JP2016523077A

JP2016523077A - シグナルペプチドを含まない天然で分泌性のポリペプチドの発現

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Publication number: JP2016523077A
Application number: JP2016520461A
Authority: JP
Inventors: スィモンボーカートマーティン
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2016-08-08
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: US20160130626A1; EP3013962A1; CN105339499A; JP6606068B2; DK3013962T3; US9926584B2; WO2014206829A1; EP3013962B1

Abstract

本発明は、翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする外性ポリヌクレオチドを含む微生物宿主細胞を提供するステップ；ポリペプチドの発現を促進する条件下で微生物宿主細胞を培養するステップ、および任意選択的に、そのポリペプチドを回収するステップを含む、天然では分泌性のポリペプチドを組み換え産生させる方法、ならびに微生物、ある種のポリヌクレオチド、発現コンストラクトおよびプロテアーゼ置換変異体に関する。

Description

配列表に対する参照
本願は、コンピュータ可読形態の配列表を含有する。コンピュータ可読形態は、参照により本明細書中に組み込まれる。

ＰｆｕＳと呼ばれる耐熱性の分泌性プロテアーゼは、ピュロコックス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）から単離され、以前は分泌シグナルを含む発現ＤＮＡコンストラクトを用いて生成されてきたが、ＰｆｕＳプロテアーゼの収率はかなり低かった（欧州特許出願公開第０９９４１９１Ａ１号明細書；宝酒造、日本）。ピュロコックス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）からの耐熱性ＰｆｕＳプロテアーゼの発現収率を向上させて、酵素を工業的に使用させるために、十分な量を許容可能な生産費用で産生できるようにすることは興味深い。

ＸｙｎＢと呼ばれる耐熱性の分泌性キシラナーゼは、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）から同定され、クローン化され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてこの酵素が組み換え産生された。ＸｙｎＢの成熟Ｎ末端は、ＳｉｇｎａｌＰシグナルペプチド分析ソフトウェアにより予測されるように２３アミノ酸リーダーペプチドの下流に位置し、他の細菌ファミリーの１１種類のキシラナーゼを用いて行った多重配列分析の結果により裏付けられた。ＸｙｎＢリーダーペプチドにより、この酵素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にとって毒性となった。ＸｙｎＢ酵素を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてリーダーペプチドなしで発現させ、細胞溶解によって回収した（ＭｏｒｒｉｓＤＤｅｔａｌ．，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（５）：１７５９−６５）。ＸｙｎＢ酵素も古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主においてそのネイティブ分泌シグナルを用いて組み換え発現させたが、収率はごく僅かであった（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ；ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）１６０：１４８４−１４９５）。ディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）からの耐熱性ＸｙｎＢキシラナーゼの発現収率を向上させて、酵素を工業的に使用させるために、十分な量を許容可能な生産費用で産生できるようにすることは興味深い。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、主に、いわゆるシグナルペプチドを有するポリペプチドを活発に分泌するという理由で、目的とする様々なポリペプチドの工業生産においてワークホース（ｗｏｒｋｈｏｒｓｅ）として特徴付けられている。シグナルペプチドは、典型的には約２０〜３０アミノ酸の短いポリペプチドであり、分泌されようとするポリペプチドのＮ末端との転写的および翻訳的融合物に発現される。これは、好適に装備された宿主細胞の分泌機構内に融合ポリペプチドを向かわせ、これによって、融合ポリペプチドが切断されると共に、目的とする現時点の成熟型ポリペプチドが、そのシグナルペプチドなしで周囲の培養ブロス中に分泌され、上記シグナルペプチドは、細胞内に保持されて分解される。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における目的の組み換え生成ポリペプチドの分泌によって、細胞溶解ステップを実施する必要なしに、培養ブロスから直接ポリペプチドの比較的容易な回収が可能になる。細胞から増殖培地に膜外輸送されることが指令されたポリペプチドだけが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）においてシグナルペプチドを天然に備えている。

細胞中のほとんどのポリペプチドは、膜外輸送を指令されておらず、むしろ細胞内、周辺細胞質、膜結合などであることが意図されている。このような天然では非分泌性のポリペプチドは、宿主細胞内から回収する必要があり、これは、通常、困難な回収工程を伴う煩雑な細胞溶解ステップを必要とするため、生成するのが厄介であると一般に考えられている。従って、その理由から、工業生産には天然で分泌性の酵素が好ましい。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）においてＰｆｕＳプロテアーゼおよびＸｙｎＢキシラナーゼの発現レベル（ネイティブＣ末端セルロース−結合ドメインなし）を調べるために、周知の有効なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）シグナルペプチドを用いて翻訳Ｎ末端融合ポリペプチドとしてこの２種類の酵素を発現させた。しかし、これらの酵素はまた、何らシグナルペプチドなく、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主においても実験的に発現された。

予想に反して、本発明者らは、本明細書中の実施例で明らかにされるように、分泌シグナルペプチドなしで酵素を発現させた場合、上清においてこれらの２種類の酵素の比較的高い収率を見出した。これは非常に驚くべき結果であり、ＰｆｕＳ様プロテアーゼおよびＸｙｎＢ様キシラナーゼをシグナルペプチドなしで、シグナルペプチドが使用された場合よりも高い収率でバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において生成させることができることを示すものであるため、経済的に重要なものの１つである。酵素は、高価な細胞溶解ステップなく、ブロスから首尾よく直接回収され得る。

従って、第一の態様において、本発明は、天然では分泌性のポリペプチドを組み換え産生させる方法に関し、この方法は、
ａ）翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする外性ポリヌクレオチドを含む微生物宿主細胞を提供するステップ；
ｂ）ポリペプチドの発現を促進する条件下で微生物宿主細胞を培養するステップ、および任意選択的に、
そのポリペプチドを回収するステップ
を含む。

第二の態様において、本発明は、翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする外性ポリヌクレオチドを含む組み換え微生物宿主細胞に関する。

本発明の第三の態様は、配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ；または配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するキシラナーゼである、翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする単離合成ポリヌクレオチドに関する。

第四の態様において、本発明は、最適な宿主細胞においてその発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされる請求項１１〜１４のいずれか一項で定められるとおりのポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクトまたは発現ベクターに関する。

本発明の第五の態様は、
ａ）配列番号６の位置１〜４１３で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号６の位置１〜４１３で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成されるプロテアーゼであって、配列番号６の位置３６９に対応する位置でのアミノ酸置換を含み；好ましくは配列番号６の位置３６９に対応する位置のグリシンがアスパラギン酸に置換される：Ｇ３６９Ｄ、プロテアーゼ；または
ｂ）配列番号１５の位置１〜２０４で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成され、およびその最初のＮ末端アミノ酸としてメチオニンを含むキシラナーゼ
である、単離合成ポリペプチドに関する。

本発明の第六の態様は、
ａ）配列番号８の位置１〜４１３で示されるアミノ酸配列を有するか、またはそのアミノ酸配列を含むか、もしくはそれから構成されるプロテアーゼ；または
ｂ）配列番号１５の位置１〜２０４で示されるアミノ酸配列を有するか、またはそのアミノ酸配列を含むか、もしくはそれから構成され、およびその最初のＮ末端アミノ酸としてメチオニンを含む、キシラナーゼ
である単離合成ポリペプチドに関する。

最後の態様は、第五または第六の態様において定義されるとおりのプロテアーゼポリペプチドを含む組成物に関する。

図１は、実施例４からのｐＪＡ４１５６プラスミドのプラスミドマップを示す。図２は、実施例４からのｐＨｙＧｅ３９６プラスミドのプラスミドマップを示す。

定義
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然に生じ、また、個体群に多型性をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントである（コードされるポリペプチドに変化がない）ことが可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。

コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの組み合わせであってよい。

制御配列：「制御配列」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来（すなわち、同じ遺伝子由来）もしくは外来（すなわち、異なる遺伝子由来）のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。

発現：「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。

発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。

宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異によって、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。

単離された：「単離された」という用語は、自然界に存在しない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的例として、これらに限定されないが、（１）任意の非天然物質、（２）自然界では結合している、天然に存在する成分の１つまたは複数または全部から少なくとも部分的に取り出された任意の物質、例えば、これらに限定されないが、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子；（３）自然界で見出される物質に関して、人為的に修飾された任意の物質；（４）天然では結合している他の成分に関して、その物質の量を増加すること（例えば、宿主細胞における組み換え生産；その物質をコードする遺伝子の多数のコピー；ならびに物質をコードする遺伝子と天然に結合したプロモータより強力なプロモータの使用）により、修飾された任意の物質。

成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断等などの翻訳および任意の翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。宿主細胞が、同じポリヌクレオチドによって発現されるさらに異なる成熟型ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）の２つの混合物を産生し得ることは当技術分野において公知である。さらに、異なる宿主細胞は、ポリペプチドのプロセシングも異なるため、ポリペプチドを発現する１つの宿主細胞は、同じポリヌクレオチドを発現する別の細胞と比較して、異なる成熟型ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）を生成し得ることも公知である。

核酸コンストラクト：「核酸コンストラクト」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかである核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、または、そうでなければ自然界に存在しないであろう方法で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、あるいは、合成のものであり、１つまたは複数の制御配列を含む。

全長ポリペプチド：「全長ポリペプチド」という用語は、シグナルペプチドおよびあるいはプロペプチドも含有する、生物学的活性を有するポリペプチドの前駆体型として本明細書中で定義され、細胞からの分泌時にこのシグナルペプチドが切断され、あるいはプロペプチドも切断されて、生物学的活性を有するポリペプチドが生じる。

シグナルペプチド：「シグナルペプチド」という用語は、生物学的活性を有するポリペプチドのアミノ末端に対してインフレームで連結（融合）されるペプチドとして本明細書中で定義され、ポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づける。プロペプチドは、シグナルペプチドとポリペプチドのアミノ末端との間に存在し得る（下記のプレプロペプチドの定義を参照のこと）。

プロペプチド：「プロペプチド」という用語は、ポリペプチドのアミノ末端にインフレームで連結（融合）されるアミノ酸配列であり、結果として生じるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合ではチモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからプロペプチドの触媒性または自己触媒性切断によって成熟活性ポリペプチドに変換され得る。

プレプロペプチド：「プレプロペプチド」という用語は、ポリペプチドのアミノ末端に存在するシグナルペプチドおよびプロペプチドとして本明細書中で定義され、ここでプロペプチドは、ポリペプチドのアミノ末端にインフレームで連結（または融合）され、シグナルペプチド領域がプロペプチド領域のアミノ末端にインフレームで連結（または融合）される。

シグナルペプチドコード配列：「シグナルペプチドコード配列」という用語は、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとして本明細書中で定義される。

プロペプチドコード配列：「プロペプチドコード配列」という用語は、プロペプチドをコードするポリヌクレオチドとして本明細書中で定義される。

プレプロペプチドコード配列：「プレプロペプチドコード配列」という用語は、プレプロペプチドをコードするポリヌクレオチドとして本明細書中で定義される。

野生型シグナルペプチド：「野生型シグナルペプチド」という用語は、天然で見出される酵母または糸状菌などの天然の微生物により発現されるシグナルペプチドを指す。

親シグナルペプチド：「親シグナルペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、本発明のシグナルペプチド変異体を作製するために修飾、例えば置換、挿入、欠失および／または短縮がなされるシグナルペプチドを意味する。この用語はまた、変異体が比較され、アライメントされるシグナルペプチドも指す。この親は、天然の（野生型）シグナルペプチドであり得るか、またはこれは、何らかの好適な手段によって調製されるそれらの変異体でもあり得る。例えば、親シグナルペプチドは、アミノ酸配列において修飾または変更されている天然のシグナルペプチドの変異体であり得る。親シグナルペプチドはまた、同じ染色体遺伝子座を占有するポリヌクレオチド配列の２つ以上の代替型のいずれかによりコードされるシグナルペプチドである対立遺伝子変異体でもあり得る。

野生型プレプロペプチド：「野生型プレプロペプチド」という用語は、天然で見出される酵母または糸状菌などの天然の微生物により発現されるプレプロペプチドを指す。

親プレプロペプチド：「親プレプロペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、本発明のプレプロペプチド変異体を作製するために修飾、例えば、置換、挿入、欠失および／または短縮化がなされるプレプロペプチドを意味する。この用語はまた、変異体が比較され、アライメントされるプレプロペプチドも指す。この親は、天然の（野生型）プレプロペプチドであり得るか、またはこれは、何らかの好適な手段によって調製されるそれらの変異体でもあり得る。例えば、親プレプロペプチドは、アミノ酸配列において修飾または変更されている天然のプレプロペプチドの変異体であり得る。親プレプロペプチドはまた、同じ染色体遺伝子座を占有するポリヌクレオチド配列の２つ以上の代替型のいずれかによりコードされるプレプロペプチドである対立遺伝子変異体でもあり得る。

変異体：「変異体」という用語は、１つまたは複数（いくつか）の変更、例えばペプチドまたはポリペプチドにおける１つまたは複数（いくつか）の特異的な位置での１つまたは複数（いくつか）の特異的なアミノ酸残基の置換、挿入、欠失および／または短縮を含むペプチドまたはポリペプチドとして本明細書中で定義される。

変異体シグナルペプチド：「変異体シグナルペプチド」という用語は、シグナルペプチドにおける１つまたは複数（いくつか）の特異的な位置での１つまたは複数（いくつか）の特異的なアミノ酸残基の１つまたは複数（いくつか）の変更、例えば置換、挿入、欠失および／または短縮などを含む、親シグナルペプチドのシグナルペプチドとして本明細書中で定義される。

変異体プレプロペプチド：「変異体プレプロペプチド」という用語は、プレプロペプチドにおける１つまたは複数（いくつか）の特異的な位置での１つまたは複数（いくつか）の特異的なアミノ酸残基の１つまたは複数（いくつか）の変更、例えば置換、挿入、欠失および／または短縮などを含む、親プレプロペプチドのプレプロペプチドとして本明細書中で定義される。作動可能にリンクされた：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指令するよう、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に、制御配列が位置する構造を意味する。

配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）

本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）

変異体：「変異体」という用語は、親野生型または参照のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（例えば、いくつか）の位置で、改変（すなわち、置換、挿入、および／または欠失）を含む、酵素活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；および、挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して、およびその直後に、アミノ酸を付加することを意味する。

成熟型ポリペプチドの変異体は、１つまたは複数（例えば、いくつか）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含み得る。成熟型ポリペプチドに導入されたアミノ酸置換、欠失および／または挿入の数は、最大１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０であってよい。アミノ酸変更は、軽度のもの、すなわち、タンパク質のフォールディングおよび／または活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換または挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の小さな欠失；アミノ末端メチオニン残基などの小さなアミノもしくはカルボキシル末端の延伸；最大２０〜２５残基の小さなリンカーペプチド；または正味電荷もしくは別の機能を変化させることによって精製を容易にする、例えば、ポリヒスチジン配列（ｐｏｌｙ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｔｒａｃｔ）、抗原エピトープもしくは結合ドメインなどの小さな延伸であってよい。

保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈａｎｄＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。一般的な置換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。

あるいは、アミノ酸変異は、ポリペプチドの物理化学的特性が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変異は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、至適ｐＨを変化させることであり得る。

ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍａｎｄＷｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するために酵素活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅＶｏｓｅｔａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒｅｔａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、関連するポリペプチドとのアラインメントから推測されることも可能である。

単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎａｎｄＳａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：５３−５７；ＢｏｗｉｅａｎｄＳａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎｅｔａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅｅｔａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ４６：１４５；Ｎｅｒｅｔａｌ．，１９８８，ＤＮＡ７：１２７）が挙げられる。

突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓｅｔａｌ．，１９９９，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。

融合ポリペプチド：目的とするポリペプチドは、１つのポリペプチドの１領域が、別のポリペプチドの１領域のＮ末端またはＣ末端で融合されたハイブリッドポリペプチドであってもよい。

ポリペプチドは、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合ポリペプチドはまた、翻訳後に融合ポリペプチドが形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒｅｔａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯＪ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：７７６−７７９）。

融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａｅｔａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄｅｔａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓｅｔａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎｅｔａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅｅｔａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＷｏｒｌｄ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。

ポリヌクレオチド
本発明は、分泌シグナルを含まない天然で分泌性のプロテアーゼまたはキシラナーゼをコードする単離合成ポリヌクレオチドに関し、ここで、このポリペプチドは、配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列；好ましくは配列番号８の位置１〜４１３で示されるプロテアーゼに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成されるプロテアーゼであるか；またはこのポリペプチドは、配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列；好ましくは配列番号１５の位置１〜２０４で示されるプロテアーゼに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成されるキシラナーゼである。

好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；好ましくは配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するか、含むか、またはそれから構成され；より好ましくは本発明のポリヌクレオチドは、配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；さらにより好ましくは、配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するか、含むか、またはそれから構成される。

別の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するか、含むか、またはそれから構成される。

ポリヌクレオチドの単離またはクローン化に用いられる技術は当技術分野において公知であり、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡからの単離、またはこれらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローン化は、例えば、発現ライブラリの周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングを用いて共有される構造機構を伴うクローン化されたＤＮＡ断片を検出することにより実施可能である。例えば、Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅法が用いられ得る。ピュロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）の株または関連生物からポリヌクレオチドをクローン化し得、従って例えばポリヌクレオチドの領域をコードするポリペプチドの対立遺伝子または種変異体であり得る。

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成に必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に類似する」という用語は、ポリペプチドの非天然形態を指す。これらのポリペプチドは、天然のソースから単離されたポリペプチドとはいくらかの操作法で異なっていてもよく、例えば、特異活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）、耐熱性、至適ｐＨ等が異なる変異体である。変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、例えばその部分配列として与えられるポリヌクレオチドに基づいて構築され得、および／または、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないが、酵素の生成のために意図される宿主生体のコドン利用に対応するヌクレオチド置換の導入により、または、異なるアミノ酸配列をもたらし得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えばＦｏｒｄｅｔａｌ．，１９９１，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ２：９５−１０７を参照のこと。

ポリヌクレオチドのソース
本発明のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは、何らかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的に対して、「から得られる」という用語は、本明細書中で使用される場合、ある種のソースと関連して、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、ソースにより、またはソースからのポリヌクレオチドが挿入されている株により産生されることを意味する。

ポリヌクレオチドは細菌性ポリヌクレオチドであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、プロテアーゼ活性を有する分泌性ポリペプチドをコードする、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ポリヌクレオチドなどのグラム陽性細菌ポリヌクレオチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）もしくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）ポリヌクレオチドなどのグラム陰性細菌ポリヌクレオチドであり得る。

一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、高度好熱嫌気性細菌由来、例えばディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）を含む、ディクチオグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ）門由来などであり得る。

別の態様において、ポリヌクレオチドは、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ポリヌクレオチドである。

別の態様において、ポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｕｂｅｒｉｓ）またはストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）ポリヌクレオチドである。

別の態様において、ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）またはストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）ポリヌクレオチドである。

別の態様において、ポリヌクレオチドは、ピュロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）ポリヌクレオチド；好ましくはピュロコックス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）ポリヌクレオチドである。

ポリヌクレオチドは、真菌性ポリヌクレオチドであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ポリペプチドなどのイースト菌ポリヌクレオチド；または、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスペリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリホネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペクス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルプス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニムファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）もしくはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）ポリヌクレオチドなどの糸状真菌性ポリペプチドであり得る。

他の態様において、ポリヌクレオチドは、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）ポリヌクレオチドである。

他の態様において、ポリヌクレオチドは、アクレモニウムセルロリチクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウムグラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウムロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａｇｒｉｓｅａ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペクスラクテウス（Ｉｒｐｅｘｌａｃｔｅｕｓ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムフニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビアアクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビアアルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビアアルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビアアウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビアフィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｆｉｍｅｔｉ）、チエラビアミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビアオビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビアペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビアセトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｓｅｔｏｓａ）、チエラビアスペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビアスブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）ポリヌクレオチドである。

前述の種について、本発明は、知られている種の名称に関わらず、完全および不完全世代、ならびに、例えば無性世代といった他の分類学上の均等物の両方を含むことが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。

これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：ＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕＶｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＰａｔｅｎｔＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。

ポリヌクレオチドは、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物を含む他のソースまたは天然の材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接得られたＤＮＡサンプルから同定され、また、得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接単離する技術は技術分野において周知である。次いで、ポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることにより得られ得る。一旦、ポリヌクレオチドが検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に知られている技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化されることが可能である。

核酸コンストラクト
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトに関する。

ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されてポリペプチドの発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。

制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。いくつかの態様では、プロモータは異種プロモータである。

細菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を指令する上で好適なプロモータの例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ＡｇａｉｓｓｅａｎｄＬｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆｅｔａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒｅｔａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２１−２５）から得られるプロモータがある。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔｅｔａｌ．，１９８０，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９に記載されている。タンデムプロモータの例は、国際公開第９９／４３８３４号パンフレットに開示されている。

制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。本発明においては、宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。

細菌宿主細胞の好ましいターミネータは、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ（ａｍｙＬ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。

制御配列はまた、プロモータの下流で、かつ遺伝子の発現を増大する遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域でもあってもよい。

好適なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅｅｔａｌ．，１９９５，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７７：３４６５−３４７１）から得られる。

制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。

また、宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節配列の例としては、調節化合物の存在などの化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンまたはオフにするものがある。原核系における調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。

発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。

ベクターは、例えば、プラスミド、染色体外要素、微小染色体、または人工染色体といった、自律複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター）であってよい。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有してもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを互いに含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンを用いてもよい。

ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。

細菌性選択マーカーの例としては、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、またはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーがある。

ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。

宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。

自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。

細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。

本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。

上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９を参照のこと）。

宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドを産生可能である、本発明のポリペプチドの産生を支配する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされる本発明のポリヌクレオチドを含む、組み換え宿主細胞にも関する。

ポリヌクレオチドを含むコンストラクトもしくはベクターは、コンストラクトもしくはベクターが染色体性組み込み体として、または、既述の自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により、親細胞と同一ではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源に応じて大きく変わるであろう。

宿主細胞は細菌であり得、例えばこれは原核、好ましくは何らかのグラム陽性またはグラム陰性細菌であり得る。グラム陽性細菌は、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む。グラム陰性細菌は、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）を含む。

原核宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。

宿主細胞はまた、これらに限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞を含む、何らかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞でもあり得る。

宿主細胞はまた、これらに限定されないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含む、何らかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、ＣｈａｎｇａｎｄＣｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞形質転換（例えば、ＹｏｕｎｇａｎｄＳｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕａｎｄＤａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、ＳｈｉｇｅｋａｗａａｎｄＤｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、ＫｏｅｈｌｅｒａｎｄＴｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えばＨａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法（例えばＤｏｗｅｒｅｔａｌ．，１９８８，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１６：６１２７−６１４５）により行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法（例えばＧｏｎｇｅｔａｌ．，２００４，ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えばＭａｚｏｄｉｅｒｅｔａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）または形質導入（例えばＢｕｒｋｅｅｔａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）により行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、電気穿孔法（例えばＣｈｏｉｅｔａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６４：３９１−３９７を参照のこと）または接合（例えばＰｉｎｅｄｏおよびＳｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）によって行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、天然のコンピテンス（例えばＰｅｒｒｙおよびＫｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えばＣａｔｔおよびＪｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ６８：１８９−２０７を参照のこと）、電気穿孔法（例えばＢｕｃｋｌｅｙｅｔａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）または接合（例えばＣｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）により行われ得る。しかし、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための当技術分野で公知のあらゆる方法を使用し得る。

本発明の第二の態様の好ましい実施形態では、組み換え微生物宿主細胞は、翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする外性ポリヌクレオチドを含む。

好ましくは、微生物宿主細胞は、原核宿主細胞、好ましくはグラム陽性宿主細胞、より好ましくはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であり、最も好ましくは宿主細胞は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。

ポリペプチドが相同または異種酵素であること、好ましくは酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼまたはトランスフェラーゼからなる群から選択されることが好ましく；より好ましくは酵素は、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼである。

さらに、ポリペプチドが、
ａ）配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるプロテアーゼポリペプチド；または
ｂ）配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるキシラナーゼポリペプチド
であることが好ましい。

さらにより好ましくは、ポリペプチドは：
ａ）配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列；または好ましくは配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされるプロテアーゼ；または
ｂ）配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされるキシラナーゼ
である。

生成方法
本発明はまた、天然では分泌性のポリペプチドを組み換え産生する方法にも関し；本方法は、
ａ）翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする外性ポリヌクレオチドを含む微生物宿主細胞を提供するステップ；
ｂ）ポリペプチドの発現を促進する条件下で微生物宿主細胞を培養するステップ、および任意選択的に、
そのポリペプチドを回収するステップ
を含む。

宿主細胞は、当技術分野で公知の方法を用いてポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、好適な培地中で、およびポリペプチドを発現させ、および／または単離できる条件下で実験室または工業的発酵装置中で、振盪フラスコ培養または小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）によって細胞を培養し得る。培養は、炭素および窒素源と、無機塩とを含む好適な栄養培地において、当技術分野で公知の手順を用いて行われる。好適な培地は、供給業者から入手可能であるか、または、（例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおいて）公開されている組成に従って調製し得る。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドを培地から直接回収し得る。ポリペプチドが分泌されない場合、これは細胞溶解液から回収し得る。

ポリペプチドは、当技術分野で公知のポリペプチドに特有の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または、酵素基質の消失を含む。例えば、酵素アッセイを用いて、ポリペプチドの活性を決定してもよい。

ポリペプチドは、当技術分野では公知の方法を用いて回収することができる。例えば、ポリペプチドは、これらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収することができる。一態様では、ポリペプチドを含む発酵ブロスを回収する。

ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、これらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＪａｎｓｏｎａｎｄＲｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照のこと）など、当技術分野で公知の多様な方法によって精製することができる。

代替的な態様においては、ポリペプチドを回収するのではなく、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞をポリペプチドの供給源として用いる。

好ましくは、微生物は原核宿主細胞、好ましくはグラム陽性宿主細胞、より好ましくはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であり、最も好ましくは宿主細胞は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。

ポリペプチドが相同または異種酵素であることが好ましく、好ましくは酵素は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼまたはトランスフェラーゼからなる群から選択され；より好ましくは酵素は、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼである。

第一の態様の好ましい方法において、ポリペプチドは、
ａ）配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるプロテアーゼポリペプチド、または
ｂ）配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるキシラナーゼポリペプチド
である。

第一の態様の別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、
ａ）配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列；または好ましくは配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされるプロテアーゼ；または
ｂ）配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされるキシラナーゼ
である。

プロテアーゼ活性を有するポリペプチド
好ましい実施形態では、単離合成プロテアーゼポリペプチドは、配列番号６の位置１〜４１３で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号６の位置１〜４１３で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成され、ここでこのプロテアーゼは、配列番号６の位置３６９に対応する位置でのアミノ酸置換を含み；好ましくは配列番号６の位置３６９に対応する位置のグリシンがアスパラギン酸に置換される：Ｇ３６９Ｄ。

一実施形態では、本発明は、配列番号８の位置１〜４１３で示されるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成される単離合成プロテアーゼポリペプチドまたはプロテアーゼ活性を有するそれらの断片に関する。

好ましい実施形態では、本発明の単離合成プロテアーゼポリペプチドは、位置３６９のグリシンがアスパラギン酸に置換される：Ｇ３６９Ｄ、配列番号６の位置１〜４１３で示される成熟ＰｆｕＳプロテアーゼの置換変異体である。

キシラナーゼ活性を有するポリペプチド
好ましい実施形態では、本発明の単離合成ポリペプチドは、配列番号１５の位置１〜２０４で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成され、およびその最初のＮ末端アミノ酸としてメチオニンを含むキシラナーゼである。

一実施形態では、本発明は、配列番号１５の位置１〜２０４で示されるアミノ酸配列またはキシラナーゼ活性を有するそれらの断片を有するか、含むか、またはそれから構成され、およびその最初のＮ末端アミノ酸としてメチオニンを含む、単離合成キシラナーゼポリペプチドに関する。

好ましい実施形態では、本発明の単離合成プロテアーゼポリペプチドは、配列番号６の位置１〜４１３で示される成熟ＰｆｕＳプロテアーゼの置換変異体であり、位置３６９のグリシンがアスパラギン酸に置換される：Ｇ３６９Ｄ。

酵素組成物
本発明はまた、本発明の特異的なプロテアーゼポリペプチドを含む組成物にも関する。好ましくは、本組成物はこのようなポリペプチド中で濃縮される。「濃縮される」という用語は、例えば少なくとも１．１の濃縮係数で本組成物のプロテアーゼ活性が向上していることを示す。

本組成物は、主要な酵素成分、例えば１成分組成物として本発明のポリペプチドを含み得る。あるいは、本組成物は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼまたはトランスフェラーゼからなる群から選択される１つまたは複数（例えば、いくつか）の酵素などの多重酵素活性を含み得；より好ましくは酵素は、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼである。

本発明のプロテアーゼと共に好適なさらなる組成物は、内容が参照により本明細書中で組み込まれる、国際公開第２０１３／０８２４８６号パンフレットに記載される。

本組成物は、当技術分野で公知の方法に従い調製され得、液体または乾燥組成物の形態であり得る。本組成物は、当技術分野で公知の方法に従い安定化され得る。

好ましい実施形態では、本発明は、「プロテアーゼ活性を有するポリペプチド」の題名の上記セクションで定義されるとおりのプロテアーゼポリペプチドを含む組成物に関する。

発酵ブロス調合物または細胞組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス調合物または細胞組成物にも関する。発酵ブロス製品は、さらに、発酵工程に用いる別の成分、例えば、細胞（目的のポリペプチドを生成するのに用いられる本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞など）、細胞残屑、バイオマス、発酵培地および／または発酵産物なども含む。一部の実施形態では、組成物は、有機酸、死滅細胞および／または細胞残屑、ならびに培地を含有する細胞死滅全ブロスである。

本明細書で用いる場合、「発酵ブロス」という用語は、回収および／もしくは精製に一切付されないか、または最小限にしか付されない細胞発酵により生成される調製物を指す。例えば、発酵ブロスは、微生物培養物を飽和まで増殖させ、タンパク質合成（例えば、宿主細胞による酵素の発現）および細胞培地への分泌を可能にする炭素制限条件下でインキュベートする際に生成される。発酵ブロスは、発酵の終わりに得られる発酵物質の未分画もしくは分画成分を含有していてもよい。典型的に、発酵ブロスは、未分画であり、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を、例えば遠心分離により除去した後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに生育可能なおよび／または生育不能な微生物細胞を含む。

一実施形態では、発酵ブロス調合物および細胞組成物は、少なくとも１つの１〜５炭素有機酸および／またはその塩を含む第一有機酸成分と、少なくとも１つの６以上の炭素有機酸および／またはその塩を含む第二有機酸成分とを含む。特定の実施形態では、第一有機酸成分は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、それらの塩、またはこれらのうちの２つ以上の混合物であり、また、第二有機酸成分は、安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチル吉草酸、フェニル酢酸、それらの塩、またはこれらのうちの２つ以上の混合物である。

一態様では、組成物は、有機酸を含み、また任意選択で、死滅細胞および／または細胞残屑も含有する。一実施形態では、死滅細胞および／または細胞残屑は、これらの成分を含まない組成物を提供するために、細胞死滅全ブロスから除去される。

発酵ブロス調合物または細胞組成物は、防腐剤および／または抗菌（例えば、静菌）剤を含んでもよく、このようなものとして、限定しないが、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、および当技術分野では公知の他の物質などが挙げられる。

細胞死滅全ブロスまたは組成物は、発酵の終わりに得られる発酵物質の未分画成分を含んでもよい。典型的に、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を飽和まで増殖させ、タンパク質合成を可能にする炭素制限条件下でインキュベートした後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに死滅糸状真菌細胞を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物中に存在する微生物細胞を、当技術分野では公知の方法を用いて、透過性にするか、および／または溶解させることができる。

本明細書に記載する全ブロスまたは組成物は、典型的に、液体であるが、死滅細胞、細胞残屑、培地成分、および／または不溶性酵素などの不溶性成分を含有してもよい。一部の実施形態では、清澄化した液体組成物を提供するために、不溶性成分を除去してもよい。

本発明の全ブロス調合物および細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレットまたは国際公開第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載の方法によって生成してもよい。

次の実施例は、説明のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。

実施例１ピュロコックス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ４３５８７／ＤＳＭ３６３８からのＰｆｕＳプロテアーゼのクローン化および発現
ピュロコックス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）からのプロテアーゼＰｆｕＳは、耐熱性のプロテアーゼとして記載されている（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６：１９９２−１９９８（１９９０）；ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７１：１７−２０（１９９０）；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３７：１１９３−１１９９（１９９１））。ＰｆｕＳプロテアーゼの組み換え発現は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主生体で以前に示されているが、発現レベルは非常に低かった（欧州特許出願公開第０９９４１９１Ａ１号明細書；宝酒造（日本））。

本明細書中で、本発明者らは、組み換えクローン化を用いたＰｆｕＳプロテアーゼ酵素を作製する新規方法およびＰｆｕＳのネイティブシグナルペプチドまたは何らかの他のシグナルペプチドを欠く発現コンストラクトを記載する。驚くべきことに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中でこのコンストラクトを発現させた場合、高い酵素収率が得られた。

ネイティブＰｆｕＳプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１で示し、ＰｆｕＳプロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号２で示す（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ８Ｕ０Ｃ９）。

ＰｆｕＳのアミノ酸配列に基づき、合成コード配列を設計した。国際公開第１２０２５５７７号パンフレットで以前に記載されるように、合成遺伝子におけるコドン利用を古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現に対して最適化した。

標準的条件下で次のプライマー対を用いてＰＣＲによって合成ＤＮＡからＤＮＡを増幅した。
フォワードプライマー：ａａａｇｇａｇａｇｇａｔａａａｇａａｔｇｇｃａｃｃｔｇａｇａａｇａａａ（配列番号３）
リバースプライマー：ｇｃｇｔｔｔｔｔｔｔａｔｔｇａｔｔａａｃｇｃｇｔｔｔａｔｇｇｔｇａｔｇａｇｃｃａｇｇｃ（配列番号４）

アガロースゲル電気泳動により判断したところ、結果として生じたＰＣＲ断片は、１６３１ｂｐの予想サイズを有した。２回目のＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）を行う前にＰＣＲ断片を精製した。このＰＣＲ２反応において、国際公開第９９４３８３５号パンフレットで開示される三重プロモータを含有するＤＮＡ断片にＰＣＲ１断片の５’末端を融合させ、作動可能にリンクさせた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ１産物の３’末端に融合させた。抗生物質マーカーとしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を使用した（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎｅｔａｌ．，１９９３，Ｐｌａｓｍｉｄ３０：３１２−３１５に記載のとおり）。得られた、意図される最終ＰｆｕＳをコードするＤＮＡ断片を配列番号５で示し、意図されるコードされるアミノ酸配列を配列番号６で示す。

上記のＰＣＲ反応の代わりに、供給業者による合成ＤＮＡとして全ての調節エレメントを含む完全なＤＮＡ断片をオーダーし得る。

国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに記載のように、配列番号５の発現コンストラクトを相同組み換えによって古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムに組み込んだ。発現宿主は、次の表現型を有する古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株であった：胞子形成なし（ｓｐｏ−）、ビオチン栄養要求（ｂｉｏＩ−）、プロテアーゼ陰性（ＮｐｒＥ−およびＡｐｒＥ−）、α−アミラーゼ陰性（ＡｍｙＥ−）、サーファクチン非産生（ＳｒｆＣ−）。

選択マーカーとしてクロラムフェニコールを含有するＴＢ寒天プレート上でＭＴＢＯ０４１１−１と呼ばれるある古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クロラムフェニコール耐性発現クローンを選択した。３４ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを補給した１００ｍｌカゼインベース培地をそれぞれ含有する５００ｍＬバッフル付きエーレンマイヤーフラスコ中で回転振盪テーブル上で液体培地中でクローンを培養した。

選択されたクローンからのポリヌクレオチド挿入物を確認するためにＤＮＡ配列決定を使用し、配列番号５の位置１４６３において無作為突然変異を同定し、この配列においてＧからＡへの変化があった（Ｇ１４６３Ａ）。位置１４６３での突然変異ヌクレオチドを含む、クローンＭＴＢＯ０４１１−１において挿入されるポリヌクレオチド発現コンストラクトの実際のＤＮＡ配列を配列番号７で示す。Ｇ１４６３Ａヌクレオチド突然変異の結果生じる、成熟ポリペプチドの位置３６９の単アミノ酸置換：Ｇ３６９Ｄを含む、推定のコードされる変異体ＰｆｕＳアミノ酸配列を配列番号８で示す。

ＭＴＢＯ０４１１−１クローンを３７℃で２〜５日間培養した。続く精製または酵素タンパク質活性測定のために、細胞不含の培養上清を７０℃で２０分間熱処理し、それに続いて遠心分離して発現宿主からの内因性プロテアーゼを不活性化し、分解したタンパク質を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってＰｆｕＳプロテアーゼの良好な発現が分かった（実施例２参照）。

比較のために、本発明者らはまた、機能的バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）分泌シグナルを含んだＰｆｕＳプロテアーゼ発現コンストラクトも組み立てた。ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅させるために次のプライマー対：
フォワードプライマー：ｔｃａｔｃｇａｔｃｇｃａｔｃｇｇｃｔｇｃａｃｃｔｇａｇａａｇａａａｇｔｔｇ（配列番号９）
リバースプライマー：ｃｃａａｇｇｃｃｇｇｔｔｔｔｔｔａｔｇｔｔｔｔａｔｇｇｔｇａｔｇａｇｃｃａｇｇｃ（配列番号１０）
を使用したことを除き、上記で概説するように、アミノ末端シグナルペプチドを含むＰｆｕＳプロテアーゼの発現を行った。

結果として生じる発現ベクターコンストラクトは、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ａｐｒＨプロテアーゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡにインフレームで融合される上記のものと同じコード配列から構成され：
ａｔｇａａａａａａｃｃｇｃｔｇｇｇｇａａａａｔｔｇｔｃｇｃａａｇｃａｃｃｇｃａｃｔａｃｔｃａｔｔｔｃｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔａｇｔｔｃａｔｃｇａｔｃｇｃａｔｃｇｇｃｔｇｃａｃｃｔａｇｇ（配列番号１１）、
ここで位置１〜８１のヌクレオチドはＡｐｒＨシグナルをコードし、ヌクレオチド８２〜９０は、クローン化工程の後に残されたものである）。

上記のようにクローン化および形質転換を行い、古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現クローンを選択してＭＴＢＯ０４１１−２としたが、これは配列番号１３で示される推定アミノ酸配列をコードする配列番号１２で示されるｐｆｕＳ遺伝子断片を保有する。

実施例２．プロテアーゼ活性の検出および酵素収率
１％カゼイン（可溶化脱脂粉乳）を含有する固化したルリア・ベルターニ寒天培地において開けた穴に１０μＬの熱処理サンプルを添加することによって、未使用の培養ブロス溶液ならびに実施例１からの２個の選択クローンの培養ブロス上清のプロテアーゼ活性を測定した。７０℃で１８時間インキュベートした後の穴の周辺の透明化ゾーンはタンパク質分解活性を示した。

ＰｆｕＳ遺伝子を欠く古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）対照宿主株は、透明化ゾーンを生じず、一方で実施例１からのシグナルペプチドを含まずＰｆｕＳコンストラクトがある古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クローンは、既に発酵の２日後に１０ｍｍ半径の明確な透明化ゾーンを示した。実施例１からのシグナルペプチドがあるＰｆｕＳ遺伝子コンストラクトの透明化ゾーンは、発酵２日後に、対照古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株と比較して顕著な相違はなかった（約１ｍｍ）。本発明者らは、振盪フラスコ中での発酵５日後に初めて、ＡｐｒＨシグナルペプチドがあるＰｆｕＳプロテアーゼを発現するクローンから５ｍｍの顕著な透明化を検出することができた。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からの結果と共に、本発明者らは、何らシグナルペプチドを含まない発現から、発酵２日後に何ら顕著な発現をもたらさなかったＡｐｒＨプロテアーゼからの他の周知の有効なシグナルペプチドを伴う発現よりもきわめて高いＰｆｕＳプロテアーゼ発現レベルが達成されたと結論付けた。

細胞不含発酵培養上清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって変異体ＰｆｕＳプロテアーゼ発現の成功を分析した。およそ４０ｋＤａの個別のタンパク質バンドから、培養培地へのＰｆｕＳ発現の成功が示された。発酵中または発酵後、古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の溶解は活発に誘導されなかったが、これは工業生産目的に有利である。

全組み換え発現ＰｆｕＳ酵素サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、実施例１の分泌シグナルを含まない遺伝子コンストラクトの発現レベルが、以前報告されたものよりも顕著に高く（例えば欧州特許出願公開第０９９４１９１Ａ１号明細書；宝酒造、日本を参照のこと）、また上記実施例１の分泌シグナルがあるコンストラクトよりも顕著に高かったことが示されたが、これは、欧州特許出願公開第０９９４１９１Ａ１号明細書（宝酒造、日本）で以前に報告された酵素収率と同等であり、すなわち１３〜６０ｍｇ／Ｌ培養物の範囲であった。

組み換え精製変異体ＰｆｕＳプロテアーゼ（サンプルＩＤＵ４３ＰＳ）は、２００Ｋ／ｈの走査速度で５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ５中で示差熱量測定によって１０３℃の融解温度を示した。

組み換えＰｆｕＳの成熟アミノ末端は、Ｎ末端ａａ配列決定によりＡＥＬＥＧＬＤであることが分かり、測定したインタクトな質量は４３０６６．４ダルトンであり、これは、質量の計算値が４３，０６１Ｄａである配列番号８で示される導入された点突然変異：Ｇ３６９ＤがあるＰｆｕＳの記載の成熟変異体ペプチドにより予想され；一方で配列番号６で示される野生型成熟ＰｆｕＳポリペプチドの質量計算値は４３，００３ダルトンである。

基質としてＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いた酵素性加水分解反応において生じたパラ−ニトロアニリンの量を測定することによる、欧州特許出願公開第０９９４１９１Ａ１号明細書（宝酒造、日本）で使用される方法によって、プロテアーゼＰｆｕＳの活性も分光学的に決定した。簡潔に述べると、的確な測定のために酵素標品を適切に希釈した（すなわち再蒸留水での細胞不含培地上清の５００倍および１０００倍希釈液）。１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０中の５０ｍｕＬの１ｍＭＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ＮＡ溶液を５０ｍｕＬの希釈サンプル溶液に添加した。次に、９５℃で３０分間反応を進行させた。氷上で冷却することによって反応を終了させた後、生じたパラ−ニトロアニリンの量を計算するために４０５ｎｍでの吸光度を測定した。１単位の酵素は、９５℃で１ｍｕモルのｐ−ニトロアニリン／１分を生じさせる酵素の量として定義された。米国特許出願公開第２００４０８８８５８８号明細書で述べられるように、特異活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）が９．５Ｕ／ｍｇタンパク質のプロテアーゼＰｆｕＳと仮定して、測定された酵素活性に基づき、培養上清または細胞中で発現された酵素タンパク質の量を計算した。パラ−ＮＡの吸収係数は、４１０ｎｍ、ｐＨ７．５で８８００Ｍ−１ｃｍ−１であり、本発明者らは、ｐＨ７．０で４０５ｎｍで測定されるこの実施例の反応において同じ係数を使用した。ランベルト−ベールの法則を使用して、１ｃｍキュベットにおける吸収値１は、１１３，６ｍｕＭパラ−ＮＡに相当する。

５００倍〜１０００倍サンプル希釈物（表２で示される）の吸収値から計算した酵素発現収率は、透明化ゾーン半径測定からの推定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定と非常によく相関する。発現収率は、ＡｐｒＨシグナルペプチドがあるコンストラクトに対して２〜２６ｍｇ／Ｌの範囲であり、シグナルペプチドを含まないコンストラクトでは＞５倍高かった（１０８〜１６７ｍｇ／Ｌ）。

実施例３．プロテアーゼの特徴
Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡプロテアーゼ活性アッセイ：
ｐＮＡ基質：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（ＢａｃｈｅｍＬ−１４００）。
温度：室温（２５℃）
アッセイバッファー：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＣＨＥＳ、１００ｍＭＣＡＢＳ、１ｍＭＣａＣｌ₂、１５０ｍＭＫＣｌ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ９．０。

２０μｌプロテアーゼ（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で希釈）を１００μｌアッセイバッファーと混合した。１００μｌｐＮＡ基質を添加することによって、アッセイを開始した（１．０ｍｌＤＭＳＯ中で５０ｍｇ溶解し、さらに０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で４５×希釈）。プロテアーゼ活性の目安としてＯＤ₄₀₅の増加を監視した。

プロテアーゼ精製
培養ブロスを遠心分離し（２００００×ｇ、２分）、傾けて上清を沈殿物から慎重に除去した。残りのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を除去するために、Ｎａｌｇｅｎｅ０．２μｍろ過ユニットに通して上清をろ過した。固形（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を０．２μｍろ液に添加して０．８５Ｍ最終濃度にし、塩調節ろ液を１００ｍＭＨ₃ＢＯ₃、１０ｍＭＭＥＳ、２ｍＭＣａＣｌ₂、０．９Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ｐＨ６．０中で平衡化したフェニル−セファロースＦＦ（ｈｉｇｈｓｕｂ）カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅより）に載せた。平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、平衡化バッファーと１００ｍＭＨ₃ＢＯ₃、１０ｍＭＭＥＳ、２ｍＭＣａＣｌ₂、ｐＨ６．０＋２５％（ｖ／ｖ）２−プロパノールとの間で、５カラム体積にわたり、直線的な勾配でプロテアーゼを溶出した。カラムからの分画をプロテアーゼ活性について分析し（ｐＨ９でＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを使用）、ピーク分画をプールした。フェニル−セファロースＦＦカラムからのプールをＧ２５セファデックスカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅより）上の１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ₂、ｐＨ９．０に移した。Ｇ２５ろ液を１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ₂、ｐＨ９．０で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅより）に載せた。平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、５カラム体積にわたり同じバッファー中で、直線的なＮａＣｌ勾配（０→０．５Ｍ）でプロテアーゼを溶出した。カラムからの分画をプロテアーゼ活性について分析し（ｐＨ９でＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを使用）、活性のある分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でバンドが１本だけ見られた分画を精製標品としてプールし、さらなる実験のために使用した。

ＥＤＭＡＮ分解によるＮ末端配列の決定はＡＥＬＥＧＬＤであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した場合の相対的分子量は、およそＭ_r＝４１ｋＤａであった。インタクトな分子量分析により決定した分子量は４３，０６２．４Ｄａであった。これは、４３，０６１．３Ｄａの配列番号８で示される成熟配列に基づく計算分子量とよく対応する。

実施例４．ディクチオグロムス・サーモフィルム・キシラナス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍｘｙｌａｎａｓ）のクローン化および発現
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主株は、それぞれ、胞子形成転写因子シグマＦ、アルカリプロテアーゼ、ｇｌｕ−特異的プロテアーゼ（Ｃ−コンポーネント）、チトクロムＰ４５０様酵素ＣｙｐＸ、レバンスクラーゼ、バチロペプチダーゼＦ（２個の遺伝子）、２個の細胞外セリンプロテアーゼおよび細胞壁結合プロテアーゼＷｐｒＡをコードする、ｓｐｏＩＩＡＣ、ａｐｒＬ、ｍｐｒＬ、ｃｙｐＸ、ｓａｃＢ、ｂｐｒＡＢ、ｅｐｒ、ｖｐｒおよびｗｐｒＡ遺伝子において欠失があった。そのリボソーム結合部位での突然変異によって、１０ｋＤａバックグラウンドタンパク質をコードするｆｏｒＤ遺伝子の発現も減少または消失した。さらに、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主株は、コード遺伝子の不活性化または排除ゆえに、α−アミラーゼ、セルラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを産生することができない。

発現カセットのファージインテグラーゼ介在性の部位特異的な組み込みにおいて組み込み部位とするために、２個の染色体遺伝子座ａｍｙＬおよびｇｎｔＰにおいてラクトコッカスファージＴＰ９０１−１からの人工プロモータ、マーカー遺伝子およびａｔｔＢインテグラーゼ認識部位を挿入することによって、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株宿主をさらに修飾した（国際公開第２００６／０４２５４８号パンフレットで開示されるとおり）。

人工ディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）キシラナーゼ発現カセットのファージインテグラーゼ介在性の部位特異的組み込みを用いて本明細書中で２つの株を構築したが、ここでコード配列はＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における発現に対してコドン最適化されていた。

ａｔｔＰ部位が下流に隣接し、その後の削除のための相同性領域が上流に隣接する好適なファージインテグラーゼ介在性の組み込みベクターに成熟キシラナーゼｘｙｎＤｔ（配列番号１５で示される）をコードするコドン最適化遺伝子（配列番号１４で示される）をクローン化し、それによりプラスミドｐＪＡ４１５６を作製した（図１；配列番号１６を参照のこと）。このベクターを宿主株に形質転換し、その結果生じた株ＪＡ４１８２において、上記で概説されるように２個の遺伝子座でキシラナーゼ発現カセットを確立した。

ａｔｔＰ部位が下流に隣接し、その後の削除のための相同性領域が上流に隣接する好適なファージインテグラーゼ介在性の組み込みベクターに、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ遺伝子（ＳＰ_amyL）由来であり、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）において有効であることが知られている人工シグナルペプチド（配列番号１８で示される）がある翻訳融合物中の成熟キシラナーゼｘｙｎＤｔをコードするコドン最適化遺伝子（配列番号１７で示される）をクローン化し、それによりプラスミドｐＨｙＧｅ３９６を作製した（図２；配列番号１９を参照のこと）。ベクターを宿主株に形質転換し、結果として生じる株ＨＹＧＥ４３５において、上記で概説されるように２個の遺伝子座においてキシラナーゼ発現カセットを確立した。

各株において２か所の組み込み部位に組み込まれる発現カセットは、ネイティブの２ドメインＤ．サーモフィルム（Ｄ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）キシラナーゼ酵素の成熟キシラナーゼの部分のみをコードし、そのネイティブＣ末端セルロース−結合ドメインは含まれず、そのネイティブシグナルペプチド（またはリーダー配列）もまた含まれなかった。しかし、ＨｙＧｅ４３５株に組み込まれるキシラナーゼ発現カセットは、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ遺伝子（ＳＰ_amyL）由来であり、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）において有効であることが知られている人工シグナルペプチドを含有し、シグナルペプチドは、成熟キシラナーゼコード配列と共に翻訳融合物中にあった。対照的に、ＪＡ４１８２株に組み込まれたキシラナーゼ発現カセットには、シグナルペプチド−コード配列はなく；翻訳開始コドンＡＴＧが成熟キシラナーゼのコード配列の５’末端に単純に付加された。
・ＪＡ４１８２（ａｍｙＬ：：ｘｙｎＤｔ；ｇｎｔＰ：：ｘｙｎＤｔ）
・ＨＹＧＥ４３５（ａｍｙＬ：：ＳＰ_amyL＿ｘｙｎＤｔ；ｇｎｔＰ：：ＳＰ_amyL＿ｘｙｎＤｔ；ｉｐｓＡ^-；ｐｒｓＡ⁺）

さらに、ＨｙＧｅ４３５株は、ｉｓｐＡ細胞内プロテアーゼコード遺伝子の欠失があり、さらに組み込まれたｐｒｓＡシャペロンコード遺伝子を保有する。ｉｓｐＡ欠失およびｐｒｓＡ遺伝子の両者とも、ＨｙＧｅ４３５株においてキシラナーゼの収率を幾分向上させると予想された。

実施例５．Ｄ．サーモフィルム（Ｄ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）キシラナーゼ活性の活性測定のためのアッセイ
本方法は、発酵サンプル中のキシラナーゼ活性を測定するために使用される。この反応は２ステップで行われる：
１）キシラナーゼが小麦アラビノキシランを加水分解して（ｐＨ６．０、３７℃）、還元炭水化物を放出させる。
２）４０５ｎＭで測定可能な比色による読み出しを生じさせる、還元された糖と複合体形成するＰＡＨＢＡＨおよびビスマスを含有するアルカリ試薬（ｐＨ＞１０、３７°Ｃ）の添加によって本反応を停止させる。発色は、サンプル中に存在するキシラナーゼ活性と比例する。

発酵サンプルを重量測定し、希釈物を調製し、分析ロボットにおいてアッセイを行った。プレートリーダー、例えば一体化されたＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＳＯＦＴＭＡＸＰＲＯ（登録商標）プレートリーダー上でサンプルを測定する。

バッファーおよび試薬

アラビノース−ＭＥＳ基質バッファー：
等量の１％アラビノースと２×ＭＥＳバッファーとを混合するが、その体積はアッセイ要件に従う。

アッセイ手順
標準物質の調製：
使用される標準物質は、規定の濃度（下記の測定の場合は４．０３ｍｇ／ｍｌであった）のキシラナーゼサンプルである。使用前に標準物質を周囲温度にして融解する。標準物質を希釈し、１μｇ／ｍｌの開始希釈物とする。

標準物質を次のように希釈する（４つ組）。

統合バランス（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｂａｌａｎｃｅ）、Ｓｐａｎ８ピペッティングシステムおよびＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）プレートリーダーを用いてカスタマイズ化ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）液体操作システム上で全アッセイステップを行う。

サンプルの調製：
１）全培養ブロスサンプルが極度に濃厚で粘性がある場合、９００ｒｐｍで１５分間、鋼鉄製玉軸受け（６ｍｍ直径）と共に２４ウェルプレートにおいて振盪することによって最初にサンプルを調製する。その後、広口径ピペットを用いてサンプルをロボットバランス（ｒｏｂｏｔｂａｌａｎｃｅ）に移し、重量を測定して、ＡＣＥＳバッファー中のおよそ１０倍の最初の希釈物を得る（実際の重量／最初の希釈をその後、最終的な計算において補正する）。一般的には、この最初のステップは、２００μｌの培養ブロスを１８００μｌＡＣＥＳバッファーに添加することである。サンプルを上清として受け取るかまたは問題なくピペットで採取できる場合、直接的な液体から液体へのピペット採取ステップとして最初の希釈を行う。
２）次に、重量測定したサンプルを３つ組で分配し、９６ウェルマイクロタイタープレートのＡＣＥＳバッファー中でのそれらの予想活性に従い、プレート方式で希釈する。それらの予想活性による標準曲線内に入る最終的な２枚の希釈プレートを用いた。
３）上記のように最終的な２枚の希釈プレートのそれぞれにおいて標準曲線を作成する。
４）最終的な２枚の希釈プレートのそれぞれに対して、２０μＬの各サンプルおよび標準物質を１１０μＬのアラビノース−ＭＥＳ基質バッファーに移し、すぐに混合する（９００ｒｐｍで３０秒間、ロボットオービタル振盪器）。
５）プレートを密封し、密閉インキュベーター中で振盪しながら（６００ｒｐｍ、ＩＫＡＳｃｈｕｅｔｔｌｅｒＭＴＳ４）、３７℃で３０分間インキュベートする。
６）６５μＬのＰＡＨＢＡＨをプレートに添加し、その後、これらを密封し、振盪しながら（６００ｒｐｍ、ＩＫＡＳｃｈｕｅｔｔｌｅｒＭＴＳ４）３７℃でさらに１５分間インキュベートする。
７）プレートリーダー上で４０５ｎＭでの吸光度についてプレートの測定を行い、結果として得られる付随する標準曲線から活性を推定する。

実施例６．Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株ＪＡ４１８２およびＨＹＧＥ４３５のフェドバッチ発酵
Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株ＪＡ４１８２およびＨＹＧＥ４３５でのフェドバッチ発酵を以下に記載のように実施した。培地は全て、標準的な方法によって滅菌した。特に記載のない限り、水道水を使用した。下記レシピに示す成分濃度は、全て接種前のものである。

第一接種培地
ＳＳＢ５寒天：１０ｇ／ｌダイズペプトン；スクロース１０ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム２ｇ／ｌ；リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ₂Ｏ５ｇ／ｌ；ビタミン（チアミン−二塩化物１１，４ｍｇ／ｌ；リボフラビン０，９７ｍｇ／ｌ；ニコチン酸７，７ｍｇ／ｌ；Ｄパントテン酸カルシウム９，５ｍｇ／ｌ；ピリドキサル−ＨＣｌ１，９ｍｇ／ｌ；Ｄ−ビオチン０，３７ｍｇ／ｌ；葉酸０，９７ｍｇ／ｌ）；微量金属（ＭｎＳＯ₄、Ｈ₂Ｏ９，８ｍｇ／ｌ；ＦｅＳＯ₄、７Ｈ₂Ｏ３９，２５ｍｇ／ｌ；ＣｕＳＯ₄、５Ｈ₂Ｏ３，９ｍｇ／ｌ；ＺｎＣｌ₂ ３，９ｍｇ／ｌ）；４ＮＮａＯＨでｐＨ７，３〜７，４に調節した２５ｇ／ｌ寒天。

転写バッファー：
Ｍ−９バッファー（調製のために脱イオン水を使用する）：リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ₂Ｏ８．８ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム３ｇ／ｌ；塩化ナトリウム４ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム、７Ｈ₂Ｏ０．２ｇ／ｌ。

接種材料振盪フラスコ培地（濃度は接種前のもの）：
ＰＲＫ−５０：１１０ｇ／ｌのひき割りダイズ；リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ₂Ｏ５ｇ／ｌ；滅菌前にＮａＯＨ／Ｈ₃ＰＯ₄でｐＨ８．０に調節。

構成培地（濃度は接種前のもの）：
トリプトン（Ｄｉｆｃｏからのカゼイン加水分解物）３０ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム、７Ｈ₂Ｏ４ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム７ｇ／ｌ；リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ₂Ｏ７ｇ／ｌ；硫酸二アンモニウム４ｇ／ｌ；クエン酸０．７８ｇ／ｌ；ビタミン（チアミン−二塩化物３４．２ｍｇ／ｌ；リボフラビン２．９ｍｇ／ｌ；ニコチン酸２３ｍｇ／ｌ；Ｄ−パントテン酸カルシウム２８．５ｍｇ／ｌ；ピリドキサル−ＨＣｌ５．７ｍｇ／ｌ；Ｄ−ビオチン１．１ｍｇ／ｌ；葉酸２．９ｍｇ／ｌ）；微量金属（ＭｎＳＯ₄、Ｈ₂Ｏ３９．２ｍｇ／ｌ；ＦｅＳＯ₄、７Ｈ₂Ｏ１５７ｍｇ／ｌ；ＣｕＳＯ₄、５Ｈ₂Ｏ１５．６ｍｇ／ｌ；ＺｎＣｌ₂ １５．６ｍｇ／ｌ）；消泡剤（ＳＢ２１２１）１．２５ｍｌ／ｌ；滅菌前にＮａＯＨ／Ｈ₃ＰＯ₄でｐＨ６．０に調節。

供給培地：
スクロース７０８ｇ／ｌ。

接種ステップの手順：
初めに、ＳＳＢ５寒天斜面上で、株を３７℃で１日増殖させた。次に、寒天をＭ−９バッファーで洗浄し、得られた細胞懸濁液の６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した。接種材料振盪フラスコ（ＰＲＫ−５０）に、ＯＤ（６５０ｎｍ）ｘｍｌ細胞懸濁液＝０．１の接種材料を接種する。振盪フラスコを３７℃、３００ｒｐｍで２０時間インキュベートした。

振盪フラスコからの増殖培養物を主要発酵槽に接種することにより、主要発酵槽（発酵タンク）中の発酵を開始した。接種量は、構成培地の１１％（７２０ｍｌ構成培地に対し、８０ｍｌ）であった。

発酵槽：
温度制御装置、アンモニア水およびリン酸によるｐＨ制御装置、発酵全体を通して＞２０％酸素飽和を測定するための溶存酸素電極を備える、標準的な実験室用発酵槽を使用した。

発酵パラメータ：
温度：４１℃
アンモニア水およびリン酸を用いて、ｐＨを６．８〜７．２に維持した。
制御：６．８（アンモニア水）；７．２リン酸
ばっ気：１．５リットル／分／ｋｇブロス重量
攪拌：１３５０ｒｐｍ。

供給計画：
０時間。接種後０．０５ｇ／分／ｋｇの初期ブロス
８時間。接種後０．１５６ｇ／分／ｋｇの初期ブロス
終了。接種後０．１５６ｇ／分／ｋｇの初期ブロス

実験設定：
発酵は３日間実施した。

結果：
上清中の相対的キシラナーゼ活性を第３日に決定した：

予想とは反対に、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主株ＪＡ４１８２からのキシラナーゼ収率はより非常に高く、酵素は、全くシグナルペプチドがなくても発現された。実測収率は、回収後に僅か約１．４ｍｇ／ｌであった古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるそのネイティブシグナルを含む全長Ｄ．サーモフィルム（Ｄ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）キシラナーゼコード配列を発現する場合に以前に報告されたものよりも１０００倍高かった（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．；ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）１６０：１４８４−１４９５の表１を参照のこと）。

好ましい実施形態
［１］配列番号８の位置１〜４１３で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、分泌シグナルを含まないプロテアーゼポリペプチドをコードする単離合成ポリヌクレオチド。

［２］コードされるプロテアーゼポリペプチドが、配列番号８の位置１〜４１３で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成される、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。

［３］配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；好ましくは配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、実施形態１または２に記載のポリヌクレオチド。

［４］配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；好ましくは配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成される、実施形態１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

［５］選択宿主細胞においてその発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされる実施形態１〜４のいずれか一項で定義されるとおりのポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクトまたは発現ベクター。

［６］実施形態１〜４で定義されるとおりのポリヌクレオチドまたは実施形態５で定義されるとおりの核酸コンストラクトもしくは発現ベクターで形質転換されるかまたはこれを含み、そのプロテアーゼポリペプチドを産生可能である、原核宿主細胞。

［７］バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞である、実施形態６に記載の宿主細胞。

［８］バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の群から選択される、実施形態７に記載の宿主細胞。

［９］前記プロテアーゼポリペプチドが、配列番号８の位置１〜４１３で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成される、実施形態６〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞。

［１０］プロテアーゼポリペプチドを生成する方法であって、
ａ）プロテアーゼポリペプチドの発現を促進する条件下で実施形態６〜９のいずれか一項で定義されるとおりの宿主細胞を培養するステップ；および任意選択的に、
ｂ）そのプロテアーゼを回収するステップ
を含む方法。

［１１］配列番号８の位置１〜４１３で示されるアミノ酸配列を有する、単離合成プロテアーゼポリペプチド。

［１２］配列番号８の位置１〜４１３で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成される、実施形態１１に記載のポリペプチド。

［１３］配列番号６の位置１〜４１３で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、位置３６９で置換を含む単離プロテアーゼである、実施形態１１または１２に記載のポリペプチド。

［１４］配列番号６の位置１〜４１３で示される成熟ＰｆｕＳプロテアーゼの置換変異体であり、位置３６９のグリシンがアスパラギン酸に置換される：Ｇ３６９Ｄ、実施形態１１または１２に記載のポリペプチド。

［１５］実施形態１１〜１４のいずれかで定義されるとおりのプロテアーゼポリペプチドを含む、組成物。

Claims

天然では分泌性のポリペプチドを組み換え産生させる方法であって、
ａ）翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする外性ポリヌクレオチドを含む微生物宿主細胞を提供するステップ；
ｂ）ポリペプチドの発現を促進する条件下で前記微生物宿主細胞を培養するステップ、および任意選択的に、
ｃ）前記ポリペプチドを回収するステップ
を含む、方法。
前記微生物が原核宿主細胞、好ましくはグラム陽性宿主細胞、より好ましくはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であり、最も好ましくは前記宿主細胞が、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記ポリペプチドが相同または異種酵素であり、好ましくは前記酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼまたはトランスフェラーゼからなる群から選択され；より好ましくは前記酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼである、請求項１または２に記載の方法。
前記ポリペプチドが：
ａ）配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるプロテアーゼポリペプチド、または
ｂ）配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるキシラナーゼポリペプチド
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリペプチドが：
ａ）配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；好ましくは配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされるプロテアーゼ；または
ｂ）配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされるキシラナーゼ
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする外性ポリヌクレオチドを含む組み換え微生物宿主細胞。
原核宿主細胞、好ましくはグラム陽性宿主細胞、より好ましくはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であり、最も好ましくは前記宿主細胞が、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項６に記載の微生物。
前記ポリペプチドが相同または異種酵素であり、好ましくは前記酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼまたはトランスフェラーゼからなる群から選択され；より好ましくは前記酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼである、請求項６または７に記載の微生物。
前記ポリペプチドが、
ａ）配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるプロテアーゼポリペプチド；または
ｂ）配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるキシラナーゼポリペプチド
である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の微生物。
前記ポリペプチドが：
ａ）配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；好ましくは配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされるプロテアーゼ、または
ｂ）配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされるキシラナーゼ
である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の微生物。
配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ；または配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するキシラナーゼである、翻訳的に融合されるシグナルペプチドを含まない、天然では分泌性のポリペプチドをコードする単離合成ポリヌクレオチド。
前記コードされるポリペプチドが、配列番号８の位置１〜４１３で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるプロテアーゼ；または配列番号１５の位置１〜２０４で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるキシラナーゼである、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；または配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチド。
配列番号７の位置１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；配列番号７の位置３３１〜１５６９で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列；または配列番号１４の位置１〜６１２で示される配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、選択宿主細胞でのその発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされるポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクトまたは発現ベクター。
ａ）配列番号６の位置１〜４１３で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成され、配列番号６の位置３６９に対応する位置でのアミノ酸置換を含み；好ましくは配列番号６の位置３６９に対応する位置のグリシンがアスパラギン酸に置換される：Ｇ３６９Ｄ、プロテアーゼ；または
ｂ）配列番号１５の位置１〜２０４で示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれから構成され、およびその最初のＮ末端アミノ酸としてメチオニンを含む、キシラナーゼ
である、単離合成ポリペプチド。
ａ）配列番号８の位置１〜４１３で示されるアミノ酸配列を有するか、または前記アミノ酸配列を含むか、もしくはそれから構成されるプロテアーゼ；または
ｂ）配列番号１５の位置１〜２０４で示されるアミノ酸配列を有するか、または前記アミノ酸配列を含むか、もしくはそれから構成され、およびその最初のＮ末端アミノ酸としてメチオニンを含む、キシラナーゼ
である単離合成ポリペプチド。
請求項１６または１７に記載のプロテアーゼポリペプチドを含む組成物。