JP2016526877A - hDIS3 PINドメイン阻害剤の選択と癌治療のためのhDIS3 PINドメイン阻害剤の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、hDIS3 PINドメイン阻害剤の選択またはスクリーニングの方法、そのような方法に使用される酵母菌株および細胞株に関する。本発明はまた、新しい治療薬である選択されたhDIS3 PINドメイン阻害剤と、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌、とりわけ多発性骨髄腫の処置におけるその使用に関する。本発明はまた、新しい治療薬hDIS3 PINドメイン阻害剤を含む組成物と、癌細胞において合成致死を引き起こすための方法に関する。【選択図】図4
Description
本発明は、hDIS3 PINドメイン阻害剤の選択方法、およびそうした方法で使用される酵母菌株と細胞株に関する。本発明はさらに新しい治療薬である選択されたhDIS3 PINドメイン阻害剤と、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌、とりわけ多発性骨髄腫の処置におけるその使用に関する。本発明はさらに新しい治療薬hDIS3 PINドメイン阻害剤を含む組成物と、癌細胞において合成致死を引き起こすための方法に関する。
本発明はさらに、hDIS3 PINドメインの触媒的な阻害による合成致死に対する癌細胞の感受性について、多発性骨髄腫のような癌の患者のスクリーニング方法と同様にhDIS3 PINドメイン阻害剤の選択方法とスクリーニング方法に関する。
合成致死は、標的とした癌治療の発達に関して最も有望な戦略の1つとして最近台頭してきている(Porcelliら、2012)。こうした戦略により、形質転換していない細胞に対する効果を潜在的に低くして、癌細胞を標的とすることが可能となる。例えば、BRCA1とBRCA2に突然変異を有する乳癌細胞は、ポリ[ADP−リボース]ポリメラーゼ(PARP1)の阻害に非常に敏感であるが、PARP1の阻害は、野生型のBRCAを有する標準細胞の生存と増殖にはほとんど影響がない(Bryantら、2005;ファーマーら、2005)。PARP1阻害剤に基づくリード化合物は高度な臨床試験にある(バーバーら、2013)。
多発性骨髄腫(MM)は、すべての腫瘍の1%以上、血液の悪性腫瘍の10−15%、および血液と骨髄の癌に関連する死の20%以上を占める致命的な腫瘍性疾患である(Laubachら、2011)。処置するのは難しく、今日に至るまで成功した治療は見つかっていない。
MMの遺伝的背景は完全には理解されていない。MM患者の最大で90%において、染色体の異常が検出されている。
38人のMM患者の全ゲノム配列決定を記載した最近の公報は、この癌に関連する体細胞突然変異に包括的な考察を与えている(Chapmanら、2011)。患者のおよそ50%は、MMの進行の主要な前提条件として染色体転座とともに、NRASまたはKRAS活性化突然変異のいずれかを有していた。思いがけないことに、癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子として以前は記載されていなかったhDIS3遺伝子がMM患者で頻繁に変異した。hDIS3タンパク質はよく記載されているエキソソーム複合体の触媒サブユニットであり、これは真核生物のRNAプロセシングと分解において重要な役割を果たす(以下を参照)(Chapmanら、2011)。MM患者における高い頻度のhDIS3遺伝子突然変異は、別のハイスループット研究で細菌確認されている(ウォーカーら、2012)。
興味深いことに、hDIS3遺伝子突然変異は、髄芽腫(この場合、D479をVに変化させる真の触媒による突然変異であり、これはMg2+イオンの配位を破壊し、それによってhDIS3エキソヌクレアーゼの活性を無効にする)や急性骨髄性白血病(活性部位:D488Nにおける別のアスパラギン酸塩の置換を含む)の複数の症例のように、他のタイプの癌に専用の包括的なスクリーニングでも見つかった(パースンズら、2011;Dingら、2012)。加えて、hDIS3は、その発現が表在拡大型黒色腫と結節性メラノーマを区別する遺伝子の1つとして、トランスクリプトーム分析で確認された(ローズら、2011)。さらに、それぞれのmRNAとタンパク質の上昇値が転移の発生率と正に相関しているヒトの結腸直腸癌とこの癌のマウスモデルにおいて、当初hDIS3過剰発現が観察された(Limら、1997;Liangら、2007)。ごく最近になって、機能ゲノム科学研究は、結腸直腸癌細胞株の成長維持にとって必要不可欠な複数の遺伝子の1つとしてhDIS3を定義した(キャンプスら、2013)。
真核生物のRNA分解とプロセシング経路は遺伝子発現調節の本質的な構成要素である。RNAターンオーバーは細胞ホメオスタシスの重大な部分である。
3’−5’エキソヌクレアーゼのRNA分解を触媒するエキソソーム複合体は、RNAターンオーバーのすべての経路に実際に基本的な役割を果たす一次の真核生物のリボヌクレアーゼである(Lebreton&Seraphin(2008年);Schmid&Jensen、2008年;Tomeckiら、2010a)。要するに、それは以下に関与する:正常なmRNAのターンオーバーと不安定なmRNAのAUリッチ領域によって制御された分解(Gherziら、2004;Mukherjeeら、2002);安定したRNAクラス(SnRNA、snoRNA、rRNA、tRNA)の核プロセシング(Allmangら、1999;Gudipatiら、2012);その存在がエキソソーム突然変異体中で発見された遺伝子間領域から発生する不安定な転写物の分解(Wyersら、2005);RNA干渉経路のsiRNAによって始められたエンドヌクレアーゼ分解性(endonucleolytic)の切断後のmRNAの完全な分解(OrbanとIzaurralde、2005年)。さらに、エキソソーム複合体は、核と細胞質の両方のRNAの品質管理に重大な役割を果たす。これは、早熟な終止コドン(NMD、ナンセンス変異依存mRNA分解機構)を含む、終止コドン(NSD、ノンストップ分解機構)を欠く、または翻訳中のリボソームの停止(NGD、No−Go Decay)を引き起こすいくつかの立体的な障害を備えたmRNAを欠く、転写物の分解として細胞質のRNA品質管理経路に関与する(Allmangら、1999年;Allmangら、2000年;Assenholtら、2008年;Gudipatiら、2012年;Isken& Maquat、2007年;Kadabaら、2004年;Parker、2012年;Wangら、2008)。最も重要なことには、それは、不適切に処理されたプレmRNA、rRNA、およびtRNA、これらの合成の前駆体を含む、核の中の望ましくない分子の分解の原因である一次の酵素である。エキソソーム突然変異体では、遺伝子間領域とアンチセンス領域から生じる莫大な量のRNAが蓄積するため、エキソソームの関心機能は転写の浸透を抑える際にある(Prekerら、2008;ルバら、2011)。こうした転写物のいくつかは制御的機能を持っており、これらが生じる部位の近くにある遺伝子の染色質のサイレンシングに関与する(Camblongら、2007)。
hDIS3タンパク質はRNAエキソソーム複合体の触媒サブユニットであり、これはRNAプロセシングと分解に重大な役割を果たす。エキソソーム複合体は進化的に保存された構造を有する。それは9つのサブユニット環からできており、古細菌および細菌の加リン酸分解リボヌクレアーゼに対して相同であるにもかかわらず任意の検知できる触媒活性が欠けている(Liuら、2006;Dziembowskiら、2007)。該環サブユニットによって形成された触媒現象的に不活性な中央のエキソソームチャネルは、関連する触媒サブユニットによって完全に供給される複合体(Wasmuth&Lima、2012年;Drazkowskaら、2013)のリボヌクレアーゼ活性の制御において重要な機能を有している。エキソソームの酵素活性の原因であるリボヌクレアーゼは2つの異なるファミリーに属する:Dis3様のタンパク質はバクテリアのリボヌクレアーゼII/Rに似ており、その一方でRrp6様のサブユニットはリボヌクレアーゼDファミリーのメンバーである(Tomeckiら、2010aで概説されている)。エキソソームは酵母菌中で発見され、研究作業の大部分はこのモデルシステムを用いて行われてきた(ミッチェルら、1997)。酵母菌ゲノムでは、Dis3とRrp6のタンパク質をコードする単一遺伝子がある。Dis3は、核と細胞質の両方に存在する唯一の必要不可欠な触媒サブユニットである。この多ドメインタンパク質には2つの異なる触媒活性:RNBドメインに存在する3’−5’のエキソヌクレアーゼ活性と、N末端基PINドメインから生じるエンドヌクレアーゼ分解性の活性(Dziembowskiら、2007年;Lebretonら;2008年、Schaefferら、2009年;Schneider ら;2009)がある。Dis3エキソヌクレアーゼ活性部位は、基質が送達される際に通る、9つのサブユニット環の中央のチャネルの底の近くにある(Bonneauら、2009;Maletら、2010)。両方の活性は互いに協力し合うが、エキソの活性の方が細胞生理学にとってはより重要である(Lebretonら、2008;Schaefferら、2009;Schneiderら、2009)。Rrp6は核に制限され、核のエキソソーム機能のサブセットにのみ関与している。エキソソームは独力で機能せず、その完全な活性と複数基質の効率的な認識のために適切な補助因子を必要とする。すべての補助因子の中央の成分はRNAヘリカーゼであり、これは基質を環の中央のチャネルに伝達すると考えられており、それはその後Dis3のエキソヌクレアーゼ活性部位にRNAを送達する。
よく保存された構造にもかかわらず、ヒトと酵母菌のエキソソームの間には、とりわけ触媒サブユニットの特性には重要な違いがある。ヒトゲノムは2つのタンパク質−hDIS3とhDIS3Lをコード化する。これらは、新しく発見されたCR3モチーフと、9つのサブユニット環との相互作用に必要とされる構造上無傷なPINドメインを含むすべてのDis3元素を含んでいる(Tomeckiら、2010b;Staalsら、2010;Schaefferら、2012)。プロテオミクス解析は、hDIS3とhDIS3Lの両方が最も可能性が高いのは相互に排他的な方法でヒトのエキソソーム環と相互に作用することを確認した。顕著なことに、両方のヒトDis3相同体は進行性の3’−5’加水分解のエキソヌクレアーゼであるが、hDIS3だけはそのPINドメイン中でエンドヌクレアーゼ活性も保持した。生体内の局在化研究と基質特異性の分析によると、hDIS3Lが細胞質のエキソソームに制限され、一方で、hDIS3は、主として細胞質にある小さな画分を備えた核質のタンパク質であることが明らかになった(Tomeckiら、2010b、Staalsら、2010)。加えて、ヒトRRP6は主として核であり、細胞質中の小さな画分とともに、核小体中で著しく豊かである。したがって、ヒトRNAエキソソームは、そのS.セレビジエ(cerevisiae)相当物と同じ構造的なスキャフォールドに基づくが、核の異なる領域と細胞質において機能的かつ組成的に別々の変異体として存在する(Lykke−Andersenら、2011)。
不十分なパフォーマンス、重篤な副作用の発生、および現在使用されている治療薬に対する耐性が骨髄細胞のような癌(腫瘍)細胞中ですぐに進行するという事実のため、とりわけ癌細胞に影響を及ぼす新しい専用の治療法が大いに必要とされている。
上に示された情報はエキソソーム複合体の機能と様々な癌の進行の間の分子リンクの存在を示唆する。
本発明は、DIS3 RNBドメイン中の癌患者で見られる突然変異に対応する突然変異を有するDIS3におけるエンドヌクレアーゼ分解性のDIS3 PINドメイン活性の阻害が、こうした突然変異を有する細胞において合成致死の効果を与えるという予期しない発見に基づいている。
上に記載されるように、往々にしてhDIS3遺伝子中の突然変異によるhDIS3活性の変化は、黒色腫、結腸直腸癌、髄芽腫、急性骨髄性白血病、および、とりわけ多発性骨髄腫(MM)患者などの癌患者で見られることが多い。細胞ホメオスタシスについてのRNA代謝の重要性ゆえに、こうした突然変異を保護する癌細胞はエキソソーム複合体の活性に対するさらなる損傷に潜在的により脆弱なことがある。しかしながら、当該技術では、これを開発することができる成功した治療方法も有効な治療薬もない。こうした処置のための潜在的に新しい治療薬の選択し、スクリーニングし、および効率的に試験する方法もなく、特に、新しい治療薬の有効な選択とスクリーニングに利用可能な方法はなく、RNBドメイン中に存在する突然変異とhDIS3 PINドメインのエンドヌクレアーゼ分解性のエンドヌクレアーゼ分解性の活性の阻害との間の合成致死に基づく癌の処置で使用することができる治療薬はない。
したがって、本発明の目的は、hDIS3 PINドメイン阻害剤の選択およびスクリーニング方法、こうした方法で使用される酵母菌株、および細胞株を提供することである。本発明の目的は、新しい治療薬−選択されたhDIS3 PINドメイン阻害剤と、RNBドメイン中に存在する突然変異とhDIS3 PINドメインのエンドヌクレアーゼ分解性の活性の阻害との間の合成致死に基づいて、癌、とりわけ、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する多発性骨髄腫の処置におけるその使用を提供することである。
本発明は、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の方法に関し、該方法は以下の工程を含む:
a)好ましくは癌細胞中のhDIS3で生じる突然変異を導入することにより、RNBドメイン中の突然変異を含むDIS3、そのフラグメント、相同体または変異体を含んでいるモデルシステムを構築する工程、
b)a)で得られたモデルシステムを試験済みの薬剤である、想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
c)モデルシステムに適切な方法によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)試験済みの薬剤と接触した際にPINドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程。
a)好ましくは癌細胞中のhDIS3で生じる突然変異を導入することにより、RNBドメイン中の突然変異を含むDIS3、そのフラグメント、相同体または変異体を含んでいるモデルシステムを構築する工程、
b)a)で得られたモデルシステムを試験済みの薬剤である、想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
c)モデルシステムに適切な方法によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)試験済みの薬剤と接触した際にPINドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程。
本発明はさらにhDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法に関し、該方法は以下の工程を含む:
a)DIS3 PINドメイン、そのフラグメント、変異体または相同体、好ましくは単離されたhDIS3 PINドメインを含む、精製タンパク質を得る工程;
b)a)で得られたタンパク質を、試験済みの薬剤である、想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
c)好ましくはRNA基質の生体外での消化によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)試験済みの薬剤と接触した際にPINドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程。
a)DIS3 PINドメイン、そのフラグメント、変異体または相同体、好ましくは単離されたhDIS3 PINドメインを含む、精製タンパク質を得る工程;
b)a)で得られたタンパク質を、試験済みの薬剤である、想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
c)好ましくはRNA基質の生体外での消化によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)試験済みの薬剤と接触した際にPINドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程。
hDIS3 RNBドメイン中の突然変異を含む精製されたhDIS3変異体の使用に関する方法は、生体外でhDIS3 PINドメイン阻害剤を選択し、スクリーニングするための適切なモデルシステムである。
本発明はさらにhDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法に関し、該方法は以下の工程を含む:
a)好ましくは癌細胞中でhDIS3を生じる突然変異と等価な突然変異を導入することにより、RNBドメイン中に突然変異を備えたDis3を含む酵母菌株を構築する工程、
b)a)で得られた酵母菌株を、試験済みの薬剤である想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
c)試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)野性型Dis3を含む酵母菌ではなく、a)で構築された酵母菌の処理後に選択的な成長遅延または細胞死(合成致死)を引き起こす、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程。
a)好ましくは癌細胞中でhDIS3を生じる突然変異と等価な突然変異を導入することにより、RNBドメイン中に突然変異を備えたDis3を含む酵母菌株を構築する工程、
b)a)で得られた酵母菌株を、試験済みの薬剤である想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
c)試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)野性型Dis3を含む酵母菌ではなく、a)で構築された酵母菌の処理後に選択的な成長遅延または細胞死(合成致死)を引き起こす、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程。
Dis3 RNBドメイン中の突然変異を含む酵母菌株の使用に関する方法は、生体内でDIS3 PINドメイン阻害剤を選択し、スクリーニングするのに適切なモデルシステムである。
本発明は、さらにhDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるhDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法に関し、該方法は以下の工程を含む:
a)好ましくは癌細胞中のhDIS3で生じる突然変異を導入することによって、RNBドメイン中に突然変異を有するhDIS3、そのフラグメントまたは変異体を含む、改変した細胞株、好ましくはヒト細胞株を構築する工程、
b)a)で得られた細胞株を、試験済みの薬剤である、想定されるhDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
c)試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)野性型hDIS3を発現する細胞株ではなく、a)で構築された細胞株の処理後に選択的な成長遅延または細胞死(合成致死)を引き起こす、hDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程。
a)好ましくは癌細胞中のhDIS3で生じる突然変異を導入することによって、RNBドメイン中に突然変異を有するhDIS3、そのフラグメントまたは変異体を含む、改変した細胞株、好ましくはヒト細胞株を構築する工程、
b)a)で得られた細胞株を、試験済みの薬剤である、想定されるhDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
c)試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)野性型hDIS3を発現する細胞株ではなく、a)で構築された細胞株の処理後に選択的な成長遅延または細胞死(合成致死)を引き起こす、hDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程。
hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する改変されたヒト細胞株の使用を含む方法は、生体内でhDIS3 PINドメイン阻害剤を選択し、スクリーニングするための適切なモデルシステムである。
本発明に係るDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の好ましい方法では、癌細胞中のhDIS3遺伝子中の突然変異は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病で生じる少なくとも1つの突然変異である。
本発明に係るDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の好ましい方法では、癌細胞中のhDIS3 RNBドメイン中の突然変異は、SEQ ID NO:1に関して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異である。
本発明に係るDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の好ましい方法では、hDIS3は、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内のコード配列中に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくはSEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸変化を含んでいる。
hDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の好ましい方法では、DIS3 PINドメインはSEQ ID NO:1のAA 1−217のhDIS3 PINである。
本発明はさらにhDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬に関し、治療薬は本発明に係るDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で得られる。
本発明はさらに、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される、治療薬である2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオン(AC1LAHYLとしても知られている)、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩に関する。好ましい治療薬は、SEQ ID NO:1に関して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異を有する癌細胞中のhDIS3 RNBドメインに突然変異を有する癌細胞に使用される。好ましい治療薬は、hDIS3 RNBドメインがSEQ ID NO:1の配列AA 427−843中に少なくとも1つの突然変異を有するhDIS3 RNBドメインである癌細胞に使用される。
治療薬が化合物である場合、本発明はさらにこうした化合物の溶媒和物、薬学的に許容可能なプロドラッグ、薬学的に活性代謝物、および薬学的に許容可能な塩を含む。治療薬である2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンに関して、本発明はさらにDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性の阻害剤活性を有している、誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩を含んでいる。
本発明はさらに、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、本発明の治療薬、あるいは、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法によって得られる治療薬の使用に関する。
本発明はさらにhDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオン、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩の使用に関する。治療薬は、SEQ ID NO:1に関連して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異を備えたhDIS3 RNBドメインに突然変異を有する癌細胞に使用されるのが好ましい。好ましくは、hDIS3 RNB中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される。治療薬の好ましい使用では、hDIS3は、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内のコード配列に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくは、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸変化を含んでいる。
本発明はさらに、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬を含む組成物に関し、治療薬は本発明のDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で得られるか、あるいは本発明の治療薬である。好ましい実施形態では、組成物は、SEQ ID NO:1に関連して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異を含む癌細胞のhDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞に使用される。組成物の好ましい使用では、hDIS3 RNB中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される。組成物は好ましくは、抗癌活性を有する少なくとも1つの追加の薬剤をさらに含み、追加の薬剤は、多発性骨髄腫、髄芽腫、または急性骨髄性白血病に対する抗癌活性を有している。好ましくは、追加の薬剤は、骨髄腫用のボルテゾミブ、カーフィルゾミブクラフェン(clafen)(シクロホスファミド)、シクロホスファミド、シトキサン(シクロホスファミド)、ドキシル(塩酸ドキソルビシンリポソーム)、塩酸ドキソルビシンリポソーム、dox−SL(塩酸ドキソルビシンリポソーム)、エバセト(evacet)(塩酸ドキソルビシンリポソーム)、カイプロリス(kyprolis)(カーフィルゾミブ)、レナリドミド、LipoDox(塩酸ドキソルビシンリポソーム)、モゾビル(プレリキサホル)、ネオサル(neosar)(シクロホスファミド)、プレリキサホル、ポマリドミド(ポマリスト)、ポマリスト、レブラミド(レナリドミド)、シノビール(synovir)(サリドマイド)、サリドマイド、サロミド(サリドマイド)、ベルケイド(ボルテゾミブ)、ゾレドロン酸、ゾメタ(ゾレドロン酸);急性骨髄性白血病(AML)用のアドリアマイシンPFS(塩酸ドキソルビシン)、アドリアマイシンRDF(塩酸ドキソルビシン)、三酸化ヒ素、セルビジン(塩酸ダウノルビシン)、クラフェン(シクロホスファミド)、シクロホスファミド、シタラビン、シトサール(cytosar)−U(シタラビン)、シトキサン(シクロホスファミド)、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、ネオサル(シクロホスファミド)、ルビドマイシン(rubidomycin)(塩酸ダウノルビシン)、タラビン(tarabine)PFS(シタラビン)、トリセノックス(三酸化ヒ素)、ビンカサール(vincasar)PFS(硫酸ビンクリスチン)、硫酸ビンクリスチン;髄芽腫用のロムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、またはシクロホスファミドから選択される。
組成物の好ましい使用では、癌細胞中のDIS3は、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内のコード配列中に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくは、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸変化を含む。
本発明はさらに治療薬、その調製物、または本発明の治療薬を含む組成物、あるいは薬学的に許容可能な担体中の本発明の組成物に関する。薬学的に許容可能な担体の選択は、投与経路だけでなく、治療薬の溶解度、および、細胞、組織、または有機体に入る前にそれが不活性化または分解することを防ぐ必要性に依存する。薬学的に許容可能な担体は、溶媒、分散剤、および添加剤(コーティング、界面活性剤、香料添加剤、酸化防止剤など)を含んでもよい。
本発明の組成物はさらに抗癌活性を有する少なくとも1つの追加の薬剤、好ましくは多発性骨髄腫、髄芽腫、または急性骨髄性白血病に対する活性を含む薬剤を含んでもよい。本発明の治療薬と追加の抗癌剤(複数の抗癌剤)は同時に投与されるか、あるいは、共に、または連続して、または、任意の適切な順序で投与されることもある。
本発明の組成物と治療薬は、経口または局所の注入を含む様々な経路によって投与されることがある。経口投与用の調製物は、溶液、懸濁、エマルジョン、カプセル剤、錠剤、または散剤の形をしていることがある。経口の液状製剤は、随意に界面活性剤、懸濁化剤、または乳化剤を加えて、水やアルコールのような希釈剤を含むこともある。カプセル剤はゼラチンタイプであってもよく、錠剤は当該技術で知られている賦形剤を含むこともある。注入可能な調製物は、酸化防止剤、バッファー、等張性の薬剤などを随意に含む水性および非水性の等張性の無菌液を含んでいる。典型的な担体は水または生理食塩水である。組成物は一般に、活性成分を担体で希釈または混合するか、あるいは、担体中にそれを密封することによって得られる。治療薬が核酸である場合、治療薬は細胞または組織のタイプを認識する特別のリポソーム系に投与可能である。別の実施形態では、核酸は所望の阻害剤、例えば、ミクロのRNA、siRNAをコード化する配列を含む発現ベクターを使用して導入可能である。
治療薬の用量は、投与経路、疾患の進行、および患者の年齢や体重のような他の重要な状況を考慮して決定される。
本発明はさらに癌細胞の合成致死を引き起こす方法に関し、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、hDIS3 PINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する薬剤で処置される。癌細胞の合成致死を引き起こす好ましい方法では、hDIS3 PINドメインの活性を阻害する薬剤は、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法によって得られるか、あるいは本発明の治療薬であるか、あるいは、本発明の組成物である。癌細胞の合成致死を引き起こす好ましい方法では、DIS3は、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内のコード配列中に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくは、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸変化を含む。癌細胞の合成致死を引き起こす好ましい方法では、DIS3 PINドメインは、SEQ ID NO:1のAA 1−217のhDIS3 PINである。
本発明はさらに、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用される酵母菌株、好ましくはS.cerevisiae株に関し、酵母菌株はDis3 RNBドメイン中の突然変異を含むDIS3を含み、これは癌細胞で見られる突然変異、好ましくは髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫細胞で見られる突然変異の等価物である。Dis3 RNBドメイン中の酵母菌株の突然変異において、好ましくは少なくとも1つの突然変異が、SEQ ID NO:1に関して、ヒト等価物S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択される。酵母菌株において、Dis3は好ましくは、そのRNBドメイン内のコード配列中に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくはSEQ ID NO:1のAA 427−843のヒトhDIS RNBドメインに相同するそのRNBドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸変化を含み、したがって、こうした突然変異は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫から選択された癌細胞中の突然変異と等価である。好ましい酵母菌株では、DIS3 PINドメインはSEQ ID NO:1のAA 1−217のhDIS3 PINであるか、あるいは、DIS3 PINドメインは(SEQ ID NO:2のAA 1−241)のDIS3 PINである。好ましい酵母菌株は、dis3−G833R、dis3−R847K、dis3−V568G、dis3−A588P、dis3−D551Nから選択される。
hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の好ましい選択方法において、該方法は、本発明の酵母菌株の使用を含む。
本発明はさらに、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための本発明の酵母菌株の使用に関する。
本発明はさらに、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用される細胞株に関し、細胞株は癌細胞で見られる突然変異の等価物であるDIS3 RNBドメイン中の突然変異を有するDIS3を含む。細胞株は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫から選択される癌細胞に関して、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用されるのが好ましい。好ましい細胞株は、ヒト細胞株、好ましくはHEK293 Flp−In T−Rex細胞株の誘導体である。本発明の好ましいヒト細胞株は、以下を発現する双方向に誘導可能なプロモーターを含むベクターの使用により構築される:
−内因性のhDIS3コピーを発現停止させることができるsh−microRNA
−hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞で見られる突然変異に対応する突然変異を有し、かつ、sh−miRNA活性に対する感受性をなくすために再コード化されたフラグメントを含む、外因性のhDIS3変異体。
−内因性のhDIS3コピーを発現停止させることができるsh−microRNA
−hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞で見られる突然変異に対応する突然変異を有し、かつ、sh−miRNA活性に対する感受性をなくすために再コード化されたフラグメントを含む、外因性のhDIS3変異体。
本発明はさらに本発明に係る改変された細胞株の構築方法と、こうした方法で使用されるベクターを提供する。
好ましい細胞株において、DIS3 RNBドメイン中の突然変異、SEQ ID NO:1に関して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異が存在する。
好ましい細胞株において、DIS3 RNBはSEQ ID NO:1の配列AA 427−843中の少なくとも1つの突然変異を含むhDIS3 RNBをコード化する。好ましい細胞株では、DIS3 PINドメインはSEQ ID NO:1のAA 1−217のhDIS3 PINである。
hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の好ましい選択方法では、方法は本発明の細胞株の使用を含む。
本発明はさらに、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための本発明の細胞株の使用に関する。
別の態様では、本発明は、hDIS3 PINドメイン活性の阻害剤に対する癌細胞の感受性のために、hDIS3突然変異を有する癌細胞を有する癌患者、とりわけ髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫の患者をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、その突然変異を有する、精製されたhDIS3タンパク質、そのフラグメント、または相同体を用いる生体外アッセイである。
別の態様では、本発明は、hDIS3 PINドメイン活性の阻害剤に対する癌細胞の感受性のために、hDIS3突然変異を有する細胞を有する癌患者、とりわけ、髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫の患者をスクリーニングする方法を提供し、該方法はDis3 RNBドメイン中の対応する突然変異を含む酵母菌株の使用を含んでいる。本発明はさらに癌患者のスクリーニングのこうした方法で使用される酵母菌株を提供する。こうした方法で使用される本発明に係る酵母菌株は、ヒト患者で見られる突然変異に対応する致命的でないDis3 RNBドメイン突然変異を有する。
また別の態様では、本発明は、hDIS3 PINドメイン活性の阻害剤に対する癌細胞の感受性のために、癌患者、とりわけ髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫の患者のスクリーニングのための、hDIS3 RNBドメイン中の突然変異を含む改変されたヒト細胞株の使用に関する方法を提供する。本発明はさらに癌患者のスクリーニングのためのこうした方法で使用される改変されたヒト細胞株を提供する。こうした方法で使用される改変されたヒト細胞株は、患者に見られる突然変異に対応する致命的ではないDis3 RNBドメイン突然変異を有する。
本明細書で議論されるように、本発明は、hDIS3リボヌクレアーゼのRNBドメイン中に突然変異を有する癌の処置のための治療薬としてもさらに使用することが可能な、hDIS3 PINドメイン阻害剤であるエキソソーム複合体阻害剤の新規な選択方法に関する。好ましくは、hDIS3のRNBドメインは、(SEQ ID NO:1の427−843)であり、hDIS3 PINドメインは(SEQ ID NO:1の1−217)である。hDIS3リボヌクレアーゼのRNBドメイン中の突然変異は、好ましくは、髄芽腫、急性骨髄性白血病、および、とりわけ多発性骨髄腫のような癌で生じる突然変異と同じである。hDIS3リボヌクレアーゼのRNBドメイン中の突然変異は、SEQ ID NO:1に関して、突然変異S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845Vから選択されるのが好ましい。本発明はさらに、本発明の方法によって選択される新規なhDIS3 PINドメイン阻害剤と、髄芽腫、急性骨髄性白血病、および、とりわけ多発性骨髄腫のようなhDIS3リボヌクレアーゼのRNBドメイン中に突然変異を有する癌の処置のための治療薬としてのその使用に関する。hDIS3リボヌクレアーゼのRNBドメイン中の突然変異は、好ましくは、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病のような癌で生じる突然変異と同じである。hDIS3リボヌクレアーゼのRNBドメイン中の突然変異は、SEQ ID NO:1に関して、突然変異S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845Vから選択される。hDIS3 PINドメイン阻害剤であるエキソソーム複合体組成物の治療薬としての使用は、RNBドメイン中に既に存在している突然変異と、新規なエキソソーム複合体阻害剤であるhDIS3 PINドメイン阻害剤によるhDIS3 PINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性の外部によって誘発された阻害との間の合成致死に基づく。
本明細書で使用されるように、用語「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質フラグメント」は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指すために区別なく使用される。ポリマーは線形でも分岐してもよく、修飾されたアミノ酸またはアミノ酸アナログを含むこともあり、アミノ酸以外の化学部分によって中断されることがある。こうした用語は、天然に、または介在によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは、標識成分または生物活性成分を含む共役などの他の操作または修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
本明細書で使用されるような「タンパク質ドメイン」は、タンパク質鎖の残りとは無関係に進化し、機能し、存在することができる、所定のタンパク質配列および構造の保存された部分である。それぞれのドメインはコンパクトな三次元構造を形成し、独立して安定しており、折り畳むことが可能であることが多い。
本明細書で使用されるような「DIS3 RNBドメイン」はDIS3リボヌクレアーゼ、好ましくは、エキソリボヌクレアーゼ分解活性を備える酵母菌(例えば、Saccharomyces cerevisiae)またはヒトの一部である。hDIS3 RNBドメインは、hDIS3タンパク質配列(SEQ ID NO:1のAA 427−843)中のアミノ酸427−843を含む。S.cerevisiae Dis3 RNBドメインは、酵母菌Dis3タンパク質配列(SEQ ID NO:2のAA 478−910)中にアミノ酸478−910を含む。
本明細書で使用されるような「DIS3 PINドメイン」は、DIS3リボヌクレアーゼ、好ましくは、エンドリボヌクレアーゼ分解(endoribonucleolytic)活性を含む、酵母菌(例えばSaccharomyces cerevisiae)またはヒトの一部である。ヒト細胞のDIS3 PINドメインは、DIS3タンパク質配列(SEQ ID NO:1のAA 1−127)のアミノ酸1−217を含む。S.cerevisiae Dis3 PINドメインは、酵母菌Dis3タンパク質配列(SEQ ID NO:2のAA 1−241)中にアミノ酸1−241を含む。
「単離した」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その天然環境で関連している材料をほとんど含んでいないものである。
用語「相同」または「同一性」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して、2つの配列間の相同の定量的尺度を示す。相同体は基準配列と比較して少なくとも50%の同一性を有する。好ましくは、相同体は基準配列に対して80、85、90、95、98、または99%の同一性を有している。「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」またはその変種は、上に定義されるようなヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性によって特徴づけられる配列を指す。ポリペプチドの配列類似性は配列同一性とも呼ばれ、一般に配列分析ソフトウェアを使用して測定される。本発明では、相同タンパク質配列は、限定されないが、(Saccharomyces cerevisiae)を含むヒト以外の種のポリペプチドのタンパク質配列を含んでいる。
本明細書で使用されるように、用語「等価な突然変異」は、ほぼ等価な配列、例えば、互いに異なる位置にあるが互いに対応している、上に定義されるような相同体中の突然変異を指す。
本明細書で使用される「合成致死」は、遺伝子事象の同時発生と薬剤(治療薬、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤、または薬物のような)の活性が生命体または細胞の死、あるいは選択的な成長の遅れ、とりわけ癌細胞の死をもたらす一種の相互作用を指すことを意図している。
「ベクター」は、生体外か生体内で、標的細胞に送達される異種のポリヌクレオチドを含む組換えDNAまたはRNAのプラスミドまたはウイルスを指す。
「組み換え」との用語は、自然には発生しない、あるいは、自然では見られない配置の別のポリヌクレオチドに関連付けられる、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
「癌」または「癌性の」という用語は、一般に無秩序な細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物の生理状態を指す、または記載したものである。「腫瘍」は1つ以上の癌細胞を含む。癌の例としては、限定されないが、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病が挙げられる。したがって、本明細書で使用される癌との用語によって、癌と腫瘍の両方を指すものと理解されたい。
「薬学的に許容可能な」との句は、物質または組成物が製剤を含む他の成分と化学的におよび/または毒物学的に適合しなければならないこと、および/または、哺乳動物がそれによって処置されることを示している。
本明細書で使用されるように、「処置する」または「処置」との用語は、治療処置と予防的または再発防止手段の両方を指し、目的は、癌の進行または拡大といった望ましくない生理学的変化または疾患を防ぐまたは遅らせることである。この発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、限定されないが、検知可能であっても検知可能でなくても、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した(つまり、悪化していない)状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および、緩解(部分的であれ全体的であれ)を含む。「処置」は、処置を受けない際の予想される生存期間と比較して、長期間の生存のことを意味し得ることもある。処置を必要とする者は、すでに疾患または障害を抱えている者だけでなく、疾患または障害を有する傾向にある者、あるいは疾患または障害を防がれる者を含んでいる。癌の場合では、処置は癌細胞の数を減らすこと、癌(腫瘍)サイズを縮小すること、癌細胞または腫瘍の増殖を阻害すること(つまり、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止させること)、および/または、癌に関連した症状の1つ以上をある程度まで和らげることであると理解されなければならない。
化合物に関する用語「誘導体」とは、いくつかの化学的または物理的なプロセスによって同様の化合物に由来する化合物であると理解されるものとする。
MMや他の癌でみられる変異のほとんどはhDIS3 RNBドメイン中の保存された残留物に影響を与え、このことはそれらがこの酵素のエキソヌクレアーゼ分解活性に対して影響を及ぼすことがあるという事実を指摘している(図1A)。これに反して、これらの突然変異のいずれもPINドメイン内にはなく、hDIS3の第2のエンドリボヌクレアーゼ分解活性にはまったく関与しない(図1A)。
本出願人らは、hDIS3S477R、hDIS3G766R、およびhDIS3R780K変異体のようにMM患者で観察されたhDIS3遺伝子中の複数の突然変異が、hDIS3タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ分解活性を著しく減少させることを発見した(図1のCと図2)。S477R、G766R、およびR780K突然変異と、5’−末端標識されたRNA基質(以下の実施例1で使用されるように)を有する、hDIS3の組み換え変異体を使用して行なわれた生化学的アッセイにより、全体的な活性が減少するだけでなく、MM患者で見られる突然変異が最終的な分解産物のパターン、酵素の処理能力、およびRNA分子の構造化した領域を分解する能力が変化したことが示されている。
これを支持して、本出願人らは、導入されたアミノ酸を含む内因性のDis3を発現する酵母菌株がMM患者で見られるもの(dis3−G833R(ヒトにおけるG766R)、dis3−R847K(ヒトにおけるR780K)、dis3−V568G(ヒトにおけるV504G)、およびdis3−A588P(ヒトにおけるA524P)など)の等価物に変化することをさらに実証しており、様々な強度の成長欠陥を示している。これはエキソソーム機能不全に典型的な分子表現型を伴う(図3A、3B)。さらに、酵母菌中のN末端基PINドメインエンドヌクレアーゼ活性のさらなる不活性化が、RNBドメイン中のMMのようなDis3突然変異で合成致死性であり、タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ分解活性に悪影響を及ぼすことが思いがけず示されている(図3D)。ヒトと酵母菌のエキソソームには違いがあるため、十分に保存された構造であるにもかかわらず、ヒトモデルも出願人によって構築された。MM患者で観察されたhDIS3突然変異を有するヒト細胞が野生型のhDIS3バージョンを発現するその相当物よりも成長が遅く、低い代謝活性を示すことが思いがけずに分かった(図9)。成長障害は3つのヒトRNAポリメラーゼすべてによって合成されたRNA分子の蓄積とよく相関する。5.8SrRNA前駆体と不安定な非コード化転写物−PROMPTの場合に、最も強力な蓄積が観察される(図6)。
hDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ分解活性の不活性化は、RNBドメイン内のMMに関連する突然変異で相乗的に作用し、成長異常の増大とPROMPTのさらなる蓄積を引き起こすこと分かった(図10)。この発見は、酵母菌の場合に得られる同様の結果とあわせて、PINドメインが、髄芽腫、急性骨髄性白血病、および、とりわけ多発性骨髄腫(MM)におけるhDIS3のRNBドメインで生じる変化などのhDIS3リボヌクレアーゼのRNBドメイン中の突然変異を好ましくは有する、改変したhDIS3活性を有する癌の治療で使用され得る新規な治療薬を設計するための非常に有効なターゲットであることが思いがけず実証した。
さらに、2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオン(AC1LAHYL)がhDIS3 PINドメイン活性の阻害剤として作用し、かつ、DIS3 MMに関連する突然変異を備えた細胞の成長を選択的に阻害することができることが出願人によって示された。
したがって、エキソソーム複合体阻害剤、好ましくはhDIS3 PINドメイン阻害剤、とりわけ、2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオン(AC1LAHYL)、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩は、hDIS3突然変異を有する、髄芽腫、急性骨髄性白血病、とりわけ多発性骨髄腫細胞のような癌細胞を特異的に標的とするために使用されてもよい。これらの癌中のhDIS3のRNBドメインの突然変異は、SEQ ID NO:1に関して、突然変異S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845Vから選択されるのが好ましい。
本明細書に記載されるRNA基質の生体外消化に基づいた生体外アッセイは、精製hDIS3タンパク質、そのフラグメント(単離したPINドメインの組み換えバージョンなど)または相同体と使用とあわせて、新規なhDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングする際にも使用されることがある。精製hDIS3タンパク質またはその単離させたPINドメインは、異種発現後に細菌、好ましくは大腸菌から得られたり精製されたりすることがある。好ましくは、単離hDIS3 PINドメインは、SEQ ID NO:1の1−217で開示された配列を含む。RNA基質は例えば5’フルオレセイン標識されたss17−(A)−34であってもよい。試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性の評価は、変性PAGEとフルオロイメージングなどの当業者に周知の任意の手段によって評価されてもよい。本方法を用いて発見された治療薬は、hDIS3突然変異、好ましくは多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病のようなhDIS3のRNBドメイン中の突然変異を有する癌の癌治療で使用されるのが好ましい。
本明細書で記載されるように、dis3−G833R(ヒトにおけるG766R)、dis3−R847K(ヒトにおけるR780K)、dis3−V568G(ヒトにおけるV504G)、dis3−A588P(ヒトにおけるA524P)のようなMM患者で見られるものと等価のアミノ酸変化を導入された内因性のDis3を発現する酵母菌株は、DIS3 PINドメイン阻害剤である新規な治療薬をスクリーニングする際にも適用されてもよい。こうした薬剤は、酵母菌増殖培地に加えられると前述の酵母菌株の成長を阻害する能力によって検知されることがある。エキソソーム機能はこうした酵母菌株について評価され、試験済みの薬剤の存在下と不在下で育てられた酵母菌と比較されることがある。エキソソーム機能の評価は、当業者に知られている任意の手段によって、例えば、全RNAの単離、さらには、5’−ETS、NEL025の原因不明の不安定な転写物、および、5.8SrRNA合成の7S前駆体(その分解中間物と同様に)などの典型的なエキソソーム基質に特異的なプローブを使用するノーザンブロット解析によって行われてもよい。この方法で発見された治療薬は、好ましくは、hDIS3突然変異、好ましくは多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病のようなhDIS3のRNBドメイン中の突然変異を有する癌の癌治療で使用されてもよい。
本明細書に記載される改変されたヒト細胞株アッセイは、新しいPINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングする際にも使用されることがある。例えば、MMのような突然変異を有するhDIS3変異体を生成するヒトモデルの安定した細胞株は、トランスフェクションのためのベクターを用いて得られることがあり、ベクターは、以下を発現する双方向誘導可能なプロモーターを含む:
−内因性のhDIS3コピーを発現停止させることができるsh−microRNA、および、
−突然変異を匿い、癌患者で見られる突然変異に対応し、および、sh−miRNA活性に対する感受性をなくさせるために再コードされたフラグメントを含んでいる、外因性のhDIS3変異体。
−内因性のhDIS3コピーを発現停止させることができるsh−microRNA、および、
−突然変異を匿い、癌患者で見られる突然変異に対応し、および、sh−miRNA活性に対する感受性をなくさせるために再コードされたフラグメントを含んでいる、外因性のhDIS3変異体。
ベクターはさらにeGFPのようなマーカー遺伝子を含むことがある。本発明のベクターはpMM9またはpMM10のヌクレオチド配列を含むことがある。
この種のベクターは所望のhDIS3変異体を発現するヒト細胞株の構築を可能にする。本発明のこうした改変されたヒト細胞株は当業者に知られている任意の手段によってエキソソーム機能の評価のために使用されてもよい。
こうした方法は、例えば、hDIS3の内因性のコピーを発現停止させるmiRNAの発現の誘発と、外因性のhDIS3変異体の発現の誘発の後に、細胞の細胞成長を評価する工程を含むこともある。これは顕微鏡検査法(好ましくは蛍光顕微鏡検査法)および/またはフローサイトメトリーによって行われることもある。さらに、これに、細胞の生存率評価(好ましくは細胞代謝活性に高感度なアッセイ、例えば、AlamarBlue(登録商標))を組み合わせることもある。エキソソーム機能の評価は、5.8S処理中間物、tRNA、RNAポリメラーゼIII転写物、およびPROMPTのようなエキソソーム基質を調べることを含んでもよい。これは、例えば、内因性のhDIS3コピーのsh−miRNAサイレンシングの発現の誘発と、外因性のhDIS3変異体の発現の同時誘発の後に、全RNAの単離によって達成されてもよい。これは低または高分解能のノーザンプロットを伴うこともある。単離RNAはDNAに逆転写されてもよく、PCRまたはRealTime PCRなどの方法を用いてさらに分析されてもよい。
こうした方法は、例えば、hDIS3の内因性のコピーを発現停止させるmiRNAの発現の誘発と、外因性のhDIS3変異体の発現の誘発の後に、細胞の細胞成長を評価する工程を含むこともある。これは顕微鏡検査法(好ましくは蛍光顕微鏡検査法)および/またはフローサイトメトリーによって行われることもある。さらに、これに、細胞の生存率評価(好ましくは細胞代謝活性に高感度なアッセイ、例えば、AlamarBlue(登録商標))を組み合わせることもある。エキソソーム機能の評価は、5.8S処理中間物、tRNA、RNAポリメラーゼIII転写物、およびPROMPTのようなエキソソーム基質を調べることを含んでもよい。これは、例えば、内因性のhDIS3コピーのsh−miRNAサイレンシングの発現の誘発と、外因性のhDIS3変異体の発現の同時誘発の後に、全RNAの単離によって達成されてもよい。これは低または高分解能のノーザンプロットを伴うこともある。単離RNAはDNAに逆転写されてもよく、PCRまたはRealTime PCRなどの方法を用いてさらに分析されてもよい。
特定の癌患者で見られる突然変異を有するRNA基質と精製されたhDIS3タンパク質に基づく本明細書で開示された生体外アッセイは、癌患者で見られる新しいhDIS3突然変異のエキソソーム機能に対する効果を評価するために、および、エキソソーム複合体阻害剤、好ましくはhDIS3 PINドメイン阻害剤を用いる将来の治療に対する特定の突然変異を備えた癌細胞の潜在的な感受性を評価するために使用されてもよい。特定の癌患者で見られる突然変異を有する精製されたhDIS3タンパク質は、野性型hDIS3配列の組み換え変異体として調製され、かつ、異種発現後に細菌、好ましくは大腸菌から精製されることもある。RNA基質は、例えば、UTPで均一に標識された生体外の転写RNA基質であってもよく、あるいは、別の例として、5’−末端標識されたRNA基質(以下の実施例1で使用されるように)であってもよい。
試験済みの薬剤の存在下と不在下で特定の癌患者で見られる突然変異を有するhDIS3タンパク質の活性の評価は、RNA基質の標識化に依存して、TLC、あるいは変性PAGEおよびホスホルイメージングなどの当業者に周知の任意の手段によって評価されてもよい。
癌患者で見られるものと選択的に等価なアミノ酸変化を導入された内因性のDis3を発現する酵母菌株に基づく本明細書に記載された酵母菌方法は、癌患者で見られる新規なhDIS3突然変異のエキソソーム機能に対する効果を評価するために、および、エキソソーム複合体阻害剤、好ましくはhDIS3 PINドメイン阻害剤を用いる将来の治療に対する特定の突然変異を備えた癌細胞の潜在的な感受性を評価するために、使用されてもよい。こうした突然変異体の酵母菌株中のエキソソーム機能の評価は、当業者に知られている任意の手段によって、例えば、全RNAの単離によって、さらに、5’−ETS、NEL025の原因不明の不安定な転写物、および、5.8SrRNA合成の7S前駆体(その分解中間物と同様に)などの典型的なエキソソーム基質に特異的なプローブを使用するノーザンブロット解析によって行われてもよい。
本発明のベクターは、特定の変異体についてhDIS3タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ分解活性を評価するべく患者の癌細胞で見られる特定の突然変異のために改変されたヒト細胞株を得るために、および、さらに、エキソソーム複合体阻害剤、好ましくはhDIS3 PINドメイン阻害剤を使用する治療に対する特定の突然変異を備えた癌細胞の潜在的な感受性を評価するためにも用いられてもよい。こうした改変されたヒト細胞株は、当業者に知られている任意の手段によってエキソソーム機能の評価に使用されてもよい。こうした方法は、例えば、hDIS3の内因性のコピーを発現停止させるmiRNAの発現の誘発と、外因性のhDIS3変異体の発現の誘発後に、細胞の細胞成長を評価する工程を含むことがある。これは顕微鏡検査法(好ましくは、蛍光顕微鏡検査法)および/またはフローサイトメトリーによって実行されてもよい。これに、細胞の生存率評価(好ましくは細胞代謝活性に高感度なアッセイ、例えば、AlamarBlue(登録商標))を組み合わせることもある。エキソソーム機能の評価は、5.8SrRNA処理中間物、tRNA、RNAポリメラーゼIII転写物、およびPROMPTのようなエキソソーム基質を検査することを含んでもよい。これは、例えば、内因性のhDIS3コピーのsh−miRNAサイレンシングの発現の誘発と、外因性のhDIS3変異体の発現の同時誘発の後に、全RNAの単離によって実行されてもよい。これは低または高分解能のノーザンプロットを伴うこともある。単離RNAはDNAに逆転写されてもよく、PCRまたはRealTime PCRなどの方法を用いてさらに分析されてもよい。
本発明とその利点が詳細に記載されてきたが、添付の請求項で定義されるような本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変化、置換、および変更を本明細書で行うことができることが理解されよう。
本発明は以下の実施例でさらに記載されるが、実施例は実例目的のためだけに与えられるもので、いかなる方法でも本発明を制限することを意図していない。
以下の例において、特に指定のない限り、標準的な材料と方法が、Sambrook J.らの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press」に記載されるように使用されるか、あるいは、メーカーの推奨する特定の材料と方法に従って行われる。
(菌種)
以下の大腸菌株が使用された:MH1(E. coli araD lacX74 galU hsdR hsdM rpsL)、dam−/dcm− (New England Biolabs; E. coli ara−14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dcm−6 hisG4 rfbD1 R(zgb210::Tn10) TetS endA1 rspL136 (StrR) dam13::Tn9 (CamR) xylA−5 mtl−1 thi−1 mcrB1 hsdR2), BL21−CodonPlus−RIL (Stratagene; E. coli B F− ompT hsdS(rB− mB−) dcm+ Tetr gal endA Hte [argU ileY leuW Camr]).
以下の大腸菌株が使用された:MH1(E. coli araD lacX74 galU hsdR hsdM rpsL)、dam−/dcm− (New England Biolabs; E. coli ara−14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dcm−6 hisG4 rfbD1 R(zgb210::Tn10) TetS endA1 rspL136 (StrR) dam13::Tn9 (CamR) xylA−5 mtl−1 thi−1 mcrB1 hsdR2), BL21−CodonPlus−RIL (Stratagene; E. coli B F− ompT hsdS(rB− mB−) dcm+ Tetr gal endA Hte [argU ileY leuW Camr]).
(酵母菌株)
野生型のDis3pと、タンパク質Aタグ−TEVプロテアーゼ開裂部位およびTRP選択マーカー(ADZY532;wtとも呼ばれる)との融合をコード化するS.cerevisiaeは、相同遺伝子組換えによって作成された、半数体のBMA64(MATa ade 2−1 his3−11,15 leu2−3,112 trp1* ura3−1 can1−100)の誘導体であった(Puigら、2001)。S.cerevisiae株dis3−D551N突然変異体は事前に構築された(Dziembowskiら、2007)。rrp6Δ株は、Euroscarfからのものであった(acc. no.: Y11777; BY4742 MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 YOR001w::kanMX4)。
野生型のDis3pと、タンパク質Aタグ−TEVプロテアーゼ開裂部位およびTRP選択マーカー(ADZY532;wtとも呼ばれる)との融合をコード化するS.cerevisiaeは、相同遺伝子組換えによって作成された、半数体のBMA64(MATa ade 2−1 his3−11,15 leu2−3,112 trp1* ura3−1 can1−100)の誘導体であった(Puigら、2001)。S.cerevisiae株dis3−D551N突然変異体は事前に構築された(Dziembowskiら、2007)。rrp6Δ株は、Euroscarfからのものであった(acc. no.: Y11777; BY4742 MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 YOR001w::kanMX4)。
S.cerevisiae株dis3−V568G、dis3−A588P、dis3−G833R、およびdis3−R847K突然変異体は実施例IIで指定されるように構築された。
S.cerevisiae株ADZY531は以下のように構築された。D171N突然変異は、生体内の組み換えによってBMA64野性型の半数体株中のDIS3遺伝子に導入された。最初に、D171N突然変異を有するDIS3遺伝子のフラグメントが、テンプレートとして、ADZKD106(CGGTCATATGAGAGTGTGTTGCG)(SEQ ID NO:3)とADZKD110プライマー(GAGAATTTGTATTTTCAGGGTGAGC)(SEQ ID NO:4)とpBS3278ベクター(Lebretonら、2008)を使用して増幅された。DIS3遺伝子の残りの部分は、タンパク質Aタグ−プロテアーゼTEV開裂部位とTRP選択マーカーとともに、テンプレートとして、ADZKD111(GCTCACCCTGAAAATACAAATTCTC)(SEQ ID NO:5)とADZKD107(AGTGGTTTAGTGGTAAAATCCAACGTTGCCATCGTTGGGCCCCCGGTTCG)(SEQ ID NO:6)プライマーと、ADZY532から単離させたゲノムDNAを用いて増幅された。最後の工程では、オーバーラップPCRは、ADZKD106とADZKD107プライマーと、両方のフラグメントを結合するために上記の反応で得られた両方の増幅産物を用いて行われた。最終的なPCR生成物を用いた半数体のBMA64株の形質転換により、株ADZY531が得られた。
すべての制限酵素とT4 DNAリガーゼはThermo Scientificのものであった。CIPはNew England Biolabsのものであった。すべてのDNA精製キット:DNAプラスミドミニ、DNAプラスミドMidi、およびGel−OutはA&A Biotechnologyからのものであった。T4 PNKはNew England Biolabsからのものであった。PCR反応はPhusion DNAポリメラーゼ(Thermo Scientific)を用いて行われた。
表6では、以下の実施例で得られるhDIS3 RNBドメイン突然変異、酵母菌株または細胞株中のそれの等価物、そのような突然変異体に関して観察された効果が集められている。
実施例I
MM関連突然変異を有する幾つかのhDIS3遺伝子バージョンによってコード化されたタンパク質は、異なるRNA基質の分解において様々な欠損を示す。
オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびクローニング。
大腸菌BL21−CodonPlus−RIL株を使用した。テンプレートとして(野生型hDIS3;Tomecki et al.2010bをコード化する)pHEX1構築物を使用して、表1に示されるオリゴヌクレオチド対との部位特異的変異誘発によって、(大腸菌中の様々なhDIS3バージョンの異種発現のための)プラスミドpMM1、pMM2、pMM3、pMM4、pMM5およびpMM6を生成した。
MM関連突然変異を有する幾つかのhDIS3遺伝子バージョンによってコード化されたタンパク質は、異なるRNA基質の分解において様々な欠損を示す。
オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびクローニング。
大腸菌BL21−CodonPlus−RIL株を使用した。テンプレートとして(野生型hDIS3;Tomecki et al.2010bをコード化する)pHEX1構築物を使用して、表1に示されるオリゴヌクレオチド対との部位特異的変異誘発によって、(大腸菌中の様々なhDIS3バージョンの異種発現のための)プラスミドpMM1、pMM2、pMM3、pMM4、pMM5およびpMM6を生成した。
PstI、MlsI、XmaJI、BshTI、Psp1406IおよびEco147Iの制限酵素での消化、およびプライマーを使用するhDIS3挿入物の配列決定によって、それぞれ、S477R、V504G、A524P、G766R、R780KおよびI845Vの突然変異の存在を確認した(表2)。
D487N突然変異を有するhDIS3をコード化する、pHEX8構築物 − RNBドメインの純種の触媒性の突然変異体(Tomecki et al.2010b)も比較に使用した。
hDIS3タンパク質の異種発現および精製。
異なるhDIS3バージョンの精製のために、大腸菌BL21−CodonPlus−RIL株(Stratagene)を、適切なプラスミド(pHEX1、pHEX8、pMM1、pMM2、pMM3、pMM4、pMM5、pMM6)で形質転換した。形質転換体の成長および更なるタンパク質の分離を、標準手続に従って行った。タンパク質を、Superdex S−200 10/300 GLカラム(GE Healthcare)上のニッケル親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過によって天然の抽出液から精製した。すべての工程を、AEKTAxpressの装置を使用して自動的に行った。タンパク質の純度を、SDS−PAGEゲル中の電気泳動によって評価した。標準としてBSAの連続希釈液を使用してCoomassie Brilliant Blue R−250で染色したゲルの濃度測定分析によって、タンパク質量を推測した。MM患者に見られる野生型の、触媒性の突然変異体および変異体に対応する得られた精製したhDIS3変異体を、生体外の生化学アッセイにおいてさらに使用した。
異なるhDIS3バージョンの精製のために、大腸菌BL21−CodonPlus−RIL株(Stratagene)を、適切なプラスミド(pHEX1、pHEX8、pMM1、pMM2、pMM3、pMM4、pMM5、pMM6)で形質転換した。形質転換体の成長および更なるタンパク質の分離を、標準手続に従って行った。タンパク質を、Superdex S−200 10/300 GLカラム(GE Healthcare)上のニッケル親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過によって天然の抽出液から精製した。すべての工程を、AEKTAxpressの装置を使用して自動的に行った。タンパク質の純度を、SDS−PAGEゲル中の電気泳動によって評価した。標準としてBSAの連続希釈液を使用してCoomassie Brilliant Blue R−250で染色したゲルの濃度測定分析によって、タンパク質量を推測した。MM患者に見られる野生型の、触媒性の突然変異体および変異体に対応する得られた精製したhDIS3変異体を、生体外の生化学アッセイにおいてさらに使用した。
生体外の生化学アッセイの基質の調製。
オリゴリボヌクレオチド:
ss17−A14, r(CCCCACCACCAUCACUUAAAAAAAAAAAAAA) (SEQ ID NO: 26), ss44, r(CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA) (SEQ ID NO: 27)およびcompl, r(AAGUGAUGGUGGUGGGG) (SEQ ID NO: 28)を、電気泳動、切除および溶出によって精製した。基質の5’−末端標識化を、T4 PNK(NEB)および[γ−32P]ATP(GE Healthcare)で行った。すべての標識化した一本鎖RNA基質を、電気泳動に従ってさらに精製した。ds17−(A)14の部分的RNA二本鎖を、1:1.2モル比で非放射性の一本鎖のオリゴリボヌクレオチドss17−(A)14とcomplを混合することによって調製し、標準状態で放射性標識したss17−(A)14オリゴを加えた。[α−32P]UTPおよびT7 RNAポリメラーゼ(NEB)の存在下で、テンプレートとしてSalIで消化されたpLsm1プラスミドを使用して行われた生体外の転写によって、内部標識したRNAを得た。放射性標識した転写物を、抽出し、Sephadex G−50 (Bio−Rad)を備えたSpin Modules (MP Biomedicals)において遠心分離によってさらに精製した。
オリゴリボヌクレオチド:
ss17−A14, r(CCCCACCACCAUCACUUAAAAAAAAAAAAAA) (SEQ ID NO: 26), ss44, r(CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA) (SEQ ID NO: 27)およびcompl, r(AAGUGAUGGUGGUGGGG) (SEQ ID NO: 28)を、電気泳動、切除および溶出によって精製した。基質の5’−末端標識化を、T4 PNK(NEB)および[γ−32P]ATP(GE Healthcare)で行った。すべての標識化した一本鎖RNA基質を、電気泳動に従ってさらに精製した。ds17−(A)14の部分的RNA二本鎖を、1:1.2モル比で非放射性の一本鎖のオリゴリボヌクレオチドss17−(A)14とcomplを混合することによって調製し、標準状態で放射性標識したss17−(A)14オリゴを加えた。[α−32P]UTPおよびT7 RNAポリメラーゼ(NEB)の存在下で、テンプレートとしてSalIで消化されたpLsm1プラスミドを使用して行われた生体外の転写によって、内部標識したRNAを得た。放射性標識した転写物を、抽出し、Sephadex G−50 (Bio−Rad)を備えたSpin Modules (MP Biomedicals)において遠心分離によってさらに精製した。
Prof. Joanna Kufel (University of Warsaw)によって快く提供された、内部標識したRNAを調製するために使用される、pLsm1プラスミドは、A. thaliana Lsm1タンパク質に対応するオープン・リーディング・フレームの挿入物を包含するヌクレオチド(insert encompassing nucleotides)1−387を備えるpGEM−T Easyである。
エキソリボヌクレアーゼアッセイ。
hDIS3 エキソリボヌクレアーゼ分解活性の生体外の酵素アッセイを、10mMのTris−HCl,pH8.0;75mmのNaCl;1mMの2−メルカプトエタノール,100μMのMgCl2中で行った。タンパク濃度は0.1μMであったが、一方で、基質濃度は、二本鎖RNA分子および非構造化(unstructured)RNA分子に対して、それぞれ、0.2μMまたは2μMであった。ゲルベースの分析に関して、反応を、示された時間の間37℃で実行し、その後、ホルムアミド充填色素(formamide loading dye)によって終了した。反応生成物を、変性の20%のポリアクリルアミド、8Mの尿素、1xTBEのゲル中に溶解した。TLCベースの実験の場合には、サンプルを、分割量の反応混合物と0.5MのEDTA、1μlとを混合することによって収集し、続いて、マーカーとして非放射性のUMPを使用して、0.5MのLiCl/1Mのギ酸中のPEIセルロースプレート(Schleicher & Schuell)上にそれらを流す(running)ことによって分析した。両方のタイプの分析に関して、反応生成物を、FUJI PhosphorImagerを使用して視覚化した。
hDIS3 エキソリボヌクレアーゼ分解活性の生体外の酵素アッセイを、10mMのTris−HCl,pH8.0;75mmのNaCl;1mMの2−メルカプトエタノール,100μMのMgCl2中で行った。タンパク濃度は0.1μMであったが、一方で、基質濃度は、二本鎖RNA分子および非構造化(unstructured)RNA分子に対して、それぞれ、0.2μMまたは2μMであった。ゲルベースの分析に関して、反応を、示された時間の間37℃で実行し、その後、ホルムアミド充填色素(formamide loading dye)によって終了した。反応生成物を、変性の20%のポリアクリルアミド、8Mの尿素、1xTBEのゲル中に溶解した。TLCベースの実験の場合には、サンプルを、分割量の反応混合物と0.5MのEDTA、1μlとを混合することによって収集し、続いて、マーカーとして非放射性のUMPを使用して、0.5MのLiCl/1Mのギ酸中のPEIセルロースプレート(Schleicher & Schuell)上にそれらを流す(running)ことによって分析した。両方のタイプの分析に関して、反応生成物を、FUJI PhosphorImagerを使用して視覚化した。
エキソヌクレアーゼ分解活性を分析するために、hDIS3タンパク質の組み換えバージョン(野生型またはMMで検出された異なる突然変異を有するもののいずれか)を、異種過剰発現に従って大腸菌から精製した。hDIS3S477R、hDIS3V504G、hDIS3G766R、hDIS3R780KおよびhDIS3I845Vの突然変異タンパク質は、うまく精製された(図1のB)が、hDIS3A524Pの組み換えバージョンを得ることが困難であると証明され、これは、利用された発現条件にかかわらず不溶性であった。平行して、2つの対照hDIS3変異体を精製した:強力なエキソリボヌクレアーゼ分解活性を以前に示した、hDIS3WT、およびhDIS3D487N − そのアミドで置換されたRNBドメインの活性部位においてマグネシウムを調整するアスパラギン酸残基の1つを有する触媒不活性突然変異体(Tomecki et al. 2010b;hDIS3D487NがhDIS3RNB MUTとして言及される、補足の図S6を参照)。上に言及されたタンパク質バージョンはすべて、類似した効率とともに得られ、すべての場合において、比較可能な程度の純度を達成することが可能であった − 質量分析によって特定された唯一の顕著な汚染物質は、細菌性のDnaKのシャペロンであって、そのレベルは、この特定の変異体のより低い溶解性が恐らく原因で(図1のB)、hDIS3S477Rに対してわずかに増加した。
その後、事前の生化学的実験を、すべての精製したhDIS3変異体およびUTPで一様に標識化された生体外で転写したRNA基質を使用して行った。標準的なTLC方法によるそのようなRNA基質の分解の時間経過ベースの分析によって、エキソリボヌクレアーゼ分解活性に対する個々の突然変異の影響を一時的に評価することが可能となった。タンパク質の分解の可能性が、hDIS3V504GおよびhDIS3I845Vの場合にはほぼ不変であった(すなわち、RNA分解の速度が、hDIS3WTと比較可能であった)一方で、hDIS3S477R、hDIS3G766RおよびhDIS3R780Kの変異体に対する活性が深刻に減少した(図1のC)ことが留意された。hDIS3R780Kに関して、表現型は、RNBドメインの純種の触媒性の突然変異体−hDIS3D487Nに対して観察されたものに非常によく類似していた(図1のC)。
より質的に野生型のタンパク質に関連する異なるhDIS3突然変異によって引き起こされたRNA分解の欠損を評価するために、生化学アッセイを、様々な5’−末端標識化オリゴリボヌクレオチド基質、すなわち、1)17−merの包括的な(generic)配列に続いて、14−ヌクレオチド長のオリゴ(A)テイル(5’P*−ss17−(A)14)から構成される、一本鎖RNAオリゴヌクレオチド;2)44−merの、欠乏(lacking)オリゴ(A)伸長(5’P*−ss44)および3)17−ヌクレオチド二本鎖に続いて、14−nt長のオリゴ(A)テイル(5’P*−ds17−(A)14)を含有している構造化基質、の上で行い、崩壊生成物を、変性のポリアクリルアミドゲルにおいて分析した(図2)。hDIS3I845VおよびhDIS3V504Gの突然変異体の場合には、最終分解生成物のパターンが、すべての基質に対するhDIS3WT対照について全く同じであったことが認識された(図2A−C)。しかしながら、分解速度は、hDIS3WTおよびhDIS3I845Vの対照物と比較したときに、hDIS3V504G変異体に対してわずかによりゆっくりであった。これに反して、残りの突然変異は、hDIS3機能に対して明白な影響があった。最も顕著だったのは、R780Kであり、これは、触媒性のD487N突然変異に類似した、両方の一本鎖基質のエキソヌクレアーゼ分解の実質的に完全な阻害につながり(図2A、B)、これは、図1のCに示される、TLC分析の結果をうまく確証していた。一方、hDIS3S477RおよびhDIS3G766Rの変異体は、hDIS3WTと比較して、最終分解生成物の比率の変化に存在する、5’P*−ss17−(A)14基質上のわずかにより軽度の欠損を示し:hDIS3S477Rについては、4−nt長の崩壊生成物のレベルは減少し、一方でhDIS3G766Rの場合には、5−nt長の分解生成物の量の減少を犠牲にして、それは増加した(図2A)。その上に、hDIS3G766R突然変異体は、処理能力を失ったようであり、5’P*−ss44基質の存在下で離散性になった(図2B)。重要なことに、部分的に二本鎖の5’P*−ds17−(A)14の基質の場合には、hDIS3S477R、hDIS3G766RおよびhDIS3R780Kは、一本鎖伸長を消化するように見えたが、一方で、それらはすべて、hDIS3D487Nの触媒性の突然変異体の場合のように、たとえ部分的な二本鎖の分解が完全には止められなくても、基質における二次構造との遭遇で停止した(この効果は、R780K突然変異を有するhDIS3変異体に対して顕著であった)(図2C)。
結論として、異なる技術を利用して及び様々なRNA基質を使用して実行された生化学アッセイの結果は、以下のアミノ酸置換基:S477R、G766RおよびR780KにつながるhDIS3遺伝子中の突然変異が、hDIS3エキソリボヌクレアーゼ分解活性の著しい異常を引き起こす一方で、V504GおよびI845Vの場合には、効果が、あったとしても、よりわずかなものであることを強く示した。
実施例II
MM患者に見られる突然変異に対応する酵母DIS3遺伝子の突然変異は、細胞成長の欠損および分子表現型を引き起こし、エキソソーム機能の障害につながる。
S.cerevisiae株(酵母菌株)および突然変異体の構成。
dis3−V568G、dis3−A588P、dis3−G833Rおよびdis3−R847Kの突然変異体(対応するヒトのアミノ酸変化についての図1のAを参照)を、以下のように構築した。二倍体BMA64株を、それぞれの突然変異を有するDIS3遺伝子、タグ(TEVプロテアーゼ切断部位および配列コード化プロテインAを包含する)およびTRP選択マーカーを含有しているDNAフラグメントで形質転換した。最初に、DIS3遺伝子の2部位(parts)を、2つの独立した増幅において生成した:Dis3pコード化配列の上流に位置する配列に相補的な、ADZKD106フォワードプライマーおよび突然変異した部位を包含する適切なリバースプライマーADZKD134、ADZKD136、ADZKD138、ADZKD140を使用する5’;および突然変異した部位を包含する適切なフォワードプライマーADZKD133、ADZKD135、ADZKD137、ADZKD139、およびTRP選択マーカーの下流の配列に相補的なADZKD107リバースプライマーを用いる3’。プライマー、それらの配列および突然変異体の構成は、以下の表3に明記される。
MM患者に見られる突然変異に対応する酵母DIS3遺伝子の突然変異は、細胞成長の欠損および分子表現型を引き起こし、エキソソーム機能の障害につながる。
S.cerevisiae株(酵母菌株)および突然変異体の構成。
dis3−V568G、dis3−A588P、dis3−G833Rおよびdis3−R847Kの突然変異体(対応するヒトのアミノ酸変化についての図1のAを参照)を、以下のように構築した。二倍体BMA64株を、それぞれの突然変異を有するDIS3遺伝子、タグ(TEVプロテアーゼ切断部位および配列コード化プロテインAを包含する)およびTRP選択マーカーを含有しているDNAフラグメントで形質転換した。最初に、DIS3遺伝子の2部位(parts)を、2つの独立した増幅において生成した:Dis3pコード化配列の上流に位置する配列に相補的な、ADZKD106フォワードプライマーおよび突然変異した部位を包含する適切なリバースプライマーADZKD134、ADZKD136、ADZKD138、ADZKD140を使用する5’;および突然変異した部位を包含する適切なフォワードプライマーADZKD133、ADZKD135、ADZKD137、ADZKD139、およびTRP選択マーカーの下流の配列に相補的なADZKD107リバースプライマーを用いる3’。プライマー、それらの配列および突然変異体の構成は、以下の表3に明記される。
ADZY532(wt)株から単離された総ゲノムDNAは、すべての前述の増幅におけるテンプレートとして作用した。所望の突然変異を有する全長アンプリコンを、重複PCR(ここで、5’および3’の増幅の生成物はテンプレートとして作用した)におけるADZKD106およびADZKD107のプライマーとともに得て、続いて、形質転換に使用した。選択した形質転換体を、胞子形成し、胞子を切開した。dis3−V568G突然変異を有する胞子は、株ADZY679、dis3−A588P−ADZY681、dis3−G833R−ADZY783およびdis3−R847K−株ADZY685を与えた。V568G、A588P、G833RおよびR847Kの突然変異の存在は、ADZKD145(GGATGATGTTAATTGCTTGG)(SEQ ID NO.37)−ADZKD146(TTGAAACTCTACCACCGACC)(SEQ ID NO.38)のプライマー対を使用するゲノムDNAフラグメントの増幅に続いて、それぞれ、MlsI、ApaI、BshTIおよびPsp1406Iの制限酵素でのPCR生成物の消化によって確認された。最終的に、ORF配列の精度は、プライマーを使用して、得られたPCR生成物の配列決定によって確証された:
RTADZ−9:GAGATACATTGTGAGGGACC(SEQ ID NO.39)、
RTADZ−27:ATGTCAGTTCCCGCTATCGC(SEQ ID NO.40)、
ADZKD151:CGTCGTTCTTGTTACCAACG(SEQ ID NO.41)、
ADZKD152:CACCGTGATTTCCGACAAGC(SEQ ID NO.42)、
ADZ1601:GCCCGCAGAAGGCCACGATTGG(SEQ ID NO.43)、
RTADZ−68:AGGGCTCTCTTGAAATTGTCTG(SEQ ID No:44)、および
ADZ1603:GACAGGTGTGTGGATCCCGAAG(SEQ ID No.45)。
rrp6Δdis3−G833Rおよびrrp6Δdis3−R847K株を、ADZY783またはADZY685のいずれかでのrrp6Δ株の交雑を介して得た。胞子を切開し、二重突然変異体を選択した。DIS3 G833RまたはR847Kの突然変異のいずれかと一緒にRRP6欠失を有する胞子は、それぞれ、株ADZY732およびADZY742を与えた。
RTADZ−9:GAGATACATTGTGAGGGACC(SEQ ID NO.39)、
RTADZ−27:ATGTCAGTTCCCGCTATCGC(SEQ ID NO.40)、
ADZKD151:CGTCGTTCTTGTTACCAACG(SEQ ID NO.41)、
ADZKD152:CACCGTGATTTCCGACAAGC(SEQ ID NO.42)、
ADZ1601:GCCCGCAGAAGGCCACGATTGG(SEQ ID NO.43)、
RTADZ−68:AGGGCTCTCTTGAAATTGTCTG(SEQ ID No:44)、および
ADZ1603:GACAGGTGTGTGGATCCCGAAG(SEQ ID No.45)。
rrp6Δdis3−G833Rおよびrrp6Δdis3−R847K株を、ADZY783またはADZY685のいずれかでのrrp6Δ株の交雑を介して得た。胞子を切開し、二重突然変異体を選択した。DIS3 G833RまたはR847Kの突然変異のいずれかと一緒にRRP6欠失を有する胞子は、それぞれ、株ADZY732およびADZY742を与えた。
Dis3−dis3−D171N G833R−pA/DIS3 WT(ADZY713)およびdis3−D171N R847K−pA/DIS3 WT(ADZY716)のPINおよびRNBのドメインの両方における突然変異を有する二倍体株を、以下のように得た。
二倍体BMA64株を、D171N突然変異(PINドメインにおける突然変異)、G833RまたはR847K突然変異(RNBドメインにおける突然変異)をそれぞれ有するDIS3遺伝子、タグ(TEVプロテアーゼ切断部位および配列コード化プロテインAを包含する)およびTRP選択マーカーを含有しているDNAフラグメントで形質転換した。最初に、DIS3遺伝子の2部位を増幅した:テンプレートとしてADZKD106−ADZKD141(CCTAAATAGAGCATTCAACGGTGACCAGG)(SEQ ID No.46)プライマー対およびADZY531株から単離された総ゲノムDNA(DIS3遺伝子座はPINドメインにおいてD171N突然変異を含有している)を使用する、5’;およびテンプレートとしてADZKD142(CCTGGTCACCGTTGAATGCTCTATTTAGG)(SEQ ID No.47)−ADZKD107プライマー対を用い、それぞれ、ADZY783またはADZY685(DIS3遺伝子座はG833RまたはR847Kの突然変異を含有している)から単離された総ゲノムDNAを利用する、3’。所望の突然変異を有する全長アンプリコンを、重複PCR(ここで、5’および3’の増幅の生成物はテンプレートとして作用した)におけるADZKD106およびADZKD107のプライマーとともに得て、続いて、形質転換に使用した。選択した形質転換体は、所望の菌株を与えた。
二倍体BMA64株を、D171N突然変異(PINドメインにおける突然変異)、G833RまたはR847K突然変異(RNBドメインにおける突然変異)をそれぞれ有するDIS3遺伝子、タグ(TEVプロテアーゼ切断部位および配列コード化プロテインAを包含する)およびTRP選択マーカーを含有しているDNAフラグメントで形質転換した。最初に、DIS3遺伝子の2部位を増幅した:テンプレートとしてADZKD106−ADZKD141(CCTAAATAGAGCATTCAACGGTGACCAGG)(SEQ ID No.46)プライマー対およびADZY531株から単離された総ゲノムDNA(DIS3遺伝子座はPINドメインにおいてD171N突然変異を含有している)を使用する、5’;およびテンプレートとしてADZKD142(CCTGGTCACCGTTGAATGCTCTATTTAGG)(SEQ ID No.47)−ADZKD107プライマー対を用い、それぞれ、ADZY783またはADZY685(DIS3遺伝子座はG833RまたはR847Kの突然変異を含有している)から単離された総ゲノムDNAを利用する、3’。所望の突然変異を有する全長アンプリコンを、重複PCR(ここで、5’および3’の増幅の生成物はテンプレートとして作用した)におけるADZKD106およびADZKD107のプライマーとともに得て、続いて、形質転換に使用した。選択した形質転換体は、所望の菌株を与えた。
酵母成長アッセイ。
YPDプレート上に連続希釈液を入れる前にOD600が0.2に達するまで、上に記載された酵母菌株を、一晩30℃で完全なYPD培地中で成長させた。細胞成長を、25℃、30℃または37℃での60時間のインキュベーション後に分析した。Dis3のPINおよびRNBのドメインの両方において突然変異を有する菌株に対する生存率の分析を、ADZY713およびADZY716の二倍体株の胞子形成に続いて、四分子切開によって実行した。
YPDプレート上に連続希釈液を入れる前にOD600が0.2に達するまで、上に記載された酵母菌株を、一晩30℃で完全なYPD培地中で成長させた。細胞成長を、25℃、30℃または37℃での60時間のインキュベーション後に分析した。Dis3のPINおよびRNBのドメインの両方において突然変異を有する菌株に対する生存率の分析を、ADZY713およびADZY716の二倍体株の胞子形成に続いて、四分子切開によって実行した。
RNA単離およびノーザンブロット解析。
RNAを、標準的なホット・アシッド・フェノール手順(hot acid phenol procedure)を使用して酵母培養液から単離した。ノーザンブロットを、標準手続に従って処理し、42℃(5’−標識化オリゴヌクレオチドプローブ)、または63℃(ランダムプライミングによって標識化されたDNAフラグメント)のいずれかで調べた。
RNAを、標準的なホット・アシッド・フェノール手順(hot acid phenol procedure)を使用して酵母培養液から単離した。ノーザンブロットを、標準手続に従って処理し、42℃(5’−標識化オリゴヌクレオチドプローブ)、または63℃(ランダムプライミングによって標識化されたDNAフラグメント)のいずれかで調べた。
酵母5’−ETSおよびNEL025 CUTの検出のために、Lebreton et al.2008に記載されるような、α−32P[dATP]およびDecaLabel DNA Labeling Kit(ThermoScientific)でのランダムプライミングによって、PCRプローブを標識化した。他の転写物については、32P−標識化オリゴヌクレオチドを、プローブとして使用した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は以下であった:酵母7Sアンチセンスオリゴ−GGCCAGCAATTTCAAGTTA(SEQ ID No.48)、酵母5.8Sアンチセンスのオリゴ−GCGTTGTTCATCGATGC(SEQ ID No.49)、酵母5Sアンチセンスオリゴ−CTACTCGGTCAGGCTC(SEQ ID No.50)。ハイブリダイゼーション後、膜を、洗浄し、PhosphorImagerスクリーン(FujiFilm)にさらした後に、FLA 7000スキャナー(FujiFilm)を使用してスキャンした。
ウェスタンブロッティング
酵母培養液からのタンパク質サンプルを、10−12%のSDS−PAGEゲルに流し、Protranニトロセルロース膜(Whatman)上に固定した。Protein Aタグを、ウサギのPeroxidase−Anti−Peroxidase Soluble Complex抗体(Sigma−Aldrich; P1291)(1:3000)の使用によって直接検出した。最終的に、ブロットを、Immun−Star(商標) WesternC(商標) キット(Bio−Rad)およびCL−XPosure(商標) フィルム(Thermo Scientific)を使用して、Curix 60マシーン(AGFA)において発達させた。
酵母培養液からのタンパク質サンプルを、10−12%のSDS−PAGEゲルに流し、Protranニトロセルロース膜(Whatman)上に固定した。Protein Aタグを、ウサギのPeroxidase−Anti−Peroxidase Soluble Complex抗体(Sigma−Aldrich; P1291)(1:3000)の使用によって直接検出した。最終的に、ブロットを、Immun−Star(商標) WesternC(商標) キット(Bio−Rad)およびCL−XPosure(商標) フィルム(Thermo Scientific)を使用して、Curix 60マシーン(AGFA)において発達させた。
hDIS3 MM突然変異の機能解析を、導入された同等のアミノ酸変化で内因性のDis3を発現する酵母菌株の構築とともに始めた。dis3−S541R(ヒトにおけるS477R)を除く突然変異体のすべてを生成することが可能であった。最初に、塩基性成長試験を行い、dis3−G833R(ヒトにおけるG766R)およびdis3−R847K(ヒトにおけるR780K)の株が、生理的温度であっても、野生型の対照と比較して、強い成長遅延の表現型を示すことが認識された(図3A)。dis3−G833Rの場合には、突然変異体の成長欠陥は、dis3−D551N(ヒトにおけるD487N)の触媒性の突然変異体に対して観察されたものよりさらに強力であった。一方、2つの残りの突然変異株−dis3−V568G(ヒトにおけるV504G)およびdis3−A588P(ヒトにおけるA524P)は、30℃で正常には成長したが、それらの成長が高温で実質的には完全に止められたため、それらは極端に温度感受性であるように見えた(図3A)。酵母DIS3突然変異体の成長試験の結果は、MM患者で変化されたアミノ酸がエキソソーム機能にとって重要であることの第1の生体内でのサポートを提供した。その上、前の生体外での分析で上に観察されるように、V568(hDIS3中のV504)の置換は、G833(hDIS3中のG766)またはR847(hDIS3中のR780)の変化よりも軽度の欠損につながった(図3A)。また、rrp6ΔバックグラウンドにおけるS.cerevisiae中の2つのG833およびR847の突然変異の表現型を試験し、そのような組み合わせが、結果として、わずかに相乗的な成長阻害をもたらすことがわかった(図3A)。
その後、酵母中のDIS3遺伝子突然変異の分子の効果を、典型的なエキソソーム基質:リボソームRNAプロセシングの5’−ETS副産物、NEL025 CUT(潜在性の不安定転写物(cryptic unstable transcript))および5.8S rRNA成熟経路における7S前駆体、を検出するプローブを使用して、突然変異体および対照株から単離された総RNAサンプルに関するノーザンブロット解析によって試験した。すべてのDIS3突然変異(MM患者に見られた突然変異に対応する純種のD551N触媒性の1つの突然変異および4つの突然変異)が、野生型菌株中のそれらの量に関して全長5’−ETSおよび7S rRNAの比較可能な蓄積を引き起こすことが観察された(図3B)。一方、NEL025 CUTと同様に、7Sおよび5’−ETS分解中間物のレベルを慎重に観察すると、DIS3突然変異は、2つのクラスに分類され得、その1つは、V568GおよびA588Pの置換基によって表わされる、別のものよりもすべての前述の種の重要な蓄積につながった、D551N、G833RおよびR847Kのアミノ酸変化を包含する(図3B)。また、これは以下の事実と一致している:1)それぞれの突然変異体hDIS3タンパク質は、生体外の生化学アッセイ中の異なる表現型を示した(図2);2)突然変異体の酵母菌株は、可変的な成長欠陥を実証した(図3A)。
菌株の生成中に利用されたすべての挿入物の3’−末端で導入されたプロテインAタグに対するウェスタンブロットによって確証されるように、観察された表現型は、それぞれのDIS3突然変異体の発現の欠如が原因ではない(図3C)。
DIS3 G833RまたはR847K突然変異をRRP6遺伝子の欠失と組み合わせることによって、分析された分子表現型(恐らくdis3−G833Rの単一の突然変異体と比較したrrp6Δ dis3−G833R中のNEL025 CUTのさらなる蓄積は除く)が著しく増強されるようには見えなかった(図3B)。一方、D171NのバックグラウンドにおいてG833RまたはR847K突然変異を有するであろう菌株は単離されず(図3D)、D171Nは、PINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を止めると以前に示された(Lebreton et al. 2008)。それは、ヒトにおけるMM関連突然変異に類似したRNBドメイン突然変異が、純種の触媒性のRNBドメイン突然変異、D487Nに関して観察されたものと同様に(Lebreton et al. 2008)、エンドヌクレアーゼの同時の不活性化で合成的に致死的な酵母にあることを示す。
要するに、酵母モデルを使用して行われた実験は、特に多発性骨髄腫の患者で観察された突然変異と同等であるRNBドメインにおける突然変異において、hDIS3活性が変化させられるこれらの癌と類似したDis3位置でアミノ酸を変化させることが、その生理的基質をエキソヌクレアーゼによって分解する(exonucleolytically degrade)エキソソームの能力の障害を介してS.cerevisiaeの成長を阻害することを示した。
実施例III
MM関連hDIS3突然変異は、結果として、ヒトの細胞モデル中の異なるRNA種の蓄積をもたらす。
内因性のhDIS3 mRNAに対するC末端およびsh−miRNAsでのFLAGエピトープでの再コード化されたhDIS3の異なるバージョンの同時発現のためのベクターの生成に関する多段階のクローニング手順は、以下であった。最初に、hDIS3のWT、RNB MUT(D487N)、G766RおよびR780Kの変異体をコード化するオープン・リーディング・フレームを包含する挿入物を、D3FMluI:(ATATACGCGTGCCGCCACCATGCTCAAGTCCAAGACGTTC)(SEQ ID No.51)およびD3RB120I:(GCGCGGGCCCTTACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAATCTAT ATCTTTTCCAAGCTTCATCTTCT)(SEQ ID No.52)プライマー対によって、およびそれぞれのテンプレートとしてpHEX1、pHEX8、pMM4またはpMM5の構築物を使用して、増幅した。次に、挿入物を、BI−16ベクターのMluIおよびBsp120Iの部位へとクローン化し(Sammarco and Grabczyk, 2005)、それ故、その中に存在するhRLUC ORFを、大腸菌MH1株の使用と置き換えた。このように、[BI−16’]hDIS3 WT、[BI−16’]hDIS3 RNB MUT、[BI−16’]hDIS3 G766Rおよび[BI−16’]hDIS3 R780Kの一過性ベクターを構築した。hDIS3挿入物を以下のように配列決定した。
MM関連hDIS3突然変異は、結果として、ヒトの細胞モデル中の異なるRNA種の蓄積をもたらす。
内因性のhDIS3 mRNAに対するC末端およびsh−miRNAsでのFLAGエピトープでの再コード化されたhDIS3の異なるバージョンの同時発現のためのベクターの生成に関する多段階のクローニング手順は、以下であった。最初に、hDIS3のWT、RNB MUT(D487N)、G766RおよびR780Kの変異体をコード化するオープン・リーディング・フレームを包含する挿入物を、D3FMluI:(ATATACGCGTGCCGCCACCATGCTCAAGTCCAAGACGTTC)(SEQ ID No.51)およびD3RB120I:(GCGCGGGCCCTTACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAATCTAT ATCTTTTCCAAGCTTCATCTTCT)(SEQ ID No.52)プライマー対によって、およびそれぞれのテンプレートとしてpHEX1、pHEX8、pMM4またはpMM5の構築物を使用して、増幅した。次に、挿入物を、BI−16ベクターのMluIおよびBsp120Iの部位へとクローン化し(Sammarco and Grabczyk, 2005)、それ故、その中に存在するhRLUC ORFを、大腸菌MH1株の使用と置き換えた。このように、[BI−16’]hDIS3 WT、[BI−16’]hDIS3 RNB MUT、[BI−16’]hDIS3 G766Rおよび[BI−16’]hDIS3 R780Kの一過性ベクターを構築した。hDIS3挿入物を以下のように配列決定した。
平行して、Invitrogen(「miR RNAi」オプションを有する)からのBLOCK−iT(商標)RNAi Designerツールを使用して、内因性のhDIS3 mRNAを特異的に及び効率的に標的とするべきであるmiRNA配列のために、調査を実行した(http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress)。候補配列を、選択し、hDIS3 ORFの位置495.、898.、1159.、1273.、および1404.で始まる、それぞれ、1.3.、5.、6.、および7.としてランク付けした(最も高いスコアはプログラムによって戻され;2.および4.とランク付けされた配列は、1.および3.と部分的に重複したため拒絶された)。InvitrogenからのBLOCK−iT(商標)Pol II miR RNAi Expression Vector Kitsの概念に基づいて(http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products−and−Services/Applications/rnai/Vector−based−RNAi/Pol−II−miR−RNAi−Vectors.html)、合成DNAフラグメントを設計し、これは、上にリストされたmiRNA配列の組み合わせ、miR1159−miR1273−miR1404(tri−miR2)を包含しており、これは、さらなる実験に利用された。それは、予め設計されたmiRNAに対応する3つの直列に位置するshRNA、いわゆる、sh−miRをコード化し、ここで、センスおよびアンチセンスのmiRNA配列は、ループ要素によって分離され、ヘアピンの形成が可能となる。sh−miR配列の各々を、ヒト細胞において活性な天然のmiRNA生合成経路に従って、モチーフを有する両方の末端で隣接させて(flanked)、人工のpre−miRNA前駆体からの正確なmiRNAプロセシングを確かなものとした。さらに、単純性疱疹ウィルス・チミジル酸キナーゼ(HSV−TK−pA)をコード化する遺伝子に由来するポリアデニル化シグナルを、この合成カセットの3’−末端に置き、ヒト細胞における転写の正確な完了を可能にした。カセットは、5’および3’の末端(extremities)に、それぞれ、EcoRI/SalIおよびClaI/HindIII制限部位の組み合わせを包含し、これを、続くクローニング工程に使用した。これを、BlueHeronBioによって合成し、pUCAmpMinusMCSベクターのEcoRI部位とHindIII部位との間に挿入した。次に、(人工のpre−miRNAを含有しているカセットの発現のモニタリングを可能にする)配列コード化eGFPを、テンプレートとして、eGFPFor(GCGGAATTCATATACCTAGGACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC)(SEQ ID No.53)、eGFPRev(GCGCGTCGACTCACTACCTCCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC)(SEQ ID No.54)プライマー対およびpEGFP−N1プラスミド(Clontech)を使用して、PCRにおいて増幅し、提供された[pUCAmpMinusMCS]tri−miR 2プラスミドのEcoRIおよびSalIの部位に挿入し、それ故、[pUCAmpMinusMCS]eGFP−tri−miR 2の一過性の構築物を与えた。
さらに、XmaJI制限エンドヌクレアーゼによって認識された部位を、eGFP ORFの5’−末端の上流のeGFPForオリゴヌクレオチドに導入し、これをさらなるクローニング段階で使用した。
さらに、XmaJI制限エンドヌクレアーゼによって認識された部位を、eGFP ORFの5’−末端の上流のeGFPForオリゴヌクレオチドに導入し、これをさらなるクローニング段階で使用した。
構築物の生成の次の相において、外因性のhDIS3 ORFをmiRNA作用に対して非感受性にするために、その配列を変化させる必要があった。この目的のために、オープン・リーディング・フレームのヌクレオチド451.−1457.を包含する再コード化されたhDIS3フラグメントの合成が要求された。このフラグメントが、最初はmiRNAとの標的とされる目的であった5つの部位をすべて包含し、一方で、それが、D487N(RNB MUT)、G766RおよびR780Kの突然変異が初期段階で導入された領域の外に位置したことを留意する価値はある。再コード化の考えは、miRNAによって認識された部位を包含しているフラグメント内の(遺伝コードの変性を利用され得るそれらの位置での)あらゆる考えられ得るコドンへと同義突然変異を導入し、コドン利用の頻度を考慮に入れることであって、その結果、配列は、できるだけ最初の配列から分岐するだろう。再コード化されたhDIS3 ORFフラグメントを、pUCAmpMinusMCSベクター中の挿入物としても、BlueHeronBioによって合成し、最初の配列に完全に相補的な〜30−45のnt長の隣接領域で囲み、およびSchI制限酵素(DNAをその部位からのいくらかの距離で開裂し、開裂後に平滑末端を残す、エンドヌクレアーゼ)によって認識された部位を有する両末端で終端した。そのような末端の存在のために、挿入物は、SchIを用いて提供された[pUCAmpMinusMCS]rec_hDIS3プラスミド(大腸菌MH1株で増殖した)から切除され得、その後、テンプレートとして第一工程(上記参照)で生成された、[BI−16’]hDIS3 WT、[BI−16’]hDIS3 RNB MUT、[BI−16’]hDIS3 G766Rおよび[BI−16’]hDIS3 R780Kプラスミドを利用して、重複伸長PCRにおいて「メガプライマー」として利用され得る(Bryksin and Matsumura, 2010)。生成物を、DpnI制限酵素で消化し、形質転換によって大腸菌MH1株に導入した。これによって、[BI−16’]hDIS3rec WT、[BI−16’]hDIS3rec RNB MUT、[BI−16’]hDIS3rec G766Rおよび[BI−16’]hDIS3rec R780Kの一過性の構築物がそれぞれ生じた。再コード化されたフラグメントの存在を、以下のプライマーを使用して、AdeI制限酵素での消化および配列決定によって確認した:HD3F1848、HD3F2429、hD3r819R−CTTGTTCTCCTCGGAATCTC(SEQ ID No.55)、HD3R1592およびHD3R2443。
最終的なクローニング段階の目標は、[pUCAmpMinusMCS]eGFP−tri−miR 2からのeGFPコード化配列およびpre−miRNA/HSV−TK−pAの共シストロン(co−cistron)を含有しているDNAフラグメントを、後者に存在するFLUC ORFの置換によって、以前の工程からの4つのBI−16ベクター誘導体の各々に移すことであった。この目的のために、すべてのプラスミドを、XmaJIおよびClaIの制限部位を利用して、標準的なクローニング手順の前に大腸菌dam−/dcm−菌株において増殖させ、その後、ライゲーション生成物を大腸菌MH1株へと形質転換した。これは、結局、最終構築物:pMM7、pMM8、PMM9、pMM10の生成につながった。hDIS3recおよびeGFP−tri−miR 2の挿入物の両方を、以下のプライマーを使用して配列決定した:HD3F1848、HD3F2429、hD3r819R、HD3R1592およびHD3R2443、BI16seq1−CATTCTCCGCTCCATCGTTC(SEQ ID No:56)およびBI16seq2−TCCACTGGTCGACTCACTAC(SEQ ID No:57)。
安定した細胞株の細胞培養および生成。
HEK293 Flp−In T−REx(Invitrogen)細胞を、5%のCO2の加湿雰囲気において37℃で、10%のテトラサイクリン遊離の胎児ウシ血清(TET System Approved FBS, Clontech)および抗生物質(Penicillin−Streptomycin; Sigma−Aldrich)が補足された、ダルベッコ変法イーグル培地(D−MEM,Gibco)中の単層として培養した。安定した誘導可能なHEK293 Flp−In T−REx細胞株を、Flp−In(商標)T−REx(商標)システム(Invitrogen)を使用するこの研究で得て、pMM7、pMM8、PMM9、pMM10の構築物(プラスミドDNAの非常に純粋なMidi preps)の使用とともに、ヒグロマイシンB(100μg/ml)およびブラストサイジン(10−15μg/ml)(両方ともInvitrogenから)が補足された、上記と同じ条件で成長させた。Lipofectamine2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクションを行った。外因性の遺伝子の発現を、100ng/mlの終末濃度で培地にドキシサイクリンを加えることによって誘発した。
HEK293 Flp−In T−REx(Invitrogen)細胞を、5%のCO2の加湿雰囲気において37℃で、10%のテトラサイクリン遊離の胎児ウシ血清(TET System Approved FBS, Clontech)および抗生物質(Penicillin−Streptomycin; Sigma−Aldrich)が補足された、ダルベッコ変法イーグル培地(D−MEM,Gibco)中の単層として培養した。安定した誘導可能なHEK293 Flp−In T−REx細胞株を、Flp−In(商標)T−REx(商標)システム(Invitrogen)を使用するこの研究で得て、pMM7、pMM8、PMM9、pMM10の構築物(プラスミドDNAの非常に純粋なMidi preps)の使用とともに、ヒグロマイシンB(100μg/ml)およびブラストサイジン(10−15μg/ml)(両方ともInvitrogenから)が補足された、上記と同じ条件で成長させた。Lipofectamine2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクションを行った。外因性の遺伝子の発現を、100ng/mlの終末濃度で培地にドキシサイクリンを加えることによって誘発した。
RNA単離およびノーザンブロット解析。
RNAを、TRI Reagent(Sigma−Aldrich)を使用して、ヒト細胞株から単離した。膜へのRNA固定に続いて、ノーザンブロットを標準手続に従って処理した。
RNAを、TRI Reagent(Sigma−Aldrich)を使用して、ヒト細胞株から単離した。膜へのRNA固定に続いて、ノーザンブロットを標準手続に従って処理した。
以下のプライマー対の使用で得られた、無作為に初回刺激を受けた(primed)PCR生成物を、それぞれ、GAPDH mRNAおよび7SL RNAの検出のためのプローブとして使用した:GAPDH_F(TGCACCACCAACTGCTTAGC)(SEQ ID No:58)−GAPDH_R(GGCATGGACTGTGGTCATGAG)(SEQ ID No:59)、および7SL_F(TCGGGTGTCCGCACTAAGTT)(SEQ ID No:60)−7SL−R(TGGCTATTCACAGGCGCGAT)(SEQ ID No:61)。(Tomecki et al. 2010b; Supplementary Information)に記載されるように生成された、無作為に初回刺激を受けたプローブを、hDIS3転写物の検出に使用した。ヒストンH2A mRNAに特異的な無作為に初回刺激を受けたDNAプローブを、pUC19のそれぞれの部位間でクローン化された、その全長CDS(GenBank ID:AY131971.1)に対応する配列のEcoRI/HindIII媒介性の切除によって生成し、構築物は、Prof. Zbigniew Dominskiによって快く提供された。他の転写物については、32P標識化オリゴヌクレオチドを、プローブとして使用した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、表4に従った。
ハイブリダイゼーション後、膜を、洗浄し、PhosphorImagerスクリーン(FujiFilm)にさらした後に、FLA 7000スキャナー(FujiFilm)を使用してスキャンした。
ウェスタンブロッティング
ヒト細胞株からのタンパク質サンプルを、ウェスタンブロッティング用に実施例IIに記載されるように処置し、以下の一次抗体の1つでインキュベートした:マウスのモノクローナル抗eGFP(B2)(Santa Cruz Biotechnology; sc−9996)(1:1000)、ウサギのポリクローナル抗FLAG(Sigma−Aldrich; F−7425)(1:3000)、ウサギのポリクローナル抗hDIS3L(Sigma−Aldrich; HPA041805,lot:R38591)(1:500)、ウサギのポリクローナル抗hRRP6(Sigma−Aldrich; P4124)(1:3000)、ウサギのポリクローナル抗hDIS3L2(手製;Lubas et al. 2013を参照)(1:2000)、ヤギのポリクローナル抗GAPDH(V−18)(Santa Cruz Biotechnology; sc−20357)(1:2000)。その後、膜を、TBSTで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合させた適切な二次抗体(ヤギ抗マウス、ヤギ抗ウサギ(Calbiochem;それぞれ、401215、401393)またはウサギ抗ヤギ(Sigma−Aldrich;A5420))でインキュベートした。最終的に、ブロットを、Immun−Star(商標)WesternC(商標)Kit(Bio−Rad)およびCL−XPosure(商標)Films(Thermo Scientific)を使用して、Curix 60マシーン(AGFA)において発達させた。
ヒト細胞株からのタンパク質サンプルを、ウェスタンブロッティング用に実施例IIに記載されるように処置し、以下の一次抗体の1つでインキュベートした:マウスのモノクローナル抗eGFP(B2)(Santa Cruz Biotechnology; sc−9996)(1:1000)、ウサギのポリクローナル抗FLAG(Sigma−Aldrich; F−7425)(1:3000)、ウサギのポリクローナル抗hDIS3L(Sigma−Aldrich; HPA041805,lot:R38591)(1:500)、ウサギのポリクローナル抗hRRP6(Sigma−Aldrich; P4124)(1:3000)、ウサギのポリクローナル抗hDIS3L2(手製;Lubas et al. 2013を参照)(1:2000)、ヤギのポリクローナル抗GAPDH(V−18)(Santa Cruz Biotechnology; sc−20357)(1:2000)。その後、膜を、TBSTで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合させた適切な二次抗体(ヤギ抗マウス、ヤギ抗ウサギ(Calbiochem;それぞれ、401215、401393)またはウサギ抗ヤギ(Sigma−Aldrich;A5420))でインキュベートした。最終的に、ブロットを、Immun−Star(商標)WesternC(商標)Kit(Bio−Rad)およびCL−XPosure(商標)Films(Thermo Scientific)を使用して、Curix 60マシーン(AGFA)において発達させた。
免疫局在性分析
HEK293 Flp−In T−REX由来の安定した細胞株の2x104細胞を、ドキシサイクリン(100ng/ml)を有する培地中で、チャンバースライド(Thermo Scientific)上に蒔き、タンパク質発現を誘発した。細胞を、固定し、透過処理し、遮断した。細胞を、まず一次抗体、その後フルオロフォアに連結された二次抗体でインキュベートした。最終的に、細胞を、DAPI(Invitrogen)で染色した。最後の洗剤後、カバースリップを、ProLong Goldの褪色防止用試薬(Invitrogen)中のチャンバースライド上に取り付け、25℃に一晩暗所に置き、その後、顕微鏡分析まで4℃で保存した。以下の抗体を使用した(括弧中の希釈液):1)一次 − マウスのモノクローナル抗FLAG(M2)(Sigma−Aldrich;F3165)(1:200);ウサギのポリクローナル抗hDIS3(Sigma−Aldrich;HPA039281,lot:R37348)(1:100);ウサギのポリクローナル抗フィブリラリン(Abcam;ab5821)(1:150);2)二次 − Alexa Fluor 635結合したヤギ抗マウス、Alexa Fluor 555結合したヤギ抗ウサギIgG、Alexa Fluor(両方ともMolecular Probesから)(1:800)。イメージングを、適切な発光フィルターおよび60x/1.40油浸対物レンズを使用して、分光検出装置(Olympus)を有するFluoView FV1000システム上で実行した。画像を、FluoViewソフトウェアを使用して処理した。
HEK293 Flp−In T−REX由来の安定した細胞株の2x104細胞を、ドキシサイクリン(100ng/ml)を有する培地中で、チャンバースライド(Thermo Scientific)上に蒔き、タンパク質発現を誘発した。細胞を、固定し、透過処理し、遮断した。細胞を、まず一次抗体、その後フルオロフォアに連結された二次抗体でインキュベートした。最終的に、細胞を、DAPI(Invitrogen)で染色した。最後の洗剤後、カバースリップを、ProLong Goldの褪色防止用試薬(Invitrogen)中のチャンバースライド上に取り付け、25℃に一晩暗所に置き、その後、顕微鏡分析まで4℃で保存した。以下の抗体を使用した(括弧中の希釈液):1)一次 − マウスのモノクローナル抗FLAG(M2)(Sigma−Aldrich;F3165)(1:200);ウサギのポリクローナル抗hDIS3(Sigma−Aldrich;HPA039281,lot:R37348)(1:100);ウサギのポリクローナル抗フィブリラリン(Abcam;ab5821)(1:150);2)二次 − Alexa Fluor 635結合したヤギ抗マウス、Alexa Fluor 555結合したヤギ抗ウサギIgG、Alexa Fluor(両方ともMolecular Probesから)(1:800)。イメージングを、適切な発光フィルターおよび60x/1.40油浸対物レンズを使用して、分光検出装置(Olympus)を有するFluoView FV1000システム上で実行した。画像を、FluoViewソフトウェアを使用して処理した。
ポリソーム勾配およびRNA単離。
安定した細胞株を、〜95%のコンフルエンスに達するまで、1枚のプレート上のドキシサイクリンを含有している培地中で一晩成長させた。細胞を、15分間37℃でシクロヘキシミド(Sigma−Aldrich;200μg/ml)で処置し、トリプシン処理によって採取し、500xg;4℃で1分間遠心沈殿し、その後、100μg/mlのシクロヘキシミドを含有している氷冷のPBSで3回洗浄した。最後の洗剤およびPBSの完全除去後、細胞を、0.5mlの溶解バッファー中で懸濁し(10mMのHepes−KOH、pH=7.5;100mMのKCl;2.5mMのMgCl2;1mMのDTT;100μg/mlのシクロヘキシミド;1mg/mlのヘパリン(Sigma−Aldrich);1%還元のIgepal−CA630(Sigma−Aldrich);80u/μlのRiboLock(商標)RNase Inhibitor(Thermo Scientific);1xProtease Inhibitor Cocktail, Complete EDTA遊離(Roche))、回転輪上で4℃で15分間、ピペッティング(pipetting)およびインキュベーションを介して溶解した。その後、溶解液を、10000xg;4℃で10分間遠心分離にかけ、収集した上清中のRNA濃度を、Nanodrop 2000c装置(Thermo Scientific)を使用して測定した。500μlの溶解バッファー中の細胞質溶解液の8のOD260ユニットを、(洗浄剤およびリボヌクレアーゼ阻害剤を欠く、溶解バッファー中のろ過した蔗糖液を使用して調製した)7−47%の蔗糖勾配上へと層状にし、SW−41Tiローター(Beckman Coulter)において39000xg;4℃で2時間超遠心分離にかけた。続いて、(上述のように調製した)60%の蔗糖液をチューブの底部に注入することによって、0.5mlの画分を各勾配から採取し、OD260を、AEKTA Purifier上でモニタリングした。ポリソーム勾配からのRNA単離のために、採取した画分を、ボルテックスによって、650μlのフェノール:グアニジンチオシアナート(1:1)と徹底的に混合し、8分間65℃でインキュベートした。その後、320μlのクロロホルムおよび3Mの酢酸ナトリウム(pH=5.2)、120μlを加え、その後、13200rpmで5分間、ボルテックスおよび遠心分離が続いた。サンプルを、クロロホルムで2回抽出し、RNAを、イソプロパノールを用いて水相から沈殿させ、75%のエタノールで洗浄して、20μlnoRNase遊離水で懸濁した。続いて、RNAサンプルを、プールして、ノーザンブロッティングによって分析した。
安定した細胞株を、〜95%のコンフルエンスに達するまで、1枚のプレート上のドキシサイクリンを含有している培地中で一晩成長させた。細胞を、15分間37℃でシクロヘキシミド(Sigma−Aldrich;200μg/ml)で処置し、トリプシン処理によって採取し、500xg;4℃で1分間遠心沈殿し、その後、100μg/mlのシクロヘキシミドを含有している氷冷のPBSで3回洗浄した。最後の洗剤およびPBSの完全除去後、細胞を、0.5mlの溶解バッファー中で懸濁し(10mMのHepes−KOH、pH=7.5;100mMのKCl;2.5mMのMgCl2;1mMのDTT;100μg/mlのシクロヘキシミド;1mg/mlのヘパリン(Sigma−Aldrich);1%還元のIgepal−CA630(Sigma−Aldrich);80u/μlのRiboLock(商標)RNase Inhibitor(Thermo Scientific);1xProtease Inhibitor Cocktail, Complete EDTA遊離(Roche))、回転輪上で4℃で15分間、ピペッティング(pipetting)およびインキュベーションを介して溶解した。その後、溶解液を、10000xg;4℃で10分間遠心分離にかけ、収集した上清中のRNA濃度を、Nanodrop 2000c装置(Thermo Scientific)を使用して測定した。500μlの溶解バッファー中の細胞質溶解液の8のOD260ユニットを、(洗浄剤およびリボヌクレアーゼ阻害剤を欠く、溶解バッファー中のろ過した蔗糖液を使用して調製した)7−47%の蔗糖勾配上へと層状にし、SW−41Tiローター(Beckman Coulter)において39000xg;4℃で2時間超遠心分離にかけた。続いて、(上述のように調製した)60%の蔗糖液をチューブの底部に注入することによって、0.5mlの画分を各勾配から採取し、OD260を、AEKTA Purifier上でモニタリングした。ポリソーム勾配からのRNA単離のために、採取した画分を、ボルテックスによって、650μlのフェノール:グアニジンチオシアナート(1:1)と徹底的に混合し、8分間65℃でインキュベートした。その後、320μlのクロロホルムおよび3Mの酢酸ナトリウム(pH=5.2)、120μlを加え、その後、13200rpmで5分間、ボルテックスおよび遠心分離が続いた。サンプルを、クロロホルムで2回抽出し、RNAを、イソプロパノールを用いて水相から沈殿させ、75%のエタノールで洗浄して、20μlnoRNase遊離水で懸濁した。続いて、RNAサンプルを、プールして、ノーザンブロッティングによって分析した。
siRNAトランスフェクション。
siRNA媒介性のノックダウンを、stealthRNAおよびLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)を使用して行った。hRRP6(ID HSS182420)に対するstealthRNAオリゴまたは陰性対照(stealth(商標)RNAi Negative Control Low GC)(両方ともInvitrogenから)を、20nMの終末濃度で使用した。細胞を、採取前の更なる60時間の間、ドキシサイクリンが欠如下または存在下で成長させた。
siRNA媒介性のノックダウンを、stealthRNAおよびLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)を使用して行った。hRRP6(ID HSS182420)に対するstealthRNAオリゴまたは陰性対照(stealth(商標)RNAi Negative Control Low GC)(両方ともInvitrogenから)を、20nMの終末濃度で使用した。細胞を、採取前の更なる60時間の間、ドキシサイクリンが欠如下または存在下で成長させた。
逆転写および定量PCR。
安定したヒト細胞株から抽出された10μgの合計のRNAを、RiboLock(商標)RNase Inhibitor(Thermo Scientific)の存在下で、6ユニットのTURBO(商標)DNase(Ambion)で処置した。抽出後、2μgのDNase処置したRNAを、50pmolのオリゴ(dT)プライマーと250ngのランダムヘキサマー(Invitrogen)の混合物の使用によって逆転写し、cDNA反応のSuperscript III(商標)逆転写酵素(Invitrogen)1/100を、BSA、10μlの最終容量で、Platinum(登録商標) Quantitative PCR SuperMix−UDG(Invitrogen)、
2.5pmolの各プライマーおよび0.3μgのBSAを3回繰り返して混合し、58℃のアニール温度を使用して、Roche LightCycler(登録商標)480システムにおいてリアルタイムPCR分析に適用した。逆転写酵素を欠く陰性対照は、無視できるバックグラウンドを示した。すべてのデータをGAPDH mRNAに正規化した。以下の表5に明記したプライマー対を、増幅に使用した。
安定したヒト細胞株から抽出された10μgの合計のRNAを、RiboLock(商標)RNase Inhibitor(Thermo Scientific)の存在下で、6ユニットのTURBO(商標)DNase(Ambion)で処置した。抽出後、2μgのDNase処置したRNAを、50pmolのオリゴ(dT)プライマーと250ngのランダムヘキサマー(Invitrogen)の混合物の使用によって逆転写し、cDNA反応のSuperscript III(商標)逆転写酵素(Invitrogen)1/100を、BSA、10μlの最終容量で、Platinum(登録商標) Quantitative PCR SuperMix−UDG(Invitrogen)、
2.5pmolの各プライマーおよび0.3μgのBSAを3回繰り返して混合し、58℃のアニール温度を使用して、Roche LightCycler(登録商標)480システムにおいてリアルタイムPCR分析に適用した。逆転写酵素を欠く陰性対照は、無視できるバックグラウンドを示した。すべてのデータをGAPDH mRNAに正規化した。以下の表5に明記したプライマー対を、増幅に使用した。
酵母細胞を使用して実行した生化学的解析および実験の結果がかなり有望であったため、適切な細胞モデルを使用するヒトにおけるhDIS3突然変異の影響の試験を促進した。最も適切なものは、明白に、異なるhDIS3変異体を有する複数の骨髄腫細胞株であろう。しかし、患者からの幾つかの市販のMM細胞株のために行われた配列分析は、hDIS3遺伝子中の突然変異の存在を明らかにしなかった(データは示されず)。一方、I845V突然変異はSKMM1細胞株(データは示されず)中に存在したが、突然変異が酵素のエキソリボヌクレアーゼ分解活性に影響しないため、この株を使用することに利点はなかった(図1のCおよび図2)。それ故、新しい細胞モデルを構築することが必要であり、これによって、細胞生理およびRNA代謝に対するhDIS3突然変異の影響を分析することが可能となるだろう。この目標を、InvitrogenからのFlp−In(商標)T−REx(商標)システムと、双方向テトラサイクリン誘導性プロモーターを含有している適合性ベクターの使用を組み合わせることによって達成した(Sammarco & Grabczyk, 2005)(図4のA)。この実験準備によって、以下を安定して同時発現するHEK293 Flp−In T−REx細胞株を生成することが可能となった:1)内因性のhDIS3コピーを発現停止したsh−microRNA、および2)FLAGエピトープで標識化され、miRNA作用に対して非感受性にするために再コード化されたフラグメントを含有している、外因性のhDIS3変異体(図4のA)。hDIS3WT、純種の触媒性の突然変異体hDIS3D487N、またはすべての前の実験で検査されてきた多発性骨髄腫に関係する2つのhDIS3変異体の1つを外因的に過剰産生する、4つのそのような細胞株を樹立し、それは、特に酵母モデル−hDIS3G766RおよびhDIS3R780Kにおいて最も強力な表現型を与えた。ノーザンブロット解析およびウェスタンブロット解析は、両方の挿入物が、すべての4つの細胞株中は効率的に発現されたことを確証した(図4のB、C)。モデル細胞株での実験を始める前に、両方がエキソソームコア−hDIS3LおよびhRRP6と協働し、複合体(hDIS3L2)とは無関係に機能する、RNA代謝に関係する他の既知のヒト3’−5’エキソヌクレアーゼの発現が、この実験システムにおいて変わらないままであることが確証された(図4のD)。さらに、hDIS3または導入された突然変異のいずれの過剰発現もタンパク質の細胞内局在性に影響を与えないことを確認するために、これらの細胞株に関する免疫局在性実験を行った(図5のA、B)。
モデル細胞株を用いて、hDIS3タンパク質の突然変異したバージョンの発現が、様々なクラスを表わすRNA分子の代謝中の異常につながるか否かを検査した。この目的のために、細胞株からの合計のRNAを単離し、その細胞株を、いずれか未処置のままにするか、48時間のドキシサイクリン媒介性の誘発にさらした。そのような誘発期間後、hDIS3D487NおよびhDIS3R780Kの突然変異タンパク質を発現する細胞株が、hDIS3WTまたはhDIS3G766Rの変異体を生成する細胞株よりわずかに悪化したことに留意することは重要である。
最初に、低分解能の(low−resolution)ノーザンブロット解析を、異なるRNAポリメラーゼによって合成された選択された転写物に適用した。とりわけ、未処理の5.8SリボソームRNA前駆体(RNAポリメラーゼI転写物)の大量蓄積が、突然変異したhDIS3変異体(しかし野生型の対照物ではない)を有する細胞株中のドキシサイクリン媒介性の誘発後に認識された(図6A)。RNAポリメラーゼII転写物の場合には、正規化に使用された、GAPDH polyA+mRNAのレベルは、(誘発に関係なく)すべての細胞株において一定のままであったが、hDIS3D487N、hDIS3G766RおよびhDIS3R780Kの突然変異タンパク質を発現する細胞におけるヒストンH2A polyA−mRNAの量の明らかな増加が観察された(図6A)。RNAポリメラーゼIII転写物に関して、hDIS3突然変異体の発現は、RNase MRP RNAに大きな影響を与えるようには見えなかったが(図6A)、この酵素によって合成された2つの他の代表的なRNA種(すなわち、RNase P RNAおよび7SL RNA)のレベルは、特にhDIS3D487NおよびhDIS3R780Kの変異体を生成する細胞株において増加した(図6A)。7SL RNAに対して観察された表現型も、高分解能のノーザンブロット解析によって確証された(図6D)。
蓄積の度合いが、5.8S rRNA前駆体に対して最も強かったために、それを、ローディングコントロールとして5S rRNAを使用して、高分解能のノーザンブロットによってより詳しく分析した(図6B)。一般に、これらの種のレベルが、hDIS3突然変異を有する細胞株で実行された誘発後に独占的に高められたことが確証された(図6B)。しかしながら、この実験によって、以下をさらに実証することが可能であった:1)観察された前駆体のパターンは、個々の突然変異体の各々の間で異なっており、2)蓄積する前駆体は、hDIS3G766Rタンパク質を発現する細胞株中で検出されたものよりhDIS3 D487NおよびR780Kの突然変異体間で類似していた(図6B)。さらに、明らかに大きなプロセシングの欠陥(processing defect)にもかかわらず、成熟した5.8S rRNAのレベルは、著しく低下することがなかったことが示された(図6B)。最終的に、リボソーム生合成もポリソーム形成も、著しく妨げられるようには見えなかった(図7のA)。興味深いことに、観察された5.8S rRNA前駆体は、ポリソームに組み込まれた(図7のB)。それらの蓄積が、hRRP6発現のsiRNA媒介性のサイレンシングよってさらに増大されることがなかったことに留意する価値もある(図8)。
2刊の最近の公報は、特に酵母(シュナイダーら、2012;Gudipatiら、2012)中の非コード化RNAの全体的な分解における、エキソソームおよび触媒性Dis3の活性の重要性を強調した。両方の高スループット解析において、tRNAおよびそれらの前駆体の蓄積は、Dis3不活性化から結果として生じる最も顕著な表現型の1つとして報告された。これは、幾つかの他のRNAポリメラーゼIII転写物のレベルがhDIS3の突然変異体を生成する細胞中で増大されるという結果(図6A)とともに、選択されたtRNA分子に対するhDIS3突然変異の影響をより注意深く分析することを促した。tRNATyrおよびtRNACysの前駆体と同様に、ほぼすべての検査された成熟したtRNA(tRNATyrおよびtRNAPheを除く)が、ドキシサイクリン処置後にD487NまたはR780Kの突然変異を有する外因性のhDIS3バージョンを有する細胞株において蓄積することが留意された(図6C)。その効果は、5.8S rRNA前駆体に関してそれほど顕著ではなかったが(図6A−C)、極端に再生可能であった。位置487および780のアミノ酸置換基が、G766R変化より強力な分子の表現型を示したことを強調することも価値がある(図6C)。
U3 snoRNAおよび3つの異なるsnRNAの蓄積に対するhDIS3突然変異の影響も検査されたが、U5 snRNAに対してのみ、tRNAの場合に以前に観察された表現型に類似している表現型が認識された(図6D)。これに反して、すべての分析されたPROMPT−不安定な転写物(これらは以前にヒトのエキソソームサブユニットのsiRNA媒介性の欠失にさらされた細胞において蓄積すると示された(Preker et al. 2008; Tomecki et al. 2010b; Lubas et al. 2011))については、それらのレベルが、突然変異したhDIS3変異体を生成するすべての細胞株において増大したことがわかった(図6E)。他の分析に一致して、PROMPTの蓄積は、G766R置換の場合よりもhDIS3 D487NまたはR780Kの突然変異を有する細胞においてはるかに顕著であった(図6E)。さらに、4つのPROMPTのうちの3つの下流に局在化したプロモーターから合成された対応するタンパク質をコード化する転写物を分析し、それらが、全く無関係のミトコンドリアの転写物−ATP6/8と同様に、hDIS3突然変異による影響を受けなかったことが実証された(図6E)。
要約すると、モデル細胞株におけるhDIS3突然変異は、5.8Sプロセシング中間体、tRNA、RNAポリメラーゼIII転写物およびPROMPTを含む、大多数の分析されたエキソソーム基質の蓄積を結果としてもたらした。蓄積の程度は、異なるエキソソームターゲット間で可変的であったが、ほとんどの場合、hDIS3G766R変異体よりhDIS3D487NおよびhDIS3R780Kを生成する細胞においてより大きかったことが明白に観察された。
実施例IV
MM関連hDIS3突然変異は、ヒトのモデル細胞株の成長阻害につながる。
細胞成長分析。
実施例IIIで得られた安定した誘導可能なHEK293 Flp−In T−REx細胞株を、90%のコンフルエンスに達するまで、実施例IIIに記載されるように成長させた。48時間の誘発モードで、2x105細胞を、ドキシサイクリンを欠いている又は含有している培地中でプレート上に直接蒔き、さらに48時間成長させた。48時間+48時間の誘発モードで、細胞を、最初に、40%のコンフルエンスで、ドキシサイクリンを欠いている又は含有している培地中で、新しいプレート上に再び蒔き、48時間後、2x105細胞を、それぞれの培地中でプレート上に蒔き、さらに48時間成長させた。細胞成長およびeGFP蛍光を、Olympus IX81の顕微鏡(Olympus)を使用して分析した。
MM関連hDIS3突然変異は、ヒトのモデル細胞株の成長阻害につながる。
細胞成長分析。
実施例IIIで得られた安定した誘導可能なHEK293 Flp−In T−REx細胞株を、90%のコンフルエンスに達するまで、実施例IIIに記載されるように成長させた。48時間の誘発モードで、2x105細胞を、ドキシサイクリンを欠いている又は含有している培地中でプレート上に直接蒔き、さらに48時間成長させた。48時間+48時間の誘発モードで、細胞を、最初に、40%のコンフルエンスで、ドキシサイクリンを欠いている又は含有している培地中で、新しいプレート上に再び蒔き、48時間後、2x105細胞を、それぞれの培地中でプレート上に蒔き、さらに48時間成長させた。細胞成長およびeGFP蛍光を、Olympus IX81の顕微鏡(Olympus)を使用して分析した。
「細胞間競争アッセイ」を、等量(5x105)の「空の(empty)」HEK293 Flp−In T−RExと樹立された安定した細胞株を混合し、それらをプレート上に蒔き、その後ドキシサイクリンでの発現の誘発によって実行した。最終的に、顕微鏡観察を上に記載されるように行った。
細胞株の代謝活性に関するアッセイを、以下のように行った。5000の細胞を、96ウェルのプレート上に(各々の細胞株、条件および測定の時間のために)3回繰り返して蒔いた。細胞を、ドキシサイクリンを欠いている培地中で維持するか、または誘発因子での処置にさらした。誘発の24時間、72時間または120時間後、10μlのAlamarBlue(登録商標)(Invitrogen)を培養液に加えた。減少した試薬の量を、DTX880 Multimode Detector(Beckman Coulter)を使用して、120分後に定量化した。RNA単離のための細胞の成長中に、D487NまたはR780Kの置換基を有するhDIS3変異体を発現する細胞株が、2つの他の細胞株よりも48時間の間のドキシサイクリン媒介性の誘発後にわずかに悪化したことが認識された。hDIS3突然変異が細胞生理に影響を与えたかどうかをしっかりと確認するために、樹立細胞株のためのさらなる成長分析を、蛍光顕微鏡を使用して、持続性の誘発(即ち:48時間、その後ドキシサイクリンを含有している新鮮な培地への細胞の継代、およびさらなる48時間の培養が続いた)にさらされた誘発されていない細胞およびそれらの対照物についての観察を介して行った。それらはすべて、正常に及び比較的ドキシサイクリンを欠いている培地中で成長したが(データは示されず)、内因性のhDIS3の長期的なsh−miRNA媒介性の抑制およびsh−miRNA非感受性の外因性のhDIS3変異体の同時発現後に、4つの細胞株は、異なって作用した(図9のA)。細胞のゲノムへと統合された構築物から生成されたhDIS3WTは、内因性のhDIS3発現のレベルの減少を明確に補足し、その結果、細胞成長は妨げられなかった。これに反して、hDIS3D487NおよびhDIS3R780Kの変異体を発現する細胞株の場合には、成長阻害が観察され(図9のA)、一方で、hDIS3中のG766R突然変異は、細胞成長に対して単に適度な効果を発揮した(図9のA)。これらの結果は、G766Rが、D487NまたはR780Kのアミノ酸変化と比較したときに(特に一本鎖基質を使用するときに)、分解のより軽度な阻害につながることを示唆した、生化学的データと(図1のCおよび図2を参照)、2つのD487NまたはR780Kの突然変異が、G766R突然変異の場合におけるよりも様々なRNA分子のより顕著な蓄積を結果としてもたらすという発見(図6)の両方に一致していた。
視野(field of view)内の実質的にすべての細胞が、eGFP蛍光を示し(図9のA)、そのため、これらの細胞が、hDIS3−FLAG融合をコード化する、第2の挿入物も発現したと仮定され得ることに留意する価値はある。遍在性のeGFP発現も、FACS分析によって確証された(データは示されず)。その上、別の簡潔な成長試験においてモデル細胞株のeGFP発現を活用することが可能であり、これは「細胞間競争アッセイ」と称された。この実験では、等数の4つの安定した細胞株の各々と対照HEK293 Flp−In T−REx細胞(eGFPを欠いている)を混合し、発現の誘発後に、そのような「雑種(hybrid)」細胞株を、蛍光顕微鏡で観察した。T−REx+hDIS3WTとT−REx+hDIS3G766Rの混合物の場合には、蛍光性の細胞の非蛍光性の細胞に対する1:1の比率を維持し、これは、樹立細胞株が、対照株より著しく遅く成長することがないことを意味している(図9のB)。対照的に、T−REx+hDIS3D487NとT−REx+hDIS3R780Kの混合物に対する蛍光性の細胞の数は、蛍光を欠いている細胞と比較して、はるかに少なく(図9のB)、これは、「空の」HEK293 Flp−In T−REx細胞が、これらの2つの特定のhDIS3突然変異体を安定して発現する細胞株との競合で優っていたことを示している。これは、それらが、細胞の死亡率の増加によって反映される、内因性の野生型hDIS3タンパク質のレベルの減少を補足するのに欠損していることを示唆している。
細胞生存率のより詳細な比較分析を、AlamarBlue(登録商標)試薬を使用して、モデル細胞株に対して行った。この化合物に基づくアッセイは、それが、細胞培養液への追加後に代謝的に活性な細胞によって還元され、これが分光特性を変化させるという事実に依存している。化合物の還元形の量は、細胞および(間接的に)その生存率(増殖および死亡の両方の結果)の代謝活性を反映している。それ故、異なるhDIS3変異体をコード化する導入遺伝子を有する細胞株における減少したAlamarBlue(登録商標)の量の比色測定を実行し、細胞は、誘発されていなかったか、またはドキシサイクリン処置にさらされていた。すべての細胞株に対して結果が著しく類似していたことがわかったが、但し、sh−miRNAおよび外因性のhDIS3の同時発現は誘発されなかった(図9のC)。一方、ドキシサイクリン媒介性の誘発後に、モデル株の著しく異なる行動が観察され、外因性のhDIS3WTを発現する細胞株の代謝活性は、誘発の欠如と比較して、実質的に不変であったが、それは、突然変異したhDIS3バージョンを生成する、3つの残りの細胞株中で異なる程度まで還元された(図9のC)。事前の成長試験に一致して、表現型は、hDIS3D487N突然変異体に対して最も強力で、hDIS3G766R変異体の場合に最も弱かった(図9のC)。
要約すると、実験システムを用いることで、多発性骨髄腫患者で見られたG766RおよびR780Kの置換基と同様に、hDIS3 D487Nの触媒性の突然変異が、ヒト細胞の増大した死亡率および代謝活性の阻害につながることが実証された。成長欠陥は、RNA代謝における異常の最終的な結果かもしれない。
実施例V
hDIS3 RNBドメインnにおけるMM関連突然変異は、ヒト細胞中のPINドメインの触媒性の突然変異により合成的に致死的である。
オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびクローニング。
それぞれのテンプレートとして、pMM11、pMM12、PMM13、pMM14の構築物を、D3PINF(AGGAATAACCGGGCGATTCGAGTAGCAGCAAAATGGTACAATG)(SEQ ID No:97)−D3PINR(TCGAATCGCCCGGTTATTCCTGTCATTAGCATTT TCTCCCTG)(SEQ ID No:98)−実施例IIIで構築されたオリゴヌクレオチド対およびpMM7、pMM8、pMM9、pMM10のプラスミドを使用して、部位特異的変異誘発によって生成した。PINおよびRNBのドメインで同時に生じる突然変異の影響を検査するために、これらの構築物を生成した。
hDIS3 RNBドメインnにおけるMM関連突然変異は、ヒト細胞中のPINドメインの触媒性の突然変異により合成的に致死的である。
オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびクローニング。
それぞれのテンプレートとして、pMM11、pMM12、PMM13、pMM14の構築物を、D3PINF(AGGAATAACCGGGCGATTCGAGTAGCAGCAAAATGGTACAATG)(SEQ ID No:97)−D3PINR(TCGAATCGCCCGGTTATTCCTGTCATTAGCATTT TCTCCCTG)(SEQ ID No:98)−実施例IIIで構築されたオリゴヌクレオチド対およびpMM7、pMM8、pMM9、pMM10のプラスミドを使用して、部位特異的変異誘発によって生成した。PINおよびRNBのドメインで同時に生じる突然変異の影響を検査するために、これらの構築物を生成した。
細胞培養、安定した細胞株の生成および細胞成長分析。
細胞株を、実施例IIIに記載されているように得たが、pMM11、pMM12、pMM13、pMM14の構成物を使用した。細胞を、実施例IIIに記載される条件で成長させた。細胞成長を、実施例IVに記載されるように分析した。
細胞株を、実施例IIIに記載されているように得たが、pMM11、pMM12、pMM13、pMM14の構成物を使用した。細胞を、実施例IIIに記載される条件で成長させた。細胞成長を、実施例IVに記載されるように分析した。
RNA単離およびノーザンブロット解析。
RNA単離および高分解能のノーザンブロットを、実施例IIIに記載されているように実行した。
RNA単離および高分解能のノーザンブロットを、実施例IIIに記載されているように実行した。
逆転写および定量PCR。
逆転写および定量PCRを、実施例IIIに記載されるように実行した。
逆転写および定量PCRを、実施例IIIに記載されるように実行した。
次に、異なるhDIS3 RNBドメイン突然変異のバックグラウンドにhDIS3 PINドメインのエンドヌクレアーゼ活性の効果があるかどうかを評価することが重要であった。この目的のために、類似した安定した細胞株を構築し、これは、生体外でのアッセイにおいてhDIS3のエンドヌクレアーゼ分解活性を止めると以前に示された、PINドメイン(D146N)の触媒部位において更なる突然変異を有していた。実施例IVに記載されているように実行された細胞成長アッセイは、D146N突然変異を有する異なるhDIS3バージョンを発現する細胞株の成長が、ドキシサイクリンの欠如下でむしろ影響を受けなかったことを明らかにした(図10A)。一方、hDIS3D146Nの単一の突然変異体を発現する細胞株のみが、誘発後に比較的正常に及びhDIS3WTを生成するその対照物と比較可能に成長し、これは、エンドヌクレアーゼ活性単独では、細胞生理にほとんど影響がないことを示している(図10A)。対照的に、PINドメイン触媒性の突然変異とRNBドメイン内のアミノ酸置換基(D487N、G766RまたはR780K)を組み合わせることで、結果として、劇的な成長欠陥につながった(図10A)。G766R突然変異単独を有するhDIS3を生成するそれぞれの細胞株が、WT対照と比較して、非常に軽度の成長阻害を示したことを考慮に入れると、hDIS3の両方のヌクレアーゼ分解活性の不活性化の相乗効果は、hDIS3D146N G766Rの二重突然変異体を発現する細胞の場合に最も明白であった(図10A)。重要なことに、AlamarBlue(登録商標)試薬を使用して行われたアッセイは、RNBドメイン内で突然変異を有する細胞の代謝活性もまた、PINドメインのエンドヌクレアーゼの不活性化を伴った後にさらに減少されることを開示した(図10B)。
その後、RNBドメイン内のMM関連hDIS3突然変異とPINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性の破壊との組み合わせから結果として生じる分子の表現型の分析を、細胞とそれぞれの単一の突然変異体との比較によって実行した。図10C示されるように、PINドメイン触媒活性単独の不活性化は、5.8S rRNA前駆体の蓄積にはつながらなかった。興味深いことに、RNBドメイン突然変異のバックグラウンドにおけるD146N置換の相乗効果は観察されず、これは、前駆体分子のレベルが、無傷のPINドメイン活性中心を有するそれぞれのhDIS3バージョンを生成する細胞株と比較してhDIS3D146N D487N、hDIS3D146N G766RおよびhDIS3D146N R780Kを発現する細胞株において高められなかったためである(図10C)。これは、そのような3’−伸長の5.8S rRNA種が、主にhDIS3 エキソリボヌクレアーゼ分解活性によって正常に分解されることを示している。同様に、RNAポリメラーゼIII転写物またはU5 snRNAに対するD146N突然変異の更なる効果が検知されず、すなわち、RNA種は、RNBドメイン内で突然変異を有するhDIS3変異体を生成する細胞株において蓄積されることがわかった(データは示されず)。これに反して、結果は、異なるPROMPTのレベルが、D146N置換を有するhDIS3またはそのWT対照物のいずれかを生成する細胞株間で比較可能であるが、hDIS3D146N D487N、hDIS3D146N G766RおよびhDIS3D146N R780Kの二重突然変異体を発現する細胞株が、それぞれの単一の突然変異体よりもはるかに多い両のPROMPTを蓄積することを明確に実証している(図10D)。これは、そのような非コー化RNA分子が、hDIS3の両方のヌクレアーゼ分解活性の協働作用によって分解されることを強く示唆している。興味深いことに、4つの試験したPROMPTのうちの3つに対応するタンパク質をコード化する転写物に対して非常に類似した傾向が見つけられたが(しかし、エキソソーム機能不全によって影響されることが予期されなかった、ミトコンドリアのATP6/8 mRNAに対してはそうではなかった)、二重および単一の突然変異体間の倍差(fold differences)は、PROMPTの場合でのように劇的なものではなかった(図10E)。
実施例VI
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンは、生体外でhDIS3の単離したPINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する。
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンの合成。
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンの合成を、Bioorganic & Medicinal Chemistry vol. 20 ((2012)467−479)に記載される方法に従って行った。
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンは、生体外でhDIS3の単離したPINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する。
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンの合成。
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンの合成を、Bioorganic & Medicinal Chemistry vol. 20 ((2012)467−479)に記載される方法に従って行った。
トルエン中のホモフタル酸無水物1(0.5g;3.08mmol)、塩酸ベンジルヒドロキシルアミン(0.59g;3.7mmol)およびトリエチルアミン(0.5ml;3.7mmol)の混合物を、4時間Dean−Starkの装置によって加熱マントル上で加熱した。基質がまだLCMS上で可視であり、アミンを加えて、加熱しても何も変化せず、そのため、反応を止めた。白色固形物を、ろ過によって除去した。ろ液を、濃縮乾固し、DCM中に溶解し、カラムクロマトグラフイーAcOEt/ヘキサン1/8によって精製した。Et2Oからの結晶化によって、白色固形物として0.39g(48%)の2を得た。1H NMR(CDCl3、200MHz):δ8.23(d、2H、J=9Hz);7.66−7.26(m、8H);5.15(s、2H);4.15(s、2H)。
DCM中の2(0.36g;1.34mmol)の溶液に、BBr3(0.25ml;2.66mmol)を、一度で加え、反応を室温で1示間撹拌した。反応を水で慎重にクエンチした。15分後、黄色固形物を、ろ過によって除去した。ろ液を、DCMで抽出し、MgSO4によって乾燥させ、濃縮した。Et2Oからの結晶化によって、ベージュ色固形物として0.088gの3を得た。1H NMR(DMSO、200MHz):δ10.39(brs、1H);8.01(d、1H、J=8Hz);7.68−7.36(m、3H);4.25(s、2H)。
DCM中の2(0.36g;1.34mmol)の溶液に、BBr3(0.25ml;2.66mmol)を、一度で加え、反応を室温で1示間撹拌した。反応を水で慎重にクエンチした。15分後、黄色固形物を、ろ過によって除去した。ろ液を、DCMで抽出し、MgSO4によって乾燥させ、濃縮した。Et2Oからの結晶化によって、ベージュ色固形物として0.088gの3を得た。1H NMR(DMSO、200MHz):δ10.39(brs、1H);8.01(d、1H、J=8Hz);7.68−7.36(m、3H);4.25(s、2H)。
活性アッセイ。
組み換えタンパク質を、実施例Iに記載される方法によって得た。生体外での生化学アッセイのための基質は、実施例Iに記載される基質と同様に調製された、5’フルオレセイン標識化ss17−(A)34であった。活性アッセイを、2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンの存在下または欠如下で実施例Iに記載されるように行った。
組み換えタンパク質を、実施例Iに記載される方法によって得た。生体外での生化学アッセイのための基質は、実施例Iに記載される基質と同様に調製された、5’フルオレセイン標識化ss17−(A)34であった。活性アッセイを、2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンの存在下または欠如下で実施例Iに記載されるように行った。
hDIS3 PINドメインの不活性化が、RNBドメインにおけるMM関連突然変異によって合成的に致死的であることを確立した後に、推定上の阻害剤の検索を行った。RNAse Hの周知の阻害剤である、2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオン(Hang et al.2004)を合成した。ヒトのDIS3 PINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性のめの活性アッセイを行うために、単離したPINドメインの組み換えバージョンを生成した(図11のA)。次に、活性アッセイを、推定上の阻害剤の存在下また欠如下で行った(図11のB)。2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンは、80μMの濃度でヒトのDIS3 PINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を効率的に阻害した。
実施例VII
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンは、具体的にはMM患者において見られる突然変異に対応する酵母DIS3遺伝子中の突然変異を有する酵母菌株の成長を阻害する。
酵母成長アッセイ。
実施例IIで得た、G833RまたはR847Kの突然変異を有する酵母菌株を、成長アッセイに使用した。示された酵母菌株の連続希釈液を、(1mMの濃度で)YPDプレートおよび2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンを有するYPDプレート上に入れ、60時間30℃でインキュベートした。
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンは、具体的にはMM患者において見られる突然変異に対応する酵母DIS3遺伝子中の突然変異を有する酵母菌株の成長を阻害する。
酵母成長アッセイ。
実施例IIで得た、G833RまたはR847Kの突然変異を有する酵母菌株を、成長アッセイに使用した。示された酵母菌株の連続希釈液を、(1mMの濃度で)YPDプレートおよび2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンを有するYPDプレート上に入れ、60時間30℃でインキュベートした。
2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンが、DIS3 PINドメイン活性を阻害することを認識して、生体内での分析を、実施例II(図12)で得た、G833RまたはR847Kの突然変異を有する酵母菌株を使用して行った。2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオンは、WT酵母ではなくG833RおよびR847Kの突然変異を有する酵母の完全な成長阻害につながる。これは、hDIS3 PINドメイン活性の阻害剤が、実際、DIS3 MM関連突然変異を有する細胞の成長を特異的に阻害することを示している。
以下の表6では、酵母または細胞株における集められたhDIS3 RNBドメイン突然変異(その位置は、SEQ ID No:1に関連している)およびその同等物が示される。
上述の実施例によって、hDIS3 PINドメイン活性を阻害する化合物の生体内でのその適用は、それはそれを確認された、hDIS3活性において妨害のある細胞の成長阻害、特にhRNB Dis3ドメインの突然変異につながることが確認された。これらは、hDIS3 PINドメインの阻害剤である化合物が、hDIS3 RNBドメイン内に突然変異がある癌の処置用の有効な治療薬でもあることを確証している。hDIS3 RNBドメイン内に突然変異がある癌は、多発性骨髄腫、髄芽細胞腫および急性骨髄性白血病から選択され得る。hDIS3のRNBドメインにおける突然変異は、好ましくは、SEQ ID No:1に関連している、突然変異S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845Vから選択される。
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47. Wasmuth EV & Lima CD. 2012. Mol Cell 48: 133−144.
48. Wyers F et al. 2005. Cell 121: 725−737.
配列表のフリーテキスト(配列Seq Id No 3−98は明細書内に与えられる):
SEQ ID NO:1は、wt ヒトDis3アミノ酸配列である
MLKSKTFLKKTRAGGVMKIVREHYLRDDIGCGAPGCAACGGAHEGPALEPQPQDPASSVCPQPHYLLPDTNVLLHQIDVLEDPAIRNVIVLQTVLQEVRNRSAPVYKRIRDVTNNQEKHFYTFTNEHHRETYVEQEQGENANDRNDRAIRVAAKWYNEHLKKMSADNQLQVIFITNDRRNKEKAIEEGIPAFTCEEYVKSLTANPELIDRLACLSEEGNEIESGKIIFSEHLPLSKLQQGIKSGTYLQGTFRASRENYLEATVWIHGDSEENKEIILQGLKHLNRAVHEDIVAVELLPKSQWVAPSSVVLHDEGQNEEDVEKEEETERMLKTAVSEKMLKPTGRVVGIIKRNWRPYCGMLSKSDIKESRRHLFTPADKRIPRIRIETRQASTLEGRRIIVAIDGWPRNSRYPNGHFVRNLGDVGEKETETEVLLLEHDVPHQPFSQAVLSFLPKMPWSITEKDMKNREDLRHLCICSVDPPGCTDIDDALHCRELENGNLEVGVHIADVSHFIRPGNALなDQESARRGTTVYLCEKRIDMVPELLSSNLCSLKCDVDRLAFSCIWEMNHNAEILKTKFTKSVINSKASLTYAEAQLRIDSANMNDDITTSLRGLNKLAKILKKRRIEKGALTLSSPEVRFHMDSETHDPIDLQTKELRETNSMVEEFMLLANISVAKKIHEEFSEHALLRKHPAPPPSNYEILVKAARSRNLEIKTDTAKSLAESLDQAESPTFPYLNTLLRILATRCMMQAVYFCSGMDNDFHHYGLASPIYTHFTSPIRRYADVIVHRLLAVAIGADCTYPELTDKHKLADICKNLNFRHKMAQYAQRASVAFHTQLFFKSKGIVSEEAYILFVRKNAIVVLIPKYGLEGTVFFEEKDKPNPQLIYDDEIPSLKIEDTVFHVFDKVKVKIMLDSSNLQHQKIRMSLVEPQIPGISIPTDTSNMDLNGPKKKKMKLGK
SEQ ID NO:1は、wt ヒトDis3アミノ酸配列である
MLKSKTFLKKTRAGGVMKIVREHYLRDDIGCGAPGCAACGGAHEGPALEPQPQDPASSVCPQPHYLLPDTNVLLHQIDVLEDPAIRNVIVLQTVLQEVRNRSAPVYKRIRDVTNNQEKHFYTFTNEHHRETYVEQEQGENANDRNDRAIRVAAKWYNEHLKKMSADNQLQVIFITNDRRNKEKAIEEGIPAFTCEEYVKSLTANPELIDRLACLSEEGNEIESGKIIFSEHLPLSKLQQGIKSGTYLQGTFRASRENYLEATVWIHGDSEENKEIILQGLKHLNRAVHEDIVAVELLPKSQWVAPSSVVLHDEGQNEEDVEKEEETERMLKTAVSEKMLKPTGRVVGIIKRNWRPYCGMLSKSDIKESRRHLFTPADKRIPRIRIETRQASTLEGRRIIVAIDGWPRNSRYPNGHFVRNLGDVGEKETETEVLLLEHDVPHQPFSQAVLSFLPKMPWSITEKDMKNREDLRHLCICSVDPPGCTDIDDALHCRELENGNLEVGVHIADVSHFIRPGNALなDQESARRGTTVYLCEKRIDMVPELLSSNLCSLKCDVDRLAFSCIWEMNHNAEILKTKFTKSVINSKASLTYAEAQLRIDSANMNDDITTSLRGLNKLAKILKKRRIEKGALTLSSPEVRFHMDSETHDPIDLQTKELRETNSMVEEFMLLANISVAKKIHEEFSEHALLRKHPAPPPSNYEILVKAARSRNLEIKTDTAKSLAESLDQAESPTFPYLNTLLRILATRCMMQAVYFCSGMDNDFHHYGLASPIYTHFTSPIRRYADVIVHRLLAVAIGADCTYPELTDKHKLADICKNLNFRHKMAQYAQRASVAFHTQLFFKSKGIVSEEAYILFVRKNAIVVLIPKYGLEGTVFFEEKDKPNPQLIYDDEIPSLKIEDTVFHVFDKVKVKIMLDSSNLQHQKIRMSLVEPQIPGISIPTDTSNMDLNGPKKKKMKLGK
SEQ ID NO:2は、wt Saccharomyces cerevisiae Dis3アミノ酸配列である
MSVPAIAPRRKRLADGLSVTQKVFVRSRNGGATKIVREHYLRSDIPCLSRSCTKCPQIVVPDAQNELPKFILSDSPLELSAPIGKHYVVLDTNVVLQAIDLLENPNCFFDVIVPQIVLDEVRNKSYPVYTRLRTLCRDSDDHKRFIVFHNEFSEHTFVERLPNETINDRNDRAIRKTCQWYSEHLKPYDINVVLVTNDRLNREAATKEVESNIITKSLVQYIELLPNADDIRDSIPQMDSFDKDLERDTFSDFTFPEYYSTARVMGGLKNGVLYQGNIQISEYNFLEGSVSLPRFSKPVLIVGQKNLNRAFNGDQVIVELLPQSEWKAPSSIVLDSEHFDVNDNPDIEAGDDDDNNESSSNTTVISDKQRRLLAKDAMIAQRSKKIQPTAKVVYIQRRSWRQYVGQLAPSSVDPQSSSTQNVFVILMDKCLPKVRIRTRRAAELLDKRIVISIDSWPTTHKYPLGHFVRDLGTIESAQAETEALLLEHDVEYRPFSKKVLECLPAEGHDWKAPTKLDDPEAVSKDPLLTKRKDLRDKLICSIDPPGCVDIDDALHAKKLPNGNWEVGVHIADVTHFVKPGTALDAEGAARGTSVYLVDKRIDMLPMLLGTDLCSLKPYVDRFAFSVIWELDDSANIVNVNFMKSVIRSREAFSYEQAQLRIDDKTQNDELTMGMRALLKLSVKLKQKRLEAGALNLASPEVKVHMDSETSDPNEVEIKKLLATNSLVEEFMLLANISVARKIYDAFPQTAMLRRHAAPPSTNFEILNEMLNTRKNMSISLESSKALADSLDRCVDPEDPYFNTLVRIMSTRCMMAAQYFYSGAYSYPDFRHYGLAVDIYTHFTSPIRRYCDVVAHRQLAGAIGYEPLSLTHRDKNKMDMICRNINRKHRNAQFAGRASIEYYVGQVMRNNESTETGYVIKVFNNGIVVLVPKFGVEGLIRLDNLTEDPNSAAFDEVEYKLTFVPTNSDKPRDVYVFDKVEVQVRSVMDPITSKRKAELLLK
MSVPAIAPRRKRLADGLSVTQKVFVRSRNGGATKIVREHYLRSDIPCLSRSCTKCPQIVVPDAQNELPKFILSDSPLELSAPIGKHYVVLDTNVVLQAIDLLENPNCFFDVIVPQIVLDEVRNKSYPVYTRLRTLCRDSDDHKRFIVFHNEFSEHTFVERLPNETINDRNDRAIRKTCQWYSEHLKPYDINVVLVTNDRLNREAATKEVESNIITKSLVQYIELLPNADDIRDSIPQMDSFDKDLERDTFSDFTFPEYYSTARVMGGLKNGVLYQGNIQISEYNFLEGSVSLPRFSKPVLIVGQKNLNRAFNGDQVIVELLPQSEWKAPSSIVLDSEHFDVNDNPDIEAGDDDDNNESSSNTTVISDKQRRLLAKDAMIAQRSKKIQPTAKVVYIQRRSWRQYVGQLAPSSVDPQSSSTQNVFVILMDKCLPKVRIRTRRAAELLDKRIVISIDSWPTTHKYPLGHFVRDLGTIESAQAETEALLLEHDVEYRPFSKKVLECLPAEGHDWKAPTKLDDPEAVSKDPLLTKRKDLRDKLICSIDPPGCVDIDDALHAKKLPNGNWEVGVHIADVTHFVKPGTALDAEGAARGTSVYLVDKRIDMLPMLLGTDLCSLKPYVDRFAFSVIWELDDSANIVNVNFMKSVIRSREAFSYEQAQLRIDDKTQNDELTMGMRALLKLSVKLKQKRLEAGALNLASPEVKVHMDSETSDPNEVEIKKLLATNSLVEEFMLLANISVARKIYDAFPQTAMLRRHAAPPSTNFEILNEMLNTRKNMSISLESSKALADSLDRCVDPEDPYFNTLVRIMSTRCMMAAQYFYSGAYSYPDFRHYGLAVDIYTHFTSPIRRYCDVVAHRQLAGAIGYEPLSLTHRDKNKMDMICRNINRKHRNAQFAGRASIEYYVGQVMRNNESTETGYVIKVFNNGIVVLVPKFGVEGLIRLDNLTEDPNSAAFDEVEYKLTFVPTNSDKPRDVYVFDKVEVQVRSVMDPITSKRKAELLLK
Claims (42)
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
a)好ましくは癌細胞中のhDIS3で生じる突然変異を導入することにより、RNBドメイン中の突然変異を含むDIS3、そのフラグメント、相同体または変異体を含んでいるモデルシステムを構築する工程、
b)a)で得られたモデルシステムを試験済みの薬剤である、想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
c)モデルシステムに適切な方法によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)試験済みの薬剤と接触した際にPINドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程、
を含む、方法。 - hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
a)DIS3 PINドメイン、そのフラグメント、変異体または相同体、好ましくは単離されたhDIS3 PINドメインを含む、精製タンパク質を得る工程;
b)a)で得られたタンパク質を、試験済みの薬剤である、想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
c)好ましくはRNA基質の生体外での消化によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)試験済みの薬剤と接触した際にPINドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程、
を含む、方法。 - hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
a)好ましくは癌細胞中でhDIS3を生じる突然変異を導入することにより、RNBドメイン中に突然変異を備えたDis3を含む酵母菌株を構築する工程、
b)a)で得られた酵母菌株を、試験済みの薬剤である想定されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
c)試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)野性型Dis3を含む酵母菌ではなく、a)で構築された酵母菌の処理後に選択的な成長遅延または細胞死(合成致死)を引き起こす、DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程、
を含む、方法。 - hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるhDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
a)好ましくは癌細胞中のhDIS3で生じる突然変異を導入することによって、RNBドメイン中に突然変異を有するhDIS3、そのフラグメントまたは変異体を含む、改変した細胞株、好ましくはヒト細胞株を構築する工程、
b)a)で得られた細胞株を、試験済みの薬剤である、想定されるhDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
c)試験済みの薬剤の存在下と不在下でPINドメインの活性を評価する工程、
d)野性型hDIS3を発現する細胞株ではなく、a)で構築された細胞株の処理後に選択的な成長遅延または細胞死(合成致死)を引き起こす、hDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程、
を含む、方法。 - 癌細胞中のhDIS3遺伝子中の突然変異は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病で生じる少なくとも1つの突然変異である、請求項1乃至4に記載の方法。
- 癌細胞中のhDIS3 RNBドメイン中の突然変異は、SEQ ID NO:1に関して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異である、請求項1乃至5に記載の方法。
- hDIS3は、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内のコード配列中に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくはSEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸変化を含んでいる、請求項1乃至6に記載の方法。
- DIS3 PINドメインはSEQ ID NO:1のAA 1−217のhDIS3 PINである、請求項1乃至7に記載の方法。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬であって、治療薬が請求項1乃至8のいずれか1つの方法で得られる、治療薬。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される、治療薬2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオン(AC1LAHYL)、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、SEQ ID NO:1に関して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異を有する癌細胞である、請求項9または10に記載の治療薬。
- hDIS3 RNBドメインはSEQ ID NO:1の配列AA 427−843中に少なくとも1つの突然変異を有するhDIS3 RNBである、請求項9乃至11に記載の治療薬。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、請求項9乃至12の治療薬、または、請求項1乃至8の方法によって得られる治療薬の使用。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、2−ヒドロキシ−(4H)−イソキノリン−1,3−ジオン、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩の使用。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、SEQ ID NO:1に関連して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異を有する癌細胞である、請求項13または14に記載の使用。
- hDIS3 RNB中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される、請求項13乃至15に記載の使用。
- hDIS3は、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内のコード配列に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくは、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸変化を含んでいる、請求項13乃至16に記載の使用。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬を含む組成物であって、治療薬は請求項1乃至8のいずれか1つの方法で得られるか、あるいは請求項9乃至12に記載されるように得られる、組成物。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、SEQ ID NO:1に関連して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異を含む癌細胞である、請求項18に記載の組成物。
- hDIS3 RNB中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される、請求項18または19に記載の組成物。
- 抗癌活性を有する少なくとも1つの追加の薬剤をさらに含み、追加の薬剤は、多発性骨髄腫、髄芽腫、または急性骨髄性白血病に対する抗癌活性を有している、請求項18乃至20に記載の組成物。
- DIS3は、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内のコード配列中に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくは、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸変化を含む、請求項18乃至21に記載の組成物。
- 癌細胞の合成致死を引き起こす方法であって、hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、hDIS3 PINドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する薬剤で処置される、方法。
- hDIS3 PINドメインの活性を阻害する薬剤は、請求項1乃至8の方法によって得られるか、あるいは、請求項9乃至12の治療薬であるか、あるいは、請求項18乃至22の組成物である、請求項23に記載の方法。
- DIS3は、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内のコード配列中に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくは、SEQ ID NO:1のAA 427−843のそのRNBドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸変化を含む、請求項23または24に記載の方法。
- DIS3 PINドメインは、SEQ ID NO:1のAA 1−217のhDIS3 PINである、請求項23乃至25に記載の方法。
- DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法で使用される酵母菌株、好ましくはS.cerevisiae株であって、酵母菌株はDis3 RNBドメイン中の突然変異を含むDIS3を含み、これは癌細胞で見られる突然変異の等価物である、酵母菌株。
- 癌細胞は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫から選択される、請求項27に記載の酵母菌株。
- hDIS3 RNBドメイン中の突然変異は、SEQ ID NO:1に関連して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異である、請求項27または28に記載の酵母菌株。
- Dis3はそのRNBドメイン内のコード配列中に少なくとも1つの突然変異を有し、好ましくはSEQ ID NO:1のAA 427−843のヒトhDIS RNBドメインに相同するそのRNBドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸変化を含み、したがって、こうした突然変異は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫から選択された癌細胞中の突然変異と等価である、請求項27乃至29に記載の酵母菌株。
- DIS3 PINドメインはSEQ ID NO:1のAA 1−217のhDIS3 PINであるか、あるいは、DIS3 PINドメインは(SEQ ID NO:2のAA 1−241)のDIS3 PINである、請求項27乃至30に記載の酵母菌株。
- 該方法は請求項27乃至31で定義される酵母菌株の使用を含む、請求項3に記載の方法。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための請求項27乃至31のいずれか1つの酵母菌株の使用。
- DIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用される細胞株であって、細胞株は癌細胞で見られる突然変異の等価物であるDIS3 RNBドメイン中の突然変異を有するDIS3を含む、細胞株。
- 細胞株は髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫から選択される、請求項34に記載の細胞株。
- 細胞株は、ヒト細胞株、好ましくはHEK293 Flp−In T−Rex細胞株の誘導体である、請求項34または35に記載の細胞株。
- ヒト細胞株は、
−内因性のhDIS3コピーを発現停止させることができるsh−microRNA
−hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞で見られる突然変異に対応する突然変異を有し、かつ、sh−miRNA活性に対する感受性をなくすために再コード化されたフラグメントを含む、外因性のhDIS3変異体、
を発現する双方向に誘導可能なプロモーターを含むベクターの使用により構築される、請求項34乃至36のいずれか1つに記載の細胞株。 - DIS3 RNBドメイン中の突然変異は、SEQ ID NO:1に関して、S477R、G766R、R780K、V504G、A524P、I845V、D487Nから選択された少なくとも1つの突然変異である、請求項34乃至37に記載の細胞株。
- DIS3 RNBはSEQ ID NO:1の配列AA 427−843中の少なくとも1つの突然変異を含むhDIS3 RNBをコード化する、請求項35乃至38に記載の細胞株。
- DIS3 PINドメインはSEQ ID NO:1のAA 1−217のhDIS3 PINである、請求項34乃至39に記載の細胞株。
- 該方法は請求項34乃至40の細胞株の使用を含む、請求項3に記載の方法。
- hDIS3 RNBドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるDIS3 PINドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための請求項34乃至40のいずれか1つの細胞株の使用。
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