JP2016531157A - 逆方向アプローチを使用した長いrnaの非常に効果的な合成 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許協力条約出願は2013年9月14日に出願された、米国仮特許出願第61/877,980号の利点に基づき、主張する。これらの特許の開示内容は、参照することによって本願に組み込まれるものとする。
A.31−mer G−rich RNAキメラ合成(16のグアノシンを含むオリゴヌクレオチド)(図1を参照)
配列:5´−ACG GGA AGA GGG AAmeU GAG GGmeU ACG AGG GCGme U−3´(配列番号No.4)。
「meU」が修飾塩基2´−O−メチルウリジンである点に注意する。
B.43−mer RNA合成(図2を参照)
配列:GGC CCA UCC GUG GAG 988 876 77 C CCA GGG 888 767 76 C GGU C(配列番号No.5):
「6」は、修飾塩基2´−O−メチルアデノシンを表し;
「7」は、修飾塩基2´−O−メチルシチジンを表し;
「8」は、修飾塩基2´−O−メチルグアノシンを表し;
そして、
「9」は、修飾塩基2´−O−メチルウリジンを表す点に注意。
C.74−mer RNA合成(図3を参照)
配列:UCC UCU GUA GUU CAG UCG GUA GAA CGG CGG ACU UUC AAU CCG UAU GUC ACU GGU UCG AGU CCA GUC AGA GGA GC(配列番号No.6)。
D.76−mer RNA合成(図4を参照)
配列:GCC CGG AUA GCU CAG UCG GUA GAG CAU CAG ACU UUU UAU CUG AGG GUC CAG GGU UCA AGU CCC UGU UCG GGC GCC A(配列番号No.7)
(A)非コ−ドRNA(ncRNA)は、哺乳類のX染色体不活性化を制御することが公知で、スモールRNAを産生するために加工されてもよい。
(http://genesdev.cshlp.org/content/23/13/1494.long)
(B)RNA干渉(RNAi)機構は、転写後に遺伝子発現を制御するマイクロRNA(miRNA)および低分子干渉RNA(siRNA)の生成における役割を十分に特徴づける。
mrhlとして公知の2.4−kb非スプライス、ポリアデニル化核保持ncRNAは、80−ntスモールRNAを産生するために、Droshaにより加工される。
(C)miRNAおよびpiwi−干渉RNA(piRNA)が最近最も注目されているが、長いRNA転写物は、異なる固有とされる機能を有するスモールRNAへ加工する際の制御において、重要な役割を有する。
(D)長いncRNAは、スモールRNAを産生するために加工可能であるが、他の転写物がどのように加工されるにも影響することができる。(例えば、スモールRNAに切られるそれらの機能を調整するか、またはそれらのpre−mRNAスプライシングパターンを変更することによって)
(E)ncRNAは、他の転写物にスモールRNAを産生させないようにする。
(F)非コ−ドRNAおよびホルモン制御は、新生の分野である。
ここで、
Bは、アデニン、シトシン、グアノシン、ウラシル、イノシン、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル、5−フルオロウラシル、7−デアザ−アデニン、7−デアザアデノシンおよび5−フルオロサイトシンからなる群から選択される1種であり;
nは、整数100〜約200であり;
Lは、ヌクレオシド、リンカーまたはスペーサを有するコレステロールからなる群から選択される非ヌクレオシド配位子、ビオチン、エチレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、アミノリンカー、二硫化物リンカー、ペプチドリンカー、ポリペプチドリンカー、タンパク質、発蛍光団、クエンチャー色素、一つ以上の2´、5´−結合デオキシヌクレオシド単位、一つ以上の2´、5´−結合リボヌクレオシド単位、および一つ以上の2´、5´−結合デオキシリボース単位であり、
ここで、Lは、介在するリン酸塩を介してRNAヌクレオチドの3´末端に付着され;そして、
(a)化学式2で表されるヌクレオシド固相担体を使用し、
(化学式2)
ここで、
Mは、水素ラジカルまたはリンカーであり;
Mがリンカーである場合、化学式Y−C(O)で表され、付加的にオリゴヌクレオチド合成に適する固相担体につながり、
ここで、Yは、2個の炭素と20個の炭素間の長さを有する炭化水素ジラジカル部分であり、そして
Yは、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリールおよびアルアルキルからなる群から選択され、そして、
炭化水素ジラジカル部分は、付加的に、介在する−O−、−S−、−S(O)2−、−C(O)−および−NR6−から成り、R6は、水素ラジカル、または置換C1〜C20アルキルまたは置換アルアルキルであり、
Wは、酸素ジラジカル、N−Hジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され、そして、
Rは、
Wが酸素ジラジカルである場合、Rはtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)、またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン(TOM)であり、そして、
WがN−Hジラジカルである場合、RはR5 Xで表され、xは、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロ イルからなる群から選択され、そして、
Wがフッ素ラジカルである場合、Rが存在しないように、
選択され、
Bは、9−(N6−ベンゾイルアデニニル)−、9−(N6−アセチルアデニニル)−、9−(N6−tert−ブチルフェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−フェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル)−、1−(N4−ベンゾイルシトシニル)−、1−(N4−アセチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)シトシニル)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェニルアセチルシトシン)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、9−(N2−イソブチルグアニン)−、9−(N2−tert−ブチルフェノキシアセチルグアニン)−、9−(N2−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、および、1−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか、または、
Bは、1−(N4−ベンゾイル−5メチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−、5−メチルシトシニル)−、1−(N4−アセチル−5−メチルシトシニル)−、1−(5−メチル−ウラシリル)−、1−(5−フルオロ−ウラシリル)−、1−(N4−ベンゾイル−5−フルオロシトシル)−、9−(N6−ベンゾイル−7−デアザアデニル)−、9−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−、7−デアザアデニル)−、9−(N2−イソブチル基−7−デアザグアニル)−、および、9N2−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−7−デアザグアニル)−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり、
Zは、ジメトキシトリフェニル(DMT)、モノメトキシトリフェニル(MMT)およびトリメトキシトリフェニル(TMT)からなる保護基であり、
(化学式1)
Yは、酸素原子または硫黄原子であり、
Wは、酸素ジラジカル、N−Hジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され、そして、
R4は、
Wが酸素ジラジカルである場合、R4はtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン(TOM)であり、そして、
WがN−Hジラジカルである場合、R4はR5Xで表され、Xは、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され、
Wがフッ素ラジカルである場合、R4は存在しないように、
選択され;
Bは、9−(N6−ベンゾイルアデニニル)−、9−(N6−アセチルアデニニル)−、9−(N6−tert−ブチルフェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−フェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル)−、1−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)アデニニル)−、1−(N4−ベンゾイルシトシニル)−、1−(N4−アセチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)シトシニル)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェニルアセチルシトシン)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、9−(N2−イソブチルグアニン)−、9−(N2−tert−ブチルフェノキシアセチルグアニン)−、9−(N2−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、および、1−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか、または、
Bは、1−(N4−ベンゾイル−5−メチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−、5−メチルシトシニル)−、1−(N4−アセチル−5−メチルシトシニル)−、1−(5−メチル−ウラシリル)−、1−(5−フルオロ−ウラシリル)−、1−(N4−ベンゾイル−5−フルオロシトシル)−、9−(N6−ベンゾイル−7−デアザアデニル)−、9−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−、7−デアザアデニル)−、9−(N2−イソブチル基−7−デアザグアニル)−、および、9−N2−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−7−デアザグアニル)−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり、
Zは、ジメトキシトリフェニル(DMT)、モノメトキシトリフェニル(MMT)およびトリメトキシトリフェニル(TMT)からなる保護基であり、
R1は、アルキルまたはアリールラジカルであり、
R2は、アルキルまたはアリールラジカルであり、そして、
R3は、シアノエチル、アルキルまたはアリールラジカルである。
Bは、水素であるか、または、アミン保護基を有する各一級アミンで付加的に官能基化される核酸塩基である。
ここで、
Bは、アデニン、シトシン、グアノシン、ウラシル、イノシン、5−メチル−シトシン、5−メチル−ウラシル、5−フルオロ−ウラシル、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−アデノシンおよび5−フルオロ−サイトシンからなる群から選択される1種であり;
nは、整数100〜約200であり;
Lは、ヌクレオシド、リンカーまたはスペーサを有するコレステロールからなる群から選択される非ヌクレオシド配位子、ビオチン、エチレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、アミノリンカー、二硫化物リンカー、ペプチドリンカー、ポリペプチドリンカー、タンパク質、発蛍光団、クエンチャー色素、一つ以上の2´、5´−結合デオキシヌクレオシド単位、一つ以上の2´、5´−結合リボヌクレオシド単位、および一つ以上の2´、5´−結合デオキシリボース単位であり、
ここで、Lは、介在するリン酸塩を介してRNAヌクレオチドの3´末端に付着される。
(a)ヌクレオシドに化学式2で表される固相担体を使用し、
(化学式2)
ここで、
Mは、水素ラジカルまたはリンカーであり;
Mがリンカーである場合、化学式Y−C(O)で表され、付加的にオリゴヌクレオチド合成に適する固相担体につなげられ、
ここで、Yは、2個の炭素と20個の炭素間の長さを有する炭化水素ジラジカル部分であり、そして、Yは、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリールおよびアルアルキルからなる群から選択され、そして、炭化水素ジラジカル部分は、付加的に、介在する−O−、−S−、−S(O)2−、−C(O)−および−NR6−から成り、R6は、水素ラジカルであるか、または、置換C1〜C20アルキルまたは置換アルアルキルであり;
Wは、酸素ジラジカル、N−Hジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され、そして、
Rは、
Wが酸素ジラジカルである場合、Rはtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン(TOM)であり;そして、
WがN−Hジラジカルである場合、RはR5 Xで表され、xは、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され;そして、
Wがフッ素ラジカルである場合、Rが存在しないように、
選択され;
Bは、9−(N6−ベンゾイルアデニニル)−、9−(N6−アセチルアデニニル)−、9−(N6−tert−ブチルフェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−フェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル)−、1−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)アデニニル)、1−(N4−ベンゾイルシトシニル)−、1−(N4−アセチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)シトシニル)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェニルアセチルシトシニル)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、9−(N2−イソブチルグアニン)−、9−(N2−tert−ブチルフェノキシアセチルグアニン)−、9−(N2−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、および、1−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか;または、
Bは、1−(N4−ベンゾイル−5メチルシトシニル)−1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−5−メチルシトシニル)−1−(N4−アセチル−5−メチルシトシニル)−1−(5−メチル−ウラシリル)−1−(5−フルオロ−ウラシリル)−1−(N4−ベンゾイル−5−フルオロシトシル)−9−(N6−ベンゾイル−7−デアザアデニル)−9−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−7−デアザアデニル)−9−(N2−イソブチル−7−デアザグアニル)−そして、9N2−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−7−デアザグアニル)−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり;
Zは、ジメトキシトリフェニル(DMT)、モノメトキシトリフェニル(MMT)およびトリメトキシトリフェニル(TMT)からなる保護基である;
(化学式1)
ここで、
Yは、酸素原子または硫黄原子であり;
Wは、酸素ジラジカル、N−Hジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され;そして、
R4は、
Wが酸素ジラジカルである場合、R4はtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン(TOM)であり;そして
WがN−Hジラジカルである場合、R4はR5 Xで表され、xは、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され;そして、
Wがフッ素ラジカルである場合、R4は存在しないように、
選択され;
Bは、9−(N6−ベンゾイルアデニニル)−、9−(N6−アセチルアデニニル)−、9−(N6−tert−ブチルフェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−フェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル)−、1−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)アデニニル)1−(N4−ベンゾイルシトシニル)−、1−(N4−アセチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)シトシニル)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェニルアセチルシトシン)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、9−(N2−イソブチルグアニン)−、9−(N2−tert−ブチルフェノキシアセチルグアニン)−、9−(N2−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、および、1−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか;または、
Bは、1−(N4−ベンゾイル−5メチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−5−メチルシトシニル)−、1−(N4−アセチル−5−メチルシトシニル)−、1−(5−メチル−ウラシリル)−、1−(5−フルオロ−ウラシリル)−、1−(N4−ベンゾイル−5−フルオロシトシル)−、9−(N6−ベンゾイル−7−デアザアデニル)−、9−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−7−デアザアデニル)−、9−(N2−イソブチル−7−デアザグアニル)−、および、9N2−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−7−デアザグアニル)−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり;
Zは、ジメトキシトリフェニル(DMT)、モノメトキシトリフェニル(MMT)およびトリメトキシトリフェニル(TMT)からなる保護基であり;
R1は、アルキルまたはアリールラジカルであり;
R2は、アルキルまたはアリールラジカルであり;そして、
R3は、シアノエチル、アルキルまたはアリールラジカルである。
Bは、水素であるか、または、アミン保護基を有する各一級アミンで付加的に官能基化される核酸塩基である。
オリゴヌクレオチドSeq.#1(配列番号No.1)(100−mer)、Seq.#2(配列番号No.2)(150−mer)、Seq.#3(配列番号No.3)が、合成される。Seq.#2(200−merまで延長)は、Seq.#3を除いて、1 micromoleスケ−ルの5´→3´方向のREV−RNAホスホロアミダイト化学を用いて、合成された。Seq.#3は、0.5υmoleスケ−ルで合成された。合成は、標準RNAを用いてExpedite8900合成装置で実行された。(1υmoleサイクル、および固相担体を有するモノマーのカップリングタイム、6.0分)オリゴヌクレオチドにおいて合成5は、汎用UnyLinker support 3000A(ChemGenes Cat #N−4000−30)を表す。
N6−tbpac−2´−O−TBDMS−3´−O−DMT−アデノシン−5´−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル−ホスホラミダイト。
Lot #AT239−9(ChemGenes Cat #ANP−3407)
汎用UnyLinker support 3000A、ChemGenes Cat #N−4000−30、Lot #AT157−9
無水アセトニトリルRN−1447
CAP A(フェノキシ酢酸無水物/THF/ピリジン)
CAP B(10%のN−メチルイミダゾール/THF)
DMT除去試薬(3%のTCA(トルエン中))
酸化溶液(0.05Mのヨウ素/ピリジン/H2O/THF)
活性化試薬、5−エチルチオ−1−H−テトラゾール(ETT)(0.35M(アセトニトリル中))
上澄み液は静かに移され、そして、ペレットはもう一度、n−ブタノ−ルで洗浄された。
最後に、500ulアセトニトリルで洗浄され、再び、5000回転数/分で5分間、遠心分離し、上澄み液は静かに移された。ペレットは、1000ulのM.Q水に溶かされ、そして、OD(Crude desalt)を点検する。
200−merのIE HPLCは、さらにより幅広いピークで、予想される溶出時間で溶離する。
このリストは、便利で例示的な要約として役立つことを意味し、完全ではなく、網羅的でなく、制限するものではない。
ここで、
Yは、酸素または硫黄であり;
Wは、酸素、窒素、硫黄またはフッ素であり;
Wが硫黄でないときに、R4はTBDMS、トリイソプロピルシリルオキシメチレン、Fmoc、アルキル、アリールまたはアセチルのようなシリルエ−テルであり;
Wが硫黄であるときは、R4はベンゾイル、アセチルまたは二硫化物であり;
Zは、DMT、MMT、TMT保護基であり;
R1およびR2は、アルキルまたはアリール基からそれぞれに選択され;
R3は、シアノエチル、アルキルまたはアリールである。
ここで、
Mは、水素ラジカルまたはY−CO−であり;
Yは、長さ2〜20の原子の鎖であり、酸素、窒素および硫黄からなる群から独立して選択される一つ以上のヘテロ原子によって、付加的に置換される炭化水素鎖を主成分としており、または、固相担体への結合に適するいずれかのリンカー(例えば、CPG、ポリスチレン、またはオリゴヌクレオチド合成に適する他のいずれかの固相担体)であり;
Wは、酸素、窒素、硫黄またはフッ素であり;
Wが硫黄でない場合は、Rは、シリルエ−テル(例えばTBDMS、トリイソプロピルシリルオキシメチレン、Fmoc、アルキル、アリール、アミノまたはアセチル)であるか、Wが硫黄である場合には、Rはベンゾイル、アセチルまたは二硫化物であり;
Zは、DMT、MMT、TMT保護基である。
RNAは、天然または修飾された核酸塩基、gapmer、ホスホジエステル、ホスホロチオエ−ト、ホスホロセレン酸塩から成る。合成は自動、半自動のDNA/RNA、または他の合成装置、または手動で行うことができる。合成は、ミクログラムからキログラムスケ−ルといった、さまざまなスケ−ルで行うことができる。
5−ヨ−ド−dU、5−ヨ−ド−rU、5−ビニル−dU、5−ビニル−rU、5−ビニルチミジン、N−3メチルデオキシウリジン、N−3 メチル-リボウリジン、N−3メチルチミジン、4チオウリジン、4−チオ−2´−デオキシウリジン、2,6−ジアミノプリンデオキシリボシド、N−3 メチルリボチミジン、2、6−ジアミノプリンリボシド、8−ブロモ2´−デオキシアデノシン、8−ブロモ−r−アデノシン、8−オキソ−デオキシアデノシン、8−オキソ−リボアデノシン、8−オキソ−2´−デオキシ−アデノシン、8−オキソ−リボアデノシン、8−オキソ−デオキシイノシン、8−オキソ−リボ−イノシン、8−ブロモ−デオキシイノシン、8−ブロモ−リボ−イノシン、N−1メチルリボアデノシン、N−1メチル2´−デオキシアデノシン、N−1メチル2´−デオキシイノシン、N−1メチルリボアデノシン、N−1メチルデオキシグアノシン、N−1−メチル−リボグアノシン、エテノアデノシン、エテノ2´−デオキシアデノシン、プリン2´−デオキシリボシド、プリン-ヌクレオシド、2−アミノプリン−2´−デオキシリボシド、2−アミノプリン−リボヌクレオシドに限定されるものではないが、一つ以上のプリンまたはピリミジン修飾から成ることができる。
Claims (13)
-
以下の化学式のRNAオリゴヌクレオチドを合成するプロセスであって、
Bは、アデニン、シトシン、グアノシン、ウラシル、イノシン、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル、5−フルオロウラシル、7−デアザ−アデニン、7−デアザアデノシンおよび5−フルオロサイトシンからなる群から選択される1種であり、
nは、整数100〜約200であり、
Lは、ヌクレオシド、リンカーまたはスペーサを有するコレステロールからなる群から選択される非ヌクレオシド配位子、ビオチン、エチレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、アミノリンカー、二硫化物リンカー、ペプチドリンカー、ポリペプチドリンカー、タンパク質、発蛍光団、クエンチャー色素、一つ以上の2´、5´−結合デオキシヌクレオシド単位、一つ以上の2´、5´−結合リボヌクレオシド単位、および一つ以上の2´、5´−結合デオキシリボース単位であり、
Lは、介在するリン酸塩を介してRNAヌクレオチドの3´末端に付着され、
RNAヌクレオチドの5´末端から3´末端への方向で合成されるRNAのプロセスは、
(a)化学式2で表されるヌクレオシド固相担体を使用し、
(化学式2)
Mは、水素ラジカルまたはリンカーであり、
Mがリンカーである場合、化学式Y−C(O)で表され、付加的にオリゴヌクレオチド合成に適する固相担体につながり、
ここで、Yは、2個の炭素と20個の炭素間の長さを有する炭化水素ジラジカル部分であり、そして、
Yは、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリールおよびアルアルキルからなる群から選択され、そして、炭化水素ジラジカル部分は、付加的に、介在する−O−、−S−、−S(O)2−、−C(O)−および−NR6−から成り、R6は、水素ラジカル、または置換C1〜C20アルキルまたは置換アルアルキルであり、
Wは、酸素ジラジカル、N−Hジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され、そして、
Rは、
Wが酸素ジラジカルである場合、Rはtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)、またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン(TOM)であり、そして、
WがN−Hジラジカルである場合、RはR5 Xで表され、xは、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され、そして、
Wがフッ素ラジカルである場合、Rは存在せず、
Bは、9−(N6−ベンゾイルアデニニル)−、9−(N6−アセチルアデニニル)−、9−(N6−tert−ブチルフェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−フェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル)−、1−(N4−ベンゾイルシトシニル)−、1−(N4−アセチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)シトシニル)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェニルアセチルシトシン)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、9−(N2−イソブチルグアニン)−、9−(N2−tert−ブチルフェノキシアセチルグアニン)−、9−(N2−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、および、1−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか、または、
Bは、1−(N4−ベンゾイル−5メチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−、5−メチルシトシニル)−、1−(N4−アセチル−5−メチルシトシニル)−、1−(5−メチル−ウラシリル)−、1−(5−フルオロ−ウラシリル)−、1−(N4−ベンゾイル−5−フルオロシトシル)−、9−(N6−ベンゾイル−7−デアザアデニル)−、9−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−、7−デアザアデニル)−、9−(N2−イソブチル−7−デアザグアニル)−、および、9N2−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−7−デアザグアニル)−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり、
Zは、ジメトキシトリフェニル(DMT)、モノメトキシトリフェニル(MMT)およびトリメトキシトリフェニル(TMT)からなる保護基であり、
(b)オリゴヌクレオチド合成装置上の化学式1で表されるホスホラミダイトを配置し、
(化学式1)
Yは、酸素原子または硫黄原子であり、
Wは、酸素ジラジカル、N−Hジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され;そして、
R4は、
Wが酸素ジラジカルである場合、R4はtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン(TOM)であり;そして、
WがN−Hジラジカルである場合、R4はR5 Xで表され、Xは、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され、
Wがフッ素ラジカルである場合、R4は存在しないように、
選択され、
Bは、9−(N6−ベンゾイルアデニニル)−、9−(N6−アセチルアデニニル)−、9−(N6−tert−ブチルフェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−フェノキシアセチルアデニニル)−、9−(N6−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル)−、1−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)アデニニル)−、1−(N4−ベンゾイルシトシニル)−、1−(N4−アセチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)シトシニル)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェニルアセチルシトシン)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、9−(N2−イソブチルグアニン)−、9−(N2−tert−ブチルフェノキシアセチルグアニン)−、9−(N2−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン)−、1−(N4−フェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−tert−ブチルフェノキシアセチルシトシニル)−、1−(N4−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル)−、および、1−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか、または、
Bは、1−(N4−ベンゾイル−5−メチルシトシニル)−、1−(N4−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−、5−メチルシトシニル)−、1−(N4−アセチル−5−メチルシトシニル)−、1−(5−メチル−ウラシリル)−、1−(5−フルオロ−ウラシリル)−、1−(N4−ベンゾイル−5−フルオロシトシル)−、9−(N6−ベンゾイル−7−デアザアデニル)−、9−(N6−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−、7−デアザアデニル)−、9−(N2−イソブチル−7−デアザグアニル)−、および、9N2−(N,N−ジメチルホルムアミジニル)−7−デアザグアニル)−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり、
Zは、ジメトキシトリフェニル(DMT)、モノメトキシトリフェニル(MMT)およびトリメトキシトリフェニル(TMT)からなる保護基であり、
R1は、アルキルまたはアリールラジカルであり、
R2は、アルキルまたはアリールラジカルであり、そして、
R3は、シアノエチル、アルキルまたはアリールラジカルであり、
Bは、水素であるか、または、アミン保護基を有する各一級アミンで付加的に官能基化される核酸塩基であり、
(c)化学式2で表されるヌクレオシド固相担体から保護基Zを取り除き、
(d)保護基を少なくとも一つ有するオリゴヌクレオチドを生じさせるために、補助試薬の混合物を用いて、オリゴヌクレオチド合成装置において、化学式2のヌクレオシドおよび式1のホスホラミダイトをカップリングすることにより、RNA合成のプロセスを実行し、
(d)ホスホラミダイトにL基を提供し、
(e)L基を有するオリゴヌクレオチドを生じさせるために、オリゴヌクレオチドの末端に、L基を伴うホスホラミダイトを加え、
(f)固相担体からL基を有するオリゴヌクレオチドを分離し、
(g)オリゴヌクレオチドから少なくとも一つの保護基を取り除き、
(h)オリゴヌクレオチドを生じさせるためにシリル保護基を取り除き、
(i)オリゴヌクレオチドを沈殿させ、
(j)純度を決定するためにオリゴヌクレオチドを分析するプロセスにおいて、
補助試薬は、CAP A(フェノキシ樹脂無水酢酸/テトラヒドロフラン/ピリジン)、CAP B(10%のN−メチルイミダゾール/テトラヒドロフラン)、DMT除去試薬(3%のTCA(トルエン中))、酸化溶液(0.05Mのヨウ素/ピリジン/水/テトラヒドロフラン)および活性化試薬(0.35Mの5−エチルチオ−1−H−テトラゾール(アセトニトリル中))から成ることを特徴とする、プロセス。 - Lはリンカーまたはスペーサを有するコレステロールであり、そして、nは整数100〜約200であることを特徴とする、請求項1に記載のプロセス。
- Lはポリエチレングリコール(PEG)であり、そして、nは整数100〜約200であることを特徴とする、請求項1に記載のプロセス。
- RNAオリゴヌクレオチドが請求項1に記載のプロセスによって合成されることを特徴とする、RNAオリゴヌクレオチド。
- 請求項1に記載の逆RNA合成方法論を用いた、100〜200―merの長鎖RNAのRNA合成の方法。
- デオキシ、バックボーン修飾塩基、修飾DNAおよび修飾RNA塩基から成る、長鎖RNAキメラであって、
前記長鎖RNAキメラは、請求項1に記載のプロセスに従って合成される。 - 請求項1に記載の逆方法論を用いる、末端、分岐点、または、鎖の内で、一つ以上の5´、2´、2´、3´結合を有する長鎖RNA。
- 請求項1に記載の逆合成方法論を用いる、天然および修飾ヌクレオシド、脱塩基部位、逆脱塩基部位、発色団および配位子からなる長鎖RNA。
- 請求項1に記載の逆合成方法論を用いる、発色団、配位子、一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基からなる長鎖RNA。
- 請求項1に記載の逆RNA方法論を用いる、一つ以上のデオキシ、修飾デオキシ、または修飾リボヌクレオシドとの分岐点を有する長鎖RNA。
- 長鎖RNAの精製の方法であって、
前記長鎖RNAは、請求項1に記載の逆方法論により合成され、そして、前記方法は、HPLCゲル電気泳動またはRNA精製技術により行われる。 - 長鎖RNAの、表面への標識および付着の方法であって、
前記長鎖RNAは請求項1に記載の逆方法論によって合成される。 - 分子生物学研究開発の長鎖RNAを使用する方法であって、
前記長鎖RNAは請求項1に記載の逆方法論により合成される。
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