JP2016515402A - 組織の流れ制御およびライブイメージングへの適合性を有する灌流バイオリアクタ - Google Patents

Abstract

組織の広域スペクトルを工学的に処理するための灌流バイオリアクタチャンバが提供される。バイオリアクタは、長期の培養の間に、様々な形状、構造およびトポロジーのスキャフォールド材を通る、またはそのまわりの流体の制御された分配を可能にする。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１３年４月１８日出願の米国仮特許出願第６１／８１３，３７８号の利益、および２０１３年７月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８５７，４９０号の利益を請求するものである。

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、認可番号ＮＹＣＰＦＣＵ１１−１９１５の下で、米国政府の支援によって行われたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

開示される主題は、組織工学および組織採取のためのシステムならびに装置に関する。特に開示される本主題は、長期の培養の間に、様々な形状、構造およびトポロジーのスキャフォールド材を通る、またはそのまわりの流体の制御された分配を可能にする、組織の広域スペクトルを工学的に処理するための灌流バイオリアクタチャンバの利用を対象にしている。

組織工学の分野において、本開示は、移植および科学研究用の複雑形状、多相の組織の特性を最適化する技術を大幅に簡易化および改善するだけではなく、培養を中断することなく組織の成長についてさらに洞察することを可能にする。

本開示の一態様によれば、バイオリアクタ培養チャンバが提供される。バイオリアクタ培養チャンバは、スキャフォールド（scaffold）、少なくとも１つのＰＤＭＳブロック、複数のマニホルド（manifold）、および複数の流体経路ブロック（fluid routing block）を含む。流体経路ブロックは、流体経路のための構造的特徴を有するように構成される。流体経路ブロックは、マニホルドの中に入れ子状に重なるように構成される。バイオリアクタ培養チャンバは、ケースも含む。ケースは、スキャフォールド、ＰＤＭＳブロックおよび複数のマニホルドの外側に配設される。

本開示の別の態様によれば、バイオリアクタ培養チャンバが提供される。バイオリアクタ培養チャンバは、ブロックを含む。ブロックは、少なくとも１つの側面、ほぼ中央の空洞を有する。ブロックは、少なくとも１つの側面からほぼ中央の空洞へ延びる複数のチャネルを有する。バイオリアクタ培養チャンバは、流体経路マニホルドを含む。流体経路マニホルドは、入口および出口を含む。流体経路マニホルドは、複数のチャネルと流体連通する。バイオリアクタ培養チャンバは、流体経路マニホルドの外面のまわりに配設された筐体を含む。

いくつかの実施形態において、筐体は実質的に管状である。いくつかの実施形態において、ブロックはＰＤＭＳを含む。いくつかの実施形態において、筐体は流体経路マニホルドに圧縮力を及ぼす。いくつかの実施形態において、複数のチャネルは、複数のチャネルのそれぞれが実質的に同じ流路抵抗を有するように構成される。いくつかの実施形態において、バイオリアクタ培養チャンバは、ほぼ中央の空洞の中に配設されたスキャフォールドを含む。いくつかの実施形態において、スキャフォールドは複数のセルを含む。いくつかの実施形態において、入口はリザーバと流体連通する。いくつかの実施形態において、リザーバは栄養液を含む。いくつかの実施形態において、ブロックおよび筐体は、Ｘ線に対して実質的に透過性である。いくつかの実施形態において、ブロックおよび筐体は、ＭＲＩに対して実質的に透過性である。いくつかの実施形態において、バイオリアクタ培養チャンバは、入口および出口を有する追加の流体経路マニホルドを含む。そうした実施形態では、筐体は、その追加の流体経路マニホルドの外面のまわりに配設される。いくつかの実施形態において、スキャフォールドおよびほぼ中央の空洞は、実質的に同じ形状である。

本明細書に記載される主題の様々な態様、特徴および実施形態を、以下に簡単に記載する添付図面を参照しながら詳しく説明する。図面は例示的であり、分かりやすくするために一部の構成要素および特徴が誇張され、必ずしも一定の縮尺で描かれていない。図面は、本主題の様々な態様および特徴を例示するものであり、本主題の１つもしくは複数の実施形態または例を、全体としてまたは部分的に例示することがある。

開示される主題によるバイオリアクタ培養チャンバの構成要素の概略的な分解図である。 組み立てられた図１のバイオリアクタ培養チャンバの概略図である。 開示される主題による２部分からなる培養基灌流の例示的な実施形態の概略図である。 所望の流体の流れ方式を決定し、ＰＤＭＳブロックを設計することができる、流れのシミュレーションを示す計算流体力学のプロットである。 所望の流体の流れ方式を決定し、ＰＤＭＳブロックを設計することができる、流れのシミュレーションを示す計算流体力学のプロットである。 開示される主題による例示的なＰＤＭＳブロックの製作技術の概略的な分解図である。 組み立てられた図５のＰＤＭＳブロック構造物の概略図である。 開示される主題による別の例示的なＰＤＭＳブロックの製作技術の概略的な分解図である。 開示される主題によるマニホルドの代替的実施形態の概略図である。 図８の実施形態の正面図である。 開示される主題によるマニホルドの代替的実施形態の概略図である。 開示される主題によるＰＤＭＳブロックの代替的実施形態を示す図である。 開示される主題によるバイオリアクタ培養チャンバの代替的実施形態の構成要素の概略的な分解図である。 本開示の実施形態による、骨軟骨の同種移植片について細胞の生存度を維持するためのシステムの図である。

次に、添付図面にその例を示す、開示される主題の例示的な実施形態について詳しく参照する。開示される主題の装置および対応する方法を、システムに関する詳細な説明と共に記載する。

本明細書に示す方法およびシステムは、長期の培養の間に、様々な形状、構造およびトポロジーのスキャフォールド材を通る、またはそのまわりの流体の制御された分配を可能にする、組織の広域スペクトルを工学的に処理するための灌流バイオリアクタチャンバの設計および利用に用いることができる。また本明細書に開示されるバイオリアクタは、（例えば、複合組織の形成を支援する）２つ以上の異なる培養基の使用、組織内部の酸素濃度の制御、および培養の中断を伴わない（例えば、μＣＴ、ＭＲＩによる）ライブイメージングを可能にする。

バイオリアクタ培養チャンバの例示的な実施形態を図１に示すが、それは５つの主な構成要素を含む。これらの構成要素は、複雑なスキャフォールド１００、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ブロック２００、２つの流体経路マニホルド３００、４００、およびケース５００を含む。バイオリアクタを組み立てるために、スキャフォールド１００が、特に構成物の形状に合うように製作されたＰＤＭＳブロック２００の中に挿入される。ＰＤＭＳブロック２００は、２つの流体経路マニホルド３００、４００の間に挟まれ、管状の筐体５００が組立体の上を摺動し、個々の構成要素すべてを組立ユニット１０００として（図２に示すように）一緒に気密封止する圧縮力を与える。流体経路マニホルド３００、４００は、培養基を灌流するための複数のポートを有するように設計される。

図３は、２つの異なるタイプの流体３１０、３２０（「培養基＃１」および「培養基＃２」）の導入を可能にする、２つの入口３０１、３０２および２つの出口４０１、４０２を備える流体経路マニホルド３００、４００を示している（流れの方向を矢印によって示す）。流体経路マニホルド３００、４００は、流れている流体を、ＰＤＭＳブロック２００の異なる領域の中、およびスキャフォールド１００へ空間的に分配する。

大きい構成物では、細胞の生存度を保持し、組織の形成を刺激するために、適切に制御された栄養分の供給が必要である。培養基の灌流を制御するために、ＰＤＭＳブロック２００内のチャネル３３０は、局所的なスキャフォールドの厚さに応じて大きさを定められ、スキャフォールド全体にわたって所望の流体の流れ方式が実現されるように位置決めされる。

図４は、計算流体力学のデータ計算および可視化技術を用いて予測される、所与の設計に対する流れのシミュレーションを示している。例えば、異なる位置で異なる厚さを有する解剖学的に成形されたスキャフォールド内で均質に近い流体の流速を得るためには、厳密に同じ流路抵抗を与えるように、より厚い領域にはより大きい直径のチャネルを配置することができ、より薄い領域にはより小さい直径のチャネルが配置される。追加として、または別法として、どちらかの領域内のチャネルの間隔を、所望される実質的な濃度、すなわち組織空間内の酸素を与えるように（例えば、細胞の特定のタイプおよび密度に対して）決めることができる。

灌流チャネルの数、大きさおよび配置は、計算流体力学によって決定し、流体の流れの所望の分配方式を得るように設計することができる。所与の実施形態について、流体の流れの所望の方式を与えるチャネルの分布および大きさが決まると、図５に示すように、ＰＤＭＳブロックを作るための鋳型を作製することができる。示される例示的な実施形態では、ＰＤＭＳブロックの製作技術は、所定のチャネルを備える２つのケース２１０、２２０、所定のチャネルを備える雄型の（positive）スキャフォールド形の鋳型２３０、および様々な大きさのロッド２４０の４つの構成要素を含む。鋳型を用いて、ＰＤＭＳブロック２００を作製する。

雄型のスキャフォールド形の鋳型、およびチャネル用の所定の孔を含む外側ケーシングは、３次元的な印刷または機械加工によって製作することができる。図６に示すように、複数のロッド２４０を、外側ケーシング２１０、２２０の所定の孔を通して、雄型のスキャフォールド形の鋳型の中に挿入する。２つのケーシングの間の空の空間にＰＤＭＳを流し込み、硬化させて、所定のチャネルを備える雌型の（negative）ＰＤＭＳブロックを作製する。次いで、ロッドを取り除いて様々な大きさおよび位置を有するチャネルを作製し、ＰＤＭＳブロックを切断し、雄型のスキャフォールド形の鋳型を取り除く。

本開示の別の態様によれば、限定ではなく例示のためのものであるが、このバイオリアクタを組み立てるために用いられる材料は、ＣＴまたはＭＲＩでのモニタリングへの適合性を考慮した、シリコーン、ならびにポリカーボネートおよびポリエーテルイミド（例えばＵｌｔｅｍ）などのプラスチックである。チャンバ全体をイメージング用の機械に入れることが可能であるが、いずれの部分も取り外したり開放したりする必要はなく、イメージング中の無菌性が考慮される。

ＰＤＭＳブロックを製作するさらなる方法は、図７に示すように、マニホルドチャネルの低融点材料（例えばワックス）で３次元印刷された構造体に対してＰＤＭＳを鋳造することによって実施される。この場合、ワックスまたは溶解性材料を３次元印刷し、雄型の鋳型２５０を作製する。鋳型をケース２６０の中に挿入し、頂部からＰＤＭＳを注ぐことができる。硬化後、温度を上昇させてＰＤＭＳからワックスを取り除き、ＰＤＭＳマニホルドを得る。この同じプロセスを、溶解性材料（例えば水溶性）で実施することも可能である。

本開示によれば、本明細書において開示されるシステムおよび方法は、様々な利点を提供する。本開示は、１つまたは複数のタイプの培養基のＰＤＭＳブロック内への空間的分配を制御する、流体経路マニホルドの設計を可能にする。ＰＤＭＳブロックは、異なる大きさおよび間隔の複数のチャネルを任意の所望の位置に有することができる。ブロックは、スキャフォールド内の所望の流体の流れ分布に合うように、計算による流れシミュレーションによって設計される。チャネルのあるＰＤＭＳブロックを製作する方法が提供される。バイオリアクタの設計は、（例えば、μＣＴ、ＭＲＩによる）リアルタイムのイメージングに適合性がある。（１つまたは複数の）チャネルのあるＰＤＭＳブロックを製作する様々な代替的方法が提供される。

図８〜１３には、開示される主題のさらなる例示的な実施形態が示してある。図８〜９に示すように、マニホルド３０２は、組立後の位置（または図８に示すページの範囲外）にあるとき半径方向内側に延びる、上側および下側のフランジを含む略平坦な内面を有するように構成することができる。マニホルド３０２は、上側フランジと下側フランジの間に延びる平坦な側面に配設された陥凹部３０４も含む。陥凹部３０４は、同様に成形されたスキャフォールドおよび／または組織の成長に適合するように大きさおよび形状を定められる。さらに、陥凹部３０４の中にポート３０６が位置決めされ、組立後の位置にあるとき、バイオリアクタの長手方向の軸に直交する方向における流体の移動を可能にするように構成される。図９に示すように、流体は、マニホルド３０２の内面からポート３０８を介して供給および／または除去される。

同様に、図１０は、マニホルド３１２の別の実施形態を示している。この実施形態では、陥凹部３１４は、長方形の形状を有するように構成され、ポート３１６から半径方向外側に延びる複数のチャネルを含む。図９の実施形態に関連して前述したように、流体は、マニホルド３１２の内面からポート３１８を介して供給および／または除去される。

図１１は、流体の移動および組織の発生を容易にするように、そこから配設された複数の孔または細孔２１２を有する例示的なＰＤＭＳブロック２０２を示している。孔の大きさは、スキャフォールドの任意の所与の寸法に従って変化することができる。さらに、孔の集中度または密度は、スキャフォールドの任意の所与の寸法に従って変化することができる。

図１２は、流体経路ブロック３２２および３２４を受けるように構成することができる、例示的なマニホルド３０２および３０４を示している。示される実施形態において、流体経路ブロック３２２および３２４は、マニホルド３０２、３０４の中に挿入される別個の不連続な部分として構成される。これらの流体経路ブロック３２２および３２４は、合わさり密封した状態で連結され、スキャフォールド１０２を囲む。流体経路ブロック３２２および３２４は、所望されるように流体を経路する様々な大きさ、形状および集中度のチャネルを有するように構成することができる。組み立てられるとき、これらの構成要素は、入れ子状に重ねられ、連結され、ケース５０２の中に挿入される。

本開示の様々な実施形態は、天然の組織、例えば移植用の同種移植片の輸送および貯蔵に有用である。骨および軟骨の同種移植片の採取、評価ならびにマッチングは、約１ヶ月（そのうち、約２週間が採取およびスクリーニングによるものであり、２週間が組織のマッチングによるものである）を要する場合がある。この期間中、細胞の生存度は、１５〜５０％の範囲まで低下する。本開示によるデバイスは、こうした移植片の生存度を維持する。例えば、骨軟骨の同種移植片は、入手の可能性が限られ、貯蔵寿命はわずか約１４日と短い。骨軟骨の同種移植片を本開示による灌流バイオリアクタに入れることによって、骨軟骨組織の貯蔵寿命を延ばすように組織を維持し保持することができる。

図１３を参照すると、移植片を維持するためのシステム１３００が示されている。詳しく前述したような移植片チャンバ１３０１が、環境制御ユニット１３０３および培養基リザーバ１３０２に連結される。それぞれが、マイクロポンプ１３０４と流体連通する。マイクロポンプ１３０４は、培養基を環境制御ユニット１３０３および移植片チャンバ１３０１を通して循環させる。いくつかの実施形態において、マイクロポンプ１３０４は電池で動く。

本明細書では、開示される主題をある特定の好ましい実施形態に関して記載しているが、開示される主題に、その範囲から逸脱することなく様々な変更および改善を加えることが可能であることが当業者には認識されるであろう。さらに、開示される主題の１つの実施形態の個々の特徴が、本明細書において論じられる、またはその１つの実施形態の図面には示され、他の実施形態では示されないことがあるが、１つの実施形態の個々の特徴は、別の実施形態の１つもしくは複数の特徴、または複数の実施形態による特徴と組み合わせることが可能であることは明白であるはずである。

以下に請求される具体的な実施形態に加え、開示される主題は、以下に請求される従属的な特徴および上記において開示されたものの任意の他の可能な組み合わせを有する他の実施形態も対象にしている。したがって、従属請求項に示され、上記において開示された特定の特徴は、開示される主題の範囲内で他の形で互いに組み合わせることが可能であり、したがって、開示される主題は、任意の他の可能な組み合わせを有する他の実施形態も明確に対象にしていると認識すべきである。したがって、開示される主題の具体的な実施形態に関する前述の説明は、例示および説明のために示されたものである。網羅的であること、または開示される主題をそうした開示された実施形態に限定することは意図されない。

開示される主題の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される主題の方法およびシステムに、様々な変更および変形を加えることが可能であることが当業者には明らかになるであろう。したがって、開示される主題は、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内である変更形態および変形形態を含むことが意図される。

１００ スキャフォールド
１０２ スキャフォールド
２００ ＰＤＭＳブロック
２０２ ＰＤＭＳブロック
２１０ ケース、外側ケーシング
２１２ 孔、細孔
２２０ ケース、外側ケーシング
２３０ 鋳型
２４０ ロッド
２５０ 鋳型
２６０ ケース
３００ 流体経路マニホルド
３０１ 入口
３０２ 入口、マニホルド
３０４ 陥凹部、マニホルド
３０６ ポート
３０８ ポート
３１０ 流体
３１２ マニホルド
３１４ 陥凹部
３１６ ポート
３１８ ポート
３２０ 流体
３３０ チャネル
３２２ 流体経路ブロック
３２４ 流体経路ブロック
４００ 流体経路マニホルド
４０１ 出口
４０２ 出口
５００ ケース
５０２ ケース
１０００ 組立ユニット
１３００ システム
１３０１ 移植片チャンバ
１３０２ 培養基リザーバ
１３０３ 環境制御ユニット
１３０４ マイクロポンプ

Claims (14)

1. スキャフォールドと、
   少なくとも１つのＰＤＭＳブロックと、
   複数のマニホルドと、
   流体経路の構造的特徴を有するように構成され、かつ前記マニホルドの中に入れ子状に重なるように構成された複数の流体経路ブロックと、
   前記スキャフォールド、前記ＰＤＭＳブロックおよび前記複数のマニホルドの外側に配設されるケースと
   を備えるバイオリアクタ培養チャンバ。
2. 少なくとも１つの側面、ほぼ中央の空洞、および前記少なくとも１つの側面から前記ほぼ中央の空洞へ延びる複数のチャネルを有するブロックと、
   入口および出口を有し、前記複数のチャネルと流体連通する流体経路マニホルドと、
   前記流体経路マニホルドの外面のまわりに配設された筐体と
   を備えるバイオリアクタ培養チャンバ。
3. 前記筐体は実質的に管状である、請求項２に記載のバイオリアクタ。
4. 前記ブロックはＰＤＭＳを含む、請求項２に記載のバイオリアクタ。
5. 前記筐体は前記流体経路マニホルドに圧縮力を及ぼす、請求項２に記載のバイオリアクタ。
6. 前記複数のチャネルは、前記複数のチャネルのそれぞれが実質的に同じ流路抵抗を有するように構成される、請求項２に記載のバイオリアクタ。
7. 前記ほぼ中央の空洞の中に配設されたスキャフォールドをさらに備える、請求項２に記載のバイオリアクタ。
8. 前記スキャフォールドは複数のセルを含む、請求項７に記載のバイオリアクタ。
9. 前記入口はリザーバと流体連通する、請求項２に記載のバイオリアクタ。
10. 前記リザーバは栄養液を含む、請求項９に記載のバイオリアクタ。
11. 前記ブロックおよび前記筐体は、Ｘ線に対して実質的に透過性である、請求項２に記載のバイオリアクタ。
12. 前記ブロックおよび前記筐体は、ＭＲＩに対して実質的に透過性である、請求項２に記載のバイオリアクタ。
13. 入口および出口を有する追加の流体経路マニホルドさらに備え、前記筐体は、前記追加の流体経路マニホルドの外面のまわりに配設される、請求項２に記載のバイオリアクタ。
14. 前記スキャフォールドおよび前記ほぼ中央の空洞は、実質的に同じ形状である、請求項７に記載のバイオリアクタ。