JP2016512884A - マイクロ流体熱量計のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

反応のエンタルピーを測定するための装置および方法を開示する。ある用量（ボーラス）の反応体がマイクロ流体装置（106）に注入されると、そこで、その反応体が第二の流体と反応する。ナノホールのアレイ（114）を通過する異常光透過の変化によってカロリメトリー測定が実施される。

Description

関連出願
本出願は、参照により全体として本明細書に組み入れられる、2013年3月15日に出願された「Microfluidic Calorimetry in Continuous Flow with Transient Injection」と題する米国特許仮出願第61/793,545号への優先権を主張する。

財政支援
本明細書に記載された研究は、米国国立癌研究所および米国国立衛生研究所によって付与された助成金第R21CA131884号によって全体または一部において財政支援を受けたものである。合衆国政府は本開示において一定の権利を有する。

開示の背景
概して、本開示は、マイクロ流体カロリメトリーシステムおよびマイクロ流体熱量計を使用する方法に関する。より具体的には、本開示は、二つの試薬をマイクロ流体層流中に提供し、金属膜中のナノホールアレイを通過する光学信号を検出し、光学データを処理してカロリメトリー測定値を得るためのシステムおよび方法に関する。

カロリメトリーは、薬物リード化合物の発見および最適化における意思決定のための情報を提供する、医薬品研究開発における価値あるツールである。アフィニティーセンサのような、当産業によって使用される現在の高スループットスクリーニング法とは違って、カロリメトリー分析は、分子間の結合相互作用に関する非常に詳細な情報を提供することができる。カロリメトリーは、反応のエンタルピーおよびエントロピーをはじめとする詳細な熱力学的情報を提供する。エンタルピーを測定し、エントロピーを決定する能力は、薬物開発チームが、結合反応へのエンタルピーおよびエントロピーの相対的寄与を評価することを可能にする。エンタルピーは、結合反応中の結合の数およびタイプを動因とする。エントロピーは、リガンドおよび結合部位のジオメトリーを動因とする。エンタルピーおよびエントロピーの寄与を理解することは、より容易に最適化される化合物の選択を可能にするため、薬物開発において決定的である。具体的には、エンタルピーを動因とする反応が、その高度な選択性および反応性のゆえに、より好まれる傾向にある。

現在の技術では、初期の高スループットスクリーニングおよび第一の候補薬物選択はアフィニティー分析によって実施される。候補薬物のセットが絞り込まれて少数が選択されてはじめて、候補物質は、現在利用可能な二つのカロリメトリー技術：示差走査カロリメトリーおよび等温滴定型カロリメトリーによって分析されて、反応の熱化学的性質が測定される。現行世代の熱量計の限界は、
・エンタルピーの変化が小さい反応の場合の感度の不十分さ
・必要なタンパク質の量の多さ（0.5mg〜5mg）
・長い試験実施時間（60〜90分）および交絡効果の有意性を評価するために対照試験を順次に実施する必要性の両方による、試験スループットの低さ
を含む。潜在的な交絡効果は、主として、異種サンプル媒体（異なるpH、イオン強度および溶媒のバッファ）の混合による熱、化合物貯蔵からのDMSOの存在および溶媒和作用を含む。

さらには、溶解度が低い化合物は、多くの場合、高スループットスクリーン中でヒット化合物を生成する。残念ながら、試薬（タンパク質およびそのリガンド）の質量要件を満たすために求められるこれらの化合物の濃度は、多くの場合、溶解限界よりも上である。その結果、これらの化合物とそれらの標的との相互作用に関するカロリメトリー試験を実施することはできない。逆説的にいうならば、カロリメトリーを使用できるようになる前にさらなる合成／医薬品化学が必要であるが、この化学作業は、カロリメトリーデータなしでは正当化することができない。結果として、潜在的に有望な化合物が探求されない。より少量の試薬を分析する能力が、濃度に関するこの必要性を軽減するであろう。

医薬品分析の他にも、カロリメトリーはまた、材料科学および化学の多くの分科において価値がある。たとえば、カロリメトリーは、化学プロセスおよび安全設備の設計に使用される高反応性または爆発性化合物試験にも有用である。

開示の概要
したがって、製薬産業においては、マイクロ流体カロリメトリーのためのシステムおよび方法の必要性がある。表面プラズモン共鳴に関連する物理的現象である異常光透過を活用して、マイクロ流体層流中で起こる化学反応の温度変化を測定するための装置を製造することができる。そのような熱量計に対する前述の必要性を解決することに加えて、本明細書に開示されるマイクロ流体熱量計は静的な層流を使用し、従来のカロリメトリー法に対して数多くの利点がある。第一に、試薬の正確な量を知る必要がない。第二に、流路に沿って試薬を流し、反応を観察すると、試薬は流れながら拡散し、反応し続けるため、反応をその進行と同時に観察することが可能である。第三に、反応および拡散領域は空間的に動かないため（流路沿いの位置で放出される熱が試験期間中に一定のままであることを暗示する）、収集されたデータを時間的に積分してデータ中のノイズおよび誤差を減らすことができる。

本開示の一つの局面にしたがって、カロリメトリーの方法は、カロリメトリー装置を提供する工程を含む。装置は、マイクロ流体層流流路、層流流路に結合された第一の入口、および層流流路に結合された第二の入口を含む。装置はまた、第一の入口に結合された流体インジェクタおよびマイクロ流体層流流路に沿って配置された複数のマイクロスケールセンサを含む。方法は、第一の流体を第一の入口に通してマイクロ流体層流流路の中に流す工程および第二の流体を第二の入口に通してマイクロ流体流路の中に流す工程を含む。方法はさらに、第一の試薬ボーラスを流体インジェクタを介して第一の流路に注入する工程を含む。注入された第一の試薬はマイクロ流体流路中で第二の流体と接触する。そして、第一の試薬ボーラスがマイクロ流体流路を通って流れるとき、複数の試薬濃度についてカロリメトリー測定を実施する。

いくつかの態様において、方法はまた、試薬が定常状態で流れていたとき得られた第二のカロリメトリー測定値に近似する、カロリメトリー測定値の部分を分析する工程を含む。カロリメトリー測定は、いくつかの態様において、マイクロ流体層流流路沿いの特定の位置で実施される。

いくつかの態様において、方法は、第二の試薬がマイクロ流体層流流路中で第二の流体と接触するように、第二の試薬ボーラスを流体インジェクタを介して第一の流路に注入する工程を含む。そして、第二の試薬がマイクロ流体流路を通って流れるとき、複数の試薬濃度について第二のカロリメトリー測定を実施する。

いくつかの態様において、試薬と第二の流体との間の反応が温度変化を生じさせる。特定の態様において、複数のマイクロスケールセンサは温度センサであり、温度変化を検出する。温度センサは、層流流路の下に配置された金属層中のナノホールアレイである。ナノホールアレイは誘電体ミラーによって包囲されている。いくつかの態様においては、層流流路中の流体からの熱を金属層の表面に伝達するための層が、金属層と層流流路との間に配置される。

いくつかの態様においては、カロリメトリー測定値を計算するとき、反応のエンタルピー、反応の結合定数、ギブス自由エネルギー値、自由エネルギーの変化、エントロピー値およびエントロピーの変化の少なくとも一つを計算する。

いくつかの態様において、試薬ボーラスの量は約10nL〜約250nLである。マイクロ流体層流流路中の第二の流体の量は、カロリメトリー測定が実施されるときのマイクロ流体層流流路中の試薬の量の約4〜約10倍の大きさである。いくつかの態様において、第一の流体は、試薬と反応しないように選択される。特定の態様において、方法はまた、流体の拡散率に基づいて第一の流体および第二の流体の少なくとも一つの流量を選択する工程を含む。

本開示のもう一つの局面にしたがって、カロリメトリーのためのシステムは、マイクロ流体層流流路、層流流路に結合された第一の入口、および層流流路に結合された第二の入口を含む。システムはまた、第一の入口に結合された流体インジェクタ、およびマイクロ流体層流流路に沿って配置された複数のマイクロスケールセンサを含む。システムはまた、第一の試薬ボーラスがマイクロ流体流路を通って流れるとき、複数の試薬濃度についてカロリメトリー測定値を計算するためのプロセッサを含む。

いくつかの態様において、流体インジェクタは、第一の入口の近位端に結合された近位端および第一の入口の遠位端に結合された遠位端を含む。システムはまた、流体を流体インジェクタに選択的に導入して、流体インジェクタ中に貯蔵された試薬を第一の入口に射出するように構成されている、流体インジェクタの近位端に結合された弁を含む。いくつかの態様において、システムは、第二の入口に結合された第二の流体インジェクタを含む。流体インジェクタは、約10nL〜約250nLを保持するように構成されている。いくつかの態様において、流体インジェクタは、マイクロ流体層流流路よりも約0.25〜約10倍少ない量を保持するように構成されている。

いくつかの態様において、複数のマイクロスケールセンサは、第一の流体と試薬との反応によって生じる温度変化を検出するように構成された温度センサである。温度センサは、層流流路の下に配置された金属層中のナノホールアレイである。ナノホールアレイは誘電体ミラーによって包囲されている。いくつかの態様において、システムはまた、層流流路中の流体からの熱を金属層の表面に伝達するための、金属層と層流流路との間に配置された層を含む。特定の態様において、複数のマイクロスケールセンサは光学センサである。光学センサは表面プラズモンセンサであり、その応答が、光電子倍増管、電荷結合素子およびフォトダイオードの少なくとも一つによって測定される。

いくつかの態様において、システムは、マイクロ流体層流流路の顕微鏡写真を撮るように構成された顕微鏡を含む。いくつかの態様において、システムは、マイクロ流体層流流路の始端から特定の距離に配置されたマイクロスケールセンサのアレイを含む。

いくつかの態様において、プロセッサは、複数のマイクロセンサによって収集されたデータセットに応答してカロリメトリー測定値を計算するように構成されている。カロリメトリー測定は、反応のエンタルピー、反応の結合定数、ギブス自由エネルギー値、自由エネルギーの変化、エントロピー値およびエントロピーの変化の少なくとも一つの計算を含む。

プロセッサはまた、複数の特定のセンサ位置および試薬の注入後の複数の特定の時点で、試薬濃度の推定値を計算するように構成されている。プロセッサはまた、いくつかの態様において、前記カロリメトリー測定値を、定常状態流量条件下で得られたカロリメトリー測定値と比較するように構成されている。

いくつかの態様において、システムは、流体を装置の入口の中に流すように構成された制御可能な第一および第二の流体ポンプを含む。いくつかの態様において、第二の流体ポンプが第二の流体を第二の入口の中に流す速度は制御可能である。

したがって、マイクロ流体熱量計装置のためのシステムおよび方法が本明細書に開示される。一つの局面にしたがって、マイクロ流体熱量計システムは、熱量計装置および装置と接続したプロセッサを含む。装置は、流体をマイクロ流体層流流路の中に流すために二つの入口に接続されたマイクロ流体層流流路を含む。層流流路の下には、流路中の既知の位置に複数のマイクロスケール温度センサがある。プロセッサは、温度センサと接続しており、流路中のセンサのそれぞれの位置における局所温度に基づいて、マイクロスケール温度センサによって出力されるデータに基づくカロリメトリー測定値を決定する。

一例において、システムはまた、装置の温度を測定する環境温度センサを含む。温度制御装置がセンサから温度を受け取り、環境温度がほぼ一定になるように必要に応じて装置を加熱または冷却する。

一例において、温度センサは、層流流路の下の金属層中のナノホールアレイである。ナノホールアレイは誘電体ミラーによって包囲され得る。マイクロ流体熱量計システムはまた、層流流路中の流体からの熱を金属層の表面に伝達する層を、金属層と層流流路との間に含み得る。

一例において、システムはまた、光を金属層に当てる光源およびナノホールアレイを透過した光を測定する光学センサを含む。光学センサは、光電子倍増管、電荷結合素子（CCD）、CMOSセンサまたはフォトダイオードであり得る。一例において、システムは、層流流路の上方にある、または流路の一つの壁を形成する、光学ウィンドウを含む。

一例において、層流流路および入口は誘電材料から形成される。試薬を流れに導入するために注入弁が入口に接続され得る。システムはまた、入口を通過する流量を変化させるための制御装置を含み得る。

一例において、層流流路の中に流れる流体は、動かない拡散領域内で層流流路中に拡散する。非反応性流体のベースライン温度を測定するために温度センサが拡散領域の外で層流流路中に配置され得る。一例において、装置はまた、層流流路中または少なくとも一つの入口の化学濃度を検出するための化学センサを含む。

もう一つの局面にしたがって、本開示は、上記熱量計装置を使用してカロリメトリー測定値を決定する方法に関する。一例において、方法は、少なくとも複数の開口アレイのサブセットから測定された光および流路中の開口アレイのそれぞれの位置に関するデータを処理する工程を含む。少なくとも一つの光学センサからのデータは、プラズモン媒介光透過の原理にしたがって処理され得る。一例において、方法はさらに、反応と関連するエンタルピーが、得られる溶液の温度の変化を生じさせるように、試薬を流体中に配置する工程を含む。一例において、方法は、流体の拡散率に基づいて流体の流量を選択する工程を含む。

一例において、化学濃度プロフィールは既知であり、光学データが化学濃度プロフィールで逆畳み込みされて、ナノホールアレイにおける温度が決定される。一例において、データを処理する工程は、反応の結合定数、ギブス自由エネルギー、自由エネルギーの変化、エントロピーおよびエントロピーの変化の一つを温度から測定する工程を含む。

もう一つの局面にしたがって、本開示は、反応のカロリメトリー値を測定する方法に関する。方法は、上記装置に類似した装置の光学センサから光学センサデータを受け取る工程、流路沿いの各開口アレイ位置における光学データを処理して温度変化を測定する工程、ならびに、少なくとも温度変化、ナノホールアレイ位置、流量および初期試薬濃度からカロリメトリー値を計算する工程を含む。

上記様々な例に加えて、一例において、環境システム温度は、受け取った光学データを処理する際に使用される基準温度としてセットされる。もう一つの例においては、拡散領域の外の試薬の温度がベースライン温度として使用される。一例において、データを処理する工程は、データを時間的に積分する工程を含む。

もう一つの局面にしたがって、本開示は、流体をマイクロ流体層流流路の中に流すために二つの入口に接続されたマイクロ流体層流流路を含む使い捨てカロリメトリー装置に関する。層流流路の下には、流路中の既知の位置に複数のナノホールを有する金属膜層がある。層流流路、入口および金属膜層に関して上述した様々な例に加えて、一例において、装置は多重化されている。この例において、使い捨て装置はさらに、少なくとも第二の層流流路および金属層を含む。第一の層流流路中で実施される試験は、環境温度、試薬物質、溶媒物質、試薬濃度および試薬流量の少なくとも一つにおいて、第二の層流流路中で実施される試験とは異なることができる。

もう一つの局面にしたがって、本開示は、上記カロリメトリー装置の少なくとも一つを使用して、薬物と別のタンパク質との間の複数の反応に関する光学センサデータを生成する、医薬品開発の方法に関する。方法はさらに、各反応のカロリメトリー測定値を決定する工程および薬物の一つをさらなる治験のために選択する工程を含む。

もう一つの局面にしたがって、本開示は、流体をマイクロ流体層流流路の中の流すために二つの入口に接続されたマイクロ流体層流流路および層流流路に沿って配置された少なくとも一つの別個の温度感知装置を含む、温度感知のためのシステムに関する。

当業者は、本明細書に記載される図面が例示目的のみのためのものであることを理解するであろう。いくつかの例において、記載された態様の理解を容易にするために、記載される態様の様々な局面が誇張または拡大された状態で示されることが理解されよう。図中、類似の参照番号は、概して、様々な図面を通して類似の特徴、機能的に類似および／または構造的に類似の要素を指す。図面は必ずしも一定のスケールで描かれておらず、代わりに、教示の原理を説明することが重視されている。図面は、本教示の範囲を限定することを意図したものでは全くない。システムおよび方法は、以下の例示的説明から添付の図面を参照してより良く理解され得る。

システムおよび方法は、以下の例示的説明から添付の図面を参照してより良く理解され得る。

本開示の例示的態様の、マイクロ流体カロリメトリーのためのシステムのブロック図である。 本開示の例示的態様の、マイクロ流体カロリメトリーのシステムにおいて使用するための装置の分解ソリッドモデルである。 本開示の例示的態様の、光透過のための使用されるナノホールのアレイの図である。 図4aは、例示的なナノホールアレイを通過する複数の誘電率の場合の光透過率対波長のグラフである。図4bは、例示的なナノホールアレイを通過する光透過率対誘電率のグラフである。 本開示の例示的態様の、入口およびナノホールアレイを有する層流流路の図である。 図6a、6b、および6cは、本開示の様々な例示的態様の、マイクロ流体カロリメトリーのシステムに使用するための層流流路の断面図である。 本開示の例示的態様の、マイクロ流体カロリメトリーシステムに使用するための、注入弁を備えた層流流路の図である。 本開示の例示的態様の、図7Aに示すマイクロ流体カロリメトリーシステムの反応室の図である。 本開示の例示的態様の、図7Aの流体流路に類似した層流流路を使用して生成された試薬濃度測定値の一連の差分マップである。 本開示の例示的態様の、図1のマイクロ流体カロリメトリーシステムを使用する方法の流れ図である。 本開示の例示的態様の、カロリメトリー測定値を得るために図1のマイクロ流体カロリメトリーシステムから受け取った光学データを処理する方法の流れ図である。 本開示の例示的態様の、シミュレーションされた温度を示す。 本開示の例示的態様の、層流流路の幅方向の特定の位置における熱損失係数、温度および質量分率に関するシミュレーション結果を示すグラフを示す。 医薬品研究開発過程における化合物数と時間との間の傾向を示すグラフである。 本開示の例示的態様の、図1のマイクロ流体カロリメトリーシステムを利用する医薬品研究開発方法の流れ図である。

詳細な説明
以下、本開示の全体的理解を提供するために、マイクロ流体カロリメトリーのためのシステムおよび方法を含む特定の例示的態様を説明する。しかし、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、対処する用途に適切であるように適合および変形され得、他の適当な用途にも用いられ得ること、およびそのような他の追加および変形がそれらの範囲を逸脱しないことが当業者には理解されよう。

図1は、本開示の例示的態様の、マイクロ流体カロリメトリーのためのシステム100のブロック図である。システム100は、マイクロスケール化学反応から温度変化および他のカロリメトリー測定値を検出するために使用される。ユーザは、二つの試薬を層流流路の中に流し、通過させて試薬どうしをそれらの拡散界面で反応させることにより、マイクロ流体熱量計中で試験を実施する。光学センサが、反応による流動溶液の温度変化によって影響を受ける異常光透過（EOT）信号を検出する。EOT信号は、層流流路の下の金属膜中のナノホールを通して放出される。コンピュータがEOT信号を処理して、温度変化および他のカロリメトリー測定値を得る。

システムはカロリメトリー装置102およびプロセッサ140からなる。カロリメトリー装置102は光源104、使い捨て装置106および取り付け装置108からなる。使い捨て装置は層流流路110、入口112およびナノホール付き金属箔114からなる。二つの試薬が入口112から層流流路110に入る。層流流路および入口の配置は、図5に関してさらに詳細に説明する。層流流路の下には、光透過率感知に使用される複数のナノホールアレイを有する金属箔114がある。ナノホールアレイの真上の層流流路110中の液体の熱が金属箔中の表面プラズモン共鳴（SPR）に影響し、それが、それにより、ナノホールを通過する光透過率に影響する。ナノホールアレイ感知の原理は、図3および4に関してさらに詳細に説明する。

使い捨て装置106は、温度センサ120、温度制御装置122および光学センサ124からなる取り付け装置108中に配置される。温度センサ120および温度制御装置122は、環境温度変動が試験に影響を及ぼすことを防ぐために、ほぼ一定のシステム温度を維持するために使用される。温度センサ120は、環境システム温度130を検出し、それを温度制御装置122に送る。現在の環境システム温度130に基づき、温度制御装置122は、システムを加熱または冷却する、または、温度が設定温度に十分に近いならば、何の措置をも講じない。一つの態様において、環境温度は0.0002°K変動することを許されるが、反応によって放出される熱の量、必要な精度および温度センサの精度に依存して、環境温度は、より小さいまたはより大きい範囲内に保持されてもよい。温度130はまた、カロリメトリー装置の校正における使用またはカロリメトリー値を計算する際の基準温度としての使用のために、システムプロセッサ140に送られてもよい。

光学センサ124は、金属箔114中のナノホールを通して放出される光を検出する。光学センサ124は、光電子倍増管、フォトダイオード、電荷結合素子（CCD）もしくは他のイメージセンサまたはナノホールアレイを互いから区別するのに十分な感度で光を検出することができる任意の他の装置であり得る。光学センサは、ナノホールを通して受け取った光学データをプロセッサ140に送る。

カロリメトリー装置102はまた、ナノホール114を有する金属膜に向けて光を放出する光源104を含む。一つの態様において、光源104は、層流流路110中を移動し、入射角8で金属箔に当たる光を放出する。光源は単一波長レーザであり得る。または、光源はブロードバンド光源であってもよく、単色光線を送るためにモノクロメータまたは光学フィルタが使用されてもよいし、検出に分光測定技術が使用されてもよい。

図2は、マイクロ流体カロリメトリーのためのシステムの例示的態様における取り付け装置108および使い捨て装置106のパーツを示す分解ソリッドモデル200である。左から右に、ソリッドモデル200は、プラスチックカバー202、カバーガラス204、フローセル206、ナノホールアレイチップ208、取り付けトレー210、加熱ユニット212およびプラスチックベース214を示す。プラスチックカバー202、取り付けトレー210およびプラスチックベース214が装置を支持し、保護する。これらが取り付け装置108の主要構造部品である。使い捨て装置106の一部であるフローセル206は、層流流路110および入口112の壁を構成する特徴を含む。フローセル206は、フローセルを上から絶縁するポリジメチルシロキサン（PDMS）混合物から成形されるが、十分な精度で成形することができる別の同様に絶縁性の材料が使用されてもよい。3Dソリッドオブジェクトプリンタが、PDMSフローセルを創造するために使用される鋳型を作製し得る。または、フォトリソグラフィーを使用してフローセル106を形成してもよい。アクセスホール220、222および224がフローセルへの管材アクセスを許す。アクセスホール220は、流路を通過した後の流体を取り出し得るように層流流路110へのアクセスを提供し、アクセスホール222および224は、試薬を入口に導入するために二つの入口へのアクセスを提供する。アクセスホール222および224を通って入口112に入る管材は、入口112への注入量および速度を制御するための手段、たとえばシリンジポンプを備えたシリンジに接続する。取り付け要素202、210および214は、3Dソリッドオブジェクトプリンタまたは他の適当な製造法を使用して構築され得る。カロリメトリー装置をアセンブルしたのち、ねじまたは他の締め付けアセンブリ（図示せず）を使用してプラスチックカバー202およびプラスチックベース214を締め付けて、これらの要素を互いに接触させて保持する。

ナノホールアレイチップ208は、絶縁体としても働く透明な表面、たとえばガラス基材の上の伝導面、この場合はナノホール付き金属箔114からなる。ナノホール感知における使用に適当な金属のタイプおよび性質ならびにナノホールアレイチップの設計および製造に関するさらなる詳細は米国特許第7,318,907に記載されている。この特許の内容は全体として本明細書に組み入れられる。例示的な態様においては、まず、クロムまたは他の金属結合物質の薄い（たとえば25nm）層をガラス基材に蒸着させる。次いで、より厚い（たとえば105nm）金の層をクロムの上に蒸着させる。または、金属箔は、金、銀、アルミニウム、ベリリウム、レニウム、オスミウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、酸化レニウム、酸化タングステン、銅、チタンまたは別の適当な金属で作られることもできる。金属を蒸着させたならば、たとえばフォトリソグラフィー技術、電子ビームリソグラフィー法、集束イオンビーム（FIB）または他の方法を使用して金属中にナノホールアレイをミリングする。IpAの流れを用いるFIBの場合、金属層を貫通するミリングのために15秒が必要である。図1に示すように、ナノホールアレイチップ208は使い捨て装置の一部であり得る。ナノホールアレイチップ208は、流路に取り付けられてもよいし、取り付けトレー210が取り付け装置108と整合する別個の使い捨てパーツであってもよい。この態様においては、装置がアセンブルされ、締め付けられると、層流流路110中の流体は金属箔と直に接触する。

加熱ユニット212は、熱電ヒータおよび少なくとも一つの温度センサ、たとえばサーミスタからなる。ワイヤ226が加熱ユニット212を熱制御装置（図示せず）に接続し、この熱制御装置が、サーミスタからの温度に基づいて熱電ヒータを制御する。加熱ユニット212はまた、装置を冷却することができてもよい。図2には示さない光学センサ124がプラスチックベース214の下にある。加熱ユニット212ならびに取り付け要素210および214はそれらの中央に穴を有して、ナノホールを通過する光が光学センサ124に達し、光学センサによって測定されることができるようになっている。加熱ユニット中の穴は、層流流路110全体の温度一貫性に実質的に影響しない。

使い捨て装置106は少なくとも第二の層流流路（図示せず）を含み得、その層流流路は、同じセットの入口に流体的に接続されてもよいし、一つのチップ上で二つ以上の試験を可能にする多重化設計の場合、一つまたは複数のさらなる入口に流体的に接続されてもよい。金属箔114または第二の金属箔上のナノホールアレイのもう一つのセットが第二の層流流路の下にある。取り付け装置は、複数の試験を同時に実施する、または試験を一度に一つずつ実施するように構成され得る。試験が一度に一つずつ実施されるならば、取り付け装置は、各フローセルで試験が実施されるときフローセルからフローセルに移動する一つの光学センサを有し得る。多重化装置中の一つの層流流路中で実施される試験は、環境温度、試薬物質、溶媒物質、試薬濃度および試薬流量の少なくとも一つにおいて、異なる層流流路中で実施される試験とは異なることができる。

図3は一つの10×10ナノホールアレイ300の図である。光源からの入射光と、光源によって励起される表面プラズモン共鳴（SPR）との相互作用が、ナノホールからの異常光透過（EOT）と呼ばれるきわめて効率的な光透過を生じさせる。これまでの研究および試験結果が、濃度または温度の変化によるEOT信号の挙動が多様なナノホールパラメータ、たとえばナノホールの直径、ナノホール配列の形状（たとえば長方形配列対円形配列）、ナノホールアレイのサイズ、ナノホールアレイの配置などに依存することを示している。この態様において、ナノホールアレイ300は、正方形に配置された100個のナノホール302で形成されているが、ナノホールの数および配列は異なってもよい。たとえば、3×3および9×9のナノホールアレイもまた一般に使用される。ナノホールは、異なるパターン、たとえば六角形、直線または半球パターンに配列されてもよい。一つのナノホールの中心から隣接ナノホールの中心までで計測されるナノホール間のピッチ距離304および306がPDと表示されている。水平ピッチ距離304と垂直ピッチ距離306とは同じである。一つの態様において、ピッチ距離PDは350nmであり、各ナノホールの直径308は150nmである（Ji et al, 2008）。150nmの選択は、集束イオンビーム（FIB）および電子ビームリソグラフィーを使用する相対的に大きなホールの容易な作製によって決められる（Ji et al, 2008）。ホール直径は130nm〜290nmの範囲であり得るが、より小さなホールが使用されてもよい。ピッチ距離は、入射光の波長、ナノホールの幾何学模様ならびに金属膜の誘電率および金属膜上の溶媒の誘電率に依存する。ピッチ距離は220nm〜540nmの範囲であり得る。ピッチは、使用される光の波長および使用される幾何学模様の関数である。

各ナノホールアレイ300は、ナノホールアレイの透過ピークと関連する表面プラズモンエネルギーを反射し、閉じ込めるために、誘電体ミラー、たとえばブラッグミラーグローブによって包囲され得る。これは、強め合う干渉効果および弱め合う干渉効果を生じさせ、それにより、特定の波長における透過率を増減させる。ナノホール感知用途のためのブラッグミラーの使用は、Lindquist et al.（2009）にさらに詳細に論じられている。この内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。

EOTにおける透過光の割合は、複数の流体誘電率の場合の透過率対波長を示す図4aに示すように、入射光の波長によって影響を受ける（Krishnan, A. et al. 2001）。誘電率ε₁を有する特定の誘電流体層および誘電率ε₂を有する金属箔の場合、光が入射角θを有し、金属箔が格子定数a₀および定数γを有するならば、共鳴波長ピークは次式のとおりである。

式1は、カロリメトリーシステム中で観察される化学反応中に他すべての変数が一定であるとき、ピークにおける共鳴波長の変化が誘電流体層の誘電率の変化に基づくことを示す。誘電率の変化は材料の温度、圧力および濃度の変化に依存する。濃度定数を一定に保持しながら誘電率を温度および圧力の変化に関連させ、

（式中、ρは密度であり、Tは温度であり、βは体積膨張係数であり、Tは温度であり、k_Tは等温圧縮率係数であり、Pは圧力である）
と定めると、次式が得られる。

式中、定濃度Cは次式のとおりである。

温度および圧力条件の基準値はn₀およびP₀によって表される。図4aに示すように、試験結果は、流体の誘電率ε₂が変化するとき、ピーク波長およびピーク波長における透過率の両方が変化することを示す。そのうえ、単一の波長の場合、流体の誘電率が変化するとき、光学センサ124によって測定される透過率が変化する。

これは、サブ波長ナノホールアレイを透過する入射光の割合をナノホールに隣接する材料の誘電率に対して示すグラフである図4bにより明確に示されている（Krishnan, A. et al. 2001）。誘電率は材料の温度、圧力および濃度に依存するため、EOTセンサを温度センサとして使用することができる。

図5は、本開示の例示的態様の、ナノホールアレイ502および504を有する層流流路110および入口112の図である。流れは流路中で完全に展開し、定常状態にある。左側の入口は、暗い縞模様で示す第一の試薬506を含む。右側の入口は、一様な白で示す第二の試薬508を含む。例示的な医薬品試験の場合、一方の入口に通して流される流体は薬物を含有し、他方の入口に通して流される流体は、その薬物が結合し得る、または結合し得ないタンパク質を含む。他のタイプのカロリメトリー試験の場合には他の種類の試薬を使用し得る。明るめの縞模様領域510は、反応が起こっている二つの試薬の界面の拡散領域を示す。この拡散領域の形状は試薬の流量および流体の拡散率に依存し、より拡散性の試薬は、より非拡散の試薬よりも幅広い拡散領域を有する。試薬は、領域の形状または位置を制御するために、二つの異なる流量を与えられ得る。流路中の流量の許容可能範囲は0.0005m/s〜0.05m/sまたは0.15μL/min〜15μL/minである。説明のために、図5の入口は、層流流路に斜めに進入する状態で示されているが、層流流路への進入の前では、流体が層流進入時にx方向速度を有しないよう、入口と層流流路とは互いに実質的に平行であり、層流流路と横並びであることが好ましい。

拡散領域510は時間とともに動くことはなく、従来のカロリメトリー法に対していくつかの重要な利点を提供する。試薬量が流路に加えられると、試薬は流路を通って流れ続けて、拡散領域510下の所与のナノホールで、その上の流体が、試験期間中、実質的に類似した濃度および反応熱を有するようになる。これは、観察者がデータを時間的に積分することを可能にして、測定におけるノイズおよび誤差を減らす。加えて、拡散領域は流路の長さに沿って延展するため、複数の反応段階が同時に観察され、反応が時間とともにどのように進行するのかの詳細な観察が可能になる。さらには、左試薬と右試薬との比率が拡散領域の幅方向に変化するため、ナノホールは、流路の幅方向に、変化する試薬相対濃度での反応を観察する。

層流流路の幅512（wと表示）および流路の長さ514（lと表示）は一定のスケールではなく、一般に長さ1は幅wよりもずっと大きい。一つの態様において、試薬の実質的な相互拡散および反応生成物の生成を観察するのに十分な大きさの表面積を提供するために、wは500μmであり、長さは5000μmである。より概して、幅は一般に50〜1000μmの範囲であることができ、長さは約500〜10000μmの範囲であることができる。流路の幅および長さは、所望の試薬消費量および層流を維持する必要性によって上限が決まり、ナノホールアレイの最小分離距離およびナノホールアレイの所望の分解能、すなわちナノホールアレイセンサの数によって下限が決まる。層流流路の高さは、一つの態様において10μmであるが、一般に、1〜30μmの範囲であり得る。小さめの高さは試薬消費量を減らし、精度および感度を改善し得る。理由は、流路の高さ方向の温度の変動が最小化されるからである。しかし、実地の考慮事項、たとえば製造許容差および入口圧が流路高さの下限を決めることもある。試薬消費量は層流流路の内部幾何学容積によって決まる。二つの部品それぞれの試薬量は、この流路の長さ、幅および高さの積の半分に少なくとも等しい。実際には、流量を安定化し、測定を実施するためには、この積の一般に2〜10倍が必要である。層流流路を設計する際の他の考慮事項は、層流に必要な流量および試薬の拡散率である。流路幅および長さは、少なくともこれらの特性に依存して異なる。ナノホールアレイ502は、水平方向に距離512（aと表示）だけ等間隔に離れ、垂直方向に距離518（bと表示）だけ等間隔に離れている。図示するように、aとbは等しいが、等しくある必要はない。さらには、ナノホールアレイ502は、層流流路110全体を通して等間隔である必要はない。たとえば、水平方向に、ナノホールアレイ502は、試薬が反応するところの流路の中央の近くにより密集していてもよい。垂直方向に、ナノホールアレイ502は、試薬が反応し始めるところの入口112の近くにより密集していてもよい。温度変化を捕らえるためにはナノホールアレイ502を反応の近くに配置することが重要であるが、温度が反応によって影響されていない流体のベースライン測定を実施するためにナノホールアレイ502を層流流路110の縁の近くに配置することもまた有用であり得る。同様に、任意の反応または拡散の前に試薬のベースライン測定を実施するためにナノホールアレイ504または他のタイプの温度もしくは濃度センサを入口112中に配置することもまた有用であり得る。層流流路中のナノホール502の間隔を決定する一つの方法が、図10に関してさらに詳細に説明される。

図6は、マイクロ流体カロリメトリーのための層流流路の様々な断面図を示す。図6aは、PDMS流路604、ナノホール614付き金属箔606、ガラス基材608、加熱ユニット610および光学センサ612からなる層流流路600を示す。試薬が、PDMS流路604および金属箔606によって画定された長方形の中を移動する。入射光602がPDMS層604を透過して流路の中に移動し、金属箔606に当たる。これが金属箔の上で表面プラズモンを励起し、その表面プラズモンが光と相互作用して、ガラス基材608を透過し、光学センサ612に達するEOT616を生じさせる。前述したように、光学センサは、光電子倍増管、フォトダイオード、電荷結合素子（CCD）もしくは他のイメージセンサまたはナノホールアレイを互いから区別するのに十分な分解能で光を検出することができる任意の他の装置であり得る。加熱ユニット212に類似している加熱ユニット610は、ここでもまた、EOT616を妨害しない。層流流路および他の装置の要素は一定のスケールで描かれていない。

図6bは図6aに類似するが、層流流路の上に光学ウィンドウ638を含む。これは、反応を上から見ることを可能にする。これはまた、層流流路の側面を、そうでなければ光源を妨害するであろう材料、たとえばシリケートによって構成することを可能にする。理由は、光源は、妨害物質を透過するよりも光学ウィンドウを透過するからである。流路を製造するための代替材料へのアクセスが、より多くの材料選択肢により、より高い設計精度、ひいてはより小さな層流流路容積を可能にする。

図6cもまた図6aに類似するが、この場合、層流流路660は、金属箔646の上かつPDMS流路644の下に配置された誘電伝熱層658を含む。ナノホールアレイは、その表面から上に非常に小さな距離、たとえば100nmまでしか温度変化を感知することができないため、反応の熱が伝熱層658を通過して移動しなければならない、すなわち伝熱層がきわめて薄くなければならない。金属箔でコートされたガラス基材が二つ以上のカロリメトリー試験のために再使用されるならば、再使用可能な金属箔を試薬および反応から保護するために、伝熱層658は、図1の使い捨て装置106の一部になるであろう。層658は、たとえば、蒸着二酸化ケイ素、窒化ケイ素またはスピンコートもしくは蒸着されたポリマー、たとえばPDMS、アクリル樹脂もしくはポリカーボネートで構成され得る。

図7Aは層流流路を示す。層流流路700は、反応室715と呼ばれる下流部分、第一の流体入口ポート701、バッファ入口ポート702および出口ポート716を含む。層流流路700はまた、試薬入口ポート703を含み、これを通して試薬のボーラスを試薬貯蔵部705に注入することができる。層流流路700はまた、いくつかの弁706、708、709、710および711を含む。試薬貯蔵部705を満たすために、装置は、バッファ流体のような流体でプライミングされる。プライミングされたならば、弁706、708および711は閉じられる。弁709および710が開かれ、試薬のボーラスが試薬入口ポート703から試薬貯蔵部705に汲み込まれる。試薬ボーラスが試薬貯蔵部705に入ると、ボーラスの量が、試薬貯蔵部705中のプライミング流体の一部分を押し退ける。過剰なプライミング流体が出口ポート712を通って流れ出す。図5に示すように、この拡散領域の形状は試薬の流量および流体の拡散率に依存する。いくつかの態様において、バッファおよび／またはプライミング溶液は、任意の適当な水性バッファ、好ましくは感温性である誘電特性を有する光学的に明澄なバッファであることができる。

試験中、第一の流体およびバッファ流体がそれぞれ入口ポート701および702から装置に入る。第一の流体とは反応しないバッファ流体が流れている間にベースライン測定を実施してもよいし、校正を実施してもよい。層流が初期化されたのち、弁706を閉じ、弁708および711を開く。バッファ流体が試薬貯蔵部705（流体インジェクタとも呼ばれる）を通って流れるとき、試薬ボーラスが反応室715に注入される。反応室715へのボーラスの注入は、図7Bに関してさらに説明する。いくつかの態様において、装置は、試薬を定常状態流量レベルで反応室715中に流すのではなく、試薬のボーラスを注入するだけにより、試験に使用される試薬の量を最小化する。試薬が不足している、または高価である場合、これは特に有益である。いくつかの態様において、試薬ボーラスの量は、約5nL〜約300nL、約10nL〜約250nL、約10nL〜約200nL、約10nL〜約150nL、約10nL〜約100nLまたは約10nL〜約50nLである。いくつかの態様において、流体貯蔵部705は、反応室715よりも約0.25〜約10、約1.25〜約7または約2〜約5倍少ない量を保持するように構成されている。一つの態様において、試薬はタンパク質溶液であり、右側入口は薬物を含むが、他の用途、たとえば酵素学的研究、燃焼、制御システム、温度補償回路および爆発物の研究には他の試薬が使用されてもよい。もう一つの態様において、バッファ溶液が第一の流体入口ポート701およびバッファ入口ポート702の両方から注入される。いくつかの態様において、装置は、試薬を流体に注入するための二つ以上の試薬貯蔵部705を含むことができる。いくつかの態様において、試薬貯蔵部705ならびに不随する入口および出口ポートおよび弁は、第一の流体ポート701に接続された流路に結合される。いくつかの態様において、装置の流路は幅約150μm〜約300μmであり、高さ約15μm〜約50μmである。いくつかの態様において、反応室715の長さは約3mm〜約10mmである。

いくつかの態様において、ボーラスの注入および／または弁の開閉は層流流路への流体圧を乱さない。その乱れは層流を乱し得る。試薬が放出された後でさえ、流れは注入弁経路を通過し続けて、試薬の背後の流体の圧力は乱されないようになる。

この態様において、試薬は、弁を離れるとき、バッファ溶液と混合し得る。ボーラスを注入して、バッファ入口702からのバッファが、試薬貯蔵部705を出るときの試薬と混合することを許すとき、弁706は、わずかに開いたままであってもよい。この場合、ナノホールを使用して試薬溶液のEOT信号を測定し、その濃度を測定することができる。

注入システム中にポンプを使用して流量を調節し得る。たとえば、動電学的注入システムおよびぜん動注入システムまたは任意の他のマイクロスケール注入システム、たとえば内容全体が参照により本明細書に組み入れられるLeach, et al.（2003）に開示されている注入流動システムを使用し得る。一つの多重化態様においては、同じ層流流路を通して複数の試験を実施し得るように、複数の注入弁が一つの入口に配置される。

いくつかの態様において、試薬のボーラスを注入し、層流流路700中、Y接続713から特定の距離で試験することができる。たとえば、試薬のボーラス708を注入したのち、Y接続713から約0.10mm〜約0.15mm、約1.50mm〜約1.60mmまたは約3.0mm〜約3.2mmの距離で測定を実施することができる。

いくつかの態様において、ボーラスの小さなスケールおよびボーラスの不均一性が試験結果に有意に影響する。いくつかの態様において、定常状態連続流の下、ボーラス中の濃度プロフィールを同じ試薬の濃度プロフィールと比較することにより、試験結果に影響することができる分散、ボーラスプロフィールおよび他の不均一性の影響を考慮に入れる。いくつかの態様において、ユーザは、定常状態流の下、一つの試薬濃度プロフィールを創出したのち、その濃度プロフィールをその後のボーラス試験に使用することができる。特定の態様において、これが、その後の試験における試薬を節約することができる。

特定の態様においては、ボーラス濃度プロフィールを定常状態濃度プロフィールと比較して、定常状態の濃度プロフィールに近似するボーラス濃度プロフィールの領域を決定する。他の態様において、ボーラス濃度プロフィールは定常状態プロフィールと直接は比較されない。それどころか、ボーラス濃度プロフィールに関する詳細は、層流流路700の既知の流動力学に応じて評価される。

図7Bは、図7AのY接続713をさらに詳細に示す。上記のように、第一の流体が、入口701に結合されている流路721から反応室715に入る。ボーラス720は、バッファ流体によって運ばれ、流路722から反応室715に入る。ボーラス720と第一の流体との間の反応は、流路721からの流れと流路722からの流れとの間の層流界面723で測定される。いくつかの態様において、層流界面723で、ボーラス720と第一の流体との間の反応を、ボーラスと第一の流体との間の定常状態濃度プロフィールと比較することができる。

図7C〜7Eは、フルオレセインの50nLボーラスを、上記層流流路700に類似する、インジェクタ弁を備えた層流流路に注入した試験から生成された、ボーラス濃度プロフィールを定常状態濃度プロフィールと比較する一連の差分マップである。図7Cは、ボーラスが層流流路を0.11mm下流に移動したところでボーラスの濃度プロフィールを定常状態の濃度プロフィールと比較する差分マップである。図7Dは、ボーラスが層流流路を1.54mm下流に移動したところでボーラスの濃度プロフィールを定常状態の濃度プロフィールと比較する差分マップであり、図7Eは、ボーラスが層流流路を3.09mm下流に移動したところでボーラスの濃度プロフィールを定常状態の濃度プロフィールと比較する差分マップである。この試験において、差分マップは、ボーラス濃度プロフィールと定常状態濃度プロフィールとのパーセント差を示す。図7Cはまた、ボーラスの濃度プロフィールが定常状態濃度プロフィールに近似する差分マップの領域をマークする破線のボックスを含む。加えて、各濃度プロフィールはボーラスの進展を示すため、ボーラスが定常状態に近似するところの差分マップの領域の長さが反応の時間測定の近似値を提供する。

いくつかの態様において、ボーラスの濃度分布は、理論的計算および／またはシミュレーションから時間的および空間的に予測することができ、この情報を使用して、入口716および流路700への注入ののち任意の時点での試薬の濃度を推測することができる。そして、予測された濃度を温度測定値とともに使用して熱量を計算し得る。

いくつかの態様においては、ボーラスが層流流路700中を流れるとともにボーラスの濃度プロフィールが変化する。ボーラスは、層流流路700中で他の流体と相互拡散することができ、層流流路700が十分に長いならば、均一な流体混合物を形成することができる。ボーラスがその周囲の流体と相互拡散するとき、ボーラス中の試薬の相対濃度は低下する。この原理を使用して、いくつかの態様においては、一つのボーラスを層流流路700に注入し、それを使用して、試験流体との、複数の試薬濃度での化学反応を試験する。たとえば、試薬のボーラス708は、相対的に高い濃度レベルで層流流路700に注入することができる。ボーラスが層流流路700中を流れるとき、ボーラスは、周囲の流体と化学反応および／または相互拡散して、初期濃度に対して連続的に低下するボーラス濃度を生じさせる。いくつかの態様において、本明細書に記載されるような単回ボーラス式試験は、定常状態流量および異なる試薬濃度それぞれで実施される複数の試験に取って代わることができ、その中で、同じデータを生成するために要する試薬の量を減らす。

いくつかの態様において、ボーラスが反応室715の長さに沿って進むときのボーラスの縦方向延展、すなわち分散は数学的にモデル化される。いくつかの態様においては、Taylor-Aris流体力学的分散理論を使用して、ボーラスが反応室715の長さに沿って流れるときのボーラスの質量分布を予測する。ボーラスの分散の計算は、流路の高さおよび幅を与えられると、時間の関数として流路中の下流位置における平均濃度の計算を提供する。いくつかの態様において、反応室715は、ボーラスの濃度が所与の位置での反応室715の高さ方向に均一になることを許すのに十分な浅さであると仮定される。この手法において、流体流の速度v(x）にしたがって流路の幅方向に変化するようなペクレ数Pe(x）＝v(x）h/Dが定められる。ペクレ数は拡散係数の計算に使用される。

ボーラスの平均濃度は次式によって計算され得る。

上記式中、流路の高さは均一であると仮定され、ボーラスの初期濃度は1に正規化される。位置z₀はt＝0での濃度ステップの位置であり、erfは誤差関数である。

図8は、マイクロ流体熱量計、特に図1の熱量計を使用する方法の流れ図である。まず、装置および試薬を準備する（工程802）。これは、図7に関して説明したように、試薬を注入弁に入れる工程およびバッファ流体をさらに準備する工程を含み得る。試薬は、溶媒に溶解してもよいし、溶媒と混合してもよい。この場合、化学反応の熱が流体中に検出可能な温度変化を生じさせる。装置を準備する工程は、たとえば少なくとも入口および層流セルを含む使い捨て装置を取り付け装置に挿入することにより、光学センサ、ナノホールおよび層流流路が正しく整列し、加熱ユニットが正しい位置にあり、光路を妨害しないようなやり方でカロリメトリー装置をアセンブルする工程を含む。場合によっては、準備はまた、光源がナノホールに向けられ、層流流路に上から入るならば、入射角がわかるように光源を整合させる工程を含む。外部流体供給源または注入弁への任意の管材を接続する。最後に、必要に応じて、外部熱制御装置およびデータを受信し、処理するためのコンピュータへの配線を接続する。

次に、試薬をマイクロ流体流路に通して流す（工程804）。流量は、試験を開始する前に選択され、バッファ溶液のための注入機構および任意の注入弁を含む注入システムによって制御される。または、バッファ溶液が層流流路中を通過するとき、流量を調節してもよいし、他の校正を実施してもよい。両方の入口が、バッファ溶液による初期化ののちサンプルを注入する注入弁に接続されるならば、注入弁からの試薬の放出は、両方の試薬が層流流路を同時に占めるように注意深く制御されなければならない。

流体が層流流路中に流されると、光学センサがナノホールを通して光出力を感知し、そのデータを、接続されたコンピュータプロセッサに送る（工程806）。すると、コンピュータプロセッサは、少なくとも光放出データを処理して、反応のカロリメトリー測定値を決定する（工程808）。カロリメトリー測定値を決定するためのデータ処理は、図9に関して説明する。

図9は、光学データを処理してカロリメトリー測定値を得る方法の流れ図である。コンピュータが光学センサから光学データ906を受け取る。また、コンピュータは、流路沿いの光学センサ910の位置をメモリ中に有する、または受け取る。光学センサデータは、D＝TC＋Error（Dは、空間的な光学データの行列であり、Tは、濃度行列Cとで畳み込みされる温度行列であり、Error項は試験測定ノイズである）の関係で、濃度および温度の両方に依存する。多変量曲線分解交互最小二乗（MCR-ALS）法が、所与の制約、たとえば非負性、閉包または他のハードモデル化制約の範囲内で試験データと最良に当てはまる濃度および温度を反復的に計算するために使用され得る逆畳み込み技術である。他の適当な反復または非反復逆畳み込み法を使用してもよい。光学データは流体の濃度および温度の両方に依存するため、化学濃度に関する情報908は、光学データからナノセンサアレイ位置における流体温度を決定する（工程902）ために、既知であることが好ましい。試薬は層流中で拡散を受けているため、試薬の既知の質量輸送特性を使用して、温度を決定するために逆畳み込みアルゴリズム中で使用される濃度の初期推測を決定し得る。加えて、層流流路または入口中のナノホールアレイを、温度が既知である位置における化学濃度センサとして使用してもよい。または、他のタイプの化学濃度センサを層流流路または入口に沿って配置して濃度を直接測定してもよい。拡散領域は空間中で動かないため、温度マップおよび光学データは、時間とともに動くことはないはずである。したがって、ノイズ項を減らすために、データを時間的に積分し得る。

局所温度が決定されたならば、他のカロリメトリー測定値を計算し得る（工程904）。図5中、流体504と流体506との初期交差点でxおよびz方向が示されている。原点（x＝0、y＝0、z＝0）は、金属箔の上の平面において右側入口の右縁が層流流路と出会うところである。xおよびy方向は図6Aに示されている。流路中のエネルギー方程式は以下のとおりである。

式中、pは流体の密度であり、cは流体の比熱であり、V_zは流路沿いz方向の速度であり、Tは温度であり、kは、流路中を流れる溶液の熱伝導率であり、qは、反応による熱の放出または吸収である。

流路深さd（y＝0〜Y＝d）にかけてy方向に積分し、T＝1/d∫Tdyと定めると、次式が得られる。

試験結果は、q〜＝o>>q〜＝d'であることを示し、よって、PDMS側の損失を無視し得る。次に、x＝0からx＝wまでx方向に積分すると、次式が得られる。

境界におけるx方向への熱伝達は断熱的であり、よって、次式が得られる。

式中、q(z）は、流路の幅xおよび深さyにかけて平均化した化学反応による局所熱源である。ここで、温度Tはまた、流路幅xにかけて平均化される。q〜＝oは、チップ表面から来る熱流束を表し、次式によって近似することができる。

式中、H(x,z）は、試験的に決定されたシステムの校正損失係数である。流れ方向に沿って位置Z1とZ2との間で、全熱源は、局所熱源をz方向に沿って積分することによって得ることができる。f＝Tと設定し、書き換えると、次式が得られる。

この分析手法において、一般的な形態のエネルギー方程式を使用すると、熱源の項が重視され、以前の数値結果に基づいて必要な簡約が実施されている。式11は、この試験構成の場合の流れ場の温度測定に基づいて反応のエンタルピー（ΔH＝q/n_AB）を抽出することができることを示す。反応および温度のエンタルピーから、さらなるカロリメトリー測定値、たとえば反応の結合定数、ギブス自由エネルギー、自由エネルギーの変化、エントロピーおよび温度からのエントロピーの変化を計算することができる。

たとえば、結合定数K_Dは、エネルギー収支中の温度プロフィールを使用して、X₁、X₂、Z₁、Z₂および流路高さによって画定される容積を使用して、その容積中の反応による熱源qを測定することによって得ることができる。いくつかの容積X₂、X₃、Z₁、Z₂；X₃、X₄、Z₁、Z₂...X_n、X_n+1、Z₁、Z₂に関してこの計算を繰り返すと、様々な量の反応体および生成物の場合に放出されるエネルギーに関する情報が提供される。各容積中の反応による測定された熱源は反応のエンタルピーおよび結合定数に関連する。この情報を、以下、組み合わせた物質収支および結合定数定義において使用して、様々な容積中の反応による測定された熱源を使用して、結合定数を繰り返し測定する。

正確なエンタルピー測定値を得るために、ナノホールアレイは、隣接するセンサーを妨害することなく十分な測定分解能を提供するべきである。最適なナノセンサアレイ配置を決定するために、様々な配置のナノホールアレイを用いる反応シミュレーションを実施した。まず、図5に関して上述した寸法（w＝500μm、1＝5000μm）および10μmに等しい深さを有する層流流路のモデルをコンピュータ流体力学ソフトウェアFLUENTで作製した。3D空間中のNaOH＋HCl反応の定常状態ケースに関して連続、ナビエ・ストークス、質量輸送および反応速度の式を500,000のノードで解き、図10に示すような温度場を金属箔の表面に得た。モデルは、流路の壁でのスリップなし条件および側壁が断熱性であることを仮定する。298.15Kで水の性質としてモデル化された流体混合物の熱物理的性質は、反応の温度変化としてわずか±5Kであり、混合物は大部分が水である。図10は、このモデルによって作製された温度マップを示す。

シミュレーションモデルに対して熱境界分析を実施してy方向の温度を分析した。金属箔の直近で感知された温度は、流路に対して垂直な平均温度の99.8610％であることがわかった。ナノホールアレイのようなSPRセンサは、近接場、すなわち入射波長（−150nm）のλ/4の厚さの温度を感知するだけであるため、これは、近接場感知が流路全体の温度を正確に表すことを確認する。

また、層流流路中の反応の温度場のための妥当なモデルが、最適なナノホールアレイ間隔を決定することを可能にする。センサ間隔分析のために、金属箔表面（y＝0の面）における温度、熱流束および濃度をFLUENTモデルから決定した。式13からの各項は、複数の間隔値の場合には等間隔の点で推定され、各アレイにおける生成エンタルピーは、次式を使用して推定され得る。

したがって、生成エンタルピーは、様々なアレイ間隔アルゴリズムおよびシミュレーションによってわかった熱損失係数のマップを使用して推定される。各間隔アルゴリズムの成功は推定生成エンタルピーの精度によって決まる。生成エンタルピーに代えて、またはそれに加えて、他の既知の測定値、たとえば質量分率およびエントロピーの推定値を使用してもよい。手順は、アレイ間の様々な水平間隔値、様々な入口速度およびz方向の様々なインターバルに関して繰り返される。手順はまた、様々なアレイ配列、拡散速度または他の変数に関して繰り返されてもよい。

三つのセンサ間隔アルゴリズムを調査した。
1. 基準としてx＝0の壁を採用し、センサをセンサ間隔距離と等間隔で配置する。
2. 基準としてxに対する流路の中央を採用し、センサをセンサ間隔距離と等間隔で配置する。
3. 基準としてxに対する流路の中央を採用するが、第一のセンサは、センサ間隔値の半分中央から離れる（すなわち、中央にセンサはない）。

加えて、0.0005m/s、0.005m/sおよび0.05m/sの流速の場合の間隔を調査した。予想どおり、所与の長さの流路の場合、x方向の拡散幅は低い滞留時間のゆえに小さいため、より高い流量の場合にはx方向により大きな分解能が必要である。異なる反応が異なる拡散率を有するため、設定ナノホールアレイ間隔に関して必要な分解能を達成するために試薬の流量を変化させることができる。

前述の間隔アルゴリズムそれぞれによって離間させた211m〜120 11mの範囲のセンサ間隔の場合、誤差率は、40 11mののち、濃度、温度および熱損失係数曲線の形状のゆえに、ガウス分布に類似するxの関数として逸脱し始める。図11は、0.0005mlsの流量の場合、z＝50 11mで、xに対する熱損失係数1102および温度1104曲線を示す。Z₁＝50μmおよびZ₂＝800μmでのNaClの質量分率曲線1106および1108がそれぞれ曲線1102および1104の下にある。60μm間隔配置が流路の幅方向の熱損失および温度平均を十分に表すことができるが、入口の近くの領域における質量分率を表すことはできない。この挙動は、熱伝導率（拡散率）定数のより大きな値に比べてx方向における質量拡散係数の低い値に起因する。特定の間隔配置において、センサ位置は、一つの点が曲線の全平均を表すことができる位置（図11の質量分率グラフ中の水平線の近傍）に対応することができる。しかし、これらの位置は、曲線特性に依存し、多くのパラメータ、たとえば反応の性質およびz位置とともに変化することができる。したがって、誤差分析は、特に注意して実施されるべきである。結果は、40μmののち、この挙動が生じ始めることを示す。したがって、例示的態様において、センサは10〜30μm間隔の格子に配列される。

このタイプのモデル化は、他の流量に最適なセンサ間隔を決定するために使用することができる。概して、より高い流量は、流路の幅にかけてx方向により密な間隔のセンサを必要とする。さらには、示したモデルは、センサが流路の中央により密集している間隔のような、間隔センサの他のアルゴリズムを試験するために使用することもできる。モデル化のためにはFLUENTまたは別のコンピュータ流体力学ソフトウェアを使用し得る。

医薬品開発用途
図12は、医薬品研究開発過程における化合物数と時間との間の傾向を示すグラフである。はじめに、特定の治療標的のために調査される化合物が数多くある。現在、過程のはじめに高スループットスクリーニングが使用され、カロリメトリーは概して、開発過程のかなり遅くまで化合物に対して実施されない。本明細書に開示されるマイクロ流体カロリメトリー装置の一つの目的は、カロリメトリーを薬物開発のより早い時期に利用して化合物数対時間の曲線を下寄りの点線まで押し下げ得るよう、高感度かつ高速の低量カロリメトリー測定を可能にすることである。

図13は医薬品研究開発の方法の流れ図である。まず、高スループットスクリーニング（HTS）を実施する（工程1302）。HTSは、生物学的実体、たとえばタンパク質、細胞、胚などが化合物と反応するかどうかを判定するための自動化された方法である。現在のHTSシステムは1日100,000種までの化合物を試験することができ、HTSスクリーニングの進歩はその出力を絶えず増している。HTSは多数の化合物を試験することを可能にするが、化合物が有効であるかどうかに関する二値の結果を提供するだけである。多数の化合物に対して実施することができる他のスクリーニング法を追加的または代替的に使用してもよい。

高スループットスクリーニングおよび／または他のスクリーニング試験ののち、次に、カロリメトリーを使用して化合物を試験する（工程1304）。高スループットスクリーニングで反応した化合物は、現在、二つのカロリメトリー技術：示差走査カロリメトリーおよび等温走査カロリメトリーを使用して試験されている。本明細書に開示される発明のマイクロ流体カロリメトリー法は、示差走査カロリメトリーおよび等温走査カロリメトリーの両方に取って代わることができ、より速やかに結果を出し、潜在的に、現在の熱量計の試薬消費量の1/1000しか使用しない。図9に関して上述したように、光学データ1314を処理して、薬物−タンパク質相互作用のエンタルピー特性を測定し（1306）、カロリメトリーデータ1316を生成する。次いで、そのデータを解析して薬物候補物質をフィルタリングする（1308）。フィルタリングは、特定範囲のエンタルピーおよび／またはエントロピーを有するすべての化合物を戻し得る。または、フィルタリングは、最良の結果を出した所与の数の化合物を選択してもよい。カロリメトリー計測値を重みづけし、合計して、各化合物に複合スコアを与えてもよい。フィルタリングの結果は、施設内審査委員会ののち第一ラウンドの治験に選択される薬物候補物質のサブセット1318である。治験の前に他の前臨床試験、たとえばインビボまたはインビトロ試験が必要になることもある。

本開示の好ましい態様が本明細書に示され、記載されたが、そのような態様は例として提供されただけであることが当業者には明らかであろう。本開示を逸脱することなく、数多くの改変、変更および置換が当業者には思い浮かぶであろう。本明細書に記載される開示の態様に対する様々な代替を用いても本開示を実施し得ることが理解されよう。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を限定し、特許請求の範囲およびその均等物の範囲内の方法および構造が特許請求の範囲によって包含されるものとする。

参考文献

Claims (74)

1. マイクロ流体層流流路と、
   該層流流路に結合された第一の入口と、
   該層流流路に結合された第二の入口と、
   該第一の入口に結合された流体インジェクタと、
   該マイクロ流体層流流路に沿って配置された複数のマイクロスケールセンサと
   を含むカロリメトリー装置を提供する工程；
   第一の流体を該第一の入口に通して該マイクロ流体層流流路の中に流す工程；
   第二の流体を該第二の入口に通して該マイクロ流体流路の中に流す工程；
   第一の試薬が該マイクロ流体流路中で該第二の流体と接触するように、第一の試薬ボーラスを該流体インジェクタを介して第一の流路に注入する工程；および
   該第一の試薬ボーラスが該マイクロ流体流路を通って流れるとき、複数の試薬濃度についてカロリメトリー測定値を計算する工程
   を含む、カロリメトリーの方法。
2. 試薬が定常状態で流れていたとき得られた第二のカロリメトリー測定値に近似する、前記カロリメトリー測定値の部分を分析する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
3. カロリメトリー測定値を計算する工程が、マイクロ流体層流流路沿いの特定の位置でカロリメトリー測定値を計算することをさらに含む、請求項1記載の方法。
4. 第二の試薬がマイクロ流体流路中で第二の流体と接触するように、第二の試薬ボーラスを流体インジェクタを介して第一の流路に注入する工程；および
   該第二の試薬ボーラスが該マイクロ流体流路を通って流れるとき、複数の試薬濃度についてカロリメトリー測定値を計算する工程
   をさらに含む、請求項1記載の方法。
5. 複数のマイクロスケールセンサが温度センサである、請求項1記載の方法。
6. 温度センサが、層流流路の下に配置された金属層中のナノホールアレイである、請求項5記載の方法。
7. ナノホールアレイが誘電体ミラーによって包囲されている、請求項6記載の方法。
8. 層流流路中の流体からの熱を金属層の表面に伝達するための、該金属層と該層流流路との間に配置された層をさらに含む、請求項6記載の方法。
9. カロリメトリー測定値を計算する工程が、反応のエンタルピー、反応の結合定数、ギブス自由エネルギー値、自由エネルギーの変化、エントロピー値およびエントロピーの変化の少なくとも一つを計算することを含む、請求項1記載の方法。
10. 試薬の量が約10nL〜約1マイクロLである、請求項1記載の方法。
11. マイクロ流体層流流路中の第二の流体の量が、カロリメトリー測定が実施されるときのマイクロ流体層流流路中の試薬の量の約4〜約10倍の大きさである、請求項1記載の方法。
12. 第一の流体が試薬と反応しない、請求項1記載の方法。
13. 流体の拡散率に基づいて第一の流体および第二の流体の少なくとも一つの流量を選択する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
14. 試薬と第二の流体との間の反応が温度変化を生じさせる、請求項1記載の方法。
15. 第一の試薬ボーラスが約5nL〜約250nLである、請求項1記載の方法。
16. マイクロ流体層流流路と、
    該層流流路に結合された第一の入口と、
    該層流流路に結合された第二の入口と、
    該第一の入口に結合された流体インジェクタと、
    該マイクロ流体層流流路に沿って配置された複数のマイクロスケールセンサと、
    第一の試薬ボーラスが該マイクロ流体流路を通って流れるとき、複数の試薬濃度についてカロリメトリー測定値を計算するように構成されたプロセッサと
    を含む、カロリメトリーのためのシステム。
17. 流体インジェクタが、第一の入口の近位端に結合された近位端と、該第一の入口の遠位端に結合された遠位端と、流体を該流体インジェクタに選択的に導入して、該流体インジェクタ中に貯蔵された試薬を該第一の入口に射出するように構成されている、該流体インジェクタの該近位端に結合された値とを含む、請求項16記載のシステム。
18. 第二の入口に結合された第二の流体インジェクタをさらに含む、請求項16記載のシステム。
19. 流体インジェクタが、約5nL〜約250nLを保持するように構成されている、請求項16記載のシステム。
20. 流体インジェクタが、マイクロ流体層流流路よりも約0.25〜約10倍少ない量を保持するように構成されている、請求項16記載のシステム。
21. 複数のマイクロスケールセンサが温度センサである、請求項16記載のシステム。
22. 温度センサが、層流流路の下に配置された金属層中のナノホールアレイである、請求項16記載のシステム。
23. ナノホールアレイが誘電体ミラーによって包囲されている、請求項22記載のシステム。
24. 層流流路中の流体からの熱を金属層の表面に伝達するための、該金属層と該層流流路との間に配置された層をさらに含む、請求項22記載のシステム。
25. 複数のマイクロスケールセンサが光学センサである、請求項16記載のシステム。
26. 光学センサが表面プラズモンセンサであり、その応答が、光電子倍増管、電荷結合素子およびフォトダイオードの少なくとも一つによって測定される、請求項25記載のシステム。
27. マイクロ流体層流流路の顕微鏡写真を撮るように構成された顕微鏡をさらに含む、請求項16記載のシステム。
28. 複数のマイクロスケールセンサがマイクロスケールセンサのアレイである、請求項16記載のシステム。
29. マイクロスケールセンサのアレイが、マイクロ流体層流流路の始端から特定の距離に配置されている、請求項28記載のシステム。
30. 複数のマイクロセンサによって収集されたデータセットに応答してカロリメトリー測定値を計算するように構成されたプロセッサをさらに含む、請求項16記載のシステム。
31. カロリメトリー測定が、反応のエンタルピー、反応の結合定数、ギブス自由エネルギー値、自由エネルギーの変化、エントロピー値およびエントロピーの変化の少なくとも一つの計算を含む、請求項30記載のシステム。
32. プロセッサがさらに、複数の特定のセンサ位置および流体インジェクタによる試薬の注入後の複数の特定の時点で、試薬濃度の推定値を計算するように構成されている、請求項16記載のシステム。
33. プロセッサがさらに、前記カロリメトリー測定値を、定常状態流量条件下で得られたカロリメトリー測定値と比較するように構成されている、請求項30記載のシステム。
34. 第一の流体を第一の入口の中に流すように構成された第一の流体ポンプをさらに含む、請求項16記載のシステム。
35. 第一の流体ポンプが第一の流体を第一の入口の中に流す速度が制御可能である、請求項34記載のシステム。
36. 第二の流体を第二の入口の中に流すように構成された第二の流体ポンプをさらに含む、請求項16記載のシステム。
37. 第二の流体ポンプが第二の流体を第二の入口の中に流す速度が制御可能である、請求項36記載のシステム。
38. マイクロ流体層流流路と、
    該層流流路に結合された第一の入口と、
    該層流流路に結合された第二の入口と、
    該第一の入口に結合された流体インジェクタと、
    該マイクロ流体層流流路に沿って配置された複数のマイクロスケールセンサと
    を含むカロリメトリー装置を提供する工程；
    第一の流体を該第一の入口に通して該マイクロ流体層流流路の中に流す工程；
    第二の流体を該第二の入口に通して該マイクロ流体流路の中に流す工程；
    第一の試薬が該マイクロ流体流路中の該第二の流体と接触するように、約100ナノリットル未満の第一の試薬ボーラスを該流体インジェクタを介して第一の流路に注入する工程；および
    該第一の試薬ボーラスが該マイクロ流体流路を通って流れるとき、カロリメトリー測定値を計算する工程
    を含む、カロリメトリーの方法。
39. 第一の試薬ボーラスが約5ナノリットル〜約50ナノリットルである、請求項38記載の方法。
40. 第一の試薬ボーラスがマイクロ流体流路を通って流れて、該ボーラス中の第一の試薬の濃度が変化するとき、複数の第一の試薬濃度についてカロリメトリー測定値を計算する、請求項38記載の方法。
41. 試薬が定常状態で流れていたとき得られた第二のカロリメトリー測定値に近似する、前記カロリメトリー測定値の部分を分析する工程をさらに含む、請求項38記載の方法。
42. カロリメトリー測定値を計算する工程が、マイクロ流体層流流路沿いの特定の位置でカロリメトリー測定値を計算することをさらに含む、請求項38記載の方法。
43. 第二の試薬がマイクロ流体流路中で第二の流体と接触するように、第二の試薬ボーラスを流体インジェクタを介して第一の流路に注入する工程
    をさらに含む、請求項38記載の方法。
44. 第二の試薬ボーラスがマイクロ流体流路を通って流れるとき、複数の試薬濃度についてカロリメトリー測定値を計算する工程をさらに含む、請求項38記載の方法。
45. 複数のマイクロスケールセンサが温度センサである、請求項38記載の方法。
46. 温度センサが、層流流路の下に配置された金属層中のナノホールアレイである、請求項45記載の方法。
47. ナノホールアレイが誘電体ミラーによって包囲されている、請求項45記載の方法。
48. 層流流路中の流体からの熱を金属層の表面に伝達するための、該金属層と該層流流路との間に配置された層をさらに含む、請求項45記載の方法。
49. カロリメトリー測定値を計算する工程が、反応のエンタルピー、反応の結合定数、ギブス自由エネルギー値、自由エネルギーの変化、エントロピー値およびエントロピーの変化の少なくとも一つを計算することを含む、請求項38記載の方法。
50. 試薬の量が約10nL〜約1マイクロLである、請求項38記載の方法。
51. マイクロ流体層流流路中の第二の流体の量が、カロリメトリー測定が実施されるときのマイクロ流体層流流路中の試薬の量の約4〜約10倍の大きさである、請求項38記載の方法。
52. 第一の流体が試薬と反応しない、請求項38記載の方法。
53. 流体の拡散率に基づいて第一の流体および第二の流体の少なくとも一つの流量を選択する工程をさらに含む、請求項38記載の方法。
54. 試薬と第二の流体との間の反応が温度変化を生じさせる、請求項38記載の方法。
55. マイクロ流体層流流路と、
    該層流流路に結合された第一の入口と、
    該層流流路に結合された第二の入口と、
    該第一の入口に結合された流体インジェクタと、
    該マイクロ流体層流流路に沿って配置された複数のマイクロスケールセンサと、
    約100ナノリットル未満の第一の試薬ボーラスが該マイクロ流体流路を通って流れるとき、カロリメトリー測定値を計算するように構成されたプロセッサと
    を含む、カロリメトリーのためのシステム。
56. 第一の試薬ボーラスが約10ナノリットル〜約50ナノリットルである、請求項55記載のシステム。
57. プロセッサがさらに、第一の試薬ボーラスがマイクロ流体流路を通って流れて、該ボーラス中の第一の試薬の濃度が変化するとき、複数の第一の試薬濃度についてカロリメトリー測定値を計算するように構成されている、請求項55記載のシステム。
58. 流体インジェクタが、第一の入口の近位端に結合された近位端と、該第一の入口の遠位端に結合された遠位端と、流体を該流体インジェクタに選択的に導入して、該流体インジェクタ中に貯蔵された試薬を該第一の入口に射出するように構成されている、該流体インジェクタの該近位端に結合された値とを含む、請求項55記載のシステム。
59. 第二の入口に結合された第二の流体インジェクタをさらに含む、請求項55記載のシステム。
60. 流体インジェクタが、約10nL〜約250nLを保持するように構成されている、請求項55記載のシステム。
61. 流体インジェクタが、マイクロ流体層流流路よりも約1〜約10倍少ない量を保持するように構成されている、請求項55記載のシステム。
62. 複数のマイクロスケールセンサが温度センサである、請求項55記載のシステム。
63. 温度センサが、層流流路の下に配置された金属層中のナノホールアレイである、請求項62記載のシステム。
64. ナノホールアレイが誘電体ミラーによって包囲されている、請求項63記載のシステム。
65. 層流流路中の流体からの熱を金属層の表面に伝達するための、該金属層と該層流流路との間に配置された層をさらに含む、請求項63記載のシステム。
66. 複数のマイクロスケールセンサが光学センサである、請求項55記載のシステム。
67. 光学センサが表面プラズモンセンサであり、その応答が、光電子倍増管、電荷結合素子およびフォトダイオードの少なくとも一つによって測定される、請求項66記載のシステム。
68. マイクロ流体層流流路の顕微鏡写真を撮るように構成された顕微鏡をさらに含む、請求項55記載のシステム。
69. 複数のマイクロスケールセンサがマイクロスケールセンサのアレイである、請求項55記載のシステム。
70. マイクロスケールセンサのアレイが、マイクロ流体層流流路の始端から特定の距離に配置されている、請求項69記載のシステム。
71. 複数のマイクロセンサによって収集されたデータセットに応答してカロリメトリー測定値を計算するように構成されたプロセッサをさらに含む、請求項55記載のシステム。
72. カロリメトリー測定が、反応のエンタルピー、反応の結合定数、ギブス自由エネルギー値、自由エネルギーの変化、エントロピー値およびエントロピーの変化の少なくとも一つの計算を含む、請求項71記載のシステム。
73. プロセッサがさらに、複数の特定のセンサ位置および流体インジェクタによる試薬の注入後の複数の特定の時点で、試薬濃度の推定値を計算するように構成されている、請求項55記載のシステム。
74. プロセッサがさらに、前記カロリメトリー測定値を、定常状態流量条件下で得られたカロリメトリー測定値と比較するように構成されている、請求項71記載のシステム。

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