JP2016523097A - 腫瘍エネルギー代謝プロファイリング - Google Patents

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Abstract

哺乳動物の腫瘍関連疾患における転移又は再発又は局所的な再発の形成の可能性を含めて腫瘍進行を予測するとともに治療勧告を患者に与えるための診断方法では、組織切片又は細胞塊の栄養分、薬物、及び、エネルギー代謝への生検／外科手術の影響を減少させるために、細胞培地内での２４時間培養後に、新鮮な腫瘍組織又は新鮮な腫瘍細胞塊においてエネルギー代謝の鍵酵素の酵素活性度が決定され、嫌気性酵素の酵素活性度の商が好気性酵素の酵素活性度に対する比率の状態に置かれ、転移の予後及び治療勧告のために前記比率を考慮に入れることができる。

Description

本発明は、哺乳動物の腫瘍関連疾患における腫瘍進行を予測（転移及び再発の発生の可能性の予測を含む）するとともに治療勧告を患者に与えるための診断方法に注意を向ける。本発明は、個人に合わせた腫瘍治療に関する決定のためにエネルギー代謝における鍵酵素の酵素活性度を使用することについて更に説明する。
悪性腫瘍の転移の可能性の評価のために細胞エネルギー代謝の個々のパラメータを考慮することがしばしば試されてきたが、試験結果又は試験手順を臨床の日常生活に生かせなかった（ノバルティス財団シンポジウム２４０，２５１（２００１））。グルコース、グルタミン、ケトン体、乳酸塩、及び、ＡＴＰなどのエネルギー代謝の基質及び生成物の濃度が、異種移植腫瘍における細胞株中で、腫瘍患者の冷凍組織サンプル中で、また、生体内でも、腫瘍を供給する更に大きな血管中で決定されてきた（癌研究６２，６６７４（２００２年１１月１５日））。これらの決定は、酵素活性試験、生物発光試験、ＮＭＲ、又は、質量分析法などの代謝の分析において一般に知られている方法に基づいている。現在、腫瘍の個々の予後に関する或いは腫瘍の化学的感受性に関する証拠を与えるために腫瘍組織中の全ての本質的なエネルギー代謝経路が検査される臨床試験は存在しない。
人の悪性腫瘍の臨床治療においては、エネルギー代謝酵素の酵素活性試験の適用のための幾つかの公開された実験手法が、これらの酵素活性度が健康な組織と腫瘍組織とで異なるという事実にもかかわらず考慮されてこなかった。治療に関する迅速な決定を可能にするとともに、腫瘍診断後の腫瘍進行の信頼できる予測を可能にする方法が必要である。悪性腫瘍のエネルギー代謝の解析のための現在利用できる方法は、前述した要件を満たさない。
組織サンプル−本明細書中において、用語「組織サンプル」は固体組織と液状物質（すなわち、血液）からの単細胞とを含む−で行なわれるそのような方法が、患者の生体内の結果と同一の結果を与えるとともに、測定された酵素活性度の個人間交差比較を可能にすれば、非常に有益である。これは、ホルマリン固定組織、細胞株、球状体、及び、異種移植腫瘍の解析を用いても不可能である。生体内のエネルギー代謝の代表は、生検材料から取得される冷凍組織サンプルかもしれない。そのようなサンプルは代謝産物の決定を可能にするが、その一方で、細胞区画室内に位置される或いは多酵素複合体の一部である酵素の活性度の決定は制限される。しかしながら、冷凍組織における測定は、患者から生検材料を取得する前のエネルギー供給及び基質供給における患者の個々の違いと、生検中に外科医により誘発される腫瘍代謝の変化とが酵素活性度に影響を及ぼすという不都合を有する。そのような状況は、測定された代謝データの標準化及び個人間交差比較を可能にしない。既に生検中に、生検中又は薬物投与中の麻酔薬の種類及び投与量が細胞におけるエネルギー代謝に明確に影響を与える場合がある（蘇生 １９，１５９（１９９０年４月）。
患者組織におけるエネルギー代謝の酵素の発現が免疫組織化学又は生体発光によって決定される他の方法は、半定量的であり、酵素の実際の活性を示さない。Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １ １３０（２００５年８月）は、ホモジネート及び生体組織における活性酵素を示す、いわゆる「活性に基づくプロテオームプロファイリング」又はその更なる開発された用途（クリックケミストリー）について記載するが、それらは、半定量的であり、非常に時間がかかるとともに、高価である。
今まで、前述の方法又はそのような方法の組み合わせのいずれも、生体腫瘍組織の全体のエネルギー代謝の決定又は表示を可能にしない。特に、全ての既知の関連する細胞エネルギー基質の代謝に関与する鍵酵素の活性は、腫瘍進行の予測のため又は治療勧告のために未だ考慮されて決定されてこなかった。
本発明に内在する課題は、（リンパ節及び遠位部位への）転移及び再発の発生の可能性の予測を含めて腫瘍進行を予測するとともに治療勧告を与えるための診断方法を提供することである。診断方法は、臨床の日常生活にとって十分に容易でなければならない。
この課題は、転移、再発の発現、及び／又は、局所的な再発の形成の可能性を含めて腫瘍予後を予測するとともに治療勧告を与えるための診断方法であって、
（ａ）患者の腫瘍サンプル材料と患者からの比較サンプル材料とを培地内で培養して、サンプル材料中の栄養分、薬物、及び、エネルギー代謝への生検の影響を排除できるようにするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のサンプル材料から細胞ホモジネート及び細胞亜分画を調製するステップと、
（ｃ）細胞ホモジネート又は細胞亜分画のエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、サンプル材料及び比較サンプル材料において決定された酵素の酵素活性度の商を決定するステップと、
（ｄ）サンプル材料及び比較サンプル材料においてステップ（ｃ）で決定された商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率或いはその逆の比率を計算するステップと
を備え、
患者の前記サンプル材料は、組織切片、腫瘍細胞塊、及び、分離細胞から選択され、前記比較サンプル材料は、腫瘍遠位組織切片から選択され、又は、嫌気性エネルギー代謝を上方調節する状態下でステップ（ａ）において培養されるとともに腫瘍組織切片、腫瘍細胞塊、及び、分離細胞から選択される材料から選択される、方法を用いて解決される。
先のステップ（ｄ）において言及された比率は、嫌気性エネルギー利得に対する好気性エネルギー利得の比率として、すなわち、言い換えると、先のステップ（ｄ）において規定される比率の逆数値として計算することもできる。本明細書中に記載される方法は、正常値からの前述の比率の絶対偏差を使用し、すなわち、腫瘍遠位組織及び腫瘍組織は、嫌気性エネルギー代謝及び好気性エネルギー代謝が異ならない。
本発明の他の態様によれば、本発明は、（ｉ）腫瘍組織において及び比較のために腫瘍遠位組織において決定される、又は、（ｉｉ）腫瘍組織或いは腫瘍細胞において及び比較のために酸素欠乏状態下で決定されるエネルギー代謝の鍵酵素の少なくとも１つの嫌気性酵素及び少なくとも１つの好気性酵素の酵素活性度の比率を、転移、再発の発現、及び／又は、局所的な再発の形成の可能性を含めた腫瘍予後の予測のための指標又は生物指標として使用することに向けられる。
本発明の重要な特徴は、本発明の方法で使用される患者サンプルが新鮮な患者（腫瘍）サンプルであるという点である。酵素活性度の決定前に、患者サンプルが長期間にわたって培養される。最後に、予後のために使用される腫瘍のエネルギープロファイルが提供される。
しかしながら、冷凍保存された腫瘍組織又は冷凍保存された腫瘍細胞塊を本明細書中に記載される解析方法を用いて解析することも想定されて実現可能である。この場合、材料の酵素活性がかなり遅くなる温度で組織又は細胞塊が保管されることが重要であり、そのような許容できる温度は−１３０℃未満の範囲であり、好ましくは液体窒素（ＬＮ２）の状態において−１９６℃で保管される。
表１のサンプル＃２６の値のグラフ表示を示す図である。 表１の比率＃２６を使用する結腸癌を患う１１人の患者及び慢性リンパ球性白血病を患う７人の患者の基準として正常な組織を伴わない嫌気性及び好気性のエネルギー代謝の個々の商のグラフ表示を示す図である。
以下、記載された本発明の方法の実施形態について更に詳しく説明する。そのため、前述の課題は、
（ａ）患者の腫瘍組織及び腫瘍遠位組織のサンプルから取得される新鮮な組織切片を細胞培地内で培養して、組織切片の栄養分、基質、薬物、及び、エネルギー代謝への生検の影響を減少させるステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）の組織切片から細胞ホモジネート及び細胞亜分画を調製するステップと、
（ｃ）腫瘍組織中及び腫瘍遠位組織中の細胞ホモジネートにおける及び／又は細胞亜分画における好気性エネルギー代謝のうちの少なくとも１つ及び嫌気性エネルギー代謝の少なくとも１つの鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、腫瘍組織において及び腫瘍遠位組織において決定される酵素の酵素活性度の商を形成するステップと、
（ｄ）腫瘍組織及び腫瘍遠位組織においてステップ（ｃ）で決定された商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率を計算するステップと、を備える本発明の第１の方法を用いて解決される。
予後及び治療勧告の提供は、ステップ（ｄ）で得られる酵素活性プロファイルに基づいて可能である。
先のステップ（ｄ）において言及された比率は、嫌気性エネルギー利得に対する好気性エネルギー利得の比率として、すなわち、言い換えると、先のステップ（ｄ）において規定される比率の逆数値として計算することもできる。本明細書中に記載される方法は、正常値からの前述の比率の絶対偏差を使用し、すなわち、腫瘍遠位組織及び腫瘍組織は、嫌気性エネルギー代謝及び好気性エネルギー代謝が異ならない。
本発明は、転移の発生及び再発の可能性の予測を含めて腫瘍進行を予測するとともに治療勧告を与えるための第２の診断方法であって、比較又は参照の目的で腫瘍から遠い生検材料が使用されない、第２の診断方法に更に向けられる。この診断方法は、腫瘍組織サンプルのみを使用する。したがって、この方法は、本発明の第１の方法に代わる方法である。そのため、本発明は、
（ａ）患者の腫瘍組織又は患者の腫瘍細胞塊の生検材料から取得される新鮮な組織切片を細胞培地内で培養して、組織切片の基質、栄養分、薬物、及び、エネルギー代謝への生検の影響を減少させるステップと、
（ｂ）組織切片における嫌気性エネルギー代謝を上方調節する状態下で同じ生検材料からの第２の組織切片を培養するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ａ）及び（ｂ）の組織切片から細胞ホモジネート及び細胞亜分画を調製するステップと、
（ｄ）腫瘍組織における及びステップ（ｃ）で得られる上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍組織サンプルにおける細胞ホモジネート及び／又は細胞亜分画のエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、腫瘍組織における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍組織サンプルにおける酵素の酵素活性度の商を決定するステップと、
（ｅ）腫瘍組織における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍組織サンプルにおけるステップ（ｃ）で決定された商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率を計算するステップと、を備える診断方法にも向けられる。
予後及び治療勧告の提供は、ステップ（ｅ）で得られる酵素活性プロファイルに基づいて可能である。
先のステップ（ｅ）において言及された比率は、嫌気性エネルギー利得に対する好気性エネルギー利得の比率として、すなわち、言い換えると、先のステップ（ｅ）において規定される比率の逆数値として計算することもできる。本明細書中に記載される方法は、正常値からの前述の比率の絶対偏差を使用し、すなわち、（ａ）及び（ｂ）に記載される状態下で培養された組織切片は、嫌気性エネルギー代謝及び好気性エネルギー代謝が異ならない。
本発明の第３の実施形態の主題は、患者から収集される腫瘍細胞塊に端を発する第３の方法であって、酵素活性度が決定される第３の方法である。本発明のこの第３の方法は、
（ａ）患者から取得される新鮮な腫瘍細胞塊の一部を細胞培地内で培養して、薬物、栄養分、基質、及び、エネルギー代謝への生検の影響を排除できるようにするステップと、
（ｂ）嫌気性エネルギー代謝を上方調節する状態下で患者から取得される腫瘍細胞塊の他の部分を培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）の腫瘍細胞塊から細胞亜分画及び細胞ホモジネートを調製するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）の腫瘍細胞塊における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍細胞塊における細胞亜分画又は細胞ホモジネートのエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、腫瘍細胞塊における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍細胞塊における酵素の酵素活性度の商を決定するステップと、
（ｅ）腫瘍細胞塊における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍組織塊におけるステップ（ｄ）で決定された商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率を計算するステップと、を備える。
先のステップ（ｅ）において言及された比率は、嫌気性エネルギー利得に対する好気性エネルギー利得の比率として、すなわち、言い換えると、先のステップ（ｅ）において規定される比率の逆数値として計算することもできる。本明細書中に記載される方法は、正常値からの前述の比率の絶対偏差を使用し、すなわち、（ａ）及び（ｂ）に記載される状態下で培養された組織切片は、嫌気性エネルギー代謝及び好気性エネルギー代謝が異ならない。
本発明の第４の実施形態において、転移、再発の発現、及び／又は、局所的な再発の形成の可能性を含めて腫瘍予後を予測するとともに治療勧告を与えるための診断方法は、
（ａ）患者から取得される固体又は液体の腫瘍サンプルから細胞を分離して、分離細胞の数を推定するとともに、これらの細胞を希釈して、これらの細胞を細胞培地内で培養することにより、薬物、栄養分、及び、エネルギー代謝への生検の影響の排除を可能にするとともに、細胞の増殖を可能にするステップと、
（ｂ）嫌気性エネルギー代謝を上方調節する状態下で（ａ）に記載されるように分離されて処理された同じ量の細胞を培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）の分離細胞から細胞亜分画及び細胞ホモジネートを調製するステップと、
（ｄ）分離細胞における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う分離細胞における細胞亜分画又は細胞ホモジネートのエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、（ａ）の分離細胞における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う分離細胞における酵素の酵素活性度の商を決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ａ）の分離細胞における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う分離細胞におけるステップ（ｄ）で決定された商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率又はその逆の比率を計算するステップと、を備える。
本発明の方法は、生体外方法及び生体内方法である。
本発明の第１の方法では、細胞の経路を与えるエネルギーにおける関連する鍵酵素の活性度が測定される。酵素活性度は、腫瘍組織切片において及び腫瘍から遠い組織の組織切片において測定される。酵素は、細胞の嫌気性及び好気性のエネルギー利得に関与する。酵素に関して、腫瘍組織切片及び腫瘍遠位組織切片における酵素活性度の商が形成される。好気性エネルギー利得に関与する酵素及び嫌気性エネルギー利得に関与する酵素の酵素活性度の商から、エネルギープロファイルが計算される。エネルギープロファイルは、腫瘍の予後に関する予測と、患者のための個々の治療の選択とを可能にする。
本発明の第２の方法は、対応する正常組織（癌が無い組織）又は対応する正常細胞（癌が無い細胞塊／非癌性細胞）を得ることができない又は得ることができなかった腫瘍組織又は腫瘍細胞から取得される測定値に適している。例えば、前立腺癌の場合、肉眼的に、腫瘍組織と腫瘍が無い組織との間を生検中に区別することが非常に難しい。また、腫瘍は、臓器全体にわたって或いは構造体（リンパ節）全体にわたって分布され得るため、腫瘍が無い組織を得ることを不可能にする。考慮され得る更なるケースは、対応する正常組織をこれ以上特定できないケース（ＣＵＰ−原発不明癌症候群）である。最後に、本発明のこの代替方法は、測定のための基準として正常組織を得ることを困難にする、固体腫瘍を伴わないとともに腫瘍細胞が非腫瘍性病変細胞と混合される癌腫瘍疾患に適している。特に、これは、血液系の腫瘍疾患において当てはまる。
本発明の第３の方法は、組織切片の代わりに腫瘍細胞塊を使用する。これは、固体ではない腫瘍にとって重要である。これらは、腫瘍細胞が液状懸濁液中にある腫瘍である。これは、例えば、血液癌において当てはまる。
本発明の第４の実施形態は、組織切片の代わりに或いは多数（最大で５×１０６個の細胞）の腫瘍細胞の代わりに腫瘍サンプルから分離された細胞を使用する。固体腫瘍サンプルの場合、これは、あまりにも小さくてカットできない腫瘍サンプルにおいて重要である。液体腫瘍サンプルの場合、これは、非常に少数の細胞を含む腫瘍サンプルにおいて重要である。いずれの場合にも、低い検出限界（ＬＯＤ）を達成することが重要である。このため、細胞は、標準的な方法（例えば酵素消化法）によって固体腫瘍サンプルから分離され、その後、細胞培地内で希釈されて、培養皿（例えば、９６−ウェル細胞培養プレート）内へ播種される。分離細胞は、最大で２週間にわたって増殖可能である。液状腫瘍サンプルから分離された細胞は同じ方法で処理されるが、分離ステップは遠心分離によって行なわれる。その後、前述した測定が行なわれる。方法の望ましい加速に起因して細胞増殖ステップを省く場合には、蛍光を発する或いは蛍光性の酵素基質を使用して或いは当業者に知られる他の増幅方法を使用して酵素活性の検出を増幅させることができる。特に、この改良された方法は、例えば前立腺（例えば前立腺癌）、肝臓（例えば肝細胞癌）、皮膚（例えば悪性黒色腫）、脳（例えば、グリア芽腫又は髄芽細胞腫）、又は、脳脊髄液（例えば、悪性脳腫瘍細胞を含む）からの針生検（定位針生検を含む）材料を測定するときに重要となり得る。
本発明の方法は、転移又は局所的な再発を形成することで知られる全ての種類の腫瘍に適している。
本発明の方法における酵素活性度の測定及びサンプル調製は、実現可能かつ費用効率の高い臨床試験の要件を満たす。本発明の方法の結果は、悪性腫瘍疾患の治療及び予後に関する決定を改善する。せいぜい一人の患者における腫瘍組織と非腫瘍組織との間を区別することしかできない冷凍生検において酵素活性度を決定する既知の方法とは対照的に、本発明の方法は、異なる患者群から得られるデータの比較を可能にする。これは、患者に適した治療の選択における安全性をサポートする。
本発明の方法を用いると、細胞エネルギー代謝の鍵酵素の酵素活性度に基づいてそれぞれの腫瘍の完全な代謝エネルギープロファイルがもたらされる。この方法は、その標準化に起因して、迅速な履行を可能にするとともに、患者の腫瘍の完全な個々のエネルギープロファイルを決定するべく臨床の日常生活において適用するのに適している。本発明のプロセスは、処理されたサンプルにおける標準化されて制御されたエネルギー代謝に起因して、パラメータの個人間の交差比較を可能にする。
本発明の方法にしたがって決定される組織切片における漸増的な嫌気性エネルギー代謝は、腫瘍進行とかなり相関する。したがって、好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率こそが、転移、再発、又は、局所的再発の可能性において予見的である。ホジキンリンパ腫などの少数の腫瘍部分群は、好気性エネルギー代謝へのより強力な依存度を示し得る。また、本発明の方法は、それが好気性エネルギー代謝を上回る嫌気性エネルギー代謝の増大或いはその逆を検出するため、これらのケースにも適する。
本発明の方法では、細胞エネルギー代謝の鍵酵素の酵素活性度に基づいて特定の腫瘍の代謝プロファイルが確立される。本発明の本質的な成果は、細胞の代謝経路を与える全ての関連するエネルギーのエネルギープロファイルを代謝的に活性な生体外腫瘍組織で確立したことである。
本発明の方法で考慮されてもよい酵素は、代謝経路を与える人の嫌気性及び好気性エネルギーにおける鍵酵素である。これらの経路は、本質的には、解糖、グルタミノリシス、リポリシス、クエン酸回路、及び、酸化的リン酸化（ミトコンドリア呼吸）を含む。
本発明の方法に適した細胞及び腫瘍細胞のエネルギー代謝の鍵酵素としては、リンゴ酸酵素（ＭＥ）、特にＭＥ１、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ低親和性（ＰＫＬＡ；好ましくは二量体ＰＫ−Ｍ２）、ピルビン酸キナーゼ高親和性（ＰＫＨＡ；好ましくは四量体ＰＫ−Ｍ２）、ヘキソキナーゼ、及び、シトクロムｃ酸化酵素（ＣＯＸ）が挙げられる。これらは、人の身体に存在する酵素である。これらは、健康な組織中及び腫瘍組織中に存在する。比酵素活性度はＵ／ｍｇタンパク質で表される。これらの酵素のうち、リンゴ酸酵素（ＭＥ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ低親和性（ＰＫＬＡ又は二量体ＰＫ−Ｍ２）、及び、ヘキソキナーゼは、嫌気性エネルギー代謝の酵素と見なされ、一方、ピルビン酸キナーゼ高親和性（ＰＫＨＡ；好ましくは四量体ＰＫ−Ｍ２）、及び、シトクロムｃ酸化酵素（ＣＯＸ）は、好気性エネルギー代謝の酵素と見なされる。
リンゴ酸酵素（リンゴ酸脱炭酸酵素）は、グルタミノリシスの鍵酵素である。グルタミノリシスは、アミノ酸グルタミンがグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ＣＯ２、ピルビン酸塩、乳酸塩、アラニン、及び、クエン酸塩へと分解される一連の生化学反応を備える。エネルギーは、この経路中に嫌気的に与えられ得る。特に、リンゴ酸酵素は、可逆的化学反応、すなわち、
（Ｓ）−リンゴ酸塩＋ＮａＤＰ＋⇔ピルビン酸塩＋ＣＯ２＋ＮＡＤＰＨ
を触媒する。
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、嫌気性解糖及び嫌気性グルタミノリシスにおける最後の反応ステップ、すなわち、
ピルビン酸塩＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋⇔乳酸塩＋ＮＡＤ＋
を触媒する。
したがって、Ｌ−乳酸脱水素酵素は、ピルビン酸塩へのＬ−乳酸塩の酸化を触媒すると同時に、ＮＡＤＨ／Ｈ＋へのＮＡＤ＋還元及びその逆反応を触媒する酵素である。
ピルビン酸キナーゼＰＫＬＡ（ピルビン酸キナーゼ低親和性、例えば二量体ＰＫ−Ｍ２）及びＰＫＨＡ（ピルビン酸キナーゼ高親和性、例えば四量体ＰＫ−Ｍ２）は、解糖に関与する酵素である。それらの酵素は、ホスホエノールピルビン酸塩からＡＤＰへのリン酸基の転移を触媒し、それにより、ピルビン酸塩の１つの分子とＡＴＰの１つの分子とがもたらされる。したがって、ＰＫＬＡ活性度は、解糖の嫌気性分岐に関する情報を与える。一方、ＰＫＨＡ活性は、解糖の好気性分岐に関する情報を与える。
ヘキソキナーゼは、ＡＴＰ及びＭｇ２＋イオンの存在下でグルコース−６−リン酸塩へのグルコースのリン酸化反応を触媒する。グルコース−６−リン酸塩の他に、ＡＤＰ及びＨ＋が得られる。
シトクロムｃ酸化酵素（ＣＯＸ）活性度の測定は、酸化的リン酸化、すなわち、ミトコンドリアの酸素消費に関する情報を与える。それは、ミトコンドリア膜における呼吸電子伝達系中の最後の酵素である。シトクロムｃ酸化酵素の酵素活性度の決定のため、還元されたシトクロムｃが酸化される。
また、β酸化、すなわち、脂肪酸の代謝のための指標として、ミトコンドリアアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、例えばパルミトイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（非常に長い長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）を使用できる。β酸化からのエネルギー生成は、クエン酸回路及び／又はミトコンドリア呼吸鎖によって行なわれ、それは、嫌気性エネルギー生成の経路と見なされる。
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの嫌気性酵素の酵素活性度及び少なくとも１つの好気性酵素の酵素活性度が決定されて、これらの酵素活性度が商の形成において考慮に入れられる。したがって、本発明の目的のため、嫌気性エネルギー代謝の酵素としてのリンゴ酸酵素（ＭＥ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ低親和性（ＰＫＬＡ又は二量体ＰＫ−Ｍ２）、ヘキソキナーゼ、及び、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼから選択される酵素のうちの１つ以上の活性度を決定してもよく、また、好気性エネルギー代謝の酵素としてのピルビン酸キナーゼ高親和性（ＰＫＨＡ；四量体ＰＫ−Ｍ２）及びシトクロムｃ酸化酵素（ＣＯＸ）から選択される酵素のうちの１つ以上の活性度を決定してもよい。決定された活性度は、先に規定された商を形成するのに役立つ。
また、本発明の方法で決定される嫌気性酵素及び好気性酵素の数が異なることも想定し得る。
本発明の更なる好ましい実施形態では、比較的容易に検出できる（既知の比較的高い比活性度を伴うことを意味する）酵素、ＰＫＬＡ、ＬＤＨ、及び、ＰＫＨＡの比率が決定される。これらの酵素の決定は、特に、本明細書中に記載される解析方法を使用して、日常の研究室の決まりきった活動において実現可能である。
本発明の更なる好ましい実施形態では、嫌気性及び好気性のエネルギー生成の少なくとも１つの酵素及びリンゴ酸酵素の少なくとも酵素活性度が決定されて、これらの酵素活性度が比率の形成において考慮に入れられる。本発明の更なる好ましい実施形態によれば、考慮に入れられる酵素活性度は、酵素ＭＥ１、ＣＯＸ、ＰＫＨＡ、ＰＫＬＡ、及び、ＬＤＨである。
組織サンプルにおいて決定されるエネルギーの好気性発生に対する嫌気性発生の関係（比率）は、腫瘍の進行の予測を可能にする。特に、組織切片における逓増的な好気性エネルギー代謝は、腫瘍進行とかなり関連がある。
組織サンプル調製のため、柔組織及び／又は結合組織（腫瘍を含む）の生検又は切除は患者で行なわれる。この目的のために、様々な生検技術及び手技を適用できる。これらの技術は、長年にわたって知られて幅広く使用される。本発明の方法のうちの１つにおいて、サンプルは、同じ臓器に属する腫瘍組織及び健康組織から取得され、健康組織は、本発明では、腫瘍遠位組織と称される。これは、腫瘍組織及び健康組織の両方における酵素の酵素活性度を考慮できるため、重要である。つまり、腫瘍遠位組織は、腫瘍の近傍の場所から取得されるが腫瘍の一部ではない組織であり得る。最も好ましくは、腫瘍遠位組織は、腫瘍の由来となる柔組織又は結合組織に属するべきである。
本発明の方法に晒されるサンプル又は生検材料又は細胞塊は新鮮な材料である。新鮮とは、組織材料又は細胞塊が凍結又はホルマリン固定に晒されなかったことを意味する。サンプル又は生検材料は、細胞培地に加えられるとともに、サンプル又は生検材料を薄い組織切片へと処理できる機器へ受け渡される。新鮮に得られた組織から組織切片が取得されることは本発明の方法の本質的特徴である。したがって、当初の腫瘍組織及び組織切片はいずれも、保存されず又は凍結されず、或いは、アガロースのようなゲル化材料を用いて処理されない。
好ましくは、組織切片の厚さは、細胞培地から組織片の内部への栄養素の拡散を可能にするように選択される。組織の更なる厚さは、スライスされた組織の代謝性能を培養中に維持するように選択されるべきである。そのため、組織切片の厚さは、２００μｍ〜４００μｍ、好ましくは２５０μｍ〜３５０μｍ、最も好ましくは約３００μｍであり得る。
新鮮な生検材料の切断のための装置が組織スライサであってもよい。組織切片の調製のための組織スライサは、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｅ Ｖｅｒｔｒｉｅｂ ＧｍｂＨ，３５５７８ Ｗｅｔｚｌａｒから入手できる。例えば、Ｌｅｉｃａ ＶＴ １２００Ｓ ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（登録商標）薄切りブレードは、本発明の方法のために組織切片を得る目的に適している。また、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｅ Ｖｅｒｔｒｉｅｂ ＧｍｂＨから入手できる組織チョッパ及び英国のレイクスのラフバラにあるＣａｍｐｄｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．が提供しているＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパも適している。いわゆる組織チョッパは、組織切片のより迅速な調製を可能にする。
組織切片が細胞培地内で特定の期間にわたって培養されることは本発明の本質的特徴である。この培養は、生検がなされる前に患者に与えられた組織切片中の薬物の分解又は代謝を可能にして、外科医によって或いは患者の身体によって、例えば患者の栄養状態又は投薬、又は持病によって誘発される組織のエネルギー代謝への生検の影響を排除できるようにする。培養中、組織切片は、栄養分、薬物、及び、組織への手術の影響から回復する。組織切片の培養後、組織切片へのそのような影響が除去されるべきである。本発明にしたがった組織切片の培養後、栄養分、投薬又は手術の影響は、組織切片のエネルギー代謝における鍵酵素の酵素活性度に何ら影響を及ぼさない。これは、本発明にしたがった酵素活性度の決定のために達せられるべき状態である。このため、培養が行なわれ、また、培養は、本発明のプロセスにおいて欠くことができないステップと見なされる
当業者であれば分かるように、培養期間の継続時間は、生検／手術の前に患者に投与された薬剤の種類及び投与量に基づいて、及び、生検又は手術の影響の種類に基づいて変化し得るが、明確な期間に対する標準化がもっともらしく思われる。
したがって、この期間の最小の持続時間は、エネルギー代謝プロファイルの酵素への基質及び薬物の影響を本質的に排除できる組織の状態に達するのに必要な程度の長さでなければならない。したがって、培養期間は例えば１６〜２８時間となり得る。好ましくは、本発明の目的のために２４時間の培養期間を選択できる。本発明は、２４時間の培養期間を提案する。十中八九、その培養時間後に、組織切片中の酵素活性度への栄養分、薬物、及び、手術の影響を安全に無視できる。
サンプル又は生検材料及び組織切片の培養には、通常、細胞培地が適している。そのような細胞培地は市販されている。細胞培地ＲＰＭＩ１６４０は、サンプル又は生検材料の保管及び輸送のため及び組織切片の培養のために使用され得る媒体である。サンプルの代謝状態を標準化するための組織サンプルの培養は、本発明の方法の重要な特徴である。
培養のため、サンプルは通常の雰囲気下に維持される。本発明の代替方法にしたがって組織切片が参照目的のために嫌気状態下又は酸素欠乏状態下で培養されるべき場合には、組織サンプルを窒素又は二酸化炭素又は酸素を欠く雰囲気下に維持できる。酸素を伴わない或いは酸素を実質的に伴わない二酸化炭素雰囲気又は窒素雰囲気が好ましい。特に好ましいものは二酸化炭素である。
細胞培地内での培養後、組織切片が細胞ホモジネートへと処理された後、細胞ホモジネートがサイトゾルと細胞内成分とに分画される。細胞ホモジネートの調製は、穏やかな細胞破壊に適した装置を伴う壊変緩衝液内で行なわれる。このため、組織及び細胞の均質化のためのポッター組織グラインダを使用できる。ミトコンドリア膜ではなく細胞壁を破壊して開放することが重要である。そのような装置は、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，１２３５−１２４６ （２０１２）に記載されており、例えばドイツのＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧから入手できる。例えば、腫瘍組織の組織切片は、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ均質化器を用いて破壊され得る。適した壊変緩衝液は、例えば、ミトコンドリアの完全性を損なわない１２個の押し潰しによる、２５０ｍＭのサッカロースと、５０ｍＭのＫＣｌと、５ｍＭのＭｇＣｌ２と、２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌと、ｐＨ７．４の水とから成るいわゆる緩衝液Ａである。ミトコンドリア及びサイトゾルは分画遠心法によって蓄積され得る（６００ｇ ５分、浮遊物１０，０００ｇ、１０分、ペレットがミトコンドリア分画であり、浮遊物が細胞質分画である）。サンプルの量が限られる場合には、酵素活性度の測定のために組織又は細胞ホモジネートを使用できる。これらのホモジネートは、機械的（すなわち、ポッター組織グラインダ又は超音波処理）又は化学的（すなわち、洗浄剤）な細胞破壊によって得ることができる。
酵素活性度は、前述の反応に基づく既知のうまく説明された反応によって測定され得る。そのような反応は以前に教科書に記載されてしまっている。その後、エネルギー代謝の一群の鍵酵素の酵素活性度の決定のための試薬の想定し得る濃度が示唆される。
Figure 2016523097
複合体ＩＶの決定は、５４０−５５０ｎｍで２５℃、９６ウェルプレートにおいて１０分間にわたって行なわれ、残りの酵素の決定は、３４０〜４００ｎｍ、光度計型ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＰＬＵＳ ３８４分子装置で９６ウェルプレートにおいて３７℃で３０分間（同時）にわたって行なわれる。
複合体ＩＶの決定のため、還元状態の活性シトクロムｃが酸化される。前述の酸化反応のための基質として還元されたシトクロムｃを与えるべく、亜ジチオン酸ナトリウム溶液を用いてシクロトムｃが処理される。例えば、０．３ｍＬの１Ｍの亜ジチオン酸ナトリウム溶液を用いて２．７ｍＬのシクロトムｃ（酸化された）ストック溶液を処理できる。このストック溶液は、窒素雰囲気下に維持される２０ｍＭのリン酸塩緩衝液内に保管され得る。ストック溶液の精製のために、Ｅｃｏｎｏ（登録商標）−Ｐｃ １０ＤＧカラムを使用できる。
本発明の特定の好ましい実施形態では、酵素活性のために必要とされる試薬が固形物としてウェルプレートの底部及び／又は壁に堆積される。そのように処理されるウェルプレートは、サンプル緩衝液内のサンプルの付加と、プレートのウェル内のサンプルの異なる酵素の活性度の光度測定とを可能にする。
固体試薬がウェルの壁及び／又は底部に堆積されたウェルプレートは、例えば、酵素活性度の決定のために必要な試薬を伴う適切な濃度の特定量の緩衝溶液を用いてウェルプレートのウェルを処理することによって得ることができる。真空下で、そのように処理されたウェルを低温で乾燥させて、緩衝溶液の水を蒸発させることができる。特異的酵素の酵素活性度の決定のための乾燥された試薬が、ウェルの底部及び壁に付着する。
本発明の方法における次のステップは、腫瘍組織サンプル及び腫瘍遠位組織サンプルにおける或いは酸素正常状態の腫瘍組織（細胞塊）及び酸素欠乏状態の腫瘍組織（細胞塊）における特異的酵素活性度の商を生成することである。
例えば、嫌気性酵素としての酵素ＭＥ１、ＬＤＨ、ＰＫＬＡ及び好気性酵素ＰＫＨＡ、ＣＯＸの酵素活性度を考慮する場合には、一人の患者の腫瘍組織及び腫瘍遠位組織のそれぞれにおいて、最初に、測定された酵素活性度の商ＭＥ１／ＭＥ１、ＬＤＨ／ＬＤＨ、ＰＫＬＡ／ＰＫＬＡ、ＰＫＨＡ／ＰＫＨＡ、及び、ＣＯＸ／ＣＯＸを形成し、次のステップとして、それらの商を以下の方程式に示されるような互いに対する関係（比率）の状態におく。
ＭＥ１＋ＬＤＨ＋ＰＫＬＡ
ＣＯＸ＋ＰＫＨＡ
この方程式から得られる値は、患者における転移の形成を示す。非常に高い値及び非常に低い値はいずれも悪い予後を反映し、一方、中間値は良好な予後を反映する。
或いは、前述の商の生成のために腫瘍遠位組織が利用できない場合には、酸素正常状態下の比酵素活性度が最大嫌気性状態下の比酵素活性度と比較されてパーセンテージ値として表される。そのため、最大嫌気性状態下の腫瘍組織サンプルにおける比酵素活性度が１００％と見なされる。１００％値に基づいて、腫瘍組織サンプルにおける嫌気性状態（通常の酸素含有量）を調整することなく培養後に得られる比酵素活性度のパーセンテージ値が計算される。そのため、この代替方法でも、商は、酸素存在下の及び酸素を伴わない酵素活性度測定から形成される。商は、先に示される方程式に含められる。結果として生じる値（比率）は、患者における転移、再発、又は、局所的な再発の形成の可能性の予測を含む予後を示す。
患者の病理学的状況の評価のためには、カットオフ値が有利となり得る。いわゆるカットオフ値は、本発明の方法の商または結果を考慮した大きな患者集団（５００人以上の患者）の統計的解析から得られる。
以下、本明細書中に開示される図及び表に基づいて本発明を更に説明する。表中、Ｎ状態は、リンパ節転移及び／又は遠隔転移を伴う（Ｎ≧１）及び転移を伴わない（Ｎ０）患者を意味する。
表１において与えられるデータに関して、細胞における全ての本質的なエネルギー代謝の鍵酵素の比酵素活性度が測定された。ＭＥ１−活性度は、グルタミノリシスに関するデータを与える。ＬＤＨに関して、嫌気性解糖及び嫌気性グルタミノリシスにおける最後の反応ステップの活性データが与えられる。ＰＫＬＡ活性度は、解糖の嫌気性分岐に関する情報を与える。ＰＫＨＡ活性度は、解糖の好気性分岐に関するデータを与え、また、ＣＯＸ活性度は、酸化的リン酸化反応に関するデータ（ミトコンドリアの酸素消費量）を与える。
表１は、好気性酵素（ＰＫＨＡ、ＣＯＸ）に対する嫌気性酵素（ＭＥ１、ＬＤＨ、ＰＫＬＡ）の全ての想定し得る組み合わせ比率の測定データを示す。Ｎ状態≧１を伴う結腸癌患者における好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率は、絶対差（ｄｉｆｆ）又は相対差（比率）のｔ−検定値により示されるようにかなり増大される（＃１５、＃１７〜１８、＃２０、及び、＃２６）。これはもっともらしく思われる。
リスク評価は、測定された値に基づいて及び商を用いて既に計算された有意性レベルに基づいて可能であり、例えば、この場合、測定された嫌気性エネルギー代謝及び好気性エネルギー代謝の少なくとも１つの酵素及びＭＥ１酵素が含まれる（＃２０及び＃２６）。
要約すると、組織切片における漸増的な嫌気性エネルギー利得は、腫瘍進行とかなり相関するが、（同じ患者の）冷凍生検におけるエネルギー代謝は、仮に可能であるとしても、腫瘍組織と非腫瘍組織との間を区別することしかできない、と結論つけることができる。また、冷凍生検から得られる値は、腫瘍生物学の一般的な知識に基づいて想定し得ない、腫瘍進行の高まりに伴う嫌気性（＃６、＃８−９、＃１１〜１２、＃１４〜１５、＃１７〜１８、＃２０〜２１、＃２３〜２４、及び、＃２６）エネルギー利得又は好気性（＃４、＃５）エネルギー利得の減少を示す。冷凍組織切片における測定値がそのエネルギープロファイルに基づいてＮ０状態と≧Ｎ１状態との間をこのように区別できない理由は、測定方法における標準化の欠如であり得る。
本発明によれば、組織切片は、厳格に標準化された状態（３００μｍの拡散活性カット圧、ＲＰＭＩ媒体、３７℃、５％ＣＯ２、２４時間培養時間）下で代謝し、一方、酵素活性度の測定の直前に冷凍生検から取得されたサンプルは、ひどく異なる個々の基質オファー、並びに、食習慣、持病、季節、年齢、性別、及び、それぞれの患者の身体内のホルモン状態などの様々な更なる非常に変わりやすい影響に見舞われる可能性がある。測定値は、標準化されたサンプル処理・測定プロセスのみが腫瘍の知識に基づいて生物学的に道理にかなう癌腫の進行リスクの有意な予後を可能にすることを示す。
表１では、以下の略語、すなわち、Ｎ＝ＷＨＯのＴＮＭ分類（第７版）にしたがった局所的なリンパ節状態、ｍｅａｎ＝平均値、ＳＤ＝標準偏差、ｎ＝患者数が使用され、ｐ値（確率）＜０．０５が統計学的に有意であると見なされた（ソフトウェア：Ｅｘｃｅｌ（登録商標）で使用される、対応のあるｔ−検定、両側検定、タイプ２）。ＭＥ１：リンゴ酸酵素１、ＬＤＨ：乳酸脱水素酵素、ＰＫＬＡ：ピルビン酸キナーゼ低親和性（ＰＫ−Ｍ２のリン酸化二量体）、ＰＫＨＡ：ピルビン酸キナーゼ高親和性（ＰＫ−Ｍ２の非リン酸化四量体）、ＣＯＸ：シトクロムｃ酸化酵素。
表１では、全ての酵素活性度が腫瘍及び腫瘍遠位結腸組織のそれぞれの酵素活性度の比率として与えられる。これは、個々の患者の代謝における潜在的な差を考慮するのに役立つとともに、一般的により低い比活性度を有する酵素の統計的影響を考慮するのに役立つ。
図１は、表１のサンプル＃２６の値のグラフ表示を示す。これらは、患者の腫瘍組織及び腫瘍遠位組織から得られる商、及び、好気性及び嫌気性のエネルギー代謝の酵素の酵素活性度である。１つのグループでは、２４時間の培養後に本発明の方法にしたがって酵素活性度データが組織切片から得られる。他のグループでは、酵素活性度が同じ方法で測定されるが、組織切片は、２４時間培養を伴わない冷凍生検組織である。図１は、結腸癌患者においてＮ０（リンパ節転移がない）状態と≧Ｎ１（リンパ節転移が存在する）状態との間を区別する目的で本発明にしたがって得られるデータが冷凍生検から得られるデータよりも優れていることを示す。リンパ節転移を伴う腫瘍では、エネルギー利得が益々嫌気性である。しかしながら、これは、本発明のプロセスにしたがって調整される新鮮な組織サンプルのｐ値と比べて高いｐ値に起因して、図１の冷凍生検組織サンプルにおける嫌気性／好気性エネルギー代謝の比率では達成されない。
図２は、表１の比率＃２６を使用する結腸癌を患う１１人の患者及び慢性リンパ球性白血病を患う７人の患者の基準として正常な組織を伴わない嫌気性及び好気性のエネルギー代謝の個々の商のグラフ表示を示す。示される酵素の酵素活性度（ｍＵ／ｍｇタンパク質）は、通常の酸素含有量状態下及び酸素欠乏状態下で測定された。酸素欠乏状態は、２４時間の期間にわたってＣＯ２含有バッグ内で組織サンプルを培養することによってもたらされた。嫌気性組織サンプルにおいて及び通常の酸素含有量の存在下で培養された組織サンプルにおいて測定された酵素活性度からの個々の商が形成された。グラフ表示は、酸素欠乏状態下で得られる値の割合（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）としての通常の酸素含有量下での測定値を示す。結腸直腸癌患者（リンパ節転移を伴わない及び遠隔転移を伴わない）における平均値は、０．７７±０．３６（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）に達し、また、結腸直腸癌患者（リンパ節転移及び／又は遠隔転移を伴う）の平均値は、組織サンプルの酸素欠乏状態下で得られる最大個体基準値の１．５７±０．５４（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）に達する（図２Ａ、ｎ＝１１、ｐ＝０．０４；Ｔ−検定、両側検定、タイプ２、ソフトウェア：Ｅｘｃｅｌ（登録商標））。図２Ｂは、結腸直腸癌における個々の患者スコアの分布を示す（ｎ＝１１）。
慢性リンパ球性白血病患者（高い危険因子を伴わない：不活性化ＴＰ５３変異及び／又はｄｅｌ（１７ｐ）及び／又は現在の標準的な治療では効果がない及び／又は短い寛解（＜２年））における平均値は、１．４９±０．１６（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）に達し、また、慢性リンパ球性白血病患者（高い危険因子を伴う：不活性化ＴＰ５３変異及び／又はｄｅｌ（１７ｐ）及び／又は現在の標準的な治療では効果がない及び／又は短い寛解（＜２年））における平均値は、組織サンプルの酸素欠乏状態下で得られる最大個体基準値の２．２８±０．３３（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）に達する（図２Ｃ、ｎ＝７、ｐ＝０．００６；Ｔ−検定、両側検定、タイプ２、ソフトウェア：Ｅｘｃｅｌ（登録商標））。図２Ｄは、慢性リンパ球性白血病における個々の患者スコアの分布を示す（ｎ＝７）。
そのため、この方法は、対応する正常組織が基準サンプルとして存在しない場合には本発明の目的に適している。
以下、本発明及び患者に対する本発明の適用を以下の例で更に説明する。言うまでもなく、これらの例は、単なる例示目的のためであり、いかなる方法によってもこの発明を限定するように解釈されるべきでない。
治癒的結腸癌切除後における危険因子を伴わないＵＩＣＣステージＩＩの結腸癌患者（患者Ａ）のための該患者の代謝エネルギープロファイルに基づく治療勧告
Ｓ３ガイドライン”Ｋｏｌｏｒｅｋｔａｌｅｓ Ｋａｒｚｉｎｏｍ” ２００４／２００８（証拠に基づくコンセンサス会議０６．／０７．０２．２００４ 及び ０８．／０９．０６．２００７，“Ｓ３ ガイドライン “結腸直腸癌” ２００４／２００８の結果）によれば、ステージＩＩの結腸直腸癌が治癒的に切除された患者に関して補助化学療法を行なうことができる（勧告度０、証拠１ｂ、強いコンセンサス）。しかしながら、現在では、このステージでの補助（術後）化学療法の強制的使用が現在の無作為研究から導かれることができない。したがって、この場合、勧告は、治療が少なくとも考慮に入れられるべきであり、治療が個人的に議論されるべきであるというものである。このことは、治療オプションをとにかく選択すべきかどうか及び選択する場合にはいずれの治療オプションが選択されるべきか、またそのような患者のための予後がどのようなものとなり得るかを医療従事者がこれまでのところ確信していないことを意味する。ＵＩＣＣステージＩＩにおける危険因子として、Ｔ４ステージ、腫瘍穿孔又は腫瘍裂傷、緊急状態下での外科手術、及び、非常に限られた数の検査済みリンパ節が規定される。患者Ａは、ＴＮＭ分類ｐＴ３、ｐＮ０（０／３１）、Ｇ２、Ｒ０を用いてエンコードされ、また、Ｓ３ガイドラインによれば、そのような患者は危険状況にない。
そのような患者の結腸癌組織及び腫瘍遠位結腸組織が本発明の方法に晒され、また、以下の酵素活性度が決定された（酸素正常状態下で測定が行なわれた）。すなわち、腫瘍遠位結腸組織：ＣＯＸ＝３．５５ｍＵ／ｍｇ、ＬＤＨ＝２４５ｍＵ／ｍｇ、ＭＥ１＝０．８４ｍＵ／ｍｇ、ＰＫＬＡ＝２２６ｍＵ／ｍｇ、ＰＫＨＡ＝４３ｍＵ／ｍｇ；結腸癌組織：ＣＯＸ＝０．９３ｍＵ／ｍｇ、ＬＤＨ＝２２０ｍＵ／ｍｇ、ＭＥ１：１．２ｍＵ／ｍｇ、ＰＫＬＡ＝２１１ｍＵ／ｍｇ、ＰＫＨＡ＝２９ｍＵ／ｍｇ；商（ＭＥ１＋ＬＤＨ＋ＰＫＬＡ）／（ＣＯＸ＋ＰＫＨＡ）＝３．５０。
本発明の代替方法にしたがった酵素活性度の並列決定により、結腸癌組織において酸素欠乏状態下で以下の値が得られた。すなわち、ＣＯＸ＝２．２９ｍＵ／ｍｇ、ＬＤＨ＝５６５ｍＵ／ｍｇ、ＭＥ１＝２．７４ｍＵ／ｍｇ、ＰＫＬＡ＝５２８ｍＵ／ｍｇ、ＰＫＨＡ＝１０９ｍＵ／ｍｇ、比率（ＭＥ１＋ＬＤＨ＋ＰＫＬＡ）／（ＣＯＸ＋ＰＫＨＡ）は１．８３である。
したがって、好気性エネルギー代謝に対する嫌気性エネルギー代謝の腫瘍遠位結腸に基づく比率は３．５０である。商の決定のためにこの例の選択された酵素組み合わせを考慮に入れると、１．５０の値は、嫌気性エネルギー代謝と好気性エネルギー代謝との間の等しい釣り合いに対応する（分子＝１．０＋１．０＋１．０；分母＝１．０＋１．０；商は１．５である）。患者の正常組織に基づき、好気性エネルギー代謝に対する嫌気性エネルギー代謝の比率は、患者Ａの腫瘍組織において２．３倍を超えて高い。患者の酸素欠乏状態で処理された腫瘍組織に基づき、患者Ａの好気性エネルギー代謝に対する嫌気性エネルギー代謝の比率は１．２倍を超えて高い。腫瘍遠位正常組織を用いて行なわれた方法における３．０のカットオフ値（値≧ ３．０は更に悪い予後に関連付けられる）と、酸素欠乏状態で処理された腫瘍組織を用いる方法における１．０のカットオフ値（値≧１．０は更に悪い予後に関連付けられる）とを考慮に入れる場合、患者Ａにおける本発明の両方の方法の結果は、更に悪い予後と関連付けられる。
本発明に基づき、患者Ａのための治療勧告は、結果として、化学療法を含む補助オキサリプラチンの適用である。この治療は、ＵＩＣＣステージＩＩＩ患者にとって義務的である。現在有効なガイドラインによれば、ＵＩＣＣステージＩＩＩ患者は、正式には、患者Ａの評価と比べて更に悪い予後を有する。そのため、本発明の方法の結果に基づき、患者Ａのための治療は、ＵＩＣＣステージＩＩＩ患者のための化学療法プロトコルＳ３ガイドラインに従うべきである。これは、リンパ節が手術時に転移しないという事実にもかかわらず、また、ガイドラインによればこの患者の危険因子が低いという事実にもかかわらず、実際にはこの患者が最終的に致命的な経過を伴う転移又は再発を予期しなければならないからである。
両方のカットオフ値は、一例として選択されるが、現実的である。
症候性ＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）患者（患者Ｂ）のための該患者の代謝腫瘍エネルギープロファイルに基づく予後及び治療勧告
患者Ｂは、最初、１９９４年に症候性ＣＬＬを伴うと診断された。そのとき以来から、患者は症状を何ら示さなかった。そのときのガイドライン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｇｈｏ−ｏｎｋｏｐｅｄｉａ．ｄｅ／ｄｅ／ｏｎｋｏｐｅｄｉａ／ｌｅｉｔｌｉｎｉｅｎ／ｃｌｌ）にしたがって、症状が生じない限り、治療の代わりに、注意深い振る舞いが選択された（“ｗ＆ｗ”，“ｗａｉｔ ａｎｄ ｗａｔｃｈ”）。それ以来、１７ｐ１３の欠失のための分子細胞遺伝学的ＦＩＳＨ（蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）に基づく欠失解析及びＴＰ５３変異分析は否定的であった。１７ｐ１３欠失及びＴＰ５３不活性化変異を伴う患者は、ＣＬＬガイドラインにしたがって、低い応答速度と、より短い進行無病生存期間及び全生存期間とを示す。２０１０年に、患者は、稀なクローンＴＰ５３変異を（腫瘍細胞の２．５１％において）伴うと診断されたが、依然として症状を示さなかった。試験のための患者Ｂの組織サンプル材料の転移時に、患者は、臨床的に症状を示すようになった。
この場合には、この腫瘍が対応する正常細胞を得ることができるようにしないため、酸素欠乏状態下で付加的な酵素活性度測定を伴う本発明の代替方法が行なわれた。２×１０７個の腫瘍細胞が、血液サンプルからのＦｉｃｏｌｌ（登録商標）階調度を用いる標準的な手順にしたがって精製されるとともに、ＲＰＭＩ−１６４０細胞培地に試験のために与えられた。平行して、患者Ｂのサンプル材料を用いて、染色体異常解析、欠失解析、及び、遺伝子突然変異解析が病院で行なわれた。本発明の前述した代替方法にしたがって、以下の酵素活性度が白血病腫瘍細胞塊において決定された（正常酸素含有量下及び酸素欠乏状態下での酵素活性度が括弧内に示される）：ＣＯＸ＝０．８６（０．７１）ｍＵ／ｍｇ，ＬＤＨ＝８９（８２）ｍＵ／ｍｇ，ＭＥ１＝０．１９（０．０７）ｍＵ／ｍｇ，ＰＫＬＡ＝１５９（１３２）ｍＵ／ｍｇ，ＰＫＨＡ＝１３（１６）ｍＵ／ｍｇ；ｒａｔｉｏ（ＭＥ１＋ＬＤＨ＋ＰＫＬＡ）／（ＣＯＸ＋ＰＫＨＡ）＝２．５１。
この解析に基づき、また、腫瘍を考慮すると、例示的であるが現実的なカットオフ値は２．０である。このことは、２．０よりも大きい値が更に悪い予後と関連付けられることを意味し、その結果、患者Ｂにおける予後（商２．５１）はかなり悪い。
一方、現在のＣＬＬガイドラインは、臨床的にフィット（“ｇｏ ｇｏ”）と見なされる患者Ｂのために、染色体解析の結果に依存している２つの治療オプションを考慮する。患者Ｂが染色体１７の欠失（ｄｅｌ（１７ｐ））を有さない場合、いわゆるＦＣＲスキームが治療のために選択されなければならない（フルラダビン、シクロホスファミド、リツキシマブ）。ｄｅｌ（１７ｐ）に関しては、ＣＬＬガイドラインにしたがった別の治療が選択されなければならない。この場合、ＣＬＬガイドラインは、同種血液幹細胞移植をその後に伴うアレムツズマブの投与を推奨した。これは、この治療がより長い無病生存期間を可能にする場合があるからである。不活性ＴＰ５３変異は、多くの場合、ｄｅｌ（１７ｐ）に伴って起こるが、ｄｅｌ（１７ｐ）を伴わない不活性ＴＰ５３変異はめったにない。それにもかかわらず、不活性ＴＰ５３変異は、それ自体、いわゆるＦＣＲスキームに合わせて非常に悪い予後及びより低い応答速度と関連付けられる。しかしながら、ＣＬＬガイドラインは、ＴＰ５３変異されたＣＬＬ−患者にとって好ましい治療に関する明確な勧告を与えない。
本発明の方法に基づいて、患者Ｂのための勧告は、同種血液幹細胞移植の確立をその後に伴うアレムツズマブの投与である。この勧告は、欠損ｄｅｌ（１７ｐ）にもかかわらず有効である。間近のケースにおいて、ガイドラインは、ＦＣＲスキームとは異なる治療スキームで更に有利な病気進行と更に良い応答とを提案する。その間に、患者Ｂのための臨床的診断は、ＴＰ５３−突然変異白血病細胞のクローン性増殖が生じたことを明らかにした。最後に、本発明の方法に基づく治療勧告は、ＣＬＬガイドラインに従った。このケースは、本発明の方法を使用することによりたった２４時間で治療を勧告してガイドラインに対応する予後を与えることができたことを示す。逆に、患者Ｂを用いて行なわれるような染色体診断及び突然変異解析（通常は臨床試験）は、２週間かかり、非常にコスト集約的である。したがって、特許請求の範囲に記載される方法は、非常に安価であり、より迅速である。
７人のＣＬＬ患者の小集団では、かなり悪い予後を有する二人の患者（患者Ｂ及び患者Ｃ）を１００％の精度で特定することができた。患者Ｃは治療に応じず、また、患者Ｃは、ＣＬＬガイドラインにしたがって、１〜２年の統計的生存時間を有する。酸素正常状態下で及び酸素欠乏状態下で測定される酵素活性度に基づく本発明の方法を用いると、以下の値（酸素欠乏症に関する値が括弧に示される）が得られた：ＣＯＸ＝１．１６（１．３８）ｍＵ／ｍｇ，ＬＤＨ＝１２５（１２６）ｍＵ／ｍｇ，ＭＥ１＝０．２５（０．２３）ｍＵ／ｍｇ，ＰＫＬＡ＝１０８（１０６）ｍＵ／ｍｇ，ＰＫＨＡ＝１２（１８）ｍＵ／ｍｇ；ｒａｔｉｏ（ＭＥ１＋ＬＤＨ＋ＰＫＬＡ）／（ＣＯＸ＋ＰＫＨＡ）＝２．０４。
この解析に基づき、また、この患者における例示的な選択された現実的な２．０（値＞２．０は更に悪い予後と関連付けられる）のカットオフ値を考慮すると、患者Ｃにおける予後はかなり悪い。
７人の検査されたＣＬＬ患者において、検証可能な良好な予後を伴う患者のための商の平均値は、１．４９±０．１６であった。検証可能なかなり悪い予後を伴う患者（ＴＰ５３変異又は治療に応じない）において、商の中央値は２．２８±０．３３であった。中央値の違いにおける統計的な差異は、ｐ＝０．００６を伴って非常に大きかった（ｐ＜０．０５、両側検定、タイプ２、ソフトウェア：Ｅｘｃｅｌ（登録商標））。患者Ｄには、特筆すべき低い個々の商が嫌気性から好気性まで存在する。したがって、値は、１．２４であり、すなわち、２．０を明らかに下回った。症状を示す患者Ｄのための治療勧告はＦＣＲ治療スキームであり、該患者の病気の経過はかなり有利である。測定と相関するものとして、本発明の方法によれば、理想的に臨床的な染色体解析及び突然変異解析が変化を示さないことを予期できる。実際に、臨床解析は、検査されたＣＬＬ患者のうち患者Ｄだけがｄｅｌ（１７ｐ）の存在もＴＰ５３変異の存在も示さないだけでなく、染色体異常も全く示さないことを確認した。ＣＬＬガイドラインによれば、患者Ｄに関してはかなり有利な発病機序を期待できる。
Figure 2016523097

Claims (10)

  1. 転移、再発の発現、及び／又は、局所的な再発の形成の可能性を含めて腫瘍予後を予測するとともに治療勧告を与えるための診断方法であって、
    （ａ）患者の新鮮な腫瘍サンプル材料と患者からの新鮮な比較サンプル材料とを培地内で培養して、前記サンプル材料中の栄養分、薬物、及び、エネルギー代謝への生検の影響を排除できるようにするステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の前記サンプル材料から細胞ホモジネート及び細胞亜分画を調製するステップと、
    （ｃ）細胞ホモジネート又は細胞亜分画のエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、前記サンプル材料及び前記比較サンプル材料において決定された酵素の酵素活性度の商を決定するステップと、
    （ｄ）前記サンプル材料及び前記比較サンプル材料においてステップ（ｃ）で決定された前記商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率或いはその逆の比率を計算するステップと
    を備え、
    患者の前記サンプル材料は、組織切片、腫瘍細胞塊、及び、分離細胞から選択され、前記比較サンプル材料は、腫瘍遠位組織切片から選択され、又は、嫌気性エネルギー代謝を上方調節する状態下でステップ（ａ）において培養されるとともに腫瘍組織切片、腫瘍細胞塊、及び、分離細胞から選択される材料から選択される、前記診断方法。
  2. （ａ）患者の腫瘍組織及び腫瘍遠位組織の生検材料から取得された組織切片を培地内で培養して、前記組織切片の栄養分、薬物、及び、エネルギー代謝への生検の影響を排除できるようにするステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の前記組織切片から細胞ホモジネート及び細胞亜分画を調製するステップと、
    （ｃ）腫瘍組織及び腫瘍遠位組織における細胞ホモジネート又は細胞亜分画のエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、腫瘍組織及び腫瘍遠位組織において決定された酵素の酵素活性度の商を決定するステップと、
    （ｄ）腫瘍組織及び腫瘍遠位組織においてステップ（ｃ）で決定された前記商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率或いはその逆の比率を計算するステップと
    を備える請求項１に記載の診断方法。
  3. （ａ）患者の腫瘍組織の生検材料から取得された組織切片を細胞培地内で培養して、前記組織切片の薬物、栄養分、及び、エネルギー代謝への生検の影響を排除できるようにするステップと、
    （ｂ）前記組織切片における嫌気性エネルギー代謝を上方調節する状態下で同じ生検材料からの第２の組織切片を培養するステップと、
    （ｃ）ステップ（ａ）の前記組織切片から細胞ホモジネート及び細胞亜分画を調製するステップと、
    （ｄ）腫瘍組織における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍組織サンプルにおける細胞ホモジネート又は細胞亜分画のエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、腫瘍組織における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う前記腫瘍組織サンプルにおける酵素の酵素活性度の商を形成するステップと、
    （ｅ）腫瘍組織における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う前記腫瘍組織サンプルにおけるステップ（ｃ）で決定された前記商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率或いはその逆の比率を計算するステップと
    を備える請求項１に記載の診断方法。
  4. （ａ）患者から取得された腫瘍細胞塊の一部を細胞培地内で培養して、薬物、栄養分、及び、エネルギー代謝への生検の影響を排除できるようにするステップと、
    （ｂ）嫌気性エネルギー代謝を上方調節する状態下で患者から取得された同じ腫瘍細胞の他の部分を培養するステップと、
    （ｃ）ステップ（ａ）の腫瘍細胞塊から細胞ホモジネート及び細胞亜分画を調製するステップと、
    （ｄ）腫瘍細胞塊における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍細胞塊における細胞亜分画又は細胞ホモジネートのエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、腫瘍細胞塊における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍細胞塊における酵素の酵素活性度の商を決定するステップと、
    （ｅ）ステップ（ａ）の腫瘍細胞塊における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う腫瘍細胞塊におけるステップ（ｃ）で決定された前記商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率又はその逆の比率を計算するステップと、
    を備える請求項１に記載の診断方法。
  5. （ａ）患者から取得される固体又は液体の腫瘍サンプルから細胞を分離して、分離細胞の数を推定するとともに、これらの細胞を希釈して、これらの細胞を細胞培地内で培養することにより、薬物、栄養分、及び、エネルギー代謝への生検の影響の排除を可能にするとともに、細胞の増殖を可能にするステップと、
    （ｂ）嫌気性エネルギー代謝を上方調節する状態下で（ａ）に記載されるように分離されて処理された同じ量の細胞を培養するステップと、
    （ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）の分離細胞から細胞亜分画及び細胞ホモジネートを調製するステップと、
    （ｄ）分離細胞における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う分離細胞における細胞亜分画又は細胞ホモジネートのエネルギー代謝の少なくとも１つの嫌気性鍵酵素及び少なくとも１つの好気性鍵酵素の酵素活性度を決定するとともに、（ａ）の分離細胞における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う分離細胞における酵素の酵素活性度の商を決定するステップと、
    （ｅ）ステップ（ａ）の分離細胞における及び上方調節された嫌気性エネルギー代謝を伴う分離細胞におけるステップ（ｄ）で決定された前記商に基づいて好気性エネルギー利得に対する嫌気性エネルギー利得の比率又はその逆の比率を計算するステップと、
    を備える請求項１に記載の診断方法。
  6. 細胞のエネルギー代謝の鍵酵素の少なくとも１つの嫌気性酵素及び少なくとも１つの好気性酵素が選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の診断方法。
  7. 細胞のエネルギー代謝の鍵酵素は、リンゴ酸酵素（ＭＥ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ低親和性（ＰＫＬＡ又は二量体ＰＫ−Ｍ２）、ヘキソキナーゼ、及び、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上から、及び、ピルビン酸キナーゼ高親和性（ＰＫＨＡ；四量体ＰＫ−Ｍ２）及びシトクロムｃ酸化酵素（ＣＯＸ）から選択される酵素のうちの１つ以上から選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断方法。
  8. 酵素活性度の決定のための試薬がウェルプレートのウェルの壁に事前に配置される請求項１〜７のいずれか一項に記載の診断方法。
  9. （ｉ）新鮮な腫瘍組織において及び比較のために新鮮な腫瘍遠位組織において決定される、又は、（ｉｉ）腫瘍組織或いは腫瘍細胞において及び比較のために請求項１〜８に記載の方法により決定される酸素欠乏状態下において決定される、エネルギー代謝の鍵酵素の少なくとも１つの嫌気性酵素及び少なくとも１つの好気性酵素の酵素活性度の商の、転移、再発の発現、及び／又は、局所的な再発の形成の可能性を含めた腫瘍予後の予測のための指標又は生物指標としての使用。
  10. １つ以上の酵素は、嫌気性酵素として、リンゴ酸酵素（ＭＥ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ低親和性（ＰＫＬＡ又は二量体ＰＫ−Ｍ２）、ヘキソキナーゼ、及び、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのグループから選択されるとともに、好気性酵素として、ピルビン酸キナーゼ高親和性（ＰＫＨＡ；四量体ＰＫ−Ｍ２）及びシトクロムｃ酸化酵素（ＣＯＸ）から選択されるグループのうちの１つ以上から選択される請求項９に記載の使用。
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