JP2016521775A - ヘパラン硫酸 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)PRPSLAKKQRFRHRNRRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRもしくはPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRのアミノ酸配列を有するヘパリン結合ドメインを含むまたはからなるポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意するステップ、
(ii)該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させるステップ、
(iii)混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離するステップ、
(iv)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させるステップ、
(v)解離されたグリコサミノグリカンを回収するステップ
を含みうる、本明細書中に記載の本発明者らの方法によって取得、同定、単離または濃縮されうる。
(i)固体支持体に接着され、目的のタンパク質からのヘパリン結合ドメインを含む、またはからなる、ポリペプチド分子を有する該支持体を提供するステップ;
(ii)該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物、好ましくはヘパラン硫酸製剤、と接触させて、ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体の形成を可能にさせるステップ;
(iii)混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離するステップ;
(iv)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させるステップ;
(v)解離されたグリコサミノグリカンを回収するステップ。
本発明者らは、配列に基づくアフィニティークロマトグラフィープラットフォームを使用して、ビトロネクチン(VN)のヘパリン結合ドメインを利用した。これは、VN結合ヘパラン硫酸(HS)画分の濃縮を可能にした。結合アビディティーおよびVNに関するVN結合HS9+veの特異性が、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)およびキャピラリー電気泳動の組合せを使用して確認された。組織培養物処理ポリスチレン(TCPS)表面上へのアリルアミン(AA)重合体のプラズマ重合は、HS9+veの効率的な捕獲を可能にした。HSおよびVNの表面組合せは、hESCの接着を支持した。各コーティング層の表面密度が、放射標識と結合アッセイの双方によって確認された。HS組成分析は、グルコサミン残基上のN−硫酸化と共に6O−硫酸化、および3個を超える二糖単位の長さがVNへのHS9+ve結合に決定的であったことを明らかにした。この組合せ基質は、オーソドックスな受動的なVN吸着に対して細胞接着に必要なVN表面密度の著しい減少を可能にする。この方法は、費用効果の高い様式でhESCの3次元培養のために容易にスケールアップすることができる。
本発明は、HS9と呼ばれる一クラスのヘパラン硫酸分子に関する。HS9分子は、ビトロネクチンのヘパリン結合ドメインに相当するポリペプチドに結合する1種または複数のGAGを含む化合物の混合物を濃縮する方法によって入手可能である。特に、HS9分子は、アミノ酸配列PRPSLAKKQRFRHRNRRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRもしくはPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRを含むまたはからなるドメインである、ビトロネクチンのヘパラン結合ドメインに結合するヘパラン硫酸について濃縮することによって得られうる。濃縮のプロセスは、HS9を単離するために使用されてもよい。
(i)ヘパリン結合ドメインを含むポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意すること;
(ii)該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させること;
(iii)混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離すること;
(iv)ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること;
(v)解離されたグリコサミノグリカンを回収すること
を含む。
(a)in vitroで細胞および/または組織をHS9と接触させて培養するステップ、
(b)細胞および/または組織を回収するステップ、
(c)治療を必要とするヒトまたは動物の対象内に細胞および/または組織を埋め込むステップ
を含む。
(a)HS9;
(b)HS9によって結合されるヘパリン結合ドメイン(例えば、配列番号1または配列番号3)を含むタンパク質と組み合わせたHS9
のうちの1つを含んでいてもよい。
本明細書において培養され、記載される幹細胞は、いかなる種類の幹細胞であってもよい。該幹細胞は全能性、多能性、または多分化能であってもよい。多能性幹細胞は、胚幹細胞または誘導多能性幹細胞であってもよい。
本発明の一部の態様および実施形態は、多能性細胞の使用に関係している。胚幹細胞および誘導多能性幹細胞が、こうした細胞の例として記載されている。
1.核移植による初期化。この技法は、体細胞から卵母細胞または接合体中への核の移植を伴う。一部の状況では、これは、動物−ヒトハイブリッド細胞の作製を導きうる。例えば、細胞は、動物卵母細胞または接合体とのヒト体細胞の融合または動物体細胞とのヒト卵母細胞または接合体の融合によって作製されうる。
本明細書中に記載の方法および組成物は、誘導多能性幹細胞の増殖に使用してもよい。
増殖された幹細胞は、親幹細胞の少なくとも1つの特性を保持しうる。幹細胞は、1回または複数回の継代後にこの特性を保持しうる。これらは、複数回の継代後にそのようにしうる。
本発明者らの方法によって増殖された幹細胞は、以下の幹細胞特徴のいずれかを示しうる。
保持される生物活性は、1つまたは複数の多能性マーカーの発現を含みうる。
生物活性は、一定回数の継代後の細胞生存率を含みうる。細胞生存率は、多様な方法で、例えば、トリパンブルー排出法によって、試験されうる。生体染色のためのプロトコールは、以下の通りである。好適な容量(20〜200μL)の細胞懸濁液を適切なチューブに入れ、等量の0.4%トリパンブルーを添加して穏やかに混合し、室温で5分間置かせる。10μlの染色された細胞を血球計数器に入れ、生存(染色されていない)細胞および死滅した(染色された)細胞の数を計数する。それぞれの4分の1において染色されていない細胞の平均の数を算出し、2×104を乗算して細胞/mlを求める。生存細胞の百分率は、死滅細胞および生存細胞の数で除算された生存細胞の数である。
増殖された幹細胞は、増殖の間または後に正常な核型を保持しうる。「正常な」核型は、ムカゴが由来した、またはそこから変化したがいかなる実質的な様式にもない、親幹細胞の核型と同一、類似、または実質的に類似の核型である。例えば、転座、染色体損失、欠失などのいかなる全体的異常もあってはならない。
増殖した幹細胞は、全てのこれらの細胞系列、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力を保持しうる。これらの系列のそれぞれに分化させるための幹細胞の誘導の方法は、当技術分野において知られており、増殖された幹細胞の能力をアッセイするために使用されうる。増殖された細胞のすべてまたは実質的な部分は、この能力を保持しうる。これは、増殖された幹細胞の50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、93%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上、または実質的に100%でありうる。
本明細書で使用される場合、「グルコサミノグリカン」および「GAG」という用語は互換的に使用され、また、オリゴ糖を含み、それらの結合した糖の1つまたは複数がアミノ置換基またはその誘導体を有する分子の大きな集合を指すことが理解される。GAGの例は、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびヘパラン硫酸である。
ヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は、プロテオグリカンの高度に多様なサブグループであり、タンパク質骨格に共有結合により結合したヘパラン硫酸グルコサミノグリカン側鎖で構成される。コアタンパク質は3つの主要な形態:パールカンとして公知の分泌形態、グリピカンとして公知の、原形質膜内に固定された形態、およびシンデカンとして公知の膜貫通形態で存在する。これらは、哺乳動物の細胞表面および大多数の細胞外マトリクスに遍在する構成物である。HS鎖を、あまり一般的には見出されないコアに結合させることができるアグリン、またはアミロイド前駆体タンパク質などの他のタンパク質が存在する。
ヘパラン硫酸の亜硝酸に基づく解重合が完了すると、炭水化物鎖がその個々の二糖成分に最終的に分解される。
ヘパリナーゼIIIは、糖鎖をグルクロニド結合で切断する。一連のヘパリナーゼ酵素(I、IIおよびIII)はそれぞれ、ある特定のヘパラン硫酸配列を特定の硫酸化認識部位で解重合することにより比較的特異的な活性を示す。ヘパリナーゼIは、HS鎖に沿ってNS領域を伴うHS鎖を切断する。これにより、硫酸化ドメインの破壊が導かれる。ヘパリナーゼIIIは、NAドメインを伴うHSを解重合させ、その結果、炭水化物鎖が個々の硫酸化ドメインに分離する。ヘパリナーゼIIは、主に、変動する硫酸化パターンが見出されるHS鎖のNA/NS「肩」ドメインで切断する。注:ヘパランポリマーの反復二糖骨格は、アミノ糖グルコサミンと結合したウロン酸である。「NS」とは、アミノ糖がアミノ基上に硫酸を有し、C2、C6およびC3の他の基を硫酸化することが可能であることを意味する。「NA」とは、アミノ基が硫酸化されておらず、アセチル化されたままであることを示す。
本発明の医薬組成物および医薬は、HS9でコーティングおよび/または含浸されたバイオマテリアルの形態をとっていてもよい。インプラントまたはプロテーゼは、バイオマテリアルから形成されてもよい。こうしたインプラントまたはプロテーゼは、細胞の移植(transplantion)を補助するために外科的に埋め込まれてもよい。
HS9(好ましくは単離されたHS9)を含む培地は、いかなる種類であってもよいが液体またはゲルであることが好ましく、他の栄養素および増殖因子(例えば、ビトロネクチン)を含んでいてもよい。培地は、液体またはゲルへの再構成用の乾燥された形態、例えば、粉末(powered)形態で調製されてもよい。HS9は、好ましくは、微量でない量で存在することになる。例えば、培地中のHS9の濃度は、約1ng/ml培地から約1000ng/ml培地までの間の範囲に及びうる。好ましくは、培地中のHS9の濃度は、約500ng/ml以下、より好ましくは、250ng/ml以下、100ng/ml以下、90ng/ml以下、80ng/ml以下、70ng/ml以下、60ng/ml以下、50ng/ml以下、40ng/ml以下、30ng/ml以下、20ng/ml以下、10ng/ml以下、または5ng/ml以下のうちの1つである。
本発明者らの方法は、任意の選択されたタンパク質に結合するHSの単離を可能にする。これは、哺乳類またはヒト細胞外マトリクスタンパク質などの細胞培養基質として有用なタンパク質に結合するHSの単離を可能にする。
本明細書中に記載の細胞培養基質は、細胞、例えば幹細胞を培養する方法において使用してもよい。
in vitroおよびin vivoの両方の使用において、HS9は、約500ng/ml以下、より好ましくは、250ng/ml以下、100ng/ml以下、90ng/ml以下、80ng/ml以下、70ng/ml以下、60ng/ml以下、50ng/ml以下、40ng/ml以下、30ng/ml以下、20ng/ml以下、10ng/ml以下、5ng/ml以下のうちの1つ;または約100mg以下、50mg以下、40mg以下、30mg以下、20mg以下、10mg以下、5mg以下、4mg以下、3mg以下、2mg以下、または1mg以下の;または約0.3〜5μg/ml、0.3〜4、0.3〜3、0.3〜2.5、0.3〜2、0.3〜1.5、0.3〜1.0、0.3〜0.9、0.3〜0.8、0.3〜0.7、0.3〜0.6、0.3〜0.5、0.3〜0.4、1〜2、1〜1.75、1〜1.5、1〜1.25、1.25〜2、1.5〜2、または1.75〜2μg/mlの間の濃度または投与量で使用されうる。
ビトロネクチンは、細胞外マトリクスにおいて見出される糖タンパク質である。
in vitroおよびin vivoの両方の使用において、ビトロネクチンは、HS9と組み合わせて使用されてもよい。本発明の一部の細胞培養法において、外因性のHS2が培養物に添加される。
VN−HBDペプチド表面の調製
本発明者らの以前の研究におけるVN5プラットフォーム[18]に従って、本研究は、China peptides Co. Ltd, Chinaによって合成されたN末端ビオチン化VN−HBDペプチド(ビオチン−PRPSLAKKQRFRHRNRRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR)[48]を利用した。RGDモチーフを欠いているこのペプチドが、表面を覆った、ヘパリナーゼ処理hESCの接着効率を評価するために、最初にストレプトアビジンがコーティングされた表面上に固定化された[15]。ストレプトアビジン(Genescipt)が最初にPBSにおいて1mg/mlストックに再構成され、その後20μg/ml作用濃度として調製された。細菌性グレード(Bacterial grade)24ウェルプレート(Beckon Dickinson)が625μlの作用ストレプトアビジン濃度でコーティングされ、4℃で一晩インキュベートされた。次いでウェルがPBSで2回洗浄され、10μMのVN−HBDペプチドが室温で2時間インキュベートされ、その後、ウェルが再び洗浄され、10μM Rock阻害剤(Y27632)(Calbiochem)で補充された1mlのmTeSR(登録商標)1培地[49]がKlimらの方法に従って添加された[15]。コーティングされたプレートが、以前記載されたように直ちにクリスタルバイオレット細胞接着アッセイに使用された[18]。
細胞接着の研究のために細胞表面HSを効率的に除去するために、ヘパリナーゼI、IIおよびIIIが用いられた。ヘパリナーゼI(E.C.4.2.2.7)、ヘパリナーゼII(E.C.番号なし)およびヘパリナーゼIII(E.C.4.2.2.8)(Sigma Aldrich)が消化バッファー(20mMトリス−HCL、50mM NaCl、4mM CaCl2および0.01%BSA、pH7.5)に再懸濁され、1凍結融解サイクル内で使用された。ウェル当たり1×106細胞でのHES−3単一細胞がヘパリナーゼI(10ミリ国際単位(mIU))、ヘパリナーゼII(5mIU)およびヘパリナーゼIII(10mIU)を含有する100μlのDMEM/F12培地(Invitrogen)に再懸濁された。細胞懸濁液が10分毎に混合されながら、37℃で1時間インキュベートされた。次いで細胞が12,000rpmで回転され、表面HS発現がFACSによって分析された。可溶性ヘパリン(Sigma Aldrich)が細胞でプレインキュベートされ、ペプチド表面での表面に結合したHSへの競合物として役立った。同様に、細胞(1×106)が100μl DMEM/F12培地(Invitrogen)に再懸濁され、10分毎に混合されながら500μg/ml濃度での可溶性ヘパリンで1時間インキュベートされた。次いで細胞がクリスタルバイオレットアッセイでVN−HBD表面への結合に関して分析された。ヘパリナーゼ消化細胞および可溶性ヘパリンでインキュベートされた細胞の双方が、96ウェルプレートにおける調製された10μMのVN−HBDペプチド表面またはVN5陽性対照上に播種された[18]。プレートが、45分間インキュベートされて、接着が可能にされ、クリスタルバイオレット細胞接着アッセイが行なわれた。ストレプトアビジンがコーティングされた表面は、陰性対照として役立ち、データがVN5の吸光度に基準化された。
酵素消化がHES−3細胞からの外因性のHS鎖を効率的に除去したことを保証するために、10E4[50]と3G10[51]抗HS抗体の双方を使用したFACS分析が行なわれた。2.5×105の密度で消化された細胞が1%BSAで洗浄され、200μlの10E4または3G10(1:100)抗体(Seikagaku)がそれぞれのアイソタイプ対照(10μg/ml)(DAKO)に対して1時間追加された。次いで細胞が洗浄され、FITCがコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体(DAKO)(1:500)で30分間染色された。次いで外因性のHS発現がFACS Calibur(Becton Dickinson)を使用して決定され、結果がFlowJoソフトウェアで分析された。ゲーティングがアイソタイプ対照と10E4/3G10発現間の交差点で行なわれた。
ヘパリンへの合成されたVN−HBDペプチドの結合能力を確認するために、Bairdら[52]の様式で3H−ヘパリン結合アッセイが用いられた。簡潔に述べると、ビオチン化VN−HBDペプチドがPBSで連続的に希釈され(0、12.5、25、50および100μgペプチド)、0.2μMニトロセルロース膜(Biorad)上に個々にスポットされた。ペプチドが膜上に残されて乾燥され、80℃まで30分間加熱された。次いで膜がPBSで3回洗浄され、そこに4%BSA(Sigma Aldrich)中の1mlの0.1μCiの3H−ヘパリン(Perkin Elmer)が添加され、膜が一晩インキュベートされた。翌日、膜が3回洗浄され、1mlのUltima Goldシンチレーションカクテル(Perkin Elmer)が液体シンチレーションTri−carb 2800TRカウンター(Perkin Elmer)における分析で1分間添加された。
フロースルーにおけるA280nmでの結合していないペプチドの検出によって評価されるビオチン化VN−HBDペプチド(3mg)の飽和量が1mlストレプトアビジンカラム(GE Healthcare)に結合された。ペプチドが堅くカラムに結合していることを保証するために、1.5M高塩バッファー洗浄が行なわれた。HSトレース(A280nm)が検出されなかった場合、カラムは、HSローディングの前に低塩バッファーで平衡化された。
VNへの結合親和性に関して種々のHSバリアントを分析するために、ニトロセルロース膜がウェル中に添加されたTBSTおよびVN(1μg)ですすがれた。膜が5%BSAで1時間ブロックされた。GAG(2mg)が、1mlの0.1M MESバッファー、pH5.5に溶解されたビオチン−LC−ヒドラジド(60μlの2mg/ml溶液)(Thermo Scientific)を使用して、最初にビオチン化された。簡潔に述べると、EDC(1.5mg)が混合物に添加され、別の1.5mgのEDCの添加前に2時間インキュベートされ、その後取り込まれなかったビオチンがFast Desalting(PD10)カラム(GE Healthcare)で除去された。これらのビオチン化GAG(1μg)がドットブロット装置のウェル中に添加され、10分間置かれ、次いでピペットで吸引され、TBSTで洗浄された。ストレプトアビジン−HRP(2ml)が10分間添加され、洗浄され、LumiGLO化学発光基質(Kirkegaard & Perry Laboratories)に暴露され、X線フィルム(Amersham)に暴露された。
VNおよび他のECMタンパク質への各脱塩されたHSバリアント(ヘパリン、HSpm、HS9+veおよびHS9−ve)の結合親和性を調査するために、ヘパリン−セファロースビーズ競合アッセイがOnoら[53]に従って行なわれた。簡潔に述べると、アッセイが室温で行なわれ、反応当たり20μlのBiogel P10(Biorad)を有する20μlのヘパリン−セファロースビーズ(Sigma Aldrich)が使用された。ビーズスラリーの「マスターミックス」が、誤差を減少させるために調製された。マスターミックスが1mlの1%BSAで3回洗浄された。ビーズスラリーのアリコート(40μl)が結合実験のために個々の1.5mlエッペンドルフチューブ中に分離された。
このアッセイは、グリコサミノグリカン結合96ウェルプレート(Iduron)上へのHSバリアントの固定化および製造者の推奨に従って抗体を通して評価されるVN結合能力に基づいた。ウェルが、200μlの5 g/ml GAG(ヘパリン、HSpm、HS9+veおよびHS9−ve)、ヘパリン二糖標準(dp2からdp12)または標準アッセイバッファー(SAB;100mM NaCl、50mM NaAc、(v/v)0.2%Tween20、pH7.2)において調製された選択的に脱硫酸化されたヘパリン標準で室温で一晩インキュベートされた。次いでウェルが200μlのSABで3回洗浄され、37℃で1時間ブロックされた(SAB中の0.4%(w/v)アイシングラス)。ウェルがSABで3回洗浄され、種々の濃度(0〜1μg/ml、各200μl)のVNがウェル中に添加され、37℃で2時間インキュベートされた。ウェルが再び洗浄され、200μlの抗VN抗体(250ng/ml)(Millipore)が37℃で1時間添加された。ウェルが洗浄されて、結合していない抗体が除去され、200μlの250ng/mlヤギ抗マウスビオチン化抗体(Sigma Aldrich)が37℃で1時間添加された。インキュベーション後、ウェルが洗浄され、ExtrAvidin(200μlの220ng/ml)(Sigma Aldrich)が37℃で30分間添加された。最後に、ウェルが洗浄され(3回)、200μlのSIGMAFAST(商標)リン酸p−ニトロフェニル(Sigma Aldrich)が40分間添加された。比色吸光度が405nmでVictorマルチプレートリーダー(Perkin Elmer)で読まれた。
ヘパリン、HSpm、HS9+veおよびHS9−veバリアント(200μg)がヘパリナーゼI、IIおよびIII(Iduron)で全て消化されて(50mM NaAc、1mM酢酸カルシウムおよび100μg/ml BSA、pH7)、2mg/mlストックが得られた。ヘパリンが最初にそれぞれ4mIUのヘパリナーゼIおよびIIで30℃で3時間消化され、それから1mIUのヘパリナーゼIIで別の60分間消化された。HS試料が4mIUヘパリナーゼIで30分間消化され、4mIUヘパリナーゼIIおよびIIIで30℃で別の3.5時間消化された。232nmでの吸光度が消化プロセスを通して測定されて、完全な消化が保証された。反応が95℃で1分間変性させることによって終結された。
HSを化学的に固定化するために、NaOHがポリスチレン表面のエッチングのために用いられて、白壁透明底96ウェルTCPSプレート(Corning)においてカルボキシル基の最大数が暴露された[54]。4:1(v/v)NaOH(4N):メタノールの溶液が調製され、250μlが各ウェル中に指定された時点(0日から7日)で37℃で添加された。7日後、ウェルが10%クエン酸(Sigma Aldrich)で1時間洗浄され、後の3H−GAG移植アッセイに使用された。
様々なGAG(ヘパリン、HSpm、HS9+veおよびHS9−ve)の一級アミン含有量を比較するために、フルオレサミンタンパク質色素アッセイが利用された。フルオレサミン(Sigma Aldrich)(3mg/ml)の新鮮ストックが琥珀色のチューブ中で活発に混合されながらジメチルスルホキシド(DMSO)で調製された。2つのGAG濃度(0.5および1mg/ml)が利用された。GAG溶液(90μl)が30μlのストックフルオレサミン溶液に添加され、ピペッティングによって混合された。反応物は、15分間進行させておかれ、その後反応物は、徹底的に混合され、Infinite(登録商標)200 Multimode Microplate Reader(Tecan)を使用して読まれた。検量線がBSA(500μg/mlから)標準の2倍希釈から産出された。90μl標準が30μlの色素と室温で15分間混合され、読まれた。一級アミンの濃度が検量線との比較によって定量化された。
HSをNaOHがエッチングしたPSおよびTCPS表面上に物理的に連結するために、共有結合的固定化が探索された。ここで、1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)(Sigma Aldrich)が50mg/mlの作用濃度まで3H−リジン(Perkin Elmer)におけるアミンのクロスリンクに最適化された。これが0.1M MESバッファー、pH6に溶解され、200μlのこの溶液がホワイトウォール、透明底96ウェルTCPSプレート中に添加されて、撹拌されながら室温で1時間反応させられた。60分後、プレートが最初に0.1M MESバッファーで、次いで水でそれぞれ2回洗浄された。PBS(100μl)中の種々の濃度の3H−ヘパリンおよび3H−HS(0から100mg/ml)が3重のウェル中に添加され、撹拌されながら室温で2時間インキュベートされた。最後に、ウェルが10×PBSで2回(各10分)、水で1回(10分)、水でさらに3回(各5分)洗浄された。シンチレーション液(200μl)が各ウェル中に添加され、放射性カウント(1分)がMicroBetaカウンター(Perkin Elmer)上でモニターされた。
正に帯電した表面を作製する簡単な方法は、ポリ−L−リジン(PLL)でのコーティングによる。0.01%PLL溶液(Sigma Aldrich)(50μl)がホワイトウォール、透明底96ウェルTCPSプレートの各ウェル中にまたは300μlが24ウェルプレートの各ウェル中に撹拌されながら室温で5分間添加された。過剰な結合していないPLL溶液が除去され、表面がPBSで2回洗浄された。プレートが3時間風乾された。次いでポリ−L−リジンがコーティングされた正に帯電した表面がGAG(5μg/ml)の固定化および後の細胞培養に利用された。
ESC培養に関するPLL表面の適合性を保証するために、細胞接着アッセイがHES−3で行なわれた。PLLが予めコーティングされた24ウェルプレートがPBS中の400μlのGAG(ヘパリン、HSpm、HS9+ve、HS9−ve)(5 g/ml)で室温で2時間コーティングされた。ウェルがPBSで洗浄され、その後PBS中のVN2.5またはVN5(ウェル当たり300μl)で4℃で一晩コーティングされた。HES−3細胞が、常法に従って、MTeSR(登録商標)1培地(Stem Cell Technologies)においてVN5でコーティングされたTCPS上で維持された。分化した細胞が手動のピペッティングによって除去され、残りが機械的に解離された。細胞(3×105)が各試験ウェル中に播種され、細胞増殖が7日目の終わりに評価された。
負に帯電したGAGの静電気的な固定化のために正に帯電したTCPS表面を頑強に産出するために、アリルアミン単量体(Sigma Aldrich)を使用したプラズマ重合が用いられた[47]。ポリスチレンプレート(96ウェルまたは24ウェル)(SARSTEDT)およびアルミホイルがプラズマチャンバーに真空下で一晩置かれて、翌日のプラズマコーティングの前に全ての空気が除去された。反応器が5×10−2パスカル(5×10−4ミリバール)未満のベース圧力まで排気された。
(30秒の終わりでチャンバーを単離した後の圧力 − チャンバーを単離する前の圧力)/30*1251
次いでプラズマが13.56MHzおよび5ワットで無線周波発生器(Coaxial Power System Ltd)で点火された。プラズマが40分間オンにされ、その後チャンバーがベース圧力に汲み出され戻された。プレートが除去され、蓋が交換されて、無菌性が維持された。次いでこれらの無菌のプレートが細胞培養のためのGAGの固定化を伴う実験に使用された。チャンバーにおけるアルミホイルが、アルミニウムアノードおよびプレート上に沈着したアミンの密度を確認するためのワイドスキャン分析を備えたXPSによって読まれた。結果がCasaXPSソフトウェアで分析された。窒素:炭素(N:C)比がNおよびCピーク下の面積から計算されて、表面上のAAの相対量が取得された。様々な百分率のAAがコーティングされた96ウェルプレート上の固定化GAGが、GAG ELISAアッセイ方法を使用して、VNへのそれらの結合能力に関して分析された。
100%のAAが重合した96ウェルプレートに結合しているGAGの量を決定するために、3H−ヘパリン(Perkin Elmer)および3H−HSpm(RC TRITEC、Switzerlandによって放射標識された)を使用した結合アッセイが用いられた。上昇する濃度(0、1.25、2.5および5μg/ml)の90%の非標識ヘパリンまたはHSpm:10%の3H−ヘパリンおよび3H−HSpm放射性溶液の混合物がPBS中で調製された。各GAG溶液(200μl)が試験される表面(TCPS、PLL、AA)上で室温で一晩インキュベートされた。翌日、ウェルがPBSで洗浄され、200μlのシンチレーションカクテルが添加され、プレートがMicroBeta液体シンチレーションカウンターにおいてそれぞれ1分間3回読まれた。検量線が3H−GAGの既知量で産出され、ヘパリンおよびHSpmの表面密度が決定された。
種々の96ウェルプレート(HS9+veでコーティングされた、TCPS、PLL+HS9+veおよび100%のAAが重合した表面)に結合しているVNの量を定量化するために、AA+HS9+ve放射性標識されたVNが用いられた。表面がウェル当たり300μlで5μg/mlのHS9+veでコーティングされた。VNがヨウ素化ビーズ(Thermo Scientific)を使用して125Iアイソトープ(Perkin Elmer)で標識され、MicroBetaシンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で定量化された。
全てのデータ値が±標準誤差として全て3重で報告された。一元配置ANOVAが行なわれて、群にわたる相違が比較され、P<0.05が有意であるとみなされた。両側スチューデントT検定(two−tailed student’s t−test)が行なわれて、2つの試料群間の相違が決定された。Sigmaプロットソフトウェアを使用して、グラフがプロットされ、データが変換された。
表面ヘパラン硫酸は、VN−HBD基質への接着に重要である
内在性GAGはVNとの接着複合体の一部でありえたため、最初に、本発明者らは、細胞接着における表面HSの役割を調査しようと努めた。Braamらは、αVβ5インテグリンが、hESCが全長VNに接着するために必要であることを以前示した[12]。Klimらによる研究も、表面GAGが、コンドロイチナーゼ(chrondroitinase)ABCでの消化後にhESCがRGDモチーフを欠いているVN−HBDを結合することができるために重要であることを実証した。しかしながら、コンドロイチナーゼABCは、幹細胞表面上で最も豊富なGAG、HSよりも、コンドロイチン硫酸(CS)を主に消化する。したがって、VNがコーティングされたTCPSへの細胞接着に関する表面HSの機能的役割を調査するために、酵素ヘパリナーゼI、IIおよびIIIが最初に使用されて、内在性細胞表面GAGが特異的に消化された。組合せで使用された場合、酵素は、>90%の内在性HSを除去することができる[56]。消化後、細胞がFACSによって分析されて、10E4と3G10抗体の双方で表面HSがないことが確認された(図1)。10E4抗体は、インタクトなHSに結合し、3G10抗体は、脱重合されたHS鎖に結合する。消化前、細胞は、高レベル(>90%)のインタクトな10E4反応性HSおよび低レベル(<2%)の消化された3G10反応性HSを発現した。ヘパリナーゼ消化後、インタクトなHS鎖が除去され、細胞表面上の>95%の3G10反応性不飽和化ウロン酸残基が明らかになった(図1a〜d)。これは、ヘパリナーゼ消化後に内在性HSがないことを確認した。
次に本発明者らは、増加したVN結合親和性を有するHSバリアントを単離した。合成されたビオチン化VN−HBDペプチドのヘパリン結合能力を確認するために、3H−ヘパリン結合アッセイが最初に行なわれた[52]。データは、ペプチドが濃度依存的に3H−ヘパリンに結合することができたことを示し(図2a)、VNにおけるこの配列が実際にヘパリン結合性であり、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用されるであろうことを示唆している。最初に、カラムが、過剰なペプチド(緑色トレース)が280nmでのフロースルーにおいて観察されるまでビオチンペプチドで飽和させられた(図11)。カラムが、HSpmの市販の製剤のローディングのための準備として低塩バッファーで平衡化された(図2b)。ペプチドに結合しなかったフロースルーHS(青色トレース)は、HS9−veと命名された。結合したバリアントが、一段階1.5M NaCl溶出(赤色トレース)を使用してカラムから溶出され、HS9+ve(青色トレース)として回収され、脱塩された。100mgの出発HSpmから、19.6mg(19.6%)のHS9+veおよび43.4mg(43.4%)のHS9−veが単離された;重量の残りは、NaClによって構成された。興味深い所見は、高塩洗浄中にHS9+veの最大溶出に達するための遅延時間の存在であった。これは、HS9+veを含む高から低結合親和性種の不均一な集団があることを示唆した。次に、VNへのHS9+veおよびHS9−veバリアントの結合能力が決定された。
ヘパリン、出発物質(HSpm)、ならびに結合したおよび結合していないバリアントの結合親和性をさらに調査するために、ドットブロッティング、ヘパリン−セファロースビーズアッセイおよびGAGマイクロタイタープレートアッセイが行なわれた。これらのアッセイは、VNまたはGAGを固定化することまたはヘパリンビーズへのVN結合に関する競合によってそれらのVN結合親和性を評価するための種々の戦略を使用した。
ニトロセルロース−固定化VN、後のビオチン化GAGを使用した免疫ブロットが使用されて、各HSバリアントの結合能力が検証された。陰性対照においてスポットがないことによって示されるように、GAGの非特異的結合は、検出されなかった、(図3a)。陽性対照では、ヘパリンは、VNに強く結合することが見出され、フィルム上の強いスポットを作製した。HS9+veは、HS9−veバリアントよりもよくVNに結合し、HSpmは、中間の結合能力を有することが見出された。本発明者らは、HSpmが陽性および陰性HSの混合物、したがって高度に可変性の程度の結合能力を含有することを推測していたので、これは、予測されていた。
このアッセイは、HSバリアントがヘパリンビーズへのVNの結合を阻害する能力を測定する。極端な負電荷を有するヘパリンは、最も高い親和性でVNに結合する。したがって、VNに関するヘパリンの結合能力が種々のHSバリアントで検証された。VNがヘパリンビーズにまさに結合したことを確認するため、および好適な作用濃度を決定するために、様々な量のVNが利用され(0〜80ng)、このELISA方法を使用して検出された。VN飽和曲線は、それが40ngで生じる最大の結合で濃度依存的に結合したことを明らかにした。曲線から同定された最適以下のVN量は、20ngであった(補足図2a)。次いでVN(20ng)からの吸光度が100%結合したレベルとして使用された。
HS9バリアント結合親和性のさらなる検証を提供するために、VNへのGAG結合に基づくELISAが用いられた;最初の実験は、プレート表面を完全に飽和させるのに必要なヘパリン、HSpm、HS9+veおよびHS9−veの濃度を最適化するように設計された。ウェルが1、5および10μg/mlの各GAGでコーティングされ、VNへの結合親和性が探索された(図14)。データは、5μg/mlのGAG溶液がウェルを完全に飽和させるのに十分であることを明らかにした;したがって、この飽和濃度が実験の残りの部分に使用された。
この技法は、サイズおよび電荷に基づいて個々の二糖を分離する。7ヘパリン二糖標準の分離が完了され、図4aに示されている。Δ−二糖標準IS命名は、2O−、6O−およびN−硫酸化を含有するΔUA2S(1→4)−D−GlcNS6Sを表し;IISは、6O−およびN−硫酸化を含有するΔUA(1→4)−D−GlcNS6Sを表し;IIISは、2O−およびN−硫酸化を含有するΔUA2S(1→4)−D−GlcNSを表し;IVSは、N−硫酸化のみを含有するΔUA(1→4)−D−GlcNSを表し;IAは、2O−および6O−硫酸化を含有するΔUA2S(1→4)−D−GlcNAc6Sを表し;IIAは、6O−硫酸化のみを含有するΔUA(1→4)−D−GlcNAc6Sを表し、IIIAは、2O−硫酸化のみを含有するΔUA2S(1→4)−D−GlcNAcを表す。元素構造は、Ruiz−Caleroらにおいて表されている[57]。
次に、共有結合的および静電気的な方法を使用した、細胞培養のための無修飾VNの提示のためにHS9+veを表面上に効率的に固定化するための戦略が探求された。
次にNaOHが、表面をエッチングして、低カルボキシル化ポリスチレン(PS)表面上に遊離のカルボキシル基を作製するために利用された。表面上へのHS中の一級アミン基のカップリングがEDC化学的方法で達成された(図5a)。EDC化学的方法が二糖単位をそれらの遊離のアミン末端を通して表面カルボキシル基に繋ぎ止めるために使用されうることがPlanteらによって以前示された[42]。
次に、負に帯電したHSと正に帯電した表面の間の静電相互作用を利用する戦略が用いられた。ポリ−L−リジン(PLL)は、幹細胞の多くの型のための基質として成功的に使用されてきたが、TCPS上のhESCのためには使用されてきていない[59〜61]。したがって、こうした表面を試験するために、PLLがコーティングされたTCPSプレートが種々の濃度の3H−ヘパリンおよび3H−HSpmでのコーティングに一晩供された(図5c)。次いで、各GAGの表面密度が決定された:1μgの3H−GAG溶液は、2μgの3H−ヘパリンおよび3H−HSpmでの、それぞれ、約800ng/cm2および400ng/cm2まで増加する密度で約200ng/cm2の表面密度を産み出した。観察された3H−ヘパリンのより高い密度は、そのより高い全体的な負電荷のためであった。興味深いことに、表面密度の相違は、2μgでのみヘパリンおよびHSpmにおいて観察され、より低いGAG濃度でのPLL表面上へのGAGの下位の結合を示唆している。したがって、その後、2μgがPLL表面上でのGAGの固定化に使用された。
前の2つの方法が、操作された基質に必須である主要な必要条件(コスト、単純性、安全性および有効性)に対処することに失敗したため、別の表面がGAGを長期細胞増殖のために固定化するために明確に必要であった。本発明者らは、プラスチック表面上へのアリルアミン(AA)単量体のプラズマ重合が、GAGを効率的に固定化することができることを以前報告した[47]。AA単量体は、正に帯電しており、表面上に重合した場合、表面に超過時間持続する正味の正電荷を与える[62]。
本発明者らの以前の研究[18]は、VN吸着TCPS表面上でのhESCの成功的な維持のための閾値密度が250ng/cm2であることを実証した。ここで、問題は、VNへの調整された親和性を有するHSがVNを効率的に捕らえ、提示するための基質として使用されうるかどうかになった。TCPS、AA+HS9+veおよびPLL+HS9+ve基質上のVNの表面密度が測定され、比較された。増加する濃度(0、1.25、2.5および5μg/ml)の125I−VNが種々の表面上でインキュベートされ、量がシンチレーションによって測定され、検量線と比較された(図6d)。全ての表面は、125I−VNの結合の濃度依存的増加を示し、最も低いVN表面密度がPLL+HS9+ve表面上で記録され、最も高いVN表面密度がTCPS表面上で記録された。PLL+HS9+ve表面上で細胞が接着し、増殖するための不十分なVNが表面上にあり、これは、おそらく、図5dにおいて見られたHES−3細胞応答を説明している。
連続的な培養のためのAA+GAG+VNからなる基質コーティングの適合性を決定するために、hESC(HES−3)増殖が7日の期間にわたって評価された。AAおよびGAG(ヘパリン、HSpm、HS9+veおよびHS9−ve)で予めコーティングされた表面が2μg/mlのVN溶液濃度(VN2)を固定化するために使用された。7日後に撮影された顕微鏡写真は、VN2上での細胞接着および増殖がヘパリンおよびHS9+veの予めコーティングでのみ支持されたことを明らかにした(図7aおよびc)。明確に、HSpmおよびHS9−ve基質と比較してより高い量のVNがヘパリンおよびHS9+ve基質上で吸着した(図7bおよびd)。このバイオアッセイは、アフィニティークロマトグラフィーが、より高いVN結合親和性を有する「調整」HSを低結合HS9−veおよび中間結合HSpmから分離することができたことを確認した。ヘパリンは、広範囲のECMタンパク質に強く結合するため、それは、実験のための陽性対照として利用された。ヘパリンは、HES−3細胞を低VN濃度(VN2)で支持することができるが、それは、その有害な臨床的副作用のために、将来の療法のための好適な予めコーティングではない[23]。
VN−HBDペプチドアフィニティークロマトグラフィーを経たVN結合HSバリアントの単離は、本発明者らが新規なhESC培養プラットフォームを操作することを可能にした。種々のバリアントの結合能力がドットブロット、ELISAおよびヘパリンビーズ競合アッセイの組合せを使用して比較された。VN結合へのHS9+veバリアントの明らかな特異性を調べるために、それは、LNおよびFNの結合と比較された。共に、これらの結果は、HS9+veバリアントが相対的特異性で、HSpmおよびHS9−veバリアントよりも確実によりよくVNを結合することを確認した。この結果は、特異的な基質の範囲を産出するために他のECMタンパク質に調整されたHSバリアントのライブラリーを単離する可能性を示唆している。HS9+veにおける異なる種を分離するための異なるモル濃度バッファーでの段階的な溶出を伴う、アフィニティークロマトグラフィー中の溶出バッファーへの改変が、将来の可能性である。
(参考文献)
Claims (27)
- ヘパラン硫酸HS9。
- 単離されたまたは実質的に精製された形態のヘパラン硫酸HS9。
- 前記HS9が、アミノ酸配列PRPSLAKKQRFRHRNRRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR(配列番号1)もしくはPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR(配列番号3)を有する、またはからなる、ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある、請求項1または2に記載のヘパラン硫酸HS9。
- ヘパリンリアーゼI、IIおよびIIIでの消化ならびに次いで結果として生じる二糖断片のキャピラリー電気泳動分析の後に、以下を含む二糖組成:
- (i)アミノ酸配列PRPSLAKKQRFRHRNRRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRまたはPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRを有するヘパリン結合ドメインを含むポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意するステップ、
(ii)前記ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させるステップ、
(iii)前記混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離するステップ、
(iv)前記ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させるステップ、
(v)解離された前記グリコサミノグリカンを回収するステップ
を含む方法によって得られる、請求項1から4のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸HS9。 - グリコサミノグリカンを含む前記混合物が、ブタ腸粘膜から得られるヘパラン硫酸製剤である、請求項5に記載のヘパラン硫酸HS9。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸HS9を含む組成物。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸HS9を含む医薬組成物または医薬。
- ビトロネクチンタンパク質をさらに含む、請求項8に記載の医薬組成物または医薬。
- 医療の方法における使用のための、請求項8または9に記載の医薬組成物または医薬。
- 医療の方法における使用のための、請求項1から6のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸HS9。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のHS9を含む細胞培養基質を有する細胞培養物品または容器。
- 細胞培養表面の少なくとも一部がHS9でコーティングされている、請求項12に記載の細胞培養物品または容器。
- ビトロネクチンをさらに含む、請求項12または13に記載の細胞培養物品または容器。
- 細胞培養基質を形成する方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載のHS9を細胞培養支持体表面に適用するステップを含む前記方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のHS9を含む細胞培養基質と接触している細胞を含む、in vitroの細胞培養物。
- 前記細胞培養基質がビトロネクチンをさらに含む、請求項16に記載のin vitroの細胞培養物。
- 細胞を培養する方法であって、in vitroで請求項1から6のいずれか一項に記載のHS9を含む細胞培養基質と接触している細胞を培養するステップを含む前記方法。
- 前記細胞培養基質がビトロネクチンをさらに含む、請求項18に記載の細胞を培養する方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸HS9を含む培地。
- バイオマテリアルおよび請求項1から6のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸HS9を含む生体適合性のインプラントまたはプロテーゼ。
- 生体適合性のインプラントまたはプロテーゼを形成する方法であって、バイオマテリアルを請求項1から6のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸HS9でコーティングするまたは含浸させるステップを含む前記方法。
- ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸を含む細胞培養基質を有する細胞培養物品または容器であって、前記ペプチドまたはポリペプチドが前記単離されたヘパラン硫酸と接触している前記細胞培養物品または容器。
- 前記ペプチドまたはポリペプチドが細胞外マトリクスタンパク質、またはそれに由来するペプチドである、請求項23に記載の細胞培養物品または容器。
- 細胞培養基質を形成する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドを細胞培養支持体表面に結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸を適用するステップおよび前記単離されたヘパラン硫酸を前記ペプチドまたはポリペプチドと接触させるステップを含む前記方法。
- ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸を含む細胞培養基質と接触している細胞を含むin vitroの細胞培養物であって、前記ペプチドまたはポリペプチドが前記単離されたヘパラン硫酸と接触している前記in vitroの細胞培養物。
- 細胞を培養する方法であって、前記方法がペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸を含む細胞培養基質と接触している細胞をin vitroで培養するステップを含み、前記ペプチドまたはポリペプチドが単離されたヘパラン硫酸と接触している前記方法。
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