JP2016533363A5

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Publication number: JP2016533363A5
Application number: JP2016523216A
Authority: JP
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2019-09-05
Anticipated expiration: 2034-09-24

Description

以下の例で使用される無細胞系は、培養された昆虫細胞（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｓｆ２１）から生成された翻訳活性を有する溶解物に基づく。細胞内成分の完全性を維持する非常に穏やかな溶解物の調製手順によって、小胞体（ＥＲ）の重要な部分は、機能的に活性な膜小胞として溶解物中で維持され得る。小胞含有種の溶解物を使用して、グリコシル化、シグナルペプチド切断、脂質化、リン酸化およびジスルフィド結合形成といった翻訳後修飾（ＰＴＭ）が、標的タンパク質において行われ得る。

これらの実験で使用された真核生物の翻訳系は、培養されたツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（のＳｆ２１）細胞由来の翻訳活性を有する溶解物に基づいており、Ｓｆ２１昆虫細胞の小胞体（ＥＲ）にその起源を有する機能的な内因性膜小胞を含む。

Claims

抗原性標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を産生するための方法であって、
非ヒト哺乳動物である宿主に前記抗原性標的タンパク質を組み込んだ小胞体由来膜小胞を含む免疫原性組成物を適用することによって、前記宿主において免疫応答を誘導することと、前記宿主由来の前記標的タンパク質に対する抗体を得ることと、を含み、
少なくとも下記の工程、
ａ）前記標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有する細胞溶解物と、を含む反応媒体におけるインビトロ翻訳反応によって前記標的タンパク質を合成する工程と、
ｂ）前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を、前記媒体から分離する工程と、
ｃ）生理学的に適合可能な媒体において、前記合成された標的タンパク質を含む前記膜小胞を提供する工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記膜小胞を、宿主に適用する工程と、
ｅ）前記標的タンパク質に対する特異的免疫応答に対して、前記宿主の血清サンプルを試験する工程と、
ｆ）前記標的タンパク質に対する特異的免疫応答を示す宿主の血清から、前記標的タンパク質に対する特異的抗体を得る工程と、
を含み、
前記細胞溶解物は、昆虫細胞溶解物である、
ことを特徴とする方法。
前記昆虫細胞溶解物は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞溶解物である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記昆虫細胞溶解物は、Ｓｆ２ｌ細胞溶解物である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
前記膜小胞および前記昆虫細胞溶解物は、同じ細胞株由来である、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
前記合成された標的タンパク質を含む前記膜小胞は、遠心分離によって前記媒体から分離される、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、前記膜小胞において前記合成されたタンパク質の濃縮を促進する条件下で成立する、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
工程ｂ）の後に、前記標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有しない細胞溶解物と、を含む第二の反応媒体に、前記分離された膜小胞を移すことと、前記第二の反応媒体においてインビトロ翻訳反応を行うことと、前記第二の反応媒体から、増加した量の前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離することと、を含む付加的な工程ｂ’）をさらに含み、
工程ｂ’）は、１回又は複数回繰り返され得る、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、前記翻訳反応の過程における反応物または生成物の添加および／または排出を含む連続的な透析に基づく方法によって行われる、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、カスパーゼ阻害剤の存在下で行われる、
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
前記宿主に適用されたタンパク質含有膜小胞を有する前記免疫原性組成物は、任意の追加の免疫賦活アジュバントを含まない、
ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。