JP2016506380A - グリシル−l−2−メチルプロリル−l−グルタミン酸を使用する自閉症スペクトラム障害の処置 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年11月28日に出願の米国特許仮出願第61/730,829号、表題「Treatment of Autism Spectrum Disorders Using Glycyl-2-Methylprolyl Glutamic Acid」、発明者Larry Glass, Michael John Bickerdike, Michael Fredrick SnapeおよびPatricia Perez DeCogramの優先権を主張する。本出願は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
本発明は、一般に、自閉症、脆弱X症候群、レット症候群(RTT)、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)を含む自閉症スペクトラム障害(ASD)、ならびに病的要求回避(PDA)の療法に関する。詳細には、本発明は、グリシル−2−メチル−プロリル−グルタミン酸(G−2−MePE)を使用するASDの処置に関する。
より近年、米国精神医学会(APA)のDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disordersの第5版(DSM−5)は、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)をASDとして認めている。
本発明は、DSM−4またはDSM−5のいずれの分類に関係なく、障害の処置に適用される。
神経発生障害(NDD)には、脆弱X症候群(FXS)、アンゲルマン症候群、結節硬化複合群、フェランマクダーミド症候群、レット症候群、CDKL5突然変異(レット症候群およびX連鎖乳児けいれん障害とも関連する)および他が含まれる。全てではないがNDDの多くは遺伝子突然変異によって引き起こされ、このように、時には単一遺伝子障害と呼ばれる。一部のNDD患者は、自閉症の行動および症状を示す。
NDDのための現在利用できる処置は、症候に基づく、つまり症状の管理に焦点を当てた支援的なものであり、多学科的アプローチを必要とする。学習の遅れおよび社会的障害の核心問題に対処するために、教育的および社会的な技術訓練および療法が早期に実施される。特別な学術的、社会的、職業的および支援サービスがしばしば必要とされる。同時に起こる不安、ADHD、うつ病、不適応挙動(攻撃性など)および睡眠問題の管理のために、医薬品、精神療法または行動療法を使用することができる。発作を制御するために、抗てんかん薬を使用することができる。
欧州特許第0366638号は、GPE(アミノ酸Gly−Pro−Gluからなるトリペプチド)ならびにそのジペプチド誘導体Gly−ProおよびPro−Gluを開示する。欧州特許第0366638号は、GPEが神経修飾物質として有効であり、ニューロンの電気的性質に作用できることを開示する。
国際公開第95/172904号は、GPEが神経保護特性を有すること、ならびにGPEの投与がニューロンおよびグリア細胞死の予防または阻害によって中枢神経系(CNS)への傷害を低減できることを開示する。
国際公開第98/14202号は、GPEの投与が中枢神経系(CNS)でコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)および一酸化窒素合成酵素(NOS)の有効量を増加させ得ることを開示する。
国際公開第99/65509号は、パーキンソン病などの疾患の処置で、例えばGPEの投与によってCNSでGPEの有効量を増加させることが、CNSでチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の有効量を増加させ、THによって媒介されるドーパミン産生を増加させ得ることを開示する。
国際公開第02/16408号は、患者内のGPEと同等の生理作用を誘導することが可能な、アミノ酸置換および特定の他の改変を有する特定のGPE類似体を開示する。GPE類似体の適用には、CNSの損傷または疾患を含む急性の脳損傷および神経変性疾患の処置が含まれる。
本発明は、グリシル−L−プロリル−L−グルタミン酸(GPE)の合成類似体およびペプチド様物質に関する。詳細には、本発明は、抗アポトーシスおよび抗壊死性であるGPE類似体およびペプチド模倣薬、それらを作製する方法、それらを含有する医薬組成物、ならびに動物において認知機能を強化するため、および/または記憶障害を処置するため、およびニューロン接続性を向上させるためのそれらの使用に関する。より具体的には、本出願は、ASDの処置におけるGPE類似体、L−グリシル−2−メチル−L−プロリル−L−グルタミン酸(G−2MePE)の使用方法に関する。
nは、0または1であり;
Xは、Hまたは−NR6R7であり;
Yは、H、アルキル、−CO2R5または−CONR6R7であり;
Zは、H、アルキル、−CO2R5または−CONR6R7であり;
R1は、H、アルキルまたはアラルキルであり;
R2、R3およびR4は、独立してHまたはアルキルであり:
各R5は、独立してH、アルキルまたは脂肪アルコール残基であり;
各R6およびR7は、独立してH、アルキルもしくはアラルキルであるか、または−NR6R7はピロリジノ、ピペリジノもしくはモルホリノである)
またはYが−CO2(アルキル)でありZが−CO2Hであるか、もしくはYが−CO2HでありZが−CO2(アルキル)である化合物がラクトン化される場合に形成される、ラクトン;
ならびに薬学的に許容されるその塩を提供し、
ただし、化合物は、GPE、N−Me−GPE、GPEアミド、APE、GPQまたはその塩でない。
本発明は、その具体的な実施形態を参照して記載される。本発明の他の態様および特色は、図を参照して理解することができる。
投薬量または時間に関する用語「約」は特定の変数を指し、正常な測定誤差の範囲内にあるその変数周辺の範囲は、その変数の値から20%以内にある。観察される結果に関する用語「約」は、変動が観察される変数の値から20%以内にあることを意味する。
用語「動物」には、ヒトならびにヒト以外の動物、例えば家畜(ネコ、イヌ等)および畜産動物(ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等)が含まれる。
用語「アラルキル」は、式−(CH2)1-2Arを意味し、式中、Arは5−または6員環の炭素環式または複素環式の芳香環であり、任意選択で、Cl、Br、−OH、−O−アルキル、−CO2R8(式中、R8はHまたはアルキルである)または−NR8R9(式中、R8は前に記載した通りであり、R9はHまたはアルキルである)から選択される1〜3個の置換基で置換される。例示的なアラルキル基には、ベンジル、2−クロロベンジル、4−(ジメチルアミノ)ベンジル、フェネチル、1−ピロリルメチル、2−チエニルメチルおよび3−ピリジルメチルが含まれる。
用語「疾患」には、特にパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、糖尿病、運動障害、発作、加齢による認知機能不全ならびに自閉症、脆弱X症候群、レット症候群(RTT)、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)を含む自閉症スペクトラム障害、ならびに病的要求回避(PDA)を含む動物の任意の不健康な状態が含まれる。
用語「脂肪アルコール残基」は、炭素原子数7〜20個の、最高3個の炭素間二重結合を任意選択で含有する直鎖状ヒドロカルビル基である。例示的な脂肪アルコール残基には、デシル、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、オクタデシル(ステアリル)、オレイル、リノレイルおよびエイコシルが含まれる。
用語「損傷」には、動物の任意の急性傷害、例えば、非出血性脳卒中、外傷性脳損傷、胎児仮死と関連する周産期窒息、例えば胎盤剥離、臍帯閉塞後、または子宮内成長遅滞と関連する上記窒息、十分な蘇生または呼吸の失敗に関連する周産期窒息、ニアミス溺水(near miss drowning)、ニアミス乳児突然死(near miss cot death)、一酸化炭素吸入、アンモニアまたは他のガス中毒、心停止、昏睡、髄膜炎、低血糖およびてんかん重積持続状態と関連する重度のCNS傷害、冠状動脈バイパス手術、低血圧症状および高血圧性危機、脳外傷および毒性の損傷と関連する脳窒息症状が含まれる。
用語「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、所望の薬理特性を有する塩を意味する。そのような塩には、化合物に存在する酸性陽子が無機または有機の塩基と反応して形成することができる塩が含まれる。適する無機塩には、アルカリ金属、例えばナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアルミニウムで形成されるものが含まれる。適する有機塩には、有機塩基、例えばアミン、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N−メチルグルカミン等で形成されるものが含まれる。塩には、化合物に存在する1つまたは複数のアミン基と酸との反応によって形成される酸付加塩も含まれる。適する酸には、無機の酸(例えば、塩酸および臭化水素酸)および有機酸(例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸およびアルカン−およびアレーンスルホン酸、例えばメタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸)が含まれる。化合物に2つの酸性基が存在する場合は、薬学的に許容される塩は一酸単塩または二塩であってもよく、同様に、2つより多くの酸性基が存在する場合は、そのような基の一部または全部が塩を形成していてもよい。2つ以上のアミン基が化合物に存在する場合にも、同じ論法を適用することができる。
用語「治療的有効量」は、疾患を処置するために動物に投与したときに、当技術分野で認められる検査システムを使用して測定したときに、その疾患のために処置を実行するのに十分である薬剤の量を意味する。
疾患を「処置すること」またはその「処置」という用語には、その疾患の素因を有するかもしれないが、その疾患の症状をまだ起こしていないか示していない動物でその疾患が起こることを予防すること(予防的処置)、その疾患を阻止すること(その発達を遅らせるか停止させること)、その疾患の症状または副作用を軽減すること(待期的処置を含む)、およびその疾患を軽減すること(疾患の退行を引き起こすこと)を含めることができる。
用語「cG−2AllylP」および「NNZ−2591」および「NNZ」は、環式のグリシル−2−アリルプロリンを意味する。
潜在的な水素原子(例えばピロリジン環などの水素原子)は明暸性のために式から省略されているが、存在するものと理解するべきである。
自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的交流および伝達の異常、限定的関心ならびに反復性の行動を特徴とする、関連する発達障害の集合である。ASDの現行の分類は、5つの異なる形を認める:古典的な自閉症または自閉性障害、アスペルガー症候群、レット症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)。6番目の症候群、病的要求回避(PDA)は、さらなる特異的広汎性発達障害である。しかし、PDAはASDとして認識されつつはあるが、それはまだ米国精神医学会によって発表されるDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM−IV)の一部でもないし、改訂版であるDSM−Vの一部でもない。
自閉症
古典的な自閉症は、非常に多様な神経発生的障害である。それは乳児期または早期小児期に一般的に診断され、明白な症状はしばしば6ヶ月齢から出現し、2〜3歳までに確立されるようになる。DSM−IVに示される基準によると、自閉症の診断は、(a)社会的交流の障害、(b)伝達の障害、および(c)限定的および反復性の関心および行動を含む三つ組の症状を必要とする。非典型的摂食などの他の機能不全も一般的であるが、診断に必須でない。これらの障害のうち、社会的交流障害が診断にとって特に重要であり、以下の障害の2つが自閉症の診断のために存在しなければならない:
(i)社会的交流を調節するための複数の非言語的行動(例えばアイコンタクト)の使用の障害;
(ii)発達レベルに適当な同朋関係を発達させることができない;
(iii)喜び、関心または達成を共有しようと自発的に努めることがない;
(iv)社会的または感情的な互恵主義の欠如。
最後に、自閉症の診断のためには、少なくとも1つの領域(すなわち社会的交流、言葉または想像遊び)の機能における障害が3歳未満で開始することが必要である。
自閉症は一般的に、脳波図(EEG)でのてんかんまたはてんかん様活動と関連している。自閉症患者の60パーセントも、EEGでてんかん様活動を有する(Spence and Schneider, 2009 Ped Res 65: 599-606)。
自閉症は、自閉症患者の中枢神経系(CNS)で減損しているIGF−1の機能の乱れと関連してもいる(Riikonen et al., 2006 Devel Med Child Neurol 48: 751-755)。CNSでのIGF−1レベルは、フルオキセチンなどの症状を低減する薬剤による処置の後に自閉症患者で増加する(Makkonen et al., 2011 Neuropediatrics 42:207-209)。
重要なことに、自閉症は、ニューロン接続性に関してレット症候群および脆弱X症候群の特色を共有する。全ての3つの障害は、シナプス機能およびニューロン接続性の欠陥を特徴とする。これは、全て正常なシナプス接続の形成不全を示す、これらの患者群での死後のヒト脳の研究に反映される。これは、ニューロン樹状突起棘密度の低減であるか、または未熟なシナプスと関連しているが増強された樹状突起棘密度のいずれかである、変化した形態学的特徴に反映される。これは、自閉症、レット症候群および脆弱X症候群の動物モデルに反映され、これらは、それらの障害で病的であることが公知である遺伝子の変化に基づく。これらの動物モデルでは、ニューロン接続性の欠陥は、形態学的に、さらに長期増強(LTP)の不全として明らかにされる。IGF−1、IGF−1[1〜3]およびG−2−MePEがシナプス形成を増加させるので、これは重要である。
アスペルガー症候群またはアスペルガー障害は自閉症に類似し、特定の特色を共有する。自閉症と同様に、アスペルガー症候群も社会的交流の障害を特徴とし、これは限定的および反復性の関心および行動を伴う。したがって、アスペルガー症候群の診断は、自閉症と同じ三つ組の障害を特徴とする。しかし、言葉または認知能の発達の一般的な遅れおよび対象の環境への関心の欠如がないことによって、それは他のASDと異なる。さらに、アスペルガー症候群は古典的な自閉症より症候学的に一般的に重度でなく、アスペルガー患者は自足で活動することができ、比較的正常な生活を送ることができる。
小児統合失調障害(CDD)はヘラー症候群としても知られ、小児が通例2〜4歳までに(すなわち自閉症およびレット症候群より遅くに)発症するが、その後、社会的伝達および他の技術の重度の喪失を示す状態である。小児統合失調障害は自閉症に非常に似ており、両方とも正常な発達と、その後の言葉、社会的遊びおよび運動技能のかなりの喪失を含む。しかし、小児統合失調障害は一般的に自閉症より後に起こり、より劇的な技術の喪失を含み、はるかにより一般的でない。
CDDの診断は、以下の領域の2つ以上での、以前に獲得した技術の劇的な喪失に依存する:言葉、社会的技能、遊び、運動技能(例えば、歩行、上り、握りなどの能力の劇的な減退)、腸または膀胱の制御(前にトイレのしつけをしたにもかかわらず)。発達上の技術の喪失は急であってもよく、数日から数週間のコースにわたって起こるか、より段階的であってもよい。
特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)は、他の十分定義されたASDに関連した症状の全てではないがいくつかを示す患者を記載するASDである。ASD診断のための主要な基準には、他人との付き合いの困難、反復性の行動および特定の刺激への感受性の増加が含まれる。これらは、上記のASDで全て見出される。しかし、自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群および小児統合失調障害の全ては、それらの特異的診断を可能にする他の特色を有する。これらの4つの障害のうちの1つの特異的診断が不可能であるがASDが明らかな場合は、PDD−NOSの診断が下される。そのような診断は、スペクトル中の他の状態に適用される年齢よりも遅い年齢で開始する症状からもたらすことができる。
レット症候群(RTT)は、専ら女性のみが罹患する(10:000中1人の生産児)神経発生的障害である。RTTは、自閉症スペクトラム障害に分類される(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、改訂第4版)(DSM−IV−R)。米国では、およそ16,000人の患者が現在RTTに罹っている。(Rett Syndrome Research Trust data)。レット症候群の診断のために、以下の症状が特徴的である:6〜18ヶ月齢からの発達障害;3ヶ月齢から4歳の間に始まる頭部成長の速度低下;重度の言語障害;反復性および常同的な手の動作;ならびに異常歩行、例えばつま先歩きまたは不安定な硬直脚歩行。さらに、レット症候群の診断の助けとなることができるが診断に必須でない、いくつかの支援的な基準がある。これらには呼吸困難、EEG異常、発作、筋硬直および痙縮、側弯症(脊柱の湾曲)、歯ぎしり、背に対して小さい手および足、成長遅延、減少した体脂肪および筋肉質量、異常な睡眠パターン、刺激感受性もしくは興奮、そしゃくおよび/もしくは嚥下困難、血行不良ならびに便秘が含まれる。
RTTの85%から95%の症例は、Mecp2遺伝子−メチル−CpG結合タンパク質2(MeCP2)をコードする遺伝子−の突然変異によって引き起こされることが報告されている(Amir et al. 1999. Nat Genet 23:185-188; Rett Syndrome Research Trust)。Mecp2はX染色体(位置Xq28)にマッピングされ、この理由で、男性でのこの遺伝子の突然変異は通常致死性である。RTTは遺伝子障害であるが、記録された症例の1%未満が遺伝性である。Mecp2のほとんど全ての突然変異は新規に起こり、3分の2は第3および第4エクソンに位置する8つのCpGジヌクレオチド(R106、R133、T158、R168、R255、R270、R294およびR306)の突然変異によって引き起こされる。
ASDを総合して考えれば、全ての5つの形の間で症状の提示に共通性があることが明らかである。これらの共通する特色は、正常な社会的適格性の障害および反復性の行動である。アスペルガー症候群以外の全てにおいては、言語技術の不足が最も一般的に明らかである遅い知的発達の一貫した提示もある。その年齢の正常なパラメータと比較した認知能の低下が、自閉症、レット症候群、CDDおよびPDD−NOSではしばしばかなり顕著である。EEGでのてんかんまたは異常な活動の存在も、自閉症、脆弱X症候群およびレット症候群に共通する。てんかんは、異常なニューロン接続性の状況で起こる。ニューロン接続性の障害および乱れたシナプス機能は、自閉症、脆弱X症候群およびレット症候群、ならびにこれらの状態の動物モデルに共通する特色である。
正当性を提供するために、ASDおよび神経発生障害の動物モデルは臨床状態に類似した症状を実証し、それらの症状の病因に関して相当な程度の表面的妥当性を有しなければならない。古典的自閉症は多くの異なる遺伝子障害によって引き起こされ得ることが知られており、数パーセントを越える自閉症症例の原因が単一の遺伝子欠損にあるとは考えられていない。実際、近年の研究は、稀な遺伝した遺伝子欠損に加えて、ASDの根底にあると考えられている染色体位置の多数の新規構造変動を明らかにした(Marshall et al, 2008; Sebat et al, 2007)。したがって、1p、5q、7q、15q、16p、17pおよびXqを含む、20以上の主要な部位の遺伝子配列のコピー数変動(CNV)、転位および反転が、ASD遺伝子座としてマッピングされている。
したがって、R451C突然変異マウスは、NLGN3突然変異に基づくASDのモデルに相当する。この場合、NLGN3のR451位置の突然変異は、「機能増加」突然変異になる。
対照的に、マウスでのNLGN4の臨床突然変異のモデル化は、NLGN4の「機能喪失」突然変異によって達成される(古典的ノックアウトモデル)。このモデルでは、突然変異マウスは、社会的交流欠陥および減少した超音波発声を示す(Jamain et al, 2008)。伝達欠陥は臨床ASDの中心であり、NLGN4ノックアウトマウスでは、野生型雌対応物に曝露させた雄マウスからの超音波発声の低減はASDのモデルとしてのその系統の表面的妥当性を裏づける。
CADM1ノックアウトマウスの分析は、これらの動物がさらなる不安関連の行動、社会的交流の障害、ならびに社会的記憶および認識の障害を示すことを明らかにする。さらに、CADM1ノックアウトマウスは劣った運動技能を実証する(Takayanagi et al, 2010)。これらの機能不全は、再びASDの総合的症状と一貫している。
記したように、22q13欠失症候群それ自体は、非常に稀である。しかし、22q13欠失症候群は、ASDの病因で特異的遺伝子が関与する重要な情報を提供する。shank3に加えて、この障害は、ASDのさらなる可能な遺伝子欠損を明らかにする。記載される22q13欠失症候群の50件ほどの症例のうち、1つを除く全症例は、shank3を越えて、Islet Brain−2遺伝子(IB2)として知られるさらなる遺伝子を含む遺伝子欠失を有する(Sebat et al, 2007)。IB2タンパク質はMAPキナーゼおよびアミロイド前駆体タンパク質を含む多くの他のタンパク質と相互作用し、神経突起でのタンパク質輸送に影響するようであり、シナプス後肥厚に豊富である(Giza et al, 2010)。このタンパク質を欠くマウス(IB2−/−ノックアウトマウス)は、社会的交流の障害(社会的臭い嗅ぎおよび交流時間の減少)、探査行動の減少ならびに認知および運動欠陥を示す(Giza et al, 2010)。この行動表現型は、小脳細胞での興奮性伝達の減少と関連していた。したがって、shank3ノックアウトと同様に、IB2突然変異の表現型はASDとも一貫している。
上記のシナプス後肥厚タンパク質欠損の動物モデルに加えて、ASDと様々な特色を共有する他の単生症候群が自閉症に至る可能性があることから、ASDまたは神経発生障害を標的にする薬物のための別の手段がもたらされる。これの優れた例は、脆弱X症候群である。
上記のように、ASDでは、神経突起発達障害、シナプス接続性の障害、ならびに結果としての社会的および認知機能の対応する障害を含む、保存された病理が観察される。そのようなシナプスの機能不全は、シナプス後肥厚タンパク質の遺伝的に変化した機能から生じる。正常な神経突起成長およびシナプス後発達は、脳由来の神経栄養因子(BDNF;Chapleau et al, 2009)、およびインスリン様成長因子−1(IGF−1;Riikonen et al, 2006;Tropea et al, 2009)などの成長因子によって調節し、増強することができる。実際、IGF−1は正常な樹状突起棘成長およびシナプス形成のために必須である(Cheng et al., 2003 J Neurosci Res. 73:1-9)。したがって、成長因子機能を促進する薬物は、ASDなどの進行性の発達障害の処置で有用である。cG−2AllylPは、IGF−1の末端トリペプチド、IGF1(1〜3)の小分子類似体である。IGF−1模倣類似体として、cG−2AllylPは、様々な動物モデルで栄養および神経保護効果を発揮する。したがって、cG−2AllylPは、上記の遺伝子突然変異から生じるシナプス機能不全に関係するものなどの、ASDおよびFXS症状の処置で有効である。
G−2MePEは本明細書に開示されるGPE類似体の化合物のメンバーであるので、開示される化合物のいずれもASDの症状の処置で効果を示すことができる。さらに、本発明の化合物および方法は基礎をなす神経学的機構に対処する(例えば、炎症性サイトカインの放出を阻害することによって神経炎症を減少させる)ので、本発明は症状の短期管理以上のものを提供することができる。むしろ、本発明の化合物および方法は、神経機能を向上させ、神経細胞移動を促進し、神経形成を促進し、ニューロン幹細胞分化を促進し、軸索および樹状突起の増生を促進し、シナプス伝達を促進し、それによってASDの有害な症状を軽減することができる。
本発明の最も広い定義は概要で示したが、ここでは本発明の特定の化合物を説明する。
一態様では、本発明は式1および式2の化合物:
nは、0または1であり;
Xは、Hまたは−NR6R7であり;
Yは、H、アルキル、−CO2R5または−CONR6R7であり;
Zは、H、アルキル、−CO2R5または−CONR6R7であり;
R1は、H、アルキルまたはアラルキルであり;
R2、R3およびR4は、独立してHまたはアルキルであり:
各R5は、独立してH、アルキルまたは脂肪アルコール残基であり;
各R6およびR7は、独立してH、アルキルもしくはアラルキルであるか、または−NR6R7はピロリジノ、ピペリジノもしくはモルホリノである)
またはYが−CO2(アルキル)でありZが−CO2Hであるか、もしくはYが−CO2HでありZが−CO2(アルキル)である化合物がラクトン化される場合に形成される、ラクトン;
ならびに薬学的に許容されるその塩を提供し、
ただし、化合物は、GPE、N−Me−GPE、GPEアミド、APE、GPQまたはその塩でない。
(a)化合物が、式1の化合物である;
(b)mが、0である;
(c)nが、1である;
(d)X、Y、R1、R2、R3、R4およびR5の少なくとも1つが水素でない;
(e)Xが、−NR6R7である;
(f)Yが、−CO2R5または−CO2NR6R7である;
(g)Zが、−CO2R5または−CO2NR6R7である。
本発明の他の化合物は、Xが−NR6R7であり、R6およびR7は独立してアルキルまたはアラルキルである、式1の化合物である。より好ましい実施形態は、Xが−NR6R7であり、R6およびR7の両方がアルキルである、式1の化合物である。
本発明のさらに別の化合物は、G−2−MePE、mが0であり、nが1であり、R1=R3=R4=Hであり、R2がメチルであり、XがNR6R7であって式中R6=R7=Hであり、YがCO2R5であって式中R5=Hであり、ZがCO2R5であって式中R5=Hである、式1の化合物である。
本発明の化合物は、抗炎症性、抗アポトーシス性、抗壊死性および神経保護の作用を有することができる。それらのin vivo活性は、細胞数、所望のマーカーの特異的染色、またはKlempt ND et al: Hypoxia-ischemia induces transforming growth factor β1 mRNA in the infant rat brain. Molecular Brain Research: 13: 93-101で論じられるものなどの方法によって測定することができる。それらの活性は、当技術分野で公知であるか本明細書に記載される方法を使用してin vitroで測定することもできる。
実験動物で認知機能を検査するのに有益な標準的な行動試験としては、これらに限定されないが、モリス水迷路検査、受動回避応答検査、新規オブジェクト認識検査、嗅覚識別検査、8アーム放射状迷路検査およびT迷路検査が挙げられる。これらの検査は、加齢ラットの認知機能へのGPEおよびG−2−MePEの影響の研究に、直接に適用できる。
化合物の治療比は、例えば、ラットなどの適する動物種において、低酸素虚血性損傷などの適するin vivoモデル(Sirimanne ES, Guan J, Williams CE and Gluckman PD: Two models for determining the mechanisms of damage and repair after hypoxic-ischemic injury in the developing rat brain (Journal of Neuroscience Methods: 55: 7-14, 1994)で有効な抗炎症性、抗アポトーシス性および抗壊死性の活性を与える用量を、その試験動物種で有意な観察可能な副作用を与える用量と比較することによって判定することができる。
化合物の治療比は、例えば、ラットなどの適する動物種において、適するin vivoモデル(下の例4、5および6)で有効な認知機能強化を与えるか記憶障害を処置する用量を、その試験動物種で有意な体重減少(または他の観察可能な副作用)を与える用量と比較することによって判定することもできる。
マウス(MeCP2ノックアウトモデルを使用)でのレット症候群の1つの研究では、GPEは、寿命を長くし、ニューロン機能を増加させる効果を有することが見出された(米国特許出願公開第2009/0099077号)。しかし、本明細書でさらに開示されるように、天然に存在するペプチドであるGPEは、in vivoおよびin vitroで速やかに分解され、したがってレット症候群患者の長期療法におけるその有用性は不明である。
一般に、本発明の化合物は、単独で、または本発明の少なくとも1種の他の化合物および/または処置する疾患のための少なくとも1種の他の従来の治療薬剤と組み合わせて、当技術分野で公知である通常の様式のいずれかによって治療的有効量で投与することができる。治療的有効量は、疾患または損傷、疾患の重症度、処置する動物の年齢および相対的な健康、化合物の効力ならびに他の因子によって大きく異なってもよい。抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗壊死薬、抗神経変性薬として、本発明の化合物の治療的有効量は、動物の質量の1キログラム当たり約0.001ミリグラム(mg/kg)〜約100(mg/kg)、例えば約0.1〜約10mg/kgであってもよく、より低い用量、例えば約0.001〜約0.1mg/kg、例えば約0.01mg/kgは、脳脊髄液を介した投与、例えば側脳室内投与に適当であり、より高い用量、例えば約1〜約100mg/kg、例えば約10mg/kgは、経口、全身(例えば経皮)または非経口(例えば静脈内)投与などの方法による投与に適当である。当業者は、不要な実験なしで、その技術およびこの開示を考慮して、所与の疾患または損傷のために本発明の化合物の治療的有効量を判定することができる。
一般に、本発明の化合物は、以下の経路の1つによって医薬組成物として投与することができる:経口、局所、全身(例えば経皮、鼻腔内、または坐薬による)、または非経口(例えば筋肉内、皮下または静脈内注射)、CNSへの投与(例えば脊椎内または槽間注射による);埋め込みによる、および浸透ポンプ、埋込ポンプ、経皮パッチ等のような装置による注入による。組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体、散剤、持続的放出製剤、溶液、懸濁液、エリキシル剤、エアゾール剤、可溶性ゲル剤または任意の他の適当な組成物の形をとることができ、本発明の少なくとも1つの化合物を、少なくとも1つの薬学的に許容されるか生理的に許容される賦形剤と一緒に含むことができる。適する賦形剤は、当業者周知であり、それらおよび組成物を製剤化する方法は、Gennaro AR: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000のような標準的な参考文献に見出すことができる。適する液体担体、特に注射用溶液のためのものには、水、食塩水、デキストロース水溶液、グリコール等が含まれ、静脈内、脊椎内および槽内投与のためには等張性溶液が好ましく、CNSへの化合物の投与のためには人工脳脊髄液などの基剤も特に適する。上のテキストは、参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明の化合物は、in vivoでのそれらの寿命を増加させるために、例えば国際公開第95/32003号に記載されるコンジュゲート技術に基づいて、ポリエチレングリコールに付着させる(「ペグ化する」)こともできる。
望ましくは、可能であれば、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗壊死剤または抗神経変性剤として投与されるとき、本発明の化合物は経口投与されてもよい。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物のタイプ、単位投薬量のサイズ、賦形剤の種類および当業者周知の他の因子によって大きく異なってもよい。一般に、最終組成物は、約0.0001重量パーセント(重量%)〜約10重量%の本発明の化合物、好ましくは約0.001重量%〜約1重量%を含むことができ、残部は1種または複数の賦形剤である。
これらの化合物の調製で使用される出発材料および試薬は、Aldrich Chemical Company(Milwaukee、Wis.)、Bachem(Torrance、Calif.)、Sigma(St.Louis、Mo.)などの民間供給業者から入手してもよいし、Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991;Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989;Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991;March J; Advanced Organic Chemistry, 4th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992;およびLarock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989、などの参考文献に記載される手順に従って当業者周知の方法によって調製される。ほとんどの場合、アミノ酸およびそれらのエステルまたはアミド、および保護アミノ酸は、広く市販されており、改変されたアミノ酸およびそれらのアミドまたはエステルの調製は、化学および生化学の文献に広く記載されており、したがって当業者周知である。例えば、N−ピロリジン酢酸は、Dega-Szafran Z and Pryzbylak R. Synthesis, IR, and NMR studies of zwitterionic α-(1-pyrrolidine)alkanocarboxylic acids and their N-methyl derivatives. J. Mol. Struct.: 436-7, 107-121, 1997に記載され;N−ピペリジン酢酸は、Matsuda O, Ito S, and Sekiya M. Reaction of N-(alkoxymethyl)dialkylamines and N,N'-methylenebisdialkylamines with isocyanides. Chem. Pharm. Bull.: 23(1), 219-221, 1975に記載される。上記刊行物の各々は、参照により個々に組み込まれたものとしてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明の化合物は、下記の方法によって、および実施例で示される通りに調製することができる。
本発明のペプチドを調製する一般手順は、樹脂にカルボキシル末端保護アミノ酸を最初に付着させることを含む。付着後に樹脂を濾過し、洗浄し、カルボキシル末端アミノ酸のI−アミノ基の保護基(望ましくBOC)を除去する。この保護基の除去は、当然ながらそのアミノ酸と樹脂の間の結合を切断することなく起こらなければならない。次のアミノと必要に応じて側鎖の保護アミノ酸を、続いて樹脂上のアミノ酸の遊離I−アミノ基に連結する。この連結は、第2のアミノ酸の遊離カルボキシル基と樹脂に付着した第1のアミノ酸のアミノ基との間でのアミド結合の形成によって起こる。全てのアミノ酸が樹脂に付着するまで、この順序の事象を連続したアミノ酸で繰り返す。最後に、保護されたペプチドを樹脂から切り離し、保護基を取り外して所望のペプチドを露出させる。ペプチドを樹脂から分離し、保護基を取り外すために使用される開裂技術は、樹脂および保護基の選択に依存し、ペプチド合成技術に詳しい者に公知である。
これらの方法の実施のために、Applied Biosystemsモデル430Aなどの市販のペプチドシンセサイザが利用できる。
当業者は、利用可能なその技術および知識、ならびにこの開示を考慮して、本発明の化合物のために1つまたは複数の適する合成方法を開発することにおいて、不要な実験を企てる必要はない。
0℃まで冷却させたジクロロメタン(50ml)中のBOC−プロリン[Anderson GW and McGregor AC: J. Amer. Chem. Soc.: 79, 6810, 1994]の溶液(10mmol)に、トリエチルアミン(1.39ml、10mmol)およびクロロギ酸エチル(0.96ml、10mmol)を加えた。生じた混合液を、30分間0℃で撹拌した。次にジベンジル−L−グルタメート(10mmol)の溶液を加え、混合液を2時間0℃で撹拌し、次に室温まで温め、一晩撹拌した。水性炭酸水素ナトリウムおよびクエン酸(2moll-1)で反応混合液を洗浄し、次に乾燥させ(MgSO4)、減圧で濃縮し、BOC−L−プロリン−L−グルタミン酸ジベンジルエステル(5.0g、95%)を得た。
BOC−L−グルタミル−L−プロリンジベンジルエステル(3.4g、10mmol)の溶液を0℃まで冷却し、室温で2時間、トリフルオロ酢酸(25ml)で処理した。減圧下で揮発性物質の除去の後、残留物をエーテルで粉砕して、L−プロリン−L−グルタミン酸ジベンジルエステルを得た。
ジクロロメタン(10ml)中のジシクロヘキシルカルボジイミド(10.3mmol)の溶液を、ジクロロメタン(30ml)中のL−プロリン−L−グルタミン酸ジベンジルエステル(10mmol)、N,N−ジメチルグリシン(10mmol)およびトリエチルアミン(10.3mmol)の撹拌および冷却された(0℃)溶液に加えた。混合液を0℃で一晩、その後室温で3時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下で蒸発させた。生じた粗製のジベンジルエステルを酢酸エチル(30ml)および10%パラジウム炭(0.5g)を含有するメタノール(30ml)の混合液に溶解し、その後水素の取り込みが終わるまで常温常圧で水素化した。濾過した溶液を蒸発させ、残留物を酢酸エチルから再結晶させて、トリペプチド誘導体を得た。
窒素雰囲気下の−5℃において、塩化チオニル(5.84cm3、80.1mmol)を、無水メタノール(30cm3)中の(L)−2−メチルプロリン1(0.43g、3.33mmol)の撹拌された溶液に用心深く滴下添加した。反応混合液を還流下で24時間加熱し、生じた淡黄色溶液を真空下で濃縮して乾燥させた。残留物をメタノールとトルエンの1:1の混合液(30cm3)に溶解し、次に濃縮乾燥させて残留性塩化チオニルを除去した。この手順をさらに2回繰り返し、吸湿性の分光的に純粋なオフホワイト固体として塩酸塩2(0.62g、104%)を得た:
融点127-131℃; [α]D -59.8 (c CH2Cl2中0.24); νmax (フィルム)/cm-1 3579, 3398 br, 2885, 2717, 2681, 2623, 2507, 1743, 1584, 1447, 1432, 1374, 1317, 1294, 1237, 1212, 1172, 1123, 981, 894, 861および764; δH (300 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.88 (3H, s, Proα-CH3), 1.70-2.30 (3H, br m, Proβ-HAHBおよびProγ-H2), 2.30-2.60 (1H, br m, Proβ-HAHB), 3.40-3.84 (2H, br m, Proδ-H2), 3.87 (3H, s, CO2CH3), 9.43 (1H, br s, NH)および10.49 (1H, br s, HCl); δC (75 MHz; CDCl3) 21.1 (CH3, Proα-CH3), 22.4 (CH2, Proγ-C), 35.6 (CH2, Proβ-C), 45.2 (CH2, Proδ-C), 53.7 (CH3, CO2CH3), 68.4 (四重線, Proα-C)および170.7 (四重線, CO); m/z (FAB+) 323.1745 [M2.H35Cl.H+: (C7H13NO2)2.H35Cl.Hは323.1738を必要とする]および325.1718 [M2.H37Cl.H+: (C7H13NO2)2.H37Cl.Hは325.1708を必要とする].
窒素雰囲気下の0℃で、無水トリエチルアミン(0.45cm3、3.23mmol)を塩化メチレン(16cm3)中のメチルL−2−メチルプロリネート塩酸塩2(0.42g、2.34mmol)およびN−ベンジルオキシカルボニル−グリシン(98.5%)3(0.52g、2.45mmol)の混合液に滴下添加した。生じた溶液を20分間撹拌し、0℃の塩化メチレン(8cm3)中の1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(0.56g、2.71mmol)の溶液を滴下添加し、反応混合液を室温まで温め、さらなる20時間撹拌した。生じた白い混合液をCelite(商標)パッドを通して濾過し、1,3−ジシクロヘキシル尿素を部分的に除去し、パッドを塩化メチレン(50cm3)で洗浄した。濾液を10%塩酸水(50cm3)および飽和炭酸水素ナトリウム水(50cm3)で連続して洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、真空下で濃縮し、乾燥させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(35g SiO2;30〜70%酢酸エチル−ヘキサン;勾配溶出)による残留物のさらなる精製は、白色半固体として1,3-ジシクロヘキシル尿素を含有する暫定的メチルN−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−L−2−メチルプロリネート4(0.56g)を得た:Rf0.65(EtOAc);m/z(EI+)334.1534(M+。C17H22N2O5は334.1529を必要とする)および224(1,3−ジシクロヘキシル尿素)。
Rf 0.50 (20% MeOH - CH2Cl2); [α]D -62.3 (c CH2Cl2中0.20); νmax (フィルム)/cm-1 3583, 3324 br, 2980, 2942, 1722, 1649, 1529, 1454, 1432, 1373, 1337, 1251, 1219, 1179, 1053, 1027, 965, 912, 735および698; δH (300 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.59 (3H, s, Proα-CH3), 1.89 (1H, 6本線, J 18.8, 6.2および6.2, Proβ-HAHB), 2.01 (2H, dtt, J 18.7, 6.2および6.2, Proγ-H2), 2.25-2.40 (1H, m, Proβ-HAHB), 3.54 (2H, t, J 6.6, Proδ-H2), 3.89 (1H, dd, J 17.1および3.9, Glyα-HAHB), 4.04 (1H, dd, J 17.2および5.3, Glyα-HAHB), 5.11 (2H, s, OCH2Ph), 5.84 (1H, br t, J 4.2, N-H), 7.22-7.43 (5H, m, Ph)および7.89 (1H, br s, -COOH); δC (75 MHz; CDCl3) 21.3 (CH3, Proα-CH3), 23.8 (CH2, Proγ-C), 38.2 (CH2, Proβ-C), 43.6 (CH2, Glyα-C), 47.2 (CH2, Proδ-C), 66.7 (四重線, Proα-C), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 127.9 (CH, Ph), 127.9 (CH, Ph), 128.4, (CH, Ph), 136.4 (四重線, Ph), 156.4 (四重線, NCO2), 167.5 (四重線, Gly-CON)および176.7 (四重線, CO); m/z (EI+) 320.1368 (M+.C16H20N2O5は320.1372を必要とする).
室温の窒素下で、トリエチルアミン(0.50cm3、3.59mmol)を塩化メチレン(60cm3)中のジペプチド5(0.36g、1.12mmol)およびL−グルタミン酸ジベンジルエステルp−トルエンスルホネート6(0.73g、1.46mmol)の溶液に滴下添加し、反応混合液を10分間撹拌した。ビス(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィン酸塩化物(BoPCl、97%)(0.37g、1.41mmol)を加え、無色溶液を17時間撹拌した。塩化メチレン溶液を10%塩酸水(50cm3)および飽和炭酸水素ナトリウム水(50cm3)で連続して洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、真空下で蒸発させ、乾燥させた。反復(2×)フラッシュカラムクロマトグラフィー(24g SiO2;30〜70%酢酸エチル−ヘキサン;勾配溶出)による生じた残留物の精製は、完全に保護されたトリペプチド7(0.63g、89%)を無色の油として与えた。NMR分析により、トリペプチド7は専らトランス配向配座異性体であることが示された:
Rf 0.55 (EtOAc); [α]D -41.9 (c CH2Cl2中0.29); νmax (フィルム)/cm-1 3583, 3353 br, 2950, 1734, 1660, 1521, 1499, 1454, 1429, 1257, 1214, 1188, 1166, 1051, 911, 737および697; δH (400 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.64 (3H, s, Proα-CH3), 1.72 (1H, dt, J 12.8, 7.6および7.6, Proβ-HAHB), 1.92 (2H, 5本線, J 6.7, Proγ-H2), 2.04 (1H, 6本線, J 7.3 Gluβ-HAHB), 2.17-2.27 (1H, m, Gluβ-HAHB), 2.35-2.51 (3H, m, Proβ-HAHBおよびGluγ-H2), 3.37-3.57 (2H, m, Proδ-H2), 3.90 (1H, dd, J 17.0および3.6, Glyα-HAHB), 4.00 (1H, dd, J 17.1および5.1, Glyα-HAHB), 4.56 (1H, td, J 7.7および4.9, Gluα-H), 5.05-5.20 (6H, m, 3 x OCH2Ph), 5.66-5.72 (1H, br m, Gly-NH), 7.26-7.37 (15H, m, 3 x Ph)および7.44 (1H, d, J 7.2, Glu-NH); δC (100 MHz; CDCl3) 21.9 (CH3, Proα-CH3), 23.4 (CH2, Proγ-C), 26.6 (CH2, Gluβ-C), 30.1 (CH2, Gluγ-C), 38.3 (CH2, Proβ-C), 43.9 (CH2, Glyα-C), 47.6 (CH2, Proδ-C), 52.2 (CH, Gluα-C), 66.4 (CH2, OCH2Ph), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 67.1 (CH2, OCH2Ph), 68.2 (四重線, Proα-C), 127.9 (CH, Ph), 128.0 (CH, Ph), 128.1, (CH, Ph), 128.2, (CH, Ph), 128.2, (CH, Ph), 128.3, (CH, Ph), 128.4, (CH, Ph), 128.5, (CH, Ph), 128.5, (CH, Ph), 135.2 (四重線, Ph), 135.7 (四重線, Ph), 136.4 (四重線, Ph), 156.1 (四重線, NCO2), 167.3 (四重線, Gly-CO), 171.4 (四重線, CO), 172.9 (四重線, CO)および173.4 (四重線, CO); m/z (FAB+) 630.2809 (MH+.C35H40N3O8は630.2815を必要とする).
光から保護された水素雰囲気下の室温で、91:9のメタノール−水(22cm3)中の保護されたトリペプチド7(0.63g、1.00mmol)および10重量%のパラジウム活性炭(0.32g、0.30mmol)の混合液を23時間撹拌した。Celite(商標)パッドを通して反応混合液を濾過し、75:25のメタノール−水(200cm3)でパッドを洗浄した。減圧下で濾液を濃縮して乾燥させ、残留物を無水ジエチルエーテルで粉砕して、G−2−MePEおよび暫定的メチルアミン8(0.27g、86%)の38:1混合物を極めて吸湿性の白色固体として与えた。混合物の分析的逆相HPLC研究[Altech Econosphere C18Siカラム、150×4.6mm、5μm;H2O(0.05%TFA)で5分間洗い流し、その後MeCNを溶出剤として1ml/分の流量で25分間にわたる固定勾配;ダイオードアレイを使用して検出]は、それが、それぞれ207および197nmで13.64および14.44分間の滞留時間を有する2つの溶出ピークの38:1混合物であることを示した。1H NMR分析により、G−2−MePEは配座異性体の73:27のトランス:シス混合物であることが示された(比は、それぞれ主および副配座異性体のGluα−H陽子に帰属された、δ4.18および3.71での二重の二重項および三重項の相対強度から推定された)
融点144℃φ; [α]D -52.4 (c H2O中0.19); δH (300 MHz; D2O; 内部MeOH) 1.52 (3H, s, Proα-CH3), 1.81-2.21 (6H, m, Proβ-H2, Proγ-H2およびGluβ-H2), 2.34 (1.46H, t, J 7.2, Gluγ-H2), 2.42*(0.54H, t, J 7.3, Gluγ-H2), 3.50-3.66 (2H, m, Proδ-H2), 3.71* (0.27H, t, J 6.2, Gluα-H), 3.85 (1H, d, J 16.6, Glyα-HAHB), 3.92 (1H, d, J 16.6, Glyα-HAHB)および4.18 (0.73H, dd, J 8.4および4.7, Gluα-H); δC (75 MHz; D2O; 内部MeOH) 21.8 (CH3, Proα-CH3), 25.0 (CH2, Proγ-C), 27.8* (CH2, Gluβ-C), 28.8 (CH2, Gluβ-C), 32.9 (CH2, Gluγ-C), 40.8 (CH2, Proβ-C), 42.7 (CH2, Glyα-C), 49.5 (CH2, Proδ-C), 56.0* (CH, Gluα-C), 56.4 (CH, Gluα-C), 69.8 (四重線, Proα-C), 166.5 (四重線, Gly-CO), 177.3 (四重線, Pro-CON), 179.2 (四重線, Gluα-CO), 180.2* (四重線, Gluγ-CO)および180.6 (四重線, Gluγ-CO); m/z (FAB+) 316.1508 (MH+.C13H22N3O6は316.1509を必要とする).
異なる起源の神経細胞の神経変性へのそれらの影響を判定するために、GPE類似体の治療効果を一連の実験においてin vitroで検討した。本明細書に記載されるin vitro系は当技術分野で確立されており、神経変性障害を患っているヒトでの効果を含む、in vivoで観察される神経保護効果の予測となることが公知である。
以下の実験プロトコルは、University of Auckland Animal Ethics Committeeによって承認されたガイドラインに従った。
代謝された細胞培養上清の採取のための皮質星状神経膠細胞培養の調製
出産後1日目のラットからの1つの皮質半球を使用し、4mlのDMEMに収集した。5mlガラスピペットおよび18ゲージ針を使用して粉砕を行った。100μm細胞ストレーナーによって細胞懸濁液をふるい、50mlのDMEMで洗浄した(250gで5分間の遠心分離)。沈降物を、20mlのDMEM+10%ウシ胎児血清に再懸濁した。懸濁液を2つの25cm3フラスコ(フラスコ当たり10ml)に加え、10%CO2の存在下において37℃で培養し、続いて週に2回培地を交換した。細胞が集密に到達したとき、それらをPBSで3回洗浄し、Neurobasal/B27に適合させ、さらに3日間インキュベートした。一時的保存のために、この上清を−80℃で冷凍した。
母獣をCO2処理によって屠殺し、次に帝王切開のために準備した。手術の後、胚をそれらの羊膜腔から取り出し、断首した。頭部は、線状体のためにはDMEM/F12培地、皮質のためにはPBS+0.65%D(+)−グルコース中の氷上に置いた。
DMEM/F12培地に、完全な脳を腹部側を上向きにして頭蓋から取り出した。立体顕微鏡下で線状体を両半球から切り裂き、線条体組織を氷上のファルコンチューブに入れた。次にP1000ピペッタを使用して、線条体組織を1mlの容量に粉砕した。交互排出の剪断力を用いて、ピペットチップ内で溶液を約15回上下に優しくピペット操作することによって組織を粉砕した。組織断片は、30秒以内にファルコンチューブの底に沈殿した。次に、解離した単細胞の懸濁液を含有する上清を、氷上の新しい無菌ファルコンチューブに移した。それらを過剰に粉砕することによって既に解離した細胞を過度に傷つけるのを避けるために、組織断片を再び粉砕した。第1の管の組織断片に1ミリリットルの氷冷DMEM/F12培地を加え、前の通りに粉砕した。組織断片を沈殿させ、上清を氷上の新しい無菌ファルコンチューブに取り出した。4℃で5分間、細胞を250gで遠心分離した。
線条体細胞の平板培養および培養
ポリ−L−リジン(0.1mg/ml)をコーティングした96ウェルプレート(内部の60ウェルのみ)に、Neurobasal/B27培地(Invitrogen)に細胞数200,000/cm2の密度で、線条体細胞を平板培養した。5%CO2の存在下、細胞を100%湿度下の37℃で培養した。1日目、3日目および6日目に培地を交換した。
細胞の皮質組織抽出手順および調製
PBS+0.65%D(+)−グルコース含有ペトリ皿に、腹部側を上側にして2つの皮質半球をスパチュラによって完全な脳から注意深く取り出した。組織を固定するために皮質の吻側部分(嗅球の近く)に鉗子を入れ、側面に矢状方向の切り傷を2つつけて、パラホルムおよび嗅内皮質を取り出した。後部末端で前頭方向の切り傷をつけて、海馬構成体を取り出した。視覚皮質の領域17/18を捕えるために、最後の前頭切り傷は最後の切り傷から2、3ミリメートル離した。
1mlのNeurobasal/B27培地中でガラス製のパスツールピペットで1回、その後22ゲージ針を有する1mlインスリンシリンジを使用して2回、細胞を粉砕した。細胞懸濁液を100μm細胞ストレーナーに通過させ、1mlのNeurobasal/B27培地によって洗い落とした。細胞を計数し、60μl当たり細胞数50,000に調整した。
96ウェルプレートを0.2mg/mlポリ−L−リジンでコーティングし、その後PBS中の2μg/mlラミニンでコーティングし、その後60μlの皮質星状神経膠細胞馴化培地を各ウェルに加えた。その後、60μlの皮質細胞懸濁液を加えた。100%湿度下の37℃で、細胞を10%CO2の存在下で培養した。1日目に、培地を全て交換し(1:1のNeurobasal/B27および星状神経膠細胞馴化培地)、1μMシトシン−β−D−アラビノフラノシド(有糸分裂阻害剤)を添加した。2日目および5日目に、培地の2/3を交換した。
2つの半球の積層小脳皮質をP8ラットから外植し、PBS+0.65%D(+)グルコース溶液中で小片に切り分け、23ゲージ針で粉砕し、その後押圧で125μm孔径の篩に通した。得られた微小外植片を2回遠心分離し(培地交換)(60g)、無血清BSA添加STARTV培地(Biochrom)に入れた。培養のために、100%湿度下の34℃で、5%CO2の存在下で、35mmサイズの6ウェルプレートに置かれた0.1mg/mlのポリ−L−リジンでコーティングしたカバーガラスの上に、40μlの細胞懸濁液を3時間接着させた。その後、1mlのSTARTV培地を毒素および薬物と一緒に加えた。100%湿度下の5%CO2の存在下での培養の2〜3日後に、培養を監視(評価)した。細胞計数分析のために、パラホルムアルデヒドの上昇濃度(0.4%、1.2%、3%および4%で各々3分間)で培養を固定し、その後PBSで洗浄した。
GPE類似体の神経保護効果を研究するために、神経細胞に毒性損傷を引き起こすためにオカダ酸を使用してin vitroで一連の実験を実行した。オカダ酸は、ニューロンへの損傷を引き起こすことが公知である、当技術分野で認知された毒素である。さらに、オカダ酸による損傷の後の神経細胞または神経細胞機能の回復は、他の毒素によって引き起こされる損傷からの回復の予測となると認識されている。
ニューロンに毒性の損傷を引き起こすために、1:100部の30nMまたは100nMの濃度のオカダ酸および0.5mMの3−ニトロプロピオン酸にューロンを曝露させた(小脳微小外植片のためにだけ)。皮質培養のためにin vitroで8日目(DIV)に、線条体培養のために9DIVに、GPE(1nM−1mM)またはG−2−MePE(1nM−1mM)を使用した。インキュベーション時間は、24時間であった。生存率は、マルチウェルプレートリーダーでの595nmでの比色エンドポイントMTTアッセイによって判定した。小脳微小外植片のために、最も高い細胞密度を有する4つのウィンドウ(0.65mm2の視野)を選択し、神経突起増生を示す細胞を計数した。
GPE類似体G−2−MePEは、全ての3つの試験したin vitro系で、同等の神経保護効果を示した(図12〜15)。
皮質培養は10μM濃度のGPE(図12)またはG−2−MePE(10μM、図13)に応答し、神経保護はそれぞれ64%および59%であった。
培養の他の2つのタイプは、G−2−MePEのより低い用量で神経保護を実証した(小脳微小外植片:図14および線条体細胞:図15)。線条体細胞は、G−2−MePEの1nM〜1mMの範囲内で神経保護を実証し(図15)、出産後の小脳微小外植片は約1nM〜約100nMの用量範囲内でG−2−MePEによる神経保護を実証した(図14)。したがって、G−2−MePEは神経保護剤であり、神経変性障害を患っているヒトで治療効果を示すことができると結論づける。培養でニューロンに直接に投与されるときG−2−MePEは神経を保護することができるので、罹患動物の脳に直接に投与されるとき、そのG−2−MePEはin vivoで有効性を示すことができる。
(例4)加齢ラットでの線条体コリン作動性ニューロンへのG−2−MePEの影響
G−2−MePEがコリン作動性ニューロンに影響を及ぼすことができるかどうか判定するために、加齢ラットを研究した。コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)は、コリン作動性神経のための神経伝達物質アセチルコリンの生合成に関与する酵素である。ChATの免疫検出は、組織に存在するコリン作動性神経の数を判定するのに使用することができることは周知である。存在するコリン作動性神経の数が、脳でのコリン作動性神経路の生理機能に関連していることも周知である。
この実験では、18ヶ月齢のラットの脳での、ChAT陽性ニューロンの数へのG−2−MePEの影響を試験した。
18ヶ月齢雄ラットは、5つの処置のうちの1つを受けた。対照群は基剤(食塩水だけ、n=4)で処置され、4群はG−2−MePEの単一用量で処置された。0.012(n=4)、0.12(n=5)、1.2(In=5)および12mg/kg(n=3)の用量が、それぞれ皮下に与えられた。薬物処置の3日後に過量のペントバルビタールでラットを屠殺した。正常食塩水および4%パラホルムアルデヒドで脳を潅流し、潅流固定剤で一晩固定した。組織が沈むまで、0.1M PBS(pH7.4)中の25%スクロースに脳を保存した。線状体の凍結冠状切片をマイクロトームで切り、4℃で0.1M PBS中の0.1%アジ化ナトリウムに保存した。遊離浮遊切片法を使用する染色によって、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)の免疫反応性を確立した。簡潔には、抗体を1%ヤギ血清で希釈した。免疫組織化学染色の前に、4℃で一晩、切片を0.1M PBS/Triton(商標)中の0.2%トリトンにインキュベートした。50%メタノール中の1%H2O2で、切片を20分間前処置した。次に、振盪機の上で2日間、4D中のウサギ(Rb)抗ChAT(1:5000)抗体(一次抗体)と切片をインキュベートした。PBS/Triton(商標)(15分×3d)を使用して切片を洗浄し、次に室温で一晩、ヤギ抗ウサギビオチン化二次抗体(1:1000)とインキュベートした。切片を洗浄し、ExtrAvidin(商標)(Sigma)(1:1000)で3時間、続いて3、3−ジアミノベンジンテトラヒドロ塩化物(DAB、0.05%)中のH2O2(0.01%)でインキュベートして、着色した反応生成物を生成した。これらの切片をクロムミョウバンでコーティングしたスライドの上にマウントし、乾燥させ、脱水してカバーをした。
光学顕微鏡および1mm2×1000格子を使用して、ChATに対応する特異的免疫反応性を示す両方の半球の線条体ニューロンを計数した。計数のために使用した線条体領域のサイズは、イメージ分析装置を使用して測定した。mm2当たりのニューロン総数を、群の間で比較した。
データは対応のあるt検定を使用して解析し、平均±SEMで提示した。結果を、図16に示す。
図16は、G−2−MePEで処置した動物の脳でChAT免疫陽性ニューロン数が増加したことを示す。老齢ラットの脳でChATのレベルを増加させることにおいて、G−2−MePEの投与が有効なことをこれは明らかに示す。ChATはコリン作動性神経伝達物質アセチルコリンの合成に関与する酵素であるので、G−2−MePEが中央齢ラットの脳でコリン作動性伝達物質の量を増加させることができると結論づける。
G−2−MePEがChATを増加させることができ、したがってコリン作動性神経機能を向上させる能力を有することを実証したので、次に、G−2−MePEが認知および/記憶の年齢関連の変化の処置で役立つことができるかどうか検討した。したがって、記憶のための確立された検査を使用して、ラットで一連の研究を実行した。
実験1:モリス水迷路検査
モリス水迷路検査は、ラットで空間参照記憶を評価するためのよく認知された検査である。
対象
12、8または4ヶ月齢の雄ウィスターラットを使用した。
試験環境および機器
モリス水迷路検査は、無毒の色素で黒に着色した水を25cmの深さまで満たした黒いプラスチックプールを使用して実行した。壁も均一な黒色に見えるように、プールは円形の黒い挿入片を有した。プールの中央で交差する2つの想像上の直角の線によって、プールを4つの四半部(東西南北)に分けた。水面下2cmにあって見えないように、金属プラットホームをプールの端から50cmのSE四半部の地理的中心に置いた。訓練を通して、プラットホームはその位置のままであった。
プールの最も遠い点(実験者の位置に対して)は「北」と命名し、他の方位点「東」、「南」および「西」はそれぞれプールの右端、底および左端の点であった。これらの点は、プールの外側にテープで印を付けた。
各群のラットは、水中のプラットホームまで泳ぐように訓練された。
ラットは、4日連続で1日当たり6回の60秒試験を受けた。試験は、4つの出発位置(北、南、東、西)の1つのプールの壁に面している水にラットを入れることから始まった。任意の所与の試験の出発位置が前の試験のそれと異なるように、出発位置の順序は疑似ランダム的に選択し、いかなる出発位置も毎日の訓練中に2度より多く使用されなかった。所与の日に全てのラットについて位置の同じ順序を使用したが、日によって異なった。ラットがプラットホームを発見したとき、または60秒経過したときのいずれか早いときに試験は終了した。試験は、ストップウォッチで計時した。ラットがプラットホームを発見した場合は、ラットをそこに15秒間留まらせた後に保持容器に移動させた。プラットホームを発見しなかった場合は、ラットを手動でそこに導き、15秒間プラットホームに置いた。試験と試験の間隔は60秒であった。試験間のいかなる干渉も最小にするために、保持容器にはカバーをした。ラットの毎日の検査の終了時に、動物をタオルで乾燥させ、被毛が乾燥するまで保持バケツ内の暖房ランプの下に置いた。プラットホームを見つけるために要した時間(潜伏時間、秒)を、各訓練試験の各ラットについて得た。所与の試験でラットがプラットホームを発見しなかった場合は、それらの潜伏時間スコアはその試験の最大長(60秒)であった。
習得期間の完了から3日後に、薬物または基剤を1週または3週の間連続的に注入するために、ハロセン麻酔の下で皮下にミニ浸透ポンプ(Alzet)を植え込んだ。注入の完了時に、ポンプを取り出し、傷を再縫合した。
5つの処置群は以下の通りであった:
1.食塩水1週間(nは当初7であったが、体重が急減した1匹のラットは除外され、下垂体腫瘍があったことが後に見出された);
2.食塩水3週間(n=8);
3.G−2−MePE低用量(0.96mg/日)1週間(n=8);
4.G−2−MePE低用量(0.96mg/日)3週間(n=8);
5.G−2−MePE高用量(4.8mg/日)3週間(n=7)。
4ヶ月齢(n=3)および8ヶ月齢(n=9)の対照ラットは、薬物処置を受けなかった。いかなる薬物を受ける前に群の平均成績がほぼ同等であるように、習得中のそれらの水泳時間に基づいて12ヶ月齢ラットを5群のうちの1つに割り当てた。
元のプラットホーム位置を記憶するか再学習するラットの能力を、元の訓練の4週後に検査した。これは、3週ポンプ注入の場合は最低7日間、1週ポンプ注入の場合は21日間、残留薬物が洗い流されたであろうことを意味する。保持検査手順は、習得のそれと同一であった。薬物動態学的研究は、皮下投与されたG−2−MePEの血漿中濃度がほぼ一次動態学的パターンでピークまで上昇した後低下し、血漿中半減期(t1/2)は約30〜60分であったことを示す。したがって、保持研究が実施されるときまでに、G−2−MePE含有ミニポンプを取り出してから少なくとも7日後に、G−2−MePEのほぼ全ては動物の循環から除かれていた。
習得および保持期間の日ごとの試験ごとに各ラットの水泳潜伏時間を記録し、期間中の変化は分散分析を使用して検討した。
3週間基剤および3週間高用量G−2−MePEを、習得および保持で比較した。3週にわたって与えられたG−2−MePE高用量は、4週遅れの後に元の水迷路作業の保持を向上させた。
図17は、対照として若齢対照(4ヶ月)を使用した、高用量(4.8mg/日)G−2−MePE処置および低用量(0.96mg/日)処置加齢ラットおよび食塩水処置加齢ラットの間の比較を示す。G−2−MePEによる処置の前に、加齢(12ヶ月齢)群の間に差はなかった。対照的に、プラットホームに到達するのに4ヶ月齢動物はより高齢の動物より少ない時間を必要とした。食塩水またはG−2−MePEのいずれかが投与された、検査のなかった3週間の後、習得期間の検査4日目および保持期間の検査1日目に必要とされた同様の時間に示されるように、食塩水だけを受けた動物は、プラットホームに到達する能力の向上を示さなかった。対照的に、高用量または低用量のG−2−MePEによる処置を受けた動物は、食塩水処置対照と比較して、プラットホームに到達するために必要とした時間の減少に反映される通り、記憶が向上した。さらに、G−2−MePE処置動物は、4ヶ月齢若齢動物(図17)および8ヶ月齢動物(データ示さず)と類似の成績を有した。したがって、G−2−MePEは、若齢ラットに対して記憶欠陥を前に示していた中央齢ラット動物で記憶を向上させることができると結論づける。さらに、再検査するときまでにG−2−MePEは循環から洗い流されていたので、G−2−MePEの記憶増強効果はコリン作動性ニューロンの機能の向上による可能性があったと結論づける。
元の実験の5ヶ月後に、今では17ヶ月齢のラットを、放射状アーム迷路で空間作業記憶について再検査した。
方法
機器
機器は、各々アームの先端に食糧カップを有する8本の同一のアームに連絡している中央のプラットホームからなる。
検査手順
放射状迷路手順の前から最後まで、少なくとも10日間、ラットに部分的に食糧を与えなかった。
所定位置から実験者がラットの行動を明瞭に観察することができるように、迷路を組み立て、配置した。実験者は、それらの配向により迷路のアームを時計回りの方向で1から8まで番号をつけた。
1日目に、ドアをアームに挿入し、各ラットを5分間、20個の食糧ペレットを置いた中央プラットホームに閉じ込めた。これは1日に1回、4日の間続き、ラットの全てはペレットの一部を消費するのが観察された。次の日、ラットを5分間全迷路を探索させた。全てのアームは各アームの先端に位置する食糧カップに2つの食糧ペレットを餌として置き、各アームの入口および中央部に1つのペレットを置いた。2つの連続セッションで8本未満のアームを探索したラットについては、これを少なくとも5日間、最高8日間繰り返した。全てのラットは、前訓練の9日目に最終セッションを受けた。この点で、9日のうちの8日に1本のアームだけに侵入した高齢ラットの1匹を、この手順の将来の検査から除外するべきであると決められた。さもなければ、それらが前訓練で実施した探索の量に関係なく全ラットが含まれた。高齢群の間で、最終前訓練セッションで侵入したアームの数に、統計的有意差はなかった(薬物:F(2,31)=0.44、p=0.65)。
検査の30日前(前訓練の5日後)に、3週間連続的に薬物を注入するために、17匹の雄ウィスター系月齢ラットに皮下ミニ浸透ポンプ(Alzet)を植え込んだ(ハロセン麻酔下)。注入の完了時に、ポンプを取り出して、傷を再縫合した(9日間、流失させた)。
処置群は以下の通りであった:
1.若齢対照(4ヶ月齢)、n=6;
2.食塩水n=10;
3.G−2−MePE低用量(2.4mg/kg/日)n=13
4.G−2−MePE高用量(12.4mg/kg/日)n=5
食塩水および低用量群は、それらが1週間または3週間の処置を受けたか否かを問わず、この実験の第1相(ラットが12ヶ月齢のとき)の処置を受けた全てのラットで構成される。食塩水および高用量群の各々の1匹のラットは、皮膚腫瘍のために落とされた。低用量ラットの1匹は、前訓練することができなかったという事実のために、この実験に加わらなかった(下記を参照する)。
作業記憶検査は、流出の9日目に開始した。ラットは、12日間に10回の毎日の訓練セッションを受けた。食糧カップに餌を置いたことだけ以外は、手順は前訓練の場合と同じであった。ラットは、8本のアームのいずれかを訪れることによって最高16回の選択をするのに6分あった。選択とは、全ての4つの足がアーム内にあることと規定された。実験者は、ペンと紙でアーム侵入の順序を記録した。全ての8本のアームに侵入するか、16回選択するか、または6分が経過した後に、セッションを終了した。全ての8本のアームに侵入するのに実際にかかった時間を記録した。
ラットが前に訪れていないアームに侵入したとき、アーム選択が正しいとみなした。成績は、以下のパラメータに従って毎日分類した:
1)正しい選択(CC)8〜12は、選択した回数の総数で割り算した正しい選択の回数である。検査で全8本のアームの訪問に失敗した動物については、この比の分母は12とみなされる。
2)有効な正しい選択(WCC)8〜12は、作業記憶データが導き出される尺度である。CC8〜12について上で記載されるようにデータを収集したが、このパラメータについては、セッションで全8本のアームに侵入したラットだけが含まれた。
8本未満のアームに侵入したラットは、どのアームを前に訪問したかを記憶することができず、したがって、いかなる理由であれ迷路を探索しなかった動物に対して、検査を完了することができないほどの記憶障害を有していたので、作業記憶を確認するために使用されなかった。
CC8〜12:10日間にわたって全ての群による全般的な向上があった(F(9,324)=4.01、p<0.0001)が、有意な群効果(F(3,36)=1.19、ns)または群×日数相互作用(F(27,324)=1.05、ns)はなかった(データ示さず)
WCC8〜12:図18Aは、10日間の検査にわたる、WCC8〜12スコアによる習得プロファイルを示す。有意な群(F(3,12)=4.27、p=0.029)および日数(F(9,108)=2.09、p=0.036)の効果があったが、これらの因子間の相互作用は有意でなかった(F(27,108)=1.06、ns)。高用量G−2Me−PE群は日数全体で最大の向上を示し、若齢対照が続いた。低用量G−2Me−PEと食塩水の間に、ごくわずかな差しかなかった。
(例6)G−2−MePEは、加齢ラットの脳で神経芽細胞増殖を増加させ、星状細胞増加症を低減させる
ニューロン変性はニューロン数の減少をもたらすことができるので、1つの望ましい治療目的は脳のニューロン数を増加させることである。ニューロンは、ニューロンより分化していない細胞である神経芽細胞から導かれるが、神経系統の中にある。一般的に、神経芽細胞は、明確な細胞体、神経突起(軸索および樹状突起)を有し、最終的に他のニューロン(例えば、シナプス)と接続する成熟した表現型に成熟させる条件に曝露させられる。したがって、神経芽細胞増殖の測定は、神経細胞増殖の周知の早期マーカーになっている。したがって、医薬用薬剤によって誘導される神経芽細胞の増殖の増加を検出することは、動物で神経細胞の成長を予測するための認められた方法である。ラットおよびヒトは神経細胞増殖で類似の機構を共有するので、ラットでの神経芽細胞増殖の変化のin vivo検出は、ヒトでの類似の影響の予測となる。
認知機能障害の1つの組織学的相関物は、罹患動物の脳での星状細胞数の増加であることも知られている。したがって、神経芽細胞増殖を刺激すること、および星状細胞増加症を処置することにおいてG−2−MePEが役立つことができるかどうか判定するために、加齢ラットで一連の研究を実行した。
免疫組織化学
これらの研究を実行するために、組織を固定してパラフィンに包埋し、標準的な方法を使用して切片を得た。海馬のレベルを含有する冠状切片(6μm)を切り、染色のためにクロムミョウバンでコーティングされたスライドの上にマウントした。切片をキシレンで脱パラフィンし、一連のエタノールで脱水し、0.1Mリン酸緩衝食塩水(PBS)中でインキュベートした。
若齢(4ヶ月齢)、中央齢(9ヶ月齢)および老齢のラット(18ヶ月齢)の対照およびG−2−MePE処置群からとられた脳試料で、免疫組織化学的染色を実施した。
インキュベーション溶液から一次抗体が除かれたこと以外は、対照切片を同様に処理した。PCNA陽性細胞の数を脳室下ゾーンで数え、GFAP陽性細胞は大脳皮質で評価した。
脳室下ゾーン(SVZ)および歯状回(DG)は、成人の神経形成を受け入れる2つの脳領域である。SVZおよびDGでの神経形成の低減は、加齢に伴う記憶減退と相関することが多く報告されており、記憶向上への神経成長因子および上皮成長因子の影響は、SVZの前駆体増殖の増加によることが報告されている。細胞増殖のマーカーとしてPCNAを使用して、PCNAに陽性の細胞を計数することによって、SVZでの細胞増殖を調べた。選択された動物では、神経細胞特異的薬剤であるダブルコルチンで染色された通り、増殖細胞の少なくともいくつかは神経芽細胞と同定された。
18ヶ月齢雄ラットを、G2−MePEの単一用量(0、0.012、0.12、1.2、12mg/kgの用量)で腹腔内処置した。処置の3日後に脳を収集し、PCNAおよびGFAPの免疫組織化学的染色を実施した。PCNA陽性細胞をSVZで計数し、次に計数のために使用した心室壁の長さに従って細胞数を細胞数/mmとして平均した(図19A)。最高用量(12mg/kg、n=5)で処置した群は、基剤処置群と比較してPCNA陽性細胞数の有意な増加を示した(*p<0.05、n=7)。データは、神経形成の向上へのG−2PEの用量依存的影響を示した。
G−2−MePE(1.2mg/kg)の影響を、9ヶ月齢の中央齢ラットで研究した。G−2−MePE(1.2mg/kg)または基剤を、腹腔内に(i.p.)投与した。PCNA免疫組織化学的染色を使用して、処置の3日後にSVZでの細胞増殖を調べた。図19Cは、G−2−MePEの処置の後の、PCNA陽性細胞数の有意な増加を示す(**p<0.005、n=4)。PCNAで染色した増殖細胞のいくつかは神経芽細胞と同定された(上の実験1を参照)ので、G−2−MePEは中央齢ラットの脳で神経芽細胞増殖を刺激することができると結論づける。
高齢での星状神経膠細胞の機能不全は炎症を誘発する可能性があり、さらなるニューロン変性につながることを益々多くの証拠が示唆している。活性化星状神経膠細胞の上方制御はかなり報告されており、おそらく抑圧された内因性神経形成を通した、加齢に伴う記憶減退と密接に関連する。
反応性星状神経膠細胞のマーカーとしてGFAPを使用して、G−2MePまたは基剤で処置した加齢ラットの海馬のCA4小領域でGFAP陽性細胞を計数した。加齢動物の海馬(図20A)および大脳皮質で、反応性星状神経膠細胞の有意な増加を見出した。星状神経膠細胞のいくつかは、若齢(*p<0.01)および中央齢ラット(*#p<0.01)と比較して、老齢ラットでの毛細管と関連した(図20Bの写真、矢印)。
脈管構成要素の一部として、GFAP陽性の星状神経膠細胞は血管形成で役割も果たし(図20B、矢印)、脳での炎症性応答にも寄与する。したがって、老齢の脳で見られる上昇したGFAP星状神経膠細胞は、脳変性の慢性期を示すことができる。
老齢ラットの海馬のCA4小領域で、星状細胞増加症へのG−2−MePEの影響も評価した。18ヶ月齢雄ウィスターラットを、以下の通りに5つの処置群に割り当てた:基剤、0.12mg/kg/日、0.12、1.2および12mg/kg/日(各々n=6)。
コンピュータプログラム(Discovery 1)を使用して、GFAP陽性細胞を計数した。結果を、図20Cおよび20Dに示す。G−2−MePEを腹腔内に投与し、GFAP陽性細胞の数を注射の3日後に調べた。視覚的スコアリング系(0=星状神経膠細胞なし、1=少数の星状神経膠細胞、2<50%、3>50%)を使用して、5つの異なる皮質領域で星状神経膠細胞の数を推定した。
G−2−MePEによる処置は、特に0.12および12mg/kgの用量で処置した群で、基剤処置群と比較して海馬のCA4領域で反応性星状神経膠細胞数を低減した(図20C;*p<0.05)。類似の効果が、大脳皮質でのG−2−MePEについて観察された(図20D)。
本明細書で提供される研究の結果は、加齢が脳でのいくつかの変化に関連していることを示す。第1に、年齢依存性の記憶喪失および認知機能の喪失がある。第2には、年齢依存性の星状神経膠細胞の増加がある。ラットでのこれらの知見の全ては互いと、ならびに実験動物およびヒトでの認知機能および記憶の維持におけるコリン作動性神経の公知の役割と一貫している。
これらの研究の目的は、標準的な薬物動態学的方法を使用して、動物でGPEおよびG−2−MePEの薬物動態プロファイルをin vivoで比較することであった。
GPEおよびG2MePEの薬物動態を判定するために、180〜240gの重さの成体雄ウィスターラットを使用した。静脈内ボーラス注射および血液試料採取を促進するために、実験の3日前にハロセン麻酔の下で全てのラットに留置頸静脈カニューレを外科的に植え込んだ。6匹のラットの群に、0.1Mコハク酸緩衝液(pH6.5)に溶解した30mg/kg GPEまたは10mg/kg G2MePEのいずれかの単一の静脈内ボーラス注射を与えた。GPEまたはG2MePEの注射の10および0分前、ならびにGPEまたはG2MePEの注射の1、2、4、8、16、32、64および128分後に、哺乳動物組織のためのSigmaプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するヘパリン処置した管に、血液試料(各約220μl)を収集した。4℃で15分間、3000gで試料を遠心分離し、血漿を取り出し、抽出および放射線免疫検定法(「RIA」)または逆相HPLCによるアッセイまで−80℃で保存した。使用したRIAおよびHPLC方法は従来通りであった。
単一の静脈内ボーラス注射の後の薬物排泄は、式C=C0e-ktに従う一次過程であることが見出され、式中、Cは任意の時点での薬物濃度を表し、C0は時間(t)がゼロに等しいときの濃度であり、kは1時間当たりの濃度の単位で表した一次速度定数である。kおよび半減期(t1/2)は、Log C=−kt/2.3+log C0のように、血漿中濃度対時間の片対数グラフの排泄段階での、線形回帰直線の勾配から計算された。結果は、平均±標準誤差で表した。
図21は、静脈内(i.v.)注射の後のGPEおよびG−2−MePEのin vivo血漿中濃度のグラフを示す。黒四角は各時点でのGPEの濃度を表し、黒三角は各時点でのG−2−MePEの濃度を表す。
GPEおよびG−2−MePEの血漿中濃度は、注射から1分間以内に著しく増加した。30mg/kgのGPEの注射の後、40.0±10.8mg/mlのピーク濃度が観察された。GPEの血漿中濃度は、その後一次動態学的過程に従って速やかに低下した。GPEの一次速度定数は0.15±0.014ng/ml/分であると見出され、t1/2は4.95±0.43分であると見出され、血漿からのGPEの推定クリアランスは137.5±12.3ml/時間であると見出された。
注射の後、送達されたG−2−MePEの用量(10mg/kg)と比較して送達されたGPEのより高い用量(30mg/kg)にもかかわらず、G−2−MePEの最大血漿中濃度はGPEの最大血漿中濃度より約4.8倍高かった。
G−2−MePEのより低い送達用量にもかかわらず、125分未満の全ての時点でGPEよりG−2−MePEの血漿中濃度が高いとの知見は、GPEの公知の血漿中濃度に基づくと全く予想外であった。G−2−MePEのt1/2は、GPEのt1/2より4倍以上長かった。
本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載したが、本出願に記載される状態のために本発明の化合物の同等物を調製し、投与することができることは、その知識およびこの開示に関係がある分野の当業者に明らかになり、全てのそのような同等物は、本出願の請求項の範囲に含まれるものとする。
レット症候群(RTT)モデルにおける寿命および長期増強へのG−2−MePEの影響
G−2−MePE処置がレット症候群の発達および進行に影響を与えることができるかどうかをその障害のマウスモデルで判定するために、ヘミ接合性MeCP2(1lox)雄マウスを使用した。MeCP2ノックアウト(MeCP2−KO)マウス系は、ヒト障害、レット症候群に特徴的な生理的および神経学的異常の範囲および重症度を厳密に模倣するとして、当技術分野で広く認められる。
処置
ヘミ接合性MeCP2(1lox)雄マウスを、20mg/kg/日のG−2−MePEまたは食塩水で処置した(0.01%BSA、生存実験では1群当たりn=15、LTP実験ではn=20)。処置は、生後4週から腹腔内に投与した。生存実験のために、処置は実験期間を通して維持された。LTP実験のために、マウスを9週目まで処置し、その時点で切片調製のために使用した。
生存
MeCP2欠損変異マウスは、約4〜6週齢でRTT症状を起こし、10〜12週で死ぬ(Chen et al., 2001. Nat Genet 27: 327-331)。野生型対照およびMeCP2欠損動物の生存を、基剤処置およびG−2−MePE処置群で比較した。生存は処置の開始(4週)から毎週測定し、各毎週の区間(x軸)に生存したマウスの割合(y軸)を示すために、カプランマイアー生存曲線を生成するために使用した(図22を参照)。
MeCP2欠損マウスは、機能的および超微細構造的シナプスの機能不全、海馬依存性記憶および海馬長期増強(LTP)のかなりの障害を患うことが以前に報告されている(Moretti et al. The Journal of Neuroscience. 2006. 26(1):319-327)。RTTモデルでシナプスの機能へのG−2−MePE処置の影響を検査するために、基剤およびG−2−MePEで処置した9週齢の動物で海馬LTPを比較した。そうするために、食塩水またはG−2−MePEで処置したMeCP2欠損マウスからの海馬の切片のニューロンで、ベースライン電位の%としてのfEPSPの勾配を測定した(図23)。
図22は、G−2−MePE処置がMeCP2欠損マウスの生存を増加させたことを示す。野生型マウス(上の線)は対照動物であり、したがってそれらの生存は各時点で100%であった。食塩水だけで処置したMeCP2欠損マウスは、野生型マウスより非常に速やかに死に(点線)、その結果、約11週までにMeCP欠損マウスのわずか50%が生存した。しかし、驚くほど対照的に、G−2−MePEで処置したMeCP2欠損マウスは、食塩水処置マウスより実質的に長く生存することを予想外に見出した。約15週後に、動物の50%は生存した。初期に提示されたデータは、MeCP2マウスが生存に関して影響を受け、その結果、未処置の場合には動物の50パーセントが11週までに死んでいたことを示した。G−2−MePE処置動物は向上した生存を示し、50パーセントが16週で死んでいた。この研究では、寿命データは一貫しない獣医学的処置によって損なわれ、その結果、マウスは一貫してそれらの歯を削らなかったが、これは、実験の開始時に認知されなかったmecp2マウスの必要条件である。結果は、レット症候群に無関係な早期の動物死が観察された(特に対照群で)。データの再調査は、対照群を再実行したときに、群での差がより小さいとはいえ、G−2−MePEの効果が持続することを示した(50パーセント死までの時間は対照で13.5週、G−2−MePE処置動物では16週)。mecp2マウスのG−2−MePE処置によって、安全性の懸念は提議されなかった。
これらの結果は、G−2−MePEがMeCP2欠損マウスの生存を実質的に増加させることができることを実証する。MeCP2欠損マウスはレット症候群のヒトでの病理および治療効力の予測となるので、G−2−MePEがレット症候群を有するヒトの寿命を長くすることができると結論づける。
これらの結果は、MeCP2欠損マウスのin vivo処置でG−2−MePEが役立つことができることを実証した。MeCP2欠損マウスはレット症候群のヒトでの病理および治療効力の予測となるので、G−2−MePEがレット症候群を有するヒトのための有効な療法となることができると結論づける。
(例9)G−2−MePEは樹状突起の分枝を向上させ、樹状突起棘を長くする
樹状突起へのG−2−MePE処置の影響を評価する。トランスジェニックmecp2ノックアウトマウス(n=15〜20)に、G−2−MePEを腹腔内に1日1回、20mg/kgの用量で投与した。屠殺後、下の表1に従って、9週後にゴルジ染色の後に樹状突起棘密度、棘の長さおよび分枝を調べた:
G−2−MePEは樹状突起の分枝を向上させ、樹状突起棘を長くすることが観察された。図24は、この研究の結果を表す。μmで表した樹状突起の長さ(縦軸)を、細胞体からの距離(μm;水平軸)に対してプロットする。細胞体の近くに樹状突起がある細胞の場合、樹状突起は短かった。しかし、細胞体からの距離が増加するに従って、食塩水処置(白四角)は、細胞体から70μmの距離の最大値まで増加し、細胞体からさらに離れた距離に低下した樹状突起長を生成した。対照的に、G−2MePE(黒四角)による処置は、細胞体からの距離の範囲の多くにわたって、より長い樹状突起を生成した。
マウスの交配および遺伝子タイピング
MeCP2生殖細胞系無対立遺伝子マウスを使用する(Chen et al., 2001)。遺伝子タイピングは、Chen et al.(Chen et al., 2001)の通りに実施する。
G−2−MePE処置
生存測定、夜間の活動分析およびイムノブロット分析のために、G−2−MePE(Albany Molecular Research Inc.(Albany、NY)によって合成され、Neuren Pharmaceuticals Limitedによって提供された)を腹腔内注射(20mg/kg、基剤=食塩水、0.01%BSA)により毎日投与する。処置はP15から始まり、実験中維持される。細胞内生理実験のために、P15からそれらが急性切片調製のために使用されるP28〜P32まで、2週の間毎日マウスをG−2−MePE(20mg/kg体重、基剤=食塩水、0.01%BSA)で注射する。光学式画像化実験のために、まぶた縫合の日から画像化の日まで毎日マウスをG−2−MePE(20mg/kg体重、基剤=食塩水、0.01%BSA)で注射する。
ビブラトームを使用して<4℃ ACSFで、知覚運動皮質当たりの冠状切片(300μm厚)を切る。スライシングから20分間は37℃で、実験の残り期間中は室温で、切片をインキュベートする。切片をWarnerチャンバーに移し、層5に位置する視覚的に同定された錘体神経から記録をとる。126mM NaCl、25mM NaHCO3、1mM NaHPO4、3mM KCl、2mM MgSO4、2mM CaCl2および14mMブドウ糖を含有する人工脳脊髄液(ACSF)を315〜320mOsmおよびpH7.4に調整し、95%O2/5%CO2で泡立たせる。細胞内ピペット溶液は、100mMグルコン酸カリウム、20mM KCl、10mM HEPES、4mM MgATP、0.3mM NaGTPおよび10mM Na−ホスホクレアチンを含有した。
Sutter P−80プラー(Sutter Instruments)を使用してホウ珪酸塩ピペット(3〜5MΩ、WPI)を抜く。赤外線DICオプティクス(Zeiss)を有するAchroplan 40×水浸レンズで細胞を可視化し、ビデオモニタに投影される赤外線カメラ(Hamamatsu)で検出する。BNC−2110コネクタブロックおよびMシリーズ二重チャネル収集カード(National Instruments)に接続されているMulticlamp 700B増幅器(Axon Instruments)を使用して、Matlab(Mathworks、Natick、Mass.)に記述されているカスタム収集およびリアルタイム解析ソフトウェアによって、実験を進めた。ギガシールおよび破裂を達成し、低レベルのリークおよび直列抵抗について完全細胞記録を連続的に検証する。各記録のために、入力および直列抵抗を測定するために5mV試験パルスを約10回電圧固定で加える。その後、誘発ファイヤリング速度および細胞興奮性を数量化するために、電流固定で約10回のパルス(500ミリ秒、10pAインクリメントで40〜140pA)を加える。アクセス抵抗性、リークおよび細胞内在性の興奮性が、群を横断して一貫していることを検証する。最後に、−60mVの電圧固定下の自発的なEPSCを10kHzでサンプリングし、低域通過を1kHzでフィルタリングする。Matlabに記述されたカスタムソフトウェアパッケージを使用して分析を実施し、全ての事象は自動化された閾値によって検出され、各事象について実験者によって個々に盲目的に検証される。
P28マウスからの試料(<1cm)を、10%ホルマリンおよび3%重クロム酸カリで24時間固定する。次に、室温の暗所の2%硝酸銀に2日間、組織を移す。次に、これらの試料からの切片を50μm厚で切り、蒸留水に入れる。運動皮質に対応する切片をスライドの上にマウントし、10分間空気乾燥させ、次に95%アルコール、100%アルコールおよびキシレンの逐次的なすすぎを通して脱水し、次にカバーガラスで密封した。Zeiss Pascal 5 Exciter共焦点顕微鏡を使用して、10×(完全細胞)および100×(棘画像化)で画像を取得する。
この実験のために、成体の(>P60)野生型(SVEVまたはBL6)およびMeCP2(+/−)突然変異雌(BL6)を使用する。野生型対照群は、MeCP2+/−雌または野生型の年齢を一致させたSVEV雌の野生型同腹仔で構成される。片目の遮断のために、アベルチン(0.016ml/g)で動物に麻酔をかけ、片目のまぶたを4日間縫合する。画像化の前に、縫合を取り除き、遮断した目を再び開いた。遮断縫合が元のままである動物および遮断された目の状態が健康そうである動物だけを、画像化セッションのために使用する。G−2−MePEシグナル伝達活性化のために、G−2−MePE含有溶液を遮断の全期間中毎日腹腔内(IP)に注射する。画像化セッションのために、マウスにウレタンで麻酔をかける(1.5g/kg;最終投薬量まで各々20〜30分、全投薬量の20%をIP投与し、0.02mlの1%クロロプロチキセンも最初の投与と一緒に注射される)。運動を最小にするために、頭蓋を露出させ、オーダーメードのプレートを頭部に接着する。dremelドリルで頭蓋をV1の上で薄くし、食塩水(1.5%)中のアガロース溶液およびガラス製カバーガラスでカバーをする。画像化セッションの間、動物には継続的に酸素を与え、暖房ブランケットでその温度を維持し、目を周期的にシリコーン油で処置し、生理的状態を継続的に監視する。いずれかの片目に与えられる周期的刺激を表示するモニターの前に、麻酔下マウスを置く。刺激は、均一な灰色の背景の前で9秒/サイクルで漂流している、寸法が9°×72°の縦または水平の白い棒からなった。頭蓋表面は赤色光(630nm)で照らし、25分の各刺激セッションの間に15フレーム/秒の速度で輝度の変化をCCDカメラ(Cascade 512B、Roper Scientific)で捕捉する。遅いシグナルノイズを取り除くために側頭の高域フィルター(135フレーム)を用い、その後、刺激周波数に対応する側頭の高速フーリエ変換(FFT)構成要素を各ピクセルで抽出するために、シグナルをコンピュータ処理する。各目への視覚的誘発反応の強度を測定するために、FFT振幅を使用する。眼球優位性指数は、ODI=(Rcontra−Ripsi)/(Rcontra+Ripsi)として、各ピクセルでの各目の応答(R)から導かれる。両眼ゾーンは、画像化した半球と同側の目の刺激によって活性化された領域と規定される。
リアルタイム心拍数は、テールクリップセンサー(Mouse OX Oximeter−Oakmont、PA)を使用して測定する。マウスは麻酔されていないが、取り付けた開放系プラスチック管の中に物理的に拘束する。記録セッションの前に、慣れさせるために実験動物を収容するケージの中に管を一晩置く。体温は、記録時間中、約82〜84°Fに維持する。各マウスについて15分の3試験を記録し、マウスは8週齢であり、P15から基剤またはG−2−MePEで処置する。
夜間活動の測定
赤外線活性化運動モニタリングチャンバー(Opto−Varimax−MiniA;Columbus Instruments、Columbus、Ohio)を使用することにより、自発的な運動活動を測定する。実験ごとに、記録を開始する少なくとも3時間前に、マウスをチャンバー内に置く。通常の12時間暗サイクル(午後7時〜午前7時)の間、運動を監視する。1時点当たり1動物当たり1つの暗サイクルを収集する。
結果
G−2−MePE処置がRTT疾患の主な特徴の発達に影響を与えるかどうか試験するために、2週齢の突然変異動物にそれらの寿命の間、腹腔内注射を毎日与える。下に詳述するように、シナプスの生理、シナプスの分子組成および皮質可塑性の測定、ならびに健康関連の測定、例えば心拍数、運動活動レベルおよび寿命を次に取得する。
近年の研究は、MeCP2−/yマウスの複数の脳領域にわたるニューロンが、BDNFの過剰発現によって救済される表現型(Chang et al., 2006)である自発的活動の重大な低減を提示することを報告している(Chang et al., 2006;Chao et al., 2007;Dani et al., 2005;Nelson et al., 2006)。同様に、IGF1誘導体の急性適用は、ラット海馬培養で誘発興奮性シナプス後電流(EPSC)振幅を40%上昇させることが示されている(Ramsey et al., 2005;Xing et al., 2007)。MeCP2−/y生理的表現型を救済することにおけるG−2−MePEの効力を試験するために、急性脳切片で細胞内の完全細胞記録を取得し、層5の皮質ニューロンで興奮性シナプスドライブ(自発的なEPSC振幅および周波数)を測定する。ここで、−/y動物から記録されるEPSCは、野生型動物で測定されるEPSCと比較して、振幅が有意に低い。この傾向は、G−2−MePEで処置したMeCP2−/y動物から記録されるEPSCで部分的に反転され、それらは基剤処置MeCP2−/yマウスからのEPSCより振幅が有意に大きい。細胞全体で平均したときにも、これらの差が見られる。これらの測定全体にわたって、アクセス抵抗性、リークおよび細胞内在性の興奮性が、群を横断して一貫していることも検証する。EPSC区間の数量化は、野生型とMeCP2−/y動物の間でEPSC事象間の区間のわずかな増加(EPSC周波数の低減)も示す(P=0.04、コルモゴロフ−スミルノフ検査)。したがって、我々の知見は、MeCP2−/yマウスの皮質細胞での興奮性シナプスドライブの低減、およびG−2−MePE処置に続くその部分的救済が、一部、この領域での興奮性伝達を媒介するシナプスの強度の変化の結果としての、EPSC振幅の変化によることを示す。
ニューロンをまばらにおよび明確に標識するためにゴルジ染色を使用し、標識細胞で樹状突起の棘の密度および形態を測定するために高分解能共焦画像化を適用し、臨界期間マウス(P28)からの運動皮質の切片中の層5の錘体神経に分析を制限した。
低倍率画像化は錐体細胞の樹状突起の範囲を明らかに正確に示すが、シナプス接触を数え、各棘の形態学的クラスを判定するためにより高い倍率を使用する。我々は、棘を大きくふくらんだ(「キノコ」、M)、短くずんぐりした(「ずんぐりした」、S)、短く細い(「細い」、T)または糸状仮足(F)と分類する。単位枝当たりの棘の密度の比較は、処置によりノックアウトで大きく改善される、ノックアウトニューロンでの棘密度の低下の傾向を示す。
成体MeCP2+/−マウスでの眼球優位性(OD)可塑性は、G−2−MePEによって低減される
OD可塑性の発達上の変化は一部IGF−1経路の活性化によって制御され、(1〜3)IGF−1の投与は野生型若齢マウスでOD可塑性を低減することができる(Tropea et al., 2006)。したがって、G−2−MePE処置が成体MeCP2突然変異体で観察される長期OD可塑性を安定させることができるかどうか試験する。P60齢以上の雌MeCP2+/−マウスの片目を4日間遮断し、同時にG−2−MePEで処置する。G−2−MePE処置は、成体Mecp2+/−マウスでOD可塑性を低減し、G−2−MePEがシナプスの安定化または成熟を実際に速やかに誘導することができることを示す。
MeCP2−/yマウスの徐脈をG−2−MePEによって処置する
神経生理学症状の改善におけるG−2−MePEの効力を検討することに加えて、生物体の健康状態へのその影響を特徴付けようと努める。臨床および実験の証拠は、レット症候群患者での不安定な呼吸リズムおよびベースラインの心臓迷走神経緊張の減少などの自律神経系機能不全を示す(Julu et al., 2001)。交感神経系を通して血圧ホメオスターシスを調節するフィードバック機構、例えば過換気によって誘導される心拍数の減少の制御不良は、レット症候群患者で一般的であり、生命にかかわる心臓不整脈を引き起こすことがある(Acampa and Guideri, 2006; Julu et al., 2001)。
G−2−MePE投与は、運動活動および寿命を向上させる
MeCP2−/yマウスは、それらが次第に不活発になる4〜6週齢から始まるレット様症状を起こし、歩行運動失調を起こし、10〜12週齢で死ぬ(Chen et al., 2001)。ケージ化領域の中での夜間の赤外線交差事象を数えることによって、6週後にマウスでベースライン運動活動も記録する。MeCP2ノックアウトマウス(KO)は、野生型マウス(WT)と比較して著しく低減された運動活動レベルを示すが、G−2−MePE(KO−T)による処置はこれらのレベルを上げる。
最後に、MeCP2KO同腹仔と比較して、G−2−MePEで処置したMeCP2−/yマウスは、平均余命の約50%の増加を示す(0.5確率生存率の増加)。
(例11)マウスでのレット症候群における生存への経口G−2−MePEの影響
レット症候群は、運動技能の喪失を含む慢性衰弱性障害であるため、容易に投与される調製物を使用してレット症候群を処置するのが望ましい。このため、G−2−MePEおよび関連化合物の予想外の有益な治療的および薬物動態特性を利用することができる(米国特許第7,041,314号、同第7,605,177号、同第7,714,070号、同第7,863,309号、ならびに米国出願第11/315,784号および同第12/903,844号)。
野生型動物では、生存は、各時点において100%と定義される。MeCP2欠損動物では、生存は実質的に低下する。しかし、G−2−MePEをMeCP2欠損マウスに経口投与した後、生存は実質的に上昇する。
発作は、レット症候群の状況を処置するのに、突出して危険で困難であるので、MeCP2欠損動物において発作活性へのG−2MePEの影響を決定する。G−2−MePEは、神経変性疾患を有する動物における発作活性を処置するのに有効となり得る(米国特許第7,714,020号)。したがって、G−2−MePEがMeCP2欠損マウスにおいて発作活性も処置し得るかどうかを決定するための実験を実施する。
米国特許第7,714,020号において記載されている方法を使用し、食塩水またはG−2−MePEのどちらか一方により処置された野生型マウスおよびMeCP2欠損マウスの脳波記録を得る。
G−2MePEが、運動発作および非けいれん性発作の両方を軽減するのに有効となり得ることが見出される。
MeCP2欠損動物におけるin vivoおよびin vitro研究に基づくと、G−2−MePEは、レット症候群を有するヒトを処置するのに有効な療法となり得ると結論づける。さらに、G−2−MePEは、天然化合物((1〜3)IGF−1;グリシル−プロリル−グルタミン酸またはGPE)(図21)よりも、予想外に長い半減期を有しているので、G−2−MePEの使用は、GPEを含めた他の医薬剤よりも明確かつかなりの利点を有すると結論づける。
さらに、レット症候群は、他の自閉症スペクトラム障害と主要な特徴を共有しているので、本発明の化合物は、他のASDを有する動物、ならびに自閉症、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)を有するヒトにおいて、治療的利益を実現するのに有用となり得る。
Shank3欠損マウスモデル
ASDに伴う22q13欠失症候群のモデルとして、Shank3欠損マウスを、本研究に使用する。
22q13欠失症候群は、Shank3遺伝子における欠失または突然変異と連鎖している(Bonaglia et al, 2006)。Shank3遺伝子は、グルタミン酸作動性シナプスにおいて、フレームワークを形成する、マスター足場タンパク質をコードする(Boeckers et al, 2006)。Shank3は、シナプス後肥厚(PSD)のコアの重要な部分であり、α−アミノ−3−ヒドロキシル−5−メチル−4−イソオキサゾール−プロピオン酸(AMPA)、向代謝性グルタミン酸(mGlu)、およびN−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA)グルタミン酸受容体、ならびに細胞骨格要素の構成要素を含めた、PSDおよびシナプスに対する多くの重要な機能的要素を動員する。22q13欠失/Shank3突然変異の割合を探求する最近の研究により、Shank3のハプロ不全は、ASD症例の0.5%〜1%の頻度で、ASDの単一遺伝子型を引き起こすおそれがあることが示唆される(Durand et al, 2007;Moessner et al, 2007;Gauthier et al, 2008)。
野生型マウスと異型接合体との交雑により生成した異型接合体マウスを使用して、本例において、22q13欠失症候群の原因であるShank3のハプロ不全を最良にモデル化する。
薬物処置
1〜3ヶ月齢の野生型および異型接合体Shank3欠損マウスを4種の処置群:プラセボ処置野生型、プラセボ処置Shank3欠損群、および2種のShank3欠損G−2−MePE処置群に分割する。これらの動物に、プラセボ(水)、または水に製剤化したG−2−MePEを、14日間、b.i.dで経口投与して与える。G−2−MePEは、2種の用量:15または60mg/kgで投与する。
方法論
方法論の詳細な説明は、Bozdagiら(Molecular Autism 2010, 1:15)において見出すことができる。
行動評価は、いくつかの時点で行い、Bozdagiらにより記載されている方法論に則る、社会的交流および超音波社会伝達の解析を含む。手短に言えば、各処置群における雄−雌の社会的交流を評価するものである。対象となる雄は、集団で収容され、清潔な敷わらを有するクリーンケージ中で個別に試験される。各試験セッションは5分間、続く。各対象マウスを、様々な慣れていない発情C57BL/6J雌とペアにする。デジタル閉回路テレビカメラ(Panasonic、Secaucus、NJ、米国)を、ケージから水平に30cmのところに置く。超音波マイクロホン(Avisoft UltraSoundGate condenser microphone capsule CM15;Avisoft Bioacoustics、Berlin、ドイツ)をケージの上20cmに設置する。マイクロホンのサンプリング周波数は250kHzであり、解像度は16ビットである。使用した機器は、対象の雄とパートナーの雌により発せされる鳴き声を区別することができないが、マウスの雄−雌の交流の間の鳴き声の優勢は、通常、雄により発せられる。装置全体は、25ワットの単一赤色光により照明される、消音環境チャンバ(ENV−018V;Med Associates、St Albans、VT、米国)中に入れられている。続いて、Noldus Observerソフトウエア(Noldus Information Technology、Leesburg、VA、米国)を使用し、対象の遺伝子型および処置群を知らされていない実験責任者により、鼻と鼻との臭い嗅ぎ、鼻と肛門性器との臭い嗅ぎ、および他の体の領域の臭い嗅ぎの測定について、対象の雄からのビデオを採点評価する。超音波発声は、遺伝子型/処置群の情報を知らされていない、高度の訓練を受けた2名の実験責任者により、手動で特定し、統計のまとめをAvisoft packageを使用して計算する。評価者間信頼性は、95%である。データは、独立スチューデントt検定を使用して解析する。
ティッシュチョッパーを使用して、検死後短時間の海馬のスライス(350μm)をマウスから調製する。スライスを32℃に維持し、実験を32℃で行う。スライスは、NaCl、125.0;KCl、2.5;MgSO4、1.3;NaH2PO4、1.0;NaHCO3、26.2;CaCl2、2.5;グルコース、11.0(mM)を含有する、リンガー溶液により灌流する。このリンガー溶液を、細胞外記録(電極溶液:3M NaCl)の間、32℃で、95%O2/5%CO2で泡立てた。領域CA3に置いたバイポーラ−タングステン電極を用いて、シャッファー側枝−求心性交連の刺激(30秒毎に100マイクロ秒のパルス)により喚起される、領域CA1における放射状層から記録される興奮性シナプス後場電位(fEPSP)のベースラインが確立する前に、スライスを1時間維持する。試験刺激強度は、最大応答の半分となる振幅を有するfEPSPが得られるよう調節する。この初期EPSP傾き(mV/ミリ秒)は、4回の連続応答の平均波形から決定する。入力−出力(I/O)曲線は、低Mg2+(0.1mM)溶液において、ファイバーボレー増幅に対してfEPSP傾きをプロットすることにより生成される。AMPA受容体媒介性およびNMDA受容体媒介性I/Oの関係は、イオントロピー性グルタミン酸受容体アンタゴニスト:2−アミノ−2−ホスホノペンタン酸APV(50μM)および6−シアノ−7−ニトロキノキサリン−2,3−ジオンCNQX(100μM)の存在下で測定される。一対のパルス応答は、10〜200ミリ秒の刺激時間間隔で測定し、第1の刺激パルスに対する第2の刺激パルスへの平均応答比として表される。
行動
雄の試験対象による合計の社会的臭い嗅ぎの累積時間は、プラセボ処置野生型群よりも、プラセボ処置Shank3欠損群の方が短い。さらに、雄−雌社会的交流の間、超音波発声は、野生型対照によるものよりも、プラセボ処置Shank3欠損群によるものの方が少なく発せられる。
2種のShank3欠損群におけるG−2−MePE処置により、プラセボ処置Shank3欠損群と比べて、合計の社会的臭い嗅ぎの累積時間がかなり増加する。さらに、G−2−MePE処置群は、プラセボ処置突然変異体群よりも超音波発声数が増加することを示す。
マウスが社会的フェロモンを検知できることを確認しようとした嗅覚の馴化/脱馴化研究において、4つの群すべてが、正常な馴化レベル(一連の3つの同じ臭い嗅ぎに消費した時間の減少により示される)および期待される脱馴化(異なる臭い嗅ぎの消費の増加により示される)を示す。
刺激強度に対して興奮性シナプス後場電位(fEPSP)傾きをプロットすると、対照群に対してプラセボ処置Shank3欠損群における、I/O曲線の減衰が実証される。異型接合体のプラセボ処置群では、野生型対照群と比べて、I/O関数の平均傾きの50%減少を反映して、AMPA受容体媒介性電場電位の低下も観察する。対照的に、シナプスNMDA受容体機能を測定するため、競合的AMPA/カイニン酸受容体アンタゴニストCNQXの存在下で、I/O関係を解析すると、野生型とプラセボ処置異型接合体群との間に差はない。これらの結果は、Shank3異型接合体マウスにおいて、AMPA受容体媒介性基礎伝達の特異的な低下があることを示している。
両方の異型接合体群におけるG−2−MePE処置により、AMPA受容体媒介性電場電位が正常化され、プラセボ処置Shank3欠損群と比べて、I/O関数の平均傾きの増加が引き起こされる。
プラセボ処置Shank3欠損群におけるLTPの維持は、野生型対照と比べて、明らかに損なわれている。TBS LTP試験(200ミリ秒空けて、100Hzで4回のパルスを10バースト)もまた、プラセボ処置Shank3欠損群において、TBS後60分で、増強作用がかなり低下することを示す。LTPで観察されるシナプス可塑性の改変とは対照的に、突然変異体群では、長期抑制(LTD)は有意に変化しなかった。G−2−MePE処置により、プラセボ処置Shank3欠損群と比べて、Shank3欠損群の両方において、海馬の長期増強(LTP)、およびその維持が向上した。
乏しい社会的適格性および反復性の行動は、一般的な特徴であり、ASDの形態すべての重要な診断手段である。遅い知的発達および不十分な言語技術の発達もやはり、アスペルガー症候群を除いて、ASDすべてにおいて存在する、一般的な特徴である。
したがって、ASDの動物モデルにおけるG−2−MePEの効力は、ASDを患っているヒト対象において、その効力をかなり予測する。
ニューロンの形態へのG−2−MePEの影響を試験するため、Marchetto et al., A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells, Cell 143:527-539 (2010)(補足情報を含む)において記載されているRTTのin vitroモデルを使用した。このモデルは、様々なMeCP2突然変異を有するヒトRTT患者の線維芽細胞から発生する人工多能性幹細胞(iPSC)を使用する。
細胞培養およびレトロウイルス感染
RTT線維芽細胞(4種の異なるMeCP2突然変異を有する)、および対照の線維芽細胞は、皮膚生検の移植片から生成する。標的MeCP2遺伝子に対するshRNAを、レンチウイルスベクターLentiLox3.7にクローニングする(Marchettoらに記載さている通り)。線維芽細胞は、レトロウイルスリプログラミングベクター(Sox2、Oct4、c−Myc、およびKlf4)により感染させる。感染の2日後、hESC培地を含む、有糸分裂的に不活性なマウス胚線維芽細胞に線維芽細胞を植え付ける。2週間後、線維芽細胞のバックグラウンドから発現したiPSCコロニーを手で採取し、胚幹細胞培養培地mTeSR(商標)(Stem Cell Technologies)を使用するマトリゲルコーティング皿(BD)上のフィーダーフリー条件に移し、手で継代する。生成したクローンの遺伝子発現プロファイルをヒトゲノムAffymetrix Gene Chip(商標)アレイを使用して測定し、リプログラミングが成功していることを確認する。
ニューロンの前駆細胞(NPC)を得るため、細胞クラスターの機械的解離、およびFGF2を含まないhESC培地中の低粘着性皿上に5〜7日間、植え付けることにより胚様体(EB)を形成させる。その後、EBを、DMEM/F12およびN2培地(分裂終了細胞の成長および発現用の無血清補給物)中のポリオルニチン/ラミニンコーティング皿上に植え付ける。得られたロゼットを7日後に採集し、アクターゼにより解離させ、NPC培地(DMEM/F12;0.5X N2;0.5X B27およびFGF2)によりコーティングされている皿上に植え付ける。同一条件のアクターゼを用い、1〜2代の継代後にNPCの均質集団を達成する。成熟ニューロンを得るため、浮遊EBを1uMまたはレチノイン酸により、3週間処理する(4週間の分化の合計時間を与える)。成熟EBを、37℃で1時間、パパインおよびDNAseにより解離させ、FGF2を含まないNPC培地中のポリオルニチン/ラミニンコーティング皿に植え付ける。
RTTのニューロン培養を、1週間、G−2−MePE(1nM〜10μM)により処理する。
免疫細胞化学およびニューロン形態の定量
細胞は、4%パラホルムアルデヒド中で固定化し、PBS中の0.5%Triton−X100により浸透化する。次に、0.5%Triton−X100および5%ロバ血清を含有するPBS中、室温で1時間、細胞をブロッキングする。蛍光シグナルは、Zeiss倒立顕微鏡を使用して検出し、画像はPhotoshop CS3により加工する。以下の一次抗体を使用する。TRA−1−60、TRA−1−81(1:100)、NanogおよびLin28(1:500)、ヒトNestin(1:100)、Tuj−1(1:500)、Map2(1:100);meCP2(1:1000;VGLUT1(1:200)、Psd95(1:500)、GFP(1:200)、Sox1(1:250)、Mushasi1(1:200)ならびにme3H3K27(1:500)。細胞体サイズは、Syn::EGFP(商標)を使用してニューロンを特定した後、適切なソフトウエア(例えばImageJ)を使用して測定する。ニューロンの樹状突起および棘の形態を、zスタック光学セクションの個々の投影から検討し、z面において値をもつ解像度と相関する0.5um増分でスキャンする。各光学セクションは、500lpsにおいて3回スキャンし、次いでカルマンフィルターした結果である。シナプスの定量に関すると、画像は、Biorad radiance2100(商標)共焦点顕微鏡を使用し、1umのz−ステップにより撮影する。シナプスの定量は、遺伝子型に対して盲検で行う。Map2に陽性のプロセスに沿って、VGLUT1斑点だけを計数する。統計的有意性は、二元ANOVA検定およびボンフェローニ事後検定を使用して試験する。
ヒトiPSC由来のニューロンネットワークを、Syn:DsRedレポーター構築物を有するレンチウイルスベクターにより感染させる。細胞培養物を滅菌Krebs HEPES緩衝液(KHB)により2回洗浄し、KHB中、室温で40分間、2〜5μM Fluo−4AM(商標)(Molecular Probes/Invitrogen、Carlsbad、CA)によりインキュベートする。KHBで2回洗浄することにより、過剰の色素を除去し、さらに20分間のインキュベートを行い、細胞内色素濃度を平衡にして、脱エステル化させる。Olympus IX81倒立型蛍光共焦点顕微鏡(オリンパスオプティカル(Olympus Optical)、日本)に488nm(FITC)フィルターを備えたHamamatsu ORCA−ER(商標)デジタルカメラ(浜松ホトニクス株式会社、日本)を使用し、5000フレームの低速度撮影画像シーケンス(100倍率)を、336×256ピクセルの領域において、28Hzで取得する。画像は、MetaMorph7.7(商標)(MDS Analytical Technologies、Sunnyvale、CA)により取得する。続いて、ImageJ(商標)およびMatlab7.2(商標)(Mathworks、Natick、MA)における書換え型ルーチンを使用して、画像を加工する。
分化の6週間後に、星状神経膠細胞と共培養した細胞から、全細胞パッチクランプ記録を行う。新鮮なHEPES−緩衝化食塩水(処方に関する補足方法を参照されたい)により、浴を絶えず灌流する。記録用マイクロピペット(tip resistance3−6MΩ)を、補足文書において記載されている内部溶液により満たす。記録は、Axopatch200B(商標)増幅器(Axon Instruments)を使用して行う。シグナルは、2kHzでフィルターをかけて、5kHzでサンプリングする。全細胞キャパシタンスは、完全に補償される。直列抵抗は補償されないが、10mVパルスに応答して、容量性電流の増幅により、実験中、モニターされる。記録はすべて、室温で行い、化学品はSigmaから購入する。自発性シナプス後電流の周波数および振幅は、Mini Analysis Program(商標)ソフトウエア(Synaptosoft、Leonia、NJ)を用いて測定する。WTおよびRTT群の統計的比較は、p=0.05の有意水準で、ノンパラメトリックコルモゴロフ−スミルノフ両側検定を用いて行う。EPSCは、CNQXまたはDNQX(10〜20μM)によりブロッキングし、IPSPは、ビククリン(20μM)により阻害させる。
RTT iPSC由来のニューロンは、グルタミン酸作動性シナプス数の低下、棘密度の低下、およびより小さな細胞体サイズにより特徴づけられる。RTTニューロンもまた、ある種の電気生理学的欠陥、すなわち対照と比較した場合、自発的シナプス電流の周波数および振幅の有意な低下を示す。RTTニューロンは、細胞内カルシウム移行の頻度が低下することを示す。
RTT表現型のいかなる病変も弱体化し得るかどうかを試験するため、上記のモデルにおいて、G−2−MePEを試験する。
細胞培養物を各薬物濃度により処理すると、非処理RTT対照と比べて、処理されたRTT細胞培養物の形態学的および生理学的パラメータのすべてが改善される。具体的には、G−2−MePE処理RTT細胞において、グルタミン酸作動性シナプス数がかなり増加することを観察している。G−2−MePE処理の濃度はすべて、RTT由来ニューロンにおけるVGLUT1斑点数を増加させる。G−2−MePE処理は、自発性シナプス後電流の周波数および振幅、ならびにG−2−MePE処理RTTニューロンのシナプス活性により生じるカルシウム移行の頻度を正常にする。
ヒトRTTの本in vitroモデルでは、RTT患者由来のiPSC、およびそれらから分化したニューロンは、MeCP2発現の異常により特徴づけられる。本発明の上記の詳細な説明において考察した通り、RTT症例の大部分は、MeCP2遺伝子の突然変異を伴う。したがって、ヒトRTTの本in vitroモデルにおけるG−2−MePEの効力は、RTTを患っているヒト対象において、その効力をかなり予測する。
方法
レット症候群を有する30名の対象を動員する。対象は女性であり、16〜29歳の年齢である(平均=12.1、SD=4.4)。対象はすべて、IQ<60であり、MECP2遺伝子の突然変異を有する。対象はまた、EEGにおけるエーテルスパイク活性、または高速フーリエ変換(FFT)により検出されるEEGの低周波数帯域の増加も示す。対象には、併用医薬が研究前の少なくとも6週間安定であるように指示される。不注意の徴候を処置するための医薬品を服用している対象は、午前中に試験を受け、午後にはその医薬品を服用するよう指示される。QTc間隔が>451の対象を除外する。
この研究は、プラセボ、T.I.Dで5日間10mg/kgの経口G−2−MePE、またはT.I.Dで30mg/kgの経口G−2−MePEのいずれかの3種の用量を用いた無作為二重盲検プラセボ対照並行試験である。
対象は、睡眠ポリグラフ技法を使用して、24時間連続的にEEG、ECG、および呼吸速度の初期ベースライン記録を可能にするため、入院を基本とするクリニックに入れられる。手の動きも、Q−Sensor(商標)を使用して記録する。派生EEG測定は、以下:EEGにおける単位時間当たりのスパイク、EEGの周波数帯域での総パワー、QTcおよび心拍変動(HRV)、ならびに呼吸不整を含む。
有害事象もまた、有害事象の標準安全尺度およびSMURF誘発を使用して記録する。
統計的に、G−2−MePEによる処置の影響は、ベースラインスコアからの変化への処置の影響に対する、共分散の反復解析(ANCOVA)を行うことにより解析する。
G−2−MePEによる処置は、プラセボによる処置の間に存在するものほど多くの有害事象を生じることはなく、有害事象はすべて、短期間かつ軽度の重症度である。深刻な有害事象は報告されてない。QTCが増加する例は報告されていない。
呼吸速度または心拍変動には影響を及ぼさないことが観察される。
G−2−MePEによる処置により、EEGにおける単位時間当たりのスパイクの総合的に有意な低下が生じる。T.I.Dで30mg/kgの経口G−2−MePEによる処置は、プラセボと比較して、スパイク活性を低下させる。この用量のG−2−MePEはまた、プラセボと比較して、EEGのデルタ帯域の出力も低下させる。
G−2−MePEによる処置はまた、Q−Sensor(商標)デバイスを使用して計数される、24時間の期間当たりの手の動きの合計も低下させる。この効果は、プラセボと比較して、T.I.D.で30mg/kgの用量に対して顕著である。
G−2−MePEによる処置は、レット症候群自然経過/臨床的重症度スコアへの有意な影響は全体的にない。しかし、T.I.Dで30mg/kgの経口G−2−MePEにより、プラセボと比較すると、以下の準尺度:「試験によるこの通院における非言語的伝達(Nonverbal Communication at this visit by exam)」、「この通院におけるてんかん/発作(Epilepsy/Seizures at this visit)」、および「手の使用」に対して有意な影響が生じる。
G−2−MePEによる処置により、本研究において中枢神経系機能にかなりの改善が生じる。比較的短期間の処置にもかかわらず、脳の電気的活性の異常が低減し、これは効力の明確な兆候である。こうした効果は、用量依存的であり、T.I.Dで30mg/kgの経口G−2−MePEの処置後に見られる。これらの効果は、G−2−MePE投与後のレット症候群のmecp2ノックアウトトランスジェニックマウスモデルにおいて見られる、CNS機能の改善を反映する。
用量依存的効果はまた、客観的な計数デバイス、および主観的な評点により評価される、手の使用に関しても観察される。これは、無目的な手書き動作は、レット症候群の臨床表現型の特徴であること、およびこの障害に特有であることの両方なので、興味深い。
レット症候群自然経過/臨床的重症度尺度の非言語的伝達の評点は、処置により改善される。この尺度は、アイコンタクトを主に評価する。これは、G−2−MePEによる長期間処置が、集団における社会的関係性を改善し得るという見込みを提起する。
G−2−MePEは、この集団において十分に耐容される。QTc間隔の延長または無呼吸などの、患者集団における特定の懸念の標準尺度または領域のどちらにおいても、影響は観察されない。
方法
G−2−MePEがASDの症状を処置できるかどうかを決定するため、ASDを有するヒトにおいて研究を実施する。自閉症スペクトラム障害を有する20名の対象を動員する。対象は男性であり、16〜65歳の年齢である(平均=18.1、SD=3.4)。対象はすべて、IQ>60であり、自閉症障害またはアスペルガー障害の厳密なDSM−IV−TR診断を受けている。対象はまた、ADI−RおよびADOS−G文書に従い、自閉症スペクトラム障害に対する基準も満たしており、自閉症スペクトラム障害に対して提案されているDSM−V基準を満たす。対象には、併用医薬が研究前の少なくとも6週間安定であるように指示される。不注意の徴候を処置するための医薬品を服用している対象は、午前中に試験を受け、午後にはその医薬品を服用するよう指示される。自閉症に適応される非定型抗精神病医薬品により良好に処置される対象は、除外される。対象には、脆弱X症候群または結節性硬化症を含む、既知の遺伝障害についてスクリーニングがかけられ、脆弱X症候群または結節性硬化症を有する対象は除外される。制御不能なてんかんを有する対象は除外される。
対象は、以下の文書:ウェクスラーIQ、異常行動チェックリスト−コミュニティ版(ABC)、ヴァインランド、エール−ブラウン強迫観念強迫行為尺度(YBOCS)強迫行為準尺度(compulsion subscale)、対人応答性尺度(SRS)、重症度の臨床全般印象(CGI−S)、および介護人が記入した介護者負担質問票(CSQ)を使用して、ベースラインで試験する。
有害事象もまた、標準安全尺度を使用して記録される。
統計的に、G−2−MePEによる処置の影響は、ベースラインスコアからの変化への処置の影響に対する、共分散の反復解析(ANCOVA)を行うことにより解析する。
結果
G−2−MePEによる処置は、プラセボによる処置の間に存在するものほど多くの有害事象を生じることはなく、有害事象はすべて、短期間かつ軽度の重症度である。深刻な有害事象は報告されていない。
G−2−MePEによる処置により、RMET試験の成果において、総合的にかなりの改善がもたらされる。T.I.Dで30mg/kgの経口G−2−MePEにより処置すると、RMETに対する正答率が向上する。
G−2−MePEによる処置により、ET試験において、目の領域を見るのに消費した時間に、総合的にかなりの改善がもたらされる。処置期間の終了時におけるCGI−Iスコアは、有意な差を示す。正の処置効果は、ベースラインCSQスコアと相関がある。
G−2−MePEによる処置により、目から心を読むテスト−改訂版および視線追跡作業における成果にかなりの改善がもたらされる。これらの効果は、用量依存的であり、T.I.Dで30mg/kgの経口G−2−MePEの処置後に見られる。
これらの尺度の改善は、社会的情報処理の過程改善を反映する。社会的交流欠陥は、自閉症スペクトラム障害に対する中心的な症状診断であり、したがって、このことは重要な知見である。
G−2−MePEはまた、改善に関する臨床全般印象により指標が示される、機能の総合的な改善も生じる。本研究からの症例報告書のフリーテキスト注記には、社会的関係性の改善に関係するこうした効果が示されている。このことは、RMETおよびET作業において観察される変化が、日常生活における社会活動に関連し得ることを暗示している。
G−2−MePEは、この集団において十分に耐容される。
G−2−MePEの影響を以下のASDの遺伝モデル:Tbx1異型接合体マウス、Cntnap2ノックアウトマウス、およびSlc9a6ノックアウトマウスでさらに試験する。G−2−MePEを、脆弱X症候群のfmr1ノックアウトマウスモデルでも試験する。
Tbx1. TBX1遺伝子の突然変異は、自閉症スペクトラム障害を伴う(Paylor et al., 2006)。トランスジェニックTbx1マウスは、社会的交流、超音波発声、反復性の行動、および作業記憶に選択的に障害がある(Hiramoto et al., 2011)。
Cntnap2. コンタクチン関連タンパク質様2(CNTNAP2)遺伝子の突然変異体を有する患者の3分の2は、自閉症スペクトラム障害と診断される(Alarcon et al., 2008;Arking et al., 2008;Bakkaloglu et al., 2008;Strauss et al., 2006;Vernes et al., 2008)。Cntnap2ノックアウト(KO)マウスは、社会的行動、超音波発声、および反復性の行動におけるASD関連表現型を示す(Penagarikano et al., 2011)。
Slc9a6. この遺伝子は、ASD症候群に関与しており、ナトリウム−水素(sodim−hydrigen)交換輸送体6(NHE6)をコードする。SLC9A6における突然変異は、知的障害(Gilfillan et al., 2008)および自閉行動(Garbern et al., 2010)を伴う。Slc9a6について、KOマウスは、運動過多、および小脳機能障害を示す(Stromme et al., 2011)。
Fmr1. FMR1遺伝子をサイレンシングすると脆弱X症候群が生じ、この表現型には、自閉症が含まれる。脆弱X症候群の患者の3分の2は、自閉症スペクトラム障害のスクリーニング基準を満たす(Harris et al., 2008)。脆弱X症候群の小児患者も、発作閾値の低下を示す。fmr1ノックアウトマウスは、若年性発作感受性を含めた、脆弱X症候群の表現型の多くを複製する(Yan et al., 2004)。
上記モデルの各々における動物は、引用文献において記載されている方法論に従って生成する。遺伝モデルごとに、対応する野生型動物も得る。各モデルにおける動物を、3つの群(n=10〜n=20):プラセボ処置野生型マウス、突然変異体G−2−MePE処置群、および突然変異体プラセボ処置対照群に分ける。
この処置は、腹腔内投与する:プラセボ(食塩水)またはG−2−MePEを20mg/kg/日。
各モデルにおいて示されるASDの重要な特徴の測定は、引用文献に従って行われる。
結果
G−2−MePE処置により、ASD表現型に関連するすべての尺度が改善される。
マーティンベル症候群またはマーカーX症候群としても知られている脆弱X症候群(FXS)は、自閉症の最も一般的な単一遺伝子が原因であり、精神発達遅滞の最も一般的な遺伝的原因である。多様な知的障害、細長い顔、大きな耳および大きな精巣(巨精巣症)などの身体的特徴、ならびに常同性運動、社会的不安、および注意欠陥多動性障害(ADHD)を含む神経行動表現型により特徴づけられる。FXSの症状および徴候は、はい歩き動作、歩行動作またはひねり動作、拍手動作または手の噛みつき動作の遅延、活動過多行動または強迫観念行動、精神発達遅滞、会話および言語発達の遅延、アイコンタクトを避ける傾向、常同性運動、社会的不安、および注意欠陥多動性障害(ADHD)を含むことができる。
FXSの遺伝学的基礎は、公知であるので、FXSの原因および特徴を研究するのに有用な動物系を作製することは可能である。fmr1遺伝子ノックアウト突然変異体マウスが入手可能であり、巨精巣症、学習欠陥および活動過多を含む、臨床的FXSの多くの特徴を示す。臨床的FXSと同様に、fmr1ノックアウト(fmr1 KO)モデルは、神経プルーニング(neuronal pruning)に失敗していることを示し、このことは、樹状スーパーヌメラシー、ならびにERKおよびAktの過剰リン酸化を示している。結果として、fmr1ノックアウトマウスは、ヒト対象において、FXSの薬物処置の可能性を試験するための価値のあるツールである。fmr1 KOマウスにおいて、G−2−MePEによる処置は、FXSの徴候および症状の多くを改善するのに有効であることを実証する。
fmr1ノックアウトマウスモデルにおいて、G−2−MePEの影響を検討した。以下の尺度を解析した。
b)(i)海馬における樹状突起棘密度、および(ii)精巣重量を含めた、表現型の解剖学的側面も測定した。
c)全リン酸化ERKおよびAktの脳レベルをアッセイした。
脆弱X症候群などの自閉症スペクトラム障害における、ヒトの脳中のERKおよびAktの異常活性化のこうした知見は、脆弱X症候群のfmr1ノックアウトマウスモデルに反映され、したがって、有効なモデルと見なすことができる。
Fmr1ノックアウト(fmr1 KOマウスおよび野生型の同腹子(Jackson Laboratory)を、C57BL/6Jバックグラウンド上で生成し、第8世代を超えるために、C57BL/6Jバックグラウンド上に繰り返し戻し交配した。マウスを集団で収容(1ケージ当たり4〜6匹)し、特に明記しない限り、動物すべてに食物および水を自由摂取させた。マウスを、温度管理環境(21±1℃)中、12時間の明/暗周期(19:00〜7:00の間消灯)で維持した。
作業を、1日当たりに行われる作業を1つ以下で、記載されている順序で行った。
試験を開始する前に、動物に1週間の最低順応期間を許した。予防的処置または治療的処置は、順応期間中、行わなかった。健常な動物だけを研究に入れた。
実験中、マウスはすべて、同じ装置で一度試験し、非実験動物は、実験前に数分間、この装置に入れた。次に、この装置を各マウスの試験前に、湿潤ティッシュおよび乾燥ティッシュにより清潔にした。この目的は、実験対象すべてにとって、低いが一定のマウスのバックグラウンド匂いを作り出すことであった。
実験者は、全試験およびデータ解析の間、遺伝子型および処置を知らされていなかった。
実験は、UK Animals(Scientific Procedures)Act、1986の要件に則って行った。
これらの動物を以下の処置群に分けた。
1.fmr1 KO+基剤(食塩水)
2.Wt+基剤(食塩水)
3.fmr1 KO+G−2−MePE(食塩水中100mg/kg)
4.Wt+G−2−MePE(食塩水中100mg/kg)
本例において使用する場合、用語「G−2−MePE」、「NNZ」、「NNZ2566」、「NNZ−2566」、および「2566」は、同じ意味を有しており、互換的である。G−2−MePEは、IGF(1〜3)(「GPE」)と比べて、予想外に長いin vivo半減期を有することが示され、すなわち、脆弱X症候群を有するヒトを含めた動物の療法に対する良好な候補と見なされた。
海馬細胞の培養物を野生型およびfmr1 KO胎児マウス(妊娠の14〜16日)から調製した。in vitroで3日後、緑色の蛍光タンパク質(GFP)を使用して、培養の時間的経過中に、樹状突起棘密度をモニターした(Ethell and Yamaguchi, 1999;Ethell et al., 2001, Henkemeyer et al., 2003)。樹状突起棘は、通常、in vitroで7〜14日(DIV)の間で形成される。14DIVまでに、ほとんどの樹状突起物は、棘である。fmr1 KOおよびWTの海馬の一次細胞培養物における、樹状突起棘密度への、G−2−MePE、ポジティブ対照(mGluR5アンタゴニストである、2−メチル−6−(フェニルエチニル)−ピリジンまたはMPEP)、および基剤対照の影響を評価した。Fmr1 KOおよび野生型培養物は、17DIVに処理した。
処置群:
1. 0.5nMのG−2−MePE
2. 5nMのG−2−MePE
3. 50nMのG−2−MePE
4. 20μM濃度のMPEP
5. MPEP−基剤およびG−2−MePE-基剤(食塩水)
パラメトリックデータは、二元ANOVA(対象因子間としての遺伝子型および性別)を使用して解析した。研究すべてに関して、データを正規分布した。p値<0.05が、全体にわたり、統計学的に有意であると見なした。
リン酸化細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼ(ERK)およびタンパク質キナーゼB(Akt)の発現は、以前に説明されている通り(Lopez Verrilli et al.2009)、行動実験において処理されたエーテル基剤またはG−2MePE(100mg/kg、i.p.;28日間)を投与したfmr1 KO動物および野生型動物由来のリンパ球において、ウエスタンブロット分析により測定した。ERKは、成長因子伝達、増殖、ストレスおよびアポトーシスに対するサイトカイン応答の原因になる、古典的なMAPKシグナル伝達タンパク質である。Aktは、PI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路において、重要な構成要素であり、核内因子κB(NfκB)およびBcl−2ファミリータンパク質などの多くの下流エフェクターに結合して調節することにより、細胞生存および代謝を調節している。
a.オープンフィールド試験
オープンフィールドは、10cmの正方形に分割した、50×30cmの灰色の周囲を囲ったPVCアリ−ナである。マウスを、試験の5〜20分前に、実験室に持ち込んだ。マウスを隅に面するようにして正方形の隅に置き、3分間観察した。入った正方形(体全部)および立ち上がり(両前肢が地面から離れているが、グルーミングの一部としてではない)数を数えた。最初の立ち上がり(後脚)までの潜伏時間も書き留めた。フィールド周囲のマウスの動きを、300秒間、ビデオ追跡装置(vNT4.0、観測点)により記録した。各試験について、マウスが最も明るいところであるフィールドの中央部分への侵入潜伏時間、この中央領域において消費した総時間、および全行動(cmでの進路長さについて)を、初期曝露、初期曝露の10分後、および初期曝露の24時間後に記録した。
オープンフィールドチャンバに曝露されている間に、マウスは環境に馴化し、したがって、それほど動き回らず、経時的に示される移動が減少した。移動および立ち上がりは、3回の曝露中に記録した。10分間および24時間において、運動または立ち上がりが減少しなかったことは、それぞれ短期間および長期間の記憶に欠陥があることを示した。
移動時間
基剤処置fmr1 KOマウスは、基剤処置野生型群と比べて、オープンフィールドにおいてより長い距離を動き、fmr1 KO動物では活動過多であることを実証した。この活動過多は、G−2−MePEの投与により、fmr1 KO動物では元に戻った。fmr1ノックアウトマウスでは、G−2−MePEにより、2回目および3回目の試験で、移動がかなり減少したことが観察され、これらの動物において、試験環境の記憶保持が改善されたこと、および総合的に立ち上がりが減少したこと(すなわち、活動過多の弱化)を示唆した(図25)。
G−2−MePE処置のこうした効果は、実質的かつ統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。
基剤処置fmr1 KOマウスは、基剤処置野生型対照と比べて、立ち上がり行動が増加することを示した。G−2−MePEは、野生型マウスでは効果がないが、fmr1 KOマウスでは、立ち上がり行動がかなり減少した。fmr1 KOマウスは、10分間で馴化を示さず、これは、短期間の記憶欠陥を示すものである。短期間および長期間の記憶試験の間、G−2−MePE処置fmr1 KOマウスは、野生型+基剤対照とは差がなかった(図26)。
G−2−MePE処置のこうした効果は、実質的かつ統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。
連続通路試験を使用して、fmr1 KOマウスにおいて、不安へのG−2−MePEの影響を評価した。装置は、4つの連続した、徐々に不安を惹起する直線的に連結した通路からなる(各連続通路は、より明るい色でペイントされており、低い壁を有し、かつ/または前の通路よりも狭くなる)。動物を端の壁に面するように通路1の閉端に置いた。各通路に最初に侵入した潜伏時間、各通路において消費した時間量、および各通路に侵入した回数を、300秒の全試験時間中に記録した。
結果
野生型マウスは、通路1において最も多くの時間を消費し、次第に、その後の通路ではそれほど時間を消費しなかった。Fmr1 KOマウスは、活動過多であり、すべての通路で時間を消費した。この場合、通路選択の欠如は、FXSモデルマウスの活動過多の性質に関係している可能性が高い。G−2−MePEによる処置により、fmr1ノックアウト動物において、正常な行動パターンに戻り、FXSの行動表現型が元に戻ることと一致した(図27)。
G−2−MePE処置のこうした効果は、実質的かつ統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。
高架式十字迷路(EPM)は、不安および自発運動を試験するための、さらなる試験システムである。EPMは、Listerの説明に従って組み立てた(Lister 1987)。手短に言えば、迷路は、十字の形状で、床の高さより上に持ち上げられている、互いに対向した2つの開放アームおよび2つの閉鎖アームからなった。この開放アームは、一層むき出しになっており、したがって、より不安を惹起した。したがって、野生型マウスは、閉鎖アームにおいてより多くの時間を消費し、閉鎖アームにより多く訪れた。マウスは、5分間試験され、それらの行動を記録した。行われた測定には、アームおよび迷路の中央において消費した時間、ならびにアーム侵入の回数が含まれた。
野生型マウスと比べて、fmr1ノックアウトマウスは、活動過多および認知障害が組み合わさった行動パターンを示した。驚くべきことに、fmr1ノックアウトマウスは、アーム侵入の総回数がわずかに減少したこと(行動が低下した指標)(図28A)、および全アーム侵入の百分率として、開放アームになされた侵入の比が明らかに増加したしたこと(図28B)を示した。この行動表現型は、G−2−MePEを投与されたfmr1ノックアウト動物では観察されなかった(図28Aおよび28B)。実際に、「パーセント開放アーム侵入」という尺度は、薬物処置により完全に正常化した。中央(ここで、開放アームまたは閉鎖アームへの侵入選択が行われる)において消費した時間は、ベンゾジアゼピンなどの抗不安性化合物による処置により減少することが知られている。基剤処置fmr1ノックアウトマウスは、中央において消費した時間が非常に顕著に増加することを示した(図28C)。したがって、このことは、どちらのアームに侵入するかというためらいを反映したものであり、突然変異体動物において、認知欠陥の指標となり得る。中央空間で余分に消費した時間(図28C)は、恐らく、アーム侵入総回数の減少が根底にある。中央で消費した時間は、28日間のG−2−MePE処置により、正常化した。
G−2−MePE処置のこうした効果は、実質的かつ統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。
脈絡恐怖条件づけは、条件づけ(学習)手順の最も基礎となるものである。それは、新規環境(暗チャンバ)に動物を置くこと、嫌忌的な刺激を与えること(脚に、0.2mAの電気ショックを1秒間)、次にその刺激を除くことが含まれる。動物を同じ環境に戻すと、動物が嫌忌的な刺激を伴う環境を記憶して連想する場合、一般に、凍結応答を実証することになろう。凍結は、恐怖に対する種に特異的な応答であり、呼吸を除く運動がなくなるものとして定義される。
脆弱X症候群の臨床的徴候は、精神発達遅滞であり、この場合、学習および記憶が、大いに障害を受ける可能性がある。恐怖条件づけ作業において、G−2−MePEおよび基剤処置fmr1 KO、および野生型動物を試験し、この場合、脈絡に対する応答における凍結行動を測定した。これらの試験では、マウスは、嫌忌的な体験(脚へのショック)と環境的合図(暗チャンバ)との間の相関を学習かつ記憶しなければならなかった。試験前に、0.2mAで1秒間の脚へのショックに対するマウスの反応について、マウスを観察し、それらが刺激を検知した証拠として、両方の遺伝子型において、発声、ジャンプ行動、および過度の走りがあることに気付いた。
基剤処置fmr1 KOマウスは、野生型マウスと比べて、条件づけ脈絡に曝露された際の凍結行動の割合がかなり低いことを示した。G−2−MePEにより処置した場合、fmr1 KO群は、G−2−MePE処置野生型群と比較した場合、凍結行動に有意な差を示さなかった。G−2−MePE処置により、fmr1 KOマウスモデルにおいて脈絡恐怖条件づけで見られた欠陥が正常化するものと結論づける。また、基剤と比較して、fmr1 KO動物における凍結行動の率が、統計的に有意(**)に低下し、fmr1ノックアウトマウスにおいて見られた認知欠陥が元に戻ることを反映すると結論づけた。こうしたG−2−MePE処置の効果は、完全に予想外であった(図29)。
G−2−MePE処置のこれらの効果は、実質的であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。
マウスは、社会的な種であり、この種は、群れで、接近、追尾、匂い嗅ぎ、仲間のグルーミング、遭遇に対する攻撃、性的交流、親の行動、巣作り、および眠りを含めた、容易に点数化できる社会的行動に従事する。本研究において、マウスにおける社会的認知および社会的記憶は、反復曝露の際に、親交を誘発するために新しいマウスを臭い嗅ぎに消費した時間の量、および新たな刺激動物が導入された場合に臭い嗅ぎが高いレベルに戻ることを評価することにより評価した。
一連の匂い嗅ぎ
Fmr1ノックアウトマウスは、与えられたマウスへの匂い嗅ぎが高まることを示し(基剤処置野生型対照に対して***p<0.001)(図30A)、社会的行動において、機能異常があることを示唆した。この影響は、G−2−MePE(100mg/kg、i.p.)による28日間の処置によってなくなった。G−2−MePEは、野生型群では、有意な効果はなかった。G−2−MePE処置fmr1 KO動物の匂い嗅ぎ行動は、G−2−MePE処置野生型群とは、有意な差がなかった。G−2MePEは、fmr1 KOマウスで見られた社会的行動における異常を正常化したと結論づける。G−2−MePE処置fmr1 KO動物は、基剤処置fmr1 KO動物ほど、実質的にかつ統計的に有意に、臭い嗅ぎをしなかったことを示すことも見出した。G−2−MePEのこうした効果は、実質的、統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった(図30A)。
マウスは、自発的に、実験室で多くの基材に穴を掘る。この行動は、野生の祖先に起因し、この場合、マウスは、土に埋められている、発見すべき種子、穀物、昆虫、および他の食物、またはマウスの自然の生息場所にある落ち葉を求めて探し回ると思われる。それは一般的な自然の齧歯動物の行動を引き出すものであり、管理された実験室条件下で定量的なデータをもたらし、かつプリオン疾患、脆弱X、系統差、および脳の病変にかなり敏感なことが分かっている。野生型とfmr1 KO群の両方の巣作りおよびガラス玉覆い隠し行動への、G−2−MePEの影響を試験した。
図30Bおよび30Cは、fmr1 KOマウスは、野生型マウスほど、ガラス玉覆い隠し(図30A)および営巣(図30B)にかなり従事しないことを示している。それらのすべてが種に典型的な行動である、巣作りおよびガラス玉覆い隠しに関する、海馬の病変により生じる強固な障害は、FXS患者において十分に確立されている症状である、空間学習および記憶の障害を補足する。G−2−MePEは、野生型マウスでは、有意な効果はなかった。fmr1 KOマウスにG−2−MePEを投与した後、この群は、G−2−MePE処置野生型群とは有意な差がなかった。G−2−MePE処置により、fmr1 KO動物において、ガラス玉覆い隠し行動が正常化されると結論づける。同じ効果プロファイルが、営巣行動においても見られた。fmr1 KO動物において、G−2−MePEは、ガラス玉覆い隠し行動および営巣行動の両方が増加することも見出した。
G−2−MePE処置のこうした効果は、実質的であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。
樹状突起棘数は、正常の野生型動物に比べて、fmr1 KOマウスにおいて増加する。G−2−MePEが、この異常が元に戻るのに有用となり得るかどうかを決定するため、Fmr1 KOマウスのニューロンを、マイクロ流体チャンバ中で培養し、GFPを使用して形態を視覚化した。fmr1 KO動物に由来するニューロンは、対照の培養物(0.26±0.08)と比べると、0.5nMのG−2−MePEにより処置しても、有意な改善を示さず(平均±SD、n=3の独立した実験:0.33±0.07)、5nM(0.29±0.05)でも有意な改善を示さなかったことを観察した。興味深いことに、G−2−MePEを50nMで培養物に添加した場合(0.26±0.10)、WT対照(0.28±0.09)と比較して、樹状突起棘の有意な減少を観察した。これらの値は、一対事後解析により有意な差(p<0.005)となり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。
Fmr1ノックアウトマウスは、ヒト脆弱X症候群患者(巨精巣症)がそうである通り、精巣サイズおよび重量の増加を示した。WT−基剤注入動物、およびWT−G−2−MePE注入動物、ならびにfmr1 KO−基剤処置動物、およびfmr1 KO−G−2−MePE処置動物における精巣重量を測定した。巨精巣症は、WTの同腹の動物と比較して、fmr1 KOマウスにおいて明白であり、12〜28%の精巣重量の増加を示した。基剤処置野生型マウスにおける精巣の平均重量は18mgであり、基剤処置fmr1ノックアウトマウスでは、22.47mg(p<0.001)であった。G−2−MePE処置WTマウスでは、平均精巣重量は18.36mgであり、fmr1 KOのG−2−MePE処置マウスでは、精巣重量は18.7へとかなり減少した。G−2−MePE処置後のFXSマウスにおける、精巣の縮小という本発明者らの観察を支持して、精巣において、GpI mGluR RNAがかなり多量に発現し、細精管および生殖細胞において、高いレベルでmGluR5とmGluR1の両方が発現するのを伴うことが、Storto(2001)により以前に発表されているが、そこでのそれらの機能は知られていない。しかし、mGluRアンタゴニストによる処置後に、FXSマウスにおける巨精巣症の軽減という矛盾した報告が存在することに留意することは興味深く、(同じ実験室からでさえも)現在のところ、精巣におけるmGluRの役割は、十分に理解されていないことを示している。作用機序にかかわらず、G−2−MePEは、frm1 KO動物において巨精巣症を元に戻すのに有効であることを見出した。
ニューロンは、脆弱X精神発達遅滞タンパク質により非常に影響を受け、このタンパク質は、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ−Akt−哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)、およびRas-ERKシグナル伝達カスケードを介して、局所的な樹状突起翻訳を調節し、mGluR5シグナル伝達カスケードに関与する。これらの経路がG−2−MePE処置により影響を受けるかどうかを決定するため、行動試験が終了した後(G−2−MePEを最後に注射して12日後)、動物を犠牲にして、pERKおよびpAktの発現を測定した。ここで、G−2−MePE(100mg/kg)によるfmr1 KOマウスを4週間処置すると、半定量的ホスホ特異的ウエスタンブロット法によりアッセイすると、リン酸化ERK1/2経路タンパク質のレベルに影響を及ぼすことを実証した。この効果が、G−2−MePEにより最後に処置を行って12日後に、動物で観察されたことは、まったく予想外のことであった。
リン酸化ERK(pERK)のレベルによって指標とされる、ERK活性化は、野生型対照と比べて、基剤処置fmr1ノックアウトマウスにおいて増加した(図33Aおよび33B)。G−2−MePEによる4週間の処置により、fmr1 KO基剤処置マウスと比べて、fmr1 KOマウスの脳において増加したpERKがかなり低下した。ウエスタンブロットを、存在しているGAPDHタンパク質の量に正規化した。fmr1 KO−基剤処置マウスにおいて増加したERK1/2リン酸化(Thr202/Tyr204)は、G−2−MePEによる処置によってかなり低下した(p<0.05)。
脆弱X症候群を有する個体について以前に報告された通り、mTORシグナル伝達、およびmTORにより活性化される別の翻訳イニシエータであるeIF4Fを活性化するタンパク質である、リン酸化Aktのレベルが、基剤処置野生型マウスと比べて、基剤処置fmr1 KOマウスの脳においてかなり増加したことを観察した。総合的に、G−2−MePEにより処置されたfmr1 KOマウスにおける全Aktと比べて(p<0.05)、Aktリン酸化がかなり低下することを観察した(図34Aおよび34B)。G−2−MePE処置のこうした結果は、実質的、統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。
結論として、優れた表面的妥当性を有する脆弱X症候群のモデルである、fmr1ノックアウトマウスにおいて記載した研究は、以下にまとめられている通り、G−2−MePEによる処置の場合にすべてが逆戻りした野生型マウスと比べて、多くの表現型変化があることを明確に実証した。
− fmr1 KOマウスは、オープンフィールド試験、連続通路試験、および高架式十字迷路試験において活動過多を示した。この活動過多は、G−2−MePEにより元に戻った。総合的に、これらのデータは、得られた他の行動試験データ、および脆弱X症候群患者において示される重要な欠陥と一致する。これらの異常は、G−2−MePEによる処置によって元に戻った。
・学習:
− fmr1 KOマウスは、馴化(短期記憶)に欠陥を示し、この欠陥は、G−2−MePE処置により元に戻った。
− fmr1 KOマウスは、脈絡恐怖条件づけにおける学習欠陥を示し、この欠陥は、G−2−MePEにより元に戻った。
・社会的行動および複雑な種に典型的な行動:
− fmr1 KOマウスは、異常な社会的交流を示し、これはG−2−MePEにより元に戻り;
− fmr1 KOマウスは、ガラス玉覆い隠し、および次の建物(next building)において異常を示し、これらは、G−2−MePEにより元に戻った。
− fmr1 KOマウスに由来する海馬のニューロンは、in vitroでの樹状突起棘数の増加を示し、効果は、G−2−MePEにより元に戻り;
− G−2−MePEにより、fmr1 KOマウスの脳において、ERKおよびAktの異常な活性化は元に戻った。
・巨精巣症
− fmr1 KO対照マウスは、巨精巣症を示し、これは、G−2−MePEにより元に戻った。
fmr1欠乏ミラー効果を有するマウスの徴候および症状が、脆弱X症候群(FXS)を有するヒトにおいて見られるので、ならびにfmr1 KOマウスにおける根底にある遺伝子欠損が、FXSを有するヒトと同じであるので、これらの結果は、脆弱X症候群を有するヒトにおいて、効果をかなり予測すると結論づける。
したがって、G−2−MePEは、脆弱X症候群および他の自閉症スペクトラム障害を患っているヒトに対する有効な処置となり得ると結論づける。
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Claims (19)
- 自閉症スペクトラム障害(ASD)の症状を患っている動物を処置する方法であって、前記動物に、有効量のグリシル−2−メチル−L−プロリル−L−グルタミン酸(G−2−MePE)を投与することを含み、前記処置は、レット症候群自然経過/臨床重症度スケール、異常行動チェックリストコミュニティ版(ABC)、ヴァインランド、重症度の臨床総合所見(CGI−S)および介護人が記入した介護者負担質問票(CSQ)からなる群から選択される1つもしくは複数の行動検査、または脳波図(EEG)スパイク周波数、EEGの周波数帯域での総パワー、手の運動、QTcおよび心拍変動(HRV)、および前記症状を患っていない対照動物と比較した呼吸不整からなる群から選択される1つまたは複数の生理的検査によって評価される前記症状の改善をもたらす、方法。
- 前記ASDが、自閉症、脆弱X症候群、レット症候群(RTT)、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害(PDD−NOS)、ならびに病的要求回避(PDA)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- G−2−MePEの前記有効量が、約0.001mg/Kg〜約100mg/Kgである、請求項1または2に記載の方法。
- 脳に直接投与するときのG−2−MePEの前記有効量が、約0.001mg/Kg〜約0.1mg/Kgである、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 全身投与するときのG−2−MePEの前記有効量が、約1mg/Kg〜約100mg/Kgである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記G−2−MePEが、全身に、非経口的に、または脳に直接に投与される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記G−2−MePEが脳室に投与される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記G−2−MePEが、静脈内、皮下または経口経路を通して投与される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記G−2−MePEが、約10mg/kg〜約60mg/kgの用量で経口投与される、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記G−2−MePEが、生理的に適合する水溶液、油中水型マイクロエマルジョン、油中水型の粗いエマルジョン、油中水型液状結晶、ナノカプセルまたは錠剤の中にある、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記G−2−MePEが水溶液可溶性ゲルに取り込まれている、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記G−2−MePEが、前記動物の粘膜に投与される、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ゲルが前記動物の口内に置かれ、前記G−2−MePEが前記ゲルから放出される、請求項11に記載の方法。
- 自閉症スペクトラム障害(ASD)の症状を有する動物を処置する方法であって、前記動物に、式1または式2の化合物
(式中、mは0または1であり;
nは、0または1であり;
Xは、Hまたは−NR6R7であり;
Yは、H、アルキル、−CO2R5または−CONR6R7であり;
Zは、H、アルキル、−CO2R5または−CONR6R7であり;
R1は、H、アルキルまたはアラルキルであり;
R2、R3およびR4は、独立してHまたはアルキルであり:
各R5は、独立してH、アルキルまたは脂肪アルコール残基であり;
各R6およびR7は、独立してH、アルキルもしくはアラルキルであるか、または−NR6R7はピロリジノ、ピペリジノもしくはモルホリノである)
またはYが−CO2(アルキル)でありZが−CO2Hであるか、もしくはYが−CO2HでありZが−CO2(アルキル)である化合物がラクトン化される場合に形成される、ラクトン;
ならびに薬学的に許容されるその塩を投与することを含み、
ただし、前記化合物は、GPE、N−Me−GPE、GPEアミド、APE、GPQまたはその塩でない、方法。 - 前記化合物が、有効量のG−2−MePEである、請求項14に記載の方法。
- 前記動物に、インスリン様成長因子−I(IGF−I)、インスリン様成長因子−II(IGF−II)、グリシル−プロリル−グルタミン酸(GPE)、トランスフォーミング成長因子−β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子(BDNF)、成長ホルモン結合タンパク質、IGF結合タンパク質(特にIGFBP−3)、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、hst/Kfgk遺伝子生成物、FGF−3、FGF−4、FGF−6、ケラチノサイト成長因子、アンドロゲン誘導成長因子、int−2、線維芽細胞成長因子相同因子−1(FHF−1)、FHF−2、FHF−3およびFHF−4、ケラチノサイト成長因子2、神経膠活性化因子、FGF−10およびFGF−16、毛様神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2(BMP−2)、神経膠細胞系由来神経栄養因子、活性依存神経栄養性因子、サイトカイン白血病阻害因子、オンコスタチンM、インターロイキン)、α−、β−、γ−またはコンセンサスインターフェロン、TNF−α、クロメチアゾール;キヌレン酸、Semax、タクロリムス、L−トレオ−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール、アンドレノコルチコトロピン−(4−9)類似体[ORG2766]およびジゾルシピン(MK−801)、セレジリン;グルタミン酸アンタゴニスト、例えばメマチン(Namenda)NPS1506、GV1505260、MK−801、GV150526;AMPAアンタゴニスト、例えば2,3−ジヒドロキシ−6−ニトロ−7−スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン(NBQX)、LY303070およびLY300164;アドレシンMAdCAM−1および/またはそのインテグリンα4受容体(α4β1およびα4β7)に対する抗炎症剤、例えば抗MAdCAM−1mAb MECA−367(ATCC受託番号HB−9478)、フェノバム、フルオキセチンなどの選択的セロトニン再取込み阻害剤、またはリスペリドンなどの非典型的抗精神病薬からなる群から選択される第2の治療薬剤を投与することをさらに含む、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物の前記用量が、1日当たり10mg/kgを3回または1日当たり30mg/kgを3回である、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
- (a)前記化合物が、式1の化合物であり;
(b)mが、0であり;
(c)nが、1であり;
(d)X、Y、R1、R2、R3、R4およびR5の少なくとも1つが水素でなく;
(e)Xが、−NR6R7であり;
(f)Yが、−CO2R5または−CO2NR6R7であり;
(g)Zが、−CO2R5または−CO2NR6R7である、
請求項14に記載の方法。
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