JP2016539335A - Ｃａｒｓ顕微鏡法による試料の検査方法 - Google Patents

Abstract

生物源から導出された試料（１）をＣＡＲＳ顕微鏡法により検査する方法を提案する。この方法によれば、レーザ照射により試料（１）の少なくとも１つの共鳴部位（５）を励起することによって、コヒーレント反ストークスラマン散乱により生成された共鳴信号を、イメージングのために検知する。本発明による方法は、少なくとも１つの共鳴部位（５）を、試料（１）の固有の化学構造（２）と、少なくとも１つの反応相手（３，６）との、生体直交性反応によって供給するステップを含む。

Description

本発明は、請求項１の上位概念に記載の、生物源から導出された試料をＣＡＲＳ顕微鏡法により検査する方法に関する。

非線形ラマン分光とは、固体または気体における光の非線形ラマン散乱に基づく分光検査法のことである。この場合、本発明は、コヒーレント反ストークスラマン散乱（英語ではCoherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS）に基づく顕微鏡検査方法に関する。

このような検査方法（ＣＡＲＳ顕微鏡法とも称する）のために、それぞれ異なる波長の光（ν_Ｐおよびν_Ｓ、ポンプ光ビームおよびストークス光ビーム）を送出する２つのレーザが用いられる。この場合、ＣＡＲＳスペクトルν_ＣＡＲＳを発生させるために、ν_Ｓをチューニング可能とすべきである：ν_ＣＡＲＳ＝２ν_Ｐ−ν_Ｓ，Ｉ_ＣＡＲＳ〜（Ｉ_Ｐ）^２・Ｉ_Ｓ。

図２には、ＣＡＲＳ遷移の項図が概略的に示されている。この場合、差分周波数ν_Ｐ−ν_Ｓが、検査される試料における２つの分子振動状態｜１＞と｜０の差分周波数と一致しているならば、ＣＡＲＳ信号が強められる。上述のようなそれぞれ異なる分子振動状態が発生し、しかもこのような分子振動状態をそれ相応に検出可能である試料の構造、典型的には特徴的な化学結合、のことを、以下では共鳴部位（resonance site）と称する。相応の分子構造のことを、またはこのような分子構造を含む分子全体のことを、散乱体（英語ではScatterer）とも称する。

ポンプ光ビームとストークス光ビームは、顕微鏡の用途の場合、同軸で合成され、共通に同一の試料ボリュームにフォーカシングされる。反ストークスビームが送出される方向は、図３に示されているように、基礎を成す４つの波の混合プロセスに対する位相整合条件から得られる。

独国特許出願公開第１０２４３４４９号明細書（米国特許第７０９２０８６号明細書も同じ）から、ＣＡＲＳ顕微鏡法のための方法および装置が公知である。この文献に開示されているＣＡＲＳ顕微鏡には、顕微鏡光学系を同軸で通過して試料へ配向可能なポンプ光ビームとストークス光ビームを発生させる手段と、これに対応する検出光を検出する検出器と、が設けられている。

ＣＡＲＳ顕微鏡法のさらに詳しい物理的な基礎については、一般に流布している参考文献に記載されている（たとえばXie，X.S.等著、"Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy", J.B. Pawley (ed.), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd edition, New York, Springer, 2006）。

慣用の、または共焦点のラマン顕微鏡法と対比すると、ＣＡＲＳ顕微鏡法の場合には特に、高い収率の検出光を得ることができ、妨害を及ぼす副作用をより良好に抑圧することができる。さらに検出光を、より簡単に照射光から分離することができる。

既述のように、ＣＡＲＳ顕微鏡法の場合、試料もしくは特定の化学結合の特徴的な固有振動を利用することができるので、そのことにより化学種ごとに選択的なイメージングが可能となり、これは基本的に、さらに別の標識および色素を用いなくても行うことができる。ＣＡＲＳ顕微鏡法によって、試料に関する分子構造情報を、三次元の空間分解能で得ることができる。

ただしＣＡＲＳ顕微鏡法は、試料内にそれ相応の共鳴部位が存在する、ということに常に基づくものである。共鳴部位が存在しないと、または着目対象の構造において、それらの振動状態の差分周波数が周囲のものと十分に区別できないと、それらの構造を検出することはできない。さらに公知のＣＡＲＳ顕微鏡法の場合には、非共鳴のバックグラウンドの抑圧が難しいことが多い。

非共鳴のバックグラウンドを操作または低減するために、たとえばピコ秒レーザパスを投入することができるけれども、そのためには相応に複雑なレーザを使用しなければならない。非共鳴のバックグラウンドを低減するためのさらに別の可能性として、いわゆるエピ検出ないしは落射検出（"epi-detection"）、および偏光感応性検出が挙げられる。これに関連して、さらに時間分解型の方法も使用することができる。さらに別の可能性として、励起パルスの位相制御も挙げられる。

しかしながらここで挙げた方法は、実際に実施するにあたり、程度の差こそあれ複雑であることが判明している。しかも特定のケースでは、試料において規定された構造を選択的に際立たせることが望まれる場合もあるが、これは従来のＣＡＲＳ顕微鏡法では不可能である。

本発明は、その解消手段を提供しようというものであり、したがって本発明の課題は、相応に改善されたＣＡＲＳ顕微鏡法のための方法を提供することにある。

この課題は、請求項１の特徴部分に記載の、生物源から導出された試料をＣＡＲＳ顕微鏡法により検査する方法によって解決される。

従属請求項に記載された事項および以下の説明には、有利な実施形態が示されている。

本発明は、公知のＣＡＲＳ顕微鏡法を前提としている。この種の方法は、生物源から導出された試料を検査するステップを含み、このステップにおいて、レーザ照射により試料内の共鳴部位を励起することによって、コヒーレント反ストークスラマン散乱により生成された信号を、イメージングのために検知する。さらにこの場合、オプションとしてこの信号から、共鳴部位を含む化学構造の構造特性を導出することもできる。

本発明において「生物源から導出された試料」と述べた場合、これを生物系からそのまま取り出された試料とすることができ、たとえば動物の組織試料、植物の構造、および／またはそれらから導出された標本とすることができる。ただし本発明を、程度の差こそあれかなり加工処理した試料に用いることもでき、たとえば食品化学において用いることもできる。さらに本発明は特に、たとえば石油などの純度検査に適している。

もちろん本発明は特に、生体試料たとえば神経組織において標識するために適しており、この場合、標識のインテリジェンスを振動分光法の特異性と組み合わせることができる。したがって、たとえば複数の脂質を標識に基づき同時に検査することができ、イメージング処理することができる。それらの脂質は、以前は分離することによってしか検知できなかった。

共鳴部位を含む化学構造の構造特性を、コヒーレント反ストークスラマン散乱により生成された信号から、公知のようにして導出することができる。対応する信号は、チューニング可能なストークス光ビームを使用すれば、たとえばスペクトルとしても得ることができ、この信号には、それぞれ含まれている共鳴部位特に個々の化学結合に固有の特徴たとえば相応の波長、バンドおよび／またはピークが含まれている。これらの特徴は、典型的には波数の形式で、ラマンシフトもしくはＣＡＲＳシフトとして表される（これは個々の分子振動状態間の差分周波数に対応する）。化学結合について得られる特徴的な波数に関する情報は、当業者は関連参考文献から得ることができる。

本発明は、一定波長のストークス光ビームの使用にも適している。このケースでは、たしかにスペクトルは取得されないが、コヒーレント反ストークスラマン散乱により生成された信号を、このようなケースでもイメージングに用いることができる。

本発明によれば上述の方法は、試料の固有の化学構造と、少なくとも別の反応相手との生体直交性反応によって、少なくとも１つの共鳴部位を準備するステップを含み、つまり、本来ならば試料に含まれていない相応の構造を、生体直交性反応によって生じさせるステップを含む。

生体直交性反応という用語については、あとでさらに詳しく説明する。また、用語「固有の化学構造」とはここでは、試料の起源に基づきすでにその中に含まれている化学的な構造のことである。生物源に由来する試料の場合には、これはたとえば脂質において相応の結合を伴う脂肪鎖、タンパク質のペプチド結合などである。このような固有の化学結合は、ＣＡＲＳ顕微鏡法によりイメージングのために検知可能な共鳴部位を含んでいる。

このような固有の共鳴部位もしくはそれらの基礎を成す化学構造とは異なり、本発明に従って試料に取り込まれる共鳴部位とは、本来の起源によれば試料に含まれていないものである。つまり本発明によれば、本来ならば共鳴部位を含んでいない、または十分には含んでいない試料、もしくは共鳴部位が望ましい位置または特性を有していない試料に、それ相応の共鳴部位を設けることができる。

本発明によれば、少なくとも１つの共鳴部位を、少なくとも部分的に、少なくとも１つの別の反応相手の一部分とすることができ、および／または、少なくとも１つの共鳴部位を、少なくとも部分的に、生体直交性反応により生成することができる。前者のケースは基本的に、蛍光色素による古典的な染色反応および／または標識反応に対応する。この場合、一般的に、蛍光構造もしくは着色構造がそれ相応の分子内で準備され、試料の反応構造と結合される。しかしこれとは異なり、本発明による方法を適用することによって、生体直交性反応自体を実施することで、共鳴部位を発生させることもできる。

このことはたとえば、以下に示すように（二重結合または三重結合を含むことができる）ジエノファイルとの共役ジエンの環化付加によって、行うことができる：

たとえば残基Ｙを結合部位として用いる場合、適切なジエンの付加および完全な反応のために、上記反応式の右側に示された構造を生成することができ、この構造は、その固有の特性ゆえに、完全に規定されたＣＡＲＳパターンを有しており、このパターンに合わせて後続のプロセスを整合させることができる。

既述のように本発明による方法を特に、通常であればＣＡＲＳ顕微鏡によっても検出不可能な化学構造の強調もしくは視覚化のためにも、用いることができる。

特に本発明によれば、生体直交性反応を利用して共鳴部位を最初に生成すれば、対応する組織の深部に導入させることのできる小さい分子を使用することができる。なぜならば、いかなる立体障害も発生しないからであり、そのような立体障害はたとえば組織を通して拡散するからである。たとえば蛍光色素を用いた慣用の染色技術と対比すると、生体直交性反応を利用した場合に、このことは重要な利点となる。既述のように、ＣＡＲＳ顕微鏡を用いれば、三次元のイメージングが可能であることから、組織へのこのような導入は、極めて有利である。

既述のように本発明は、生体直交性の化学反応の利用に基づいている。この場合、「生体直交性反応」とは本願においては、生体系内で天然のプロセスとほとんど干渉することなく進行可能な化学反応のことである。特に生体直交性反応は、細胞を損傷する作用を生じさせることなく、進行させることができる。

生体直交性という用語およびこれに関連する化学反応は、当業者に知られている（E.M. SlettenおよびCR. Bertozzi著 "Bioorthogonale Chemie - oder: in einem Meer aus Funktionalitaet nach Selektivitaet fischen", Angew. Chem. 121 (38), 7108-7133, 2009、同じくE.M. SlettenおよびCR. Bertozzi著 "Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality", Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (38), 6974-6998, 2009を参照）。さらに概観として、K.V. ReynaおよびQ. Lin著 "Bioorthogonal Chemistry: Recent Progress and Future Directions", Chem. Commun. (Camb.) 46(10), 1589-1600, 2010も参照されたい。

この場合、典型的な生体直交反応としてたとえば、アジドとシクロオクチンとの１，３−双極子環化付加反応が挙げられる（いわゆる「銅フリーのクリックケミストリー」、J.M. Baskin等著 "Copper-Free Klick Chemistry for Dynamic in vivo Imaging", Proc. Natl. Acad. Sei. U.SA 104(43), 16793-16797, 2007を参照）。さらに別の典型的な反応は、ニトロンと上述のシクロオクチンとの反応、アルデヒドとケトンによるオキシム／水和物の生成、テトラジン反応、イソニトリルをベースとするクリック反応、およびクアドリシクランの生成である。

本発明による生体直交性反応における使用に特に有利であるとみなされるのは、ディールス・アルダー反応、および／またはシュタウディンガー・ライゲーションである。シュタウディンガー・ライゲーションは、生体共役反応を形成するための高度に化学選択的な方法である。この場合、個々の反応相手は、生体系内に存在するほぼすべての官能基に対し生体直交性であり、室温の水性環境ですでに反応する。これによりシュタウディンガー・ライゲーションを、生体細胞の複雑な環境においても使用することができる。詳細については、関連する専門文献を参照されたい（たとえばS. Sander等著 "Staudinger Ligation as a Method for Bioconjugation", Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (38), 8806-8827, 2011などを参照されたい）。

生体直交性反応の使用には一般に２つのステップが含まれ、最初に細胞基材つまりここでは検査対象となる試料に生体直交性官能基を付与し、それらを試料中に導入する。これらの官能基は化学的レポーターとも呼ばれる。使用される基材には、たとえば代謝産物、酵素阻害物質などが含まれ、本発明の場合には、ＣＡＲＳ顕微鏡において視覚化の改善が望まれる、標識すべきすべての化合物または組織が含まれる。この場合、化学的レポーターとも呼ばれる生体直交性官能基は、生体活性を損なわないようにするために、試料の構造を実質的に変化させてはならない。第２のステップにおいて、相補的な官能基を有する標識物質が導入され、この物質が化学的レポーターと反応する。

生体直交性反応を使用することにより、ＣＡＲＳ顕微鏡との関連において、場合によっては引き続き進行する生化学プロセスに悪影響を及ぼすことなく、任意の試料のターゲット部位に特化された識別が可能になる。これに続いて、標識反応によって、ＣＡＲＳイメージングに対し「活性的な」物質の合成または導入が行われる。

この方法によって、個々のターゲットのＣＡＲＳ活性散乱断面積を増加させることができ、または適切な合成反応によってはじめて発生させることができる。その際、相応の方法によれば、化学的なイメージングによって、公知の多重フォノン技術の利点が対応する選択的反応と組み合わせられる。特に、（たとえばシングルフォトン法のための）イメージング要素として、蛍光色素を従来のように使用することに比べると、生体直交性反応において使用される化合物の有利な立体的特性によって、組織のより深いところに存在するターゲット部位を、イメージングに利用することができる。

本発明に従って提案されている措置により達成可能なさらに別の利点は、既述のように、ＣＡＲＳ顕微鏡法において非共鳴のバックグラウンドの再現可能な対比染色である。

ＣＡＲＳ顕微鏡法の場合には既述のように、非共鳴のバックグラウンドが考察され、これを慣用のように「対比染色」として使用することもできる。ただしこれには、バックグラウンドは統計的である、という欠点もある。これに対し、本発明に従って提案されている措置によれば、活性的に行われる相応の「対比染色」によって、規定どおりのバックグラウンドを導入することができ、そのようにして特定の分子に合わせて狙いを定め、結果として得られたイメージを形成されたバックグランドと相関させることができる。これによって、相応のＣＡＲＳ顕微鏡法の再現性および定量表現を向上させることができる。

一般的に知られているように、古典的なラマン法はさほど感度が高くなく、強いラマン散乱体を必要とする。ＣＡＲＳ顕微鏡法は、それよりもかなり感度が高いが、ラマン分光法のように、特異性が高い複雑な物質混合物に導入することはできない。このように特異性が低いということは、検査法のベースとなるタスクのためには、場合によっては不十分である。これに対し本発明によれば、特異性をそれ相応に高めることができ、しかも必要であれば、散乱断面積を増大させることもできる。

本発明における生体直交性反応の特に有利な例として挙げられるのは、修飾されたヒュスゲン環化付加、ニトロンの双極子環化付加、ノルボルネンの環化付加、［４＋１］環化付加、および／または、オキサノボルナジエン環化付加、の形態における少なくとも１つの反応ステップである。

特に、たとえばシクロオクチンを用いた既述の銅フリークリック反応は、本発明において適用するのに特に適している。この場合、シクロオクチンは、たとえばアジド基に結合され、アジド基自体を第１の反応相手として、対応する試料に導入することができる。したがってアジド基は特に生体直交性であり、その理由は、アジド基は小さく、そのため対応する組織に良好に取り込まれ、立体的変化を引き起こさないからである。アジドは天然の試料には現れないので、競合する生物学的副反応は存在しない（M.F. Debets等著 "Azide: a unique dipole for metal-free bioorthogonal ligations", Chembiochem. 11(9), 1168-84, 2010を参照）。シクロオクチンはたしかに比較的大きいけれども、十分な安定性と直交性を有しているので、シクロオクチンも生体内において標識するのに適している。

本発明において特に、テトラジン反応、テトラゾール反応、および／またはクアドリシクラン反応も、生体直交性反応の少なくとも１つの反応ステップとして使用することができる。この種の反応も基本的に公知である。

これまで何度も説明したように、最初に、試料の少なくとも１つの固有の構造を、第１の反応相手と結合することができ、次に、試料の固有の構造と結合された反応相手を、別の反応相手と結合することができる。この場合、任意の反応相手各々が共鳴部位を含むことができ、あるいは２つまたはそれ以上の任意の反応相手の反応によってはじめて、共鳴部位を形成することができる。

特に有利であるとみなされるのは、本来は共鳴部位をもっていない試料の構造のために、生体直交性反応を用いて共鳴部位を付与するステップを含む方法である。すでに説明したとおり、そのような構造は特に、それ自体は共鳴しないバックグラウンドに該当し、バックグラウンドは、慣用の方法の場合には統計的な信号を供給するが、それらの信号は再現可能ではない。これに対し本願発明によれば、非共鳴のバックグランドを相応の共鳴部位によって標識することができ、したがって安定した再現可能なバックグラウンド信号を発生させることができる。この信号は有利には、適切な化合物の選択により、実際に着目している構造に対しコントラストを成して際立つように強調され、たとえば著しく異なる波数においてピークを有するように形成される。

対応する方法が、以下のステップを含むようにすることができる。すなわち、試料の非共鳴のバックグラウンドの構造に共鳴部位を準備し、この共鳴部位に起因する共鳴信号の信号成分を、試料の固有の共鳴部位に起因する信号成分と相関させるステップ、を含むようにすることができる。

なお、自明のとおり、これまでに挙げた特徴ならびに以下でさらに説明する特徴を、それぞれ記載どおりの組み合わせだけでなく、それとは別の組み合わせでも、あるいはそれぞれ単独でも、本発明の範囲を逸脱することなく適用することができる。

図面には、実施例に基づき本発明が概略的に描かれており、次にそれらの図面を参照しながら本発明について詳しく説明する。

本発明の１つの実施形態による方法において使用可能なＣＡＲＳ顕微鏡を示す概略図 本発明の１つの実施形態の基礎とすることができるＣＡＲＳ遷移を示す項図 本発明の１つの実施形態の基礎とすることができる４つの波の混合プロセスを示す図 本発明の１つの実施形態による方法を示す概略図 本発明の１つの実施形態による方法を示す概略図 本発明の１つの実施形態による方法を概略的に示すフローチャート

図中、互いに対応する要素には同じ参照符号が付しており、それらについて繰り返し説明しない。

図１には、共焦点走査型顕微鏡１００として構成された顕微鏡が示されており、この顕微鏡には、たとえば８００ｎｍの第１の波長の光ビーム１０２を発生させるレーザ１０１が含まれている。レーザ１０１を、モード結合型のチタンサファイアレーザ１０３として構成することができる。光ビーム１０２は、入射光学系１０４によって、たとえば微細構造化された波長変更用の光学素子１０５の端部にフォーカシングされる。この光学素子１０５を、フォトニックバンドギャップ材料１０６から成る光ファイバとして構成することができる。

フォトニックバンドギャップ材料１０６から成る光ファイバから出射する、波長が拡げられた光ビーム１０７をコリメートするために、たとえば出射光学系１０８が設けられている。相応に波長が変更された光ビームのスペクトルが、これによりたとえば３００ｎｍ〜１６００ｎｍの波長範囲にわたりほぼ連続的になり、この場合、光の出力はスペクトル全体にわたり十分に一定である。

波長が拡げられた光ビーム１０７は、抑圧手段１０８たとえば誘電体フィルタ１０９を通過し、このフィルタは、波長の拡げられた光ビーム１０７において、第１の波長の領域の光成分の出力を、波長の拡げられた光ビーム１０７のその他の波長のレベルまで低減する。ついで、波長が変更された光ビーム１０７は、たとえば光学系１１０によって照射ピンホール１１１にフォーカシングされ、その後、選択手段１１２に到達する。この選択手段１１２は、音響光学素子１１３として構成されており、主ビームスプリッタとして機能する。選択手段１１２によって、それぞれユーザが設定した波長のポンプ光ビーム１１４およびストークス光ビーム１１５を、選択することができる。

同軸で進行するポンプ光ビーム１１４およびストークス光ビーム１１５は、選択手段１１２から走査ミラー１１６に到達し、この走査ミラー１１６はこれらの光ビームを、走査光学系１１７、チューブ光学系１１８、対物レンズ１１９を通過させて、試料１の上へ導く。たとえばデスキャン検出が行われるのであれば、図面には破線で描かれた試料１から送出された検出光１２０が、対物レンズ１１９、チューブ光学系１１８、および走査光学系１１７を通過して、走査ミラー１１６まで戻り、ついで選択手段１１２に到達してそこを通過し、検出ピンホール１２１の通過後、マルチバンド検出器として構成された検出器１２２によって検出される。たとえば非デスキャン検出を行うためにも、コンデンサ側にさらに別の２つの検出器１２３，１２４を設けることができる。この場合、直線方向で試料１から送出される検出光１２５は、コンデンサ１２６によってコリメートされ、ダイクロイックビームスプリッタ１２７により、波長に応じて別の検出器１２３，１２４へ分配される。検出器の手前にフィルタ１２８，１２９が設けられており、これらのフィルタは、ポンプ光ビーム１１４もしくはストークス光ビーム１１５またはその他の光の波長を有する検出光の成分を抑圧する。

図２および図３については、すでに冒頭で参照して説明した。

図４には、生物源から導出された試料１が、部分図Ａおよび部分図Ｂにそれぞれ示されている。試料１をたとえば、標識すべき細胞、および／または１つの顕微鏡セクションの表面、および／またはそれ相応に準備された組織試料、とすることができる。

図示の実施例の場合、試料１は、参照符号２で表された固有の化学構造を有しており、この化学構造は、ここでは参照符号３が付された反応相手と結合可能である。図示の実施例の場合、反応相手３は結合部位４および共鳴部位５を含んでおり、レーザ照射により励起されると、コヒーレント反ストークスラマン散乱に基づき、共鳴部位５は共鳴信号を供給することができる。

この場合、図４の部分図Ａには、試料１の固有の化学構造２と反応相手３とが結合されていない状態が示されている。これに対し部分図Ｂには、結合された状態が示されており、この状態によって、反応相手３の共鳴部位５を、試料１の一部分として検出に利用できるようになる。

図４もしくはそれらの部分図ＡおよびＢには、一段階の反応が示されているのに対し、図５には二段階の反応が示されている。この図によれば固有の化学構造２は、まず結合分子６と結合し、この分子６は、試料１の固有の化学構造と結合するための第１の官能基７と、共鳴部位５を担持する反応相手３と結合するための第２の官能基８と、を有している。ここでは試料１の固有の化学構造２は、結合分子６の第１の官能基７と結合し、反応相手３はその結合部位４によって、結合分子６の第２の官能基８と結合する。図４と図５とでは、結合部位４と共鳴部位５が、それぞれ部分的に異なるように表されているが、これは例示の都合上にすぎない。図５の場合にも、共鳴部位５は試料１の一部であり、これをそれ相応に検出することができる。ただし図４とは異なり、部分図Ａは、結合された状態を示しているのに対し、部分図Ｂは、結合されていない状態を表している。

図６には、本発明の１つの実施形態による方法がフローチャートとして描かれており、この方法全体を参照符号１０で表す。この方法は、試料１を準備するステップ１１から始まる。ステップ１２において、試料における固有の化学構造と、少なくとも１つの別の反応相手との、生体直交性反応を実施する。ステップ１３において、ステップ１２の生体直交性反応により準備された試料を、適切な検査システムたとえば図１に示したＣＡＲＳ顕微鏡に取り込む。ステップ１４において、検査システムによる試料の検査を実施する。相応に得られた信号を、ステップ１５において検知し、たとえば、少なくとも１つの共鳴部位を含む化学構造の少なくとも１つの構造特性を導出するために、その信号を用いる。

Claims (10)

1. 生物源から導出された試料（１）をＣＡＲＳ顕微鏡法により検査する方法であって、
   レーザ照射により前記試料（１）の少なくとも１つの共鳴部位（５）を励起することによって、コヒーレント反ストークスラマン散乱により生成された共鳴信号を、イメージングのために検知する方法において、
   前記方法（１０）は、前記少なくとも１つの共鳴部位（５）を、前記試料（１）の固有の化学構造（２）と少なくとも１つの反応相手（３，６）との、生体直交性反応によって供給するステップを含む、
   方法。
2. 前記共鳴部位（５）は、少なくとも部分的に、前記少なくとも１つの反応相手（３，６）の一部分である、および／または、前記共鳴部位（５）を少なくとも部分的に、前記生体直交性反応により生成する、
   請求項１記載の方法。
3. 前記生体直交性反応の少なくとも１つの反応ステップとして、ディールス・アルダー反応および／またはシュタウディンガー・ライゲーションを用いる、
   請求項１または２記載の方法。
4. 前記生体直交性反応の少なくとも１つの反応ステップとして、修飾されたヒュスゲン環化付加、ニトロン双極子環化付加、ノルボルネン環化付加、［４＋１］環化付加、および／または、オキサノルボルナジエン環化付加を用いる、
   請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記生体直交性反応の少なくとも１つの反応ステップとして、テトラジン反応、テトラゾール反応、および／または、クアドリシクラン反応を用いる、
   請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
6. 最初に、前記試料の少なくとも１つの固有の構造（２）を、第１の反応相手（６）と結合し、次に、前記試料の前記固有の構造（２）と結合された反応相手（６）を、別の反応相手（３）と結合する、
   請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記別の反応相手（３）は、前記共鳴部位（５）を含む、
   請求項６記載の方法。
8. 前記方法は、本来は共鳴部位（５）を含まない前記試料（１）の構造のために、前記生体直交性反応を用いて共鳴部位（５）を準備するステップを含む、
   請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
9. 前記共鳴信号から、前記少なくとも１つの共鳴部位（５）を含む構造の少なくとも１つの構造特性を導出する、
   請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
10. 前記試料（１）の非散乱性のバックグラウンドの固有の構造に、共鳴部位（５）を設け、前記共鳴部位（２）に起因する前記共鳴信号の信号成分を、固有の共鳴部位（２）に起因する信号成分と相関させる、
    請求項１から９のいずれか１項記載の方法。

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