JP2016539658A - テンポリンＳＨａのアナログおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規な抗微生物ペプチドに、該ペプチドを含む医薬組成物に、およびそれらの使用に、特に抗微生物薬、殺菌剤、殺虫剤または保存剤としての使用に関する。本発明はまた、新規な該ペプチドを発現するトランスジェニック植物にも関する。

Description

本発明は、新規な抗微生物ペプチドに、該ペプチドを含む医薬組成物に、およびそれらの使用に、特に薬剤、殺菌剤、保存剤、殺虫剤またはバイオフィルム形成を防止する剤としての使用に関する。

抗生物質の耐性が細菌間で進化し、蔓延することは、特に多剤耐性菌株が出現している病院では現代における公衆の健康上の大きな問題である。徹底した研究による努力はこれらの耐性菌株に対して効果的な新規な抗生物質の開発をもたらした。にも拘わらず、これらの薬剤を用いることで、その耐性機構が出現し、その効能が制限される。

この環境に鑑みて、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）は新たな治療剤を設計するのに極めて有望であると思われる。カチオン性抗微生物ペプチドは多細胞生物の先天的免疫系の重要な構成成分の一つであり、病原に拮抗する一次防御を提供すると考えられる。その一方で、これらのペプチドへの関心は、多剤耐性菌により惹起される感染の治療において特にその使用を可能とする活性の極めて広域なスペクトルにある。次に、その活動モードは微生物膜の浸透化または迅速な分画化に基づくものであり、かくして耐性機構の発展に至るものではないようである。

特に、ＡＭＰは細菌性バイオフィルムに対する薬剤候補として多くの関心を引き付けた。バイオフィルムは、互いにくっついて、自己生産性マトリックス中に埋め込まれるコミュニティを形成する細菌である。バイオフィルム細菌は、その自由生活性カウンターパートよりも耐性がずっと大きく、治療が困難な、嚢胞性線維症、心内膜炎、膀胱炎に感染した患者の慢性感染、留置性医学装置により引き起こされる感染および虫歯および歯周炎に関連する歯垢形成などの種々の病態に関与する。バイオフィルムの抗生物質に対する耐性は、主として、かかるコミュニティでの細菌の遅い成長速度、および低い代謝活性によるため、ＡＭＰの使用は魅力的な治療方法であると考えられ、その活動モードのために、成長の遅い、または全く成長しない細菌にも作用する可能性が高い。

抗微生物ペプチドは、植物、昆虫、両生類および哺乳動物にて確認されている。両生類の皮膚は抗微生物ペプチドの主要な供給源に相当し、全種類のカエルは一般に１０〜１５種のＡＭＰからなるその特異的ペプチドレパートリーを有する。

アカガエル科のカエルはその種類が非常に多く、この科は今では１６属および３３８種を数える。これらのカエルは、１３のファミリーに分類される、著しく多様性のあるＡＭＰを合成して分泌する（Conlonら、2008および2009）。かかるファミリーの一つである、テンポリンは、小型（一般に、１０〜１４個の残基）のＡＭＰを含み、その配列は種類によって大きく変化する。テンポリンファミリーのうちで１００より多くの構成員が同定されている。これらのテンポリンは、例えば、ヨーロッパアカガエル（Rana temporaria）（Simmacoら、1996)、アカガエル（Rana esculenta）（Simmacoら、1990)、ニホンアカガエル（Rana japonica）（Isaacsonら、2002)、ヤマアカガエル（Rana ornativentris）（Kimら、2001）およびヨーロッパトノサマガエル（Pelophylax (Rana) saharica）（Abbassiら、2008; Abbassiら、2010; Abbassiら、2013）などの数種のラナ（Rana）種より単離された。

アカガエル科の他の１２のファミリーのペプチドと異なり、テンポリンは、ジスルフィド結合により環化されるＣ−末端ヘプタペプチドドメインである、「Ranaボックス」モチーフを欠く（Mangoni、2006）。さらには、テンポリンの多数は、単一の塩基性残基を有し、生理学的ｐＨで＋２の実効電荷を付与する。一般に、テンポリンは、グラム陰性菌および酵母に対して特に活性であるが、抗真菌特性（Rollins-Smithら、2003）も、そしてあるものは、抗ウイルス特性（Chincharら、2004）も示す。

北アフリカ（North African）ガエル（Pelophylax saharica）の皮膚より単離されたテンポリンＳＨａが、リーシュマニア症の原因となるリーシュマニア属（genus Leishmania）に属する原生生物に対して駆虫薬活性を示すことが判明した（Abbassiら、2008）。この知見に基づき、αへリックスの極性面にある１または複数のアミノ酸を塩基性アミノ酸で置換することにより改善された抗微生物活性を示すテンポリンのアナログが得られた（ＷＯ ２０１０／１０６２９３）。しかしながら、その毒性、特にその溶血作用は、該アナログが全身投与されるとした場合に、それが治療を目的として使用されるのに障壁を構成することとなる。

従って、強い抗微生物活性を示すと同時に、哺乳動物細胞に対する毒性が大きく減少した、改善された抗微生物ペプチドに対する多大な期待が今なお存在する。

本発明は、抗微生物活性の増加および溶血作用の減少を示す、新規な抗微生物ペプチドである、テンポリンＳＨａのアナログを提供することを目的とする。

従って、本発明は、１３〜１００個のアミノ酸を含む大きさであって、抗微生物活性を示し、配列：Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２）（ここで、Ｘ_１はＲ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_２はＶ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_３はＭ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、およびＸ_４はＦ、Ｌ、ＩおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸である：ただしＸ_２がＶである場合、その時にはＸ_３はＫ、ＲおよびＨからなる群より選択され、および／またはＸ_４はＬ、ＩおよびＷからなる群より選択される）を含むペプチド、ならびに該ペプチドの機能的誘導体および医薬的に許容される塩に関する。

好ましくは、Ｘ_１はＫを表し、Ｘ_２はＶおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_３はＭおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、およびＸ_４はＦ、ＬおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸である。

特に、該ペプチドは、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：３）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：４）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ（配列番号：５）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｗ（配列番号：６）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｉ（配列番号：７）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ（配列番号：８）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｗ（配列番号：９）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｉ（配列番号：１０）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｗ（配列番号：１１）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ（配列番号：１２）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｉ（配列番号：１３）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：１４）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ（配列番号：１５）；
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｗ（配列番号：１６）；および
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｉ（配列番号：１７）
からなる群より選択される配列を含む、または該配列からなるペプチドからなる群より選択されてもよい。

好ましくは、該ペプチドは、配列番号：３〜６、８、９、１１、１２、および１４〜１６の配列からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる。より好ましくは、該ペプチドは、配列番号：３〜６、および８の配列からなる群より、さらにより好ましくは、配列番号：３、５および６の配列からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる。

もう一つ別の態様において、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸、該核酸を含む発現カセットまたは発現ベクターに関する。本発明はさらには、該核酸、発現カセットまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

本発明はまた、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体にも関する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の少なくとも１つのペプチド、および医薬的に許容される支持体および／または賦形剤を含む、医薬組成物に関する。

本発明はさらには、薬剤として用いる本発明に係るペプチドに関する。好ましくは、該薬剤は細菌、ウイルス、真菌または寄生虫により惹起される感染を治療するものとする。好ましくは、寄生虫はリーシュマニア属に属し、小児リーシュマニアであることが好ましい。

さらに別の態様において、本発明は、本発明に係るペプチドの殺菌剤、保存剤または殺虫剤としての使用に関する。

もう一つ別の態様において、本発明は、本発明に係るペプチドで被覆されるか、または該ペプチドを含む、少なくとも１の表面を有する本体を含む、医療装置またはインプラントに関する。

最終の態様において、本発明は、本発明に係るものであって、本発明に係るペプチドを発現しうる、あるいは発現している核酸、カセットまたは発現ベクターを含む、トランスジェニック植物に関する。

テンポリンＳＨａのαヘリックスのシッファー−エドモンソン（Schiffer-Edmunson）突出部を示す。残基４、１１、７、３および１０は該ヘリックスの極性面を構成する。残基８、１、１２、５、９、２、１３および６は該ヘリックスの非極性面を構成する。 テンポリンＳＨａおよびアナログの一次構造および物理化学特性を示す。すべてのペプチドはＣ−末端でアミド化される（ａ）。アミノ酸残基の修飾（置換および欠失）は親ペプチドのテンポリンＳＨａとの関連で太文字で示される。太文字の横線は欠失（−）に相当する。実効電荷はｐＨ７.４で算定された。平均疎水性（＜Ｈ＞）および平均相対的疎水性モーメント（＜μＨ＞）をHydroMCalc（http://www.bbcm.univ.trieste.it/〜tossi/HydroCalc/HydroMCalc.html）を用いてＣＣＳスケール（Combined Consensus hydrophobicity Scale）で算定した。 本発明のテンポリンＳＨａおよびアナログのシッファー−エドモンソン突出部を示す。ヘリカルホイールをHeliQuest（http://heliquest.ipmc.cnrs.fr）を用いて図示した。「Ｎ」および「Ｃ」は、各々、Ｎ−末端およびＣ−末端を表す。非極性および極性／中性／荷電の残基が示され、アミノ酸の体積に比例して円形で図示される。疎水性モーメントベクター（＜μＨ＞）も（矢印で）示される。すべてのペプチドはヘリカルホイールの対面に位置する疎水性および親水性／塩基性残基の２つの十分に分離されたクラスターを有する両親媒性構造を明確に取り入れる。 テンポリンＳＨａおよびテンポリンＳＨａの置換または短縮されたアナログの抗微生物活性および細胞毒性活性を示す。抗生物質耐性のスタフィロコッカス・アウレウス菌株（エス・アウレウスＡＴＣＣ４３３００およびＡＴＣＣ ＢＡＡ−４４）に対する活性も示される。ＮＤ：測定せず；ａ：メチシリンおよびオキサシリンに対して耐性であり；ｂ：メチシリン、アモキシリン／クラブラン酸、セファロチン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、オキサシリン、ペニシリン、トラサイクリン、アンピシリン、ドキシサイクリン、アジスロマイシン、セフトリアゾン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ペフロキサシン、リファンピンおよびトブラマイシンに対して耐性である。 テンポリンＳＨａの置換されたアナログの抗微生物活性および細胞毒性活性を示す。ＮＤ：測定せず

テンポリンＳＨａ（これまではテンポリン−１Ｓａとして知られる）は北アフリカガエルであるペロフィラックス・サハリカ（Pelophylax saharica）（Abbassiら、2008）の皮膚より単離された。このテンポリンは５０残基の前駆体（ジンバンクデータベース番号：ＣＡＯ７７２８２）を翻訳後に成熟化させることにより得られる。この前駆体は、シグナルペプチドと、酸性残基に富む領域とを含有する保存性の高いＮ−末端ドメイン、ならびにテンポリンＳＨａの先祖配列を含有する超可変性Ｃ−末端ドメインを有する。インビボにおいて、テンポリンの成熟形態は、ｉ）先祖配列に先んずるＫＲダブレットをタンパク質分解に付して切断し、ｉｉ）Ｃ−末端のＫ残基をカルボキシペプチダーゼの作用により先祖配列から排除し、およびｉｉｉ）テンポリンのＣ−末端残基を、アミド基のドナー（ペプチジル−グリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼの基質）として供する、先祖配列のＣ−末端のＧ残基によりアミド化して得られる。成熟タンパク質は長さが１３個のアミノ酸で、Ｆ−Ｌ−Ｓ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：１）の配列を有するペプチドである。テンポリンは水溶液中で構造化されないが、膜擬似環境にてαヘリカル構造を取り入れる。

該ペプチドは、グラム陽性およびグラム陰性菌、酵母および寄生虫の小児リーシュマニア（Leishmania infantum）（Abbassiら、2008）に対して抗微生物活性を示す。テンポリンＳＨａの抗寄生虫作用は、前鞭毛型および無菌性無前鞭毛型の両方の形態の寄生虫に対して、各々、１８.１μＭおよび２２.８μＭのＩＣ_５０で生じる。

ＡＭＰを最適化するのに生じる主たる問題は、その抗微生物活性およびその細胞溶解活性が数種のパラメータ（カチオン性、疎水性、α−ヘリックス性および両親媒性を含むパラメータ）間の微妙な平衡を反映することである（Giangasperoら、2001；Yeamanら、2003；Dennisonら、2005）。これらのパラメータは極めて密接にリンクしており、アミノ酸残基を置換するだけでペプチドの数種の物理化学特性の同時修飾を誘発しうる（Conlonら、2007）。

これまでの研究にて、本発明者らは、テンポリンＳＨａのα−ヘリックスの極性面の１または複数のアミノ酸を塩基性アミノ酸と置換することで、抗微生物活性の増加したテンポリンのアナログが得られることが分かった。特に、該発明者らは、配列番号：１のテンポリンＳＨａの残基３を塩基性アミノ酸、すなわち、Ｈ、ＲまたはＫで置換することで、グラム陽性およびグラム陰性菌、酵母および小児リーシュマニアに対する活性が増加することを証明した。

本発明者らは、意外にも、該テンポリンＳＨａアナログのα−ヘリックスの非極性面の１または複数のアミノ酸をさらに置換することで、抗微生物活性を保持しながら、細胞溶解活性を大きく減少させることを見出した。

定義
本明細書において、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語は、互換的に利用され、ペプチド結合により連結したアミノ酸の鎖をいい、その鎖を形成するアミノ酸の数は関係ない。

本明細書に記載のペプチド配列において、アミノ酸は、次の命名に従って、Ｃ：システイン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｍ：メチオニン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：トレオニン；Ｖ：バリン；Ｗ：トリプトファンおよびＹ：チロシンの１文字コードで表される。

位置またはアミノ酸との関係で、本明細書にて使用される「置換」なる語は、特定の位置にあるアミノ酸がもう一つ別のアミノ酸により置換されていること、あるいは野生型ペプチド（配列番号：１）のアミノ酸と異なるアミノ酸が存在することを意味する。

本明細書にて使用される「保存的置換」なる語は、一のアミノ酸残基が、類似する化学的または物理的特性（大きさ、電荷または極性）を有するもう一つ別の残基により置換されることをいう。一例として、イソロイシン、ロイシン、アラニンおよびバリンは、（ｉ）リジン、ヒスチジンおよびアルギニン、または（ｉｉ）セリンおよびトレオニン、または（ｉｉｉ）システインおよびメチオニン、または（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミン、または（ｖ）トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン、または（ｖｉ）アスパラギン酸およびグルタミン酸と同様に、相互に保存的に置換されてもよい。

本明細書にて使用される「微生物」なる語は、細菌、真菌、酵母、ウイルスおよび／または寄生虫をいう。

本明細書にて使用される「微生物感染」なる語は、細菌、真菌、酵母、ウイルスおよび／または寄生虫により引き起こされる感染をいう。

本明細書にて使用される「抗微生物活性」なる語は、抗菌、抗ウイルス、抗真菌、および／または抗寄生虫活性をいう。該活性は、ＩＣ_５０またはＭＩＣなどの異なるパラメータを測定することで評価されてもよい。

「ＩＣ_５０」または「最大半減阻害濃度」は微生物の母集団のインビトロにおける増殖を半分にまで減少させるのに必要とされる物質の濃度である。

「ＭＩＣ」または「最小阻害濃度」は、一般には３７℃で、その試験物質の存在下でインキュベートしてから１８時間後に微生物の増殖を完全に阻害するであろうその物質の最低濃度である。

本明細書にて使用される「致死濃度の５０％」または「ＬＣ_５０」なる語は、母集団の半分を殺すのに必要とされる物質の濃度をいう。ＬＣ_５０は物質の毒性の定量的インジケータである。特に、ＬＣ_５０は本明細書にてＡＭＰの細胞溶解活性を評価するのに使用され、この場合には、細胞母集団の半分を溶解するように誘発するペプチドの濃度に相当する。

第１の態様において、本発明は、αヘリックスの極性面の残基３、および非極性面の残基６、８および／または１３が置換されているテンポリンＳＨａのペプチドアナログに関する（図１および２を参照のこと）。特に、該アナログにおいて、残基３、６および８は塩基性アミノ酸で置換される。

従って、本発明は、抗微生物活性を示し、配列：Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２）（ここで、Ｘ_１はＲ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_２はＶ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、ＸはがＭ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、そしてＸ_４はＦ、Ｌ、ＩおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸である：ただし、Ｘ_２がＶである場合、その時にはＸ_３はＫ、ＲおよびＨからなる群より選択され、および／またはＸ_４はＬ、ＩおよびＷからなる群より選択される）を含む、あるいは該配列からなるテンポリンＳＨａのペプチドアナログ、ならびに該ペプチドの機能的誘導体および医薬的に許容される塩に関する。

特定の実施態様において、Ｘ_１がＫで、Ｘ_２がＶで、Ｘ_３がＫである場合、その時にはＸ_４はＬ、ＩおよびＷからなる群より選択され、Ｘ_１がＫで、Ｘ_２がＫで、Ｘ_３がＭである場合、その時にはＸ_４はＦ、ＩおよびＷからなる群より選択される。

好ましくは、Ｘ_１はＫを表し、Ｘ_２はＶおよびＫからなる群より選択され、Ｘ_３はＭおよびＫからなる群より選択され、そしてＸ_４はＦ、ＬおよびＷからなる群より選択される。

一の実施態様によれば、本発明のペプチドは、
Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：１８）、
Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：１９）、
Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２０）、
Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：２１）、
Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２２）、
Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２３）および
Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２）
（ここで、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３は、同一または異なり、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択され、そしてＸ_４はＩ、ＬおよびＷからなる群より、好ましくはＬおよびＷからなる群より選択される）
からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる。

好ましい実施態様において、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３は、配列番号：２および１８ないし２３において、Ｋを表す。好ましくは、Ｘ_４は、配列番号：２、２０、２２および２３において、Ｌを表す。

特定の実施態様によれば、ペプチドは、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：３）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：４）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ（配列番号：５）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｗ（配列番号：６）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｉ（配列番号：７）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ（配列番号：８）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｗ（配列番号：９）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｍ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｉ（配列番号：１０）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｗ（配列番号：１１）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ（配列番号：１２）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｉ（配列番号：１３）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：１４）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ（配列番号：１５）、
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｗ（配列番号：１６）および
Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｉ−Ｋ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｉ （配列番号：１７）
からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる。

好ましくは、該ペプチドは、配列番号：３〜６、８、９、１１、１２および１４〜１６の配列からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる。
より好ましくは、該ペプチドは、配列番号：３〜６および８の配列からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなり、さらにより好ましくは、配列番号：３、５および６の配列からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる。

一の実施態様によれば、該ペプチドは、１３個と１００個との間の大きさのアミノ酸、好ましくは１３個と３０、３５、４０、４５または５０個との間の大きさのアミノ酸である。もう一つ別の実施態様によれば、該ペプチドは、１３個と１５、２０または２５個との間の大きさのアミノ酸である。特定の実施態様において、該ペプチドは大きさが１３個のアミノ酸である。

本発明に係るペプチドは、成熟した抗微生物ペプチドの先駆体であり得る。該先駆体は、次に、ＡＭＰの成熟形態に至る翻訳後修飾を受ける。このように、該先駆体は転座シグナル配列を含んでもよく、該先駆体がこれらの翻訳後修飾を受けることを可能とするように認識および／または切断部位を含んでもよい。特定の実施態様によれば、該ペプチドは成熟した抗微生物ペプチドの先駆体であり、配列：Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｔ−Ｉ−Ｎ−Ｌ−Ｓ−Ｌ−Ｃ−Ｅ−Ｑ−Ｅ−Ｒ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｒ−Ｒ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｎ−Ｅ−Ｓ−Ｎ−Ｖ−Ｅ−Ｖ−Ｅ−Ｋ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４−Ｇ−Ｋ（配列番号：２４）（ここで、Ｘ_１はＲ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_２はＶ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_３はＭ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、そしてＸ_４はＦ、Ｉ、ＬおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸である；ただし、Ｘ_２がＶである場合、その時にはＸ_３はＫ、ＲおよびＨからなる群より選択され、および／またはＸ_４はＬ、ＩおよびＷからなる群より選択される）を含む。

本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ配置であっても、Ｄ配置であってもよく、好ましくはＬ配置である。

本発明に係るペプチドは、翻訳後修飾および／または化学修飾、特に糖鎖形成、アミド化、アシル化、アセチル化またはメチル化がなされてもよい。

ペプチドのペプチダーゼに対する耐性を改善することによってその生物学的利用能を向上させるために、保護基をＣ−および／またはＮ−末端に付加してもよい。例えば、Ｎ−末端での保護基はアシル化またはアセチル化したものであってもよく、Ｃ−末端での保護基はアミド化またはエステル化したものであってもよい。好ましくは、本発明のペプチドは、Ｃ−末端のアミド化、およびＮ−末端のアセチル化、ならびにその組み合わせからなる群より選択される保護基を含む。プロテアーゼの作用はまた、Ｄ配置のアミノ酸を用いることで、ジスルフィド結合、ラクタム環またはＣ−およびＮ−末端の間に結合を形成することによりペプチドを環化することで遮断されてもよい。本発明のペプチドはまた、「典型的な」ＣＯＮＨペプチド結合に取って代わり、ペプチダーゼに対する耐性を増大させる擬ペプチド結合、例えばＣＨＯＨ−ＣＨ２、ＮＨＣＯ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＯ−ＣＨ２、Ｎ−Ｎ、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＨ２ＮＨおよびＣＨ２−Ｓを含んでもよい。好ましい実施態様において、本発明に係るペプチドはそのＣ−末端でアミド化されている。

本発明に係るペプチドは、希アミノ酸である１または複数のアミノ酸、特にヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸；または合成アミノ酸、特にオルニチン、ノルロイシン、ノルバリンおよびシクロヘキシルアラニンを含んでもよい。

本発明はまた、上記されるような、本発明に係るペプチドの機能的誘導体を包含する。本明細書中に使用されるような「機能的誘導体」なる語は、実質的に同じアミノ酸配列であり、実質的に同じらせん構造を有し、そして実質的に同じ抗微生物活性を有するペプチドをいう。該機能的誘導体は、例えば、レトロペプチド、レトロインベルソペプチド、保存的置換のあるペプチド、その１または複数のアミノ酸の側鎖が本発明のペプチドの抗微生物活性を修飾しない基によって置換されているペプチドであってもよい。「機能的誘導体」なる語はまた、その配列がＣ−末端および／またはＮ−末端で１、２、３または４個のアミノ酸により、好ましくはＮ−末端で１または２個のアミノ酸により短縮された本発明に係るペプチドをいう。

特定の実施態様において、「機能的誘導体」なる語は、レトロまたはレトロインベルソペプチド、好ましくはレトロインベルソペプチド、および／またはそのＮ−末端で１または２個のアミノ酸により短縮された配列を含む、またはその配列からなる本発明に係るペプチド、すなわち、Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２５）またはＸ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２６）（ここで、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３およびＸ_４は上記の実施態様に記載されているのと同じ意義を有する）をいう。

本発明はまた、抗微生物活性を示し、配列：Ｘ_５−Ｘ_６−Ｉ−Ｖ−Ｘ_７−Ｍ−Ｌ−Ｘ_８−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：２７）またはＬ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｉ−Ｖ−Ｘ_７−Ｍ−Ｌ−Ｘ_８−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：２８）（ここで、Ｘ_５はＳ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_６、Ｘ_７およびＸ_８は、同一または異なり、Ｇ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_５がＳである場合、残基Ｘ_６、Ｘ_７およびＸ_８のうち少なくとも１つはＲ、ＨおよびＫからなる群より選択される）を含むか、または該配列からなる、テンポリンＳＨａのペプチドアナログ、あるいは該ペプチドの機能的誘導体および医薬的に許容される塩に関する。

好ましい実施態様において、Ｘ_５はＲ、ＨおよびＫからなる群より選択される、好ましくはＫであるアミノ酸であり、Ｘ_６、Ｘ_７およびＸ_８はＧを表す。

特定の実施態様において、ペプチドは、配列：Ｘ_５−Ｘ_６−Ｉ−Ｖ−Ｘ_７−Ｍ−Ｌ−Ｘ_８−Ｋ−Ｌ−Ｆ（配列番号：２７）を含むか、または該配列からなる。好ましくは、この実施態様において、Ｘ_５はＲ、ＨおよびＫからなる群より選択される、好ましくはＫであるアミノ酸であり、Ｘ_６、Ｘ_７およびＸ_８はＧを表す。

本発明はまた、本発明に係るペプチドの医薬的に許容される塩を包含する。医薬的に許容される塩は、製薬技法にて一般に利用される、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸などの医薬的に許容される鉱酸の塩；酢酸、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、アスコルビン酸および酒石酸などの医薬的に許容される有機酸の塩；ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムまたはアンモニウムの塩などの医薬的に許容される無機塩基の塩；または塩形成性窒素を含有する有機塩基の塩であってもよい。該塩を調製する方法は当業者に周知である。

発明に係るペプチドは、典型的な化学合成（固相または均一液相における合成）により、または酵素合成（Kullmanら、1987）により得られてもよい。下記に示されるように、ペプチドをコードする導入遺伝子を含む宿主細胞を培養し、該宿主細胞から、または該ペプチドを分泌した培地から該ペプチドを抽出することからなる方法により得られてもよい。

本発明に係るペプチドは抗微生物活性を示し、テンポリンＳＨａと比べて減少した細胞溶解活性を示す。

好ましくは、本発明に係るペプチドは細胞溶解活性を全く示さないか、ほとんど示さない。特に、本発明のペプチドは、赤血球について３０μＭよりも大きなＬＣ_５０を、好ましくは４０、５０、１００、２００、５００、６００、８００μＭよりも大きなＬＣ_５０を有し得る。ＬＣ_５０値は、例えば、ラット、イヌ、ウサギ、ブタ、ネコまたはヒトの白血球について、好ましくはラットまたはヒトの赤血球について、より好ましくはラットの赤血球について得られてもよい。

細胞毒性の減少に加えて、本発明のペプチドは、少なくとも１つの細菌、ウイルス、真菌または寄生虫系統に対して、テンポリンＳＨａの抗微生物活性と好ましくは同等またはそれよりも優れた活性を有する。

本発明はまた、本発明に係るペプチドをコードする核酸に関する。

本発明の精神において、「核酸」はＤＮＡまたはＲＮＡに基づくいずれの分子も意味するものと解される。これらは、合成または半合成の組換え分子であってもよく、可能な限りベクターに増幅されても、クローン化されてもよく、化学的に修飾されてもよく、例えば、修飾結合、修飾プリンまたはピリミジン塩基または修飾糖を含む非天然の塩基または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。

本発明に係る核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖の形態であってもよい。好ましい実施態様によれば、該核酸は当業者に周知の組換え技法により合成された単離ＤＮＡ分子である。

本発明に係る核酸は、本発明に係るペプチドの配列から推定されてもよく、核酸が転写されるはずの宿主細胞に応じてコドン使用が適合されてもよい。これらの工程は当業者に周知の方法（そのうちのいくつかの方法がSambrookらの参考マニュアル（Sambrookら、2001）に記載される）に従って実施されてもよい。

本発明はさらには、その発現に必要とされる配列に作動的に連結した本発明に係る核酸を含む発現カセットに関する。特に、核酸は宿主細胞におけるその発現を可能とするプロモータの制御下にあってもよい。一般に、発現カセットは、転写を開始させるプロモータ、本発明に係る核酸、および転写ターミネータから構成されるか、またはそれらを含む。「発現カセット」なる語は、作動可能に連結した、コード領域および制御領域を含む核酸構築物を意味する。「作動可能に連結した」なる語は、コード配列（関心のある遺伝子）の発現および／またはコード化ペプチドの標的化が転写プロモータおよび／またはシグナルペプチドの制御下にあるように因子が組み合わされることを意味する。典型的には、プロモータ配列は、関心のある遺伝子の上流で、その遺伝子から発現の制御に適合する、一定の距離で置かれる。同様に、シグナルペプチドの配列は、一般に、関心のある遺伝子の配列の上流で、いずれかのプロモータの下流にて、その後者と同じ読み枠にて融合される。スペーサ配列は、それらが発現および／または標的化の妨げとならない限り、制御因子と遺伝子の間に存在してもよい。好ましい実施態様において、該発現カセットはプロモータと作動可能に連結する配列を活性化する少なくとも１つの「エンハンサ」を含む。

本発明はまた、本発明に係る核酸または発現カセットを含む、発現ベクターに関する。該発現ベクターは宿主細胞を形質転換するのに使用されてもよく、本発明の核酸の該細胞における発現を可能とする。

ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡであっても、円形であってもなくてもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。有利には、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス、コスミドおよび人工染色体より選択される。

有利には、発現ベクターは本発明に係る核酸の発現を可能とする制御因子を含む。これらの因子は、例えば、転写プロモータ、転写アクチベータ、ターミネータ配列、開始および終止コドンを含有してもよい。該因子を、その発現が望まれる宿主細胞に従って、選択する方法は当業者に周知である。

ベクターはまた、例えば、抗生物質耐性遺伝子または宿主細胞ゲノムより欠失した個々の遺伝子の相補性を提供する選択可能な遺伝子などの、宿主細胞中でその選択を可能とする因子を含有してもよい。かかる因子は当業者に周知であり、文献に広く記載される。

形質転換される宿主細胞が植物細胞である場合、発現ベクターは好ましくは植物ベクターである。植物ベクターの例が文献に記載されており、特にエイ・ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴ−ＤＮＡプラスミド、ｐＢＩＮ１９（Bevan、1984）、ｐＰＺＰ１００（Hajdukewiczら、1994）、ｐＣＡＭＢＩＡシリーズ（R.Jefferson, CAMBIA, Australia）を含む。本発明のベクターはさらに、複製起源および／または選択可能なマーカー遺伝子および／または植物組換え配列を含んでもよい。

ベクターは当業者に周知の分子生物学の典型的技法により構築されてもよい。

本発明は、細胞を形質転換または形質移入するために、本発明に係る核酸、発現カセットまたは発現ベクターを用いることに関する。宿主細胞は一過的または安定した方法にて形質転換／形質移入されてもよく、核酸、カセットまたはベクターがエピソームの形態にて、または染色体の形態にて細胞中に含まれてもよい。

本発明は、本発明に係る核酸、カセットまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

一の実施態様によれば、宿主細胞は、微生物、好ましくは細菌または酵母のものである。

もう一つ別の実施態様において、宿主細胞は動物細胞、例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である（米国特許第４,８８９,８０３号；米国特許第５,０４７,３３５号）。特定の実施態様において、細胞はヒト以外の動物の胚と関係しない細胞である。

さらにもう一つ別の実施態様において、宿主細胞は植物細胞である。本明細書中で利用されるような「植物細胞」なる語は、植物より由来のいずれの細胞もいい、カルス細胞などの未分化の組織、および胚子、植物のパーツ、草花または種子などの分化した組織を構成してもよい。

本発明はまた、本発明に係る抗微生物ペプチドを産生する方法であって、細胞を本発明に係る核酸、発現カセットまたは発現ベクターで形質転換または形質移入し；その形質移入／形質転換した細胞を培養し；該細胞により産生されたペプチドを回収することを含む方法に関する。組換えペプチドを産生する方法は当業者に周知である。例えば、不死化ヒト細胞株の産生についてはＷＯ０１／７０９６８に、植物の産生についてはＷＯ２００５／１２３９２８に、そしてトランスジェニック動物のミルクの生成については米国２００５−２２９２６１に記載される具体的な方法を引用してもよい。

本発明はまた、本発明に係る抗微生物ペプチドを産生する方法であって、本発明に係る核酸、カセットまたは発現ベクターを、無細胞発現系とも称される、インビトロ発現系に挿入し、そして該系により産生されたペプチドを回収することを含む方法に関する。多くのインビトロまたは無細胞発現系は商業的に入手可能であり、該系の使用は当業者に周知である。

本発明はさらには、薬剤として、特に微生物感染、すなわち細菌、ウイルス、真菌または寄生虫による感染を治療するための薬剤としての、本発明に係るペプチドに関する。本発明はまた、薬剤としての、本発明に係る核酸、カセットまたはベクターにも関する。薬剤は医学的または獣医学的に使用するものとする。

微生物感染は、寄生虫、特にリーシュマニア（Leishmania）またはトリパノソーマ（Trypanosoma）属による感染であってもよい。

一の実施態様において、微生物感染は、リーシュマニア属から由来の寄生虫による感染である。感染は皮膚リーシュマニア症、皮膚粘膜リーシュマニア症または内臓リーシュマニア症であってもよい。寄生虫はリーシュマニア・エチオピカ、アマゾンリーシュマニア、リーシュマニア・アラビカ、リーシュマニア・アリステデス、ブラジルリーシュマニア、小児リーシュマニア、リーシュマニア・コロンビエンシス、リーシュマニア・デアネイ、ドノバンリーシュマニア、リーシュマニア・エンリエッチイ、リーシュマニア・エクアトレンシス、リーシュマニア・フォラッチニイ、リーシュマニア・ガーンハミ、リーシュマニア・ゲルビリ、ギアナリーシュマニア、リーシュマニア・ヘレリ、リーシュマニア・ヘルチギ、リーシュマニア・キリッキ、リーシュマニア・ラインソニ、森林型熱帯リーシュマニア、メキシコリーシュマニア、リーシュマニア・ナイッフィ、リーシュマニア・パナメンシス、リーシュマニア・ペルビアナ、リーシュマニア・ピファノイ、リーシュマニア・シャーウィ、リーシュマニア・ツラニカ、熱帯リーシュマニアおよびリーシュマニア・ベネズエレンシスからなる群より選択されてもよい。好ましくは、該寄生虫は小児リーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、メキシコリーシュマニア、アマゾンリーシュマニア、森林型熱帯リーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、ギアナリーシュマニア、リーシュマニア・パナメンシスおよびリーシュマニア・ペルビアナからなる群より選択される。特に好ましくは、該寄生虫は小児リーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、森林型熱帯リーシュマニア、熱帯リーシュマニア、アマゾンリーシュマニア、リーシュマニア・キリッキおよびブラジルリーシュマニアからなる群より選択される。最も好ましくは、該感染は寄生虫の小児リーシュマニアによる感染である。

もう一つ別の実施態様において、微生物感染は、トリパノソーマ属から由来の寄生虫による感染である。寄生虫は、トリパノソーマ・アビウム、ブルーストリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、コンゴトリパノソーマ、トリパノソーマ・エクイナム、トリパノソーマ・エクイペルダム、トリパノソーマ・エバンシ、ルーイストリパノソーマ、トリパノソーマ・メロファギウム、トリパノソーマ・ペルカエ、ランゲルトリパノソーマ、トリパノソーマ・ロタトリウム、トリパノソーマ・シミアエ、トリパノソーマ・スイス、トリパノソーマ・タイレリ、トリパノソーマ・トリグラエおよびトリパノソーマ・ビバックスからなる群より選択されてもよい。好ましくは、寄生虫はブルーストリパノソーマ、クルーズトリパノソーマおよびコンゴトリパノソーマからなる群より選択される。

微生物感染はグラム陰性菌によるものであってもよい。特に、グラム陰性菌は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）およびシュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、アシネトバクター（Acinetobacter）またはクレブシエラ（Klebsiella）属から由来の細菌からなる群より選択されてもよい。好ましくは、グラム陰性菌は、エシェリキア・コリ、シュードモナス・エルギノーサ、サルモネラ・エンテリカ、アシネトバクター・バウマンニおよびクラブシエラ・ニューモニエからなる群より選択される。

微生物感染はグラム陽性菌によるものであってもよい。特に、グラム陰性菌は、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、リステリア（Listeria）またはエンテロコッカス（Enterococcus）属から由来の細菌からなる群より選択されてもよい。好ましくは、グラム陽性菌は、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、リステリア・イバノビおよびエンテロコッカス・フェカリスからなる群より選択される。

微生物感染はまた、真菌によるものであってもよい。特に、真菌は、カンジダ（Candida）またはアスペルギルス（Aspergillus）属からのものであってもよい。例えば、真菌はカンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・パラプローシスからなる群より選択されてもよい。

特定の実施態様において、本発明のペプチドは、嚢胞性線維症、心内膜炎、膀胱炎、留置性医療装置により惹起される感染、歯垢形成または歯周炎などのバイオフィルム形成に関連する細菌感染を治療するのに使用される。

本発明は抗微生物剤としての本発明に係るペプチドに関する。本発明はまた、抗微生物剤としての本発明に係る核酸、カセットまたはベクターに関する。

本発明は、特に微生物感染の間の、免疫系刺激剤としての本発明に係るペプチドに関する。本発明はまた、免疫系刺激剤としての本発明に係る核酸、カセットまたはベクターに関する。本発明の特定の実施態様によれば、本発明に係るペプチドには化学走性がある。該ペプチドは免疫細胞の感染部位への動員を誘発し、感染に対する免疫応答の効能を向上させる。

本発明は、少なくとも１つの本発明に係るペプチドと、医薬的に許容される支持剤および／または賦形剤とを含む、あるいは本質的にそれらからなる医薬組成物に関する。特に、該医薬組成物は、１、２、３、４または５種の本発明に係るペプチドと、医薬的に許容される支持剤および／または賦形剤とを含んでもよく、あるいはそれらから構成されてもよい。

本発明はまた、少なくとも１つの本発明に係る核酸、カセットまたはベクターと、医薬的に許容される支持剤および／または賦形剤とを含む、あるいは本質的にそれらからなる医薬組成物に関する。

本発明に係る組成物において使用され得る医薬的に許容される賦形剤および支持剤は当業者に周知であり（Remingtons Pharmaceutical Sciences, 第18版, A.R.Gennaro編, Mack Publishing Company [1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. FrokjaerおよびL. Hovgaard編, Taylor & Francis [2000]；およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版, A.Kibbe編, Pharmaceutical Press [2000]）、特に生理的食塩水およびリン酸緩衝液を含む。

本発明に係る医薬組成物は、局所または全身投与に、特に経口、舌下、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、局所的、気管内、鼻腔内、経皮、直腸内、眼内または心房内投与に適してもよい。好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、皮膚、経口、局所的、筋肉内、静脈内、経皮または皮下投与に適する。特定の実施態様によれば、本発明に係る医薬組成物は局所的投与に適する。本発明に係る医薬組成物は、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、顆粒、懸濁液、エマルジョン、液剤、ゲル、ペースト、軟膏、クリーム、プラスター、ポーション、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、パッチ、スプレーまたはエアロゾルの形態であってもよい。

一の実施態様によれば、本発明に係る組成物は、１〜２０００ｍｇの本発明に係るペプチドを含む。好ましくは、本発明に係る組成物は５０〜１００、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００または１５００ｍｇの本発明に係るペプチドを含む。

本発明に係る組成物は、他の抗微生物剤、特に抗微生物ペプチドまたは抗生物質などの付加的な活性物質をさらに含んでもよい。該組成物は、本発明に係るペプチドの活性を増強し得る物質をさらに含んでもよい。

本発明は微生物感染の治療用薬剤を調製するための本発明に係るペプチドの使用に関する。本発明はまた、微生物感染の治療用薬剤を調製するための本発明に係る核酸、カセットまたはベクターの使用に関する。

本発明は微生物感染の治療に用いるための本発明に係るペプチドに関する。本発明はまた、微生物感染の治療に用いるための本発明に係る核酸、カセットまたはベクターに関する。

治療は治癒的であっても予防的であってもよい。

治療される対象は動物、好ましくは哺乳動物である。特定の実施態様によれば、治療される対象はヒトである。

本発明はまた、微生物感染を治療する方法であって、治療的に効果的な用量の本発明に係るペプチド、核酸、カセットまたはベクターを投与することを含む方法に関する。

本明細書にて使用される「治療的に効果的な用量」なる語は、感染に関与する細菌、ウイルス、真菌または寄生虫に対して抗微生物活性を観察するために必要とされる本発明に係るペプチド、核酸、カセットまたはベクターの量をいう。投与されるべき本発明に係るペプチド、核酸、カセットまたはベクターの量、および治療の期間は、治療されるべき対象の生理的状態、病原体および該病原体に対するペプチドの抗微生物活性に従って、当業者により決定される。

特定の実施態様において、治療されるべき微生物感染はリーシュマニア症である。

もう一つ別の特定の実施態様において、治療されるべき微生物感染は、嚢胞性線維症、心内膜炎、膀胱炎、留置性医療装置により惹起される感染、歯垢形成または歯周炎などのバイオフィルム形成に関連する細菌感染である。

本発明のペプチドの効果的な用量は、限定されるものではないが、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜４０ｍｇからなる。投与頻度は、例えば、４〜２４時間毎であってもよく、好ましくは８〜１２時間毎である。治療期間は、例えば、１〜３０日であってもよく、好ましくは１０〜２０日、より好ましくは５〜１０日である。

本発明はまた、本発明に係るペプチドの保存剤、殺菌剤または殺虫剤としての使用に関する。

微生物による感染の危険性を排除し、あるいは防止して、食品の保存を改善するために、その食品を本発明に係るペプチドで処理してもよい。この場合には、該ペプチドは保存剤として使用される。

本発明に係るペプチドは殺虫剤として使用されてもよい。この場合には、該ペプチドは植物の植物病原体による感染を防止または治療するのに使用される。

本発明に係るペプチドは消毒剤として使用されてもよい。「消毒剤」なる語は、該ペプチドの表面（例えば、壁、ドア、医療装置）、液体（例えば、水）または気体（例えば、麻酔ガス）での抗微生物活性をいう。

バイオフィルムは院内感染のおよそ６０％に関与している。院内感染は、本質的に、インプラントされた生体材料にて微生物がコロニー形成することによるものである。細菌性バイオフィリムを撲滅することは、プランクトン状態の細菌に対して通常は活性である抗生物質がバイオフィルムに組織化された構造に対してはほとんど効果が無いようになることがしばしばであることを鑑みて大きな臨床的問題である。この型のバイオフィルムに対する抗微生物ペプチドの効果がテンポリンＡを用いて以前の実験で証明された（Cirioniら, 2003）。

一の実施態様によれば、本発明に係るペプチドは細菌性バイオフィルムを排除するために使用される。好ましい実施態様によれば、本発明に係るペプチドは、特に、外科用または補綴装置を消毒するために使用される。

本発明はまた、本発明に係るペプチドで被覆された、あるいは該ペプチドを含む少なくとも１つの表面を有するボディを含む医療用装置またはインプラントに関する。本発明はまた、本発明に係るペプチドのコーティング剤を医療用装置またはインプラントの少なくとも１つの表面に塗布するか、あるいは該コーティング剤をその少なくとも１つの表面に接触するように配置することを含む、該装置またはプラントを調製する方法に関する。

この型の医療用装置またはインプラントならびにその使用および調製方法は、例えば、特許出願ＷＯ２００５／００６９３８に記載される。

本発明に係るペプチドで被覆されるか、または該ペプチドを含む表面は、ポリエチレン、ダクロン（Dacron）、ナイロン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ラテックス、シリコーンエラストマー等などの熱可塑性またはポリマー材料、あるいは金などの金属材料から構成されてもよい。特定の実施態様において、本発明に係るペプチドは、そのＮ−末端またはＣ−末端を介して、官能基を付与した表面、好ましくは金属表面に共有結合する。所望により、該ペプチドはスペーサーアームを通して該表面に結合してもよい。

好ましくは、該表面は０.４〜３００ｍｇ／ｃｍ^２の密度でペプチドで被覆されてもよい。

また、装置またはインプラント、特に骨および関節の補綴装置は、本発明に係るペプチドを含むセメント混合物で被覆されてもよい。

該ペプチドはもう一つ別の活性分子、好ましくは抗生物質と組み合わされてもよい。

該装置またはインプラントは、例えば、血管内、腹腔、肋膜および尿道カテーテル；心臓弁；心ペースメーター；血管シャント；冠動脈ステント；歯科インプラントまたは整形外科もしくは眼内補綴であってもよい。

本発明は、本発明に係る少なくとも１つのペプチドを含む食品組成物に関する。

本発明はまた、本発明に係る少なくとも１つのペプチドを含む農薬組成物に関する。

本発明は、本発明に係る核酸、カセットまたは発現ベクターを含み、本発明に係るペプチドを発現することができるか、または発現しているトランスジェニック植物に関する。

本発明の核酸、カセットまたは発現ベクターの細胞または植物組織（種子またはプラント（plant）を含む）への導入は当業者に公知のいずれの方法で実施されてもよい。植物の遺伝子導入方法は当該分野にて周知であり、例えば、細菌のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（HooykaaおよびSchilperoort、1992）の使用、エレクトロポレーション、接合伝達、遺伝子銃技法（Russelら、1992）あるいは植物の胚またはプロトプラストへのマイクロ注射を含む。他の植物の遺伝子導入方法も周知であるか、または上記した技法を履行する他のプロトコルが先行文献（SiemensおよびSchieder、1996）に記載されており、本発明に適用されてもよい。本発明に係るトランスジェニック植物は、特に、特許出願ＷＯ ００／０５５３３７に記載の方法に従って得られてもよい。

トランスジェニック植物はいずれの植物種に属してもよい。それは単子葉であっても双子葉であってもよい。より具体的には、本発明のトランスジェニック植物は、動物または人間の食用を意図として、または意図することなく培養された植物、あるいはリーシュマニア症の媒介昆虫であるサシチョウバエ（sandfly）が止まる、トウモロコシ、コムギ、アブラナ、ダイズ、アルファルファ、アマ、ライス、サトウキビ、ビート、タバコ、コットン、ヒマワリ、トマト、キャベツ、ニンジン、イモなどの餌、またはレモンツリー、アップルツリー、アプリコットツリー、ピーチツリーおよびヘーゼルツリーなどの果樹、あるいはリチヌス・コムニス（Ricinus communis）、カパリス・スピノサ（Capparis spinosa）、ソラヌム・ジャスミノイデス（Solanum jasminoides）、ソラヌム・ルテウム（Solanum luteum）またはボウガインビレア・グラブラ（Bougainvillea glabra）などのサシチョウバエの糖分食餌の供給源として現在まで同定されている植物である。

一の実施態様によれば、本発明に係るペプチドはトランスジェニック植物にて病原体、より具体的には植物病原体に対する耐性を増加させることができる。かかるトランスジェニック植物の使用は、殺虫剤の作物への噴霧または塗布をかなり減少させ、それによりこれらの産物の有害な環境作用を最小とすることができる。

もう一つ別の実施態様によれば、トランスジェニック植物は本発明に係るペプチドを発現し、該植物またはその果汁を摂取することにより、該ペプチドはサシチョウバエまたはヒトを含む動物に投与される。この場合、該ペプチドが植物病原体に対して必ずしも効果を有するわけではないが、動物の１または複数の病原体（ヒトおよび動物のリーシュマニア症を媒介するサシチョウバエ、または該ペプチドが投与されるヒトの消化管中に存在するリーシュマニア寄生虫を含む）に対して抗微生物活性を示す。サシチョウバエがその糖分食餌で摂取するトランスジェニック植物は、媒介昆虫の消化管に本発明の抗微生物ペプチドを直接的に送達し、最終的には媒介昆虫に存在する寄生虫を直接的に殺すか、あるいは寄生虫の分化または増殖に必要とされる媒介昆虫の腸内フローラにいる細菌を殺すことでその成長を遮断することにより該寄生虫を殺す。事実、トランスジェニック植物はリーシュマニア症の伝染を間接的に制御する効果的な手段を構成する。

本発明は本発明に係るペプチドに特異的な抗体に関する。本明細書にて使用される「抗体」なる語は、特に、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、そのフラグメント（例えば、フラグメントであるＦ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ））、一本鎖抗体またはミニボディー（minibody）、でなければ本発明のペプチドを認識する初期抗体のドメイン、とりわけＣＤＲ（相補性決定領域）を含むいずれのポリペプチドもいう。例えば、これらはキメラ、ヒト化またはヒト抗体である。モノクローナル抗体は当業者に周知の方法に従ってハイブリドーマより調製されてもよい。抗体を調製する別の方法は当業者に周知である。

本発明はまた、本発明に係るペプチドを検出するために、本発明に係る抗体を使用することに関する。本発明はさらに、本発明に係るペプチドの定量測定を行うために、とりわけ免疫アッセイのために、本発明に係る抗体を使用することに関する。該測定により、宿主細胞での、または本発明に係るトランスジェニック植物での本発明のペプチドの発現を測定することが可能となる。

この記載に引用されるすべての文献は出典明示により本明細書に組み込まれる。本発明の他の特徴および利点も、本発明を説明することを目的とし、何ら限定するものではない、以下の実施例においてさらに明らかとなろう。

実施例
材料および方法
固相ペプチド合成
固相ペプチド合成は、Vanhoyeら（Vanhoyeら、2004）によって記載されるプロトコルに従い、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Novabiochem, Switzerland）およびＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（Senn Chemicals, Switzerland）を利用することにより、自動ペプチド合成装置（Applied Biosystems 433A）を用いて実施された。

凍結乾燥させた粗製ペプチドをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）セミプレパラティブカラム（１０μｍ、２５０ｘ１０ｍｍ）上にて、０.１％トリフルオロアセタート／水中にて０−７０％の線形勾配のアセトニトリル（０.０７％トリフルオロアセタート）により５ｍＬ／分の流速で溶出するＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した（１％アセトニトリル／分）。合成ペプチドの同質性および同一性は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（Voyager DE-PRO Applied Biosystems）に付し、Ｃ１８分析カラム（modulocart QS Uptisphere（登録商標）５ＯＤＢ、５μｍ、２５０ｘ４.６ｍｍ、Interchim）上のＲＰ−ＨＰＬＣで０.７５ｍＬ／分の流速で上記した条件を用いて評価された。

抗菌活性の試験
次の菌株：エシェリキア・コリ（ＡＴＣＣ２５９２２およびＭＬ−３５ｐ）、スタフィロコッカス・アウレウス（ＡＴＣＣ２５９２３およびＳＴ１０６５）、エンテロコッカス・フェカリス（ＡＴＣＣ２９２１２）、シュードモナス・エルギノーサ（ＡＴＣＣ２７８５３）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ＡＴＣＣ１９６１５）、リステリア・イバノビ、サルモネラ・エンテリカ（血清型エンテリディディス）、アシネトバクター・バウマンニ（ＡＴＣＣ１９６０６）およびクラブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ１３８８３）を抗微生物活性の試験に用いた。２種の抗生物質耐性菌株（エス・アウレウスＡＴＣＣ４３３００およびＡＴＣＣＢＡＡ−４４）も用いた。

各菌株について、およそ１０^６細菌／ｍＬの標準接種源（指数増殖期）を調製した。このために、該菌株の一つで予め接種したＬＢ寒天上で単離されたコロニーを４ｍＬのＬＢブロス培地にて培養した：ただし、エス・ピオゲネスおよびエル・イバノビについてはＢＨＩ（脳心臓浸出液（Brain Heart Infusion））寒天上で単離されたコロニーからの細菌をＢＨＩにて増殖させた。次に、細菌が指数増殖期に達するように培養液を振盪しながら３７℃で２ないし３時間インキュベートした。遠心分離に付した後、細菌懸濁液の大部分をミューラー・ヒントン（ＭＨ）ブロス培地に希釈してＯＤ_{６３０ｎｍ}を０.０１（およそ１０^６ｃｆｕ／ｍＬの濃度に相当する（ｃｆｕ：コロニー形成単位））とした。イー・フェカリスについてはＬＢの、エス・ピオゲネスおよびエル・イバノビについてはＢＨＩの異なる培地を用いた。

各ペプチドの最小阻害濃度（ＭＩＣ）はブロス培地における増殖阻害の試験により決定された。ＭＩＣは３７℃で１８時間インキュベートした後に試験した細菌株の増殖を阻害しうるペプチドの最低濃度として定義される。試験は９６ウェルの滅菌マイクロタイタープレートで実施された。一連の増大する濃度のペプチド（２〜４００μＭ）を最初にＭｉｌｌｉＱ滅菌水にて調製した。５０μＬの各濃度のペプチドを５０μＬの細菌懸濁液（１０^６ｃｆｕ／ｍＬ）とウェル中で混合した。次に該マイクロタイタープレートを３７℃で１８時間振盪しながらインキュベートした。プレートリーダー上にて６３０ｎｍでのＯＤ（濁度）を測定することにより細菌増殖を決定した。各ペプチド濃度について試験を３回重複して行い、少なくとも３回の独立した実験を行い、ＭＩＣ値を決定した。

ペプチドを含有する溶液を５０μＬのＭｉｌｌｉＱ滅菌水と置き換えることにより増殖阻害の負の対照を得た。細菌増殖を完全に阻害する正の対照は、該ペプチドを含有する溶液を５０μＬの０.７％ホルムアルデヒドと置き換えることにより得られた。

抗真菌活性の試験
３種の酵母菌株：サッカロミセス・セレビシア、カンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ９００２８）、カンジダ・パラシローシス（ＡＴＣＣ２２０１９）を試験した。これらの菌株を最初にＹＰＤ寒天上で最低４８時間増殖させた。次に酵母懸濁液を、ＹＰＤブロス培地中で、細菌が１０^６ｃｆｕ／ｍＬに正確に調整されるように、調製した。

抗真菌活性の試験は、細菌について使用されるブロス培地における増殖阻害試験（上記を参照のこと）に相当するものであり、ＭＨ培地がＹＰＤ培地と置き換えられる。真菌株を３０℃でインキュベートした。

抗リーシュマニア活性の試験
ペプチドのリーシュマニア活性は、内臓リーシュマニア症に関与する、前鞭毛型の小児リーシュマニア（菌株 ＭＨＯＭ／ＭＡ／６７／ＩＴＭＡＰ−２６３）について評価された。

１０〜２０％の補体除去したウシ胎児血清および５ｍｇ／ｍＬのブタヘミンを補足し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンの存在下にある、ＳＤＭ７９培地中、種菌の寄生虫の数に応じて、前鞭毛虫を週に１または２回継代して２６℃で維持した（Brunら、1979）。対数増殖期にある１０^５細胞／ｍＬの種菌から出発し、前鞭毛虫は培養して５日後に２５ｃｍ^２の培養フラスコ中にて固定相の２ｘ１０^８寄生虫／ｍＬの細胞密度に達した。細胞密度は、ヨウ化プロピジウムの存在下、ファクスカン（Facscan）サイトメーター上にてフローサイトメトリーにより決定された（Excalibur, Becton-Dickinson, Ivry, France）。

抗リーシュマニア活性の試験はルシフェラーゼを発現する寄生虫ラインで実施された。この寄生虫ラインは、小児リーシュマニア菌株を、サシチョウバエのルシフェラーゼをコードするレポータ遺伝子ＬＵＬ、およびRoyら（2000）に記載されるようなネオマイシン耐性遺伝子（ＮＥＯ）を含有する、ベクターのｐＧＭ−αＮＥＯ−αＬＵＣで形質転換することにより得られた。

ルシフェラーゼを発現する前鞭毛虫に対する抗リーシュマニア活性の試験：
８０μＬの前鞭毛虫懸濁液（１０^５寄生虫／ウェル）を２０μＬのペプチド溶液（５０ないし３.１２５μＭの最終濃度）と一緒にマイクロタイタープレートの各ウェルにアリコートした。負の対照では、ペプチド溶液を２０μＬのＳＤＭ７９培地と置き換えた。正の対照では、２０μＬの溶液の代わりに最高濃度のペプチドを用いて実施された。実験は各ペプチド濃度で３回重複して行われた。

２６℃で７２時間インキュベートした後、５０μＬのステディ・グロー（Steady Glo）溶菌緩衝液（Promega）を各ウェルに添加した。室温で５分間インキュベートした後、細胞溶解を顕微鏡下でチェックした。蛍光プレートリーダー（Victor, PerkinElmer）で発せられた蛍光を測定した。その蛍光は培地中に生存する寄生虫の数に比例する。増殖％を次式：
増殖％＝［（Ｌ平均値−ｂｇｄ）_ペプチドｘ１００］／（Ｌ平均値−ｂｇｄ）_負の対照
（ここで、「Ｌ平均値」は平均蛍光値を、そして「ｂｇｄ」は培地により発せされる蛍光に相当するバックグラウンドでの蛍光値を意味する）
に従って算定した。前鞭毛虫の増殖を５０％まで阻害する濃度（ＩＣ_５０）を決定した。

ラット赤血球、ヒト単球、マクロファージ、肝がん由来細胞（hepatocellular liver carcinoma cell）および線維芽細胞に対する細胞毒性試験：
抗微生物ペプチドの細胞毒性活性を、ラット赤血球、ヒト白血病単球細胞株のＴＨＰ−１、ＴＨＰ−１単球誘導のマクロファージについて、ＨｅｐＧ２のヒト肝がん誘導細胞（ヒト肝がん由来細胞株）およびヒト線維芽細胞について確かめた。マクロファージはリーシュマニアの宿主細胞である。

溶血試験
抗微生物ペプチドの溶血活性をラット赤血球を用いて評価した。赤血球溶血はヘモグロビンの反応媒体への放出により明らかにされ、その濃度は４５０ｎｍで分光光度的に測定される。

赤血球は、血液を遠心分離（９００ｘｇ、１０分）に付すことにより、血漿および白血球と分離された。赤血球を含有するペレットをＰＢＳバッファー（ｐＨ７.４）で３回洗浄した。マラセー（Malassez）細胞を計数した後、４ｘ１０^８赤血球／ｍＬのストック溶液を同じバッファーにて調製した。一連の濃度（２〜４００μＭ）の試験すべきペプチドを調製した。

試験は次のように実施された：５０μＬの異なる濃度のペプチドを５０μＬの赤血球懸濁液に添加した。３７℃で１時間インキュベートし、つづいて遠心分離（１２,０００ｘｇ、１５秒）に付した後、上清の吸光度を４５ｎｍで測定した。この試験についての負の対照（０％溶血）はペプチド溶液の代わりに５０μＬのＰＢＳバッファーを含有した。正の対照（１００％溶血）はペプチド溶液の代わりに５０μＬの０.１％トリトンＸ−１００を含有した。

得られたＬＣ_５０は３回重複して行われた３回の実験の平均値であり、細胞の５０％が溶菌するのを誘発するペプチド濃度に相当する。

単球に対する細胞毒性試験：
細胞を、指数増殖期に達するまで、ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１／１００グルタマックス（登録商標）（Invitrogen）および１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）にて培養した。トーマ（Thoma）計数チャンバーにて計数した後、ＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞密度を６.２５ｘ１０^５細胞／ｍＬに調整した。５倍に濃縮した抗微生物ペプチドの溶液をこのＲＰＭＩ培地中で調製した（２５０〜１５.６μＭ）。

細胞をウェル当たり８０μＬの細胞懸濁液にアリコートし（最終で５ｘ１０^４単球／ウェルまたは５ｘ１０^５細胞／ｍＬに相当する）、２０μＬのペプチド溶液（５０〜３.１２５μＭの最終濃度）と混合した。負および正の対照は、抗リーシュマニア活性の試験と同じプロトコルに従って実施された。各ペプチド濃度について実験を３回重複して行った。細胞を３７℃で５％のＣＯ_２雰囲気下にて７２時間にわたってインキュベートした。

７２時間後、生存細胞の数をＭＴＴ試験（Mosmann、1983）によって間接的に評価した。黄色であるＭＴＴ（または３-（４,５-ジメチルチアゾール-２-イル）-２,５-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド）が、代謝的に活性な細胞のミトコンドリア呼吸鎖中に存在するスクシナート−テトラゾリウム還元酵素の作用によって、青色であるホルマザンに還元される。青色ホルマザンは５７０ｎｍで分光光度的に検出され得る。

０.２２μｍのフィルターを用いて濾過した１０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）中のＭＴＴ溶液をウェル当たり１０μＬでアリコートした。次にプレートを３７℃で４時間インキュベートした。１００μｌの５０％イソプロパノール／１０％ＳＤＳの混合液を添加することで酵素反応を停止させ、次にプレートを室温で振盪しながら３０分間インキュベートした。ついで各ウェルの５７０ｎｍでのＯＤを測定した（ビクター（Victor）プレートリーダー、PerkinElmer）。増殖％は次式：
増殖％＝［（ＯＤ平均値−ｂｇｄ）_ペプチドｘ１００］／（ＯＤ平均値−ｂｇｄ）_負の対照
（ここで、「ｂｇｄ」は培地による吸光度に相当するバックグラウンドでのＯＤを意味する）
で示されるように算定された。負の対照（１００％増殖）はペプチドを含有しなかった。

次にＩＣ_５０を増殖％から決定した。

ＴＨＰ−１ヒト単球誘導のマクロファージについての細胞毒性試験：
マクロファージの生存能をトリパンブルーをベースとするミクロアッセイを用いて確かめた。中間対数増殖期にある培養懸濁液からのＴＨＰ−１細胞を９６ウェルプレートに５ｘ１０^５細胞／ｍＬの密度（１００μＬ／ウェル、すなわち５ｘ１０^４細胞／ウェル）でプレートし、上記されるように分化させた。ペプチド（６０μＭ〜７.５μＭ、最終濃度）の存在下、３７℃で５％ＣＯ_２と共に７２時間インキュベートした後、接着したマクロファージを予め暖めたＲＰＭＩ１６４０培地で一度に洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地に２倍に希釈した１００μＬのトリパンブルーで５分間染色させた。網目状接眼レンズを用いてウェルに付き３つに焦点を当てて生存白血球を顕微鏡により計数した。

生存指数（ＶＩ）を次式：
ＶＩ＝［Ｎ平均値_ペプチドｘ１００］／Ｎ平均値_負の対照
（ここで、Ｎ平均値は生存する寄生虫の平均数である）
を用いて各ペプチド濃度について算定した。負の対照（１００％増殖）は２０μＬのＲＰＭＩ１６４０培地を該ペプチド溶液の代わりに含有した。

５０％の細胞の溶菌を誘発するペプチド濃度に相当するＬＣ_５０値を生存指数より決定した。各ペプチド濃度について試験を６回重複して行い、少なくとも２回の独立した実験を行ってＬＣ_５０値を決定した。

ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞がん誘導の細胞についての細胞毒性試験：
ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞がん誘導の細胞を９６ウェルプレート上の１０％の補体除去したウシ胎児血清、１／１００グルタマックス（登録商標）（Invitrogen）および１００ＩＵのペニシリン／ｍＬ、および１００μｇのストレプトマイシン／ｍＬを補足したＭＥＭ培地に５ｘ１０^５細胞／ｍＬの密度で播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で７２時間増殖かつ接着させた。連続希釈したペプチドを１００μＬの補足ＭＥＭ培地に添加した（１００μＭ〜６００μＭ）。７２時間インキュベートした後、ヒト単球のＴＨＰ−１について上記されるのと同様にしてＭＴＴベースのマイクロアッセイを用いて細胞生存能を評価した。

次に各ペプチド濃度で算定した増殖の割合からＬＣ_５０値を決定した。各ペプチド濃度について試験を３回重複して行い、少なくとも３回の独立した実験を行ってＬＣ_５０値を決定した。

線維芽細胞についての細胞毒性試験：
ヒト包皮線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Invitrogen）、４ｍＭグルタミン、５００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および２５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したダルベコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen）にて、３７℃で５％ＣＯ_２下で培養した。１０^４細胞／ウェル（９６ウェルプレート）を播種した。２４時間後、連続希釈したペプチドを添加し、７２時間後の増殖期に、テトラゾリウム化合物の（３-（４,５-ジメチルチアゾール-２-イル）-５-（３-カルボキシメトキシフェニル）-２-（４-スルホフェニル）-２Ｈ-テトラゾリウム）を培養ウェルに直接添加した。生存細胞により産生されたホルマザンの生体内還元された色相を９６ウェルプレートのリーダー（吸光度、４９０ｎｍ）で定量した。ＬＣ_５０は非線形回帰分析により決定された。

結果
それらの物理化学的特性に基づき、テンポリンＳＨａの一連の欠失または置換されたアナログを設計して強力な抗微生物活性および細胞毒性の減少を得た（図２）。これらのアナログの抗微生物活性は、異なるグラム陽性菌、グラム陰性菌、および抗生物質耐性菌の参考菌株について、および真菌株について評価された。

地中海地域およびラテンアメリカにおけるヒト内臓リーシュマニア症の主たる原因菌である小児リーシュマニアを標準となるリーシュマニア種（ＭＨＯＭ／ＭＡ／６７／ＩＴＭＡＰ−２６３菌株）として選択し、本発明のテンポリンＳＨａのアナログの抗リーシュマニア活性を評価した。

媒介昆虫であるサシチョウバエに存在する、発展段階にある、前鞭毛型において活性試験を行った。小児リーシュマニアを発現するルシフェラーゼ遺伝子の代謝活性の評価は、ＡＴＰの存在下でルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化に基づく。この工程は発光をもたらし、そのシグナル強度は生存寄生虫の数と比例し、従って増殖割合とも比例する。

抗微生物活性および抗寄生虫活性はペプチドの宿主細胞に対する毒性との対比で決定される必要がある。従って、これらのペプチドの細胞毒性は、ラットの赤血球、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん由来細胞株）、ヒト線維芽細胞、ＴＨＰ−１ヒト白血病単球細胞株およびＴＨＰ−１ヒト単球誘導のマクロファージにおいて評価された。赤血球、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん由来細胞株）、およびヒト線維芽細胞は、薬物の細胞毒性を研究するのに薬理学の分野で一般的に使用される標準となる細胞型である。マクロファージは哺乳動物におけるリーシュマニアの天然の宿主細胞である。

最小阻害濃度（ＭＩＣ）、阻害濃度５０（ＩＣ_５０）および致死濃度５０（ＬＣ_５０）を図４および５に示す。

抗菌および抗真菌活性
その結果は、［Ｋ^３］テンポリンＳＨａは、グラム陽性菌株（抗生物質耐性のエス・アウレウス菌株を含む）および臨床的に関心のあるグラム陰性菌株、ならびに酵母に対して同じ効能（ＭＩＣ＝３−６μＭ）で作用する強力な広域スペクトルの抗微生物剤である（図４）。［Ｋ^３］テンポリンＳＨａの配列での２個の残基の内部欠失（残基Ｖ^６およびＭ^８の欠失）およびＣ−末端切断は該ペプチドを不活化する（図示せず）：ただし、［Ｋ^３］テンポリンＳＨａ（３−１３）はグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する活性を保存する（図４）。興味のあることに、このＮ−末端切断したアナログは酵母（シー・アルビカンスおよびシー・パラプシローシス）に対して、およびピー・アエルギノーザ（大多数のテンポリンに対して耐性を示すグラム陰性菌株）に対してテンポリンＳＨａと比べて２倍の活性を示し、その溶血活性も喪失している（ＬＣ_５０＝６１８μＭ）。［Ｋ^３］テンポリンＳＨａ（３−１３）と同様の物理化学特性を有する、Ｃ−末端切断したアナログの［Ｋ^３］テンポリンＳＨａ（１−１１）で活性のないことは、テンポリンＳＨａのＣ−末端の疎水性鎖が抗微生物活性に必要不可欠であることを示す。Ｎ−末端およびＣ−末端切断したアナログの［Ｋ^３］テンポリンＳＨａ（３−１１）もまた不活性であるということはＣ−末端の重要性を確認するものである。

図５の結果は、［Ｋ^３,Ｌ^１３］および［Ｋ^３,Ｗ^１３］テンポリンＳＨａの、［Ｋ^３］テンポリンＳＨａと同じ物理化学特性を有する２つのアナログが、［Ｋ^３］テンポリンＳＨａと同様のスペクトルで強力な抗微生物活性を示すが、興味のあることに、さらに低い溶血活性を示す（［Ｋ^３,Ｌ^１３］テンポリンＳＨａについては著しく２倍低い）。同じく活性なアナログ［Ｋ^３,Ｋ^６］、［Ｋ^３,Ｋ^８］および［Ｋ^３,Ｋ^６,Ｌ^１３］テンポリンＳＨａは数種の特性を有し、それにより該アナログは極めて魅力的なものとなる。実際、［Ｋ^３］テンポリンＳＨａと比べてその効能が低いにも拘わらずに、これらのアナログは試験した大抵の菌株（細菌および酵母）に対して良好な活性を保持し、溶血活性を有しない（ＬＣ_５０＞５００μＭ）。それらはまた、ピー・アウルギノサ（４倍）およびカンジダ（２倍）に対してテンポリンＳＨａよりも活性である。

抗寄生虫活性
テンポリンＳＨａの置換したすべてのアナログは、小児リーシュマニアの前鞭毛虫に対してその活性が様々な程度で減少し、アナログ［Ｋ^３,Ｋ^６］、［Ｋ^３,Ｋ^８］および［Ｋ^３,Ｋ^６,Ｌ^１３］テンポリンＳＨａでは単球に対する細胞毒性レベルが接近している。細菌の場合、アナログ［Ｋ^３,Ｌ^１３］および［Ｋ^３,Ｗ^１３］の抗リーシュマニア活性はあまり変わらない。

結論
テンポリンＳＨａおよびそのアナログは、原核生物であるグラム陽性およびグラム陰性菌、ならびに真核生物である酵母の増殖を予防しうるため、広域スペクトルの活性を示す。

α−ヘリックスの極性面においてセリン残基の代わりにリジン残基を用いる［Ｋ^３］テンポリンＳＨａは、テンポリンＳＨａと比べてより強力な抗微生物活性を示す。

［Ｋ^３］テンポリンＳＨａのＮ−末端領域における２つの残基（ＦおよびＬ）の欠失は、溶血活性を欠き、シー・アルビカンス、シー・パラプシローシス、およびピー・アエルギノーザに対してテンポリンＳＨａよりもさらに（２倍）活性であるアナログの［Ｋ^３］テンポリンＳＨａ（３−１３）を産生する。

興味のあることに、アナログ［Ｋ^３,Ｌ^１３］および［Ｋ^３,Ｗ^１３］テンポリンＳＨａは［Ｋ^３］テンポリンＳＨａと同様に強力であって、それよりも溶血性は低い。その上、該アナログは小児リーシュマニアの前鞭毛虫に対して中程度のリーシュマニア活性（テンポリンＳＨａと同じくらいの活性）を示し、［Ｋ^３,Ｌ^１３］テンポリンＳＨａでは宿主細胞（マクロファージ）に対する細胞毒性が減少した。

最後に、［Ｋ^３］テンポリンＳＨａの配列にて位置６または８にリジン残基をさらに挿入すると（アナログ［Ｋ^３,Ｋ^６］、［Ｋ^３,Ｋ^８］および［Ｋ^３,Ｋ^６,Ｌ^１３］テンポリンＳＨａ）、細菌および酵母に対して良好な抗微生物活性を有し、溶血活性のない薬剤が得られることがわかった。

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Claims (15)

1. １３〜１００個のアミノ酸からなる大きさのペプチドであって、抗微生物活性を示し、配列：Ｆ−Ｌ−Ｘ_１−Ｇ−Ｉ−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｘ_４（配列番号：２）
   ここで、
   Ｘ_１はＲ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘ_２はＶ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘ_３はＭ、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；および
   Ｘ_４はＦ、Ｉ、ＬおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸である：
   ただしＸ_２がＶである場合、その時にはＸ_３はＫ、ＲおよびＨからなる群より選択され、および／またはＸ_４はＬ、ＩおよびＷからなる群より選択される
   を含むペプチド、ならびに該ペプチドの機能的誘導体および医薬的に許容される塩。
2. Ｘ_１がＫを表し、Ｘ_２がＶおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_３がＭおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ_４がＦ、ＬおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
3. 配列番号３〜１７の配列からなる群より選択される配列、好ましくは配列番号：３〜６、８、９、１１、１２および１４〜１６の配列からなる群より選択される配列、より好ましくは配列番号：３〜６および８の配列からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる、請求項１または２に記載のペプチド。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸。
5. 請求項４に記載の核酸を含む発現カセット。
6. 請求項４に記載の核酸または請求項５に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
7. 請求項４に記載の核酸、請求項５に記載の発現カセット、または請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
8. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド、および医薬的に許容される支持体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
9. 薬剤としての請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
10. 薬剤が細菌、ウイルス、真菌または寄生虫による感染を治療するものとする、請求項９に記載のペプチド。
11. 寄生虫がリーシュマニア属に属する、請求項１０に記載のペプチド。
12. 微生物感染の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載に記載のペプチド、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載の発現カセット、または請求項６に記載のベクター。
13. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドの、殺菌剤、保存剤または殺虫剤としての使用。
14. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドで被覆されるか、または該ペプチドを含む少なくとも１つの表面を有する本体を含む医療装置またはインプラント。
15. 請求項４に記載の核酸、請求項５に記載の発現カセット、または請求項６に記載のベクターを含み、請求項１〜３のいずれか一項に記載に記載のペプチドを発現しうるか、または発現しているトランスジェニック植物。

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