以上のプラスミド分子の範囲内になるように意図される。プラスミドはそれ自体がタンデムに会合していても、または複数のコピー形態(二量体、三量体、四量体、五量体等)であっても、または例えば断片もしくは異なるアジュバントのような1つもしくは複数の他の実態との組み合わせであってもよいが、そのプラスミドのサイズに応じて、用量は、約100万〜約10兆/kg/日、および好ましくは約1兆/kg/日であってよい。ファージ投与の後期段階において、用量は、宿主感染において細菌当たり約0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000、10000、もしくはそれ以上のファージ粒子、または約10E6殺菌単位/kg/日〜約10E13殺菌/kg/日であってよい。
本発明はさらに、薬学的に許容される賦形剤中に提供される、本発明のプラスミドおよび/またはファージを含む薬学的組成物を意図する。したがって、本発明の製剤および薬学的組成物は、特定の細菌宿主に伝達され得る単離されたプラスミドセグメント;同じまたは典型的な細菌宿主に影響を及ぼす2種、3種、5種、10種、もしくは20種またはそれ以上の実体の混合物;あるいは、異なる細菌宿主または同じ細菌宿主の異なる株に影響を及ぼす2種、3種、5種、10種、もしくは20種またはそれ以上の受容体をコードするプラスミドを含む製剤を意図する。細菌、例えば黄色ブドウ球菌の複数の株の増殖をまとめて阻害するプラスミドのカクテル混合物を用いることが有用であるという例が存在し得る。この様式で、本発明の組成物を目的の使用の必要性に適応させることができる。化合物または組成物は、典型的には無菌またはほぼ無菌である。
本発明を実施するいくつかの局面は、一般臨床微生物学の周知の方法、バクテリオファージを取り扱うための一般的方法、ならびにバイオテクノロジーの一般的基礎、原理、および方法を含む。このような方法に関する参考文献を下記に列挙するが、これらはあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
転写は、例えばベクター由来のDNA配列がRNAポリメラーゼによってコピーされて、産物のRNA、例えばメッセンジャーRNAまたはmRNAを産生する過程である。タンパク質またはペプチドの発現のために、mRNAの転写は潜在的に調節される段階であり、したがって、最終的に組換えタンパク質または組換えペプチドの発現レベルに影響を及ぼす。
本明細書に提供する構造および機能の説明に基づいて、好ましい特徴を最適化し得る相同体および変種を単離するまたは作製することができる。したがって、構造相同性により、または特徴的な遺伝子構成モチーフ中に見出される実体を評価することにより、プラスミド伝達、受容体発現、ファージ結合、または標的宿主死滅の機能のさらなる触媒セグメントを見出すことができる。プラスミド、ファージ受容体、または宿主細胞認識の遺伝子は、典型的には特定の遺伝子配置中に見出され、例えばバイオインフォマティクス手段により利用可能な配列情報を評価することによって、対応する配置中に見出される他の実体を見出すことができる。これらはまた、構造物の変種をスクリーニングするための開始点としても役立つ場合があり、例えば、このような構造物を突然変異誘発し、所望の特徴、例えば、より広範なプラスミド伝達性、より広範なファージ受容体機能、またはより広範な宿主標的特異性を有するものをスクリーニングする。突然変異誘発の標準的方法を用いることができる。適切な変種を見出すには、遺伝子またはドメインのシャフリング技術も適用可能である。
特定のプラスミドおよび宿主に関する接合条件のために最適化すべき重要なパラメータには、例えば、ドナー細胞およびレシピエント細胞の対数増殖期、接合のためのインキュベーション温度、および他の条件が含まれる。したがって、接合の頻度または効率に影響を及ぼし得る様々な成分には、温度が含まれてよく、適切な範囲にわたって力価測定することができる。温血動物のための治療的使用の場合には、温度範囲はおそらく摂氏約25〜45度であってよく、環境状況の場合には、温度範囲はおそらく外気温よりも20度高いまたは低い範囲であってよい。混合、撹拌、イオン強度、イオン濃度等の局面もまた、最適化することができる。最適化は、F+宿主とF-宿主のモル関係等に関して試験される。
F-宿主のF+宿主への変換の実証は、標準的な接合実験を用いて示すことができる。例えば、Paranchych and Frost (1988) 「The Physiology and Biochemistry of Pili」 Advances in Microbial Physiology 29:53-114;Low and Porter (1978) 「Modes of Gene Transfer and Recombination in Bacteria」 Ann. Rev. Genetics 12: 249-287;Rowbury (1977) 「Bacterial Plasmids with Particular Reference to their Replication and Transfer Properties」 Progress in Biophysics & Molecular Biology 31: 271-317;Simon, et al. (1983) 「A Broad Host Range Mobilization System for In Vivo Genetic Engineering: Transposon Mutagenesis in Gram Negative Bacteria」. Nature Biotechnology 1: 784-791;Clewell, et al (1993). Bacterial Conjugation. Plenum Press, New York. ISBN 0-306-44376-7;Grohmann, et al. (2003). 「Conjugative Plasmid Transfer in Gram-Positive Bacteria」. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67(2):277-301を参照されたい。特定のプラスミドおよび宿主に関する効率、伝達速度、条件の最適化等を評価することができる。
好ましくは容易に検出される適切なマーカーを選択する。毒性マーカーまたは耐性マーカーは、治療または公衆衛生の態様において一般的に最も関心が高いが、方法論が機能することを確証する際には、より簡単な検出マーカーが有用である。したがって、例えばGFPのような蛍光マーカーを用いて、マーカーが検出可能に伝達されることを示すことができ、またそのマーカーを所望のシステムに関して最適化することができる。
プラスミドを獲得した細胞を選択するためには、抗生物質プレート上に細胞をプレーティングすることで、プラスミドを獲得した細胞のみが選択されるため、プラスミド上の抗生物質マーカーまたは他の選択可能マーカーを用いることが理想的である。選択マーカーを所望のマーカーに連結してもよく、その結果、選択条件によって、好ましくはそのマーカーがほぼ直接選択される。マーカーが例えばファージによって標的化可能であれば、選択を切り抜けた細胞は、受容体によって媒介されるファージ感染過程に対して感受性を示すはずである。
ファージ受容体をコードする遺伝子と選択マーカーは同じプラスミド上にあり、好ましくは密接に連結されている。受容体コード遺伝子とマーカーが容易に分離され得ない可能性を最小限に抑えるための手段を組み入れてもよい。これらのマーカーは、適切なプラスミドの複製起点に密接に連結されてもよい。
個々の遺伝子欠失変異体を作製し、テクティウイルス感受性について試験することによって、ファージ感受性を含むプラスミド上の受容体コード領域を同定することを目指して、方法を適用することができる。分子生物学の方法、配列決定およびバイオインフォマティクス解析、ならびに操作方法を用いて、プラスミドの領域を同定して、どこがファージ感受性の機能的な伝達に必要であるのかを確かめることができる。
βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、GFP、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等は、これらの戦略にとって良好な選択マーカーである。選択または検出の手段は周知であり、容易に利用可能である。
ドナー細菌(Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval, Canadaから入手したネズミチフス菌LT2(pLM2))およびレシピエント細菌(Felix De Herelle Center, Laval, Canadaから入手したX. カンペストリスHER1103)の5ミリリットル培養物を、LBブロス中で、200 rpmで振盪しながら37℃および30℃で培養した。培養物の最終的なOD600は0.5〜0.7であった。
上記の説明により、例示的なプラスミド依存性ファージの種類、およびそのようなカテゴリーに入るファージの具体例の教示が提供される。様々な標的種が記載されており、一部のプラスミドは種特異的であるか、またはいくらか特異性が低い(おそらくは関連種のクラスター)。接合によるか、形質転換またはエレクトロポレーションを含む他の方法論によるかを問わず、適切なプラスミドを標的種に導入することができる。プラスミドが取り込まれ、かつ発現が起こる適切な条件が見出されたならば、標準的な方法によりファージ感受性を容易に試験する。アッセイは、多くの場合、所望の評価に応じて、液体培養物またはプレート培養物中で行ってよい。したがって、新たな組み合わせが報告されるまたは試験される際には、ファージD等を用いた例えばIncDプラスミドのような様々なプラスミド種の試験が確認またはスクリーニングされ得る。所望の受容体の発現またはファージ効果の効率を改善する培養条件をスクリーニングすることができる。
Claims (22)
- 以下の段階を含む、ファージ受容体に連結された抗生物質マーカーまたは毒性マーカーをコードするプラスミドの蔓延を減少させる方法であって、該プラスミドが不均一な細菌培養物中の細胞内に保有されている、方法:
a) 該細菌培養物を、ファージ受容体に結合し得る十分なファージ受容体特異的殺傷剤と接触させる段階であって、該接触段階により、該受容体特異的殺傷剤の該ファージ受容体への結合、および接合性の該プラスミドを含む宿主細菌の死滅が可能になり、それによって、不均一な細菌培養物中の、抗生物質または毒性因子をコードする接合性プラスミドの蔓延が減少する、段階。 - 蔓延の減少が
a) 細菌培養物中の接合性プラスミドの絶対数の減少;または
b) 細菌培養物のメンバー当たりの接合性プラスミドの数の減少
である、請求項1記載の方法。 - 蔓延の減少が少なくとも2分の1である、請求項1記載の方法。
- 細菌培養物が
a) 対数増殖期にある;
b) 定常状態増殖期にある;
c) ラクトバチルス培養物もしくは乳製品加工培養物である;
d) 水処理施設中に存在する;
e) 真核細胞もしくは器官培養物中に存在する;
f) 真核生物宿主中に存在する;
g) 脊椎動物生物中もしくは脊椎動物生物上に存在する;または
h) 哺乳動物中もしくは哺乳動物上に存在する、
請求項1記載の方法。 - ファージ受容体特異的殺傷剤が
a) テクティウイルス(tectivirus)である;
b) 広宿主域脂質含有ファージである;
c) RPD1ファージ群のメンバーである;
d) プラスミド依存性広宿主域バクテリオファージである;
e) テクティウイルス科(tectiviridae)である、
f) 正二十面体形態、脂質含量、直径55〜65 nmの頭部、および12〜130 nmの尾部のうちの少なくとも1つまたは複数を特徴とするファージである;
g) PRD1、PRR1、PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GILO1、pGILO1、BAM35、またはGIL 16と称されるファージの群より選択される、
請求項1記載の方法。 - 細菌培養物を、前記受容体をコードする少なくとも1つの接合性プラスミドを細菌培養物のドナーメンバーからレシピエントメンバーへ伝達することを提供する接合対形成システムに曝露し、該システムによる、該接合性プラスミドの、該細菌培養物の該ドナーメンバーから該レシピエントメンバーへ伝達の達成を可能にすることによって、該接合性プラスミドを含みかつ該ファージ受容体を発現する宿主細菌を生成する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 接合性プラスミドが
a) 不和合性群N、P、もしくはWプラスミドより選択される;
b) ファージの複製に重要な1つもしくは複数の付加的遺伝子をコードする;
c) 1つもしくは複数の抗生物質耐性マーカーもしくは毒性マーカーをコードする;
d) 前記メンバーの染色体とは別のDNAの形態である;または
e) 1つもしくは複数の線毛遺伝子をコードする、
請求項6記載の方法。 - 接合対形成システムが
a) 少なくとも1つの線毛接合遺伝子;
b) 別の移動性エレメント伝達系
を含む、請求項6記載の方法。 - a) 前記可能にすることが、少なくとも摂氏30度の温度で起こる;
b) 前記可能にすることが、複数の線毛遺伝子が発現される温度で起こる;
c) 前記達成が、少なくとも2時間という時間で起こる;
d) ドナーがF+細菌細胞である;
e) レシピエントがF-細菌細胞である;
f) 前記可能にすることが、接合性プラスミドを含む細菌培養物のメンバーの増加をもたらす、
g) ドナーが非病原菌株である;または
h) ドナーとレシピエントが1:1の2対数単位内の比である、
請求項6記載の方法。 - 接触段階が
a) 前記受容体をコードする接合性プラスミドを含む各細菌細胞に対して少なくとも10個のファージ;
b) 接合性プラスミドの数を減少させ得るファージ;
c) 該プラスミドを含む前記メンバー中で複製ができないファージ;または
d) 接合性プラスミドを含む前記培養物のメンバー中で、その核酸を複製することができないファージ
との接触である、請求項6記載の方法。 - 不均一な細菌培養物内で、ファージ結合に対する感受性を付与する移動性遺伝子エレメントを伝達する方法であって、該不均一な細菌細胞が、該ファージ結合に感受性のあるドナー細菌細胞、および該ファージ結合に非感受性のレシピエント細菌細胞を含み、該ドナー細菌細胞が、該移動性遺伝子エレメントが該ドナー細胞から該レシピエント細胞に伝達され得る条件下にあり、それによって、該移動性エレメントがレシピエント細胞に伝達されて、ドナー細胞上のテクティウイルスファージの結合に対する感受性が付与される、方法。
- a) 移動性エレメントが、
i) テクティウイルスファージ受容体遺伝子;または
ii) 線毛遺伝子
の少なくとも1つをコードするプラスミドである;
b) プラスミドが
i) F、R386、R1、Col B-K99、Col B-K166、R124、R62、R64、R483、R391、R46、R724、RP4、RK2、R751、RSF1010、R401、R388、もしくはS-aより選択される;または
ii) Inc群N、P、もしくはWの中にある;または
iii) Inc群D、M、X、P1、U、W、C、もしくはJの中にある;
c) ファージに感受性のあるドナー細胞が
i) F+細胞である;または
ii) グラム陰性菌種に由来する;または
iii) エシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、プロテウス属(Proteus)、ビブリオ属(Vibrio)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、バチルス属(Bacillus)、もしくはミクロコッカス属(Micrococcus)より選択される属に由来する;
d) レシピエント細菌細胞が
i) F-細胞である;
ii) グラム陰性菌種に由来する;
iii) エシェリキア属、シュードモナス属、サルモネラ属、プロテウス属、ビブリオ属、アシネトバクター属、バチルス属、もしくはミクロコッカス属より選択される属に由来する;または
iv) 抗生物質耐性遺伝子もしくは毒性遺伝子の運搬体である;
e) 方法によって、コロニーまたは感染物中のファージ結合細胞の割合が増加する;
f) ファージが、PRD1、AP50、Bam35、NS11、PR3、PR4、PR5、PR722、L17、もしくはP37-14より選択される1つを含むテクティウイルスである;あるいは
g) 条件によって、ドナー細胞からレシピエント細胞への線毛タンパク質発現表現型の伝達が可能になる、
請求項11記載の方法。 - ドナー細胞とレシピエント細胞が異なる細菌種に由来する、請求項11記載の方法。
- ファージを投与して、受容体発現細胞に感染させる段階をさらに含む方法であって、
a) 該感染によって感受性細胞の死滅が起こる;
b) 該方法によって、抗生物質耐性遺伝子または細菌毒性遺伝子をコードする移動性エレメントの数が減少する;または
c) 該方法が、細菌細胞を、抗生物質、またはF線毛形成を誘導する化合物に曝露する段階をさらに含む、
請求項11記載の方法。 - テクティウイルス受容体を用いて、テクティウイルスの宿主として役立ち得る標的細菌内で機能的である強力な異種プロモーターによって駆動される、テクティウイルス受容体成分をコードするセグメントを含む遺伝子構築物。
- a) 前記強力なプロモーターが前記成分の高発現を誘導し、これによって、宿主に対するテクティウイルスの結合が少なくとも5倍増加する;
b) 前記プロモーターが誘導性プロモーターである;
c) 前記構築物が、前記受容体成分に密接に連結された選択可能マーカーをさらに含む;
d) 前記標的細菌がグラム陰性菌である;または
e) 前記構築物により、感染において細菌がトランスフェクションされ得る、
請求項15記載の方法。 - 溶菌ファージに結合するファージ受容体をコードする伝達性DNA、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物であって、該溶菌ファージが、該ファージ受容体を発現する細菌細胞を死滅させる、薬学的組成物。
- a) 前記伝達性DNAが、N、P、W、D、M、X、P1、U、W、C、もしくはJより選択されるIncプラスミドである;または
b) 前記溶菌ファージが、PRD1、PRR1、PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GIL01、pGIL01、BAM35、もしくはGIL16と称されるファージである、
請求項17記載の薬学的組成物。 - 請求項16記載の溶菌ファージおよび前記薬学的組成物を伴う1つまたは複数の区画を含むキット。
- 以下の段階を含む、接合性プラスミドをドナー細菌細胞からレシピエント細菌細胞に伝達する方法であって、接合性プラスミドがファージ受容体成分をコードし、ドナー細菌細胞が脊椎動物に感染し、かつレシピエント細菌細胞が昆虫または植物に感染する、方法:
レシピエント細菌細胞をドナー細菌細胞と接触させる段階であって、それによって、接合性プラスミドのレシピエント細菌細胞への伝達が可能になる、段階。 - ファージ受容体がテクティウイルス受容体である、請求項20記載の方法。
- 接合性プラスミドを含むレシピエント細菌細胞を、前記受容体成分に結合するファージと接触させる段階をさらに含み、
該接触段階により、ファージのファージ受容体成分への結合、および接合性プラスミドを含むレシピエント細菌細胞の死滅が可能になる、
請求項20記載の方法。
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