JP2016518319A - アブレーション免疫療法 - Google Patents

Abstract

本明細書における開示は、一般には、免疫療法に関し、さらに具体的には、腫瘍および病原体感染組織を処置するための免疫療法の使用に関する。この免疫療法は、Ｔｈ１媒介性機構によって拒絶されるように設計された同種異系細胞で患者を最初にプライミングする工程、次いで腫瘍または病原体感染病変においてインサイチュの壊死またはアポトーシスを誘導する工程に関する。壊死またはアポトーシスは、腫瘍または病原体感染組織の少なくとも一部に対して適用された凍結療法、不可逆的エレクトロポレーション、化学療法、放射線療法、超音波療法、エタノールケモアブレーション、マイクロ波サーマルアブレーション、高周波エネルギーまたはそれらの組み合わせなどの方法によって誘発され得る。従って、１回以上の用量の同種異系細胞（例えば、Ｔｈ１細胞）を、プライミングされた患者の腫瘍または病原体感染組織内にまたはその近位に送達する。本発明は、腫瘍または病原体に対する新しい全身性の（適応的）免疫を発達するための免疫療法的ストラテジーを提供する。【選択図】なし

Description

本開示は一般には、免疫療法に関し、さらに具体的には、腫瘍および病原体感染組織を処置するための治療方法および組成物に関する。

慢性の感染性疾患または癌を処置するための免疫系の力を利用することが、免疫療法の主な目的である。活性な免疫療法処置は、免疫系を活性化して、腫瘍または病原体感染細胞を特異的に認識し、かつ破壊するために設計された方法である。２００年以上にわたって、能動的免疫療法のアプローチを用いて、天然痘、狂犬病、腸チフス、コレラ、ペスト、はしか、水痘症、流行性耳下腺炎、ポリオウイルス感染症、Ｂ型肝炎および破傷風を含む多数の感染性疾患ならびにジフテリア毒素を防いできた。

能動的免疫療法の概念は現在、既存の腫瘍を処置するか、または腫瘍の再発を防止するという本発明の治療的癌ワクチンを開発するために、ならびに慢性のウイルス感染の処置および予防のために適用されている。これらの技術の多くは、腫瘍または病原体感染細胞を特異的に殺傷する能力を有する、循環中の免疫細胞の影響の増大を首尾よく発達させることが証明されている。しかし、腫瘍抗原に対して反応性の免疫細胞を生成する能力にかかわらず、腫瘍の逃避機構は、この免疫応答を圧倒して、最終的な腫瘍の進行を生じ得る。

癌の能動的な免疫療法は、多数のげっ歯類モデルで極めて有効であることが証明されている。しかし、数十年間のヒトでの種々のタイプの免疫療法の臨床試験における臨床上期待を裏切る結果により、ヒトでの免疫系は、ヒトの癌細胞の脅威／危険を知覚せず、同様に同じ疾患のげっ歯類モデルの免疫系も知覚しないことが示される。

同じことが慢性のウイルス感染にもあてはまる。先天性の免疫応答は、ウイルス複製を遅らせ、かつ抗ウイルスタンパク質の合成を誘発するサイトカインを活性化することができる。適応的な免疫系は、ウイルス粒子を中和して、感染した細胞を破壊する。しかし、ウイルスは、多数の対抗手段を発達させて、免疫の攻撃を回避し、免疫系にとっては動き続ける標的である。

米国特許第６，８７５，８４９号 米国特許第６，７９７，４８０号 米国特許第６，１８７，３１２号 米国特許第６，１６２，４３６号 米国特許第６，１３９，８４１号 米国特許第６，１３６，３１５号 米国特許第５，８３７，２５１号

腫瘍およびウイルスの免疫回避機構を克服し、ヒト免疫系を訓練して、ヒト癌細胞およびウイルス感染細胞の脅威／危険性を知覚させることができる能動的免疫療法を提供して、腫瘍または病原体感染細胞を、それらが身体のどこに位置しようと、根絶させ得る免疫応答を生じることが必要である。

要旨
本開示は、腫瘍または病原体に対する全身性の適応的免疫応答を誘発するための方法および組成物に関する。この方法は、同種異系細胞療法と、腫瘍または病原体感染組織を細胞損傷に供するための方法との組み合わせを用いて、腫瘍特異的抗原（単数または複数）または病原体特異的抗原（単数または複数）の解放を生じる。

一局面では、本開示は、被験体において腫瘍または病原体に対する適応的免疫応答を誘導するための方法である。この方法は、以下の工程を包含する：（１）癌または感染性疾患を有する被験体に対して、被験体の免疫系によって拒絶されるように設計されている同種異系細胞のアリコートを、抗同種異系Ｔｈ１免疫を誘発する方式で投与する工程と；（２）同じ被験体において、抗同種異系Ｔｈ１免疫記憶を形成することを可能にする時間（約７〜１４日）の後、アブレーション法を用いてアクセス可能な腫瘍病変または病原体感染組織のインサイチュアブレーションを行い、これによって、腫瘍または感染した組織の少なくとも一部が、好ましくは壊死によって（例えば、限定するものではないが、エレクトロポレーション、冷凍アブレーション、化学療法、放射線療法、超音波療法、エタノールケモアブレーション、マイクロ波サーマルアブレーション、高周波エネルギーまたはそれらの組み合わせなどの方法によって）死滅するようにする工程と；次いで；（３）好ましくは、アブレーション工程の２〜２４時間後に、同じ同種異系細胞の第二のアリコートを病変内に（プライミングするために用いられるのと同じ細胞）注入して、抗原（単数または複数）の取り込みおよび壊死またはアポトーシス組織に対して応答する、宿主抗原提示細胞（すなわち、樹状細胞）の引き続く成熟に対してアジュバントとして機能する免疫応答を作成する工程。次いで、病変由来の成熟抗原提示細胞は、リンパ節に遊走して、全身性の抗腫瘍または抗病原免疫を刺激する。別の局面では、プライミング工程は省略される。腫瘍由来の組織または病原体感染組織を、インサイチュでアブレーションして、同種異系細胞のアリコートをアブレーションの後に注射して、所望の免疫応答を生成する。

別の局面では、本開示は、腫瘍または病原体に対する患者用のワクチンを包含する。このワクチンは、腫瘍または病原体由来の抗原性物質、および同種異系細胞のアリコートを含む抗原性組成物を含み、ここでこの患者に対する抗原性組成物の投与は、拒絶反応を生み出し、かつ抗原に対する遅延型の過敏応答を刺激し、それによって患者における全身性の抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激に対するアジュバントとして機能する。このワクチンはまた、プライミング組成物であって、同種異系細胞のアリコートを含むプライミング組成物を含んでもよい。

なお別の局面では、本開示は、患者にワクチン接種する方法を包含する。この方法は、以下の工程：（１）癌または感染性疾患を有する被験体に対して、抗同種異系Ｔｈ１免疫を誘導する方式で、被験体の免疫系によって拒絶されるように設計されている同種異系細胞のアリコートを誘導するプライミング組成物を投与する工程と；（２）同じ被験体において、抗同種異系Ｔｈ１免疫記憶を発達させることを可能にする時間（約７〜１４日）の後、好ましくは感染したまたは癌性の組織の同じ個々の自家移植溶解液から、好ましくはシャペロンタンパク質を含む溶解液、および同種異系細胞（患者をプライミングするために用いられる同じ細胞）のアリコートで処方されたこのような溶解液を含んでいる、腫瘍抗原または病原体抗原の供給源（例えば、弱毒化ウイルス、腫瘍溶解液、熱ショックタンパク質）を含んでいる抗原性組成物を、好ましくは経皮的に注射して、拒絶反応を生じ、かつ全身性の抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激をアジュバントするように機能する同種抗原に対する遅延型の過敏反応を刺激する工程、を包含する。さらなる局面では、この方法は、プライミング工程なしで行われてもよい。

別の局面では、本開示は、インサイチュで生成された腫瘍抗原または病原体抗原、および同種異系細胞を含んでいる、患者中の腫瘍または病原体を処置するための治療組成物を包含し、ここでこの同種異系細胞およびインサイチュで生成された抗原は、免疫応答を誘発し、それによって患者の抗原提示細胞の引き続く成熟が、全身性に、抗腫瘍または抗病原体免疫を刺激する。この腫瘍抗原または病原体抗原は、腫瘍の壊死または病原体感染組織からインサイチュで生成される。この治療用組成物はまた、同種異系細胞を含んでいるプライミング組成物を包含し得る。このプライミング組成物中の、および抗原性組成物中の同種異系細胞は、約１×１０^８〜約１×１０^１０個の細胞を含み得る。

なおさらなる局面では、本記述には、腫瘍抗原または病原体抗原を含む、インサイチュで生成された抗原、および同種異系細胞を含んでいる、患者の腫瘍または病原体を処置するためのワクチン組成物であって、ここで、インサイチュで生成された抗原の存在下で同種異系細胞を患者に注射することで、免疫応答を生じ、それによって患者の抗原提示細胞の引き続く成熟が、全身的に抗腫瘍または抗病原体免疫を刺激するワクチン組成物を包含する。組成物中の腫瘍抗原は、腫瘍のインサイチュの壊死に由来する。組成物中の病原体抗原は、病原体感染組織のインサイチュの壊死に由来する。この組成物はまた、同種異系細胞を含んでいるプライミング組成物を包含し得る。プライミング組成物中の、およびワクチン組成物中の同種異系細胞は、約１×１０^８〜約１×１０^１０細胞を含んでもよい。

さらなる局面では、本開示は、患者にワクチン接種する方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：（１）癌または感染性疾患を有する被験体に対して、抗同種異系Ｔｈ１免疫を誘導する方式で、被験体の免疫系によって拒絶されるように設計されている同種異系細胞のアリコートを含むプライミング組成物を投与する工程と；（２）同じ被験体において、抗同種異系Ｔｈ１免疫記憶を発達させることを可能にする時間（約７〜１４日）の後、腫瘍または病原体感染組織をインサイチュでアブレーションして、腫瘍抗原または病原体抗原を遊離する工程と、（３）同種異系細胞（患者にプライミングするために用いられる同じ細胞）の組成物を投与して、全身性の抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激をアジュバントするように働く同種抗原に対する拒絶反応を生成し、遅延型過敏性反応を刺激する工程と。さらなる局面では、この方法は、プライミング工程なしで行われてもよい。

例示的な実施形態の詳細な説明
本開示は、患者における抗腫瘍または抗病原体免疫を刺激するための方法を包含する。この方法は、同種異系細胞のアリコートの注入によってＴｈ１抗同種抗原免疫記憶を発達させるために患者の最初の「プライミング」を包含する。同種異系細胞の注入が、患者の免疫系を刺激して、同種異系細胞に対して反応することが所望される。患者の免疫系が抗同種異系記憶を形成することが可能になるまで、時間間隔が経過される。いくつかの実施形態では、患者は、適切なＴｈ１免疫記憶を発達させるために同種間細胞のブースターを必要とする場合がある。

本明細書において用いられる患者とは、マウスだけでなく、ヒトも包含する。Ｔｈ１応答とは、本明細書において用いる場合、Ｔ細胞およびマクロファージを活性化するサイトカインプロフィールの生成を指す。Ｔｈ１応答とは、抗体に依存して主に免疫応答を活性化し、Ｔｈ１応答とは対立する、Ｔｈ２応答とは区別されるべきである。

次の工程は、患者が十分な抗同種異系Ｔｈ１免疫記憶を発達した後の、腫瘍床または病原体感染組織内の細胞の損傷および／または死滅を包含する。組織損傷または死滅は、細胞成分を放出し、かつ損傷部位へスカベンジャー細胞を補充する。壊死による組織損傷または組織死滅の間の細胞成分の放出は、腫瘍または病原体抗原のインサイチュ生成のために重要である。腫瘍床または病原体感染組織内で組織の損傷または死滅を生じるためには種々の方法が当該分野で公知である。好ましくは、死亡は壊死によるものであり、これは損傷部位へのスカベンジャー細胞の補充を生じる。いくつかの好ましい実施形態では、組織の死滅または損傷は、冷凍アブレーションによるか、または不可逆的エレクトロポレーションによる。あるいは、組織は、エキソビボでアブレーションされ、放出された成分が患者に注入される。

未熟な樹状細胞を含むスカベンジャー細胞は、損傷組織または死滅組織から放出された抗原をピックアップし得る。同種異系細胞の第二のアリコートを、病変内に注射して、抗原に対するＴｈ１免疫のプライミングのための樹状細胞（ＤＶ）の成熟を生じる。病変内にとは、注射を通じるか、そうでなければ癌性の領域または腫瘍または病原体感染組織へ直接の本発明の組成物の投与を意味する。好ましい実施形態では、患者に投与される同種異系細胞の全てが、同じ供給源由来である。好ましくは、同種異系細胞は、組織のアブレーションの後およそ２〜２４時間の間に投与される。この方法は特に固体または転移性腫瘍の処置において、特に前立腺、乳房、骨、肝臓、肺または腎臓に腫瘍病変を有する患者において、有用である。

第一のアリコートによって誘導される同種異系細胞に対するＴｈ１免疫に対して患者がプライミングされたという事実に起因して、同種異系細胞の拒絶を生じる、同種異系細胞の第二のアリコートの導入の際に、強力な遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を発症することが患者には望ましい。抗同種抗原ＤＴＨ反応のバイスタンダー効果は、ＤＣを生じるように働く「危険シグナル（ｄａｎｇｅｒ ｓｉｇｎａｌｓ）」を生じ得、損傷された組織から抗原を収集してプロセシングして、成熟させて流入領域リンパ節へ遊走させる。組織損傷の誘導およびＤＴＨ拒絶反応の組み合わせは、炎症性の環境を生じ得、これが損傷された組織から放出された抗原に対するＴｈ１免疫を導く。

処置プロセスによって生じる炎症の一般的状態は、損傷された組織中の抗原に対するＴｈ１免疫に対してＤＣがＴ細胞をプログラムするように機能し得、腫瘍または病原体感染細胞に対する全身の適応的免疫応答、ならびに腫瘍および病原体媒介性の免疫回避機構の無力化を生じる。適応的免疫とは、患者の防御が抗原に対する暴露後にＢ細胞およびＴ細胞によって媒介されること、ならびにこのような防御が、特異性、多様性、記憶および自己／非自己認識を示すことを意味する。このような適応的免疫とは、患者内で全身性である。適応免疫は、非特異的であって、かつ抗原に対する暴露の前に存在する、先天性免疫とは区別されるべきである。

いくつかの実施形態では、アブレーションに続いて、同種異系細胞の投与は、所望の応答を生じるのに十分であり得る。言い換えれば、同種異系細胞の第一のアリコートによる患者のプライミングは、省略されてもよい。これらの実施形態では、腫瘍由来の組織または病原体によって感染された組織は、アブレーションされて、続いて同種異系細胞のアリコートを注射される。

本発明はまた、癌細胞または感染された組織を有する患者にワクチン接種する方法を包含する。この方法を用いて、同種異系細胞の投与と組み合わせて、癌細胞または感染した組織由来のインサイチュで生成された抗原を用いて患者にワクチン接種してもよい。この方法はまた、血液学的悪性腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、および非ホジキンリンパ腫）またはウイルス感染性疾患（例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎、ＨＩＶ）および罹患した病変がアブレーションのために容易にアクセスできない他の障害を有する患者にも用いられ得る。

この方法は、同種異系細胞の第一のアリコートの注入によってＴｈ１抗同種抗原免疫記憶を発達させるための患者の第一の「プライミング」を包含する。同種異系細胞の注入は、患者の免疫系を刺激して同種異系細胞に対して反応させることが所望される。患者の免疫系が抗同種異系記憶を形成することが可能になるまで、ある期間が経過させられる。いくつかの実施形態では、患者は、適切なＴｈ１免疫記憶を発達させるために同種異系細胞のブースターを必要とし得る。

次の工程は、本明細書に記載される活性化された同種異系細胞に加えて、癌性細胞または病原体感染組織由来の抗原に対して患者の免疫系を暴露する工程を包含する。好ましい実施形態では、この抗原は、癌性細胞／腫瘍または病原体感染組織のアブレーションによってインサイチュで生成される。腫瘍または病原体感染組織のインサイチュアブレーションによって、患者における腫瘍抗原または病原体抗原の放出が生じる。病変の部位での同種異系細胞の引き続く投与は、患者で拒絶反応を生じること、および抗原に対する遅延型過敏反応を刺激することによって所望の免疫応答を生じる。アブレーションは、冷凍アブレーション、エレクトロポレーションまたは腫瘍もしくは病原体感染組織の壊死性の死滅を生じる他の手段によってもよい。

他の実施形態では、プライミング工程の後、この方法は、癌性細胞または感染された組織由来の抗原を含んでいる自家の溶解液を含む抗原性組成物を患者に投与する工程を包含し得る。この組成物はまた、同種異系細胞、すなわち、プライミング工程で用いられる同種異系細胞と同じ供給源由来の同種異系細胞のアリコートも含む。抗原性組成物の注射は、患者における拒絶反応を生じ得、かつ抗原に対する遅延型過敏性反応を刺激し得る。

未熟な樹状細胞を含むスカベンジャー細胞は、インサイチュアブレーションから、または自家の溶解液から生じる抗原をピックアップし得る。同種異系細胞は、抗原へのＴｈ１免疫のプライミングのための樹状細胞の成熟を生じ得る。患者が、プライミング工程の間に同種異系細胞の最初のアリコートによって誘導される同種異系細胞に対してＴｈ１免疫をプライミングしたという事実に起因して、壊死性病変の部位で同種異系細胞の誘導の際に強力なＤＴＨ反応を発達させることがその患者には望ましい。

処置プロセスによって生じる炎症の一般的な状態は、アブレーション部位で抗原に対するＴｈ１免疫に対してＤＣがＴ細胞をプログラムするように機能し得、腫瘍または病原体感染細胞に対する全身性の適応的免疫応答、ならびに腫瘍および病原体媒介性の免疫回避機構の無力化を生じる。

本開示はまた、弱い免疫原性または非免疫原性の腫瘍の免疫原性を増強するための方法、および非防御的な免疫応答（例えば、Ｔｈ２応答）から防御性の免疫応答（例えば、Ｔｈ１）へ免疫応答を偏向させる方法を提供する。このような疾患としては、例えば、全ての種類の癌、および種々の病原体（例えば、肝炎ウイルス、真菌感染、例えば、アスペルギルス、ＨＩＶ、マラリア、腸チフス、コレラ、ヘルペスウイルス、クラミジアおよびＨＰＶ）での感染によって生じる疾患が挙げられる。

本開示はまた、患者で腫瘍または病原体を処置するための治療組成物を包含する。この治療組成物は好ましくは、インサイチュで生成された同種異系細胞および抗原を含み、これは、腫瘍壊死または病原体感染組織の壊死の生成物を含む。治療用組成物はまた、プライミング組成物を含んでもよい。このプライミング組成物は一般には、同種異系Ｔｈ１免疫を誘導する方式で、患者の免疫系による拒絶反応を生成するために患者に注入される同種異系細胞を含む。

この治療用組成物は、腫瘍または病原体感染組織由来の抗原性物質および同種異系細胞のアリコートを含む。好ましい実施形態では、この抗原性物質は、癌性細胞由来または感染性組織由来の抗原を含んでいるインサイチュで放出された抗原性物質である。この抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織の壊死からインサイチュで誘導され得る。好ましくは、抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織のアブレーションに由来する。

アブレーションは、インビボで行われても、インサイチュで行われても、またはエキソビボで行われてもよい。いくつかの実施形態では、抗原性物質は、腫瘍由来の組織または病原体感染組織のアブレーションの際に放出される熱ショックタンパク質を含む。

治療用組成物はまた、同種異系細胞を含む。インサイチュで生成された抗原性物質による実施形態では、治療用組成物は、インサイチュで生成された抗原を含んでいる病変部位へ直接投与される同種異系細胞を含む。この同種異系細胞は、患者に注射された場合、拒絶反応を生じて、抗原に対する遅延型過敏性反応を刺激し、これによって患者における全身性の抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激に対するアジュバントとして作用する。

治療用組成物は、プライミング組成物および同種異系細胞によって生じる反応に対するアジュバントとして作用する他の組成物を含んでもよい。このプライミング組成物および同種異系細胞は、治療組成物中で一般に見出される他の成分、例えば、防腐剤を含んでもよい。これらの成分の添加は、本発明の範囲内である。

いくつかの実施形態では、この治療用組成物は、同種異系細胞およびインサイチュで生成された抗原を含むだけであって、プライミング組成物は含まない場合がある。このプライミング組成物は、所望の免疫応答を得るために必要でない場合もある。

本発明はまた、腫瘍または病原体に対する患者のためのワクチン組成物を包含する。ワクチンは好ましくはプライミング組成物および抗原性組成物を含む。プライミング組成物は一般には、患者に注射されて、同種異系のＴｈ１免疫を誘導する方式で患者の免疫系による拒絶反応を生じる、同種異系細胞を含む。

この抗原性組成物は、腫瘍または病原体感染組織由来の抗原性物質、および同種異系細胞のアリコートを含む。いくつかの実施形態では、この抗原性物質は、癌性細胞由来の、または感染された組織由来の抗原を含んでいる自家溶解液である。この抗原性物質は、腫瘍の組織壊死または病原体感染組織の壊死由来であってもよい。好ましくは、この抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織のアブレーション由来である。このアブレーションは、インビボであっても、またはエキソビボであってもよい。いくつかの実施形態では、この抗原性物質は、腫瘍由来の組織または病原体感染組織のアブレーションの際に放出される熱ショックタンパク質を含む。この抗原性組成物はまた、同種異系細胞も含む。この抗原性物質および同種異系細胞は、一緒に組み合わされても、または別々にパッケージングされてもよい。

本開示はまた、インサイチュで生成されたワクチン組成物も包含する。このワクチン中の抗原性物質は、インサイチュで生成され、同種異系細胞はアジュバントとして患者に、好ましくは病変内に投与される。抗原性物質のインサイチュ生成は、その抗原性物質を放出する患者内の腫瘍または病原体感染組織のアブレーションによって達成され得る。そのアブレーションは、腫瘍または病原体感染組織の壊死性の死滅を生じる冷凍アブレーション、エレクトロポレーションまたは他の方法によってであってもよい。

インサイチュで生成された抗原での実施形態では、患者に投与された抗原性組成物は、同種異系細胞を含み、これらの細胞は、放出された抗原を含んでいる壊死性病変部位で投与される。この抗原性組成物は、患者に注射された場合、拒絶反応を生じ、抗原に対する遅延型過敏性反応を刺激し、それによって患者での全身性の抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激に対するアジュバントとして作用する。

ワクチンは、プライミング組成物および抗原性組成物によって生じた反応に対するアジュバントとして作用する他の成分を含んでもよい。プライミング組成物および抗原性組成物は、ワクチン中で一般に見出される他の成分、例えば、防腐剤を含んでもよい。これらの成分の添加は全て、本発明の範囲内である。

いくつかの実施形態では、このワクチンは、抗原性組成物を含むだけであって、プライミング組成物は含まない場合がある。この抗原性組成物は、所望の免疫応答を得るために十分であり得る。

本発明の治療用ワクチンは、免疫応答を抑制するか、または回避することによって発達および／または持続する癌または慢性のウイルス性疾患のような疾患の予防および処置に有用である。

プライミング工程の目的は、同種抗原に対する引き続く暴露の際にリコールされ得る患者において抗同種異系Ｔｈ１免疫を生じることである。プライミングは、患者を同種異系細胞のアリコートに曝すこと、および第二のアリコートが患者に投与された場合、免疫記憶から生じる患者の免疫系による、これらの同種異系細胞の引き続く拒絶によって生じる。好ましくは、この患者は、プライミングの前に免疫抑制されない。なぜなら、これは患者が注入された同種異系細胞を拒絶する能力を阻害し、また抗同種抗原Ｔｈ１免疫の発達も阻害するからである。

本発明の一実施形態では、患者の免疫系は、Ｔｈ１免疫を生じるように歪曲される。Ｔｈ１免疫が同種異系細胞の拒絶に応答して発達するが、Ｔｈ２免疫は発達しないように、同種異系細胞を操作することが好ましい。一実施形態では、患者の免疫系は、注入された場合Ｔｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦα）を生じている同種異系細胞を投与することによってＴｈ−１応答を生じるように歪曲されてもよい。Ｔｈ１サイトカインは、Ｔｈ１型免疫に対する同種抗原に対して免疫応答を歪曲することを補助し得る。Ｔｈ１−免疫を生じるために患者の免疫系を歪曲する他の方法も、本発明の範囲内である。

患者を最初にプライミングするために用いられ、次いで後に病変内投与のため（細胞死の誘導後）または病原性物質もしくは腫瘍物質の供給源に対するアジュバントとして用いられる同種異系細胞は、好ましくは、同種異系の活性化されたＴ細胞、さらに好ましくは、同種異系の活性化されたＣＤ４＋Ｔｈ１細胞、さらに好ましくは同種異系のＣＤ４＋Ｔ細胞（エフェクターまたは記憶細胞に分化されており、高レベルの１型サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αを生じ、また好ましくは高密度で、エフェクター分子、例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、およびＦａｓＬを細胞表面上で発現するが、ＩＬ−４も他の２型サイトカインも生じない）である。先天性免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞）のＣＤ４０ライゲーションは、高レベルのサイトカインＩＬ−１２（これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１型免疫に向かって極性化させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を強化し、かつＮＫ細胞を活性化する）を誘導する能力を有する。これらの炎症促進性事象は、患者の免疫系による拒絶の際に同種異系細胞上の同種抗原に対するＴｈ１免疫の一貫した発達を可能にし得る。

プライミング工程では、活性化された同種異系のＴ細胞を、患者に対して好ましくは静脈内に投与するが、経皮投与されてもよい。この同種異系細胞は好ましくは、意図的にＨＬＡミスマッチのドナーに由来する。静脈内注入のための同種異系細胞のアリコート中の好ましい投薬量は、少なくとも約１×１０^７個の細胞、さらに好ましくは、約１×１０^８〜１×１０^１０個の細胞である。免疫応答を主に生じ得るこの範囲外の同種異系細胞の投薬量もまた、本発明の範囲内である。

罹患した組織のアブレーションまたは抗原性組成物の投与の前にＴｈ１抗同種抗原免疫の発達について患者を試験することが所望される。Ｔｈ１抗同種抗原免疫の発達は、少なくとも約７日かかる場合がある。好ましくは、患者は、Ｔｈ１抗同種抗原免疫を発達させるまでに約７日〜約１４日かかる。Ｔｈ１抗同種抗原免疫の発達は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定され得る。Ｔｈ１抗同種抗原免疫の発達について患者を試験する他の方法もまた本発明の範囲内である。Ｔｈ１抗同種抗原免疫が弱い場合、同種異系細胞の追加のブースター注射を投与してもよい。ブースター注射は、好ましくは、皮膚で遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応を生じるように皮内に行われる。

同種異系Ｔ細胞の生成
同種異系のＴ細胞は、活性化および患者への注入の際に、Ｔｈ−１免疫がその患者によって生成され得るように生成され得ることが望ましい。抗同種異系Ｔｈ１免疫の刺激に必要な特性を有する同種異系細胞を生成するための好ましい方法は以下を包含する；（１）正常なスクリーニングされたドナーからの白血球除去療法による単核細胞供給物の収集；（２）供給源物質からのＣＤ４Ｔ細胞の単離；（３）０、３および６日目に固定された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＤ４＋細胞の活性化；（４）固定された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂによる９日目の再度の細胞の活性化、ならびに活性化２４時間内の細胞の注入。

細胞死段階
インサイチュの細胞死または細胞損傷は、病変に対するＤＣの補充を生じ、ＤＣによる取り込みのための抗原の供給源を提供し得る。標的組織は、壊死が細胞死を生じるプロセスによって破壊されることが好ましい。壊死とは、細胞内の成分の量が環境に放出されるような個々の細胞または細胞の群の死滅を意味する。本出願の目的に関しては、壊死とは種々の方法による細胞死を包含し、この方法としては、冷凍アブレーション、不可逆的エレクトロポレーション、化学療法、放射線療法、超音波療法、エタノールケモアブレーション、マイクロ波サーマルアブレーション、高周波エネルギーまたはそれらの組み合わせが挙げられる。壊死性に殺傷された細胞は、健康またはアポトーシスで死ぬ細胞では生じない刺激である、ＤＣの補充および成熟を担う損傷の内因性のシグナルを活性化する。さらに、これらの刺激に対する未熟なＤＣの暴露は、局所および全身のＴｈ１免疫の開始に重要である成熟シグナルを提供する。

１つの好ましい実施形態では、壊死による死亡を生じるために、標的組織をインサイチュで凍結させることが好ましい。凍結手術（冷凍外科）とは、液体Ｎ_２またはアルゴンガスの適用によって組織壊死を誘導可能な、良く知られた、制御された手順である。凍結手術の間および後に生じる生物学的変化は、インビトロでおよびインビボで研究されてきた。組織損傷および壊死は、細胞凍結によって、および解凍後に発達する血管のうっ血によって誘導される。凍結手術（インサイチュ凍結）は、凍結組織の自家抗原に対して特異的な免疫原性応答を生じ得る抗原性刺激（抗原の非経口投与を通じて得られた刺激と匹敵）を惹起することが公知であった。

冷凍アブレーションは、ＤＣによる抗原プロセシングのために溶解された腫瘍または病原体感染細胞からペプチドを放出させ得、炎症促進性サイトカインの環境を生じ得る。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦのような冷凍アブレーション後に放出されるサイトカインは、癌または病原体感染細胞を破壊できる免疫応答に必須のＴ細胞、ＮＫ細胞およびランゲルハンス細胞を活性化し得る。

別の好ましい実施形態では、壊死によって死滅を生じるために、標的組織を不可逆性のエレクトロポレーションに供することが好ましい。不可逆的エレクトロポレーションは、組織アブレーション技術であって、ここではマイクロからミリ秒の電気的パルルを組織に送達して、不可逆的細胞膜透過化によって細胞死を生じる。不可逆的エレクトロポレーションでは、電極の間の細胞の細胞膜を破壊して細胞壊死を生じる。不可逆的エレクトロポレーションは、ＤＣによる抗原プロセシングのために溶解された腫瘍または病原体感染細胞から抗原を放出させ得、炎症促進性サイトカインの環境を生じ得る。

抗原の供給源を生成するための別の好ましい方法は、死滅した感染された組織または腫瘍から、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）としても公知の自家のシャペロンタンパク質を単離することである。ＨＳＰはとりわけ、細菌、真菌および寄生性の病原に対する免疫応答の主な標的である。細胞外環境中の特定のシャペロンはまた、シャペロンポリペプチドに対するそれらの能力に起因して、先天性免疫および適応的免疫を調節し、宿主の免疫系、特に専門的な抗原提示細胞と相互作用し得る。腫瘍由来の熱ショックタンパク質によるワクチン接種は、抗腫瘍応答を惹起することが示されている。現在の研究によって、ＨＳＰの免疫原性は、それらが会合する抗原性ペプチドに由来することが示される。

抗原の供給源として用いるためのシャペロンタンパク質の単離のための好ましい方法は、Ｋａｔｓａｎｔｉｓによって、特許文献１に記載される。追加の方法は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａによって、特許文献２；特許文献３、特許文献４；特許文献５；特許文献６；および特許文献７に記載される。

アジュバント工程
アジュバント工程の目的は、ＤＣを成熟させて、死んだ標的組織を含む病変で採取された抗原に対してＴｈ１免疫を刺激することである。これは、同じ同種異系細胞、すなわち、患者をプライミングするために用いられたのと同じ起源の同種異系細胞の注射によって達成され得る。同種異系細胞のこのアリコートは好ましくは、病変内に、すなわち、冷凍アブレーションまたは細胞死の他の方法によって生じる壊死病変中に直接注射される。あるいは、シャペロンタンパク質が抗原の供給源として用いられる場合、患者をプライミングするのに用いられる同じ同種異系細胞を、シャペロンタンパク質とともに、好ましくは経皮的に注射する。所望の免疫応答を生じる同種異系細胞の投与量は、一般には、少なくとも約１×１０^７細胞であり、さらに好ましくは、約１×１０^８〜１×１０^１０細胞である。所望の免疫応答を生じ得るこの範囲外の同種異系細胞もまた本発明の範囲内である。同種異系細胞の調製は、上記と同じである。

免疫応答を開始し、かつ天然の寛容を克服するために、免疫系は自己組織を有しており、壊死性細胞死の後またはシャペロンタンパク質と会合されて放出された抗原は、ＤＣによって取り込まれて、「危険」をシグナル伝達する免疫活性化成分とともに提示されなければならない。同種異系細胞に対する記憶免疫応答は、この「危険」を生み出す。

この組織定住ＤＣ（未熟ＤＣと呼ばれる）は、環境からインサイチュで生成された抗原を捕獲可能であるが、Ｔ細胞の刺激は欠く。病原体感染および結果として起こる炎症性反応に応答して、ＤＣは、成熟と呼ばれる分化過程を受けて、それによって、流入領域リンパ節へ遊走する能力を上方制御して、捕獲された抗原をＴ細胞に提示する。Ｔｈ１ ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＴＬを活性化するために、ＤＣは、多数の成熟／分化の刺激を統合しなければならない。病原体または腫瘍の遭遇の部位では、病原体または腫瘍由来の決定因子に対する暴露、炎症促進性サイトカイン、および／または細胞破片は、成熟過程の最初の段階を誘導する。これは、副刺激分子およびケモカイン受容体の上方制御を包含し、それによってＤＣは、それぞれ、Ｔ細胞に対して抗原を提示し、リンパ節に遊走する能力を獲得する。リンパ節では、同族のＣＤ４^＋Ｔ細胞の遭遇は、ＤＣに対する追加の分化刺激を提供し、これが活性化されたＴ細胞の生存、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の分極化を調節する。

ＤＣの成熟は、抗原取り込みの部位で生じ、リコール拒絶反応は、ＤＣ成熟に必要な適切な炎症性危険シグナル、リンパ節への遊走、および病変で取り込まれた抗原に対するＴｈ１免疫のプログラミングを提供するためのアジュバントとして機能する。

動物
Ｂａｌｂ／ｃマウスがホストであって、Ｃ５７Ｂ１／６（Ｂ６）マウスをＴｈ１細胞の供給源として用いた。全てのマウスは、６〜１０週齢であって、ハダサー−ヘブライ大学医療センター（Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）の特定の無菌施設で飼育して、認証された動物プロトコールで処置した。

同種異系Ｔｈ１記憶細胞の調製
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞を回収して、赤血球の溶解用の塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）緩衝液で処理した。１つの脾臓あたり約７０００万〜１億個の細胞を単離した。次いで、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上でＣＤ４免疫磁性粒子を用いて、ポジティブ選択（純度＞９８％）によって精製し、約８００万〜１２００万個のＣＤ４細胞を５０〜６０％の収率で単離した。Ｔｈ１記憶細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８−コーティングした常磁性ビーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞増殖（ｅｘｐａｎｄｅｒ）ビーズ，Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での増殖によって、３：１という、最初のビーズ：ＣＤ４細胞比で生成された。精製されたＣＤ４細胞を、２０ＩＵ／ｍＬの組み換えマウス（ｒｍ）ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−７、および１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ならびに１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ−４ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）（１０％のＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、非必須アミノ酸類（ＮＥＡＡ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）および３．３ｍＭのＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ；Ｓｉｇｍａ）を含んでいるＲＰＭＩ １６４０（完全培地）中に含まれる）とともにインキュベートした。追加のサイトカイン含有完全培地（ｒｍＩＬ−２およびｒｍＩＬ−７を含む）を、３〜６日まで毎日ＣＤ４培養に添加して、０．５〜１×１０^６細胞／ｍＬの間の細胞濃度を維持した。追加のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを、３〜６日まで毎日添加した。添加されたビーズの数を算出して、増殖された細胞として１：１のビーズ：細胞の比を維持した。培養物中で６日後、ＣＤ４細胞を約８０〜１００倍増殖して、回収し、物理的破壊および磁石上の通過によって脱ビーズした。実験で用いた回収した細胞の表現型は、＞９５％のＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ^１０、ＩＦＮ−α＋およびＩＬ−４−であった。

ＣＤ３／ＣＤ２８ナノビーズ調製
ビオチン化マウス抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を各々、４００μ１のＰＢＳ中で２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈し、次いで最終容積が８００μｌになるように、１：１の比で混合した。２０μ１のストレプトアビジンコーティングしたナノビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、洗浄して、ＰＢＳ中で２００μｌの最終容積まで希釈した。８００μｌのＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂ溶液および２００μｌの希釈されたナノビーズを、次に、各々のｍＡｂの最終濃度が１ｍｌの総容積中で１０μｇ／ｍｌになるように混合した。その混合物を、ＲＴで３０分間回転する混合デバイスに入れた。次いで、ｍＡｂコンジュゲートしたナノビーズを、磁石上でＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通過させ、徹底的に洗浄した。次いで、保持されたナノビーズをカラムから遊離させて、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。そのナノビーズは、ナイーブなＴ細胞を活性化できなかった。従って、ナノビーズを、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増幅ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて６日前に前もって活性化された回収されたＴｈ１記憶細胞に対してティッテル（ｔｉｔｔｅｒｅｄ）した。１バッチあたりわずかな変動があったが、一般には２０μ１／１０^７細胞は、以前に活性化されたＴｈ１記憶細胞の最適活性化を提供することが見出された。

ＣＤ３／ＣＤ２８架橋
活性化されたＴｈ１記憶細胞の注入を要した実験では、回収されたＴｈ１細胞を、注入の前にＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲートのナノビーズの事前ティッテル（ｐｒｅ−ｔｉｔｔｅｒｅｄ）濃度でインキュベートした。最適活性化のために、細胞を、最低４時間および最大で１８時間、ナノビーズとインキュベートしなければならなかった。最適の活性化は、ＩＦＮ−αの産生ならびにＣＤ４０ＬおよびＦａｓＬの上方制御を細胞表面上で生じた。これらの実験に関して、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞の全ての注入は、予備インキュベーションの４〜８時間後に行った。注入の前に細胞を徹底的に洗浄して、未結合のビーズを除去した。これらの実験で用いた架橋されたＴｈ１記憶細胞は、細胞表面上でＦａｓＬおよびＣＤ４０Ｌを発現し、過剰の２０００ｎｇ／ｍｌ／１０^６細胞／６ｈのＩＦＮ−αおよび２０ｐｇ／ｍｌ未満のＩＬ−４を１０^６細胞／６ｈで生じた。ＣＤ３／ＣＤ２８架橋なしのＴｈ１記憶細胞は、サイトカインを生成せず、ＦａｓＬまたはＣＤ４０Ｌを発現もしなかった。

凍結療法
凍結療法は、直径３ｍｍの球状の亜酸化窒素凍結プローブ（ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ）で行った。ガスを５０バールの圧力で維持し、ジュール・トムソン効果によって、組織中で−３０〜−４０℃におよぶ温度を得ることを可能とした。腫瘍の中心に切開を作成し、凍結プローブを腫瘍と接触して配置し（これは１〜２ｍｍの深さ挿入された）：この目的は、凍結によって腫瘍に影響することであって、それを完全に破壊することではなかった。３サイクルの急速な凍結（２０秒間継続）、続いて緩徐な解凍を適用した。病変の中心に氷のボールを作成して、総腫瘍容積のほぼ２／３に達するようにさせた。

同種異系のＴｈ１細胞が広範な転移性疾患中の全身性の抗腫瘍免疫を刺激する能力を試験するために、以下のプロトコールを試験した。ＢＣＬ１白血病、４Ｔ１乳癌および３ＬＬ肺癌を含む腫瘍細胞の致死用量を、０日目にマウスに静脈内注入し、腫瘍細胞はまた、経皮的にも注射して、固形腫瘍の塊を樹立した。７日目に、マウスに、１×１０^５用量の同種異系のＴｈ１細胞を与えた。１４日目に、マウスを：（ａ）生理食塩水；（ｂ）生理食塩水＋腫瘍の部分的冷凍アブレーション；（ｃ）１０^３個の細胞の用量の同種異系のＴｈ１細胞、または（ｄ）同種異系のＴｈ１細胞＋腫瘍の部分的冷凍アブレーションのいずれかの注射によって、腫瘍内で処置した。９０日目の生存している動物の結果を下に示す（ｎ＝１０）。

固形腫瘍を有する患者の処置が、本発明から有益であり得るか否かを検討するために、固形腫瘍塊を生じる腫瘍の皮内注射のみを受けた動物で、上記の実験デザインを繰り返した。その結果は、転移性疾患を有する動物で得られた結果と同様であった。

Ｔｈ１細胞と凍結療法との組み合わせは、高い治癒率を生じる。凍結療法は、壊死によって腫瘍を殺傷し、これはアポトーシスによる死（化学療法によって生じる種類の死）よりも病理学的な種類の細胞死であると考えられる。凍結療法によって、腫瘍はさらに免疫原性になり、従って同種異系のＴｈ１細胞と壊死性の腫瘍死との組み合わせは、ある種の腫瘍ワクチンを生じ、これが全身性の抗腫瘍免疫につながると考えられる。

本発明は、好ましい実施形態を参照して記載してきたが、当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく形式上および詳細おいて変化がなされてもよいことを理解する。

Claims (19)

1. 患者における腫瘍または病原体を処置するための治療組成物であって：
   同種異系細胞と；
   腫瘍壊死または病原体感染組織の壊死の生成物を含む抗原であって、該抗原がインサイチュで生成され、それによって同種異系細胞およびインサイチュで生成された抗原が患者による免疫応答を誘発して、抗腫瘍または抗病原体免疫を作成する抗原と；
   を含んでいる治療組成物。
2. ワクチン組成物であって：
   同種異系細胞を含んでいるアジュバントと；
   疾患の細胞または組織の壊死によってインサイチュで生成された抗原であって、ここで壊死部位での該アジュバントの存在とともに該インサイチュで生成された抗原によって、患者による免疫応答を誘発して、該疾患に対する免疫を生成する抗原と、
   を包含する、ワクチン組成物。
3. プライミング組成物をさらに含んでおり、該プライミング組成物は同種異系細胞を含んでいる、請求項１または２に記載の組成物。
4. 腫瘍または病原体感染組織のアブレーションによって前記抗原がインサイチュで生成される、請求項１または２に記載の組成物。
5. 前記アブレーションが冷凍アブレーションである、請求項４に記載の組成物。
6. 前記アブレーションがエレクトロポレーションである、請求項４に記載の組成物。
7. 前記抗原が、腫瘍または病原体の抗原、熱ショックタンパク質およびそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の組成物。
8. 前記同種異系細胞が、活性化されたＴ細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
9. 前記同種異系細胞が、高レベルの１型サイトカインを発現する、請求項１または２に記載の組成物。
10. 前記同種異系細胞が、高密度のＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬおよびそれらの組み合わせを、細胞表面上で発現する、請求項１または２に記載の組成物。
11. 患者における腫瘍または病原体に対する適応的免疫応答を誘導する方法であって：
    疾患またはインサイチュでの病原体感染から抗原を生成する工程と；
    インサイチュで生成された抗原の部位に対して同種異系細胞を投与し、それによってアブレーションされた組織から抗原の取り込みに対するアジュバントとして機能する免疫応答を生成し、それによって患者の抗原提示細胞の引き続く成熟が全身的に抗腫瘍免疫または抗病原体免疫を刺激する工程と、
    を包含する、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、さらに：
    前記患者に対して、インサイチュで抗原の生成の前にプライミング組成物を投与する工程であって、該プライミング組成物が、同種異系のＴｈ１免疫を誘発する方式で患者の免疫系によって拒絶されるべき同種異系のＴ細胞を含んでいる、工程と；
    患者の免疫系が、インサイチュ抗原の生成の前に抗同種異系のＴｈ１免疫記憶を形成することを可能にする工程と、
    を包含する、方法。
13. 前記抗原が、腫瘍または病原体感染組織のアブレーションによってインサイチュで生成される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記アブレーションが冷凍アブレーションによる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記アブレーションがエレクトロポレーションによる、請求項１３に記載の方法。
16. 前記抗原が、腫瘍または病原体の抗原、熱ショックタンパク質およびそれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
17. 前記同種異系細胞が同種異系のＴ細胞である、請求項１１に記載の方法。
18. 前記同種異系細胞が、高レベルの１型サイトカインを発現する、請求項１１に記載の方法。
19. 前記同種異系細胞が、高密度のＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬおよびそれらの組み合わせを細胞表面上で発現する、請求項１１に記載の方法。