JP2016217854A - Analysis method of protein in rack dye - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ラック色素中のタンパク質の分析方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing a protein in a rack dye.
従来、医薬品、化粧品、及び食品の着色料として、様々な色素が用いられている。
近代、合成色素の発達により天然色素の使用は減少する傾向にあったが、近年では、自然志向の高まりと共に、再び、天然色素が好まれるようになっている。
しかし、天然色素は、動植物等の天然物から抽出及び精製を行って得られるものであるので、天然物に含まれるタンパク質等の残存が問題になることがある。
Conventionally, various pigments are used as coloring agents for pharmaceuticals, cosmetics, and foods.
In recent years, the use of natural pigments has been declining due to the development of synthetic pigments. However, in recent years, natural pigments have come to be favored again along with the increase in nature orientation.
However, since natural pigments are obtained by extraction and purification from natural products such as animals and plants, remaining proteins and the like contained in natural products may be problematic.
従来から化粧品、食品等の着色料として広く用いられているラック色素は、タイ及びインドの亜熱帯地域の樹木に寄生するカイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）が分泌する樹脂状物質より、室温水もしくは熱水で抽出して得られるものである。ラック色素の主要な色素成分はラッカイン酸である。 A rack pigment that has been widely used as a coloring agent for cosmetics, foods, etc., has been developed from room temperature water or a resinous substance secreted by Lactifer Laker Kerr, which is parasitic on trees in subtropical regions of Thailand and India. It is obtained by extracting with hot water. The main dye component of the rack dye is lacaic acid.
このようにラック色素は、節足動物であるカイガラムシ科ラックカイガラムシから得られる色素であるので、タンパク質を含有する可能性がある。
しかし、従来、ラック色素が含有するタンパク質の量を測定する方法は知られておらず、食品添加物公定書第８版においても、ラック色素中のタンパク質の量は規定されていない。
例えば、非特許文献１では、種々の天然着色料の分析が行われ、ラック色素製剤の分析も行われているが、その夾雑タンパク質の分析は行われていない。
As described above, the rack pigment is a pigment obtained from the scale insect of the scale family Aphididae, and thus may contain a protein.
However, conventionally, a method for measuring the amount of protein contained in the lac dye is not known, and the amount of protein in the lac dye is not defined in the 8th edition of the Food Additives Official Document.
For example, in Non-Patent Document 1, various natural colorants are analyzed and a rack dye preparation is also analyzed, but the contaminating protein is not analyzed.
前述の通り、ラック色素については、従来、これが含有するタンパク質（夾雑タンパク質）の量は問題にされていない。また、ラック色素の夾雑タンパク質がアレルゲンとなるという報告は無い。
しかし、近年のアレルゲンに対する意識の高まりから、ラック色素が含有するタンパク質の精密な分析方法（本明細書中、用語「分析」は、検出、及び定量を包含する。）を確保することは、有意義である。
As described above, conventionally, the amount of protein (contaminating protein) contained in the rack dye has not been a problem. Moreover, there is no report that the contaminating protein of the rack pigment becomes an allergen.
However, due to the recent increase in awareness of allergens, it is meaningful to ensure a precise method for analyzing the protein contained in the rack dye (in this specification, the term “analysis” includes detection and quantification). It is.
また、ラック色素の色素成分であるラッカイン酸はタンパク質と結合しやすい。このラッカイン酸へのタンパク質の結合は、ラッカイン酸の色調を赤色から紫色へと変化させる。従って、ラック色素の品質を確保する目的でも、ラック色素が含有するタンパク質の分析方法を確保することは、有意義である。 In addition, lacaic acid, which is a pigment component of the rack pigment, easily binds to proteins. This protein binding to lacqueric acid changes the color of lacqueric acid from red to purple. Therefore, it is meaningful to secure a method for analyzing the protein contained in the rack dye also for the purpose of ensuring the quality of the rack dye.
ラック色素が含有するタンパク質の分析方法が知られていなかった理由は、これまで、ラック色素が含有するタンパク質の分析の必要性が認識されていなかったことに加えて、ラック色素の色素成分の特殊性により、慣用のタンパク質の分析方法が適用できなかったことも原因であると考えられる。
例えば、慣用のタンパク質分析方法であるセミミクロケルダール法は、タンパク質そのものの量ではなく窒素の量の測定に基づく方法であり、構成原子として窒素原子を有さないコチニール色素等の夾雑タンパク質の分析に利用できる。
しかし、ラック色素の色素成分であるラッカイン酸は、その構成原子として窒素原子を有するので、セミミクロケルダール法をラック色素が含有するタンパク質の分析に適用することはできない。
また、一般に、タンパク質の精密な分析法においては、高精度の定量法であるブラッドフォード法(Bradford法)、及びタンパク質を分子量によって分離できるＳＤＳ−Ｐａｇｅ法が利用されている。
しかし、ラック色素の主要な色素成分であるラッカイン酸は、当該ブラッドフォード法及びＳＤＳ−Ｐａｇｅ法に原理的に干渉するので、従来、ラック色素中に含有されるアレルゲンタンパク質の分析に当該方法を利用することはできない。なお、このことから理解されるように、この問題は、色価が高いラック色素において顕著である。
The reason for not knowing how to analyze the protein contained in the rack dye is that the necessity of analyzing the protein contained in the rack dye has not been recognized so far, and the dye component of the rack dye is special. This may be due to the inability to apply conventional protein analysis methods.
For example, the semi-micro Kjeldahl method, which is a conventional protein analysis method, is based on the measurement of the amount of nitrogen, not the amount of protein itself, and is used for the analysis of contaminating proteins such as cochineal dyes that do not have nitrogen atoms as constituent atoms. it can.
However, since laccaic acid, which is a dye component of the rack dye, has a nitrogen atom as a constituent atom, the semi-micro Kjeldahl method cannot be applied to the analysis of the protein contained in the rack dye.
In general, in a precise protein analysis method, a Bradford method (Bradford method), which is a highly accurate quantitative method, and an SDS-Page method capable of separating proteins by molecular weight are used.
However, since laccaic acid, which is the main dye component of the rack dye, interferes in principle with the Bradford method and SDS-Page method, this method has been conventionally used for the analysis of allergen proteins contained in the rack dye. I can't do it. As can be understood from this, this problem is remarkable in a rack dye having a high color value.
一方、酵素免疫定量（ＥＬＩＳＡ）法によれば、ブラッドフォード法及びＳＤＳ−Ｐａｇｅ法等の方法を利用しなくても、単一又は複数のアレルゲンの精密な分析を行うことは可能であるが、当該方法は、各アレルゲンに特異的な抗体を用いる方法なので、複数の種類のアレルゲンタンパク質を総合的又は網羅的に簡便に分析することには適さない。
また、タンニン酸濁度法は色素中の夾雑タンパク質の量を正確に測定できる方法でない。
On the other hand, according to the enzyme immunoassay (ELISA) method, it is possible to carry out precise analysis of single or plural allergens without using methods such as Bradford method and SDS-Page method. Since this method uses an antibody specific for each allergen, it is not suitable for simply or comprehensively analyzing a plurality of types of allergen proteins.
Moreover, the tannic acid turbidity method is not a method that can accurately measure the amount of contaminating proteins in the pigment.
従って、本発明は、ラック色素中に含有されるタンパク質の分析方法（特に、精密な分析が可能な分析方法）を提供することを目的とする。また、本発明は、ラック色素中に含有されるタンパク質（すなわち、ラック色素中に含有される夾雑タンパク質）の総合的又は網羅的かつ簡便な分析が可能な分析方法を提供することを更なる目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for analyzing a protein contained in a rack dye (particularly, an analytical method capable of precise analysis). Another object of the present invention is to provide an analysis method capable of comprehensively or comprehensively and simply analyzing a protein contained in a rack dye (that is, a contaminating protein contained in the rack dye). And
前記のように、ラック色素の色素成分であるラッカイン酸は、タンパク質と結合しやいい。従って、ラック色素からのタンパク質の分離は容易ではない。
しかし、本発明者らは、鋭意検討の結果、所定の可溶化処理をしたラック色素試料を所定のゲル濾過処理に付すことによって、ラック色素中に含有されるタンパク質をラック色素の色素成分から分離できることを見出し、及びこのことにより、ラック色素試料から、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できること、言い方を換えれば、分析の対象であるタンパク質を選択的に集められることを見出した。
ここで、本発明者らの検討により、ラック色素の色価が高い場合は、前記所定の可溶化処理、及び所定のゲル濾過処理のみでは当該分離が不充分である問題が明らかになったが、本発明者らは、更に、このように特に色価が高いラック色素試料の場合でも、ゲル濾過処理の前に更に、所定の限外濾過処理を実施することによって、前記分離が可能になることを見出した。
本発明者らは、かかる知見に基づき、更なる研究の結果本発明を完成するに至った。
As described above, laccaic acid, which is a pigment component of the rack pigment, can easily bind to proteins. Therefore, the separation of the protein from the rack dye is not easy.
However, as a result of intensive studies, the present inventors have separated the protein contained in the rack dye from the dye component of the rack dye by subjecting the rack dye sample subjected to the predetermined solubilization treatment to a predetermined gel filtration treatment. It is possible to remove the dye component that interferes with the analysis of the protein from the rack dye sample to the extent that the precise analysis of the protein can be performed, in other words, the analysis target. We have found that proteins can be collected selectively.
Here, as a result of the study by the present inventors, when the color value of the rack dye is high, the problem that the separation is insufficient only by the predetermined solubilization process and the predetermined gel filtration process has been clarified. In addition, the present inventors can further perform the separation by carrying out a predetermined ultrafiltration treatment before the gel filtration treatment even in the case of such a rack dye sample having a particularly high color value. I found out.
Based on this finding, the present inventors have completed the present invention as a result of further research.
本発明は、次の態様を含む。 The present invention includes the following aspects.
項１． ラック色素中のタンパク質の分析方法であって、
（１）（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階、及び
（２）前記前処理段階（１）を経た前記ラック色素試料を分析する段階
を含む分析方法。
項２． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項１に記載の分析方法。
項３． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項２に記載の分析方法。
項４． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
項５． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項４に記載の分析方法。
項６． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。
項７． 前記段階（ｉｉｉ）の前に、更に、
（ｉｖ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、色素成分の少なくとも一部を除去する段階を含む
項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。
項８． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に段階（ｉｖ）を実施する
項７に記載の分析方法。
項９． タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法であって、
（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含む調製方法。
項１０． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項９に記載の調製方法。
項１１． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項１０に記載の調製方法。
項１２． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項９〜１１のいずれか１項に記載の調製方法。
項１３． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項１２に記載の調製方法。
項１４． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項９〜１３のいずれか１項に記載の調製方法。
項１５． 前記ゲル濾過段階の前に、更に、前記ラック色素試料を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素を除去する限外濾過段階を含む
項９〜１４のいずれか１項に記載の調製方法。
項１６． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前記限外濾過段階を実施する
項１５に記載の調製方法。
項１７． 項９〜１６のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタンパク質分析用のラック色素試料を分析することを含む
ラック色素試料中のタンパク質の調製方法。
項１８． ラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法であって、
（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収するゲル濾過段階
を含む前処理方法。
項１９． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項１８に記載の前処理方法。
項２０． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項１９に記載の前処理方法。
項２１． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項１８〜２０のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２２． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項２１に記載の前処理方法。
項２３． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項１８〜２２のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２４． 前記ゲル濾過段階の前に、更に、前記ラック色素試料を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素を除去する限外濾過段階を含む
項１８〜２３のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２５． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前記限外濾過段階を実施する
項２４に記載の前処理方法。
項２６． 項１９〜２５のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタンパク質分析用のラック色素試料を分析することを含む
ラック色素試料中のタンパク質の前処理方法。
Item 1. A method for analyzing a protein in a rack dye, comprising:
(1) (i) a step of preparing a rack dye aqueous solution by dissolving a rack dye sample that may contain a protein in an aqueous solvent having a pH in the range of 9 to 10,
(Ii) adjusting the pH of the aqueous rack dye solution prepared in the step (i) within a range of less than 7.5 to 9, and (iii) adjusting the pH of the aqueous rack dye solution in the step (ii), A dextran and derivative thereof, and a cross-linked product of one or more polysaccharides selected from agarose and derivative thereof are used as a stationary phase, and a salt concentration of 5 mM or more and a pH within a range of 1.5 to 9 are used as a mobile phase. A pretreatment step of a rack dye sample, which includes a step of collecting an eluent that may contain a protein by gel filtration using an aqueous solution, and (2) the rack that has undergone the pretreatment step (1) An analysis method comprising the step of analyzing a dye sample.
Item 2. Item 10. The analysis method according to Item 1, wherein the pH of the aqueous solution is in the range of 7-9.
Item 3. Item 3. The analysis method according to Item 2, wherein the pH of the aqueous solution is in the range of 7.5 to 8.5.
Item 4. Item 4. The analysis method according to any one of Items 1 to 3, wherein the salt concentration of the aqueous solution is in the range of 5 to 55 mM.
Item 5. Item 5. The analysis method according to Item 4, wherein the salt concentration of the aqueous solution is in the range of 10 to 50 mM.
Item 6. Item 6. The analysis method according to any one of Items 1 to 5, wherein the aqueous solution is a phosphate buffer.
Item 7. Before step (iii), further
(Iv) Any one of Items 1 to 6 including a step of removing at least a part of the dye component by subjecting the aqueous rack dye solution adjusted in pH in the step (ii) to ultrafiltration having a molecular weight cut off of 3 kD or more. 2. The analysis method according to item 1.
Item 8. Item 8. The analysis method according to Item 7, wherein step (iv) is performed when the rack dye sample has a high color value.
Item 9. A method for preparing a rack dye sample for protein analysis, comprising:
(I) a step of preparing a rack dye aqueous solution by dissolving a rack dye sample that may contain a protein in an aqueous solvent having a pH in the range of 9 to 10;
(Ii) adjusting the pH of the aqueous rack dye solution prepared in the step (i) within a range of less than 7.5 to 9, and (iii) adjusting the pH of the aqueous rack dye solution in the step (ii), A dextran and derivative thereof, and a cross-linked product of one or more polysaccharides selected from agarose and derivative thereof are used as a stationary phase, and a salt concentration of 5 mM or more and a pH within a range of 1.5 to 9 are used as a mobile phase. A preparation method comprising a step of collecting an eluent that may contain a protein by subjecting the solution to gel filtration using an aqueous solution.
Item 10. Item 10. The preparation method according to Item 9, wherein the pH of the aqueous solution is in the range of 7-9.
Item 11. Item 11. The preparation method according to Item 10, wherein the pH of the aqueous solution is in the range of 7.5 to 8.5.
Item 12. Item 12. The preparation method according to any one of Items 9 to 11, wherein the salt concentration of the aqueous solution is in the range of 5 to 55 mM.
Item 13. Item 13. The preparation method according to Item 12, wherein the salt concentration of the aqueous solution is in the range of 10 to 50 mM.
Item 14. Item 14. The preparation method according to any one of Items 9 to 13, wherein the aqueous solution is a phosphate buffer.
Item 15. Item 15. The method according to any one of Items 9 to 14, further comprising an ultrafiltration step of removing the rack dye by subjecting the rack dye sample to ultrafiltration having a molecular weight cut off of 3 kD or more before the gel filtration step. The preparation method described.
Item 16. Item 16. The preparation method according to Item 15, wherein the ultrafiltration step is performed when the rack dye sample has a high color value.
Item 17. Item 17. A method for preparing a protein in a rack dye sample, comprising analyzing the rack dye sample for protein analysis obtained by the preparation method according to any one of Items 9 to 16.
Item 18. A method of pretreatment of a rack dye sample for analysis of proteins in the rack dye, comprising:
(I) a step of preparing a rack dye aqueous solution by dissolving a rack dye sample that may contain a protein in an aqueous solvent having a pH in the range of 9 to 10;
(Ii) adjusting the pH of the aqueous rack dye solution prepared in the step (i) within a range of less than 7.5 to 9, and (iii) adjusting the pH of the aqueous rack dye solution in the step (ii), A dextran and derivative thereof, and a cross-linked product of one or more polysaccharides selected from agarose and derivative thereof are used as a stationary phase, and a salt concentration of 5 mM or more and a pH within a range of 1.5 to 9 are used as a mobile phase. A pretreatment method comprising a gel filtration step, which is subjected to gel filtration using an aqueous solution having a gel and recovering an eluent that may contain a protein.
Item 19. Item 19. The pretreatment method according to Item 18, wherein the pH of the aqueous solution is in the range of 7-9.
Item 20. Item 20. The pretreatment method according to Item 19, wherein the pH of the aqueous solution is in the range of 7.5 to 8.5.
Item 21. Item 21. The pretreatment method according to any one of Items 18 to 20, wherein the salt concentration of the aqueous solution is in the range of 5 to 55 mM.
Item 22. Item 22. The pretreatment method according to Item 21, wherein the salt concentration of the aqueous solution is in the range of 10 to 50 mM.
Item 23. Item 23. The pretreatment method according to any one of Items 18 to 22, wherein the aqueous solution is a phosphate buffer.
Item 24. Item 24. The item according to any one of Items 18 to 23, further comprising an ultrafiltration step of removing the rack dye by subjecting the rack dye sample to ultrafiltration with a molecular weight cut off of 3 kD or more before the gel filtration step. The pretreatment method described.
Item 25. Item 25. The pretreatment method according to Item 24, wherein the ultrafiltration step is performed when the rack dye sample has a high color value.
Item 26. Item 26. A method for pretreating a protein in a rack dye sample, comprising analyzing the rack dye sample for protein analysis obtained by the preparation method according to any one of Items 19 to 25.
本発明によれば、ラック色素中のタンパク質の精密な分析方法が提供される。更に、本発明によれば、ラック色素中のタンパク質の総合的又は網羅的かつ簡便な分析が可能な分析方法が提供される。 According to the present invention, a method for precise analysis of proteins in rack dyes is provided. Furthermore, according to the present invention, there is provided an analysis method capable of comprehensive or comprehensive and simple analysis of proteins in a rack dye.
本明細書中、「ラック色素」は、カイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）が分泌する樹脂状物質から得られた色素である。
ラック色素の主要な色素成分はラッカイン酸である。
本明細書中、「ラック色素試料」とは、本発明の分析方法に供される当該色素の試料の他に、本発明の分析方法における各段階を経た試料を意味する場合がある。これらの意味は、その前後の文脈によって理解される。
In the present specification, the “rack pigment” is a pigment obtained from a resinous substance secreted by Laccifer Lacca Kerr.
The main dye component of the rack dye is lacaic acid.
In the present specification, the “rack dye sample” may mean a sample that has undergone each stage in the analysis method of the present invention, in addition to the dye sample used in the analysis method of the present invention. These meanings are understood by the context before and after.
ラック色素試料中のタンパク質の分析方法
本発明のラック色素試料中のタンパク質の分析方法は、
（１）（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、７．５〜１１の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７〜１４の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階（本明細書中、前処理段階（１）と称する場合がある。）、及び
（２）前記前処理段階（１）を経た前記ラック色素試料を分析する段階（本明細書中、分析段階（２）と称する場合がある。）
を含む。
Method for analyzing protein in rack dye sample The method for analyzing a protein in the rack dye sample of the present invention comprises:
(1) (i) a step of preparing a rack dye aqueous solution by dissolving a rack dye sample possibly containing a protein in an aqueous solvent having a pH in the range of 7.5 to 11;
(Ii) adjusting the pH of the aqueous lac dye solution prepared in step (i) to within the range of 7 to 14, and (iii) using the lac dye aqueous solution adjusted in pH in step (ii) as a stationary phase. An aqueous solution using dextran and derivatives thereof, and a cross-linked product of one or more polysaccharides selected from agarose and derivatives thereof, and having a salt concentration of 5 mM or more and a pH within a range of 1.5 to 9 as a mobile phase The pretreatment step of the rack dye sample, which includes a step of collecting the eluent that may contain a protein by gel filtration using (sometimes referred to herein as pretreatment step (1)). And (2) a step of analyzing the rack dye sample having undergone the pretreatment step (1) (sometimes referred to herein as an analysis step (2)).
including.
分析対象
本発明の分析方法の分析対象は、ラック色素試料中のタンパク質である。
当該分析対象であるタンパク質は、好ましくは、前記ラック色素に共有結合していないタンパク質である。
当該タンパク質は、通常、ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）由来のタンパク質である。
本発明の分析方法に供される試料は、通常、タンパク質を含有するラック色素試料であるが、本発明の分析方法は、ラック色素試料がタンパク質を含有しないこと（又は、タンパク質の含有量が検出限界以下であること）を確認する目的でも利用できる。
従って、本発明の分析方法は、タンパク質を含有する可能性がある、あらゆるラック色素試料に適用できる。
Analysis object The analysis object of the analysis method of the present invention is a protein in a rack dye sample.
The protein to be analyzed is preferably a protein that is not covalently bonded to the rack dye.
The protein is usually a protein derived from Laccifer Lacca Kerr.
The sample subjected to the analysis method of the present invention is usually a rack dye sample containing protein, but the analysis method of the present invention is such that the rack dye sample does not contain protein (or the protein content is detected). It can also be used to confirm that it is below the limit.
Therefore, the analysis method of the present invention can be applied to any rack dye sample that may contain a protein.
前処理段階（１）
通常、ラック色素は、粉末、塊、液体又はペースト状である。その試料は、当該前処理段階（１）において、以下に詳細に説明する段階（ｉ）、及び段階（ｉｉ）を経て、後記で詳細に説明する段階（ｉｉｉ）のゲル濾過に付される。
Pretreatment stage (1)
Usually, the rack pigment is in the form of powder, lump, liquid or paste. In the pretreatment step (1), the sample is subjected to gel filtration in step (iii), which will be described in detail later, through steps (i) and (ii) described in detail below.
当該段階（ｉ）、及び（ｉｉ）によって、ラック色素試料を好適に可溶化できる。これにより、段階（ｉｉｉ）のゲル濾過の適切な実施が可能になる。本明細書中、当該段階（ｉ）、及び（ｉｉ）の処理をあわせて、可溶化処理と称する場合がある。 By the steps (i) and (ii), the rack dye sample can be suitably solubilized. This allows proper implementation of the gel filtration of step (iii). In the present specification, the steps (i) and (ii) may be collectively referred to as a solubilization treatment.
段階（ｉ）
段階（ｉ）では、ラック色素試料を水系溶媒に溶解させる。
段階（ｉ）においては、ラック色素試料の少なくとも一部が水系溶媒に溶解されればよいが、大部分のラック色素試料が溶解されることが好ましく、全てのラック色素試料が溶解されることがより好ましい。
当該水系溶媒のｐＨは、９〜１０の範囲内であり、好ましくは、９．２〜９．８の範囲内であり、より好ましくは、９．４〜９．６の範囲内であり、特に好ましくは、９．５である。
当該水系溶媒は、好適に、リン酸水素二ナトリウム水溶液であることができる。
当該リン酸水素二ナトリウム水溶液の濃度は、好ましくは、１〜１０００ｍＭの範囲内であり、より好ましくは、５〜１００ｍＭの範囲内であり、及び特に好ましくは、５０ｍＭである。
段階（ｉ）で用いられる当該水系溶媒の量は、例えば、ラック色素試料の色価８０に対し、１〜１０重量部の範囲内であることができる。
当該ラック色素試料は液状であってもよい。すなわち、ラック色素試料の「溶解」は、ラック色素試料の希釈であってもよい。
液状のラック色素試料として、具体的には、例えば、カイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）の樹脂状分泌物質の乾燥粉末１０ｇに対し、水１００ｍＬを加え、室温下で６０分間攪拌抽出し、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ａ（１１０ｍｍ）、東洋濾紙株式会社）で濾過した抽出液が例示される。
Stage (i)
In step (i), the rack dye sample is dissolved in an aqueous solvent.
In step (i), it is sufficient that at least a part of the rack dye sample is dissolved in the aqueous solvent, but it is preferable that most of the rack dye sample is dissolved, and all the rack dye samples are dissolved. More preferred.
The pH of the aqueous solvent is in the range of 9 to 10, preferably in the range of 9.2 to 9.8, more preferably in the range of 9.4 to 9.6, particularly Preferably, it is 9.5.
The aqueous solvent can be preferably a disodium hydrogen phosphate aqueous solution.
The concentration of the disodium hydrogen phosphate aqueous solution is preferably in the range of 1 to 1000 mM, more preferably in the range of 5 to 100 mM, and particularly preferably 50 mM.
The amount of the aqueous solvent used in step (i) can be, for example, in the range of 1 to 10 parts by weight with respect to the color value 80 of the rack dye sample.
The rack dye sample may be liquid. That is, the “dissolution” of the rack dye sample may be a dilution of the rack dye sample.
As a liquid rack pigment sample, specifically, for example, 100 mL of water is added to 10 g of a dry powder of a resinous secretory substance of Lactifer Lacca Kerr, and the mixture is stirred and extracted at room temperature for 60 minutes. The extract filtered with (ADVANTEC 5A (110 mm), Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) is illustrated.
段階（ｉｉ）
段階（ｉｉ）では、前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内、好ましくは、７．６〜８．５の範囲内、より好ましくは、７．８〜８．２の範囲内、特に好ましくは、８に調整する。
当該ｐＨの調整は、ｐＨ調整剤を使用して、行えばよい。
当該ｐＨ調整剤自体のｐＨは、１〜７の範囲内であり、好ましくは、３〜６の範囲内であり、より好ましくは、４〜５の範囲内であり、特に好ましくは、４．５である。
当該ｐＨ調整剤は、好適に、リン酸二水素ナトリウム水溶液であることができる。
当該リン酸二水素ナトリウム水溶液の濃度は、好ましくは、１〜１０００ｍＭの範囲内であり、より好ましくは、５〜１００ｍＭの範囲内であり、及び特に好ましくは、５０ｍＭである。
Stage (ii)
In step (ii), the pH of the aqueous rack dye solution prepared in step (i) is in the range of less than 7.5 to 9, preferably in the range of 7.6 to 8.5, more preferably 7. Within the range of 8 to 8.2, particularly preferably 8 is adjusted.
The pH may be adjusted using a pH adjuster.
The pH of the pH adjuster itself is in the range of 1-7, preferably in the range of 3-6, more preferably in the range of 4-5, and particularly preferably 4.5. It is.
The pH adjuster can suitably be an aqueous sodium dihydrogen phosphate solution.
The concentration of the aqueous sodium dihydrogen phosphate solution is preferably in the range of 1-1000 mM, more preferably in the range of 5-100 mM, and particularly preferably 50 mM.
段階（ｉｉｉ）
段階（ｉｉｉ）では、前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する。
Stage (iii)
In the step (iii), the aqueous solution of the rack dye whose pH is adjusted in the step (ii) is used as a stationary phase with a cross-linked product of one or more polysaccharides selected from dextran and derivatives thereof, and agarose and derivatives thereof. In addition, gel filtration using an aqueous solution having a salt concentration of 5 mM or more and a pH in the range of 1.5 to 9 as the mobile phase is recovered to recover an eluent that may contain protein.
段階（ｉｉｉ）のゲル濾過においては、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物が用いられる。すなわち、当該ゲル濾過におけるゲルは、当該架橋物のゲルである。
当該架橋物の好ましい例は、１−クロロ−２，３−エポキシ−プロパン架橋デキストランゲルを包含する。
In the gel filtration in step (iii), a cross-linked product of one or more polysaccharides selected from dextran and derivatives thereof and agarose and derivatives thereof is used as a stationary phase. That is, the gel in the gel filtration is a gel of the crosslinked product.
Preferred examples of the crosslinked product include 1-chloro-2,3-epoxy-propane crosslinked dextran gel.
段階（ｉｉｉ）のゲル濾過においては、移動相として、５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液が用いられる。
当該移動相としての水性溶液のｐＨは、好ましくは７〜９の範囲内であり、より好ましくは７．５〜８．５の範囲内である。
当該ｐＨがこのような範囲内であることにより、段階（ｉｉｉ）のゲル濾過において、ラック色素試料中の色素成分とタンパク質とが充分に分離される。
ｐＨの調整は、酸性物質、塩基性物質、及び緩衝剤（例、リン酸緩衝剤）等の添加のような慣用の用法により行えばよい。これらの物質は、１種単独で、又は２種以上の組み合わせで用いることができる。
当該移動相としての水性溶液の塩濃度は、好ましくは５〜５５ｍＭの範囲内であり、より好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲内である。
当該塩濃度がこのような範囲内であることにより、段階（ｉｉｉ）のゲル濾過において、ラック色素試料中の色素成分とタンパク質とが充分に分離される。
塩濃度の調整は、塩の添加のような慣用の用法により行えばよい。当該塩の例は、ＮａＣｌ、及び緩衝剤（例、リン酸緩衝剤）を含む。これらの物質は、１種単独で、又は２種以上の組み合わせで用いることができる。
In the gel filtration of step (iii), an aqueous solution having a salt concentration of 5 mM or more and a pH in the range of 1.5 to 9 is used as the mobile phase.
The pH of the aqueous solution as the mobile phase is preferably in the range of 7 to 9, more preferably in the range of 7.5 to 8.5.
When the pH is within such a range, the dye component and the protein in the rack dye sample are sufficiently separated in the gel filtration in step (iii).
The pH may be adjusted by a conventional method such as addition of an acidic substance, a basic substance, and a buffer (eg, phosphate buffer). These substances can be used alone or in combination of two or more.
The salt concentration of the aqueous solution as the mobile phase is preferably in the range of 5 to 55 mM, more preferably in the range of 10 to 50 mM.
When the salt concentration is within such a range, the dye component and the protein in the rack dye sample are sufficiently separated in the gel filtration in step (iii).
The salt concentration may be adjusted by a conventional method such as addition of salt. Examples of such salts include NaCl, and buffers (eg, phosphate buffers). These substances can be used alone or in combination of two or more.
前記水性溶液は、好ましくは、リン酸緩衝液である。これにより、塩濃度とｐＨとを同時に好適な範囲内に調整できる。リン酸緩衝液は、リン酸緩衝剤を含有する。リン酸緩衝液は、塩濃度の調整のため、更に塩（例、塩化ナトリウム）を含有してもよい。 The aqueous solution is preferably a phosphate buffer. Thereby, salt concentration and pH can be adjusted in a suitable range simultaneously. The phosphate buffer contains a phosphate buffer. The phosphate buffer may further contain a salt (eg, sodium chloride) for adjusting the salt concentration.
段階（ｉｉｉ）のゲル濾過は、一般的なゲル濾過の方法と同様に実施すればよい。
具体的には、ラック色素試料を固定相であるゲルに負荷し、当該ゲルに移動相を通して、溶出液を回収する。
前記固定相は、好ましくは、ラック色素の負荷の前に、前記移動相に用いられる水性溶液と同じ組成の水性溶液を用いて平衡化される。
The gel filtration in the step (iii) may be performed in the same manner as a general gel filtration method.
Specifically, a rack dye sample is loaded on a gel that is a stationary phase, and the eluate is collected through the mobile phase through the gel.
The stationary phase is preferably equilibrated with an aqueous solution of the same composition as the aqueous solution used for the mobile phase prior to loading of the rack dye.
当該ゲル濾過において、ラック色素に含有されるタンパク質は、ラック色素の色素成分よりも先に溶出する傾向がある。
この傾向に基づき、タンパク質を含有する画分（又はタンパク質を含有する可能性がある画分）を選択して集めることにより、ラック色素試料から、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できる。
すなわち、前処理段階（１）を経たラック色素試料は、元のラック色素試料に比べて、タンパク質含有量に対する色素成分含有量が減少している。
In the gel filtration, the protein contained in the rack dye tends to elute before the dye component of the rack dye.
Based on this tendency, by selecting and collecting the fraction containing the protein (or the fraction that may contain the protein), the dye component that interferes with the analysis of the protein is collected from the rack dye sample. It can be removed to such an extent that precise analysis can be performed.
That is, in the rack dye sample that has undergone the pretreatment stage (1), the dye component content relative to the protein content is reduced as compared to the original rack dye sample.
段階（ｉｖ）
ラック色素試料の色価が高い場合、段階（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のみでは、ラック色素試料から、ラック色素中のタンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できない場合がある。
ここで、「ラック色素試料の色価が高い場合」とは、例えば、色価が２０以上の場合、又は色価が４０以上の場合であることができる。
この場合、前記段階（ｉｉｉ）の前（前記可溶化処理の後）に、更に、前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素試料中の色素成分の少なくとも一部（言い換えると、一部又は全部）を除去すること（段階（ｉｖ））を好適に実施できる。当該段階（ｉｖ）を経たラック色素試料は、元のラック色素試料に比べて、タンパク質含有量に対する色素成分含有量が減少している。これにより、その後の段階（ｉｉｉ）で、ラック色素中のタンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できるようになる。なお、段階（ｉｖ）においてラック色素の色素成分の全部が除去された場合、段階（ｉｉｉ）を行う必要は無いが、その場合でも、段階（ｉｉｉ）を行う場合は、本発明の範囲内である。
当該限外濾過は、限外濾過膜を用いて実施できる。
当該限外濾過においては、遠心等により、ラック色素を含有する液の限外濾過膜の通過を促進させられる。当該遠心の条件は、技術常識により適当に設定できるが、例えば、４０００×ｇ、４０分間程度である。
ラック色素が含有するタンパク質は、限外濾過膜を通過せずに、当該限外濾過膜の上のラック色素試料中に残る。
好ましくは、ラック色素試料にリン酸緩衝液を加えて限外濾過を繰り返すことにより、ラック色素試料を洗浄すること、言い換えれば、色素成分を更に除去することができる。当該洗浄は、例えば、色価が高くなくなるまで（すなわち、例えば、色価が４０未満になるまで、又は色価が２０未満になるまで）繰り返すことが好ましく、具体的には、例えば、４〜５回繰り返される。
当該限外濾過は、例えば、限外濾過膜を備え、限外濾過に使用できる市販の遠心式濾過ユニット（例、Ａｍｉｃｏｎ−１５（商品名、ミリポア社））を用いて、その説明書の記載に従って実施できる。
Stage (iv)
If the color value of the rack dye sample is high, the steps (i), (ii), and (iii) only allow the dye component from the rack dye sample to interfere with the analysis of the protein in the rack dye. It may not be removed to the extent that analysis is possible.
Here, “when the color value of the rack dye sample is high” can be, for example, a case where the color value is 20 or more, or a case where the color value is 40 or more.
In this case, before the step (iii) (after the solubilization treatment), the rack dye aqueous solution whose pH is adjusted in the step (ii) is further subjected to ultrafiltration having a fractional molecular weight of 3 kD or more, It is preferable to remove at least part (in other words, part or all) of the dye component in the rack dye sample (step (iv)). The rack dye sample that has undergone the step (iv) has a reduced dye component content relative to the protein content as compared to the original rack dye sample. As a result, in the subsequent step (iii), the dye component that interferes with the analysis of the protein in the rack dye can be removed to the extent that the protein can be accurately analyzed. It should be noted that if all of the dye component of the rack dye is removed in step (iv), it is not necessary to perform step (iii), but even in that case, if step (iii) is performed, it is within the scope of the present invention. is there.
The ultrafiltration can be performed using an ultrafiltration membrane.
In the ultrafiltration, passage of the liquid containing the rack dye through the ultrafiltration membrane can be promoted by centrifugation or the like. The centrifugation conditions can be appropriately set according to common technical knowledge, but are, for example, about 4000 × g for about 40 minutes.
The protein contained in the rack dye does not pass through the ultrafiltration membrane and remains in the rack dye sample on the ultrafiltration membrane.
Preferably, the rack dye sample is washed by adding a phosphate buffer to the rack dye sample and repeating ultrafiltration, in other words, the dye component can be further removed. The washing is preferably repeated, for example, until the color value is not high (that is, until, for example, the color value is less than 40 or the color value is less than 20). Repeated 5 times.
The ultrafiltration is, for example, using a commercially available centrifugal filtration unit (for example, Amicon-15 (trade name, Millipore)) that includes an ultrafiltration membrane and can be used for ultrafiltration. Can be implemented according to
段階（ｉｖ）は、例えば、ラック色素試料の色価が高い場合（例、色価が４０以上である場合、色価が２０以上である場合）に実施するように分析のスキームを定めてもよいが、ラック色素試料の色価に限らず実施してもよい。
なお、本明細書中、色価とは、着色料溶液の可視部での極大吸収波長における吸光度を測定し、１０ｗ／ｖ％溶液の吸光度に換算した数値であり、色価は、好適には、第８版食品添加物公定書に記載の方法に従って、測定される。
Even if the color scheme of the rack dye sample is high (for example, when the color value is 40 or more, when the color value is 20 or more), step (iv) may define an analysis scheme. However, the present invention is not limited to the color value of the rack dye sample.
In the present specification, the color value is a numerical value obtained by measuring the absorbance at the maximum absorption wavelength in the visible part of the colorant solution and converting it to the absorbance of a 10 w / v% solution. , Measured according to the method described in the 8th edition Food Addendum.
タンパク質の分析段階（分析段階（２））
必要に応じて、所望により、タンパク質の分析段階の前の適当な段階、好ましくは、前処理段階（１）（すなわち、前処理段階（１）における段階（ｉｉｉ）の後に、タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を濃縮してもよい。当該濃縮は、限外濾過等の慣用の方法により実施すればよい。当該限外濾過は、例えば、限外濾過に使用できる市販の遠心式濾過ユニット（例、Ａｍｉｃｏｎ−４（商品名、ミリポア社））を用いて、その説明書の記載に従って実施できる。
Protein analysis stage (analysis stage (2))
If desired, the protein may optionally be contained after an appropriate step prior to the protein analysis step, preferably after the pretreatment step (1) (ie after step (iii) in the pretreatment step (1)). The concentrated rack dye sample may be concentrated by a conventional method such as ultrafiltration, etc. The ultrafiltration is, for example, a commercially available centrifugal filter that can be used for ultrafiltration. Using a unit (for example, Amicon-4 (trade name, Millipore)), it can be carried out according to the description of the manual.
タンパク質の分析は、その目的に応じて、適当な方法を選択して実施すればよい。例えば、前記前処理（１）後のラック色素試料は、高精度の定量法であるブラッドフォード法(Ｂｒａｄｆｏｒｄ法)、及びタンパク質を分子量によって分離できるＳＤＳ−Ｐａｇｅ法に干渉する色素成分が低減されているので、これら方法を包含する、タンパク質の分析に利用される任意の方法の１種以上を用いて、ラック色素中のタンパク質の高精度の分析が可能である。本発明の分析方法には、好ましくは、ブラッドフォード法(Ｂｒａｄｆｏｒｄ法)、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法、又はその両方が用いられる。 Protein analysis may be carried out by selecting an appropriate method according to the purpose. For example, in the rack dye sample after the pretreatment (1), dye components that interfere with Bradford method (Bradford method), which is a highly accurate quantitative method, and SDS-Page method that can separate proteins by molecular weight are reduced. Therefore, it is possible to analyze the protein in the rack dye with high accuracy by using one or more arbitrary methods used for protein analysis including these methods. In the analysis method of the present invention, preferably, the Bradford method (Bradford method), the SDS-Page method, or both are used.
タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法、及びラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法
本発明は、別の側面では、タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法、又はラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法であることができる。これらの方法は、前記分析方法において説明した前処理方法と同様に実施できる。
A method for preparing a rack dye sample for protein analysis, and a pretreatment method for a rack dye sample for analyzing a protein in the rack dye. In another aspect, the present invention provides a method for preparing a rack dye sample for protein analysis, or It can be a pretreatment method of a rack dye sample for analysis of proteins in the rack dye. These methods can be performed in the same manner as the pretreatment method described in the analysis method.
以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
１）ラック色素抽出液の調製および色価の測定
カイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）の樹脂状分泌物質の乾燥粉末１０ｇに対し、水１００ｍＬを加え、室温下で６０分間攪拌抽出し、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ａ（１１０ｍｍ）、東洋濾紙株式会社）で濾過した抽出液をラック色素抽出液とした。本抽出液の主色素成分はアントラキノン系ラッカイン酸である。
ラック色素抽出液を０．５％無水炭酸ナトリウムに溶解させた後、０．１Ｎ塩酸水で適度に希釈し、可視部での最大吸収波長（４１０ｎｍ）における吸光度を測定した。当該吸光度を１０ｗ／ｖ％溶液の吸光度に換算した値を色価とした。
1) Preparation of lac pigment extract and measurement of color value 100 g of water was added to 10 g of dry powder of a resinous secretory substance of Lactifer Lacca Kerr, and the mixture was stirred and extracted at room temperature for 60 minutes. The extract filtered through ADVANTEC 5A (110 mm), Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) was used as the rack dye extract. The main pigment component of this extract is anthraquinone-based lacaic acid.
After the rack dye extract was dissolved in 0.5% anhydrous sodium carbonate, it was appropriately diluted with 0.1N hydrochloric acid water, and the absorbance at the maximum absorption wavelength (410 nm) in the visible region was measured. A value obtained by converting the absorbance into the absorbance of a 10 w / v% solution was defined as a color value.
２）前処理段階（１）
段階（ｉ）、及び（ｉｉ）（可溶化処理）
タンパク質分析用のラック色素試料は、ラック色素抽出液を５０ｍＭリン酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ９．５）に溶解させた後、５０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．５）を加え、ｐＨを８に調整した。
2) Pretreatment stage (1)
Stages (i) and (ii) (solubilization treatment)
The rack dye sample for protein analysis was prepared by dissolving the rack dye extract in a 50 mM sodium hydrogen phosphate aqueous solution (pH 9.5), and then adding a 50 mM sodium dihydrogen phosphate aqueous solution (pH 4.5) to adjust the pH to 8. It was adjusted.
様々な色価（０．３１、０．６３、１．２５、２．５、５、１０、２０、又は４０）のラック色素抽出液の色価が２．５を超える場合、その色素成分によってタンパク定量（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）が干渉を受けることを確認した（表１参照）。 If the color value of a rack dye extract of various color values (0.31, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, or 40) exceeds 2.5, depending on the dye component It was confirmed that protein quantification (Bradford method) was interfered (see Table 1).
２．５を超える様々な色価（色価：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０）のラック色素抽出液について、以下に示す段階（ｉｉｉ）を実施した。 Step (iii) shown below was carried out on the rack dye extracts with various color values exceeding 2.5 (color values: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80).
段階（ｉｉｉ）（限外濾過）
ゲル濾過カラムとして、１−クロロ−２，３−エポキシ−プロパン架橋デキストランゲル８．３ｍＬをカラム１．４５×５．０ｃｍに充填した市販のゲル濾過クロマトグラフィーカラム（ＰＤ−１０カラム／ＧＥヘルスケア社、商品名）を用いた。
同カラムを予め５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、ラック色素抽出液１ｍＬを負荷した。
次いで、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を当該カラムに注入し、溶出液を１ｍＬずつ１３画分、分取した。
各タンパク溶出画分を、それぞれ、分子量３ｋＤでの分画性能をもつ再生セルロースメンブレン限外濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ／Ｍｅｒｃｋ社、商品名を用いて１ｍＬに濃縮した。
当該濃縮溶液の一部をＢｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質定量に供し、各画分におけるタンパク質の有無を評価した。その結果、タンパク質溶出画分はＮｏ．４〜８の画分であった。一方、タンパク質定量を妨害する色素成分の溶出は、Ｎｏ．９以降の画分であった。色素成分の溶出は、吸光度（６２０ｎｍ）（有効数字２桁）によって検出した（吸光度測定のブランクとしては、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた）。
表１中、色価について、表中の記号は、以下のことを示す。
− ：吸光度が０．００
± ：吸光度が０．０１以上０．１０未満
＋ ：吸光度が０．１０以上０．４０未満
＋＋：吸光度が０．４０以上
ここで、画分の吸光度が０．０１以上０．１０未満の場合、当該画分はラック色素を含有するが、この程度の小量であれば、タンパク質の分析へのラック色素の干渉は無視できる。
すなわち、表１から理解されるように、ラック色素抽出液の色価の上限が１０〜４０の場合、当該前処理により、ラック色素抽出液中のタンパク質を、その分析に干渉する色素成分から分離できること、及び、このことにより、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できること、が確認された。
このことは、逆に言えば、当該処理でラック色素成分からタンパク質を分離可能なラック色素抽出液の色価の上限は４０であったことを意味する。
Stage (iii) (ultrafiltration)
As a gel filtration column, a commercially available gel filtration chromatography column (PD-10 column / GE health care) in which 8.3 mL of 1-chloro-2,3-epoxy-propane crosslinked dextran gel was packed in a column 1.45 × 5.0 cm. Company name).
The column was pre-equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) and loaded with 1 mL of rack dye extract.
Subsequently, 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) was injected into the column, and the eluate was fractionated into 13 fractions of 1 mL each.
Each protein elution fraction was concentrated to 1 mL using a regenerated cellulose membrane ultrafiltration unit (Amicon Ultra / Merck, trade name) having a fractionation performance at a molecular weight of 3 kD.
A part of the concentrated solution was subjected to protein quantification by the Bradford method, and the presence or absence of protein in each fraction was evaluated. As a result, the protein elution fraction was No. There were 4 to 8 fractions. On the other hand, the elution of the dye component interfering with the protein quantification is no. Fractions after 9 The elution of the dye component was detected by absorbance (620 nm) (2 significant digits) (50 mM phosphate buffer (pH 8.0) was used as a blank for absorbance measurement).
In Table 1, regarding the color value, the symbols in the table indicate the following.
−: Absorbance of 0.00
±: Absorbance of 0.01 or more and less than 0.10 +: Absorbance of 0.10 or more and less than 0.40 +++: Absorbance of 0.40 or more When the absorbance of the fraction is 0.01 or more and less than 0.10 The fraction contains a lac dye, but with such small amounts, the interference of the lac dye with protein analysis is negligible.
That is, as understood from Table 1, when the upper limit of the color value of the rack dye extract is 10 to 40, the pretreatment separates the protein in the rack dye extract from the dye components that interfere with the analysis. It was confirmed that the dye component that interferes with the analysis of the protein can be removed to the extent that the protein can be precisely analyzed.
In other words, this means that the upper limit of the color value of the rack dye extract that can separate the protein from the rack dye component by the treatment was 40.
ここで、可溶化処理後の溶液の色価が４０を超えたラック色素抽出液については、段階（ｉｉｉ）の前に、更に、以下の段階（ｉｖ）を実施した。
３）段階（ｉｖ）［限外濾過］
分画分子量３ｋＤの限外濾過ユニット（商品名：Ａｍｉｃｏｎ−１５、ミリポア社）を用いて、色価が４０を超えるラック色素抽出液を、色価が４０以下となるように限外濾過（４，０００×ｇ、４０分間を４〜５回）した。
Here, the following step (iv) was further carried out before the step (iii) for the rack dye extract whose color value of the solution after the solubilization treatment exceeded 40.
3) Stage (iv) [ultrafiltration]
Using an ultrafiltration unit (trade name: Amicon-15, Millipore) with a molecular weight cut off of 3 kD, a rack dye extract having a color value exceeding 40 is ultrafiltered so that the color value becomes 40 or less (4 000 × g, 40 minutes 4-5 times).
なお、段階（ｉｖ）を含まない前処理段階（１）と、段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）と、において、市販の標準タンパク混合品（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ／ＢｉｏＲａｄ社：商標）を用いて、添加回収試験を行なった結果、当該タンパク質の回収率は８４％以上であり、充分に高かった。（段階（ｉｖ）を含まない前処理段階（１）で９０％、段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）で８４％） In the pretreatment stage (1) not including the stage (iv) and the pretreatment stage (1) including the stage (iv), a commercially available standard protein mixture (Precision Plus Protein Standards / BioRad: trademark) As a result of conducting an addition recovery test using the above, the protein recovery rate was 84% or more, which was sufficiently high. (90% in pretreatment stage (1) not including stage (iv), 84% in pretreatment stage (1) including stage (iv))
３）タンパク質の定量
段階（ｉｖ）を含まない前記前処理段階（１）を経た試料、及び段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を経た試料を、それぞれ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適度に希釈し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ７２, ２４８ (１９７６).）に従い、タンパク質の定量を行った。検量線作成には、標準タンパクに牛血清アルブミン水溶液を用いた。
その結果、ラック色素抽出液中のタンパク質の量は、３５０μｇ／ｍＬであった。
3) A sample having undergone the pretreatment step (1) not including the protein quantification step (iv) and a sample having undergone the pretreatment step (1) including the step (iv) were respectively treated with 50 mM phosphate buffer (pH 8). 0.0) and the protein was quantified according to the Bradford method (Anal. Biochem., 72, 248 (1976)). For preparing a calibration curve, bovine serum albumin aqueous solution was used as a standard protein.
As a result, the amount of protein in the rack dye extract was 350 μg / mL.
４）タンパク質の検出
段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を経た試料、及びラック色素抽出液（前処理段階（１）を経ていない試料）について、次のようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。
試料１００μｌに、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）９５μｌ、及び２−メルカプトエタノール５μｌを加え、及び５分間煮沸して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷する試料を得た。電気泳動の条件はＬａｅｍｍｌｉ法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））に従った（当該条件を後記した。）。電気泳動後のゲルの染色は、慣用の方法であるＣＢＢ染色法によって実施した。
ラック色素の泳動ゲルのＣＢＢ染色結果を図１に示す（図１左：前処理段階（１）を行わなかった試料。図１右：段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を行った試料）。前処理段階（１）を行わなかった試料の場合、バンドがスメアになり、各タンパク質の検出が行えなかったが、段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を行った試料の場合、タンパク質のバンドが明瞭に観察された。
＜電気泳動条件＞
・ゲル：１０〜２０％ポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ社、商品名）
・泳動条件：２００Ｖ定圧、約４０分
・電気泳動用緩衝液：１０×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳプレミックスバッファー（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）を超純水で１０倍希釈した。
・分子量マーカー：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）
・試料負荷量： ３μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／１０μｌ／ｗｅｌｌ
4) SDS-polyacrylamide gel electrolysis for the sample that has undergone the pretreatment step (1) including the protein detection step (iv) and the rack dye extract (the sample that has not undergone the pretreatment step (1)) as follows: Electrophoresis was performed.
To 100 μl of the sample, 95 μl of Laemmli sample buffer (BioRad, trade name) and 5 μl of 2-mercaptoethanol were added and boiled for 5 minutes to obtain a sample loaded on the SDS-polyacrylamide gel. The electrophoresis conditions were in accordance with the Laemmli method (Nature, 227, 680 (1970)) (the conditions are described later). The gel after electrophoresis was stained by the CBB staining method which is a conventional method.
The results of CBB staining of the rack dye electrophoresis gel are shown in FIG. 1 (FIG. 1 left: sample not subjected to pretreatment step (1). FIG. 1 right: pretreatment step (1) including step (iv) was performed. sample). In the case of the sample not subjected to the pretreatment step (1), the band became smeared and each protein could not be detected, but in the case of the sample subjected to the pretreatment step (1) including the step (iv), the protein The band was clearly observed.
<Electrophoresis conditions>
Gel: 10-20% polyacrylamide gel (TEFCO, trade name)
Electrophoretic conditions: 200 V constant pressure, about 40 minutes Electrophoresis buffer: 10 × Tris / Glycine / SDS premix buffer (BioRad, trade name) was diluted 10 times with ultrapure water.
・ Molecular weight marker: Precision Plus Protein Standards (BioRad, trade name)
Sample load: 3 μg protein / 10 μl / well
本発明は、ラック色素中のタンパク質の分析に利用できる。 The present invention can be used for analysis of proteins in rack dyes.
Claims (8)
（１）（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階、及び
（２）前記前処理段階（１）を経た前記ラック色素試料を分析する段階
を含む分析方法。 A method for analyzing a protein in a rack dye, comprising:
(1) (i) a step of preparing a rack dye aqueous solution by dissolving a rack dye sample that may contain a protein in an aqueous solvent having a pH in the range of 9 to 10,
(Ii) adjusting the pH of the aqueous rack dye solution prepared in the step (i) within a range of less than 7.5 to 9, and (iii) adjusting the pH of the aqueous rack dye solution in the step (ii), A dextran and derivative thereof, and a cross-linked product of one or more polysaccharides selected from agarose and derivative thereof are used as a stationary phase, and a salt concentration of 5 mM or more and a pH within a range of 1.5 to 9 are used as a mobile phase. A pretreatment step of a rack dye sample, which includes a step of collecting an eluent that may contain a protein by gel filtration using an aqueous solution, and (2) the rack that has undergone the pretreatment step (1) An analysis method comprising the step of analyzing a dye sample.
（ｉｖ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、色素成分の少なくとも一部を除去する段階を含む
請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。 Before step (iii), further
(Iv) The method includes the step of subjecting the aqueous rack dye solution adjusted in pH in the step (ii) to ultrafiltration with a molecular weight cut off of 3 kD or more to remove at least a part of the dye component. 2. The analysis method according to item 1.
請求項７に記載の分析方法。 The method according to claim 7, wherein the pretreatment step (iv) is performed when the rack dye sample has a high color value.
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