JP2016517698A - カビコロニーを計数するための培養装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年5月6日に出願された米国仮特許出願第61/819,690号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
実施形態Aは、薄膜式培養装置であって、
防水性の第1の基材と、
防水性の第2の基材と、
第1の基材と第2の基材との間に配置された生長領域と、
生長領域に配置された乾燥した冷水溶解性のゲル化剤と、
生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物とを含み、
生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、有効量のカルシウムキレート化合物は、培養装置において生長するコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させることができ、
コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、薄膜式培養装置である。
生長領域に配置された、有効量のカルシウムキレート化合物を含む薄膜式培養装置の生長領域において、接種された培養培地を形成させることと、
顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーを形成させるのに十分な所定の期間にわたって、接種された培養培地をインキュベートすることと、
薄膜式培養装置において、顕微鏡検出可能なカビ微生物のコロニー数を計数することとを含み、
接種された培養培地を形成することは、所定量の水性液体により水和された生長領域を形成することを含み、
生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、カルシウムキレート化合物は、培養装置において生長する前記コロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させ、
横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることがないものである。
接種された培養培地を形成することは水性サンプルを薄膜式培養装置に載せることを含み、
水性サンプルを載せる前に、薄膜式培養装置は、栄養培地、指示薬、及び/又は有効量のカルシウムキレート化合物を含むものである。
カビ微生物を生長及び計数するための薄膜式培養装置と、
所定量のカルシウムキレート化合物を収容する容器とを含み、
培養装置の接種後に培養装置の生長領域に配置されたとき、所定量の一部分は、培養装置において生長するカビ種のコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させるのに十分なものであり;
コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることはないものである。
防水性の第1の基材と、
防水性の第2の基材と、
第1の基材と第2の基材との間に配置された生長領域と、
生長領域に配置された乾燥した冷水溶解性のゲル化剤と、
生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物とを含み、
生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、有効量のカルシウムキレート化合物は、培養装置において生長するコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させることができ、
コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることはないものである。
別途記載のない限り、全ての試薬はシグマ・アルドリッチ社から得た。
栄養培地粉末混合物の調製
非タンパク質性成分4〜11(表2)の5バッチを、表に記載の量で250mLプラスチック容器に計量した。表3に示す量で各バッチにEDTAを添加した。EDTAの添加後、各粉末混合物をコーヒーグラインダーで30秒間均質化した(KitchenAid model BCG1110B;KitchenAid;St.Joseph,MI)。均質化後、表1のタンパク質性成分1〜3を添加した後、手作業で30秒間振って、粉末を混合した。比較例1は、EDTAを除く全ての成分を用いて調製した。実施例において使用するとき、「EDTA」は、シグマ・アルドリッチ(St.Louis,MO)から得たエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物(CAS No.6381−92−6)を指す。
表2に示す量でブレンドした粉末に、キサンタン/ローカストビーンガム(XLBG)の1:1(w/w)混合物を含む乾燥している粉末ゲル化剤(300g)を添加した後、手作業により30秒間振って混合した。米国特許第4,476,226号及び同第5,089,413号に概説される手順により培養プレートを作製した。簡単に、マスターロールから、3×4インチ(7.6×10.2cm)のボトムフィルム部分(すなわち、本明細書において上記した通りの「第1の基材」)を切り出した。マスターロールは、疎水性コーティングした紙と、この紙面上にコーティングされた接着剤の薄層[米国特許第5,635,367号の実施例1に記載の非阻害的な接着剤コポリマー(酢酸エチル及びヘプタン溶液中固形分約24%)、参照によりその全体が本明細書に援用される]とから構成された。接着剤は、クロラムフェニコール及びクロルテトラサイクリンにより処方され、本質的に、米国特許第5,089,413号の実施例1に記載の通りにマスターロール上にコーティングされた。厚さ約0.57mmであり直径2.4インチ(6.1cm)の円を切り取ったフォーム層を各ボトムフィルムに積層した。開口部に約2gの粉末を塗布した後、前後左右に動かし、粉末を接着剤上に均一に分布させる。過剰な粉末はフィルムをひっくり返して除去し、接着剤層に栄養分/ゲル混合粉末を結合させた薄層を得た。接着層を含む透明なトップフィルムをキサンタン/ローカストビーンガム混合物により粉末コーティングし、同様に7.6×10.2cm片に切り出し、両面接着テープ(3M社,St.Paul,MN)を使用してボトムフィルムの上面端部に接着した。接着層は、表4に示す酵素基質と混合した上記接着剤を含んだ。
凍結保存したアスペルギルス・ニガー(Aspergillusniger)(ATCC 16484)をバターフィード緩衝液で段階希釈して、1mL当たり約10コロニー形成単位(CFU)とした。上記の粉末処方でコーティングしたこの薄膜式培養装置のカバーシートを持ち上げ、コーティングしたボトムフィルムの中央で1mLの希釈サンプルをピペッティングし、カバーシートを再設置し、3M PETRIFILM酵母&カビカウントプレート(以降「PYMプレート」;3M社,St.Paul,MN)に付属のスプレッド装置を使用して下向きに圧力を加えて、接種菌液をフォーム積層体に開いている円形の孔の端部に放射状に分散させることにより、装置に接種した。各粉末コーティング組成は、3つ組で複製し調製した。接種後、このプレートを30℃に設定したインキュベータに設置した。
3M PETRIFILM Aerobic Count Plateを計数するよう設定した3M PETRIFILMプレートリーダー(3M社,St.Paul,MN)を使用し、42、48、及び66時間の時点でプレート画像を得た。ImageProソフトウェア(Media Cybernetics,Inc.)で、「count/size」機能によりコロニー面積を測定した。ヒストグラムベースの閾値を用い、次の強度値を使用し、青色コロニーの縁部を判別した。赤=124〜205、緑=182〜255及び青=112〜255。各画像に関し、接種した領域端部の、重なり合っている(接触している)コロニー及び不規則に切り欠きのあるコロニー(すなわち、円形ではない)を分析から除外した。インキュベート開始から42時間後に、各バッチのプレートについて、平均コロニー寸法を求めた(3枚の複製プレートから得られたコロニーの直径を利用して算出)。結果を表5に掲載する。
アスペルギルス・ニガー(A. niger)の培養について記載の通り、表7に示すカビ種を段階希釈し、接種し、インキュベートし、画像化し、分析した。各カビ種について、実施例1〜4の薄膜式培養装置を使用して観察された平均コロニー寸法を、比較例1の薄膜式培養装置を使用して観察された平均コロニー寸法と比較した。各サンプルの平均コロニー寸法の低減率(%)を表7に掲載する。乾燥粉末コーティングの1重量%超の濃度のEDTAを含む培養装置では、いくつかの種で、視認可能なコロニーの出現の遅延が観察された。
1−アスペルギルス・オリゼ(Aspergillusoryzae)の平均コロニー寸法は、このEDTA濃度で5%増加した。
2−ジオトリカム・カンディダム(Geotrichumcandidum)の平均コロニー寸法は、このEDTA濃度で1%増加した。
3−この濃度ではコロニーは検出されなかった。
近所の食料品店から脱脂粉乳を購入した。10mLの脱脂粉乳に3.7mgのEDTA二ナトリウム二水和物を加え、最終濃度1mM EDTAを得た。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)(ATCC #16484)をバターフィールド緩衝液に希釈して、濃度約500コロニー形成単位/mLとした。ミルクサンプルに希釈懸濁液100μLを加えた。簡単にボルテックスにかけた後、カビを含有しているミルクサンプル1mLを使用して、製造元の指示に従いPYMプレートに接種した。このPYMプレートを30℃で48時間インキュベートした後、上記の通り画像化し、コロニー寸法を分析した。バターフィード緩衝液で、対照サンプル(ミルク不含有)も調製した。コロニー寸法の低減率を表8に示す。
上記の通り薄膜式培養装置を作製した。凍結保存したものから3つの酵母株を段階希釈して、1mL当たり約100CFUの最終濃度とした。上記の通り、薄膜式培養装置に接種し、91時間インキュベートし、画像化し、分析した。データは、濃度1%未満のEDTAを存在させても、これらの非糸状菌のコロニー寸法には影響が出なかったことを示す。実施例1〜4に記載の通りにコロニー面積を算出し、ピクセルで記録した。EDTA濃度1%超の培養装置では、C.グラブラタ(C. glabrata)及びR.ムシラギノサ(R. mucilaginosa)のコロニーは検出されなかった。データを表9に示す。
表10に示す栄養分処方(これまでの実施例で加えた硫酸マグネシウム7H2O、塩化マンガン、及び硫酸亜鉛7H2Oを含まない)を使用して、実施例1〜4に記載の通りに薄膜式培養装置を作製、接種、及び分析した。実施例1〜4に記載の通りにEDTAを加えて、表11に示す通りの最終濃度を得た。実施例1〜4に記載の通り、各処方の3つ組プレートにアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)を接種し、48時間及び72時間の時点で画像化した。48時間インキュベート時の数平均コロニー寸法、及び、48時間及び72時間インキュベート時に観察されたコロニーの数をそれぞれ表12及び13に記録する。
この実施例では、上記の通りコーティングされた栄養分処方中の成分として配置するのではなく、1mL接種菌液にEDTAを溶解させてプレートに加えた。実施例1に記載の通り、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)の希釈懸濁液を調製した。10mLのバターフィード緩衝液に3.7mgのEDTAを溶解させて、1mM EDTA溶液を調製した。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)希釈懸濁液をEDTA/バターフィード緩衝液に加えて、細胞濃度約5cfu/mLを得た。製造元の指示に従い、接種菌液1mLをPYMプレートに添加し、装置を5つ組で複製した。EDTAを含有させてない、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)の5cfu/mL溶液から、一連の対照プレートを作製した。表14は、インキュベート開始から48時間及び72時間後のプレート当たりの平均コロニー数を示す。表15は、1mM EDTA下で生長するカビコロニーが有した平均コロニー直径を示す。インキュベート開始から48時間後、直径は対照プレートの1/20であった。
10mLのバターフィード緩衝液に15.2mgのEGTAを溶解させて、4mMエチレングリコール四酢酸(EGTA)溶液を調製した。段階2倍希釈を調製し、それぞれ2mM及び1mM EGTAを含有する溶液を調製した。実施例において使用するとき、「EDTA」は、シグマ・アルドリッチ(St.Louis,MO)から得たエチレングリコール−ビス(2−アミノエチルエーテル)−N,N,N’,N’−四酢酸(67−42−5)を指す。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)を希釈し、実施例12に記載の通りに溶液に添加し、最終細胞濃度約5cfu/mLを得た。製造元の指示に従い、1mLカビ懸濁液をPYMプレートに接種して、装置を3つ組で複製した。それぞれインキュベート開始から48時間後及び72時間後にプレート画像を得た。所定のインキュベート期間後(各42時間及び66時間)、青く着色したコロニーを手作業で計数して、定量的にカビ数を求めた。複製した培養装置の各セットの合計コロニー数を表16に示す。各プレートの画像から、プレートカウント数(3枚のプレートの合計)を求めた。結果を表16に示す。上記の通りのプレート画像化及び画像解析により、インキュベート開始から48時間後の平均コロニー寸法を求めた。結果を表17に示す。
Claims (20)
- 薄膜式培養装置であって、
防水性の第1の基材と、
防水性の第2の基材と、
前記第1の基材と前記第2の基材との間に配置された生長領域と、
前記生長領域に配置された乾燥した冷水溶解性のゲル化剤と、
前記生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物とを含み、
前記生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、前記有効量のカルシウムキレート化合物が、前記培養装置において生長する前記コロニー形成単位の横方向拡大率を、前記生長領域に配置された前記有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させることができ、
前記コロニー形成単位の前記横方向拡大率を低減させても、前記コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、薄膜式培養装置。 - 前記生長領域に配置されたカルシウム塩を更に含む、請求項1に記載の薄膜式培養装置。
- 前記カルシウムキレート化合物及び/又は存在していれば前記カルシウム塩が第1の乾燥コーティング内に配置されている、請求項1又は2に記載の薄膜式培養装置。
- 前記乾燥した冷水溶解性のゲル化剤が、前記第1の乾燥コーティング及び/又は第2の乾燥コーティング内に配置されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薄膜式培養装置。
- 前記有効量のカルシウムキレート化合物が、カビ微生物の生長に好適な温度で48時間インキュベートした後の前記カビ微生物の第1の平均コロニー直径を、前記カルシウムキレート化合物の存在しない実質的に同一の薄膜式培養装置において生長させた前記カビ微生物の第2の平均コロニー直径と比較して少なくとも30%低減させるのに十分である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の薄膜式培養装置。
- 前記カルシウムキレート化合物が、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール四酢酸、又はクエン酸塩を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の薄膜式培養装置。
- 前記カルシウムキレート化合物が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物を含み、前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物が、コーティング密度約0.5mg〜約12mg/100cm2で前記生長領域において乾燥コーティング内に配置されている、請求項6に記載の薄膜式培養装置。
- カビ微生物の生長を支持する栄養培地を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の薄膜式培養装置。
- 更に指示薬を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の薄膜式培養装置。
- 所定量の水性液体を更に含み、前記生長領域に配置された前記有効量のカルシウムキレート化合物が、前記生長領域に配置された前記有効量を含有する前記培養装置において生長するカビ種のコロニーの横方向拡大率を、前記生長領域に配置された前記有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させるのに有効な濃度で前記水性液体に溶解している、請求項1〜9のいずれか一項に記載の薄膜式培養装置。
- 前記第1の基材に接着させた通気膜を更に含み、前記通気膜が前記培養装置の前記生長領域と実質的に同じ広がりを持っている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の薄膜式培養装置。
- 微生物を計数するための方法であって、
薄膜式培養装置の生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物を含む前記生長領域において、接種された培養培地を形成することと、
顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーを形成させるのに十分な所定の期間にわたって、前記接種された培養培地をインキュベートすることと、
前記生長領域における顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーの数を計数することとを含み、
前記接種された培養培地を形成することは、所定量の水性液体により前記生長領域を水和することを含み、
前記生長領域が前記所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、前記カルシウムキレート化合物は、前記培養装置において生長する前記コロニー形成単位の横方向拡大率を、前記生長領域に配置された前記有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させ、
前記横方向拡大率を低減させても、前記コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、微生物を計数するための方法。 - 前記有効量のカルシウムキレート化合物が、存在していれば、この化合物を含有させなかった場合に所定の時間内に検出され得る、酵母微生物の検出を大幅に遅延させることがない、請求項12に記載の方法。
- 前記生長領域において顕微鏡検出可能な酵母コロニーの数を計数することを更に含む、請求項13に記載の方法。
- 接種された培養培地を形成することが、水性サンプルを前記薄膜式培養装置に載せることを含み、
前記水性サンプルを載せる前に、前記薄膜式培養装置が、栄養培地、指示薬、及び/又は有効量のカルシウムキレート化合物を含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 前記接種された培養培地を所定の期間インキュベートすることが、前記接種された培養培地を約40時間〜約96時間インキュベートすることを含む、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 顕微鏡検出可能なコロニーの数を計数することが、前記薄膜式培養装置の生長領域の画像を得ることを含む、請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法。
- キットであって、
カビ微生物を生長させ計数するための薄膜式培養装置と、
所定量のカルシウムキレート化合物を収容する容器とを含み、
前記培養装置の接種後に前記培養装置の生長領域に配置されたとき、所定量の一部分は、前記培養装置において生長するカビ種のコロニー形成単位の横方向拡大率を、前記生長領域に配置された前記有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させるのに十分であり、
前記コロニー形成単位の前記横方向拡大率を低減させても、前記コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、キット。 - 前記薄膜式培養装置が、
防水性の第1の基材と、
防水性の第2の基材と、
前記第1の基材と前記第2の基材との間に配置された生長領域と、
前記生長領域に配置された乾燥した冷水溶解性のゲル化剤と、
前記生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物とを含み、
前記生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、前記有効量のカルシウムキレート化合物は、前記培養装置において生長する前記コロニー形成単位の横方向拡大率を、前記生長領域に配置された前記有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させることができ、
前記コロニー形成単位の前記横方向拡大率を低減させても、前記コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、請求項18に記載のキット。 - 栄養分、検出試薬、選択薬、緩衝剤、染料、及び前述の試薬のうちの任意の2種以上を含む混合物からなる群から選択される試薬を更に含む、請求項18又は19に記載のキット。
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