JP2016525547A - 神経保護性の二環式化合物ならびに自閉症スペクトラム障害および神経発達障害の治療におけるそれらの使用方法 - Google Patents

神経保護性の二環式化合物ならびに自閉症スペクトラム障害および神経発達障害の治療におけるそれらの使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明の実施形態は、自閉症スペクトラム障害および神経発達障害の症状を治療するための、環状G−2−アリルプロリンおよび他の環状グリシルプロリン化合物を含むジケトピペラジンの治療的使用のための組成物および方法、ならびに錠剤、カプセル剤、液体製剤、ゲル剤、注射溶液、およびそのような状態の治療に有用な他の製剤を含む医薬の製造を提供する。

Description

優先権主張
この国際特許出願は、2013年7月25日に出願され、「Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use in Treating Autism Spectrum Disorders and Neurodevelopmental Disorders」と題された、発明者Lawrence Irwin Glass、Michael John Bickerdike、Michael Fredrick SnapeおよびPatricia Perez de Cogramによる、米国仮特許出願第61/958,329号の優先権を主張する。この仮出願は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
本発明は、ジケトピペラジンと構造的に関連している新規二環式化合物およびそれらの治療的使用のための方法に関する。特に、本発明は、そのような化合物の神経保護活性作用に関する。より詳細には、本発明は、自閉症スペクトラム障害(ASD)、および脆弱性X症候群(FSX)等の神経発達障害(NDD)の治療における、環状グリシル−2−アリルプロリン(「環状G−2−アリルP」または「cG−2−アリルP」または「NNZ2591」)およびその医薬組成物を含む環状グリシルプロリン(「cPG」)およびその類似体の使用に関する。
自閉症スペクトラム障害(ASD)の診断が増加しつつある。ASDは、社会的相互作用およびコミュニケーションにおける異常、限定的な興味、ならびに反復的行動を特徴とする、連鎖性発達障害の総称である。古典的な自閉症または自閉性障害に加えて、the American Psychiatric Association’s (APA) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5)の第5版は、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)をASDとして認識している。
神経発達障害(NDD)は、脆弱性X症候群(FXS)、アンジェルマン症候群、結節性硬化症複合体、フェラン−マクダーモット症候群、レット症候群、CDKL5変異(レット症候群およびX連鎖性乳児スパスム症候群とも関連している)等を含む。すべてではないが多くのNDDは、遺伝子変異によって引き起こされ、そのため、時に単一遺伝子病と称される。一部のNDD患者は、自閉症の行動および症状を呈する。
NDDの例として、脆弱性X症候群は、罹患個体が様々な程度の知的障害者であり、種々の関連精神医学的症状を見せる、X連鎖性遺伝性疾患である。臨床的に、脆弱性X症候群は、知的障害、多動性および注意力の問題、自閉症スペクトラム症状、情緒不安定ならびにてんかんを特徴とする(Hagerman, 1997a)。脆弱性X症候群で見られるてんかんは、最も一般的には小児期において存在するが、その後、成人期に向かって次第に寛解する。多動性は、罹患男性のおよそ80%において存在する(Hagerman, 1997b)。突き出た耳および顎ならびに関節の過伸展性等の身体的特色が高頻度で存在するが、診断に役立つものではない。知的障害は、表現型を定義する最も一般的な特色である。概して、男性は女性よりも重度に罹患する。女性が罹患しないという初期印象は、女性における特定の学習困難および他の神経精神医学的特色の存在の理解に取って代わられた。男性において存在する学習障害は年齢に伴ってより明確になるが、この経時的効果は、明示的な神経変性プロセスよりも発達曲線の平坦化の反映であると見られる。
脆弱性X症候群で見られる脳機能の損壊は、ヒトにおける脳構造の変化に匹敵する。MRIスキャン研究は、脆弱性X症候群が、適合対照において期待されるであろうよりも大きい脳体積に関連すること、およびこの変化がFMRPプロモーター領域におけるトリヌクレオチド拡張と相関することを明らかにする(Jakala et al, 1997)。顕微鏡レベルでは、脆弱性X症候群を持つヒトは、ニューロンの樹枝状構造の異常、特に、異常に多数の未熟な樹状突起棘を示す(Irwin et al., 2000)。
NDDの現在利用可能な治療は、症状の管理に焦点を当てれば対症的であり、かつ補助的であり、集学的アプローチを必要とする。教育的および社会的な技能訓練ならびに療法を早期に実施して、学習遅延および社会的機能障害の核心問題に対処する。特別な学問的、社会的、職業的、および支援サービスが多くの場合必要とされる。薬物療法、心理療法または行動療法が、共起する不安神経症、注意欠陥多動性障害(「ADHD」)、鬱病、攻撃性等の不適応な行動、および睡眠問題の管理に使用され得る。抗てんかん薬を使用して発作を制御してもよい。
本発明者らは、以前に、参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる、2004年8月31日に出願された特許出願公開第2004/02830号において、環状シクロペンチル−G−2−MePおよび環状−G−2−アリルP(「cG−2−アリルP」)を含むがこれらに限定されない環状グリシルプロリン(「cPG」)およびその類似体が、神経保護性および神経再生性であることを示した。ASDもNDDも現在有効な治療はなく、患者ケアは、社会的および行動的介入を主に使用する症状の管理に限定される。本発明者らは、現在、環状G−2−アリルPおよび本明細書で開示されている他の二環式化合物が、ASDおよびNDDの治療において、特に、異常な社会的行動を正常化するために有効となり得ることを発見している。
本発明者らは、予想外にも、cG−2−アリルPが、脆弱性X症候群(「FXS」)または他のASDを有する動物における、不安神経症、多動性、記憶、学習ならびに種に典型的な異常な社会的行動および反復的行動に、着実な治療効果を有することを発見した。加えて、本発明者らは、cG−2−アリルPで治療したfmr1−ノックアウト動物におけるERK1/2およびAktリン酸化の変化が、ASDのin vitro診断的評価を提供し、脆弱性X症候群の表現型が変性mGIuR発現の結果であるという仮説を裏付けることを見出した。その上、cG−2−アリルPの投与は、fmr1−ノックアウトマウスにおけるニューロンの棘の数を有意に低減させた。
本明細書で開示されているin vivo研究に使用されるfmr1−ノックアウト動物は、脆弱性X症候群を持つヒトと同じ遺伝子変異を有するため、cG−2−アリルPを含む本発明の環状グリシルプロリン(「cGP」)化合物の投与は、ヒトにおける自閉症スペクトラム障害、神経発達障害および脆弱性X症候群の症状を治療するのに有用となり得る。加えて、本発明者らは予想外にも、本発明のcGPが、ASDを持つ動物における有害な社会的行動および反復的行動を有効に治療し、故に、より正常な社会的相互作用を回復できることを見出した。
故に、本発明の一態様は、後述する構造式および置換基を有する新規環式化合物を提供する。
Figure 2016525547
式1
いくつかの態様では、式1の化合物は、
1が、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
2が、CH2、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
1、R2、R3、R4およびR5が、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、またはR4およびR5は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であるか、またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であり、但し、R1=メチルであり、R2=R3=R4=Hである場合、R5はベンジルではなく、R1=Hである場合、R2およびR3の少なくとも一方はHではない、置換基を含む。
さらなる態様では、本発明は、R1=アリル、R2=R3=R4=R5=H、X1=NH、X2=CH2である式1の化合物(環状グリシル−2−アリルプロリン)または薬学的に許容されるその塩、立体異性体もしくは水和物を提供する。
また他の態様では、本発明は、薬学的に許容される賦形剤および治療有効量の環状G−2アリルPを含む、医薬組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、認知機能障害を有する動物を治療する方法であって、該動物に有効量の環状G−2−アリルPを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。またさらなる態様では、治療される動物はヒトである。
本発明を、その具体的な実施形態を参照して記述する。本発明の他の態様は、図面を参照して理解することができる。
スコポラミン処置後のモリス水迷路試験(MWMT:Morris Water Maze Test)の、習得期(1〜4日目)における動作に対する環状G−2−アリルPによる処置の効果を示すグラフである。 MWMTのプローブ試験(5日目)におけるプラットフォーム象限潜時に対する環状G−2−アリルPによる処置の効果を示すグラフである。 3つの群:(1)ビヒクル処置、(2)スコポラミンおよびcG−2−アリルP−処置ならびに(3)スコポラミン処置した動物の習得期の4日目に、プラットフォームを見つけるのに要した時間を示すグラフである。 処置後25日目のプローブ試験中に、見慣れた物体を探索するのに費やした時間と新規物体を探索するのに費やした時間との差異を示すグラフである。見慣れた物体のデータ点は、3つの見慣れた物体の探索に費やした時間の平均を反映している。新規物体認識のデータ点は、新規物体を探索するのに費やした実時間である。 24日目のNORTの試験期における、海馬のCA1領域のAMPAグルタミン酸受容体−1染色と、新規物体の調査に費やした時間と見慣れた物体の調査に費やした時間との比との間の相互関係を示すグラフである。 ビヒクル(veh)と比較した、6日目および24日目のCA1顆粒細胞層中におけるAMPA GluRlの密度に対するcG−2−アリルP(t)の効果を示すグラフである。 処置後24日目のCA1多形細胞層中におけるAMPA GluR1の密度に対するcG−2−アリルP(t)の効果を示すグラフである。 処置後24日目の海馬のCA3領域におけるシナプス前染色の密度を増大させる傾向に対するcG−2−アリルPの効果を示すグラフである。 処置後24日目のCA1領域の多形細胞層におけるシナプス前染色の密度を増大させる傾向に対するcG−2−アリルPの効果を示すグラフである。 処置後24日目のCA1領域の放線状層におけるシナプス前染色の密度を増大させるcG−2−アリルPの効果を示すグラフである。 CA1およびCA3におけるNMDAR−1の密度に対するcG−2−アリルP処置の効果を示すグラフである。 海馬のCA1−2におけるKrox24染色の密度に対するcG−2−アリルPの効果を示すグラフである。 中齢期ラット(各群中n=2)の海馬の小領域CA3およびCA1における、シナプス後密度を並置する200nm2正方形内のビヒクルの数に対するcG−2−アリルPの効果を示すグラフである。 興奮毒性酸化ストレス後の動物におけるニューロンの生存に対する環状G−2−アリルPの効果を示すグラフである。 興奮毒性酸化ストレス後の動物におけるニューロンの生存に対する環状シクロペンチルG−2−MePの効果を示すグラフである。 全脳虚血に供した動物における環状G−2−アリルPの神経保護効果を示すグラフである。 全脳虚血に供した動物における神経防護作用に対する異なる用量の環状G−2−アリルPの効果を示すグラフである。 海馬ニューロンのin vitro研究に使用したチャンバーを描写する図である。 培養液中で17日後の海馬ニューロンの写真を描写する図である。 GFP標識Fmr1ノックアウト海馬ニューロンを描写する図である。 cG−2−2アリルPで処置したFmr1ノックアウトマウス由来の海馬ニューロンの写真を描写する図である。 本発明のcG−2−アリルPの効果を試験するのに使用したオープンフィールド試験デバイスの写真を描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1ノックアウト動物の、オープンフィールド試験に費やした時間T1のグラフを描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物の、オープンフィールド試験における短期記憶(short−tem memory)の結果のグラフを描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物の、オープンフィールド試験における長期記憶(long−tem memory)の結果のグラフを描写する図である。 ビヒクルで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物における連続路地試験(Successive Alleys Test)の結果のグラフを描写する図である。 cG−2−アリルPで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物における連続路地試験の結果のグラフを描写する図である。 野生型マウスおよびfmr1−ノックアウトマウスにおける本発明のcG−2−アリルPの効果の研究において使用した、高架式十字迷路の写真を描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物における高架式十字迷路の閉じたアーム試験の結果のグラフを描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物における高架式十字迷路の開いたアーム試験の結果のグラフを描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物における高架式十字迷路センター試験の結果のグラフを描写する図である。 野生型およびfmr1−ノックアウトマウスにおける恐怖条件付けに対するcG−2−アリルPの効果を研究するのに使用したデバイスの写真を描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物における恐怖条件付け試験の結果のグラフを描写する図である。 野生型マウスおよびfmr1−ノックアウトマウスにおける営巣行動に対するcG−2−アリルPの評価効果を研究するために使用した営巣スコアの写真を描写する図である。図29Aは1のスコアを描写し、図29Bは2のスコアを描写し、図29Cは3のスコアを描写し、図20Dは4のスコアを描写し、図29Eは5のスコアを描写している。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物における社交性試験の結果のグラフを描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物におけるpERKの発現レベルの結果のグラフを描写する図である。 ビヒクルまたはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型動物およびfmr1−ノックアウト動物におけるpAKTの発現レベルの結果のグラフを描写する図である。 炎症性メディエーターインターロイキン1−ベータ(「IL1−ベータ」)およびインターロイキン6(「IL−6」)の発現に対するPBBIおよびcG−2−アリルPの効果の結果のグラフを描写する図である。図33A〜33CはIL1−ベータについての結果を描写し、図33D〜33FはIL−6についての結果を描写している。 BAXおよびBCL−2の発現に対するPBBIおよびcG−2−アリルPの効果の結果のグラフを描写する図である。図34A〜34CはBAX発現についての結果を描写している。図34D〜34HはBCL2発現についての結果を描写している。 3つの異なる時点におけるATF3の発現に対するPBBIおよびcG−2−アリルPの効果の結果のグラフを描写する図である。 神経可塑性に関連する数種の遺伝子マーカーの発現に対するPBBIおよびcG−2−アリルPの効果の結果のグラフを描写する図である。
定義
「アルケニル」は、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和分枝鎖、直鎖または環状炭化水素ラジカルを指す。ラジカルは、二重結合の周囲でシスまたはトランス配座のいずれであってもよい。例示的なアルケニル基は、アリル、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、シクロペンテニル等を含む。いくつかの実施形態では、アルケニル基は(C2−C6)アルケニルであり、他の実施形態では、アリルは特に有用となり得る。
「アルキル」は、飽和分枝鎖、直鎖または環状炭化水素ラジカルを指す。例示的なアルキル基は、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、tert−ブチル、シクロプロピルメチル、ヘキシル等を含む。いくつかの実施形態では、アルキル基は(C1−C6)アルキルである。
「アルキニル」は、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和分枝鎖、直鎖または環状炭化水素ラジカルを指す。例示的なアルキニル基は、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル等を含む。いくつかの実施形態では、アルキニル基は(C2−C6)アルキニルである。
「アリール」は、コンジュゲートしたπ電子系を持つ不飽和環状炭化水素ラジカルを指す。例示的なアリール基は、フェニル、ナフチル等を含む。いくつかの実施形態では、アリール基は(C5−C20)アリールである。
「アリールアルキル」は、末端炭素と結合している水素原子の1個がアリール基で置きかえられている、直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。例示的なアリールアルキル基は、ベンジル、ナフチルメチル、ベンジリデン等を含む。
認知機能障害は、ASD、NDD、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症および他の障害を有する患者、ならびにヒトを含む老齢動物において観察され得る。
「含む(Comprising)」および「含む(Comprises)」は、記載されている要素を含むがこれらに限定されないことを意味する。
「増殖因子」は、細胞上の受容体と相互作用することによって細胞を刺激して成長または増殖させる、細胞外で活性なポリペプチドを指す。
「ヘテロアルキル」は、1個または複数の炭素原子が、N、P、O、S等の別の原子で置きかえられている、アルキル部分を指す。例示的なヘテロアルキル基は、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、テトラヒドロフラン、(C1−C10)置換アミン、(C2−C6)チオエーテル等を含む。
「ヘテロアリール」は、1個または複数の炭素原子が、N、P、O、S等の別の原子で置きかえられている、アリール部分を指す。例示的なヘテロアリール基は、カルバゾール、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、イソキノリン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピロール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール等を含む。
「傷害」は、神経系における細胞の変性、機能不全または死亡をもたらす、動物のあらゆる急性または慢性損傷を含む。そのような細胞は、神経細胞および非神経細胞を含む。傷害は、脳卒中、非出血性脳卒中、外傷性脳損傷;剥離、脊髄閉塞後等の胎児仮死に関連するまたは子宮内発育遅延に関連する周産期仮死;適正な蘇生または呼吸の失敗に関連する周産期仮死;ニアミスドローニング(near miss drowning)、ニアミス乳幼児突然死、一酸化炭素吸入、アンモニアまたは他のガス中毒に関連する重篤なCNS外傷;心停止、昏睡、髄膜炎、低血糖、てんかん重積症;冠動脈バイパス形成手術、低血圧エピソードおよび高血圧性クリーゼに関連する脳の仮死のエピソード;ならびに脳外傷を含む。上記の例は単なる例証としてのものであり、本発明の化合物および方法によって治療できる傷害の完全な一覧であることを意図するものではないことを理解されたい。
「薬学的に許容される賦形剤」は、概して安全、非毒性かつ望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を指し、獣医学への使用およびヒトへの薬学的使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合はガス状であってよい。
「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、所望の薬理学的特性を有する塩を指す。そのような塩は、化合物中に存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応することができる場合に形成され得る塩を含む。好適な無機塩は、アルカリ金属、例えば、ナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウムならびにアルミニウムと形成されたものを含む。好適な有機塩は、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N−メチルグルカミン等の有機塩基と形成されたものを含む。そのような塩は、無機酸(例えば、塩酸および臭化水素酸)および有機酸(例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびに、メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸等のアルカン−およびアレーン−スルホン酸)と形成された酸付加塩も含む。2つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩は一酸一塩または二酸塩であってよく;同様に、2つを超える酸性基が存在する場合、そのような基のいくつかまたはすべては、塩として存在し得る。
「保護基」は、有機合成においてそれに慣例的に関連する意味を有する、すなわち、化学反応を別の保護されていない反応部位上で選択的に行うことができるように、かつ選択的反応が完了した後に基を容易に除去できるように、多官能化合物中の1つまたは複数の反応部位を選択的にブロックする基である。
「立体異性体」は、環状G−2−アリルプロリンの構造を有するが、キラル中心を有さない分子である。用語「環状G−2−アリルプロリン」は、すべての立体異性体を含む。
「置換されている」は、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルラジカル上の水素原子の1個または複数が、別の置換基で独立に置きかえられている場合を指す。置換基は、−R’、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、−NR’−C(NR’)−OR’、−NR’−C(NR’)−SR’、NR’−C(NR’)−NR’R’、トリハロメチルおよびハロゲンを含み、ここで各R’は、独立に、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである。
「症状(Symptom)」または「症状(symptoms)」は、認知機能障害または認知機能不全、記憶喪失の1つまたは複数の兆候または症状、空間位置感覚の喪失、学習能力の減少、短期または長期記憶を形成する能力の減少、エピソード記憶の減少、記憶を統合する能力の減少、空間記憶の減少、シナプス形成の減少、シナプス安定性の減少、実行能力の欠損、認知マッピングおよび場面記憶の欠損、発言および関係記憶の欠損、配置的または接続的な関係の迅速な習得の減少(decreased rapid acquisition of configural or conjunctive associations)、具体的事象の文脈固有のコード化および想起の減少(decreased context−specific encoding and retrieval of specific events)、エピソードおよび/またはエピソード様記憶の減少、不安神経症、異常な恐怖条件付け、異常な社会的行動、反復的行動、異常な夜行性行動、発作活動、異常な運動、ホスホ−ERK1/2およびホスホ−Aktの異常発現ならびに徐脈の1つまたは複数を意味する。
「治療有効量」は、疾患を治療するために動物に投与された際に、疾患または傷害のための治療を達成するのに十分な量を意味する。「治療有効量」は、有害な症状もしくは所見を減少させ、望ましい症状もしくは所見を促進し、かつ/または根本となる障害を治療し、ならびに/あるいは治癒的である量を意味する。
「治療すること」または疾患の「治療」は、疾患にかかりやすいが疾患の症状を未だ経験しておらず呈してもいない動物において疾患が発生するのを予防すること(予防的治療)、疾患を阻害すること(その発症を減速させるまたは停止させること)、疾患の症状または副作用の軽減を提供すること(緩和的治療を含む)、および疾患を軽減させること(疾患の退行を引き起こすこと)を含む。
潜在的な水素原子(ピロール環上の水素等)は、明確化のために式から省略されているが、存在すると理解すべきである。
「ATF3」は、活性化転写因子3を意味する。
「BAX」は、bcl−2様タンパク質としても公知のアポトーシス調節剤BAXを意味する。
「BLC2アルファ」は、B−細胞リンパ腫−2を意味する。
「IL1−ベータ」は、インターロイキン1−ベータを意味する。
「IL−6」は、インターロイキン−6を意味する。
「BDNF」は、脳由来神経向性因子を意味する。
「Cdh2」は、カドヘリン−2を意味する。
「Cebpb」は、CCAAT/増強剤−結合タンパク質ベータを意味する。
「Crem」は、環状AMP応答エレメント結合を意味する。
「Egr1」は、初期増殖応答タンパク質1を意味する。
「Gria4」は、グルタミン酸受容体向イオン性AMPA4を意味する。
「Grm5」は、向代謝性グルタミン酸受容体5を意味する。
「Mapk1」は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ1を意味する。
「MeCP2」は、メチルcPg結合タンパク質2を意味する。
「Nr4a1」は、神経成長因子1Bとしても公知の核内受容体サブファミリー4群Aメンバー1を意味する。
「Ntf3」は、ニューロトロフィン3を意味する。
「Ntf4」は、ニューロトロフィン4を意味する。
「Pcdh8」は、プロトカドヘリン−8を意味する。
「Plm1」は、プレmRNA漏出タンパク質1を意味する。
「Ppp3cα」は、タンパク質ホスファターゼ3、触媒サブユニット、アルファを意味する。
「Tnf」は、腫瘍壊死因子を意味する。
自閉症スペクトラム障害
自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的相互作用およびコミュニケーションにおける異常、限定的な興味、ならびに反復的行動を特徴とする、連鎖性発達障害の総称である。古典的な自閉症または自閉性障害に加えて、the American Psychiatric Association's (APA) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5)の第5版は、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)をASDとして認識している。
神経発達障害(NDD)は、脆弱性X症候群(FXS)、アンジェルマン症候群、結節性硬化症複合体、フェラン−マクダーモット症候群、レット症候群、CDKL5変異(レット症候群およびX連鎖性乳児スパスム症候群とも関連している)等を含む。すべてではないが多くのNDDは、遺伝子変異によって引き起こされ、そのため、時に単一遺伝子病と称される。一部のNDD患者は、自閉症の行動および症状を呈する。
ASDおよびNDDを評価するための臨床的ツール
ASDおよびNDDは、1つまたは複数の臨床試験、例えば、レット症候群の自然歴/臨床的重症度尺度、異常行動チェックリスト地域版(ABC)、異常行動チェックリスト(常同症)、バインランド、重症度の臨床全般印象(CGI−S)、介護負担感アンケート(CSQ)、小児のエール・ブラウン強迫観念・強迫行為尺度(CYBOCS−PDD)、小児自閉症評定尺度、反復的行動のインタビュー、ニソンガー小児行動評定尺度、広汎性発達障害行動一覧、常同行動尺度、反復的行動尺度、ロッサゴ尺度、反復的行動アンケート、および常同行動尺度、または脳波図(EEG)スパイク頻度、EEGの周波数バンド内の総電力、手の動き、QTcおよび心拍変動(HRV)、ならびに不規則呼吸からなる群から選択される1つまたは複数の生理学的試験を使用して、前記障害に罹患していない対照動物と比較して評価することができる。これらのツールのいくつかの信頼性および関連性を以下の表1に示す。
この項において使用される場合、用語「適切な」は、すべての関連カテゴリーについて利用可能な情報を用いて良好〜優れた信頼性および妥当性を伴う臨床的に意義のある転帰を測定するツールを意味する。用語「条件付きで適切な」は、「ある特定の下位尺度のみが関連する臨床的に意義のある転帰」を測定する、または「若年層にのみ意義がある」ものであってもいいツールを意味する。用語「有望な」および「潜在的に適切な」は、「新たに出現した、または一貫性のない信頼性および妥当性(例えば、良好〜優れた信頼性/妥当性)を有するが、データはすべてのカテゴリーにおいて利用可能なわけではなく、少なくとも2つがすべてのカテゴリーにおいて適正である、臨床的に意義のある転帰」を測定するツールを意味する。
Figure 2016525547
不安神経症は、不安神経症、鬱病および気分尺度(ADAMS)、小児および青年の症状一覧(CASI)、小児行動チェックリスト(CBCL)、小児のための多次元不安神経症尺度(MASC)、小児自閉症評定尺度(PARS)、改訂小児不安神経症および鬱病尺度(RCAD)、小児不安神経症関連障害のスクリーニング(SCARED)、ニソンガー小児行動評定尺度および不安神経症診断インタビュー尺度(ADIS)を含む1つまたは複数の手段を使用して評価することができる。これらのツールのいくつかの信頼性および関連性を以下の表2に提示する。
Figure 2016525547
ASDおよびNDDにおける不安神経症を評価するための潜在的に適切な臨床的ツールを以下の表3に示す。
Figure 2016525547
社会的コミュニケーションは、臨床的ツール、例えば、ABAS−IIドメインスコア、異常行動チェックリスト(ABC)−無気力/社会的離脱、ADI−R、自閉症診断観察尺度−汎用版(ADOS−G)−新たな重症度スコア、自閉症衝撃測定(Autism Impact Measure)、自閉症スペクトラム評定尺度、自閉症治療評価チェックリスト(ATEC)、ボールトスゲーム(Ball Toss Game)、行動評価尺度(BAS)、小児のための行動評価システム第2版BASC−2(社会に関連する下位尺度)、実行能力の行動評定一覧、小児版カリフォルニア言語学習検査(VLT−C)および修正されたVLT−C(MVLT−C)、介護者−小児の対話、Jahromi 2009、CGI、小児自閉症評定尺度(CARS)、小児の社会的行動アンケート、言語の基礎の臨床評価(CELF−3および4)−語用論プロファイル、コミュニケーションおよび象徴的行動尺度(CSBS)、情動的発話タスクの理解、一般的信頼感尺度、ギリアム自閉症評定尺度(GARS)、ESCSからの共同注意測定(JAMES)、レッツフェイスイット(Let’s Face It!)、自発的表現言語の観測的評価(OSEL)、親アンケート、Nagaraj et al. 2006、親の評定アンケート、Chan et al, 2009、広汎性発達障害行動一覧(PDD−BI)(利用可能な縮約版:PDD−BI−スクリーニング版)、成人用の映像における読心術、小児用の映像における読心術、成人用の目から心を読むタスク改訂版(RMET−R;Reading the Mind in the Eyes Task−Revised)、小児用の目から心を読むタスク改訂版(RMET−R)、成人用の声における読心術、社会的コミュニケーションアンケート(SCQ)、社会的反応性尺度、社会的技能改善システム(SSiS)、心の理論試験、ならびにVABS−社会化およびコミュニケーションを使用して評価することができる。
社会的コミュニケーションを評価するために使用されるツールの中で、下記のものが「条件付きで適切な」ものとみなされる:異常行動チェックリスト(ABC):無気力/社会的離脱下位尺度、BASC−2:社会的技能、離脱、機能的下位尺度、CSBS、ESCS、JAMES、SSiS、バインランド適応行動尺度社会化およびコミュニケーション下位尺度。「潜在的に適切な」ものであるとみなされるツールは、ABAS−II:概念および社会的ドメイン、ADGS重症度スコア、自閉症スペクトラム評定尺度:社会的コミュニケーション、CSBQ:理解下位尺度、ならびにPDD−BIを含む。
自閉症
古典的な自閉症は、非常に多様性がある神経発達障害である。これは、典型的には乳児期または幼児期の間に診断され、明白な症状は多くの場合生後6か月から明らかになり、2〜3歳までに確立される。DSM−5において定められた基準によれば、自閉症の診断は、(a)社会的相互作用における機能障害、(b)コミュニケーションにおける機能障害ならびに(c)限定的な興味および反復的興味および行動を含む、存在する3つの症状を必要とする。非常同摂食等の他の機能不全も一般的であるが、診断に必須ではない。これらの機能障害のうち、社会的相互作用機能障害が診断に特に重要であり、自閉症と診断するには下記の機能障害のうち2つが存在していなくてはならない:
(i)社会的相互作用を調節するための複数の非言語行動(例えば、アイコンタクト)の使用における機能障害;
(ii)発達レベルに適切な仲間関係を発展させることの失敗;
(iii)楽しみ、興味または成就を共有しようと自発的に求めることの欠如;
(iv)社会的または感情的相互依存の欠如。
自閉症におけるコミュニケーション機能障害は、下記の方式の1つまたは複数で現れ得る:話し言葉の発達における遅延(その完全な欠如);会話を開始するもしくは持続する能力における著しい機能障害;言語の常同および反復的使用;ならびに/または自発的な空想遊びの欠如。強度が異常とみなされる1つもしくは複数の興味への執着、日常行為または慣習行為の柔軟性のない順守、反復的運動マンネリズムおよび/または物体の部分に対する持続的な集中等、限定的、反復的および常同的な行動のパターンも診断に必要とされる。
最後に、自閉症と診断するには、3歳未満に、少なくとも1つの分野(すなわち、社会的相互作用、言語、または創作遊び)の機能における機能障害が発病することを要件とする。
アスペルガー症候群
アスペルガー症候群は自閉症と同様であり、ある特定の特色を共有する。自閉症のように、アスペルガー症候群も社会的相互作用における機能障害を特徴とし、これに、限定的な興味および反復的興味および行動が付随する。故に、アスペルガー症候群の診断は、自閉症と同じ3つの機能障害を特徴とする。しかしながら、これは、言語または認知発達において一般的遅延を有さず、対象の環境において興味の欠損を有さないことにより、他のASDとは異なる。その上、アスペルガー症候群は、典型的には、古典的な自閉症よりも症候学における重症度が低く、アスペルガー患者は自活が可能であり、比較的正常な生活を送ることができる。
小児期崩壊性障害
ヘラー症候群としても公知の小児期崩壊性障害(CDD)は、小児が通常2〜4歳になるまでに発症するが(すなわち、自閉症およびレット症候群よりも遅い)、それに続き社会的、コミュニケーションおよび他の技能の重度の喪失を示す状態のことである。小児期崩壊性障害は自閉症によく似ており、いずれも、正常な発達、それに続き言語、社会的遊びおよび運動技能の有意な喪失を伴う。しかしながら、小児期崩壊性障害は、典型的には自閉症よりも遅く発生し、技能のより劇的な喪失を伴い、はるかにまれである。
CDDの診断は、下記の分野:言語、社会的技能、遊び、運動技能(歩く、登る、握る等の能力における劇的な降下等)、腸または膀胱の制御(以前にトイレトレーニングされているにもかかわらず)の2つ以上における以前に習得された技能の劇的な喪失によって決まる。発達性技能の喪失は、突然、数日〜数週間にわたって起こり得、またはより段階的であり得る。
特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)
特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)は、他の明確に定義されたASDに関連する症状のすべてではないがいくつかを呈する患者について表すASDである。ASDの診断の主要な基準は、他人と交流する困難、反復的行動、およびある特定の刺激に対する感受性の高まりを含む。これらはいずれも、上述したASDにおいて見られ得る。しかしながら、自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群およびCDDは、いずれもそれらの特異的診断を可能にする他の特色を有する。これらの4つの診断のうち1つの特異的診断を行うことができないが、ASDが明らかである場合、PDD−NOSの診断が行われる。そのような診断は、スペクトラムにおける他の状態に適用可能であるよりも遅い年齢で開始する症状に起因し得る。
レット症候群
レット症候群(RTT)は、ほぼ女性だけを侵す神経発達障害である(生児出生10000人に1人)。最近まで、RTTは、自閉症スペクトラム障害として分類されていた(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition - Revised (DSM-IV-R))。米国では、現在およそ16,000人の患者がRTTに罹患している(Rett Syndrome Research Trust data)。レット症候群の診断では、下記の症状が特徴的である:生後6〜18か月からの発達障害;生後3か月〜4歳の間に開始する頭部成長速度の減速;重度の言語障害;反復的および常同的な手の動き;ならびに歩行異常、例えば、つま先歩行または不安定な強直性歩行。加えて、レット症候群の診断に役立ち得る若干数の補助基準があるが、診断に必須ではない。これらは、呼吸困難、EEG異常、発作、筋硬直および痙直、脊柱側彎症(脊椎の湾曲)、歯ぎしり、身長に比べ小さな手および足、発育遅延、体脂肪および筋肉量の減少、異常な睡眠パターン、短気または興奮、咀嚼および/または嚥下困難、循環不良ならびに便秘を含む。
RTTの発病は、通常、生後6〜8か月の間に始まり、発達および成長速度の減速を伴う。これに続いて、退行段階(1〜4歳の小児に典型的)、擬定常段階(2〜10歳)およびその後の進行性末期運動悪化状態が起こる。RTT症状は、言語、および常同的動きによって置きかえられる目的を持った手の動きを含む運動技能における成長の突然の減速および退行、自閉症の特色、パニック様発作、睡眠周期障害、振戦、発作、呼吸機能不全(エピソード性無呼吸、過呼吸)、失行、ジストニア、ジスキネジー、低血圧症、進行性後彎症または脊柱側彎症および重度の認知機能障害を含む。ほとんどのRTT患者は、重度の障害を伴って成人期まで生存し、24時間のケアを必要とする。
RTTの85%〜95%の間の症例は、Mecp2遺伝子(Amir et al. 1999. Nat Genet 23: 185-188; Rett Syndrome Research Trust)−メチル−CpG−結合タンパク質2(MeCP2)をコードする遺伝子の変異によって引き起こされると報告されている。Mecp2はX−染色体(位置Xq28)に位置し、この理由で、男性の遺伝子への変異は通常致死的である。RTTは遺伝性疾患であるが、報告されている症例の1%未満が遺伝性であり、Mecp2のほぼすべての変異はde novoで発生し、3分の2は、3番目および4番目のエクソン上にある8CpGジヌクレオチド(R106、R133、T158、R168、R255、R270、R294およびR306)における変異によって引き起こされる。
MeCP2は、メチル化CpGジヌクレオチドを結合して、CNSにおいてDNAの転写サイレンシングを発揮するタンパク質である。MeCP2の低減または非存在の主要な効果は、樹状突起棘発達の機能障害およびシナプスの形成であると思われる。MeCP2発現は、脳成熟と時間的に相関していると思われ、なぜ症状が典型的には生後18か月前後で出現するかを説明している。
ASDに一般的な特色を提示する
ASDをまとめると、5つすべての形態の中で症状を提示する共通性があることは明瞭である。これらの一般的な特色は、正常な社会的能力における機能障害および反復的行動である。アスペルガー症候群を除くすべてにおいて、言語技能の不足として最も一般的に現れる知能発達遅延の一貫した提示もある。年齢の正常なパラメータに対する認知損失は、自閉症、レット症候群、CDDおよびPDD−NOSにおいて、多くの場合かなり著しい。
ASDの遺伝モデル
妥当性を提供するために、ASDの動物モデルは、臨床状態と同様の症状を実証し、それらの症状の病因に関して合理的な程度の表面的妥当性を有さなくてはならない。古典的な自閉症は、多くの異なる遺伝的機能障害によって引き起こされ得、自閉症症例の数パーセントを超えて占める単一の遺伝的欠陥はないと考えられていることが公知である。実際に、最近の研究は、まれな遺伝性の遺伝的欠陥に加えて、ASDの根本となると考えられる染色体位置の多数のde novo構造の多様性を明らかにした(Marshall et al, 2008; Sebat et al, 2007)。故に、1p、5q、7q、15q、16p、17pおよびXqを含む20以上の主要な部位における遺伝子配列のコピー数の多様性(CNV)、転座および反転が、ASD遺伝子座としてマッピングされている。
しかしながら、ASDの根本となる多起源のバックグラウンドおよび病因の複雑性にもかかわらず、ある特定の遺伝的欠陥はASDを生成できることが公知である。最もよく特徴付けられている欠陥のいくつかは、ニューロリジン−3(NLGN3)、ニューロリジン−4(NLGN4)、ニューレキシン−1α(NRXN1)およびシャンク3を含むシナプス後密度タンパク質のクラスターをコードする遺伝子の染色体異常から生じる(Sebat et al, 2007)。
NLGN3およびNLGN4は、グルタミン酸作動性シナプス中に存在するシナプス後細胞接着分子である。これらは、シナプス後部位とのシナプス前接触を適合させるという役割を果たし、シナプス後足場タンパク質シャンク3とも相互作用する。NLGN3およびNLGN4への変異は、ASD集団において観察されており、すべてのASD症例のおそらく1%を占める(Lintas & Persico, 2008)。Jamainおよび共同研究者は、最初に、アスペルガー症候群および古典的な自閉症をそれぞれもたらす、2人の血縁関係がない対象におけるNLGN3へのミスセンスおよびNLGN4へのフレームシフトを報告した(Jamain et al, 2003)。ASD集団におけるNLGN3またはNLGN4変異の発生率は確かに低いが(実際に、カナダでの研究における96人のASD患者の研究では、そのような変異は観察されなかった;Gauthier et al, 2005)、前臨床研究では、ニューロリジン変異が、自閉症の症状のモデルを実際に生成できることが確認された。故に、臨床的に報告されている、マウスへのNLGN3に対する同じR451Cミスセンスの導入することは、社会的相互作用の低減および阻害シナプス伝達の増強を示す変異マウス株をもたらす(Tabuchi et al, 2007)。
このようにして得られたR451C変異マウスは、NLGN3変異に基づくASDのモデルの代表である。この事例では、NLGN3のR451位における変異は、「機能獲得」変異をもたらす。
対照的に、マウスにおけるNLGN4の臨床変異をモデリングすることは、NLGN4の「機能喪失」変異によって実現される(古典的なノックアウトモデル)。このモデルでは、変異マウスは、社会的相互作用欠陥および超音波発声の低減を見せる(Jamain et al, 2008)。コミュニケーション欠陥は臨床的ASDの中核をなし、NLGN4ノックアウトマウスにおいて、野生型雌対応群に曝露した雄マウスの超音波発声における低減は、ASDのモデルとしての株の表面的妥当性を裏付ける。
シナプス前ニューレキシンタンパク質は、シナプス後ニューロリジン対応群との相互作用を介して、並置した樹状突起におけるシナプス後分化を誘導する。ニューレキシン−1α(NRXN1)遺伝子の変異は、多数の研究において報告されており(Sebat et al, 2007; Marshall et al, 2008; Kim et al, 2008; Yan et al, 2008)、これらは、コピー数のバリアントの形態で観察された。NLGN変異と同様に、NRXN1遺伝子の変異がマウスに(遺伝子ノックアウトの形態で)導入されると、ある特定のASD様特色を持つ変異体株が生成される(Etherton et al, 2009)。これらのNRX1ノックアウトマウスは、海馬小型模型興奮性シナプス後電流(mEPSC)周波数の減少および誘起電流の入力出力関係の減少を示す。これらの電気生理学的効果は、海馬における興奮性伝達の減少に関連する。興奮性神経伝達の減少に加えて、NRXN1ノックアウトマウスは、プレパルス抑制における減少を呈するが、社会的行動は影響を受けていないように思われる(Etherton et al, 2009)。
ニューレキシン−NLGNトランス−シナプス構築物とある特定の特色を共有し、細胞接着分子1(CADM1)は、シナプストランス−細胞接着活性にも関与するシナプス前および後の両方に存在する免疫グロブリンファミリータンパク質である(Biederer et al, 2002)。CADM1遺伝子への変異は、ASD患者において検出されており、これらの状態のさらなる考えられる原因を表すと思われる(Zhiling et al, 2008)。
CADM1ノックアウトマウスの分析は、これらの動物が、不安神経症に関連する行動の増加、社会的相互作用の障害ならびに社会的記憶および認識の障害を示すことを明らかにする。加えて、CADM1ノックアウトマウスは、より劣った運動技能を実証する(Takayanagi et al, 2010)。これらの機能不全は、ここでもASD症候学と一致している。
22q13欠失症候群(フェラン−マクダーモット症候群としても公知である)は、第22染色体のq13.3末端における微小欠失によって引き起こされるまれな遺伝性疾患である。この微小欠失は、典型的な遺伝的スクリーニングによって覆われていないことはまれであり、蛍光in situハイブリダイゼーション試験が診断を確認するために推奨される。最近の研究は、症候群が、正常なニューロンの機能のために重大なシナプス後密度タンパク質をコードする遺伝子シャンク3におけるエラーによって引き起こされることを示している。興味深いことに、この遺伝子におけるエラーはASDとも関連しており、22q13欠失症候群は一般的にASD診断につながり得る(Durand et al, 2007; Moessner et al, 2007; Sykes et al, 2009)。22q13欠失症候群とASDの結果的診断との密接な関連を考慮して、この変異の変異マウスモデルが開発された。
シャンク3ノックアウトマウスは、超音波発声の低減(すなわち、社会的コミュニケーションの減退)およびマウス間での社会的相互作用時間の減少を含むASD症状に酷似した数種の欠損を呈する。加えて、これらのマウスは、誘起電流と長期相乗作用(LTP:long−term potentiation)の減少との入力出力関係によって測定された、海馬CA1興奮性伝達も減少している。LTPは、記憶形成および強化の根本となる生理学的プロセスであると考えられている。故にモデルは、ASDと一致する、NLGN4ノックアウトと同様の表現型を呈する。
言及したとおり、22q13欠失症候群自体は非常にまれである。しかしながら、これは、特定の遺伝子の関与がASDの病因において決定的な役割を有し得るという重要な情報を提供する。シャンク3に加えて、この障害は、ASDにおけるさらなる考えられる遺伝子欠陥を明らかにする。50のまたは記述されている22q13欠失症候群のそのような症例のうち、1つを除いてすべてが、シャンク3を超えて伸びてIslet Brain−2遺伝子(IB2)として公知のさらなる遺伝子を含む、遺伝子欠失を有する(Sebat et al, 2007)。IB2タンパク質は、MAPキナーゼおよびアミロイド前駆体タンパク質を含む多くの他のタンパク質と相互作用し、神経突起におけるタンパク質輸送に影響を与えるように思われ、シナプス後密度において濃縮される(Giza et al, 2010)。タンパク質を欠いているマウス(IB2−/−ノックアウトマウス)は、社会的相互作用の減少(社会的臭い嗅ぎ行動および相互作用時間の低減)、探査行動の低減ならびに認知および運動欠損を呈する(Giza et al, 2010)。この行動的表現型は、小脳細胞における興奮性伝達の低減と関連していた。したがって、シャンク3ノックアウトと同様に、IB2変異の表現型もASDと一致する。
上述したシナプス後密度タンパク質欠損の動物モデルに加えて、ASDとともに自閉症につながり得る種々の特色を共有する他の単一遺伝子症候群が、ASDの薬物標的化のもう1つの手段を提供する。
最近、脆弱性X症候群は、神経発達障害(NDD)と呼ばれる障害の別のファミリーに割り当てられている。本明細書における記述は、障害の公式分類に基づいて区別していない。将来、一方または他方のASDまたはNDDが再分類されれば、この記述および本明細書における開示は、それらの名称にかかわらず、新たな分類に当てはまることになる。
脆弱性X症候群
脆弱性X症候群(FXS)は、fmr1遺伝子によってコードされたタンパク質を発現できないという結果をもたらす、X−染色体上での単一のトリヌクレオチド遺伝子配列(CGG)の拡張によって引き起こされる。FMR1(脆弱性X精神遅滞1)は、正常な神経発達に必要とされるタンパク質である。脆弱性X症候群は、小児において自閉症を引き起こす可能性があり(Hagerman et al, 2010)、自閉症と診断されたすべての小児の2〜6%において、原因はFMR1遺伝子変異である。その上、FXSを持つ小児のおよそ30%はある程度の自閉症を有し、さらに30%はPDD−NOSと診断される(Hagerman et al, 2010)。実際に、脆弱性X症候群は、自閉症の最も一般的に公知の単一遺伝子原因である。FMR1ノックアウトマウスは、FXSのモデルとして開発されたものであり、したがって、さらなるモデルとして、fmr1遺伝子の変異は、異常な樹状突起棘発達および剪定(Comery et al, 1997)を、シナプス後密度における樹枝状足場タンパク質(シャンク1を含む)およびグルタミン酸受容体サブユニットの関連異常調節(Schutt et al, 2009)とともにもたらすことが示された。樹状突起形態学のこれらの効果は、大脳皮質およびへんとう体(Zhao et al, 2005)および海馬(Lauterbom et al, 2007)におけるLTPの低下、ならびに認知障害(Kreuger et al, 2011)および社会不安神経症の増進(Spencer et al, 2005)をもたらす。
レット症候群
自閉症、アスペルガー、CDDおよびPDD−NOSのASDと比較して、レット症候群は、ほぼ単一遺伝子基盤を有するように思われ、マウスにおいて良好な表面的妥当性でモデル化され得る。レット症候群は、症例の最大96%において、Mecp2遺伝子の欠陥によって引き起こされると考えられている(Zoghbi, 2005)。結果として、MeCP2ノックアウト変異マウスは、臨床的レット症候群のすべての特質を持つ動物モデルを提供し、表現型はASDのNLGN4、シャンク3およびIB2ノックアウトモデルと若干の重複を示す。故に、MeCP2ノックアウトマウスは、海馬におけるLTPの明瞭な機能障害を、社会的および空間記憶における対応する減少(Moretti et al, 2006)ならびに物体認識障害(Schaevitz et al, 2010)とともに示す。
故に、ヒトにおけるASDは、げっ歯類を含む動物における認知または発達障害の多くの特色を共有する。したがって、マウスおよびラット等のげっ歯類におけるASDの療法の研究は、ヒトにおいて取得される合理的に予測可能な結果である。
本発明の化合物
本発明のある特定の実施形態は、後述するとおりの構造を有する環状プロリル−グルタメート(「cPG」)の新規誘導体を含む。
Figure 2016525547
式1
ある特定の実施形態では、式1の化合物は、
1が、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
2が、CH2、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
1、R2、R3、R4およびR5が、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはR4およびR5は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であるか、
またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であり、
但し、R1=メチルであり、R2=R3=R4=Hである場合、R5はベンジルではなく、
1=Hである場合、R2およびR3の少なくとも一方はHではない、
置換基を含む。
さらなる実施形態では、式1の化合物は、
1=メチル、R2=R3=R4=R5=H、X1=NH、X2=CH2
1=アリル、R2=R3=R4=R5=H、X1=NH、X2=CH2
1=R2=R3=H、R4=R5=メチル、X1=NH、X2=CH2
1=R4=R5=H、R2=R3=メチル、X1=NH、X2=CH2
置換基を含む。
本発明の他の実施形態では、式1の化合物は、
4およびR5が一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、
1=メチル、R2=R3=H、n=0、X1=NH、X2=CH2
1=メチル、R2=R3=H、n=2、X1=NH、X2=CH2
1=アリル、R2=R3=H、n=0、X1=NH、X2=CH2
1=アリル、R2=R3=H、n=2、X1=NH、X2=CH2
1=メチル、R2=R3=H、n=3、X1=NH、X2=CH2
1=アリル、R2=R3=H、n=3、X1=NH、X2=CH2
置換基を含む。
本発明のまた他の実施形態では、式1の化合物は、R1=メチルまたはアリルであり、R2=R3=R4=HおよびR5が、アミノ酸:アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ノルバリン、ノルロイシン、シトルリン、オルニチン、ホモシステイン、ホモセリン、アロイソロイシン、イソバリン、サルコシン等の側鎖からなる群から選択される、置換基を含む。
本発明のまたさらなる実施形態では、式1の化合物は、
1=メチル、R2=R3=メチル、R4=R5=H、X1=NH、およびX2=Sである置換基;
1=アリル、R2=R3=メチル、R4=R5=H、X1=NH、およびX2=Sである置換基
を含む。
当業者ならば、上記の構造的表現がキラル中心を含有し得、その数は、異なる置換基によって決まることを理解するであろう。キラリティーは、各中心においてRまたはSのいずれであってもよい。構造図面は、考えられる互変異性、立体配座ジアステレオマーまたは鏡像異性形態の1つのみを表すことができ、本発明は任意の互変異性、立体配座異性体ジアステレオマーまたは鏡像異性形態を網羅し、これは本明細書において記述されているとおりの生物学的または薬理学的活性を呈することを理解すべきである。
薬理学および有用性
環状グリシル−2−アリルプロリン(cG−2−アリルP)は、2006年4月7日に出願され、「Cyclic G−2Allyl Proline in Treatment of Parkinson’s Disease」と題された、米国実用出願第11/399,974号、現在は2010年8月17日に発行された米国特許第7,776,876号、2006年3月2日に出願され、「Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use」と題された米国実用出願第10/570,395号、現在は米国特許第8,067,425号、「Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use」と題された、PCT国際特許出願第2004/028308号、2003年9月3日に出願され、「Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use」と題された、米国仮特許出願第60/499,956号、および2011年3月8日に出願され、「Cyclic Glycyl−2−AllylProline Improves Cognitive Performance in Impaired Animals」と題された、米国特許出願公開第13/043,215号において記述されている。上記の特許出願および特許のそれぞれは、参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明のある特定の態様は、神経変性状態を伴う老化に関連する認知機能障害の治療における、または明らかな神経変性がなく認知機能障害が見られる状況における、環状G−2−アリルPの使用を含む。
スコポラミンは、アルツハイマー病に関連するコリン作用性機能低下の動物モデルにおいて一般的に使用される。スコポラミン処置後に観察される機能的欠損は、アルツハイマー病のヒト患者において見られるものを含む。故に、スコポラミン処置は、ヒト疾患において見られる認知機能障害を合理的に予測する。加えて、スコポラミン処置は、神経変性障害を有さないヒトにおける認知機能不全を模倣する。
スコポラミン誘導性認知機能不全で処置した動物に投与されたcG−2−アリルPは、それらの動物において、コリン作用性機能低下に罹患した人々に観察された治療的改善と同様の臨床的改善をもたらす。例えば、コリン作用性機能低下は、アルツハイマー病に関連する。故に、環状G−2−アリルPスコポラミンで処置した動物の効果の研究は、コリン作用性機能不全に罹患しているヒトにおいて観察される効果を合理的に予測する。
他の作用物質を本発明の化合物とともに投与することができる。そのような他の作用物質は、例えば、増殖因子および関連誘導体、例えば、インスリン様増殖因子−I(IGF−I)、インスリン様増殖因子−II(IGF−II)、トリペプチドGPE、形質転換増殖因子−β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、ならびに/またはIGF−結合タンパク質からなる群から選択され得る。追加の化合物は、グリシル−2−メチルプロリルグルタメートおよび/または参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる、米国特許出願第10/155,864号、現在は2006年5月9日に発行された米国特許第7,041,314号において開示されている他の化合物を含む。
治療用途
本発明の組成物および方法は、認知機能障害ならびにASDおよびNDDに関連する症状に罹患しているヒト患者等の動物の治療において使用を見出している。またさらに一般的には、本発明の組成物および方法は、記憶機能障害、知的障害、社会的相互作用の減少、コミュニケーションにおける機能障害、限定的な興味および反復的興味および行動ならびに発作に罹患しているヒト患者等の哺乳動物の治療において使用を見出している。
医薬組成物および投与
環状G−2−アリルPは、医薬または医薬調製物の一部として投与することができる。これは、本発明の化合物を、任意の薬学的に適切な担体、アジュバントまたは賦形剤と合わせることを伴い得る。担体、アジュバントまたは賦形剤の選択は通常、当然ながら用いられる投与経路に依存することになる。
概して、本発明の化合物は、治療有効量で、当技術分野において公知の通常モードのいずれかにより、単独でまたは治療されている疾患の他の従来の治療剤と組み合わせてのいずれかで、投与されることになる。治療有効量は、疾患または傷害、その重症度、治療されている動物の年齢および相対的健康、化合物の効力ならびに他の要因に応じて広く変動し得る。抗アポトーシス剤、抗炎症剤および抗壊死剤として、環状G−2−アリルPの治療有効量は、動物1キログラム質量当たり0.001〜100ミリグラムの範囲であってよく、0.001〜0.1mg/kg等のより低用量は、脳室内投与等によって脳脊髄液を介する投与に適切であり、1〜100mg/kg等のより高用量は、経口、全身(例えば、経皮)または非経口(例えば、静脈内)投与等の方法による投与に適切である。当業者であれば、必要以上の実験をすることなく、その技能および本開示を考慮して、所与の疾患または傷害のための本発明の化合物の治療有効量を決定することができるであろう。
環状G−2−アリルPおよび他のcGP関連化合物は、当技術分野において公知である任意の末梢経路を介して末梢に投与され得る。これらは、非経口経路、例えば、末梢循環への注射、皮下、眼窩内、点眼、髄腔内、大槽内、局所、注入(例えば、浸透圧ポンプまたは皮膚パッチ剤等の緩徐放出デバイスまたはミニポンプを使用する)、移植片、エアロゾル、吸入、乱切(scarification)、腹腔内、嚢内、筋肉内、鼻腔内、経口、口腔、経皮、経肺、経直腸または経膣を含むことができる。組成物は、ヒトまたは他の哺乳動物への非経口投与用に、上述した神経疾患の療法を提供するための治療有効量(例えば、患者の病的状態を解消するまたは低減させる量)で、製剤化され得る。
望ましくは、可能ならば、抗アポトーシス剤、抗炎症剤および抗壊死剤として投与される場合、環状G−2−アリルPは経口で投与することができる。組成物中における本発明の化合物の量は、組成物のタイプ、単位投薬量の大きさ、賦形剤の種類、および当業者に周知である他の要因に応じて広く変動し得る。概して、最終組成物は、0.0001質量パーセント(質量%)〜10質量%、好ましくは0.001質量%〜1質量%の本発明の化合物を含んでよく、残りは賦形剤である。
他の好都合な投与経路は、皮下注射(例えば、0.9%塩化ナトリウム等の生理的に適合性の担体に溶解したもの)またはCNSへの直接投与を含む。定位デバイスおよび動物のCNSの精密なマップを使用して、化合物は神経損傷部位に直接的に注射され得る。そのような投与経路は、その位置の灌流が、血流の減少によってまたはその領域への脳脊髄液(CSF)流量の減少によってのいずれかで損なわれる状況においてとりわけ所望され得る。例としては、側脳室注射による、もしくは患者の脳の側脳室に外科的に挿入されたシャントを経由する投与、静脈内投与、所望の位置への直接注射による投与、直接的もしくは循環を介した間接的な投与、または他の経路による投与を含む。
「直接的にまたは循環を介して間接的に」により、本発明者らは、作用物質を循環に送達するために十分な血流量を有する任意の組織へのcG−2−アリルPの投与を意味する。非限定的な例は、皮膚、鼻、咽頭、消化管、または他のそのような組織を含む。そのような組織に投与されると、作用物質は組織によって吸収され、ここで作用物質は組織の間質液に入り、その後、小静脈、毛細管、細動脈またはリンパ管によって吸収される。次いで、作用物質は全身の体循環に運び込まれ、ここで脳を含む患部に送達され得る。作用物質が皮下にまたは腹膜に投与されると、作用物質は隣接組織によって吸収され、次いで、作用物質は局所的に循環に入り、その後、全身循環に送達され、ここで脳に輸送され得る。作用物質が血液脳関門に接近すると、次いで、作用物質は脳内の神経組織または脳脊髄液のいずれかに拡散することができ、ここで神経組織に送達され得る。
CNSにおける化合物の有効量は、本発明の化合物および担体を含むプロドラッグ形態の化合物の投与によって増加させてよく、ここで、担体は、患者体内での開裂または消化の影響を受けやすい連結によって本発明の化合物と接合している。投与後に開裂または消化される任意の好適な連結を用いてよい。
しかしながら、出願人側には、他の投与形態を除外する意図はない。
本発明のさらなる実施形態では、動物における神経機能を回復させることは、治療量の環状G−2−アリルPを、例えば、増殖因子および関連誘導体(インスリン様増殖因子−I(IGF−I)、インスリン様増殖因子−II(IGF−II)、形質転換増殖因子−β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、IGF−結合タンパク質(とりわけIGFBP−3)、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、hst/Kfgk遺伝子産物、FGF−3、FGF−4、FGF−6、ケラチノサイト増殖因子、アンドロゲン誘導性増殖因子から選択される別の神経保護剤と組み合わせて投与することを含み得る。FGFファミリーの追加のメンバーは、例えば、int−2、線維芽細胞増殖因子相同因子−1(FHF−1:fibroblast growth factor homologous factor−1)、FHF−2、FHF−3およびFHF−4、ケラチノサイト(karatinocyte)増殖因子2、グリア活性化因子、FGF−10およびFGF−16、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2(BMP−2)、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンM、インターロイキン)、α−、β−、γ−またはコンセンサスインターフェロン、ならびにTNF−αを含む。他の形態の神経保護性治療剤は、例えば、クロメチアゾール;キヌレン酸、セマックス、タクロリムス、L−トレオ−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール、副腎皮質刺激ホルモン−(4−9)類似体(ORG 2766)およびジゾシルピン(dizolcipine)(MK−801)、セレギリン;NPS1506、GV1505260、MK−801、GV150526等のグルタメートアンタゴニスト;2,3−ジヒドロキシ−6−ニトロ−7−スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン(NBQX)、LY303070およびLY300164等のAMPAアンタゴニスト;アドレシンMAdCAM−1および/または抗MAdCAM−1mAb MECA−367(ATCC受託番号HB−9478)等のそのインテグリンα4受容体(α4β1およびα4β7)に対する抗炎症剤を含む。
環状G−2−アリルPおよび他のcGP関連化合物は、持続放出系によって好適に投与される。持続放出組成物の好適な例は、造形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルを含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号;EP 58,481)、L−グルタミン酸およびガンマ−エチル−L−グルタメートのコポリマー(Sidman et al, 1983, Biopolymers: 22: 547-56)、ポリ(メタクリル酸2−ヒドロキシエチル)(Langer et al, 1981, J. Biomed. Mater. Res. : 15: 267)、エチレン酢酸ビニル(Langer et al, 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15; 267)、またはポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)を含む。持続放出組成物は、リポソームに封入された化合物も含む。化合物を含有するリポソームは、それ自体が公知の方法:DE 3,218,121、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、日本特許出願第83−118008号、米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号、ならびにEP 102,324によって調製される。通常は、リポソームは、脂質含有量が約30molパーセントのコレステロールより大きい小型(約200〜800オングストローム)単層タイプのものであり、選択された割合は、最も効果的な療法に合わせて調整される。
非経口投与のために、一実施形態では、環状G−2−アリルPは、概して、所望の純度のそれぞれを、単位投薬量注射剤形態(溶液、懸濁液またはエマルション)で薬学的にまたは非経口的に許容される担体、すなわち用いられる投薬量および濃度ではレシピエントに非毒性であり、製剤の他の原料と適合性であるものと混合することにより、製剤化され得る。
粘膜組織への本発明の化合物の送達のために、化合物をゲル製剤に組み込むことができる。粘膜(例えば、口腔、消化管、直腸)に送達されると、作用物質はゲルを出て拡散することができ、またはゲルが分解して、それにより作用物質を組織に放出することができ、ここで循環中に吸収され得る。例示的なゲル製剤は、カルボキシルメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、キトサン、デンプン、セルロース等のカルボキシ多糖、ヒアルロン酸等のタンパク質、またはポリビニルピロリドン(polyvinylpyrollidine)、ポリビニルアルコール等の他のポリマー、ならびに当技術分野において公知である他のゲル材料で作製されているものを含み得る。
概して、製剤は、環状G−2−アリルPを、液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と接触させることによって調製される。次いで、必要ならば、生成物を所望の製剤に造形する。好ましくは、担体は、非経口担体、より好ましくはレシピエントの血液と等張の溶液である。そのような担体ビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝溶液およびデキストロース溶液を含む。固定油およびオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルも本明細書において有用である。
担体は、好適には、等張性および化学的安定性を増強する物質等の少量の添加剤を含有する。そのような材料は、用いられる投薬量および濃度ではレシピエントに非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩等の緩衝剤;アスコルビン酸等の酸化防止剤;低分子量(約10個未満の残基)ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン;グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンまたはアルギニン等のアミノ酸;単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロースまたはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の対イオン;ポリソルベート、ポロキサマーまたはポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤;および/または中性塩、例えば、NaCl、Cl、MgCl2、CaCl2等を含む。
環状G−2−アリルPおよび他のcGP化合物は、典型的には、そのようなビヒクル中、約4.5〜8のpHで製剤化される。前述の賦形剤、担体または安定剤のいくつかの使用は、化合物の塩の形成をもたらすことが理解されるであろう。最終調製物は、安定な液体または凍結乾燥固体であってよい。
医薬組成物中の環状G−2−アリルPの製剤は、アジュバントも含み得る。錠剤、カプセル剤等に組み込まれ得る典型的なアジュバントは、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤;微結晶性セルロース等の賦形剤;コーンスターチまたはアルギン酸のような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤;スクロースまたはラクトース等の甘味剤;ペパーミント、冬緑またはサクランボ等の香味剤である。剤形が錠剤である場合、環状G−2−アリルP組成物は、結合剤を含み得、滑らかなコーティングを含んでもよい。剤形がカプセル剤である場合、上記の材料に加えて、脂肪油等の液体担体も含有し得る。種々のタイプの他の材料を、コーティングとして、または投薬量単位の物理的形態の修飾物質として使用してもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、スクロース等の甘味料、プロピルパラベンのような保存料、着色剤、およびサクランボ等の香味剤を含有してもよい。注射用滅菌組成物は、従来の医薬実務に従って製剤化することができる。例えば、水、またはゴマ、ピーナッツもしくは綿実油のような自然発生の植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪ビヒクル等のビヒクル中の活性化合物の溶解または懸濁が望ましい場合があり、緩衝剤、保存料、酸化防止剤等を、許容されている医薬実務に従って組み込むことができる。
注射、心室内投与、および他の侵襲性投与経路では、環状G−2−アリルPは無菌でなくてはならない。無菌状態は、当技術分野において公知である任意の方法、例えば、滅菌濾過膜(例えば、0.2μmの膜)に通す濾過によって遂行され得る。治療用組成物は、概して、滅菌されたアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通することができるストッパーを有する静脈注射溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
環状G−2−アリルPを含有する医薬製剤は、通常は、単回または複数回用量容器内に、例えば、密封したアンプルまたはバイアル内に、水溶液としてまたは再構成用の凍結乾燥製剤として貯蔵されることになる。凍結乾燥製剤の例として、10mLのバイアルに、5mLの化合物の滅菌濾過した1%(w/v)水溶液を満たし、得られた混合物を凍結乾燥させる。輸液は、静菌性注射用水を使用して凍結乾燥化合物を再構成することによって調製される。他の剤形および種類の調製物を使用してよく、すべてが本発明の一部とみなされることが容易に理解され得る。
化合物の調製
環状G−2−アリルPを調製するのに使用される出発材料および試薬は、Aldrich Chemical Company(Milwaukee、Wis.)、Bachem(Torrance、Calif.)、Sigma(St.Louis、Mo.)等の商業的な供給業者から入手可能であるか、または、Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, vols 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; March J; Advanced Organic Chemistry, 4th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992;およびLarock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989等の参考文献に記述された手順に準拠し、当業者に周知の方法によって調製されるかのいずれかである。ほとんどの事例では、アミノ酸およびそれらのエステルまたはアミド、ならびに保護されたアミノ酸は、広く市販されており、修飾されたアミノ酸およびそれらのアミドまたはエステルの調製は、化学および生化学の文献において広範に記述されており、故に、当業者に周知である。
本発明の出発材料、中間体および最終生成物は、濾過、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー等を含む従来の技術を使用して、単離および精製することができる。これらは、物理定数およびスペクトルデータを含む従来の方法を使用して特徴付けることができる。
環状G−2−アリルPは環状ジペプチド(二環式2,5−ジケトピペラジン)であり、環状GPx(「cGP」)として公知である化合物のクラスのメンバーである。概して、cGPsおよび環状G−2−アリルPは、ペプチドおよび修飾されたペプチド合成の分野の当業者には既に周知であるような方法によって、本明細書の後の図に明記されている反応スキームに準拠して、またはペプチドおよび類似体の合成の分野の当業者に周知である他の方法に準拠することによって調製することができる。例えば、Bodanzsky: Principles of Peptide Synthesis, Berlin, New York: Springer-Verlag 1993を参照されたい。
本発明のジケトピペラジン化合物の合成は、例において論じられているとおりの液相合成による、またはMerrifield et al. 1963 J. Amer. Chem. Soc.: 85, 2149-2156によって例示されている固相合成法を介するものであってよい。固相合成は、機器のために確立されたプロトコールを使用するApplied Biosystemsモデル430A等の市販のペプチド合成機を使用して実施され得る。
ジケトピペラジン合成の具体例は、下記の例において、ならびに例えばFischer, 2003, J. Peptide Science: 9: 9-35およびその中の参考文献において見ることができる。当業者であれば、本開示の利用可能な技能および知識を考慮すると、本発明の化合物のための1つまたは複数の好適な合成方法を開発することは難しくない。
選択された方法(固相または液相)に適切な保護基、および固相合成が使用されるならば適切な基質の選択は、当業者の技能の範囲内であろう。ペプチド合成に適切な保護基は、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、ベンジル(Bzl)、t−アミルオキシカルボニル(Aoc)、トシル(Tos)、ベンジルオキシカルボニル(ZまたはCbz)、o−ブロモ−ベンジルオキシカルボニル(BrZ)等を含む。追加の保護基は、Goodman M. (ed.), "Synthesis of Peptides and Peptidomimetics" in Methods of organic chemistry (Houben-Weyl) (Workbench Edition, E22a,b,c,d,e; 2004; Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York)において同定されている。
選択された方法のためのカップリング剤の選択も、当業者の技能内となる。好適なカップリング剤は、DCC(N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド)、Bop(ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−(ジメチルアミノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)、PyBop(ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)、BopCl(ビス(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド)、2−クロロ−1,3−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(CIP)等を含む。HOBt(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)およびHOAt(1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール)等の他の化合物を、合成において、例えばラセミ化を防止するために使用してもよい。
実施形態
以下で提示する具体的な実施形態は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、以下の一覧中の要素の1つまたは複数を、本明細書において具体的には明記されていない組合せに組み込むことにより、他の実施形態を作成することができる。すべてのそのような実施形態は、本発明の範囲内であるとみなされる。
実施形態1。自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式:
Figure 2016525547
を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
(式中、
1は、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
2は、CH2、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
1、R2、R3、R4およびR5は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはR4およびR5は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であるか、
またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であり、
但し、R1=メチルであり、R2=R3=R4=Hである場合、R5はベンジルではなく、
1=Hである場合、R2およびR3の少なくとも一方はHではない)
実施形態2。自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式:
Figure 2016525547
を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
(式中、
1は、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
2は、CH2、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
1、R2およびR3は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であり、
但し、少なくとも1つのRはHではない)
実施形態3。自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式:
Figure 2016525547
を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
(式中、
1は、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
2は、CH2、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
1、R2およびR3は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数である)
実施形態4。自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式:
Figure 2016525547
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
(式中、
1、X3およびX4は、S、OおよびNHからなる群から独立に選択され、
2は、S、O、CH2およびNHからなる群から選択され、
1、R2、R3、R4およびR5は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはR4およびR5は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であるか、
またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であり、
但し、少なくとも1つのRはHではなく、X3およびX4の両方はOではない)
実施形態5。自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式:
Figure 2016525547
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
(式中、
1およびR2は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはR1およびR2は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数である)
実施形態6。自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式:
Figure 2016525547
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
(式中、
1、R2およびR3は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数である)
実施形態7。自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式:
Figure 2016525547
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
(式中、
Rは、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選択される)
実施形態8。R1=メチルである、実施形態1〜4または6のいずれかの方法。
実施形態9。R1=アリルである、実施形態1〜4または6のいずれかの方法。
実施形態10。R2=R3=メチルであり、X=Sである、実施形態1〜4のいずれかの方法。
実施形態11。R1=アリル、R2=R3=R4=R5=H、X1=NH、X2=CH2である、実施形態1の方法。
実施形態12。R1=メチル、R2=R3=H、R4およびR5が一緒になって−CH2−(CH23−CH2−であり、X1=NH、X2=CH2である、実施形態1の方法。
実施形態13。R1=メチル、R2=R3=H、R4およびR5が一緒になって−CH2−(CH22−CH2−であり、X1=NH、X2=CH2である、実施形態1の方法。
実施形態14。薬学的に許容される賦形剤を投与するステップをさらに含む、実施形態1〜13のいずれかの方法。
実施形態15。薬学的に許容される賦形剤および結合剤を投与するステップをさらに含む、実施形態1〜13のいずれかの方法。
実施形態16。薬学的に許容される賦形剤およびカプセル剤を投与するステップをさらに含む、実施形態1〜13のいずれかの方法。
実施形態17。少なくとも1つの他の抗アポトーシス剤、抗壊死剤または神経保護剤を投与するステップをさらに含む、実施形態1〜13のいずれかの方法。
実施形態18。他の抗アポトーシス剤または神経保護剤が、増殖因子および関連誘導体(インスリン様増殖因子−I[IGF−I]、インスリン様増殖因子−II[IGF−II]、形質転換増殖因子−β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、IGF−結合タンパク質[とりわけIGFBP−3]、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、hst/Kfgk遺伝子産物、FGF−3、FGF−4、FGF−6、ケラチノサイト増殖因子、アンドロゲン誘導性増殖因子、int−2、線維芽細胞増殖因子相同因子−1(FHF−1)、FHF−2、FHF−3およびFHF−4、ケラチノサイト増殖因子2、グリア活性化因子、FGF−10およびFGF−16、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2[BMP−2]、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンM、インターロイキン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、TNF−α、クロメチアゾール;キヌレン酸、セマックス、タクロリムス、L−トレオ−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール、副腎皮質刺激ホルモン−(4−9)類似体[ORG2766]、ジゾシルピン[MK−801]、セレギリン、グルタメートアンタゴニスト、AMPAアンタゴニストおよび抗炎症剤から選択される、実施形態17の方法。
実施形態19。前記グルタメートアンタゴニストが、NPS1506、GV1505260、MK−801およびGV150526からなる群から選択される、実施形態18の方法。
実施形態20。前記AMPAアンタゴニストが、2,3−ジヒドロキシ−6−ニトロ−7−スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン(NBQX)、LY303070およびLY300164からなる群から選択される、実施形態18の方法。
実施形態21。前記抗炎症剤が、抗MAdCAM−1抗体ならびにインテグリン4β1受容体およびインテグリンα4β7受容体に対する抗体からなる群から選択される、実施形態18の方法。
実施形態22。前記抗MAdCAM−1抗体がMECA−367である、実施形態21の方法。
実施形態23。前記化合物が環状G−2−アリルPである、実施形態1の方法。
実施形態24。前記化合物が環状シクロヘキシル−G−2MePである、実施形態1の方法。
実施形態25。前記化合物が環状シクロペンチル−G−2MePである、実施形態1の方法。
実施形態26。自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、哺乳動物に対する薬学的有効量の環状グリシル−2−アリルプロリン(cG−2−アリルP)を投与するステップを含む、方法。
実施形態27。前記cG−2−アリルPが、水溶液および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、添加剤、担体またはアジュバントを含む、実施形態26の方法。
実施形態28。錠剤またはカプセル剤中に、1つまたは複数の賦形剤、担体、添加剤、アジュバントまたは結合剤をさらに含む、実施形態26の方法。
実施形態29。障害が、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)ならびに病理学的要求回避(PDA;Pathological Demand Avoidance)からなる群から選択される、実施形態1〜28のいずれかの方法。
実施形態30。障害が、脆弱性X症候群(FXS)、アンジェルマン症候群、結節性硬化症複合体、フェラン−マクダーモット症候群、レット症候群、CDKL5変異およびX連鎖性乳児スパスム症候群からなる群から選択される、実施形態1〜28のいずれかの方法。
実施形態31。化合物が、直接的または循環を介して間接的のいずれかで投与される、実施形態1〜30のいずれかの方法。
実施形態32。前記化合物が、経口、腹腔内、血管内、末梢循環、皮下、眼窩内、点眼、髄腔内、大槽内、局所、注入、移植片、エアロゾル、吸入、乱切、腹腔内、嚢内、筋肉内、鼻腔内、口腔、経皮、経肺、経直腸または経膣経路を介して投与される、実施形態1〜31のいずれかの方法。
実施形態33。前記有効量が、動物のキログラム質量当たり約0.001ミリグラム(mg/kg)の下限および約100mg/kgの上限を有する、実施形態1〜32のいずれかの方法。
実施形態34。有効性の評価が、動物のリンパ球におけるリン酸化されたERK(pERK)またはリン酸化されたAkt(pAkt)の測定によるものであり、ここで、pERKまたはpAktのいずれかにおける正常化は、前記障害の重症度における低減を示す、実施形態1〜33のいずれかの方法。
実施形態35。前記治療が、レット症候群の自然歴/臨床的重症度尺度、異常行動チェックリスト地域版(ABC)、バインランド適応行動尺度、重症度の臨床全般印象(CGI−S)、臨床全般印象改善(CGI−I)、介護負担感アンケート(CSQ)からなる群から選択される1つもしくは複数の臨床試験、または脳波図(EEG)スパイク頻度、EEGの周波数バンド内の総電力、EEG周波数の大脳半球間コヒーレンス、常同的な手の動き、QTcおよび心拍変動(HRV)、ホスホ−ERK1/2およびホスホ−Aktの異常な細胞発現、増殖関連タンパク質−43(GAP−43)の異常発現、シナプトフィジン(SYN)の異常発現、不規則呼吸ならびに心臓および呼吸機能の連結からなる群から選択される1つもしくは複数の生理学的試験を使用して、前記障害に罹患していない対照動物と比較して評価されるようなASDもしくはNDDの症状における改善をもたらす、実施形態1〜33のいずれかの方法。
実施形態36。前記ASDの症状が、認知機能障害または認知機能不全、記憶喪失の1つまたは複数の兆候または症状、空間位置感覚の喪失、学習能力の減少、短期または長期記憶を形成する能力の減少、エピソード記憶の減少、記憶を統合する能力の減少、空間記憶の減少、シナプス形成の減少、シナプス安定性の減少、実行能力の欠損、認知マッピングおよび場面記憶の欠損、発言および関係記憶の欠損、配置的または接続的な関係の迅速な習得の減少、具体的事象の文脈固有のコード化および想起の減少、エピソードおよび/またはエピソード様記憶の減少、不安神経症、異常な恐怖条件付け、異常な社会的行動、反復的行動、異常な夜行性行動、発作活動、異常な運動、ホスホ−ERK1/2およびホスホ−Aktの異常発現ならびに徐脈である、実施形態1〜35のいずれかの方法。
実施形態37。実施形態1〜36までのいずれかの、治療的有効性の存在、重症度または評価を検出するのための方法であって、ASDの対象の末梢リンパ球におけるホスホ−ERK1/2またはホスホ−Aktの発現を、ASDを有さない対象の群の末梢リンパ球におけるホスホ−ERK1/2またはホスホ−Aktの発現と、あるいは治療前の対象の末梢リンパ球におけるホスホ−ERK1/2またはホスホ−Aktの発現と比較して測定するステップを含む、方法。
本発明は、次の例によってさらに例示される。これらの例は、例示によってのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない。
化合物の合成の一般的方法
フラッシュクロマトグラフィーをScharlau 60(40〜60;mメッシュ)シリカゲルを使用して実施した。分析用薄層クロマトグラフィーを0.20mmプレコートシリカゲルプレート(ALUGRAM(登録商標)SIL G/UV254)上で実行し、化合物を、UV蛍光を使用するまたはアルカリ性溶液中の過マンガン酸カリウムに漬けたプレートを加熱することによって可視化した。
摂氏度(℃)での融点をElectrothermal(登録商標)融点装置で決定し、補正しない。
旋光度を20℃で10cmパス長セルを使用してPerkin Elmer 341旋光計で測定し、10-1degcm2-1の単位で示す。試料を指示された溶媒に指定の濃度(g/100cm3で測定)で調製した。IRスペクトルをPerkin Elmer Spectrum One FT−IR分光計で記録した。試料を塩化ナトリウムディスク上の薄膜としてまたは臭化カリウムディスク中の固体として調製した。幅広なシグナルをbrによって示した。吸収極大の周波数(□)を波数(cm-1)で示す。
NMRスペクトルをBruker AVANCE DRX400(1H、400MHz;13C、100MHz)またはBruker AVANCE300(1H、300MHz;13C、75MHz)分光計で、周囲温度で記録した。1H NMRデータについて化学シフトをSiMe4から低磁場に100万分の1(ppm)で記載し、位置(δH)、相対積分、多重度(s=一重線、d=二重線、t=三重線、dd=二重線の二重線、m=多重線、br=幅広)、結合定数(J/Hz)および帰属として連続的に報告する。13C NMRデータについて、化学シフトをCDCl3と比較したppmで記載し、位置(δC)、DEPT実験によって決定されたハイブリダイゼーションの程度および帰属として連続的に報告する。1H NMRスペクトルはSiMe4(δ0.00)またはCDCl3(δ7.26)を使用して内部的に参照した。13C NMRスペクトルはCDCl3(δ77.0)を使用して内部的に参照した。グリシン−プロリンアミド結合周辺の異なるコンホメーションのためにNMRスペクトルに2セットのピークが生じる場合、少数のcis立体構造異性体についての化学シフトにアスタリスク(*)で印を付ける。
正確な質量測定をVG−70SE質量分析計で記録した。
ヘキサンおよびジクロロメタンを使用前に蒸留した。メタノールをマグネシウムの削り屑とヨウ素を使用して乾燥させ、窒素下で蒸留した。トリエチルアミンを水素化カルシウムで乾燥させ、窒素下で蒸留した。
(例1)
(8aS)−メチル−ヘキサヒドロピロロ[1,2−a]ピラジン−1,4−ジオン(環状G−2MeP)の合成
Figure 2016525547
スキーム1:試薬、条件および収量:(i)LDA、THF、−78℃、ヨードメタン、−78−>−50℃、2時間(63%);(ii)SOCl2、CH3OH、還流、N2、2.5時間(98%);(iii)Et3N、BoPCl2、CH2Cl2、RT、N2、20.5時間(78%);(iv)10%Pd/C、CH3OH、RT、15時間(98%)
(2R,5S)−4−メチル−2−トリクロロメチル−1−アザ−3−オキサビシクロ[3.3.0]オクタン−4−オン9
n−BuLi(1.31M、4.68cm3、6.14mmol)を乾燥テトラヒドロフラン(10cm3)中のジイソプロピルアミン(0.86cm3、6.14mmol)の撹拌溶液に−78℃窒素雰囲気下で、滴下で加えた。溶液を5分間撹拌し、0℃に温め、15分間撹拌した。次いで溶液を乾燥テトラヒドロフラン(20cm3)中のオキサゾリジノン8(1.00g、4.09mmol)溶液に−78℃で20分間かけて滴下で加え(暗茶色に変わった)、さらに30分間撹拌し、次いでヨードメタン(0.76cm3、12.3mmol)を5分間かけて滴下で加えた。溶液を2時間かけて−50℃に温めた。水(15cm3)を加え、溶液を室温に温め、クロロホルム(3×40cm3)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、減圧中で乾燥まで蒸発させ、暗茶色半流動体を生じた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(15%酢酸エチル−ヘキサン)による残渣の精製は淡黄色固体でのオキサゾリジノン9(0.67g、63%)をもたらした:融点55-57℃ (文献、57-60℃); δH (300 MHz, CDCl3) 1.53 (3H, s, CH3), 1.72-2.02 (3H, m, Proβ-HおよびProγ-H2), 2.18-2.26 (1H, m, Proβ-H), 3.15-3.22 (1H, m, Proδ-H), 3.35-3.44 (1H, m, Proδ-H)および4.99 (1H, s, NCH).
メチルL−2−メチルプロリネートハイドロクロリド10
a)塩化アセチルの使用
オキサゾリジノン9(0.60g、2.33mmol)を乾燥メタノール(15cm3)中に窒素雰囲気下で溶解し、塩化アセチル(0.33cm3、4.66mmol)を氷冷溶液に滴下で加えた。溶液を還流下で4.5時間加熱し、次いで溶媒を減圧下で除去し、茶色の油を生じ、フラッシュカラムクロマトグラフィー(10%CH3OH−CH2Cl2)で精製し、鱗状白色固体でのハイドロクロリド10(0.2g、48%)をもたらした:融点107-109℃ (文献、106-108℃); δH (300 MHz, CDCl3) 1.81 (3H, s, CH3), 1.93-2.14 (3H, m, Proβ-HAHBおよびProγ-H2), 2.33-2.39 (1H, m, Proβ-HAHB), 3.52-3.56 (2H, m, Proδ-H2)および3.82 (3H, s, CO2CH3).
b)塩化チオニルの使用
乾燥メタノール(1cm3)中オキサゾリジノン9(53mg、0.21mmol)の氷冷溶液を塩化チオニル(0.045cm3、0.62mmol)の滴下で処置した。溶液を還流下で2.5時間加熱し、冷却し、溶媒を減圧下で除去し、茶色の油を得た。油をトルエン(5cm3)に溶解し、残存塩化チオニルおよびメタノールを除去するために乾燥まで濃縮し、次いで鱗状白色固体でのハイドロクロリド10(16mg、43%)をもたらすようにフラッシュカラムクロマトグラフィー(10%CH30H−CH2Cl2)で精製した。1H NMR帰属は上に報告したものと一致した。
メチル−N−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−L−2−メチルプロリネート12
乾燥トリエチルアミン(0.27cm3、1.96mmol)を乾燥ジクロロメタン(35cm3)中ハイドロクロリド10(0.11g、0.61mmol)およびN−ベンジルオキシカルボニル−グリシン11(98.5%)(0.17g、0.79mmol)の溶液に窒素雰囲気下、室温で、滴下で加え、反応混合物を10分間撹拌した。Bis(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィン酸塩化物(BoPCl、97%)(0.196g、0.77mmol)を加え、得られた無色溶液を20.5時間撹拌した。溶液を10%塩酸水(30cm3)および飽和炭素水素ナトリウム水(30cm3)で連続的に洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、減圧下で乾燥まで蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(50〜80%酢酸エチル−ヘキサン;グラジエント溶出)による生じた残渣の精製は、無色油でのジペプチド12(0.18g、92%)を生じた。アミド12は、13C NMR分析によって、trans:cisが98:2の立体構造異性体の混合物として存在することが示された(比は、少数および多数の立体構造異性体それぞれのプロγ−C原子に帰属されるδ20.8および23.5での共鳴の相対強度から推定した):[α]D -33.0 (MeOH中c 1.0); νmax (フィルム)/cm-1 3406, 2952, 1732, 1651, 1521, 1434, 1373, 1329, 1310, 1284, 1257, 1220, 1195, 1172, 1135, 1107, 1082, 1052, 1029, 986, 965, 907, 876, 829, 775, 738および699; δH (300 MHz, CDCl3) 1.49 (3H, s, CH3), 1.77-2.11 (4H, m, Proβ-H2およびProγ-H2), 3.43-3.48 (2H, m, Proδ-H2), 3.61 (3H, s, OCH3), 3.85-3.89 (2H, m, Glyα-H2), 5.04 (2H, s, PhCH2), 5.76 (1H, br s, N-H)および7.21-7.28 (5H, s, ArH); δC (75 MHz, CDCl3) 13.8* (CH3, Proα-CH3), 21.1 (CH3, Proα-CH3), 20.8* (CH2, Proγ-C), 23.5 (CH2, Proγ-C), 38.0 (CH2, Proβ-C), 40.8* (CH2, Proβ-C), 43.3 (CH2, Glyα-C), 45.5* (CH2, Glyα-C), 46.6 (CH2, Proδ-C), 48.7* (CH2, Proδ-C), 51.9* (CH3, OCH3), 52.1 (CH3, OCH3), 60.0* (四重線, Proα-C), 66.0 (四重線, Proα-C), 66.3 (CH2, PhCH2), 68.6* (CH2, PhCH2), 127.5 (CH, Ph), 127.6 (CH, Ph), 127.9* (CH, Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.3* (CH, Ph), 136.2 (四重線, Ph), 155.9 (四重線, NCO2), 166.0 (四重線, Gly-CON), 169.4* (四重線, Gly-CON)および173.6 (四重線, CO2CH3); m/z (EI+) 334.1535 (M+. C17H22N2O5の計算値334.1529).
(8aS)−メチル−ヘキサヒドロピロロ[1、2−a]ピラジン−1、4−ジオン(環状G−2MeP)
メタノール(8.0cm3)中ジペプチド12(0.167g、0.51mmol)の溶液に活性炭(8.1mg、0.076mmol)上で10%Pdを加え、容器に水素ガスを流した。得られた懸濁液を水素雰囲気下で15時間勢いよく撹拌した。次いで混合物をセライトパッド、次いでショートプラグシリカゲルを通してメタノールで濾過し、溶媒を減圧下で除去し、黄色固体で環状G−2MeP(83mg、98%)を産生した:融点133-135℃; [α]D -128.1 (MeOH中c 0.52); δH (300 MHz, CDCl3) 1.36 (3H, s, CH3), 1.87-2.01 (3H, m, Proβ-HAHBおよびProγ-H2), 2.07-2.21 (1H, m, Proβ- HAHB), 3.45-3.64 (2H, m, Proδ-H2), 3.82 (1H, dd, J 17.1および4.1, CHAHBNH), 3.99 (1H, d, J 17.1, CHAHBNH)および7.66 (1H, br s, N-H); δC (75 MHz, CDCl3) 20.2 (CH2, Proγ-C), 23.2 (CH3, Proα-CH3), 35.0 (CH2, Proβ-C), 44.7 (CH2, Proδ-C), 45.9 (CH2, CH2NH), 63.8 (四重線, Proα-C), 163.3 (四重線, NCO)および173.3 (四重線, CONH); m/z (EI+) 168.08986 (M+. C8H12N2O2の計算値168.08988).
(例2)
(8aS)−メチル−スピロ[シクロヘキサン−1,3(4H)−テトラヒドロピロロ[1,2−a]ピラジン}−1,4(2H)−ジオン(環状シクロヘキシル−G−2−MeP)の合成
Figure 2016525547
スキーム2:試薬、条件および収量:(i)BnO2CCl、Na2CO3、H2O−ジオキサン(3:1)、19時間、96%;(ii)Et3N、HOAt、CIP、1,2−ジクロロエタン、還流、N2、19時間(23%);(iii)10%Pd/C、CH3OH、RT、17時間(65%)。
N−ベンジルオキシカルボニル−1−アミノシクロヘキサン−1−カルボン酸(14)
水−ジオキサン(21cm3、3:1)に溶解した1−アミノシクロヘキサンカルボン酸13(0.72g、5.02mmol)および炭酸ナトリウム(1.6g、15.1mmol)の懸濁液に、ベンジルクロロホルメート(0.79cm3、5.52mmol)を滴下で加え、溶液を室温で、19.5時間撹拌した。水層をジエチルエーテル(60cm3)で洗浄し、2M塩酸で酸性化し、酢酸エチル(2×60cm3)で抽出した。有機層を合わせ、乾燥し(MgSO4)、濾過し、減圧下で蒸発させ、静置で白色固体での粗カルバメート14(1.23g、88%)に固化する無色油を産生した:融点152-154℃ (文献、148-150℃); δH (400 MHz, CDCl3) 1.27-1.56 (3H, m, 3 x シクロヘキシル-H), 1.59-1.73 (3H, m, 3 x シクロヘキシル-H), 1.85-1.91 (2H, m, 2 x シクロペンチル-H), 2.05-2.09 (2H, m, 2 x シクロペンチル-H), 5.02 (1H, br s, N-H), 5.12 (2H, s, OCH2Ph)および7.27-7.36 (5H, s, Ph); δC (100 MHz, CDCl3) 21.1 (CH2, 2 x シクロヘキシル-C), 25.1 (CH2, 2 x シクロヘキシル-C), 32.3 (CH2, シクロヘキシル-C), 59.0 (四重線,1-C), 67.1 (CH2, OCH2Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.2 (CH, Ph), 128.5 (CH, Ph), 136.1 (四重線, Ph), 155.7 (四重線, NCO2)および178.7 (四重線, CO2H).
メチル−N−ベンジルオキシカルボニル−シクロヘキシル−グリシル−L−2−メチルプロリネート(15)
乾燥トリエチルアミン(0.21cm3、1.5mmol)を乾燥1,2−ジクロロエタン(26cm3)中のハイドロクロリド10(84.0mg、0.47mmol)、カルボン酸14(0.17g、0.61mmol)および1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(16mg、0.12mmol)の溶液に窒素雰囲気下、室温で、滴下で加え、反応混合物を10分間撹拌した。2−クロロ−1,3−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(0.13g、0.47mmol)を加え、得られた溶液を還流下で21時間加熱し、次いで10%塩酸水(30cm3)および飽和炭素水素ナトリウム水(30cm3)で連続的に洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、減圧下で乾燥まで蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(40〜50%酢酸エチル−ヘキサン;グラジエント溶出)による得られた残渣の精製は、白色固体でのアミド15(16mg、9%)を生じた。アミド15は、13C NMR分析によって、trans:cisが11:1の立体構造異性体の混合物として存在することが示された(比は、少数および多数の立体構造異性体それぞれのプロδ−C原子に帰属されるδ41.3および48.2での共鳴の相対強度から推定した):融点219-222℃; [α]D -44.9 (CH2Cl2中c 1.31); νmax (フィルム)/cm-1 3239, 2927, 1736, 1707, 1617, 1530, 1450, 1403, 1371, 1281, 1241, 1208, 1194, 1165, 1150, 1132, 1089, 1071, 1028, 984, 912, 796, 749, 739および699; δH (400 MHz, CDCl3) 1.24-2.10 (17H, m, Proα-CH3, Proβ-H2, Proγ-H2および5 x シクロヘキシル-H2), 3.25-3.48 (1H, br m, Proδ-HAHB), 3.61-3.87 (4H, br m, OCH3およびProδ-HAHB), 4.92-5.19 (3H, m, N-HおよびOCH2Ph)および7.35-7.37 (5H, s, Ph); δC(100 MHz, CDCl3) 21.26 (CH2, シクロヘキシル-C), 21.33 (CH2, シクロヘキシル-C), 21.7 (CH3, Proα-CH3), 24.8 (CH2, シクロヘキシル-C), 25.0 (CH2, Proγ-C), 29.4* (CH2, シクロヘキシル-C), 29.7* (CH2, シクロヘキシル-C), 31.1 (CH2, シクロヘキシル-C), 31.6 (CH2, シクロヘキシル-C), 31.9* (CH2, シクロヘキシル-C), 32.2* (CH2, シクロヘキシル-C), 32.8* (CH2, シクロヘキシル-C), 37.3 (CH2, Proβ-C), 41.4* (CH2, Proδ-C), 48.2 (CH2, Proδ-C), 52.1 (CH3, OCH3), 59.1 (四重線, Glyα-C), 66.7 (CH2, OCH2Ph), 67.3* (CH2, OCH2Ph), 67.4 (四重線, Proα-C), 128.0* (CH, Ph), 128.1* (CH, Ph), 128.3 (CH, Ph), 128.5 (CH, Ph), 128.7 (CH, Ph), 136.6 (四重線, Ph), 153.7 (四重線, NCO2), 171.0 (四重線, Gly-CO)および174.8 (四重線, CO2CH3); m/z (EI+) 402.2151 (M+. C22H30N2O5の計算値402.2155).
(8aS)−メチル−スピロ[シクロヘキサン−1、3(4H)−テトラヒドロピロロ[1,2−a]ピラジン]−1、4(2H)−ジオン(環状シクロヘキシル−G−2MeP)
メタノール(3.3cm3)中アミド15(40mg、0.01mmol)の溶液に活性炭(1.6mg、0.015mmol)上で10%Pdを加え、容器に水素ガスを流した。得られた懸濁液を水素雰囲気下で61.5時間勢いよく撹拌し、次いでCelite(商標)パッドを通してメタノール(15cm3)で濾過した。ろ液を減圧下で乾燥まで濃縮し、黄色半流動体を生じさせ、逆相C18フラッシュカラムクロマトグラフィー(0〜10%CH3CN/H2O;グラジエント溶出)によって精製し、白色固体での環状シクロヘキシル−G−2MeP(19mg、81%)を産生した:融点174-177℃; [α]D -63.8 (CH2Cl2中c 1.13); νmax (フィルム)/cm-1 3215, 2925, 2854, 1667, 1646, 1463, 1427, 1276, 1232, 1171, 1085, 1014, 900, 868, 818, 783, 726および715; δH (400 MHz, CDCl3) 1.31-1.89 (12H, m, 9 x シクロヘキシル-Hおよび8a-CH3), 1.94-2.15 (4H, m, 7-H2および8-H2), 2.26 (1H, td, J 13.7および4.5, 1 x シクロヘキシル-H), 3.44-3.51 (1H, m, 6-HAHB), 3.79-3.86 (1H, m, 6-HAHB)および6.40 (1H, br s, N-H); δC (100 MHz, CDCl3) 19.5 (CH2, 7-C), 20.6 (CH2, シクロヘキシル-C), 20.8 (CH2, シクロヘキシル-C), 24.5 (CH2, シクロヘキシル-C), 25.0 (CH3, 8a-CH3), 33.7 (CH2, シクロヘキシル-C), 36.3 (CH2, 8-C), 36.5 (CH2, シクロヘキシル-C), 44.7 (CH2, 6-C), 59.5 (四重線, 8a-C), 64.0 (四重線, 3-C), 168.1 (四重線, 4-C)および171.6 (四重線, 1-C); m/z (EI+) 236.15246 (M+. C13H20N2O2の計算値236.15248).
(例3)
(8aS)−アリル−ヘキサヒドロピロロ[1,2−a]ピラジン]−1、4−ジオン(環状G−2−アリルP)の合成
Figure 2016525547
スキーム3:試薬、条件および収量:(i)LDA、THF、−78℃、臭化アリル、−78−>−30℃、N2、4時間(60%);(ii)塩化アセチル、CH3OH、還流、N2、24時間(63%);(iii)Et3N、BoPCl、CH2Cl2、RT、N2 19.5時間(45%);(iv)TFA、CH2Cl2、1時間、次いでEt3N、CH2Cl2、23時間(37%)。
(2R,5S)−4−アリル−2−トリクロロメチル−1−アザ−3−オキサビシクロ[3.3.0]オクタン−4−オン17
n−BuLi(1.31M、9.93cm3、13.0mmol)を、乾燥テトラヒドロフラン(20cm3)中のジイソプロピルアミン(1.82cm3、13.0mmol)の撹拌溶液に−78℃窒素雰囲気下で、滴下で加えた。溶液を5分間撹拌し、0℃に温め、15分間撹拌し、次いで乾燥テトラヒドロフラン(40cm3)中プロオキサゾリジノン16(2.12g、8.68mmol)の溶液に−78℃で20分間かけて滴下で加え、反応混合物をさらに30分間撹拌し、臭化アリル(2.25cm3、26.0mmol)を5分間かけて滴下で加えた。溶液をゆっくり−30℃に4時間かけて温め、H2O(30cm3)でクエンチし、混合物を室温に温め、クロロホルム(3×80cm3)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥し(MgSO4)、濾過し、減圧中で乾燥まで蒸発させ、暗茶色半流動体を産生し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(10〜20%酢酸エチル−ヘキサン;グラジエント溶出)によって精製し、0℃で固化するオレンジ色油でのオキサゾリジノン17(1.48g、60%)を産生し、それについてのnmrデータは文献において報告されたものと一致した:δH (400 MHz, CDCl3) 1.58-1.92 (2H, m, Proγ-H2), 1.96-2.14 (2H, m, Proβ-H2), 2.50-2.63 (2H, m, Proδ-H2), 3.12-3.23 (2H, m, CH2-CH=CH2), 4.97 (1H, s, NCH), 5.13-5.18 (2H, m, CH=CH2)および5.82-5.92 (1H, m, CH=CH2); δC (100 MHz, CDCl3) 25.1 (CH2, Proγ-C), 35.1 (CH2, Proβ-C), 41.5 (CH2, Proδ-C), 58.3 (CH2, CH2CH=CH2), 71.2 (四重線, Proα-C), 100.4 (四重線, CCl3), 102.3 (CH, NCH), 119.8 (CH2, CH2CH=CH2), 131.9 (CH, CH2CH=CH2)および176.1 (四重線, C=O); m/z (CI+) 284.0009 [(M+H)+. C10H13 35Cl3NO2の計算値284.0012], 285.9980 [(M+H)+. C10H13 35Cl2 37ClNO2の計算値285.9982], 287.9951 [(M+H)+. C10H13 35Cl37Cl2NO2の計算値287.9953]および289.9932 [(M+H)+. C10H13 37Cl3NO2の計算値289.9923].
メチルL−2−アリルプロリネートハイドロクロリド18
乾燥メタノール(15cm3)中のオキサゾリジノン17(0.64g、2.24mmol)の氷冷溶液をメタノール(5cm3)中の塩化アセチル(0.36cm3、5.0mmol)の溶液で、滴下で処置した。溶液を還流下で24時間加熱し、次いで冷却し、溶媒を減圧下で除去した。得られた茶色の油をトルエン(40cm3)に溶解し、残存塩化チオニルおよびメタノールを除去するために乾燥まで濃縮し、次いでフラッシュカラムクロマトグラフィー(5〜10%CH3OH−CH2Cl2;グラジエント溶出)によって精製し、緑色固体でのハイドロクロリド18(0.29g、63%)が得られ、それについてのNMRデータは文献において報告されたものと一致した:δH (300 MHz, CDCl3) 1.72-2.25 (3H, m, Proβ-HAHBおよびProγ-H2), 2.32-2.52 (1H, m, Proβ-HAHB), 2.72-3.10 (2H, m, Proδ-H2), 3.31-3.78 (2H, m, CH2CH=CH2), 3.84 (3H, s, CO2CH3), 5.20-5.33 (2H, m, CH=CH2), 5.75-5.98 (1H, m, CH=CH2)および8.06 (1H, br s, N-H); m/z (CI+) 170.1183 [(M+H)+. C9H16NO2の計算値170.1181].
メチル−N−tert−ブチルオキシカルボニル−グリシル−L−2−アリルプロリネート20
乾燥トリエチルアミン(0.28cm3、2.02mmol)を乾燥ジクロロメタン(35cm3)中のハイドロクロリド18(0.13g、0.63mmol)およびN−tert−ブチルオキシカルボニル−グリシン19(0.14g、0.82mmol)の溶液に窒素雰囲気下、室温で、滴下で加え、反応混合物を10分間撹拌した。Bis(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィン酸塩化物(BoPCl、97%)(0.20g、0.80mmol)を加え、溶液を19.5時間撹拌した。次いで10%塩酸水(35cm3)および飽和炭素水素ナトリウム水(35cm3)で連続的に洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、減圧下で乾燥まで蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(40%酢酸エチル−ヘキサン)によって得られた残渣の精製は、淡黄色油でのジペプチド20(0.09g、45%)を生じた:[α]D +33.8 (CH2Cl2中c 0.83); νmax (フィルム)/cm-1 3419, 3075, 2977, 2930, 2874, 1739, 1715, 1656, 1499, 1434, 1392, 1366, 1332, 1268, 1248, 1212, 1168, 1122, 1051, 1026, 1003, 943, 919, 867, 830, 779, 739, 699および679; δH (300 MHz, CDCl3) 1.42 [9H, s, C(CH3)3], 1.93-2.08 (4H, m, Proβ-H2およびProγ-H2), 2.59-2.67 (1H, m, CHAHBCH=CH2), 3.09-3.16 (1H, m, CHAHBCH=CH2), 3.35-3.44 (1H, m, Proδ-HAHB), 3.56-3.62 (1H, m, Proδ-HAHB), 3.70 (3H, s, OCH3), 3.89 (2H, d, J 4.2, Glyα-H2), 5.06-5.11 (2H, m, CH=CH2), 5.42 (1H, br s, Gly-NH)および5.58-5.72 (1H, m, CH=CH2); δC (75 MHz, CDCl3) 23.7 (CH2, Proγ-C), 28.3 [CH3, C(CH3)3], 35.0 (CH2, Proβ-C), 37.6 (CH2, CH2CH=CH2), 43.3 (CH2, Glyα-C), 47.5 (CH2, Proδ-C), 52.5 (CH3, OCH3), 68.8 (四重線, Proα-C), 79.5 [四重線, C(CH3)3], 119.4 (CH2, CH=CH2), 132.9 (CH, CH=CH2), 155.7 (四重線, NCO2), 166.9 (四重線, Gly-CON)および173.8 (四重線, CO2CH3); m/z (EI+) 326.1845 (M+. C16H26N2O5の計算値326.1842).
(8aS)−アリル−ヘキサヒドロピロロ[1、2−a]ピラジン−1、4−ジオン(環状G−2アリルP)
ジクロロメタン(9cm3)中のジペプチド20(0.09g、0.28mmol)の溶液に室温でトリフルオロ酢酸(1cm3、0.013mmol)を滴下で加え、反応混合物を1時間、窒素雰囲気下で撹拌した。溶液を減圧下で蒸発させ、無色の油が生じ、ジクロロメタン(10cm3)に溶解し、乾燥トリエチルアミン(0.096cm3、0.69mmol)を加え、反応混合物を4.5時間撹拌した、次にトリエチルアミン(0.096cm3、0.69mmol)をさらに加えた。反応混合物を一晩撹拌し、乾燥まで濃縮して緑色の油が生じ、フラッシュカラムクロマトグラフィー(10%CH3OH−CH2Cl2)によって精製し、オフホワイト固体での環状G−2アリルP(20mg、37%)を生じた:融点106-109℃; [α]D -102.7 (CH2Cl2中c 0.95); νmax (CH2Cl2)/cm-1 3456, 3226, 2920, 1666, 1454, 1325, 1306, 1299, 1210, 1133, 1109, 1028, 1010, 949, 928, 882, 793, 761および733; δH (400 MHz, CDCl3) 1.92-2.01 (2H, m, Proγ-H2), 2.09-2.16 (2H, m, Proβ-H2), 2.39-2.56 (2H, m, CH2CH2=CH2), 3.46-3.53 (1H, m, Proδ-HAHB), 3.78-3.87 (2H, m, Proδ-HAHBおよびGlyα-HAHB), 4.09 (1H, d, J 17.2, Glyα-HAHB), 5.16-5.20 (2H, m, CH=CH2), 5.73-5.84 (1H, m, CH=CH2)および7.17 (1H, br s, N-H); δC (100 MHz, CDCl3) 20.1 (CH2, Proγ-C), 34.1 (CH2, Proβ-C), 41.7 (CH2, CH2CH2=CH2), 44.9 (CH2, Proδ-C), 46.4 (CH2, Glyα-C), 67.2 (四重線, Proα-C), 120.9 (CH2, CH=CH2), 131.0 (CH, CH=CH2), 163.4 (四重線, NCO)および171.7 (四重線, CONH); m/z (EI+) 195.1132 (M+. C10H15N2O2の計算値195.1134).
(例4)
(8aS)−メチル−スピロ[シクロペンタン−1,3(4H)−テトラヒドロピロロ[1,2−a]ピラジン]−1,4(2H)−ジオン(環状シクロペンチル−G−2−MeP)の合成
Figure 2016525547
スキーム4:試薬、条件および収量:(i)Et3N、HOAt、CIP、1,2−ジクロロエタン、83℃、N2、19時間(23%);(ii)10%Pd/C、CH3OH、RT、17時間(65%)。
N−ベンジルオキシカルボニル−1−アミノシクロペンタン−1−カルボン酸21
ジオキサン(2.5cm3)中のベンジルクロロホルメート(0.290g、1.1mmol)の溶液に水(5cm3)中の1−アミノシクロペンタンカルボン酸(Fluka)(0.2g、1.54mmol)および炭酸ナトリウム(0.490g、4.64mmol)の溶液を0℃で、滴下で加えた。撹拌を室温で一晩継続し、反応混合物をエーテルで洗浄した。水層を2M塩酸で酸性化し、酢酸エチルで抽出し、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、溶媒を除去し、静置で固化する油でカルバメート21(0.253g、62%)をもたらした。カルバメート21は1H NMR分析によって立体構造異性体の70:30混合物であることが示された(比は、多数および少数の立体構造異性体のN−Hプロトンにそれぞれ帰属されるδ5.31および7.29〜7.40での共鳴の積分から推定した):融点70-80℃ (文献1 82-86℃, エチルアセテート, 石油エーテル); δH (400 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.83 (4H, br s, 2 x シクロペンチル-H2), 2.04 (2H, br s, シクロペンチル-H2), 2.20-2.40 (2H, m, シクロペンチル-H2), 5.13 (2H, br s, OCH2Ph), 5.31 (0.7H, br s, N-H)および7.29-7.40 (5.3H, m, PhおよびN-H*); δC (100 MHz; CDCl3) 24.6 (CH2, シクロペンチル-C), 37.5 (CH2, シクロペンチル-C), 66.0 (四重線, シクロペンチル-C), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 128.0 (CH, Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.4 (CH, Ph), 136.1 (四重線, Ph), 155.8 (四重線, NCO2)および179.5 (四重線, CO2H).
メチルN−ベンジルオキシカルボニルシクロペンチル−グリシル−L−2−メチルプロリネート22
乾燥トリエチルアミン(0.19cm3、1.4mmol)を乾燥1,2−ジクロロエタン(24cm3)中のハイドロクロリド10(78mg、0.43mmol)、カルボン酸21(0.15g、0.56mmol)および1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(Acros)(15mg、0.11mmol)の溶液に窒素雰囲気下、室温で、滴下で加え、反応混合物を10分間撹拌した。2−クロロ−1,3−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(CIP)(Aldrich)(0.12g、0.43mmol)を加え、得られた溶液を還流下で19時間加熱し、10%塩酸水(30cm3)および飽和炭素水素ナトリウム水(30cm3)で連続的に洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、減圧下で乾燥まで蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(60%酢酸エチル−ヘキサン)による得られた残渣の精製は、白色固体でのアミド22(39mg、23%)を生じた。アミド22は、13C NMR分析によって、trans:cisが3:1のカルバメート立体構造異性体の混合物として存在することが示された(比は、多数および少数の立体構造異性体それぞれのカルバメートカルボニル−C原子に帰属されるδ154.1および155.7での共鳴の相対強度から推定した):融点200-203℃; [α]D -54.5 (CH2Cl2中c 1.52); νmax (フィルム)/cm-1 3432, 3239, 3042, 2953, 1736, 1712, 1627, 1540, 1455, 1417, 1439, 1374, 1282, 1256, 1216, 1194, 1171, 1156, 1136, 1100, 1081, 1042, 1020, 107, 953, 917, 876, 756および701; δH (400 MHz, CDCl3) 1.33-1.53 (3H, br m, Proα-CH3), 1.62-2.20 (11H, m, Proβ-H2, Proγ-H2および7 x シクロペンチル-H), 2.59-2.71 (1H, br m, 1 x シクロペンチル-H), 3.31-3.42 (1H, br m, Proδ-HAHB), 3.58-3.79 (4H, br m, OCH3およびProδ-HAHB), 4.92-5.17 (3H, m, N-HおよびOCH2Ph)および7.27-7.42 (5H, s, Ph); δC (100 MHz, CDCl3) 21.7 (CH3, Proα-CH3), 24.1* (CH2, シクロペンチル-C), 24.2 (CH2, シクロペンチル-C), 24.4 (CH2, Proγ-C), 24.5 (CH2, シクロペンチル-C), 36.4 (CH2, シクロペンチル-C), 37.1 (CH2, シクロペンチル-C), 37.2* (CH2, シクロペンチル-C), 37.7 (CH2, Proβ-C), 38.2* (CH2, シクロペンチル-C), 48.5 (CH2, Proδ-C), 52.1 (CH3, OCH3), 66.6 (CH2, OCH2Ph), 66.9 (四重線, Proα-C), 67.2 (四重線, Glyα-C), 127.8 (CH, Ph), 128.2 (CH, Ph), 128.4 (CH, Ph), 136.6 (四重線, Ph), 154.1 (四重線, NCO2), 155.7* (四重線, NCO2), 170.5 (四重線, Gly-CO)および174.7 (四重線, CO2CH3); m/z (EI+) 388.1991 (M+. C21H28N2O5の計算値388.1998).
―――――――――――――
*は少数の立体構造異性体に割り当てられた共鳴を示す。
(8aS)−メチル−スピロ[シクロペンタン−1,3(4H)−テトラヒドロピロロ[1、2−a]ピラジン]−1,4(2H)−ジオン(環状シクロペンチル−G−2MeP)
メタノール(4.6cm3)中のアミド22(54mg、0.14mmol)の溶液に活性炭(2.2mg、0.021mmol)上で10%Pdを加え、容器に水素ガスを流した。得られた懸濁液を水素雰囲気下で17時間勢いよく撹拌し、次いでCelite(商標)パッドを通してメタノール(15cm3)で濾過した。ろ液を、減圧下で乾燥まで濃縮し、黄色半流動体を生じ、逆相C18フラッシュカラムクロマトグラフィー(0〜10%CH3CN/H2O;グラジエント溶出)によって精製し、黄色固体で環状シクロペンチル−G−2MeP(20mg、65%)をもたらした:融点160-163℃; [α]D -97.9 (CH2Cl2中c 1.61); νmax (フィルム)/cm-1 3429, 2956, 2928, 2856, 1667, 1643, 1463, 1432, 1373, 1339, 1254, 1224, 1175, 1086, 1048, 976, 835, 774および730; δH (300 MHz, CDCl3) 1.47 (3H, br s, 8a-CH3), 1.56-2.19 (11H, m, 8-H2, 7-H2および7 x シクロペンチル), 2.58-2.67 (1H, br m, 1 x シクロペンチル), 3.48-3.56 (1H, m, 6-HAHB), 3.72-3.82 (1H, m, 6-HAHB)および6.56 (1H, br s, N-H); δC (75 MHz, CDCl3) 19.9 (CH2, 7-C), 24.6 (CH2, シクロペンチル), 24.92 (CH3, 8a-CH3), 24.93 (CH2, シクロペンチル), 36.0 (CH2, 8-C), 38.7 (CH2, シクロペンチル), 41.9 (CH2, シクロペンチル), 44.8 (CH2, 6-C), 64.3 (四重線, 8a-C), 66.8 (四重線, 3-C), 168.3 (四重線, 4-C)および172.2 (四重線, 1-C); m/z (EI+) 222.1369 (M+. C12H18N2O2の計算値222.1368).
in vitroおよびin vivo試験
次の薬理学的研究は、認知障害の減弱における環状G−2−アリルPの有効性を実証している。それらは、限定されることを意図せず、本発明の他の組成物および方法は過度の実験を伴うことなく開発できる。これらの組成物および方法すべては、本発明の一部であるとみなされる。次のすべての実験は、University of Auckland Animal Ethics Committeeまたは同等の規制機関によって承認された指針の下で開発されたプロトコールを使用して実行した。
向知性薬の有効性は、コリン作動機能低下のモデルを使用して好都合に試験できる。コリン作動機能低下は、認知症関連認知機能低下に寄与することが示されており、アルツハイマー病に対する治療介入の標的であり続けている(Hunter 2004)。コリン作動機能低下モデルは、他の状態にも適用可能である。例えば、スコポラミン誘発コリン作動機能低下は、嫌悪感および怒りの顔面発現の認識精度を選択的に損ない、感情認識へのスコポラミンの効果をハンチントン病患者において見出されるものに類似のものにすることが示されている(Kamboy 2006)。スコポラミンは、コリン作動機能低下を誘発するために一般に使用されており、ヒトアルツハイマー病、加齢および認知機能の他の障害に対する十分周知のモデルである(Liskowsky et al, Int. J. Dev. Neurosci, 24(2-3):149-156 (2006)、Lindner et al., Psychopharmacology (Berl.) Sept 27 (2006)、Bouger et al., Eur. Neuropsychopharmacol 15(3):331-346 (2005)、Ebert et al, Eur. J. Clin. Invest., 28(11):944-949 (1998)、Barker et al, Int. J. Geriatr. Psychiatry, 13(4):244-247 (1998)、G. Smith, Brain Res. 471(2): 103-118 (1998)、Flood et al, Behav. Neural. Biol. 45(2): 169-184 (1986))。
(例5)
認知機能への環状G−2−アリルPの効果を評価するために使用した学習および記憶のモリス水迷路(MWM)モデル
研究の目的は、失認および感情状態(不安症)の様式において環状G−2アリルPを調査することである。
方法
研究の最初の部分は、モリス水迷路記憶(MWM)モデルにおけるcG−2−アリルPの急性試験を含んだ。MWM試験は、ラットにおいて空間記憶を評価するために最も頻繁に使用される試験の1つであり、一般に空間記憶への疾患および処置の効果を正確に予測することが十分に認められている。したがってMWM試験は、ヒト対象における疾患および処置の効果を反映する。
MWMのための標準的手順は次のとおりであった。本発明者らは、不透水を満たし、温度を20℃に維持した環状水泳プール(深さ80cm×直径150cm)を使用した。プラットフォームを水面の1cm下に隠し、視覚的手がかりのためにプラットフォームの20cm上に、および空間的手がかりのために出発位置の3時の位置のどちらにも位置付けられた白色旗(10cm×10cm)を有した。実験の1〜4日目にラットは、各試験日に6回試行(各60秒間)で記憶取得試行を受けた(馴化期)。プラットフォームに達するための待ち時間を記録し、平均待ち時間の日々の低減を隠されたプラットフォームがどこにあるかを学習するための能力の目安として使用した。
実験5日目に正常、非加齢ウィスターラットを生理食塩水(n=28)または記憶欠損を誘発するためのスコポラミン(0.5mg/kg、i.p.、n=27)のいずれかを受ける群に分けた。プローブ試験を開始する半時間前にスコポラミンを投与した。
スコポラミン処置の10分後、環状G−2アリルPを30mg/kg(n=31)で経口投与し、ビヒクル処置動物には同一の処置プロトコールを使用する経口経管栄養によって希釈剤が投与された(n=24)。
次いでcG−2−アリルPの急性の効果を記憶処理への任意の直接的薬理学的効果を判定するために、スコポラミン誘発記憶障害を有する動物および記憶障害を有さない同年齢の対照動物において試験した。実験群を下の表4に詳述する。
Figure 2016525547
5日目に、プローブMWM試験を、プラットフォームを除去して実施した。6回試行を行い、それぞれの最大持続時間は60秒間、試行間に少なくとも5分間の休息)。ラットがプラットフォーム近くを泳いだ時間の長さは、プラットフォームを位置付けるために彼らが非空間的戦略の使用するのではなく視覚的および空間的手がかりにどの程度頼っているかの目安を提供した。データを回収し、Any−maze(v4.2)ソフトウェアを使用して分析した。
行動試験から生成されたデータを年齢群間の差異を判定するために一元配置ANOVAを使用して分析した。処置時点を依存因子として二元配置ANOVAを行動結果の進展を検討するために使用した。GraphPad Prismバージョン3.02をデータ分析のために使用した。
結果
スコポラミンでの処置は、処置した動物において空間記憶の取得を顕著に損なった(プラットフォームへの時間は4日目に対照のおよそ208%)。環状G−2アリルP(30mg/kg;毎日)は、スコポラミンによって誘導された認知障害を顕著に回復させた(図1A、1B、1C)。
(例6)
cG−2−アリルPは、シナプス可塑性および加齢関連記憶消失を改善する。
方法
加齢ラット(雄ウィスターラット、18〜20月齢)を4群に分けた:2群はビヒクル処置(群1および3)ならびに2群はG−2−アリルP処置(群2および4)(すべての群でn=6〜8)。環状G−2−アリルPをDepartment of Medicinal Chemistryによって合成し、処置前に通常の生理食塩水に溶解した。1日目に環状G−2−アリルPの単一用量を群2および4の動物に中枢で与えた(20ng/動物、i.c.v.);生理食塩水を群1および3に投与した。新規物体認知試験を使用する記憶試験を処置後3日目(群1および2)または24日目(群3および4)のいずれかで開始した。NORTの完了時にラットを過剰量のペントバルビタールナトリウムで屠殺し、通常の生理食塩水に続いて、10%ホルマリンで経心的に灌流した。群1および2においては7日目に、群3および4については28日目に組織を回収した。脳は、標準的パラフィン包埋手順を使用する処理の前に最低でも2日間同じ固定剤中に保った。簡潔には、組織の小塊(10×10×3mm)を24時間まで固定した。次いで塊をパラフィンに浸漬し、包埋し、紐状に切り、スライドに載せた。次いでスライドを、免疫染色を開始するまで保存した。脳組織におけるシナプス形成を、免疫組織化学的染色を使用して検討した。
新規物体認知試験(NORT)
探索的活動(exploratory activity)は、新たな環境においてヒトおよびラットを含む動物によって示される典型的な学習行動である。探索的活動は、新たなものが見慣れたものになる場合に経時的に減少し、馴化が生じる。見慣れた環境では探索的活動は、新規物体の導入によって再活性化できる。馴化後に環境が変化した場合の探索的行動(exploring behaviour)の増加は、親密性についての記憶および新規性の認知についての目安を提供する。
この例において本発明者らは、2回のNORTを実行した、1回は3〜6日目および他方は24〜27日目。ラットをNORTの初日に試験活動領域(90×60×40cm)に親しませるようにした。各試験の2日後に4個の新規物体を試験活動領域に置き、ラットは各日に2回の試行を受けた(各15分間、2時間離す)。物体を探索することに費やした時間は、試験した動物が物体について学習すると低減した(訓練期)。最終日(各試験の4日目)に、1つの見慣れた物体を第2回の試行の前に新規物体で置きかえた(試験6、試験期)。3個の見慣れた物体を探索することに費やした平均時間および新規物体の探索に費やした時間を親密性の記憶および新規性の認知についての目安として使用した。
海馬におけるNMDA受容体、AMPA受容体、rKrox−24およびシナプトフィジンmRNAの発現へのcG−2−アリルPの効果
ヒトおよび動物における海馬形成が多数の記憶型において重要な役割を演じていることは認められている(Morris et al. 2006 Europ. J. Neurosci. 23, 2829)。特異的機能は論争中であるが、海馬が、注意経験の自動コード化および初期保存(エピソード記憶形成)、記憶固定および新規性検出における鍵となる役割を演じていることは理解されている。第一の態様である記憶のコード化および短期保存は、シナプス可塑性およびシナプス伝達に依存しており、両者ともグルタミン酸神経伝達に関連している。
グルタミン酸神経伝達は、2種類のグルタミン酸受容体:N−メチル−D−アスパラギン酸受容体(NMDAR)およびa−アミノ−3−ヒドロキシ−5−メチル−4−イソキサロンプロピオン酸受容体AMPAまたは非NMDA受容体によって促進される。
APMA受容体サブユニットGluR1は、シナプス後受容体であり、記憶測定のために一般に使用されている。GluR1は、カルシウム流入を介在すると考えられており、学習に関連するシナプス可塑性に重要な機能を有している。シナプスへのGluR1の取り込みは、学習および記憶に不可欠である長期増強(LTP)に対して重要である可能性があることが既に示唆されている(Hayashi et al, 2000)。
NMDA受容体サブユニットNR1が空間記憶の形成のために不可欠であることが実証された。CA1領域の錐体細胞におけるNMDA受容体のRlサブユニットが選択的にノックアウトされているノックアウトモデルでは、長期増強が消失することが示された(Tsien 1996)。
シナプトフィジンはシナプス前小胞タンパク質である。その定量的検出は、シナプス密度の分子マーカーとして確立されている。
ニューロン転写因子Krox24染色をニューロン可塑性についてのマーカーとして使用する。Krox24ファミリー(および脳由来神経栄養因子、BDNF)のタンパク質産生物は、NMDA受容体介在海馬性LTPおよびLTDの際に生じるシナプス修飾安定化に近年関連付けられている(Dragunow. 2006. Behaviour genetics. 23 ; 293)。
免疫組織化学的染色
従来の脱パラフィン化および再水和技術を使用して、水をベースとする緩衝液および抗体を組織切片に浸透させた。抗原の探索は、AMPA受容体(GluR1)染色の前にだけ使用し、すなわちスライドを沸騰クエン酸緩衝液中に置き、冷却した。
次の抗体を使用した:
i)NMDA NR1サブユニットに対する一次ウサギ抗体、緩衝液中1:200濃度、48時間インキュベート(Chemicon−AB1516)、次いでSigma蛍光二次抗体(alexaFluor594)、1:200希釈、40C、24時間インキュベート。
ii)AMPA GluR1サブユニットに対する一次抗体、緩衝液中1:50濃度、48時間インキュベート(Chemicon−AB1504)、次いで3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)、1:200希釈、40C、24時間インキュベート。
iii)mシナプトフィジンに対する一次抗体(Sigma−S5768)、緩衝液中1:200濃度、次いでDAB、1:200希釈、40C、24時間インキュベート)。
iv)rKrox−24に対する一次抗体(Santa Cruz−カタログ番号SC−189)、緩衝液中1:200濃度、次いで抗ウサギ二次抗体、1:200希釈の濃度、40C、24時間インキュベート。
(e)抗体を、光学顕微鏡を使用して検出した。
結果
NORT
cG−2−アリルPで処置した群における新規性認知の改善傾向が27日後に観察された(図2)が、処置6日後にはされなかった(図無し)。本発明者らは、cG−2−アリルP処置が27日目に薬物処置動物において新規性認知を改善したと結論付けている。
AMPAグルタミン酸受容体−1染色
領域CA1(顆粒細胞層、多形細胞層および放線状層)およびCA3(錐体細胞層)由来の海馬切片をAMPA受容体GluR1について染色した。
CA3では、7または28日目のいずれでも各領域における受容体の数に変化はなかった。しかし28日目にCA1(顆粒細胞層)(図4)およびCA1多形細胞層(図5)におけるAMPA受容体の数に顕著な増加があった。
この組織学的変化は、新規物体認知試験における成績の改善と相関した。記憶の改善(図2)は、AMPAグルタミン酸受容体−1の上昇と相関した(図3)。本発明者らは、cG−2−アリルPがシナプス後レベルでグルタミン酸神経伝達(GluR1)を改善したと結論付けた。
本発明者らは、cG−2−アリルP処置がシナプス後でのGluR1染色における長期増加およびシナプス前小胞の密度の増加を生じたことを観察した。海馬における小胞の大部分がグルタミン酸小胞であることから、本発明者らは、長期記憶改善がグルタミン酸神経伝達の増加と関連したと結論付けた。
シナプトフィジン染色
本発明者らは、次に海馬のCA3およびCA1領域におけるシナプトフィジン染色のレベルへのcG−2−アリルPの効果を分析した。
試験したすべてのエリアにおいて、処置後28日でのシナプトフィジン染色の密度における顕著な増加(CA3)または増加への明らかな傾向(CA1−多形細胞層および放線状層)があった。この増加は、増加したシナプス可塑性のマーカーであり、記憶試験を適用される処置群の成績における改善の最も可能性が高い原因であるシナプス形成の明らかな指標である。
NMDA受容体−1染色
処置後のAMPA受容体において顕著な改善がある一方で、NMDA受容体における変化はあまり明白ではない(図9A、9Bおよび9C)。
Krox24染色
本発明者らは、海馬のCA1−2領域におけるKrox24染色の密度を分析した。本発明者らは、ビヒクル処置群と比較して処置群における密度の増加傾向を観察した。本発明者らは、Krox24染色結果が記憶機能の改善に正に相関すると結論付けている(図10)。
(例7)
cG−2−アリルPは、ミドルエイジラットの海馬におけるシナプス前小胞の数を増加させる。
方法
4匹のミドルエイジウィスター雄ラット(12月齢)を2群に分けた:1つはビヒクル処置(n=2)および1つはcG−2−アリルP処置(n=2)。ラットを3mg/kg/日の生理食塩水またはcG−2−アリルPのいずれかで皮下的に7日間処置した。実験21日目に動物を屠殺し、海馬組織を回収した。組織の半薄セクションをOsO4で固定し、レジンに包埋した。CA1多形細胞層およびCA3セクションを次いで超薄、80nm切片に切片化し、ウラニルアセテートおよびクエン酸鉛で染色した。動物1匹当たりシナプスおよそ50個を分析し、分類されたシナプス型および小胞密度を、AnalySIS(登録商標)を使用して測定した。
透過型電子顕微鏡をスライド上の小胞の総数を計数するために使用した。平均密度を、総面積を測定し(AxioVisionソフトウェアを使用)、小胞の数を使用することによって算出した。本発明者らは、シナプス後密度(PSD)に並列して200nm×200nm四角における小胞密度を算出するためにYoshida et al. 97、Journal of Neurochemistryにおける手順に従った。
結果
図6は、処置後24日での海馬のCA3領域におけるシナプス前染色の密度の増加傾向へのcG−2−アリルPの効果を示すグラフである。
図7は、処置後24日でのCA1領域の多形細胞層におけるシナプス前染色の密度の増加傾向へのcG−2−アリルPの効果を示すグラフである。
図8は、処置後24日でのCA1領域の放線状層におけるシナプス前染色の密度の増加傾向へのcG−2−アリルPの効果を示すグラフである。
海馬のCA1およびC3サブ領域におけるシナプス前小胞の数は、処置後21日でビヒクル処置動物と比較してcG−2−アリルP処置(3mg/kg/日×7日、皮下)後に増加した(図11)。
本発明者らは、これらの研究からスコポラミン処置が動物において認知機能を減少させることができ、これらの変化が種々の神経学的状態の1つまたは複数を有するヒトにおける認知障害を模倣できると結論付けている。追加的に本発明者らは、cG−2−アリルPがスコポラミン処置動物および通常の加齢関連認知障害を有する動物において認知機能を改善できると結論付けている。さらに本発明者らは、cG−2−アリルPがシナプス形成を増加できる、AMPA受容体を増加できる、神経可塑性を増加できる、シナプス修飾を安定化できるおよび新規性認知を増加できると結論付けている。
したがってこれらの研究は、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の慢性神経障害、ならびに加齢に関連する認知障害を罹患しているヒトを含む動物における種々の認知障害を処置するための有効な薬理学的薬剤としてのcG−2−アリルPの使用を支持している。
(例8)
小脳細胞外植への環状G−2−アリルPおよび環状シクロペンチル−G−2MePの効果
cG−2−アリルPおよび環状シクロペンチル−G−2−MePのin vitroでのニューロン細胞への効果を判定するために、成体ラット由来小脳外植を使用して一連の研究を実行した。in vitro系は、ニューロン増殖、神経突起増殖、神経束の形成、および神経細胞への毒素の影響、in vivoで観察された並列効果を研究するために好適である。それによりin vitro小脳外植を使用する研究の結果は、in vivo介入の効果を予測する。
研究の第1シリーズでは、小脳外植へのグルタミン酸の効果を判定した。生理学的濃度でグルタミン酸は、ヒトを含む哺乳動物のCNSにおける神経伝達物質である。しかし十分に高い濃度でグルタミン酸は、神経毒性であり、ニューロン細胞死を生じる。グルタミン酸がヒトを含む哺乳動物のCNSにおける天然に存在する神経伝達物質であり、グルタミン酸神経毒性が当技術分野において細胞死および変性を含む一般的神経毒性を反映すると認識されていることから、それは神経変性および神経細胞死の処置において効果的な薬剤を同定および特徴付けるための価値のある有用なツールである。
材料および方法
カバーガラスを大きなペトリ皿に置き、70%アルコールで5分間洗浄し、次いでMillipore H2Oで洗浄した。カバーガラスを空気乾燥し、ポリ−D−リジン(PBS中1mg/mlストック溶液、90〜100μ1)で2時間、34℃でコートした。
小脳組織の抽出
出生後8日のウィスターラットを研究のために使用した。ラットを屠殺し、氷中に1分間置き、断頭し、小脳を取り、氷上に置いた。小脳組織を大きなペトリ皿で0.65%グルコースを補充したPBS(PBS1ml当たり10μlの65%のストックD(+)グルコース)1mlに置き、さらに小さなセクションに刻み、23G(0.4mm)針を介して1mlインスリンシリンジで粉砕し、次いで大きなペトリ皿のグルコース溶液中に勢いよく戻した。組織を(125μmポアサイズガーゼ)を通して篩いにかけ、培地を無血清BSA補充−START V培地(Biochrom、Germany)に交換するために2回遠心分離(60gで2分間)した。2回目の遠心分離ステップは、START V培地1mlで行った。マイクロ外植片をSTART V培地500μlに再構成し、氷上に置いた。
小脳細胞の培養
PDL−コーティングの2時間後、スライドをMillipore H2Oで洗浄し、空気乾燥した。各スライドを小さなペトリ皿(直径:35mm)に置き、40μl START V/細胞懸濁液を加えた。組織を2時間、34℃でインキュベートした(定着期)。次いでSTART V培地(1ml)をペトリ皿に加え、34℃、大気中5%CO2の存在下、湿度100%で48時間培養した。
薬物適用
研究のために、特定の外植培養物をビヒクル(PBS)だけに曝露した。第1の研究では(研究1)、毒素1(Millipore水中100mM L−グルタミン酸;最終濃度:1mM)10μlおよび毒素2(Millipore水中50mM 3−ニトロプロピオン酸−pH7、最終濃度:0.5mM)10μlを試験する薬物と同時に適用した(PBS中に10mMストック溶液を調製し、最終濃度1〜100nMの間に希釈した)。それぞれの場合に薬物は、研究の期間中外植片に接触させたままにした。
薬物の効果を判定するための方法
外植を研究期に薬物に曝露した後、細胞をPBS中でリンスし、次いで漸増する濃度のパラホルムアルデヒド(0.4%PFA 500μlを適用;次いで1.2%PFA;次いで3%PFAおよび最終的に4%PFA(各固定ステップ:2〜3分間)中で固定した。最終的にマイクロ外植片をPBS中でリンスした。
次いで外植片中のニューロンを形態(神経突起の存在)について評価し、顕微鏡視野当たりの生細胞として計数した。最も高い細胞密度を示した視野4個をカバーガラス当たりで計数し、データを平均±平均の標準誤差(SEM)として示した;n=各4。統計的有意性を独立スチューデントのt検定を使用して評価した。
結果
環状G−2−アリルP
研究結果を図12に示す。グルタミン酸処置(1mM;塗りつぶしたバー)は、ビヒクル処置対照(無地バー)と比較して神経突起を有する小脳ニューロンの約85%消失を生じた。対照的にcG−2−アリルPは、グルタミン酸と同時に投与された場合(影を付けたバー)に用量依存的様式で.神経突起を有する細胞の数を顕著に増加させた。cG−2−アリルP(100pmから10nm)の低用量での処置は、グルタミン酸誘発神経毒性における顕著な減少を示した。
環状シクロペンチル−G−2−MeP
研究結果を図13に示す。環状シクロペンチル−G−2MePは、グルタミン酸と同時に投与された場合に神経突起を有する細胞の数を顕著に増加させた(薄い影を付けたバー)。環状シクロペンチル−G−2MePの低用量での処置は、グルタミン酸誘発神経毒性における顕著な減少を示した。
結論
cG−2−アリルPおよび環状シクロペンチル−G−2−MePの両方は、グルタミン酸誘発神経毒性を独立に減少または妨げ、両薬物が神経保護性であり、ニューロン変性または細胞死を阻害するために使用できることを示している。
(例9)
低酸素性虚血障害IへのcG−2−アリルPの効果
材料および方法
cG−2−アリルPが発作、心臓動脈バイパス移植術(CABG)または他の低酸素侵襲への応答におけるニューロン損傷を予防できるかどうかを判定するために、一連の研究を低酸素性虚血障害(HI)に曝露したラットにおいて実行した。
成体ラット(ウィスター、280〜310g、雄)を使用した。改変Levineモデル調製および実験手順を使用した(Rice et al, 1981, Ann. Neurol. : 9 : 131-141、Guan et al J., 1993, Cereb. Blood Flow Metab.: 13(4): 609- 16)。簡潔にこれらの手順は、一側性頸動脈結紮によって誘発されたHI損傷に続く、留置された側脳室カニューレを有する動物における吸引性窒息からなる。ガイドカニューレを定位的に硬膜最上部、正中線1.5mm右、両耳間のゼロ面7.5mm前方にハロタン麻酔下で置いた。カニューレ挿入2日後に右頸動脈を二重結紮した。麻酔から1時間回復後、各ラットを湿度(90±5%)および温度(31°±0.5℃)を管理したインキュベーターにさらに1時間入れ、次いで低酸素(6%酸素)に10分間曝露した。動物を処置前にさらに2時間インキュベーター内に保った。
9対のラットをcG−2−アリルP(2ng)またはそのビヒクル(通常の生理食塩水)のいずれかで低酸素虚血性侵襲2時間後に脳室内(icv)で処置した。各群のラットに、侵襲2時間後に浅麻酔(1.5%ハロタン)下でcG−2−アリルPまたはそのビヒクルを同時注入した。合計容量20μlをマイクロ注入ポンプによって20分間かけて注入(icv)した。
組織学的試験を低酸素性虚血障害の5日後のラットに実施した。ラットをペントバルビタールナトリウムの過剰投与で屠殺し、通常の生理食塩水に続いて10%ホルマリンで経心的に還流した。脳は、標準的パラフィン包埋手順を使用して処理する前に最低でも2日間同じ固定剤中に保った。
冠状セクション厚さ8μmを線条体から切り、大脳皮質および海馬をサイオニンおよび酸フクシンで染色した。組織学的結果を3種のレベルで評価した:(1)線条体の中央レベル、(2)完全な海馬が最初に出現した場所および(3)海馬の前角がちょうど出現した場所のレベル。組織傷害の重症度を線条体、皮質ならびに海馬のCA1−2、CA3、CA4および歯状回でスコア化した。組織傷害をニューロン消失(好酸性(赤)細胞質および萎縮した核)、汎壊死(pan−necrosis)ならびに細胞反応として同定した。組織傷害を次のスコア系を使用してスコア化した:0:組織傷害を示していない、1:<5%組織が傷害された、2:<50%組織が傷害された、3:>50%組織が傷害された、および4:>95%組織が傷害された。
結果および結論
この研究の結果を図14に示す。図14は、低酸素性虚血障害(各セットの左バー)が研究した脳の各エリアにおいて顕著な傷害スコアを生じたことを示している。図14は比較的低用量のcG−2−アリルP(各セットの右バー;2ng)の中心投与がビヒクル処置群と比較して検討した各脳領域において組織傷害を顕著に低減すること(p<0.001)も示している。
cG−2−アリルPが低酸素性虚血障害によって生じる神経傷害に対して、低酸素性虚血障害後に投与された場合でも、神経保護性である可能性があることが見られる場合がある。この驚くべき発見は、cG−2−アリルPが、神経変性または細胞死によって特徴付けられる種々の状態を処置するための有用な薬剤であることを示している。
(例10)
低酸素性虚血障害IIへのcG−2−アリルPの効果
材料および方法
例9に記載の材料および方法を使用し、処置群の数を増加させた。ラットを5つの処置群に分け、4用量のcG−2−アリルPの1つまたはそのビヒクル(通常の生理食塩水)で低酸素虚血性侵襲2時間後に脳室内(icv)で処置した(1:n=10、2ng;2:n=9、4ng;3:n=9、20ng;4:n=10、100ng;および5:n=9、ビヒクル)。
結果
図15は、低酸素だけ(ビヒクル)が研究した脳のすべてのエリアにおいてニューロン傷害スコアをもたらしたことを示している。cG−2−アリルPで処置した動物では、薬剤が低酸素/虚血性損傷後に投与されても低酸素はあまり影響を有さなかった。神経保護効果が線条体に投与された最も高い用量(100ng)を除くcG−2−アリルPのすべての用量について観察された。しかし他のすべての部位および他のすべての用量で、cG−2−アリルPは低酸素/虚血の神経傷害効果を和らげた。さらにcG−2−アリルPは、アポトーシスに関連するものなどの遅延型細胞死に関連する進行性の損傷を経験した脳領域において有効性の増加を有した。HI損傷にさらに耐性である歯状回および大脳皮質などの脳領域においては、線条体ならびに海馬のCA1−2、CA3およびCA4サブ領域などのHI損傷にさらに感受性である脳領域においてよりも、損傷の進行がより遅く、より重度であることが周知である。この結果は、cG−2−アリルPが慢性神経学的障害の処置において有益である可能性があることを示している。
(例11)
脆弱X症候群I一般的方法におけるcG−2−アリルPの効果
実験は、the United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act of 1986に従って実施した。Fmr1−KO2マウスおよび野生型(WT)同腹仔をC57BL/6Jバックグラウンドで生成し、C57BL/6Jバックグラウンドに8世代より多く繰り返し戻し交配し、Jackson’s laboratoryによってチリに送った。マウスを集団で飼い(ケージ当たり4〜6匹)、他に述べる場合を除いてすべての動物に餌および水を自由摂取させた。マウスを温度管理環境(21±1℃)で12時間明/暗周期(19:00から7:00まで照明を切る)で維持した。
課題を、1日当たり1つまで課題を実施して記載した順序で実施した。すべての実験は試験を実施する研究者およびマウスに注射する者に盲検であった。
パラメトリックデータを、二元配置ANOVA(対象因子間の遺伝子型および性別)を使用して分析した。データが正規性の仮定または等分散性に違反する場合、変換(log10または平方根)を利用した。反復測定のANOVAについて、分散の等質性を真球度のマクリーの検定を使用して試験し、これに違反する場合、ヒューン・フェルト補正を使用した。非パラメトリックデータをマンホイットニーのU検定を使用して分析した。全体を通じてp値<0.05を統計的に有意とみなした。
毒性の例は観察されなかった。動物を毛の外観における差異、立毛が存在するかどうか、眼の状態(涙眼またはポリフィア、眼瞼下垂)歩行外観、振戦、尾部緊張、操作への反応性などについて視診した。
(例12)
脆弱X症候群を有する動物由来の海馬ニューロンへのcG−2−アリルPの効果
cG−2−アリルPがニューロンに効果を与えることができるかどうかを調べるために、本発明者らは野生型マウスまたはfmr1ノックアウトマウス由来のニューロンについてin vitroで一連の研究を実行した。
方法
海馬細胞培養物を野生型およびfmr1ノックアウト胎仔マウス(妊娠14〜16日間)から調製した。簡潔には、マウスをクロロホルム麻酔下での頸椎脱臼によって屠殺し、分離した海馬細胞を15mmマルチウエル容器(Falcon Primaria)に置いた。10%ウシ胎仔血清を補充したMEM−イーグル塩(補給グルタミン不含有)のプレーティング培地を使用した。培養物を37℃、加湿した5%CO2雰囲気中に保持した。3日後、in vitro、緑色蛍光タンパク質(GFP)を、樹状突起棘形態形成を培養で経時的にモニターするために加えた(Ethell and Yamaguchi, 1999、Ethell et al., 2001、Henkemeyer et al, 2003)。樹状突起棘は、通常in vitroで7から14日目(DVI)の間に形成された。14DIVまでに大部分の樹状突起は棘であった。平均(±SD)棘密度をμm当たりの棘の数として測定し、実験は三回行った。
結果
これらの研究の結果を図16A〜16Dに示す。図16Aは、ニューロン形態の測定のためのパーティション培養チャンバーを示す。図16Bは、濃度0.5nMでのcG−2−アリルP(「NNZ2591」)で処置した海馬ニューロンの顕微鏡写真を示す。本発明者らは、統計的に有意な変化を観察しなかった(平均±SD、n=3独立した実験:0.36±0.02)。
対照的に図16Cは、5nM(0.25±0.03)の濃度でのcG−2−アリルPで処置した培養海馬ニューロンの顕微鏡写真を示す、本発明者らは、対照培養物と比較して統計的に有意な効果を観察した(0.26±0.04)。
図16Dは、cG−2−アリルPで処置した培養海馬ニューロンの顕微鏡写真を示す。棘低減への顕著な効果が50nM(0.27±0.10)の濃度でcG−2−アリルPで処置した培養物において観察された。本発明者らは、野生型動物との統計的有意差を観察しなかった(0.26±0.05)。
本発明者らはこれらの研究から、cG−2−アリルPが樹状突起棘をin vitroで減少させ、この結果はcG−2−アリルPがin vivoで神経学的発達および機能を改善できることを示しており、それによりマウスにおいて脆弱X症候群を処置することに有用である可能性があると結論付けている。脆弱X症候群についてのネズミモデルが脆弱X症候群を有するヒトにおいて見出されたのと同じ遺伝子変異を有することから、cG−2−アリルPは、脆弱X症候群を有するヒトを処置することにも有効である可能性がある。
(例13)
脆弱X症候群Iを有する動物における行動へのcG−2−アリルPの効果:
不安および記憶
cG−2−アリルPが脆弱X症候群を有する動物において有益な効果を有するかどうかを判定するために、本発明者らは、野生型およびfmr1ノックアウト動物でのin vivoでの記憶または馴化について一連の研究を実行した。
方法
動物
fmr1ノックアウトマウス2匹(C57BL/6バックグラウンド)を同じ遺伝子型の群で、温度および湿度を管理した部屋で、12時間明暗周期(午前7から午後7まで照明)で飼った。試験は明期の間に実施した。餌および水は、自由摂取させた。試験をfmr1ノックアウトマウスおよびそれらの野生型同腹仔で実施した。実験はUK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986の必要事項に合致して実行した。
研究群(n=各10)を次のとおり作製した。
1. ビヒクルで処置したfmrノックアウト(KO)
2. ビヒクルで処置した野生型(Wt)
3. cG−2−アリルPで処置したfmr1ノックアウト(KO)(「NNZ−2591」)
4. cG−2−アリルPで処置した野生型(Wt)
不安についてのオープンフィールド試験
オープンフィールド(OF)試験は、不安/機能亢進、および学習の最も基本の形態の1つである新規環境への馴化を判定するために使用される複合試験であり、同じ環境への反復曝露に応じた探索の減少が記憶の指標として解釈される。これは、オープンフィールドへの曝露の2回セッション、10分間および24時間馴化セッションで通常研究される。
図17は、これらの研究に使用したデバイスの写真である。オープンフィールドは、移動を追跡できる曝露した空間である。
この研究に使用されたデバイスは、10cm平方に区切られた活動領域50×30cmを含む灰色PVCである。マウスを試験の5〜20分前に実験室に入れる。マウスを角に面している角の四角に置き、3分間観察する。進入した(全身)四角の数および後ろ肢で立った回数(毛つくろいの一部ではなく、両前肢が地面から離れている)を計数する。最初に後ろ肢で立つまでの待ち時間も記録する。フィールド周辺のマウスの移動を、ビデオ追跡デバイスで300秒間(vNT4.0、Viewpoint)記録した。マウスが最も明るい、フィールドの中央部に進入するまでの待ち時間、この中央領域で費やした総時間数、および総活性(センチメートルでのパス長を単位として)を記録した。
オープンフィールド(OF)試験は、日常の操作に馴化された動物における、新規および見慣れた状態の下での探索的行動、不安およびまたは機能亢進を特徴付けるために使用される試験である。オープンフィールドへの曝露の際にマウスは、環境に馴化し、それにより経時的により少ない探索、移動量の減少を示す。
本実験では本発明者らは、初期曝露(T1)の際、10分後の第2の曝露の際(T2)および24時間後の第3の曝露の際(T3)に移動および立ち上がりを記録した。10分および24時間で自発運動または立ち上がりを低減しないことは、それぞれ短期および長期記憶における欠損を示している。
結果
cG−2−アリルPは、脆弱X症候群を有する動物において不安を減少させる。
図18は、進入した四角の数(垂直軸)を各処置群についてプロットしたOF試験の結果のグラフを示す。ビヒクル処置野生型動物(左バー)は、T1試験期間中に四角約80個の合計距離を進んだ。同様にcG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置野生型動物(左から3番目のバー)は、この試験期間中にほぼ同じ数の四角に進入した。
対照的に、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)は、同じ期間中により多い四角に進入した(p<0.001)。この効果の規模は、これらの動物が試験期間T1中に四角約150個に進入しており、統計的に有意で実質的であった。しかし本発明者らは、cG−2−アリルP(「NNZ2591」)がビヒクル処置およびcG−2−アリルP処置野生型動物(左から3番目のバー)において見られるものに匹敵する結果で、fmr1ノックアウト動物(右バー)の探索行動を顕著に低減したことを予想外に見出した。
この結果から本発明者らは、cG−2−アリルPがfmr1ノックアウト動物における不安を減少させると結論付けている。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らは、cG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトにおける不安を低減できると結論付けている。
cG−2−アリルPは、脆弱X症候群を有する動物において短期記憶を改善する。
図19は、期間T2(10分間)でのOF試験の結果のグラフを示し、進入した四角の数(垂直軸)を各処置群についてプロットしている。T1での結果と共に(図18)、ビヒクル処置野生型動物(左バー)およびcG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置野生型動物(左から3番目のバー)は、各群が期間T2中に四角約45個に進入して通常の探索行動を実証した。T2試験期間に進んだ距離は、T1中に進んだ距離よりも少なく、この時点までに動物が少なくとも部分的にOF試験に馴化したことを示している。
ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)は、動物の最初の2群のいずれよりも実質的に多い探索行動を示した(p<0.001)。実際に増加の規模は約2倍、四角約100個であった。
対照的に本発明者らは、cG−2−アリルPがfmr1ノックアウト動物(右バー)の探索行動を減少させ、実際にそれらの行動の大きさを野生型動物のものに正常化したことを驚くべきことに見出した。
本発明者らは、これらの結果から:(1)マウスでの脆弱X症候群が短期記憶または馴化を減少させた、および(2)cG−2−アリルPがfmr1ノックアウト動物において短期記憶または馴化を改善したと結論付けている。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトにおける短期記憶を改善できると結論付けている。
cG−2−アリルPは、脆弱X症候群を有する動物における長期記憶を改善する。
図20は、期間T3でのOF試験の結果のグラフを示し、進入した四角の数(垂直軸)を各処置群に対してプロットしている。T1(図18)およびT2(図19)での結果と共に、ビヒクル処置野生型動物(左バー)およびcG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置野生型動物(左から3番目のバー)は、各群が期間T3中に四角約25〜30個に進入して通常の探索行動を実証した。T3試験期間に進んだ距離は、T2中に進んだ距離よりも少なく、さらにT1で観察されたものと比較して減少しており、期間T3までに動物がOF試験に進行的に馴化しており、より良い長期記憶を有したことを示している。
対照的に、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)は、ビヒクル処置またはcG−2−アリルP−処置群よりも実質的にさらに多い探索行動(p<0.001)を示した。実際に増加の規模は、約2倍、四角約100個であった。興味深いことにfmr1ノックアウト動物では、馴化は、時間およびOFデバイスへの曝露で増加しなかった。期間T3で進入した四角の数は、期間T2またはT1において見出されたものと同様であった。
本発明者らは、短期記憶と同様にfmr1ノックアウト動物において、ビヒクル処置Fmr1ノックアウト動物と比較してcG−2−アリルPが実質的にT3での探索行動を減少させ(左から2番目のバー)、実際に正常化させ、長期記憶または馴化を正常に戻したことを示していることを予想外に見出した。
結論
本発明者らは、これらの結果から:(1)fmr1ノックアウトマウスが長期記憶または馴化の低下を示した、および(2)cG−2−アリルPがfmr1ノックアウト動物において長期記憶または馴化を改善したと結論付けている。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトにおける長期記憶または馴化を正常化できると結論付けている。
(例14)
脆弱X症候群IIを有する動物における行動へのcG−2−アリルPの効果:
機能亢進
cG−2−アリルPが脆弱X症候群を有する動物における機能亢進に有益な効果を有するかどうかを判定するために、本発明者らは、野生型およびfmr1ノックアウト動物でin vivoでの一連の研究を実行した。
方法
動物
fmr1ノックアウト(KO2)マウス(C57BL/6バックグラウンド)を同じ遺伝子型の群で、温度および湿度を管理した部屋で、12時間明暗周期(午前7時から午後7時まで照明)で飼った。試験は明期の間に実施した。餌および水は、自由摂取させた。試験をfmr1ノックアウトマウスおよびそれらの野生型同腹仔で実施した。実験はUK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986の必要事項に合致して実行した。動物を4群に分けた:
ビヒクル処置野生型
ビヒクル処置fmr1ノックアウト;
cG−2−アリルP処置野生型;および
cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト
連続路地試験
一研究において本発明者らは、「連続路地試験」デバイスを使用した。このデバイスは、4本の連続する線形に連結された次第に不安を惹起させる路地からなる。それぞれ続く路地は、それ以前の路地よりさらに薄い色で塗られ、より低い壁を有したおよび/またはより狭かった。路地1(A1)の閉じた末端に動物を配置し、その末端の壁に向かせた。合計試験時間300秒の間に、各路地(A2、A3、および/またはA4)に最初に進入するまでの待ち時間、各路地に費やした時間、および各路地に進入した回数を記録した。
連続路地試験について本発明者らは、上に記載の4群の動物それぞれについて、路地1(A1)、路地2(A2)、路地3(A3)および路地4(A4)に進入した数を測定した。
結果
図21および22は、連続路地試験の結果を記す。図21は、ビヒクル処置動物において得られた結果のグラフを記す。図22は、cG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置動物において得られた結果のグラフを記す。進入の数(垂直軸)を各処置群に対して示し、各路地(A1〜A4)への進入を示す。図21では、ビヒクル処置動物は、fmr1ノックアウト動物が野生型動物よりも多い進入数を示して、探索行動を示した。ビヒクル処置野生型動物は、試験期間中にアームA1(WT−A1)およびA2(WT−A2)に約3〜4回進入したが、重要なことにアームA3(WT−A3)またはA4(WT−A4)に進入しなかった。
対照的にビヒクル処置fmr1ノックアウトマウスは、最初の開いた路地に進入するまでの待ち時間が有意に短く(p<0.001)、開いた路地で有意に長い時間を費やした(p<0.001)。これらの動物は、試験期間中にアームA1(KO−A1)およびA2(KO−A2)に約10回進入した。fmr1ノックアウト動物がアームA1およびA2に進入した回数は、野生型動物の回数の2倍より多く、ビヒクル処置野生型動物よりも有意に高いレベルの機能亢進を示している。ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物もアームA3(KO−A3)およびA4(KO−A4)への路地間でより多く交差した(p<0.0001)。
本発明者らは、これらの結果からfmr1ノックアウトマウスが野生型動物よりも大きな不安を示したと結論付けている。
図22は、cG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置動物における連続路地試験の結果を示す。cG−2アリルP処置野生型動物は、試験期間中にアームA1(WT−A1)に約2回進入し、試験期間中にアームA2(WT−A2)に約4回進入した。これらの結果は、図21に示すビヒクル処置野生型動物について得られた結果に匹敵する。
対照的に、cG−2−アリルPで処置したcG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト動物は、開いたアーム進入(p<0.001)および中央で費やした時間(p<0.005)において顕著な低減を示し、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物と比較して機能亢進における低減を示している。cG−2−アリルPの効果の規模は、図21に示すビヒクル処置fmr1ノックアウト動物についての約8回と比較して、アリルP処置fmr1ノックアウト動物がアームA1(KO−A1)に4回進入して、実質的であった。同様に図21に示すビヒクル処置fmr1ノックアウト動物についての約10回と比較して、cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト動物は、アームA2(KO−A2)に約4回進入した。cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト動物は、図21に示すビヒクル処置fmr1ノックアウト動物についての約9回と比較して、アームA3(KO−A3)に約4回進入した。最後にcG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト動物は、図21に示すビヒクル処置fmr1ノックアウト動物についての約4回と比較して、アームA4(KO−A4)に約3回進入した。
結論
本発明者らは、この研究からcG−2−アリルPがこれらの条件下でfmr1ノックアウトマウスにおいて不安を減少させたと結論付けている。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが、脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
高架十字迷路
別の研究では本発明者らは、「高架十字迷路」を使用した。高架十字迷路試験は、マウスにおける不安様機能亢進を測定するために最も広く使用されているものの1つである。試験は、開いた高架エリアに対するマウスの本来の嫌悪、および新規環境におけるそれらの本来の自発的探索行動に基づいている。図23は、この研究で使用したデバイスの写真を示している。装置は、中央で互いに垂直に交わった2個の開いたアームおよび2個の閉じたアーム、ならびに中央エリアからなる。開いたアームは、より露出しており、それによりマウスにより多くの不安を作りだす。したがってマウスは、閉じたアームでより長い時間を費やし、より頻繁にそこを訪れる。マウスは、すべてのアームに接近でき、それらの間を自由に移動できるようにされた。開いたアームへの進入の数、開いたアームで費やした時間および中央で費やした時間を開いた空間が誘発する不安の指標として使用した。
閉じたアームで費やした時間
図24は、試験した動物の4群それぞれについてデバイスの閉じたアーム(垂直軸)において費やした時間量についての高架十字迷路を使用した研究の結果を示す。
図24に示すとおり、ビヒクル処置野生型マウス(左バー)は、約240秒間を閉じたアームで費やし、cG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置野生型マウス(左から3番目のバー)は、同じ時間を閉じたアームで費やした。
対照的に、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)は、閉じたアームにおいて有意に少ない時間を費やし(約160秒間;p<0.001)、fmr1ノックアウト動物における機能亢進の状態を示している。cG−2−アリルPは、fmr1ノックアウト動物で閉じたアームにおいて費やした時間を正常化させた(右バー)。この機能亢進は、ビヒクル処置野生型およびcG−2−アリルP処置野生型動物と比較してcG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト動物において有意に低減していた。統計的に有意な差異がビヒクル処置fmr1ノックアウト群とcG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト群との間で観察された(p<0.001)。
本発明者らは、この研究からcG−2−アリルPがこれらの条件下でfmr1ノックアウトマウスの機能亢進を減少させたと結論付けている。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトを処置することにも有効である可能性があると結論付けている。
高架十字迷路における開いたアームで費やした時間
図25は、この研究の結果のグラフを示し、開いたアームで費やした時間(垂直軸)を試験した動物の4群それぞれについて示す。
ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)は、それらのビヒクル処置野生型同腹仔(左バー)と比較して有意に長い時間を開いたアームで費やした(p<0.001)。対照的にcG−2−アリルP(「NNZ2591」)は、fmr1ノックアウト動物が開いたアームで費やした時間を正常化した。cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト動物マウスが開いたアームで費やした時間は、ビヒクル処置野生型マウス(左バー)またはcG−2−アリルP処置野生型動物(左から3番目のバー)について観察されたものと顕著に異ならなかった。
本発明者らは、これらの結果から:(1)fmr1ノックアウト動物が野生型動物よりもさらに機能亢進した行動を示した、および(2)cG−2−アリルPが機能亢進を正常化したと結論付けている。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
高架十字迷路における中央での時間
図26は、試験した動物の4群のそれぞれについてデバイスの中央で費やした時間(垂直軸)のグラフを示す。高架十字迷路の中央で費やした時間は、当技術分野において機能亢進の目安として認められている。
ビヒクル処置野生型マウス(左バー)は、約30秒間を迷路の中央で費やした。cG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置野生型マウス(左から3番目のバー)は、ビヒクル処置野生型動物よりもわずかに短い時間を中央で費やした。対照的に、ビヒクル処置fmr1ノックアウトマウスは、ビヒクル処置野生型動物と比較して中央で顕著に長い時間を費やした(左から2番目のバー;p<0.001)。
本発明者らは、cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウトマウス(右バー)が、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)よりも有意に少ない時間を費やしたことを予想外に見出した。本発明者らは、ビヒクル処置野生型動物(左バー;p<0.001)、cG−2−アリルP処置野生型動物(左から3番目のバー;p<0.001)またはcG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト動物(右バー;p<0.001)と比較して.ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)が中央で費やした時間において統計的有意差を観察した。実際に本発明者らは、ビヒクル処置野生型群(左バー)、cG−2−アリルP処置野生型群(左から3番目のバー)またはcG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト群(右バー)のいずれも中央で費やした時間において統計的有意差を観察しなかった。
本発明者らは、この研究からcG−2−アリルPがこれらの条件下でfmr1ノックアウトマウスの機能亢進を減少させたと結論付けている。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが、脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
(例15)
脆弱X症候群を有する動物における恐怖条件付けへのcG−2−アリルPの効果
療法(cure)または文脈いずれかの恐怖条件付けは、多数の種において十分に使用されている連合学習の形態を表す。文脈的(遅延)恐怖条件付けにおいて使用した依存測定は、条件付けられていない刺激(足ショク)、条件付けた刺激(CS)、具体的な文脈および/またはそのような合図(cue)の対に続いて生じる凍結応答である。条件付けの内容において音と対になる足ショクが与えられる場合、音だけに限らず文脈にも学習がある。
文脈的恐怖条件付け(Contextual fear conditioning)は、基本的な条件付け手順である。それは、動物を取り、新規環境に置くことを含み、嫌悪的刺激を与え、次いでそれを除去する。動物を同じ環境に戻した場合、記憶しており、環境を嫌悪的刺激に関連付けた場合に一般に凍結応答を呈する。凍結は、恐怖への応答であり、「呼吸を除く移動の不在」として定義される。この凍結挙動は、嫌悪的刺激の強度、提示の回数および対象によって達成された学習の程度に応じて数秒間から数分間継続する場合がある。
方法
動物
本発明者らは、上に記載のとおりこの研究のために野生型またはfmr1ノックアウト動物のいずれかを使用した。動物を次のとおり群に分けた。
ビヒクル処置野生型;
ビヒクル処置fmr1ノックアウト;
cG−2−アリルP処置野生型;および
cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト.
文脈的恐怖条件付けを評価するための装置
この研究で使用したデバイスを図27に示す。条件付けられていない刺激(足への穏やかなショク)を適用し、条件付けた刺激は足へのショクに伴って適用された音であった。これらの条件下で動物は、条件付けられていない刺激を条件付けた刺激および刺激の文脈の両方と関連付ける。動物を五(5)分間試験した。
結果
図28は、試験した動物のそれぞれの群について「凍結挙動」に費やした時間のグラフを示す。この研究の急性ストレス状態下で、ビヒクル処置野生型動物(左バー)は、5分間の試験期間の平均約30%を費やした(すなわち約100秒間)。対照的に、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)は、実質的に少ない時間を凍結挙動に費やした(5分間の試験期間の約18%すなわち約54秒間)。本発明者らは、fmr1ノックアウト動物がビヒクル処置野生型動物よりも少ない恐怖を示したと結論付けている。
本発明者らは、cG−2−アリルP(「NNZ2591」)がfmr1ノックアウト動物(右バー)において凍結挙動に費やした時間における実質的で統計的に有意な増加を産生したことを予想外に見出した。実際にcG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト動物について観察された凍結挙動に費やした時間は、ビヒクル処置野生型動物(左バー)およびcG−2−アリルP処置野生型動物(左から3番目のバー)によって費やされた時間に類似していた。
結論
本発明者らは、この研究からfmr1ノックアウト動物が野生型動物よりも低い恐怖条件付けを示したと結論付けている。これは、fmr1ノックアウト動物が野生型動物と比較して生存状の不利益を有する可能性があることを示している。本発明者らは、cG−2−アリルPがこれらの条件下でfmr1ノックアウトマウスにおける恐怖条件付けを増加させたことも結論付けている。この効果は、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物において観察された生存不利益を軽減する可能性がある。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが、脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
(例16)
脆弱X症候群を有する動物におけるガラス玉覆い隠しおよび営巣行動へのcG−2−アリルPの効果
マウスは社会的な種であり、接近、追従、臭い嗅ぎ行動、アログルーミング、攻撃的遭遇、性的相互作用および親の行動、グループハドル(group huddle)での巣作りおよび就寝を含む容易にスコア化される社会的行動を行い、マウスにおける社会的認識および社会的記憶は、親密さを誘導するために反復的に曝露される新たなマウスを臭い嗅ぎ行動に費やす時間の量および、新たな刺激動物が導入された場合の臭い嗅ぎ行動の高いレベルへの回復によって評価される。
ガラス玉覆い隠し
マウスは、実験室の多くの基質を自発的に掘る。この行動は、自然での生息地で土または落ち葉に埋めた種子、穀物、昆虫および他の食糧を見つけるために探した野生でのそれらの祖先に由来する。これは、一般的な天然げっ歯類の行動を使い、管理された実験室条件下で定量的データを提供し、プリオン疾患、脆弱X症候群および脳病変に極めて高い感受性を証明した。「日常生活動作」(ADL)を実施する能力の悪化は、アルツハイマー病(AD)および認知機能低下の初期徴候である(Deacon, 2012)。
ガラス玉覆い隠し行動へのcG−2−アリルPの効果を研究するために、本発明者らは野生型マウスおよびfmr1ノックアウトマウスでの一連の研究を実行した。
方法
動物
本発明者らは、この研究のために上に記載のとおり野生型またはfmr1ノックアウト動物のいずれかを使用した。動物を次のとおり群に分けた。
ビヒクル処置野生型;
ビヒクル処置fmr1ノックアウト;
cG−2−アリルP処置野生型;および
cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト
マウスを木の削り屑のベッドを有する閉鎖環境に置いた。10個のガラス玉を環境に入れ、埋められたガラス玉の数を目視観察によって判定した(中央値±四分位範囲(IQR))。
結果
本発明者らは、ビヒクル処置野生型マウスおよびcG−2−アリルP処置野生型マウスが存在する10個のガラス玉の内10個(100%)を埋めたことを観察した。対照的にfmr1ノックアウト動物は、ビヒクル処置野生型動物よりも有意に少ないガラス玉を埋めた(10個の内平均3個すなわち30%;(p<0.001)。
本発明者らは、cG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置fmr1ノックアウト動物が10個のガラス玉の内中央値8個を埋めた(80%)ことを予想外に見出した。実際に、cG−2−アリルPは、埋められたガラス玉の数をビヒクル処置野生型マウスまたはcG−2−アリルP処置野生型マウスについて見出されたものに非常に近いレベルに正常化した。
結論
本発明者らは、この研究からfmr1ノックアウトマウスが野生型動物よりも少ないガラス玉を埋め、cG−2−アリルPがこの減少を救済し、実際に行動を標準化すると結論付けた。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが、脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
営巣行動
雄および雌マウスは、巣を作り、目的が体温調節を含み、繁殖と関連することから、この試験を同等に実施する。この試験は、海馬病変および機能障害の指標としても使用される。
方法
動物
本発明者らは、上に記載のとおり野生型またはfmr1ノックアウト動物のいずれかをこの研究のために使用した。動物を次のとおり群に分けた。
ビヒクル処置野生型;
ビヒクル処置fmr1ノックアウト;
cG−2−アリルP処置野生型;および
cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト
営巣行動についての試験
マウスは、巣を作るために典型的には特定の材料を使用する。この研究では、本発明者らはワタ「ネストレッツ」を営巣ケージに導入した。それによりマウスは、ネストレッツのワタを引き裂いて使用でき、営巣ケージの寝床に巣を作るために使用できる。営巣は、マウスにおける典型的行動であり、通例の日常生活の態様を表す。したがってこの試験は、ヒトによって実行される日常生活課題を反映する。fmr1ノックアウトマウスの営巣行動における変化は、したがって脆弱X症候群を有するヒトの行動の予測となる。さらにfmr1ノックアウトマウスへの薬物の効果は、脆弱X症候群を有するヒトへの薬物の効果の合理的な予測となる。
マウスを明暗周期の暗期の約1時間前に個々に営巣ケージに置き、結果を翌朝評価した。ネストレッツの外観を下に記載のとおり5点満点制により評価し、裂かれていないネストレッツ材料の量も計量した。
1.ネストレッツは、大部分が裂かれていなかった(>90%未変化)。図20Aは、1のスコアを有するネストレッツの写真を示す。
2.ネストレッツは、部分的に裂かれていた(50〜90%未変化のまま)。図20Bは、2のスコアを有するネストレッツの写真を示す。
3.ネストレッツは、大部分が切り刻まれていたが、しばしば同定可能な巣の場所がない:ネストレッツの<50%が未変化のままであるが、<90%がケージの床のエリアの四分の一以内にある、すなわちワタは巣に集められておらず、ケージ周辺に広がっていた。材料は、時折広く定義された巣エリアにある場合もあるが、決定的な定義は50〜90%が裂かれていることである。図29Cは、3のスコアを有するネストレッツの写真を示す。
4.同定可能であるが、平らな巣:ネストレッツの>90%が裂かれており、材料はケージの床のエリアの四分の一以内の巣に集められているが、巣はその外周の50%未満がマウス体長より高い壁(横で丸くなっている)を有して平らである。図29Dは、4のスコアを有するネストレッツの写真をネストレッツの上のマウスと共に示す。
5.ほとんど完全な巣:>90%のネストレッツが裂かれており、巣は、その外周の50%より多くにおいてマウス体長より高い壁を有するくぼみである。図29Eは、5のスコアを有するネストレッツの写真をネストレッツの上のマウスと共に示す。
結果および結論
本発明者らは、ビヒクル処置野生型C57BL/6マウスが約4〜5個の間の巣の構築を達成したことを見出した。対照的にビヒクル処置fmr1ノックアウトマウスについてスコア中央値はおよそ1〜2であった。
本発明者らは、cG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置が営巣スコアをfmr1ノックアウトマウスにおいて約4〜5増加させることを予想外に見出した。
本発明者らは、fmr1ノックアウトマウスが巣を作ることに欠陥を実証し、cG−2−アリルPが少なくとも部分的にこの欠陥を回復させたと結論付けている。この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが、脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
(例17)
社交性:社会認識、社会的新規性に対する嗜好
マウスは社会的な種であり、接近、追従、臭い嗅ぎ行動、アログルーミング、攻撃的遭遇、性的相互作用および親の行動、群れでの巣作りおよび就寝を含む容易にスコア化される社会的行動を行う。社交性を研究するために本発明者らは、野生型マウスおよびfmr1ノックアウト変異を有するマウスにおいて一連の研究を実行した。
方法
動物
本発明者らは、上に記載のとおりこの研究のために野生型またはfmr1ノックアウト動物のいずれかを使用した。動物を次のとおり群に分けた。
ビヒクル処置野生型;
ビヒクル処置fmr1ノックアウト;
cG−2−アリルP処置野生型;および
cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト.
試験手順
マウスにおける社会的認識および社会的記憶は、親密さを誘導するために反復的に曝露される新たなマウスを臭い嗅ぎ行動に費やす時間の量および、新たな刺激動物が導入された場合の臭い嗅ぎ行動の高いレベルへの回復によって評価された。本発明者らは、動物の群それぞれで臭い嗅ぎ行為の数を測定した。
結果および結論
図30は、研究したマウスの様々な群ごとの、臭い嗅ぎ行為の持続時間(垂直軸)のグラフを示す。本発明者らは、ビヒクル処置野生型動物(左バー)が試験期間中に約23回の臭い嗅ぎ行為を示したことを見出した。対照的に、fmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)はあまり臭い嗅ぎ挙動を示さなかった(約6回)。
しかし本発明者らは、cG−2−アリルP(「NNZ2591」)処置fmr1ノックアウト動物(右バー)において、臭い嗅ぎ挙動の量が約21回に有意に増加した(p<0.001)ことを驚くべきことに見出した。実際にcG−2−アリルPは、ビヒクル処置野生型(左バー)またはcG−2−アリルP処置動物(左から3番目のバー)とほぼ同じレベルまでfmr1ノックアウト動物における臭い嗅ぎ挙動を増加させた。
本発明者らは、fmr1ノックアウト動物が野生型動物と比較して社交性の欠損を示すと結論付けている。この結果は、脆弱X症候群を有するヒトにおいて見出される十分周知の社交性における欠損と一致する。本発明者らは、cG−2−アリルPがfmr1ノックアウトマウスについて観察された社交性を増加させ、行動を正常化したことも結論付けている。
この研究で使用したfmr1ノックアウトマウスが、脆弱X症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはcG−2−アリルPが脆弱X症候群を有するヒトにおける社会的相互作用を改善することにおいて有効である可能性があると結論付けている。
(例18)
cG−2−アリルPは、脆弱X症候群を有する動物においてpERKおよびpAKTの過剰発現を正常化する。
ニューロンは、ラパマイシンの哺乳動物標的(mTOR)ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ−AktおよびRas−ERKシグナル伝達カスケードを通じて局所樹状翻訳を制御し、mGluR5シグナル伝達カスケードを関連付ける脆弱X精神遅滞タンパク質によって決定的に影響される。細胞内シグナル伝達分子、ERKおよびAktの過活性化は、シナプス可塑性において重要な役割を演じている。これらのタンパク質の発現のレベルは、脆弱X症候群の細胞病理学の特性であり、FXSの神経行動学的表現型に直接寄与すると考えられている。ERKは、古典的MAPKシグナル伝達タンパク質であり、増殖因子伝達、増殖、ストレスへのサイトカイン応答およびアポトーシスに関与する。Aktは、PI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路における鍵となる構成成分であり、核因子−κΒ(NfκB)およびBcl−2ファミリータンパク質などの多数の下流エフェクターに結合および制御することによって細胞生存および代謝を制御している。これらのタンパク質の過剰活性化(リン酸化)は、自閉スペクトラム障害に関連付けられている。
方法
動物
本発明者らは、上に記載のとおり、この研究のために野生型またはfmr1ノックアウト動物のいずれかを使用した。動物を次のとおり群に分けた(n=1群当たり動物4匹)。
ビヒクル処置野生型;
ビヒクル処置fmr1ノックアウト;
cG−2−アリルP処置野生型;および
cG−2−アリルP処置fmr1ノックアウト
生化学試験
全脳可溶化物のERK1/2およびAktのリン酸化レベルを、ウエスタンブロットを使用して評価した。マウスを屠殺し、脳を最終注射の12日後、最終行動試験の直後に取った。他の研究は、pERKおよびpAktを血液リンパ球中で測定した。ウエスタン分析の結果を各ブロットにおいて見られるGAPDHタンパク質の量に標準化した。
結果
リン酸化ERK
図31は、マウス由来の脳における研究の結果のグラフを示す。ビヒクル処置野生型マウスは、約0.9(UA単位)(左バー)の平均を有した。対照的にfmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)は、約1.3(UA単位)(p<0.05)へのリン酸化ERKのレベルの増加を有した。fmr1ノックアウト動物のc−2−アリルP(「NNZ2591」)での処置(左から3番目のバー)は、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物と比較してERKリン酸化を有意に低減した(p<0.05)。fmr1ノックアウト動物のcG−2−アリルPでの処置後に観察されたpERKのレベルは、ビヒクル処置野生型動物(左バー)またはcG−2−アリルP処置野生型動物(左から3番目のバー)のものと非常に類似していた。
同様の結果を動物の群から単離したリンパ球中のpERKについて見出した。
リン酸化AKT
本発明者らは、動物の脳におけるERKについて本発明者らが観察したものと同様のパターンをリン酸化AKTにおいて観察した。図32は、この研究の結果のグラフを示す。ビヒクル処置野生型マウスは、平均約0.9(UA単位)(左バー)を有した。対照的にfmr1ノックアウト動物(左から2番目のバー)は、約1.3(UA単位)のリン酸化AKTの増加したレベルを有した(p<0.05)。fmr1ノックアウト動物のc−2−アリルP(「NNZ2591」)での処置(左から3番目のバー)は、ビヒクル処置fmr1ノックアウト動物と比較して、ERKリン酸化を約0.9(UA単位)に有意に(p<0.05)低減した。fmr1ノックアウト動物のcG−2−アリルPでの処置後に観察されたpAKTのレベルは、ビヒクル処置野生型動物(左バー)またはcG−2−アリルP処置野生型動物(左から3番目のバー)のものに非常に類似していた。
同様の結果を動物の群から単離したリンパ球中のpAktについて見出した。
(例19)
レット症候群の処置:レット症候群(RTT)モデルにおけるcG−2−アリルPの寿命および長期増強への効果
cG−2−アリルP処置が、障害のネズミモデルにおいてレット症候群の発症および進行に影響を与えられるかどうかを判定するために、本発明者らはヘミ接合性MeCP2(1lox)雄マウスを使用する。MeCP2ノックアウト(MeCP2−KO)マウス系は、ヒト障害、レット症候群に特徴的な生理学的および神経学的異常性の範囲および重症度をよく模倣するとして当技術分野において広く認められている。
すべての実験はUniversity of Texas Southwestern Medical Centerにおいて実施され、University of Texas Southwestern Medical Center Animal Care and Use Committeeによって、または他の機関による同様の承認によって承認された。cG−2−アリルPはAlbany Molecular Research Inc.(Albany、NY)によって合成され、Neuren Pharmaceuticals Limitedによって供給された。
方法
処置
本発明者らは、ヘミ接合性MeCP2(1lox)雄マウスを20mg/kg/日のcG−2−アリルPまたは生理食塩水で処置した(0.01%BSA、生存実験では1群当たりn=15およびLTP実験ではn=20)。処置は、誕生後4週間から腹腔内に投与する。生存実験のために処置を実験の経過を通じて維持する。切片調製のために使用する場合は、LTP実験のためにマウスを9週まで処置する。
生存
MeCP2欠損変異マウスは、RTT症状を約4〜6週齢で発症し、10〜12週で死ぬ(Chen et al., 2001. Nat Genet 27: 327-331)。本発明者らは、野生型対照およびMeCP2欠損動物の生存をビヒクルとcG−2−アリルP−処置群とにおいて比較する。生存は、処置の開始から毎週測定し(4週間)、1週間隔(x軸)で生存している(y軸)マウスの割合を示すカプラン−マイヤー生存曲線を作成するために使用する。
長期増強(電気生理学)
MeCP2欠損マウスは、機能的および超微細構造的シナプス機能障害、海馬依存性記憶および海馬性長期増強(LTP)の顕著な機能障害を罹患すると既に報告されている(Moretti et al. The Journal of Neuroscience. 2006. 26(1): 319-327)。cG−2−アリルP処置のシナプス機能への効果をRTTモデルにおいて試験するために、本発明者らはビヒクルおよびcG−2−アリルPで処置した動物の両方において海馬性LTPを9週齢で比較する。それを行うために本発明者らは、生理食塩水またはG−2−MePEのいずれかで処置したMeCP2欠損マウス由来の海馬の切片におけるニューロンでのベースライン電位の%としてfEPSPのスロープを測定する。
結果
結果は、cG−2−アリルP処置がMeCP2欠損マウスの生存を増加させることを示している。野生型マウス(一番上の線)は対照動物であり、そのためそれらの生存は各時点で100%である。生理食塩水で処置したMeCP2欠損マウスだけが野生型マウスよりもずっと早く死に、約11週までにMeCP欠損マウスのほんの一部だけが生存している。しかし対照的に本発明者らは、cG−2−アリルPで処置したMeCP2欠損マウスは、生理食塩水処置マウスよりも実質的に長く生存することを見出している。mecp2マウスのcG−2−アリルP処置によって安全上の懸念は生じていない。
これらの結果は、cG−2−アリルPがMeCP2欠損マウスの生存を実質的に増加できることを実証している。MeCP2欠損マウスがレット症候群を有するヒトにおける病理学および治療有効性の予測であることから、本発明者らはcG−2−アリルPがレット症候群を有するヒトの寿命を増加できると結論付けている。
結果は、cG−2−アリルP処置がMeCP2欠損動物におけるfEPSPスロープによって測定される海馬性長期増強(LTP)を生理食塩水処置変異マウスと比較して増加させることも示す。本発明者らは、cG−2−アリルPが、生理食塩水だけで処置した動物と比較してMeCP2欠損マウスにおいてfESPSのスロープを増加させることを見出している。
これらの結果は、cG−2−アリルPがMeCP2欠損マウスをin vivoで処置することに有効である可能性があることを実証している。MeCP2欠損マウスがレット症候群を有するヒトにおける病理学および治療有効性の予測であることから、本発明者らはcG−2−アリルPがレット症候群を有するヒトのために有効な治療である可能性があると結論付けている。
(例20)
cG−2−アリルPは樹状突起分枝を改善し、樹状突起棘長を増加させる
本発明者らは、cG−2−アリルP処置の樹状突起への効果を評価する。トランスジェニックmecp2ノックアウトマウス(n=15から20)にcG−2−アリルPを腹腔内20mg/kgの用量で、1日1回投与する。9週間後に屠殺に続いて樹状突起棘密度、棘長さおよび分枝を下の表5に従ってゴルジ染色後に検討する。
Figure 2016525547
樹状の長さを生理食塩水(3匹の別々のマウスからニューロン3個を分析した、n=9)またはcG−2−アリルP(20mg/kg i.p.1/日、4週から;3匹の別々のマウスからニューロン3個を分析した、n=9)のいずれかで処置した9週齢の雄mecp2ヌル変異マウス由来の代表的な海馬CA1ニューロンの神経細胞体からの距離によって評価する。
本発明者らは、cG−2−アリルPが樹状の分枝を改善し、樹状突起棘長さを増加させることを観察している。μmでの樹状の長さ(垂直軸)を細胞の神経細胞体からの距離(μmで;水平軸)に対してプロットする。神経細胞体に近い樹状突起を有する細胞について、樹状突起は短い。しかし、神経細胞体からの距離が増加すると、生理食塩水処置は神経細胞体から最大約70μmの距離まで増加し、神経細胞体からさらに遠い距離で低下する樹状の長さを産生する。対照的に、cG−2−アリルP(塗りつぶした四角)での処置は、神経細胞体からの距離の範囲を超えるより長い樹状突起を産生する。
(例21)
マウスIIにおけるレット症候群の処置:マウス交配および遺伝子型判定
MeCP2生殖系列ヌル対立遺伝子マウスを使用する(Chen et al., 2001)。遺伝子型判定をChen et al.(Chen et al., 2001)のとおり実施する。
cG−2−アリルP処置
生存測定、夜行性活性分析および免疫ブロット分析について、Neuren Pharmaceuticals Limitedによって供給されたcG−2−アリルPを腹腔内注射(20mg/kg、ビヒクル=生理食塩水、0.01%BSA)を介して投与する。処置をP15に開始し、実験の経過中ずっと維持する。それらを急性切片調製のために使用する場合、細胞内生理学実験のためにマウスにcG−2−アリルP(20mg/kg体重、ビヒクル=生理食塩水、0.01%BSA)を2週間毎日、P15からP28〜P32注射する。光学的画像化実験のためにマウスの眼瞼縫合の日から画像化の日まで毎日cG−2−アリルP(20mg/kg体重、ビヒクル=生理食塩水、0.01%BSA)を注射する。
切片生理学調製
感覚運動皮質のまたは近くの冠状セクション(厚さ300μm)を、Vibratomeを使用して<4℃ ACSFで切る。切片化後に切片を37℃で20分間インキュベートし、残りの実験は室温においてである。切片をWarnerチャンバーに移し、記録を5層に位置付けられた目視同定した錐体ニューロンから取る。126mM NaCl、25mM NaHCO3、1mM NaHPO4、3mM KCl、2mM MgSO4、2mM CaCl2および14mMブドウ糖を含有する人工脳脊髄液(ACSF)を、315〜320mOsmおよびpH7.4に調整し、95%O2/5%CO2を通気する。細胞内ピペット溶液は、100mMグルコン酸カリウム、20mM KCl、10mM HEPES、4mM MgATP、0.3mM NaGTPおよび10mM Na−クレアチンリン酸を含有する。
細胞内ホールセル記録
ホウケイ酸ピペット(3〜5ΜΩ、WPI)をSutter P−80 puller(Sutter Instruments)を使用して引く。細胞をアクロプラン(Achroplan)40×水−液浸レンズを赤外線DIC光学装置(Zeiss)で使用して視覚化し、ビデオモニターに映した赤外線カメラ(浜松)で検出する。BNC−2110コネクターブロックおよびM−Series dual−channel acquisition card(National Instruments)に繋いだMulticlamp 700B amplifier(Axon Instruments)を使用して、Matlab(Mathworks、Natick、Mass.)に書き込まれた特注の取得およびリアルタイム分析ソフトウェアによって実験を進めた。ギガシール(Gigaseal)および破裂が達成され、ホールセル記録を低レベルのリークおよび直列抵抗について継続的に確認する。各記録について、5mV試験パルスを入力および直列抵抗を測定するために電圧固定で約10回印加する。次いで電流固定で約10パルス(500ms、10pA増大で40〜140pA)を惹起された発火頻度および細胞易興奮性を定量するために印加する。アクセス抵抗、リークおよび細胞内在性易興奮性が群にわたって一致していることを確認する。最終的に、−60mVでの電圧一定下での自発的EPSCを10kHzおよび低域通過フィルターでの1kHzでサンプリングする。分析をMatlabに書かれたカスタムソフトウェアパッケージを使用して、すべての事象を自動化閾値により検出し、各事象を実験者によって個々に盲検的に確認して実施する。
ゴルジ染色
P28マウス由来の試料(<1cm)を10%ホルマリンおよび3%重クロム酸カリウム中で24時間固定する。次いで組織を2%硝酸銀中、2日間、暗所、室温に移す。次いでこれらの試料からのセクションを蒸留水中に厚さ50μmに切る。運動皮質に対応するセクションをスライドにマウントし、10分間空気乾燥し、次いで95%アルコール、100%アルコールおよびキシレンでの連続的リンスで脱水し、次いでカバーガラスでシールする。画像をl0倍(ホールセル)および100倍(棘画像)でZeiss Pascal 5 Exciter共焦点顕微鏡を使用して取得する。
内在性シグナルの光学的画像化
成体(>P60)野生型(SVEVまたはBL6)およびMeCP2(+/−)変異雌(BL6)をこの実験のために使用する。野生型対照群は、MeCP2+/−雌の野生型同腹仔または野生型同年齢のSVEV雌の両方からなる。単眼除去のために、動物をアベルチン(0.016ml/g)で麻酔し、一眼の眼瞼を4日間縫合する。画像化の前に縫合を除去し、遮断した眼を再び開ける。遮断縫合糸が未変化であり、遮断した眼の状態が健康であると考えられる動物だけを画像化セッションのために使用する。cG−2−アリルPのシグナル伝達活性化について、cG−2−アリルPを含有する溶液を遮断期の間ずっと毎日腹腔内に(IP)注射する。画像化セッションのためにマウスをウレタン(1.5g/kg;全投与量の20%を各20〜30分間で最終投与までIPで投与し、1%クロルプロチキセン(cloroprothixene)0.02mlも初回投与と共に注射する)で麻酔する。頭蓋を露出させ、カスタムメイドプレートを、移動を最小化させるために頭に接着する。頭蓋をドレメルドリルで、V1で薄くし、生理食塩水(1.5%)中のアガロース溶液およびカバーガラスで覆う。画像化セッションの間、動物に常に酸素供給し、その体温は加温毛布で維持し、眼を定期的にシリコン油で処置し;生理的条件を常にモニターする。麻酔したマウスをいずれかの眼、単眼に示される定期的刺激を表示するモニターの前に置く;刺激は、大きさ9°x72°の垂直または水平に横滑りする白色バーからなり、均一に灰色のバックグラウンド上を9秒/周期で横滑りする。頭蓋表面を赤光(630nm)で照らし、輝度の変化を25分間の各刺激セッション中にCCDカメラ(Cascade 512B、Roper Scientific)によって15フレーム/秒の速度で捕捉する。経時的高域通過フィルター(135フレーム)を遅いシグナル雑音を除去するために用い、その後シグナルを、各ピクセルで刺激周波数に対応する経時的高フーリエ変換(FFT)構成成分を抽出するためにコンピューター処理する。FFT振幅を各眼に視覚的に惹起した応答の強度を測定するために使用する。眼球優位性指標は、ODI=(Rcontra−Ripsi)/(Rcontra+Ripsi)として各ピクセルでの各眼の応答(R)に由来する。両眼帯は、画像化された半球に同側性の眼の刺激によって活性化される領域として定義される。
心拍数測定
リアルタイム心臓脈拍数を尾クリップセンサー(Mouse OX Oximeter−Oakmont、PA)を使用して測定する。マウスは麻酔せず、フィットしたオープンプラスチックチューブに物理的に拘束する。記録セッションの前に、馴化させるために、チューブを、実験動物を飼っているケージに一晩置く。記録期を通じて体温を約82〜84°Fに維持する。本発明者らは、各マウスについて15分間、3試行を記録する。マウスは、8週齢で、P15からビヒクルまたはcG−2−アリルPで処置される。
夜行性活性測定
自発的な運動活性を赤外線ビーム活性化移動モニタリングチャンバー(Opto−Varimax−MiniA;Columbus Instruments、Columbus、Ohio)を使用することによって測定する。各実験についてマウスをチャンバーに記録開始の少なくとも3時間前に置く。移動を通常の12時間暗周期(午後7時から午前7時)の間モニターする。1時点当たり動物1匹当たり1暗周期を取得する。
結果
cG−2−アリルP処置がRTT疾患の主要な特性の発達に影響を与えるかどうかを試験するために、2週齢の変異動物にそれらの一生にわたって毎日腹腔内注射する。次いでシナプス生理学、シナプス分子組成および皮質可塑性の測定を下に記載のとおり、心拍数、自発運動活性レベルおよび寿命などの健康関連測定と共に行う。
MeCP2変異マウスのシナプス生理学におけるcG−2−アリルPの効果
近年の研究は、MeCP2−/yマウスの複数の脳領域にわたるニューロンが自発的活性における広範な低減を示し(Chang et al., 2006、Chao et al., 2007、Dani et al, 2005、Nelson et al, 2006)、表現型はBDNFの過発現によって救済される(Chang et al, 2006)ことを報告している。同様にIGF1誘導体の急性適用は、ラット海馬培養物において惹起された興奮性シナプス後電流(EPSC)振幅を40%上昇させることが示されている(Ramsey et al., 2005、Xing et al., 2007)。MeCP2−/y生理学的表現型を救済するcG−2−アリルPの有効性を試験するために、本発明者らは急性脳切片において細胞内ホールセル記録を取得し、5層皮質ニューロンにおいて興奮性シナプスドライブ(自発的EPSC振幅および周波数)を測定する。ここで−/y動物から記録されたEPSCは、野生型動物において測定されたEPSCと比較して振幅において顕著に低減している。傾向は、cG−2−アリルPで処置されたMeCP2−/y動物から記録されたEPSCにおいて部分的に逆転しており、ビヒクルで処置されたMeCP2−/yマウスからのEPSCよりも振幅において顕著に大きい。これらの差異は、細胞にわたって平均化する場合にも見られる。これらの測定を通じて、アクセス抵抗、リーク、および細胞内在性易興奮性は、群にわたって一致していることも確認されている。EPSC間隔を定量することは、野生型とMeCP2−/y動物との間のEPSC事象(EPSC周波数の低減)間の間隔においてわずかな増加を示している(P=0.04、コルモゴロフ−スミノフ検定)。本発明者らは、MeCP2−/yマウスの皮質細胞における興奮性シナプスドライブの低減、およびcG−2−アリルP処置後のその部分的救済は、この領域におけるシナプス介在性興奮性伝達の強さにおける変化の結果としての、EPSC振幅における変化に部分的によることを見出している。
cG−2−アリルP処置は皮質棘成熟を刺激する。
本発明者らは、ニューロンを低密度で明確に標識するためにゴルジ染色を使用し、標識細胞中の樹状突起棘密度および形態を測定するために高分解能共焦点画像化を適用し、分析を、臨界期マウス(P28)由来の運動皮質のセクションにおける層状5錐体ニューロンに制限する。
低倍率画像が錐体細胞の樹状突起の程度を明らかに描写している一方で、本発明者らはシナプス接触を計数し、各棘の形態学的クラスを決定するために高倍率を使用する。本発明者らは、大きくて球状(「マッシュルーム」、M)、短くてずんぐりしている(「ずんぐりしている」、S)、短くて薄い(「薄い」、T)または糸状仮足(F)として棘を分類する。単位枝当たりの棘の密度の比較は、ノックアウトニューロンにおける棘密度の減少傾向を示しており、処置を受けたノックアウトでは大きく回復している。
本発明者らは、続くG−2−MePEの投与で処置できる様式での興奮制伝達における機能性欠陥を支持する、ノックアウトにおける樹状接触の数および成熟状態における欠損の可能性を見出している。
成体MeCP2+/−マウスにおける眼球優位性(OD)可塑性はcG−2−アリルPによって低減する。
OD可塑性における発育変動は、IGF−1経路の活性化によって部分的に制御され、(1−3)IGF−1の投与は野生型若年マウスにおいてOD可塑性を低減できる(Tropea et al., 2006)。したがって本発明者らは、cG−2−アリルP処置が成体MeCP2変異体において観察されるOD可塑性の延長を安定化できるかどうかを試験する。雌MeCP2+/−マウス、年齢P60以上で単眼を4日間遮断し、同時にcG−2−アリルPで処置する。cG−2−アリルP処置は、成体Mecp2+/−マウスにおいてOD可塑性を低減し、確実にG−2−MePEがシナプス安定化または成熟化を急速に誘導できることを示している。
MeCP2−/yマウスにおける徐脈はcG−2−アリルPによって処置される。
神経生理学的症状を回復させることにおけるcG−2−アリルPの有効性を検討することに加えて、本発明者らは生物の全体的な健康へのその効果を特徴付けることを目指している。臨床的および実験的証拠は、レット症候群患者における不安定な呼吸リズムおよびベースライン心臓の迷走神経緊張の低減などの自律神経系機能障害を示している(Julu et al., 2001)。交感神経系を通じて血圧恒常性を制御しているフィードバック機構の調節不良、例えば心拍数の過換気誘発減少は、レット症候群患者において一般的であり、重篤な不整脈を生じる場合がある(Acampa and Guideri, 2006、Julu et al., 2001)。
心臓自律神経障害の病態形成は、十分に理解されていないが、脳幹での未成熟ニューロン連結が原因である可能性があることを示唆している。MeCP2−/yマウスにおける心拍数異常性およびcG−2−アリルP処置の効果を検討するために、本発明者らはビヒクルまたはcG−2−アリルPで処置した非麻酔野生型およびMeCP2−/y動物においてリアルタイム心臓脈拍数をモニターする。野生型マウスは、1分間当たりおよそ750回を中心とする心拍数測定値の規則的分布を示している。対照的にMeCP2−/yマウスは、さらに低い平均速度を示して、さらに不規則な心拍数を示し、その発生率は、cG−2−アリルPでの処置後に顕著に低減する。
cG−2−アリルP投与は自発運動活性および寿命を改善する。
MeCP2−/yマウスは、4〜6週齢でレット様症状を発症し、それらは進行性で嗜眠性になり、歩行失調を発症し、10から12週齢の間で死ぬ(Chen et al., 2001)。ベースライン自発運動活性も、ケージ内のエリアでの夜間の赤外線ビーム交差事象を計数することによって6週後のマウスで記録する。MeCP2ノックアウトマウス(KO)は、野生型マウス(WT)と比較して著しく低減した自発運動活性レベルを示すが、cG−2−アリルP(KO−T)での処置はこれらのレベルを上昇させる。
最終的に、MeCP2 KO同腹仔と比較して、cG−2−アリルPで処置したMeCP2−/yマウスも平均余命における増加を示す。
本発明者らは、海馬におけるニューロン神経細胞体サイズへのcG−2−アリルP処置の効果も測定する。マウスを上に記載のとおり自発運動活性についてcG−2−アリルPで処置する。海馬のCA3領域におけるニューロンでの神経細胞体サイズは、野生型動物と比較してMeCP2 KO動物において顕著に損なわれている。cG−2−アリルP処置は、KO動物において平均神経細胞体サイズを増加させるが、野生型動物における神経細胞体サイズにはほとんどまたは全く効果を有さない。
(例22)
マウスにおけるレット症候群での生存への経口cG−2−アリルPの効果
レット症候群が慢性の運動技能の消失を含む衰弱障害であることから、容易に投与される調製物を使用してレット症候群を処置することは望ましい。この目的のために本発明者らは、cG−2−アリルPおよび関連化合物の予測外に有益な治療的および薬物動態学的特性を利用できる(米国特許第7,776,876号および第8,067,425号)。
したがって本発明者らは、cG−2−アリルPを経口でMeCP2欠損マウスに投与する。簡潔には、cG−2−アリルPの薬学的有効量(動物1匹当たり20または80mg/kg)を含有する水性溶液または他の組成物を毎日投与する。対照MeCP2欠損動物には本発明者らは生理食塩水だけを投与し、野生型動物を設計に類似しているベースラインデータを得るために使用する。
野生型動物では、生存は各時点で100%であると定義される。MeCP2欠損動物では生存は、実質的に減少している。しかしMeCP2欠損マウスへのcG−2−アリルPの経口投与後、生存は実質的に増加する。
(例23)
マウスにおけるレット症候群での発作(Seizure Activity)へのcG−2−アリルPの効果
発作が顕著で、危険で治療困難なレット症候群の態様であることから、本発明者らはMeCP2欠損動物における発作へのcG−2−アリルPの効果を判定する。
生理食塩水またはcG−2−アリルPのいずれかで処置した野生型マウスおよびMeCP2欠損マウスの脳波記録を、参照として全体を組み込む米国特許第7,714,020号に記載の方法を使用して得る。
本発明者らは、G−2MePEが運動発作および非けいれん性発作の両方を減少させることに有効である可能性があることを見出している。
結論
cG−2−アリルPは、レット症候群を有するヒトを処置するための効果的な治療法である可能性がある。さらに、cG−2−アリルPが天然に存在する化合物((1−3)IGF−1;グリシルプロリルグルタミン酸またはGPE)よりも予測外に長い半減期を有することから、本発明者らは、cG−2−アリルPの使用は、GPEを含む他の薬理学的薬剤を超える明確で実質的な有利点を有することを見出している。
例えばcG−2−アリルPは、静脈内、皮下、脳室内、または非経口で送達される必要はない。実際に、マイクロ乳液、粗乳液、液体結晶調製物、ナノカプセルおよびハイドロゲルを含む経口製剤を、神経学的機能を改善でき、神経変性状態を処置できる錠剤、カプセルおよびゲルなどの経口で投与される調製物の製造において使用できる。本発明の化合物は、錠剤またはカプセルを飲むために必要である患者の運動機能が低い状況で使用できる。化合物の経口投与のための可溶性ゲルのいくつかの種類があり、これらは、本発明の化合物または組成物を患者に送達するために使用できる。cG−2−アリルPが経口で容易に投与でき、レット症候群を含む神経変性障害を処置することに経口で有効であることから、本発明者らはcG−2−アリルPがレット症候群を有する患者の長期治療のために簡便で有益である可能性があると結論付けている。
さらにレット症候群が鍵となる特性を他の自閉スペクトラム障害と共有していることから、本発明の化合物は、他のASDを有する動物から、ならびに自閉症、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および他に規定されない広汎性発達障害(PDD−NOS)を有するヒトにおいて治療的有効性を提供することにおいて有用である可能性がある。
(例24)
ASDの処置
ASDにおける化合物の治療有効性を評価するために使用されているいくつかの動物系がある。
Shank3−欠損マウスモデル
Shank3−欠損マウスを研究においてASDに関連する22q13欠失症候群のモデルとして使用する。
22q13欠失症候群は、Shank3遺伝子における欠失または変異に関連する(Bonaglia et al, 2006)。Shank3遺伝子は、グルタミン酸シナプスにおいてフレームワークを形成するマスタースキャホールディングタンパク質をコードしている(Boeckers et al, 2006)。Shank3は、シナプス後密度(PSD)のコアの欠かせない部分であり、α−アミノ−3−ヒドロキシル−5−メチル−4−イソキサゾル−プロピオン酸(AMPA)、代謝型グルタミン酸(mGlu)およびN−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA)グルタミン酸受容体の構成成分ならびに細胞骨格系構成成分を含むPSDへおよびシナプスへ多数の鍵となる機能性構成要素を動員する。22q13欠失/Shank3変異の割合を探索する近年の研究は、Shank3のハプロ不全がASD症例の0.5%から1%の頻度でASDの一遺伝子性形態を生じる場合があることを示唆している(Durand et al, 2007、Moessner et al, 2007、Gauthier et al, 2008)。
全長Shank3の発現の破壊を有するマウスモデルの生成は、当技術分野において既に記載されている(Bozdagi et al., Molecular Autism 2010, 1 :15, p4)。簡潔には、Bruce4 C57BL/6胚性幹細胞をエクソン4およびエクソン9の前に挿入されたloxP部位を有するマウス系統を生成するために使用した。loxPが導入された対立遺伝子を切り出し、エクソン4から9の欠失、すなわちShank3のアンキリン反復ドメインの完全な欠失を伴って系統を維持した。野生型(+/+)ヘテロ接合性(+/−)およびノックアウト(−/−)マウスをヘテロ接合体−ヘテロ接合体交雑からメンデルの頻度で産生した。全長Shank3 mRNAの50%低減をヘテロ接合体(qPCR)において、およびShank3タンパク質の発現の低減を確認した(Shank3抗体N69/46での免疫ブロット法による)。
ヘテロ接合体を有する野生型マウスとの交雑によって生成されたヘテロ接合性マウスを22q13欠失症候群の原因となるShank3のハプロ不全のモデルを最良としてこの例において使用する。
方法
薬物処置
1から3月齢野生型およびヘテロ接合性Shank3欠損マウスを4処置群:プラセボ処置野生型、プラセボ処置Shank3欠損群および2つのShank3欠損cG−2−アリルP処置群に分ける。動物にプラセボ(水)または水中に製剤化したcG−2−アリルPを経口投与で、14日間にわたり1日2回与える。cG−2−アリルPを2用量:15または60mg/kg投与する。
方法論
方法論の詳細な記載はBozdagi et al. (Molecular Autism 2010, 1: 15)において見出すことができる。
行動分析
行動評価は、いくつかの時点で行われ、Bozdagi et alによって記載された方法論による社会的相互作用および超音波の社会的コミュニケーションの分析を含む。簡潔には、各処置群における雄雌間の社会的相互作用を評価する。対象雄は集団で飼育し、清潔なわらを有する清潔なケージにおいて個々に試験される。各試験セッションは5分間継続する。対象マウスそれぞれを様々な見慣れない発情C57BL/6J雌と組み合わせる。デジタル閉回路テレビカメラ(Panasonic、Secaucus、NJ、USA)をケージから水平に30cmに位置付ける。超音波マイクロフォン(Avisoft UltraSoundGateコンデンサーマイクロフォンカプセルCM15;Avisoft Bioacoustics、Berlin、Germany)をケージの上20cmに置く。マイクロフォンのサンプリング周波数は250kHzであり、分解能は16ビットである。使用した装置は、雄対象と雌パートナーとによって発せられる鳴き声を区別できないが、マウスでの雄雌間の相互作用の際の鳴き声の圧倒的多数は、通常雄によって発せられる。装置全体は、単一の25ワット赤光源によって照らされる減音環境チャンバー(sound−attenuating environmental chamber)(ENV−018V;Med Associates、St Albans、VT、USA)に含まれる。次に雄対象からのビデオは、対象の遺伝子型および処置群を知らされていない調査者によって、Noldus Observerソフトウェア(Noldus Information Technology、Leesburg、VA、USA)を使用して、鼻をつきあわせる臭い嗅ぎ行動、鼻で肛門性器部の臭いを嗅ぎ行動および他の身体領域の臭いを嗅ぐ行動の測定についてスコア化される。超音波発声を、遺伝子型/処置群情報に盲検の2名の高度に訓練された調査者によって手作業で同定し、略式の統計をAvisoftパッケージを使用して算出する。評定者間信頼性は95%である。データを独立スチューデントのt検定を使用して分析する。
嗅覚馴化/脱馴化試験を各群について雄および雌マウスにおいて実施する。方法は既に記載されている(Silverman et al 2010、Yang et al 2009およびSilverman et al 2010)。非社会的および社会的臭いは、次の順で、すなわち水、水、水(蒸留水);アーモンド、アーモンド、アーモンド(1:100希釈のアーモンド抽出物);バナナ、バナナ、バナナ(1:100希釈の人工バナナ香料);社会的1、社会的1、社会的1(見慣れない性別が一致するB6マウスを飼っているケージの底から拭った);および社会的2、社会的2、社会的2(見慣れない性別が一致する129/SvImJマウスの異なる群を飼っている第2のケージの底から拭った)で、ホームケージに連続的にそれぞれ2分間挿入された一連の綿棒によって提示される。一元配置反復測定ANOVAを馴化事象の各セットおよび各脱馴化事象について各処置群内で実施し、チューキーの事後検定が続く。
海馬切片電気生理学
死後に、急性海馬切片(350μm)を、組織チョッパーを使用してマウスから調製する。切片を維持し、実験を32℃で実行する。切片を:NaCl、125.0;KCl、2.5;MgSO4、1.3;NaH2PO4、1.0;NaHCO3、26.2;CaCl2、2.5;グルコース、11.0を(mMで)含有するリンゲル溶液で灌流する。リンゲル溶液を95%O2/5%CO2、32℃で、細胞外記録の際に通気する(電極溶液:3M NaCl)。切片を奮性シナプス後場電位(fEPSP)のベースラインの確立の1時間前に維持し、エリアCA1における放射状層から記録し、シェファー側枝交連求心神経(Schaffer collateral−commissural afferents)のエリアCA3に置かれた双極性タングステン電極での刺激(30秒ごとに100μsパルス)によって惹起する。試験刺激強度は、fEPSPを最大応答の半分である振幅で得られるように調整する。EPSP初期スロープ(mV/ms)を4個の連続する応答の平均波形から決定する。入出力(I/O)曲線を低Mg2+(0.1mM)溶液中のfEPSPスロープ対線維斉射振幅をプロットすることによって生成する。AMPA受容体介在およびNMDA受容体介在I/O関連をイオンチャネル型グルタミン酸受容体アンタゴニスト:2−アミノ−2−ホスホノペンタン酸APV(50μΜ)および6−シアノ−7−ニトロキノキサリン−2,3−ジオンCNQX(100μΜ)の存在下で測定する。二連発刺激応答を10から200msの刺激間間隔で測定し、第2の刺激パルスの第1の刺激パルスに対する平均応答の比として表す。
LTPは、対照および遺伝子改変マウスに対して、高周波刺激によって(4回の100Hz、1秒刺激は5分間離された)、またはシータバースト刺激(TBS)(200ms離された100Hzでの4回のパルスの10回バースト)によって、または単一の100Hz刺激によってのいずれかによって誘導される。長期抑うつ(LTD)を誘導するために、シェファー側枝を低周波または二連発低周波刺激(1Hzでの900パルス、15分間)で刺激し、mGlu受容体依存性LTDを誘導する。データを平均±SDとして表し、統計解析を0.05のαレベルでの有意設定で分散の分析(ANOVA)またはスチューデントのt検定を使用して実施する。
結果
行動的
雄試験対象による社会的臭い嗅ぎ行動合計の累積的持続時間は、プラセボ処置野生型群においてよりもプラセボ処置Shank3−欠損群において低下している。付加的に、雄雌間の社会的相互作用の際により少ない超音波発声が野生型対照よりもプラセボ処置Shank3−欠損群によって発せられる。
2匹のShank3−欠損群におけるcG−2−アリルP処置は、プラセボ処置Shank3−欠損群と比較して、社会的臭い嗅ぎ行動の合計の累積的持続時間における顕著な増加を生じる。さらにcG−2−アリルP処置群は、プラセボ処置変異群よりも増加した超音波発声の回数を示している。
嗅覚馴化/脱馴化研究は、マウスが社会的誘引物質を検出でき、4群すべてが正常レベルの馴化(連続して3回の同じ臭いを嗅ぐ行動に費やした時間の減少によって示される)および予測される脱馴化(異なる臭いを嗅ぐ行動に費やした時間の増加によって示される)を示すことを確認することを意図した。
電気生理学
興奮性シナプス後場電位(fEPSP)スロープ対刺激強度をプロットすることは、プラセボ処置Shank3−欠損群対対照群でのI/O曲線における低下を実証している。ヘテロ接合性プラセボ処置群において本発明者らは、AMPA受容体介在場電位における減少も観察し、野生型対照群と比較してI/O関数の平均スロープにおける50%減少を反映している。対照的にシナプスNMDA受容体機能を測定するために競合的AMPA/カイニン酸(kianate)受容体アンタゴニストCNQXの存在下でI/O関連を分析する場合、野生型とプラセボ処置ヘテロ接合性群の間に差異はない。これらの結果は、Shank3ヘテロ接合性マウスでのAMPA受容体介在基底伝達における特異的低減を示している。
cG−2−アリルP処置は、両方のヘテロ接合性群においてAMPA受容体介在場電位を標準化し、プラセボ処置Shank3−欠損群と比較してI/O関数の平均スロープにおける増加を生じる。
プラセボ処置Shank3−欠損群におけるLTPの維持は、野生型対照と比較して明白に損なわれている。TBS LTP試験(200ms離された100Hzでの4回のパルスの10回バースト)もプラセボ処置Shank3−欠損群におけるTBS後60分での増強において顕著な減少を示している。LTPで観察された変化したシナプス可塑性とは対照的に、長期抑うつ(LTD)は、変異群において顕著に変化していなかった。cG−2−アリルP処置は、プラセボ処置Shank3−欠損群と比較して、海馬性長期増強(LTP)およびその維持を両方のShank3−欠損群において増加させる。
考察および結論
社会的適応力の乏しさおよび反復行動は、ASDのすべての形態の一般的特性および鍵となる診断目安である。知能発達遅延および言語技能の未発達もアスペルガー症候群を除くすべてのASDにおいて存在する一般的特性である。
上に記載の動物モデルは、臨床的ヒト状態に類似の症状を提示するとして当技術分野において認められている。上に記載のすべての変異モデル(NLGN3、NLGN4、CADM1、NRXN1、FMR1、shank3)は、社会的技能の障害または社会的不安の増加を表す。海馬への興奮性伝達の減少は、NRXN1、shank3、MeCP2およびFMR1変異動物モデルにおいて同定されている。現在、ASDの多起源または他因子性モデルは、記載されていない。上に記載の動物モデルは、ヒト集団においてASDを生じることが周知である遺伝子欠陥に基づいており、ASD治療の有効性を試験する最良の機会を提供する。
したがってASDの動物モデルにおけるcG−2−アリルPの有効性は、ASDを罹患しているヒト対象におけるその有効性の合理的な予測である。
(例25)
FXSマウスリンパ球のリン酸フローサイトメトリー分析によるシグナル伝達タンパク質リン酸−ERK1/2およびリン酸−Aktの測定
シグナル伝達経路は外部刺激を細胞応答に関連付け、通常、細胞増殖、死および分化を制御する。本発明者らは、ERK1/2およびAktに対する、それらがリン酸化された場合にだけこれらのタンパク質を認識するリン酸特異的抗体を使用する。フローサイトメトリーの1つの独特の特性は、標準的生化学技術によって得られたのではないリン酸化状態の測定を実施するその能力であり、これは薬物処置効果を研究するために広い可能性を明らかに有している。
方法
リンパ球を5匹のfmr1ノックアウトおよび5匹の野生型同腹仔対照マウスからcG−2−アリルPの注射後に研究時ごとに単離する。リンパ球を2個のシグナル伝達エフェクター、p−ERK1/2およびp−Aktの活性化について、フローサイトメトリー(リン酸フロー)による活性化の目安としてリン酸化状態を使用して検討する。
取った測定値は:
1.リンパ球での総フローサイトメトリー合計およびリン酸化ERK
2.リンパ球での総フローサイトメトリー合計およびリン酸化AKT
結果
本発明者らは、fmr1ノックアウトマウスから単離されたリンパ球がERK1/2およびAktリン酸−エピトープの活性化を示すことを見出している。cG−2−アリルPで処置したfmr1ノックアウトマウスにおけるp−AKTおよびp−ERK1/2についての平均蛍光強度(MFI)レベルは、すべての時点において減少している:単回処置15、30、60および240分後。本発明者らは、fmr1ノックアウトマウスにおいてcG−2−アリルP処置の5日後および連続する日でMFIの同様の低減を見出している。
要約すると、cG−2−アリルPは、fmr1ノックアウトマウスにおいてERK1/2およびAktのリン酸活性化における顕著な低減を産生する。この結果は、p−ERKおよびp−AktがASDまたはNDDを有するヒトを処置することにおける治療有効性を評価するために有用な生物学的マーカーであることを示している。pERKおよびpAktのリンパ球における発現がfmr1ノックアウトマウスの脳におけるこれらのリン酸化タンパク質の発現に類似していることから、リンパ球における治療効果の観察は、ヒトを含む罹患した動物の脳におけるcG−2−アリルPの効果の合理的な予測である。
(例26)
G−2−アリルPを使用する脆弱X症候群を有するヒトの処置
cG−2−アリルPが脆弱X症候群を有する患者を処置することに有効であるかどうかを判定するために、本発明者らは二重盲検、プラセボ対照研究を実行する。
方法
患者
脆弱X症候群を有する男性患者は、全fmr1変異を実証する遺伝子解析によって診断される。本明細書で上述の1つまたは複数の臨床評価ツールを使用して症状を評価する。各患者を1つまたは複数の臨床評価ツールによって1つまたは複数の反復行動(RBB)、不安および社交性についてスコア化する。4以上の臨床全般印象−重症度(CGI−S)スコア、または30以上のABC合計スコアを登録する。
薬物送達
登録患者を群に分ける。すべての登録者は、2週間にわたり1日2回、単回盲検投与プラセボで試験を開始する。次いでcG−2−アリルPを、経口で35mg/kgを1日2回(n=20)または70mg/kgを1日2回(n=20)の用量で28日間投与し、続いて28日間のプラセボ、またはプラセボに無作為化された場合は、cG−2−アリルPを70mg/kgを1日2回の用量で42日目に開始して投与し、70日目に停止する。研究投薬を調剤する前に、cG−2−アリルPを経口投与のための液体を提供するためにイチゴ風味を付けた希釈剤で再構成する。プラセボ(n=20)は、イチゴ希釈剤および水である。
評価
薬物動態学
各群のすべての対象から血液試料を42日目および70日目に採取する。四個の(4)試料を開始42日目に(投与前および投与後2〜4時間)および70日目(投与前および投与後2〜4時間)に回収する。各時点での予備試料も回収する。
有効性
有効性を、重症度の臨床全般印象(CGI−S)、改善の臨床全般印象(CGI−I)、脆弱X症候群評価尺度、臨床医完全脆弱Xドメイン特異的懸念(視覚的アナログ尺度)、介護者上位3位懸念(Caregiver Top Three Concerns)(視覚的類似尺度)、異常行動チェックリスト、バインランド適合行動尺度、CASI−16、CYBOCS−PDD、発作日誌、コンピューター化指標追跡、KiTapを使用する認知のコンピューター化測定、および表出言語試料採取課題を使用して判定する。
有効性結果測定
以下の4群の有効性結果測定を、単独および組み合わせたcG−2−アリルPの2種の投与レベルをプラセボと比較して評価する。
包括的機能的帰結測定
次の測定をベースラインで、処置の際にならびに活性およびプラセボ群の間で比較した変化で評価する。
脆弱X症候群評価尺度における変化を各対象について、ベースライン(処置前)14日目ならびに処置の終了時(42日目および70日目)の間で算出する。
包括的結果は、臨床全般印象−重症度および改善尺度(CGI−SおよびCGI−I)によって各来院時に、ベースライン以降から(例えば14、28、42、56、70および84日目測定する。
臨床医−完全脆弱Xドメイン特異的懸念における変化は、視覚的アナログ尺度(VAS)を介して捕捉され、各対象についてベースライン(処置前)、14日目および処置終了時(42および70日目)間で算出する。
視覚的類似尺度(VAS)を介して捕捉される介護者上位3位懸念(対象の脆弱X症候群に関する)における変化をベースライン(処置前)、14日目および処置終了時(42および70日目)間で対象において算出する。
CASI−16、CYBOCS−PDD、異常行動チェックリスト(ABC)、表出言語試料採取課題およびバインランド適合行動尺度(VABS)における変化を各対象についてベースライン、14日目および42日目および70日目の間で算出する。
生理学的結果測定
血清レベルならびに標準的血液学および化学パラメータ(甲状腺機能を含む)の変化を70日目までベースラインから算出する。眼底試験および扁桃腺サイズをベースライン、ならびに14、28、42、56、70および84日目に記載する。フローサイトメトリーを、14、28、42、56および70日目に得た血液試料での抹消リンパ球中の酵素AktおよびERKのリン酸化状態を評価するために使用する。ECGをスクリーニング、ベースライン、28、42、56および70日目に評価する。
認知/自動化結果測定
次の測定値をベースライン、薬物投与研究時および研究後に評価する。KiTapを使用する認知のコンピューター化測定を、ベースライン、14日目、42日目、70日目および84日目に評価する。コンピューター化指標追跡評価をベースライン、14日目、28、42、56および70日目に測定する。
薬物動態学的−薬力学的関連
適合した薬物動態学的(PK)および有効性(PD)測定値は、無作為に35mg/kgまたは70mg/kgのcG−2−アリルPいずれかを経口で1日に2回受けているすべての患者から回収する。薬力学的マーカーは、包括的機能的、生理学的および認知/自動化結果を含む。手法は、研究の経過にわたる有効性測定における変化を評価するためおよびこれらを測定されたまたは算出された薬物動態学的評価項目と相関させるためである。付加的にPK/PDモデルを、必要に応じてcG−2−アリルPの血液濃度と効果との間の関連を確立するために使用する。
統計的方法
有効性
ANOVA、ANCOVAおよびカイ二乗検定を有効性測定レベルと処置群間の変化を比較するために使用する。各投与群を同時のプラセボ群と比較し、併用投与群を併用プラセボ群と比較する。両側p値<0.05を、統計的有意性を示すとみなす。
60個(40:20)の合計試料サイズは、脆弱X症候群評価尺度などの鍵となる結果測定において80%検出力を有して統計的に有意(両側α=0.05)として検出される、活性とプラセボとの間のエフェクトサイズ>0.80を可能にする。各用量群内での比較(すなわち評価時期の比較)のために、活性およびプラセボ内でのエフェクトサイズ>0.7は、80%検出力を有して統計的に有意(両側α=0.05)として検出される。
薬物動態学
定常状態での最大濃度(Cmax;ピーク)、最小濃度(Cmin;トラフ)、C0−4および曲線下面積(AUC)パラメータをcG−2−アリルP濃度データから直接算出し、平均、中央値、幾何平均、標準偏差、範囲および95%信頼区間を含む標準的記述統計学を使用して各時点で要約する。
PKパラメータと有効性測定の間に関連があるかどうかを判定するために、研究の経過にわたる有効性測定における変化を様々な時点で推定されたPKパラメータと相関させる。これらの関連を、相関係数および一般的線形モデルを使用して統計的に試験する。
結果および結論
本発明者らは、cG−2−アリルPが患者によって良好な耐用性を示されることを見出している。本発明者らは、cG−2−アリルPが本明細書に記載の1つまたは複数の評価ツールを使用して測定される臨床転帰を改善する臨床的に関連する顕著な効果を有することをさらに見出している。本発明者らはcG−2−アリルPがpERKおよびpAktレベルを標準化することも見出している。
本研究は、cG−2−アリルPがヒトにおける脆弱X症候群の有害症状を処置することに効果的であることを実証している。
(例26)
ラットにおける貫通性弾道様脳損傷後のシナプス可塑性へのcG−2−アリルPの効果I:
この例では本発明者らは、cG−2−アリルPが貫通性弾道様脳損傷(PBBI)後に抗炎症および抗アポトーシス活性を有するかどうかを調査した。cG−2−アリルPに類似する分子構造が、記憶増強効果を有し、またはin vivoでの受動的回避学習を改善し、in vitroで神経突起増殖を促進することを示している。これは、c(GP)類似物での処置が神経可塑性およびシナプス形成を増強することを示唆している。したがって本発明者らは、cG−2−アリルPがPBBI後にシナプス可塑性を決定する遺伝子およびコードされたタンパク質を制御するかどうかを調査した。
方法
貫通性弾道様脳損傷(PBBI)
頭部への弾丸または断片創傷傷の弾道学動態を模倣する一側性前頭PBBIモデル(Williams, 2005、Williams, 2006)は、右前皮質を通じたカスタムプローブの定位挿入によって誘導された。一時的な腔が、プローブの末端に装着された弾性バルーンの急速な膨張/収縮(すなわち<40m秒間)によって形成された。PBBI装置は、コンピューター制御水圧発生装置(Mitre Corp McLean、VA)、PBBIプローブおよび、既に記載のカスタム設計プローブホルダーを備えた定位フレームからなる(Lu, 2009、Williams, 2005)。損傷重症度をコンピューター制御の水圧下でのバルーンのサイズによって決定した。0.63cm拡大に較正されたバルーン直径は、ラット総脳容積の10%を表す、すなわち10%PBBIを表す。すべての手術は麻酔下で行った。試験した群は:疑似+ビヒクル、PBBI+ビヒクル、PBBI+cG−2−アリルP(経口経管栄養による30mg/kg、損傷後30分、および収量まで毎日1回)。すべての手順は、the Institutional Animal Care and Use Committee of WRAIRによって承認された。動物はAAALACによって公認された施設で飼った。
cG−2−アリルPの経口投与
cG−2−アリルP(またはビヒクル)を30mg/kgの用量で動物に経口経管栄養を介して投与した。
ELISA
標的タンパク質をインターロイキン1ベータ(「IL−1ベータ」)(GenWay Biotech GWB−SKR107)およびインターロイキン−6(「IL−6」)(GenWay Biotech GWB−ZZD100)ELISAで製造者の説明書に従って定量した。レベルを算出し、BCAアッセイによって決定した全タンパク質濃度に標準化した(1群当たりn=9〜10)。
ウエスタンブロット
試料をすべての群(疑似+ビヒクル、PBBI+ビヒクル、PBBI+cG−2−アリルP)について損傷後24時間ならびに3および7日で分析した。組織を、HALTプロテアーゼ阻害剤を含有するRIPA緩衝液中で均質化した。総タンパク質は、BCAアッセイに基づいた。ブロットを5%ミルクでブロックし、抗ATF3、抗BAX、または抗BCL2で探索した。ブロットを、タンパク質添加を調節するために抗ベータアクチン抗体で再探索した。バンド強度の分析をLAS4000およびImageQuantTLソフトウェア(GE Healthcare)を使用して行った(1群当たりn=9〜10)。
神経可塑性mRNAアレイ
cDNAを生成した。個々の動物由来の総RNAからランダムプライマーを使用する。cDNAをSA Biosciencesによって産生された標的化PCRアレイに置き、産生物を、SyBr緑色蛍光を使用して検出した。Ctレベルをベータアクチンに標準化した。損傷結果を、相対量(RQ)を評価するために疑似と比較した(1群当たりn=6)。
結果
PBBI損傷単独では、炎症性およびアポトーシス性測定研究における急性(PBBI後24時間)増加を導いた。図33A〜33Fは、これらの結果を示す。PBBIは、IL−1ベータ(図33A)およびIL−6(図33D)の量を増加させた。cG−2−アリルPは、炎症誘発性サイトカインIL1−ベータ(図33C)およびIL−6(図33Dおよび33F)を減少させた。ANOVA:*p<0.05、**p<0.01;エラーバー:SEM。cG−2−アリルPは、IL−ベータレベルをPBBI後3日目に増加させ、その下流標的IL−6について代償性である可能性がある。cG−2−アリルPでの処置は、PBBI後7日目にIL1−ベータのレベルを減少させた(図33C)。cG−2−アリルP処置は、IL−6レベルをPBBI後24時間(図33D)および7日目の両方で減少させた(図33E)が、3日目(図33B)ではあまり効果を有さなかった。これらの結果は、cG−2−アリルPがこれらの炎症性サイトカインを減少させたことを示している。
図34は、PBBIがBAX(図34A、34Bおよび34C)ならびにBCL2(図34D、34E、34F、34Gおよび34H)の発現を顕著におよび実質的に増加させたことを示している。cG−2−アリルPは、BAX(図34A〜34C)またはBCL2(図34D〜34H)レベルを顕著に変化させなかった。
図35は、PBBIがすべての時点でATF3の発現を増加させたことを示している(図35A〜35C)。驚くべきことに本発明者らは、cG−2−アリルPがウエスタンブロットによって包括的に測定されたとおり、PBBI後24時間でATF3を減少させることを見出した(図35A)。
図36は、PBBI後に、cG−2−アリルP処置がグリア4(AMPA受容体;図36F)を24時間時点で顕著に増加させたことを示している。付加的に本発明者らは:クレム(Crem)(CREB阻害物質;図36D)の減少、NTF3(図36J)の減少、NTF4(図36K)の減少、Pcdh8(腫瘍抑制因子遺伝子;図36L)の減少、BDNF(図36A)の減少、Pim1;図36M)の減少およびPpp3ca(図36N)の増加を含む傾向を観察した。
結論
RNA発現におけるこれらの傾向、具体的にはグリア4の増加、クレムの減少およびPcdh8発現の減少は神経可塑性を促進する。NTF3およびNTF4の減少は、シナプス形成を可能にする。
全体としてこれらの結果は、cG−2−アリルPが重度のPBBI後に抗炎症性効果を有し、神経可塑性を増強したことを示している。この実験系で得られた結果がヒトにおいて見られる効果の合理的な予測であることから、cG−2−アリルPおよび類似の環状GP化合物は、軽度、中程度および重度の外傷性脳損傷の症状を処置することに有効である可能性がある。
(例27)
ラットにおける貫通性弾道様脳損傷後のシナプス可塑性へのcG−2−アリルPの効果II:
増殖関連タンパク質43およびシナプトフィジン
この例において本発明者らは、ラットにおける貫通性弾道様脳損傷(PBBI;10%損傷重症度)後の神経可塑性に関与する遺伝子およびタンパク質の発現へのcG−2−アリルPの役割を検討した。
方法
この例においてPBBIを産生するための方法は、例26のための上の記載と同じである。成体スプラーグドーリーラットを3群に無作為に帰属させた:疑似(開頭術のみ)、PBBI+ビヒクル(すなわちH2O)、およびPBBI+cG−2−アリルP。cG−2−アリルP(またはビヒクル)を損傷後30分、30mg/kgで経口経管栄養を介して投与し、その後7、14および28日間1日1回継続した。各処置終点で、ラットを灌流し、脳を組織学的分析のために処理した(n=5〜6/群/時点)。軸索新芽形成の検出のために、増殖関連タンパク質−43(GAP−43)の免疫組織化学的検出を用いた。シナプス形成をシナプトフィジン(SYN)についての免疫組織化学によって判定した。組織学的定量のために、海馬領域における積分した密度をNIH ImageJソフトウェアを使用して判定した。
結果
ビヒクル処置群ではPBBIは、同側性海馬において損傷後7日、14日および28日で、ならびに対側性海馬において損傷後7日および14日でGAP−43発現を有意に減少させた(p<0.05対疑似)。SYN染色における有意な低減がPBBI+ビヒクル群において、損傷後14日および28日に同側性海馬において、および損傷後14日に対側性海馬において検出された(p<0.05対疑似)。cG−2−アリルPでの継続的処置は、PBBI後7日または14日でGAP−43またはSYN発現における損傷誘発低減に効果を示さなかった。しかし損傷後28日でcG−2−アリルP処置は、GAP−43およびSYNの両方の発現においてPBBI−誘発低減を中等度の処置効果の指標である疑似対照と有意に異ならないレベルに減弱した。
結論
組織学的分析は、PBBIが損傷後の亜急性から慢性期の際の軸索新芽形成およびシナプス形成の有意な低減を誘発したことを示している。これらの結果は、神経可塑性を促進するcG−2−アリルPの傾向を示している。使用した動物系がヒトにおける神経可塑性の予測であることから、これらの結果は、cG−2−アリルPが脳損傷の有害作用を回復させることにおいて有効である可能性があることを示している。
本明細書で提供する記載および例は、例示の目的のみのためである。本発明の範囲は、記載された実施形態に限定されることを意図しない。本発明の要素を組み込んでいる他の実施形態は、当業者による過度の実験を伴うことなく実施できる。したがってすべてのそのような実施形態は、本発明の一部であるとみなされる。
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The following references, and all patents, patent applications and other publications cited herein are incorporated fully by reference as if separately so incorporated.

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Claims (37)

  1. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、哺乳動物に対する薬学的有効量の環状グリシル−2−アリルプロリン(cG−2−アリルP)または環状シクロヘキシル−G−2MePまたは環状シクロペンチル−G−2MePを投与するステップを含み、前記症状が、実行能力の欠損、または不安神経症、または異常な恐怖条件付け、または異常な社会的行動、または反復的行動である、方法。
  2. 前記cG−2−アリルPが、水溶液および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、添加剤、担体またはアジュバントを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 錠剤またはカプセル剤中に、1つまたは複数の賦形剤、担体、添加剤、アジュバントまたは結合剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  4. 前記障害が、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)ならびに病理学的要求回避(PDA)からなる群から選択される、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記障害が、脆弱性X症候群(FXS)、アンジェルマン症候群、結節性硬化症複合体、フェラン−マクダーモット症候群、レット症候群、CDKL5変異およびX連鎖性乳児スパスム症候群からなる群から選択される、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
  6. 前記cG−2−アリルPが、直接的または循環を介して間接的のいずれかで投与される、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
  7. 前記環状G−2−アリルPが、経口、腹腔内、血管内、末梢循環、皮下、眼窩内、点眼、髄腔内、大槽内、局所、注入、移植片、エアロゾル、吸入、乱切、腹腔内、嚢内、筋肉内、鼻腔内、口腔、経皮、経肺、経直腸または経膣経路を介して投与される、請求項3に記載の方法。
  8. 前記有効量が、前記動物のキログラム質量当たり約0.001ミリグラム(mg/kg)の下限および約100mg/kgの上限を有する、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
  9. 有効性の評価が、前記動物のリンパ球におけるリン酸化されたERK(pERK)またはリン酸化されたAkt(pAkt)の測定によるものであり、ここで、pERKまたはpAktのいずれかにおける減少は、前記障害の重症度における低減を示す、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記治療が、レット症候群の自然歴/臨床的重症度尺度、異常行動チェックリスト地域版(ABC)、バインランド適応行動尺度、重症度の臨床全般印象(CGI−S)、臨床全般印象改善(CGI−I)、介護負担感アンケート(CSQ)からなる群から選択される1つもしくは複数の臨床試験、または脳波図(EEG)スパイク頻度、EEGの周波数バンド内の総電力、EEG周波数の大脳半球間コヒーレンス、常同的な手の動き、QTcおよび心拍変動(HRV)、不規則呼吸ならびに心臓および呼吸機能の連結からなる群から選択される1つもしくは複数の生理学的試験を使用して、前記障害に罹患していない対照動物と比較して評価されるようなASDもしくはNDDの症状における改善をもたらす、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
  11. 前記ASDの症状が、認知機能障害または認知機能不全、記憶喪失の1つまたは複数の兆候または症状、空間位置感覚の喪失、学習能力の減少、短期または長期記憶を形成する能力の減少、エピソード記憶の減少、記憶を統合する能力の減少、空間記憶の減少、シナプス形成の減少、シナプス安定性の減少、実行能力の欠損、認知マッピングおよび場面記憶の欠損、発言および関係記憶の欠損、配置的または接続的な関係の迅速な習得の減少、具体的事象の文脈固有のコード化および想起の減少、エピソードおよび/またはエピソード様記憶の減少、不安神経症、異常な恐怖条件付け、異常な社会的行動、反復的行動、異常な夜行性行動、発作活動、異常な運動、ホスホ−ERK1/2およびホスホ−Aktの異常発現ならびに徐脈である、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
  12. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、式:
    Figure 2016525547
    を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
    (式中、
    1は、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
    2は、CH2、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
    1、R2、R3、R4およびR5は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
    またはR4およびR5は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であるか、
    またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であり、
    但し、R1=メチルであり、R2=R3=R4=Hである場合、R5はベンジルではなく、
    1=Hである場合、R2およびR3の少なくとも一方はHではない)
  13. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、式:
    Figure 2016525547
    を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
    (式中、
    1は、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
    2は、CH2、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
    1、R2およびR3は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
    またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であり、
    但し、少なくとも1つのRはHではない)
  14. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、式:
    Figure 2016525547
    を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
    (式中、
    1は、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
    2は、CH2、NR’、OおよびSからなる群から選択され、
    1、R2およびR3は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
    またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数である)
  15. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、式:
    Figure 2016525547
    の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
    (式中、
    1、X3およびX4は、S、OおよびNHからなる群から独立に選択され、
    2は、S、O、CH2およびNHからなる群から選択され、
    1、R2、R3、R4およびR5は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
    またはR4およびR5は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であるか、
    またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数であり、
    但し、少なくとも1つのRはHではなく、X3およびX4の両方はOではない)
  16. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、式:
    Figure 2016525547
    の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
    (式中、
    1およびR2は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
    またはR1およびR2は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数である)
  17. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、式:
    Figure 2016525547
    の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
    (式中、
    1、R2およびR3は、−H、−OR’、−SR’、−NR’R’、−NO2、−CN、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’R’、−C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各R’は、−H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
    またはR2およびR3は一緒になって−CH2−(CH2n−CH2−であり、ここでnは0〜6の整数である)
  18. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、式:
    Figure 2016525547
    の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
    (式中、
    Rは、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選択される)
  19. 1=メチルである、請求項12から15または17のいずれか1項に記載の方法。
  20. 1=アリルである、請求項12から15または17のいずれか1項に記載の方法。
  21. 2=R3=メチルであり、X2=Sである、請求項12から15のいずれか1項に記載の方法。
  22. 1=アリル、R2=R3=R4=R5=H、X1=NH、X2=CH2である、請求項12に記載の方法。
  23. 1=メチル、R2=R3=H、R4およびR5が一緒になって−CH2−(CH23−CH2−であり、X1=NH、X2=CH2である、請求項12に記載の方法。
  24. 1=メチル、R2=R3=H、R4およびR5が一緒になって−CH2−(CH22−CH2−であり、X1=NH、X2=CH2である、請求項12に記載の方法。
  25. 薬学的に許容される賦形剤を投与するステップをさらに含む、請求項12から18までのいずれか1項に記載の方法。
  26. 薬学的に許容される賦形剤および結合剤を投与するステップをさらに含む、請求項12から18までのいずれか1項に記載の方法。
  27. 薬学的に許容される賦形剤およびカプセル剤を投与するステップをさらに含む、請求項12から18までのいずれか1項に記載の方法。
  28. 少なくとも1つの他の抗アポトーシス剤、抗壊死剤または神経保護剤を投与するステップをさらに含む、請求項12から18までのいずれか1項に記載の方法。
  29. 前記他の抗アポトーシス剤または神経保護剤が、増殖因子および関連誘導体(インスリン様増殖因子−I[IGF−I]、インスリン様増殖因子−II[IGF−II]、形質転換増殖因子−β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、IGF−結合タンパク質[とりわけIGFBP−3]、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、hst/Kfgk遺伝子産物、FGF−3、FGF−4、FGF−6、ケラチノサイト増殖因子、アンドロゲン誘導性増殖因子、int−2、線維芽細胞増殖因子相同因子−1(FHF−1)、FHF−2、FHF−3およびFHF−4、ケラチノサイト増殖因子2、グリア活性化因子、FGF−10およびFGF−16、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2[BMP−2]、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンM、インターロイキン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、TNF−α、クロメチアゾール;キヌレン酸、セマックス、タクロリムス、L−トレオ−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール、副腎皮質刺激ホルモン−(4−9)類似体[ORG2766]、ジゾシルピン[MK−801]、セレギリン、グルタメートアンタゴニスト、AMPAアンタゴニストおよび抗炎症剤から選択される、請求項28に記載の方法。
  30. 前記グルタメートアンタゴニストが、NPS1506、GV1505260、MK−801およびGV150526からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
  31. 前記AMPAアンタゴニストが、2,3−ジヒドロキシ−6−ニトロ−7−スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン(NBQX)、LY303070およびLY300164からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
  32. 前記抗炎症剤が、抗MAdCAM−1抗体ならびにインテグリンα4β1受容体およびインテグリンα4β7受容体に対する抗体からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
  33. 前記抗MAdCAM−1抗体がMECA−367である、請求項32に記載の方法。
  34. 前記化合物が環状G−2−アリルPである、請求項12に記載の方法。
  35. 前記化合物が環状シクロヘキシル−G−2MePである、請求項12に記載の方法。
  36. 前記化合物が環状シクロペンチル−G−2MePである、請求項12に記載の方法。
  37. 自閉症スペクトラム障害(ASD)または神経発達障害(NDD)の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、前記動物に、哺乳動物に対する薬学的有効量の環状グリシル−2−アリルプロリン(cG−2−アリルP)または環状シクロヘキシル−G−2MePまたは環状シクロペンチル−G−2MePを投与するステップを含む、方法。
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