JP2016217811A - 微小粒子検出装置および微小粒子検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ノイズを削除し、保存/転送されるデータ量を削減し、測定時間の短縮を図る微小粒子検出装置を提供する。【解決手段】微小粒子検出装置は、光源８からの光を微小粒子を含む検体７に照射する照射光学系１と、上記微小粒子からの蛍光または散乱光を検出する光検出光学系３と、上記照射光学系１を走査させる走査駆動部２７と、データ処理部３２とを備え、上記データ処理部３２は、上記微小粒子からの蛍光の強度を第１サンプリング間隔でサンプリングし、得られた蛍光サンプリング情報に基づいて上記微小粒子の位置情報を取得する１次測定モードと、上記微小粒子からの散乱光の強度を上記第１サンプリング間隔より小さい第２サンプリング間隔でサンプリングし、得られた散乱光サンプリング情報と上記位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する２次測定モードとを実行可能になっている。【選択図】図１

Description

この発明は、微小粒子検出装置および微小粒子検出方法に関する。

特に、医療・生物学の分野においては、細胞や細胞断片等の微小粒子を含む検出対象に関して、当該微小粒子の計数やイメージ解析等を自動的に行う幾つかの技術が知られている。その中でも、スライドガラス等の基材上に付着した細胞集団等にレーザーを照射して走査することによって、蛍光イメージや散乱光イメージや透過光イメージを取得し、細胞画像処理によって１個の細胞毎の情報を抽出する技術が注目されている。この技術は、イメージングサイトメトリーと呼ばれている。

例えば、米国特許第７２８２１８０号(特許文献１)に開示されたイメージオブジェクト装置には、標的細胞上の特徴的な細胞表面抗原や特異的なモノクローナル抗体にコロイド状常磁性粒子を結合させた上で、上記標的細胞をニッケル線間に整列させ、整列された上記標的細胞に対してレーザーを１方向にスキャンすることによって、整列された上記標的細胞の一つ一つにレーザー光を照射し、発光蛍光を光電子倍増管で測定する技術が開示されている。さらに、特許文献１では、移動ステージまたはスキャニングミラーで細胞をスキャンし、電荷結合素子(ＣＣＤ)カメラによって撮像することにより、細胞の完全イメージを形成するようにしている。

また、特表２００９‐５３７０２１号公報(特許文献２)には、蛍光顕微鏡法である特許文献１の技術に対して、ビームホモジナイザーによって均一化したレーザー光を組み合わせることによって、検出精度を向上させたレーザー照射システムが開示されている。

米国特許第７２８２１８０号 特表２００９‐５３７０２１号公報

しかしながら、上記特許文献１に開示された従来のイメージオブジェクト装置および特許文献２に開示されたレーザー照射システムにおいては、何れの場合にも以下のような問題がある。

すなわち、第１の問題点は、上記標的細胞に常磁性粒子を結合させることによって、当該標的細胞を磁気的な作用によってニッケル線間に整列させるように操作する。そして、当該標的細胞に対して、レーザーを１方向にスキャンすることを前提としている。したがって、このような整列操作機構を備えていない一般的なイメージングサイトメトリー法では、上記特許文献１および上記特許文献２に開示された技術を用いることができない点が問題としてある。

上述のような整列操作機構を備えていない一般的なイメージングサイトメトリー法の場合においては、細胞や細胞断片等の微小粒子は基材上に広範囲に分散して存在している。したがって、このように広範囲に存在する微小粒子を検出するには、レーザーによって広範囲に２次元的に走査して微小粒子を検出する必要がある。その際に、微小粒子の検出漏れを防ぎ、且つ粒子の検出情報の精度を落とさないためには、上記微小粒子が存在しない領域をも含めて全体を狭いサンプリング間隔で測定を行う必要があり、結果として測定量が極端に増大してしまう。そのために、測定時間が増大するという問題、および、測定データの保存や転送に負荷が掛かるという問題が発生する。

第２の問題点は、微小粒子から発せられる蛍光を測定することによって、微小粒子のイメージを取得する場合には、自家蛍光を測定する場合と蛍光マーカーに由来する蛍光を測定する場合とがあるが、一般的に、その何れの場合においても、蛍光は微小粒子の表面全体から均一に発せられるわけではなく、微小粒子の表面の一部分から選択的に強い蛍光が発せられる。したがって、蛍光測定においては、微小粒子の全体像としての形状や大きさを測定することが難しい点である。

そのため、微小粒子の全体像(イメージ情報)としての形状や大きさを測定する場合には蛍光測定よりも散乱光測定が適している。ところが、散乱光測定の場合には照射光と同じ波長の光の測定を行うため、測定領域中の微小粒子以外の部分からの乱反射等を完全には除去することができず、測定対象である微小粒子以外からのノイズが非常に多くなってしまうという問題がある。

また、微小粒子からの測定情報と上記ノイズとの判別が難しいことから、微小粒子の測定情報がノイズに埋もれてしまい、正確な測定が困難であるという問題がある。

そこで、この発明の課題は、不要なデータの取得を減らし、保存/転送されるデータ量を削減し、測定時間の短縮を図ると共に、微小粒子のイメージ情報を精度よく測定することができる微小粒子検出装置および微小粒子検出方法を提供することにある。

上記課題を解決するため、この発明の微小粒子検出装置は、
光源から出射された光を、微小粒子を含む検体に対して照射する照射光学系と、
上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた蛍光または散乱光を検出する光検出光学系と、
上記照射光学系を、上記検体に対して相対的に走査させる走査駆動部と、
上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの蛍光または散乱光の強度を、予め設定された設定サンプリング間隔でサンプリングし、得られたサンプリング情報に基づいて上記微小粒子の位置情報またはイメージ情報を取得するデータ処理部と
を備え、
上記データ処理部は、
上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの蛍光の強度を、予め設定された第１サンプリング間隔でサンプリングし、得られた蛍光サンプリング情報に基づいて上記微小粒子における上記検体上の位置を判定して位置情報を取得する１次測定モードと、
上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの散乱光の強度を、上記第１サンプリング間隔よりも小さく予め設定された第２サンプリング間隔でサンプリングし、得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する２次測定モードと
を実行可能になっている
ことを特徴としている。

また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記データ処理部は、上記２次測定モード時に、上記得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とを照合し、上記散乱光サンプリング情報のうち上記位置情報に合致しない位置の散乱光サンプリング情報を削除するようになっている。

また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記照射光学系における上記検体上の走査位置を検知する走査位置検知部と、
上記データ処理部によって上記２次測定モードが実行されている場合に、上記走査位置検知部で検知された照射光学系の位置と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とを照合し、上記照射光学系の位置が上記位置情報に合致する位置である場合には、上記散乱光サンプリング情報を取得する一方、合致しない位置である場合には、上記散乱光サンプリング情報を取得しないように、検出状態を制御する検出制御装置と
を備えている。

また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記照射光学系の位置が上記位置情報に合致しないと判定された場合における走査速度が、上記照射光学系の位置が上記位置情報に合致すると判定された場合における走査速度よりも速くなるように、走査速度を制御する走査速度制御部
を備えている。

また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記蛍光は、複数の波長の蛍光を含み、
上記データ処理部は、
上記１次測定モードを実行する場合には、上記蛍光の波長別に上記微小粒子の位置情報を得、この得られた全ての微小粒子の位置情報を合成し、
上記２次測定モードを実行する場合には、上記得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記合成された位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する
ようになっている。

また、この発明の微小粒子検出方法は、
走査駆動部によって、照射光学系を、微小粒子を含む検体に対して相対的に走査させ、
上記照射光学系によって、光源から出射された光を上記検体に対して照射し、
光検出光学系によって、上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた蛍光または散乱光を検出し、
データ処理部によって、上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの蛍光または散乱光の強度を、予め設定された設定サンプリング間隔でサンプリングし、得られたサンプリング情報に基づいて上記微小粒子の位置情報またはイメージ情報を取得する
微小粒子検出方法であって、
上記データ処理部による上記位置情報またはイメージ情報の取得では、
上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの蛍光の強度を、予め設定された第１サンプリング間隔でサンプリングし、得られた蛍光サンプリング情報に基づいて上記微小粒子における上記検体上の位置を判定して位置情報を取得する１次測定モードと、
上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの散乱光の強度を、上記第１サンプリング間隔よりも小さく予め設定された第２サンプリング間隔でサンプリングし、得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する２次測定モードと
を実行する
ことを特徴としている。

以上より明らかなように、この発明の微小粒子検出装置および微小粒子検出方法では、１次測定モードによって、微小粒子の位置をより正確に表している蛍光サンプリング情報に基づいて、上記微小粒子の上記検体上の位置情報を取得する。さらに、２次測定モードによって、微小粒子の形状や大きさをより正確に表している散乱光サンプリング情報を得、この得られた散乱光サンプリング情報と上記検体上の位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得するようにしている。

したがって、上記散乱光サンプリング情報に含まれている上記微小粒子以外からのノイズを、微小粒子の位置をより正確に表している上記位置情報を参照して削除することが可能になる。その結果、微小粒子の測定精度の向上を図ると共に、散乱光の検出データ量を削減して測定時間の短縮を図ることが可能になる。

すなわち、この発明によれば、不要なデータの取得を減らし、保存/転送されるデータ量を削減し、測定時間の短縮を図ると共に、微小粒子のイメージ情報を精度よく測定することができるのである。

この発明の微小粒子検出装置における概略構成を示す図である。 図１におけるディスクを上面側から見た図である。 ＸＹ方向に走査する微小粒子検出装置における斜視図である。 図３に示す微小粒子検出装置による走査軌跡を示す図である。 図１および図３とは異なる微小粒子検出装置の概略構成を示す図である。

以下、この発明を図示の実施の形態により詳細に説明する。尚、本実施の形態は、変更を加えることで代替形態をとることも可能であり、開示する特定の実施の形態にこの発明を限定する意図はない。すなわち、この発明は、特許請求の範囲によって定義される範囲に含まれる変更形態,同等物および代替形態を全て包含するものである。

・第１実施の形態
図１は、本実施の形態の微小粒子検出装置の概略構成を示す図である。この微小粒子検出装置は、検体が注入されたディスクと、ディスクを回転させる回転駆動系と、散乱光または蛍光を検出する光検出光学系と、上記検出光学系を半径方向に駆動させる駆動機構とから、概略構成されている。

図１において、１は光源装置、２は対物レンズ、３は第１検出装置、４は第２検出装置である。光源装置１と対物レンズ２と第１検出装置３と第２検出装置４は、枠体内に収納されて光学モジュール５を構成している。そして、光学モジュール５の上方には対物レンズ２に対向して円形のディスク６が配置され、ディスク６内には例えば蛍光物質によって標識された微小粒子が分布する懸濁液やゲル支持体やメンブレン等の転写支持体がサンプル(上記検体)７として封入されている。

上記サンプル７は、例えばメンブレンやスライドガラス上の液体中に微小粒子が拡散した懸濁液である。ここで、上記微小粒子としては、無機粒子、微生物、細胞、血液中の赤血球、白血球、血小板、血管内皮細胞、上記組織の微小細胞片等が含まれる。

上記光学モジュール５の光源装置１には、光源８が設けられており、光源８の光軸上には、光源８からの光を平行光化する第１レンズ９と、第１レンズ９からの光を反射する第１ダイクロイックミラー１０とを、配置している。

上記光源８としては、レーザ―やＬＥＤ(Light Emitting Diode：発光ダイオード)や白熱灯等を用いることができるが、ビームスポットを絞ることによって空間分解能が高められ、且つ単色性に優れたレーザ―を用いることが望ましい。以下、光源は、半導体レーザーであるとして説明を行う。

尚、上記半導体レーザー８,第１レンズ９および第１ダイクロイックミラー１０は、一つのケース内に収納されて上記照射光学系の一例である光源装置１を構成している。

さらに、上記第１ダイクロイックミラー１０で反射されたレーザー光の光軸上には、第１ダイクロイックミラー１０で反射された光を、対物レンズ２側に向かうように反射させるプリズム１５を配置している。また、プリズム１５によって反射された光と対物レンズ２の光軸との交差位置には、プリズム１５からの光を対物レンズ２に入射するように反射させる第２ダイクロイックミラー１６を配置している。ここで、第２ダイクロイックミラー１６は、サンプル７からの蛍光を透過する一方、散乱光を反射する。

尚、この発明で言うところの「散乱光」とは、半導体レーザー８から出射された光が、サンプル７の照射箇所から周囲に等方的に散乱された光であり、出射光と同じ波長の光である。これに対し、「蛍光」とは、半導体レーザー８から出射された光がサンプル７を照射して微小粒子を標識している蛍光物質を励起し、サンプル７の照射箇所から周囲に等方的に散乱された蛍光であり、出射光とは異なる波長の光である。

ここで、詳述はしないが、上記対物レンズ２はレンズホルダ(図示せず)に格納されており、ステッピングモータ等の駆動部(図示せず)によって光軸方向に移動されて、焦点位置を変更可能になっている。

また、図１において、上記対物レンズ２の光軸上における第２ダイクロイックミラー１６の下方には、第２ダイクロイックミラー１６側から順に、対物レンズ２によって集光されて平行光に変換されたサンプル７からの光(蛍光とは異なる波長の光)を減光するバンドパスフィルタ１７、バンドパスフィルタ１７を通過した蛍光を集光する第２レンズ１８、および、第２レンズ１８を通過した蛍光の迷光をカットする第１アパーチャ１９が配置されている。さらに、対物レンズ２の光軸上における第１アパーチャ１９の下方には、第１アパーチャ１９を通過した蛍光を検出する第１受光素子２０が配置されている。尚、第１受光素子２０としては、例えば光電子増倍管(ＰＭＴ)やフォトダイオードを用いることができる。ここで、第１アパーチャ１９と第１受光素子２０とは、一つのケース内に収納されて上記光検出光学系の一例である第１検出装置３を構成している。

上記プリズム１５と第２ダイクロイックミラー１６とを結ぶ光軸上におけるプリズム１５の図１中の左方には、プリズム１５側から順に、対物レンズ２により集光されて平行光に変換されたサンプル７からの散乱光を減光するＮＤ(減光)フィルタ２１、ＮＤフィルタ２１を通過した散乱光を集光する第３レンズ２２、および、第３レンズ２２を通過した散乱光の迷光をカットする第２アパーチャ２３が配置されている。さらに、上記第２アパーチャ２３の左方には、第２アパーチャ２３を通過した散乱光を検出する第２受光素子２４が配置されている。尚、第２受光素子２４としては、例えば光電子増倍管(ＰＭＴ)やフォトダイオードを用いることができる。ここで、第２アパーチャ２３および第２受光素子２４は、一つのケース内に収納されて上記光検出光学系の一例である第２検出装置４を構成している。

尚、上記構成においては、上記半導体レーザー８のみを搭載しているが、第１ダイクロイックミラー１０の下方にもう一つの半導体レーザーを配置することも可能である。

上記ディスク６は透明に且つ円形に構成されており、中心軸２５に固定された円形の皿状のホルダ２６に収容されて、中心軸２５に対して固定されている。中心軸２５は、上記走査駆動部の一例としてのスピンドルモータ２７で回転可能になっている。これに対し、光学モジュール５は、ディスク６が成す円板の半径方向に、上記駆動機構(走査駆動部)によって段階的に移動可能になっている。尚、光学モジュール５の上記駆動機構については特に限定するものではない。例えば、光学モジュール５の枠体を、ステッピングモータ等で上記半径方向に往復動されるタイミングベルト等により、上記半径方向に配設されたガイドレールで案内されて、移行可能に構成する。

上記ディスク６は、上述したように、円形に形成されている。そして、ディスク６が一回転する毎に、光学モジュール５は１ステップ移動するように設定するのである。但し、円板状のディスク６について、上述の動作をディスク６を連続回転させながら行うには、ディスク６に一定幅を有して半径方向に延在する帯状の非検出領域を設定し、対物レンズ２からの励起光のスポットが上記非検出領域を移動する間に光学モジュール５を１ステップ移動させる必要がある。

尚、得られた蛍光画像を解析する際に支障がなければ、ディスク６を連続回転させながら、光学モジュール５を連続的に移動させて、螺旋状に走査するようにしても構わない。

上記構成において、光検出を行う際には、上記ディスク６を回転させながら光学モジュール５をディスク６の半径方向に移動させて、サンプル７内の微小粒子からの蛍光または散乱光の検出を行う。

要は、上記ディスク６をスピンドルモータ２７等の上記回転駆動系で回転させる一方、光学モジュール５を上記駆動機構によってディスク６の半径方向に移動させることによって、ディスク６上の走査範囲を走査しながら所定のサンプリング間隔で検出強度をサンプリングして、走査範囲の散乱光強度または蛍光強度の分布を画像化するのである。

上記光学モジュール５とディスク６との相対位置を変化させるためには、光学モジュール５とディスク６との何れを移動させてもよく、移動量や位置座標はエンコーダによって検出される。

ここで、上記エンコーダは、上記ホルダ２６の外周面２６aに設けられたエンコーダリング(図示せず)と、ホルダ２６の外周面２６aに対向する位置に配置されたヘッド２８とで、構成されている。上記エンコーダリングは、ホルダ２６の外周面２６aに、周方向に一定の角度のピッチで反射面を配列して形成されている。また、ヘッド２８は、一対の発光素子と受光素子とが搭載されて構成されている。こうして、ヘッド２８からのエンコーダ信号によって中心軸２５の回転変位、つまりディスク６の回転変位が検出可能になっている。したがって、ヘッド２８からのエンコーダ信号に同期して、タンジェンシャル方向の一定角度毎に上記散乱光強度または上記蛍光強度のデータを取得することが可能になっている。

尚、上記エンコーダ信号は、上記エンコーダリングおよびヘッド２８に限らず、スピンドルモータ２７に付属するロータリエンコーダによって生成するようにしても差し支えない。

尚、本実施の形態においては、上記ディスク６上の走査を、ディスク６と光学モジュール５との夫々を個別に移動させることによって行っているが、この発明はこれに限定されるものではない。例えば、ディスク６を回転させるスピンドルモータ２７をディスク６の半径方向に移動させることによって、ディスク６の回転と半径方向への移動とを単一の駆動装置で行うことも可能である。また、ディスク６の移動方向に関しては、円周方向と半径方向とに限定されるものではなく、単に直交する直線状の２軸方向であっても差し支えない。

以下、一例として、上記散乱光を検出する散乱光検出の場合を例に挙げて説明する。

上記半導体レーザー８から出射された励起光(レーザー光)は、第１レンズ９で平行光化され、第１ダイクロイックミラー１０で反射される。次いで、プリズム１５および第２ダイクロイックミラー１６によって反射され、対物レンズ２およびディスク６を通過して、サンプル７における下面上の一点に集光される。その場合、プリズム１５の長手方向(水平方向)の長さは短く、上記長手方向に直交する方向の幅は狭くなっており、半導体レーザー８からの励起光は対物レンズ２の光軸付近(励起光透過部)のみを通過するようになっている。こうして、サンプル７中の微小粒子に集束光が照射されると、上記集束光が照射された部分から周囲に等方的に散乱された散乱光が生ずる。

上記散乱光は、上記サンプル７における上記集束光が照射された部分から周囲に等方的に出射される。そして、出射された散乱光のうちのディスク６を透過して対物レンズ２に入射した成分が、対物レンズ２を通過し、第２ダイクロイックミラー１６によって反射され、ＮＤフィルタ２１,第３レンズ２２および第２アパーチャ２３を通過して、第２受光素子２４によって検出される。そして、第２受光素子２４で検出された信号は、例えばマイクロコンピュータ等によって構成される検出情報処理装置３１に送信される。

上記検出情報処理装置３１には、データ処理部３２,バッファメモリ(一次メモリ)３３および例えばＵＳＢ(Universal Serial Bus)等で成るデータ転送部３４が含まれている。そして、上記検出信号の情報は、データ処理部３２によってＡＤ変換処理された後にバッファメモリ３３に一時的に蓄積され、ある程度情報が蓄積された段階で、データ処理部３２の制御によってデータ転送部３４を介して例えばＨＤＤ(ハードディスク)等の記録装置(二次メモリ)３５に送信され、記録装置３５によって最終的に記録される。

上記第２アパーチャ２３は、空間的な迷光をカットするために配置されている。また、共焦点アパーチャとしても機能しており、サンプル７が存在する面以外からの不必要な反射光や迷光を除去する。例えば、ディスク６の面やレンズ面で発生した反射光は対物レンズ２の焦点位置からずれているので、対物レンズ２の後段に続く光学系によって第２アパーチャ２３の位置で広がった光となり、効率よく第２アパーチャ２３を透過することができない。そのため、第２アパーチャ２３によって、不要な散乱光に起因したノイズを軽減することができるのである。

こうして、上記ディスク６を回転させながら上述のような検出を行うことによって、各測定点での散乱光強度が記録装置３５に記録される。

尚、上述の説明は、上記半導体レーザー８からのレーザー光による散乱光検出の場合を説明したが、上記蛍光を検出する蛍光検出の場合も、第２ダイクロイックミラー１６を透過した蛍光を第１検出装置３で検出する以外は、全く同様である。

また、本実施の形態においては、上記蛍光検出の場合と上記散乱光検出の場合とで光源８を共通化しており、さらに第２ダイクロイックミラー１６を用いることによって、同じ光軸で蛍光検出と散乱光検出とを同時に行うようにしている。

但し、この発明においては、この実施の形態に限定されるものではなく、上記蛍光検出と上記散乱光検出との光学系を完全に独立の構成としてもよい。尚、特に上記蛍光検出の場合には、光源８からの光は波長の単一性が高いモノクロームな光を用いることが望ましい。

以下、ノイズ情報を削除して正確な測定を可能にし、データ量を削減して測定時間の短縮を図るという、この発明の特徴について説明する。本実施の形態においては、上述の特徴を、蛍光測定によって微小粒子の位置を判定する１次測定と、１次測定で判定された微小粒子の位置において散乱光サンプリング情報を取得する２次測定とによって、２段階に分けて行う。

ここで、上記蛍光を検出する蛍光検出について、図１に従って簡単に説明する。

上記半導体レーザー８から出射された励起光(レーザー光)が、上述の散乱光の場合と同様に、第１レンズ９,第１ダイクロイックミラー１０,プリズム１５および第２ダイクロイックミラー１６を介してサンプル７における下面上の一点に集光される。サンプル７から等方的に散乱された蛍光は、第２ダイクロイックミラー１６を透過し、バンドパスフィルタ１７,第２レンズ１８および第１アパーチャ１９を通過して、第１受光素子２０によって検出される。

そして、上記第１受光素子２０で検出された信号は、上記散乱光検出の場合と同様に、検出情報処理装置３１に送信され、ＡＤ変換処理された後に一時的に蓄積され、記録装置３５に送信されて最終的に記録される。

ここで、上記１次測定および上記２次測定は、第１受光素子２０,第２受光素子２４および検出情報処理装置３１によって、実行される。

先ず、上記１次測定について説明する。

（１）低分解能測定(１次測定)
初めに、低分解能での蛍光検出を行う。この場合には、サンプル７における走査面内の微小粒子を標識している蛍光物質の分布を測定し、上記微小粒子の位置を特定する。尚、この発明において必須ではないが、図１で示す構成において、第１受光素子２０と同じ光軸上において、蛍光検出と同時に散乱光検出を行うことも可能である。

以下、上記蛍光検出時におけるスキャニングの手順について、図１および図２に従って説明する。図２は、ディスク６を上面側から見た図である。低分解能測定(１次測定)は、以下の手順で行われる。

(ｉ) 光学モジュール５の位置を、ディスク６における走査面に設定されたトラックｎの位置になるように位置決めを行う。
(ii) ディスク６の回転初期位置を、予め設定された位置まで回転移動する。
(iii) ディスク６を回転駆動して、サンプル７のトラックｎ上を１回転スキャンする。その場合におけるディスク６の回転方向は、右回転と左回転との何れでも構わない。
(iｖ) 光学モジュール５を、ディスク６の半径方向内側に向かって１トラック分だけ移動する。その場合、光学モジュール５の移動方向は半径方向外側であっても差し支えない。
(ｖ) (iii)と(iｖ)とを繰り返して、サンプル７の走査面をスキャニングする。

本低分解能測定(１次測定)においては、サンプル７の走査面から粗いピッチで蛍光を読み取る。ここで、上記「粗いピッチ」とは絶対的な数値を示しているのではなく、後述する高分解能測定(２次測定)での読み取りピッチに対する相対値であって、高分解能測定の２倍〜１０倍の読み取りピッチを意味する。尚、ここで言う「ピッチ」とは、検出データを取得する間隔を意味し、サンプリング間隔と同義である。

上記データ処理部３２で読み取られたサンプル７におけるトラック毎の蛍光の上記サンプリング情報である数値データは、バッファメモリ３３に送られて順次蓄積される。さらに、バッファメモリ３３に蓄積された数値データは、データ転送部３４を介して記録装置３５に転送されて蛍光イメージング情報として記録される。

ここで、上記データ処理部３２でのデータ処理については後に詳述する。記録装置３５に転送された蛍光イメージング情報は、光照射位置の測定結果として、リアルタイムで表示装置３６によって表示されるように構成することも可能である。

上記バッファメモリ３３と記録装置３５との間でのデータ転送速度は、一般的なデータ転送装置を介して行う場合には１０ＭＨz程度以下が望ましく、０.１ＭＨz〜２ＭＨzがより望ましい。表１に、面内測定空間におけるサンプリング間隔とレーザー走査速度とをパラメータとするデータ転送速度を示す。尚、表１においては、サンプリング間隔を０.５μm〜２μmの範囲で設定している。

表１においては、例としてデータ転送速度の限界値を１ＭＨzとした場合に、限界値１ＭＨzを超過するデータ転送速度の欄にハッチングを施して示している。したがって、例えば、サンプリング間隔を粗いサンプリング間隔２μmとした場合、データ転送速度が限界値１ＭＨzを超えない範囲内で、最大となる高速走査でのレーザー走査速度は１８８.４mm/sとなる。

本低分解能測定(１次測定)においては、粗いサンプリング間隔(２μm)と、高速のレーザー走査速度(１８８.４mm/s)との条件で、蛍光検出を行う。そして、レーザーでの走査範囲が２００mm^２程度である。以上のことから、測定時間は約１０分間程度となる。

次に、上記データ処理部３２でのデータ処理について説明する。

上述のようにして、上記低分解能測定(１次測定)が行われるに際して、データ処理部３２は、以下の手順によって微小粒子の位置の判定を行う。その場合、低分解能測定(１次測定)での測定は粗いサンプリングであるため、微小粒子の大きさや形状の測定精度は低いが、粒子位置を大まかに判定するのに支障はない。

先ず、上記第１受光素子２０によって検出された蛍光の検出データには、バンドパスフィルタ１７を透過することにより大部分のノイズが除去されているものの、サンプル７に混入している微弱な蛍光を発する有機系の微粒子(サブミクロン〜数１０μm)や、サンプル７から発せられた蛍光がサンプル７表面の凹凸に遮られて生ずる影等に起因する、微弱なノイズが含まれている。そこで、粒子位置を特定する前に、データ処理部３２によって二値化処理を行うことによって、微弱なノイズを除去する。

次に、上記バッファメモリ３３に格納された二値化された画像データに基づく画像(二値化された画像)において、微小粒子が存在する位置に対し、連続した画素に同じ番号を割り当てるラベリング処理を行う。ラベリング処理の種類としては、４連結と８連結との２種類があるが、その何れを用いてもよい。ここで、上記「４連結」とは、上記二値化された画像(図２において矩形の線で囲まれた領域)における縦方向と横方向とに連続している４個の画素に同じラベルを割り当てるラベリング処理である。また、上記「８連結」とは、画像データにおける縦,横,斜めの方向に連続している８個の画素に同じラベルを割り当てるラベリング処理である。

また、上記ラベリング処理を行う領域については、二値化した画像領域に加え、その近傍の領域を含む方が望ましく、その領域は測定条件に応じて適宜設定される。

そして、上記ラベリング処理によって同一ラベルが割り当てられた画素の連なりを一つの微小粒子と見なし、この微小粒子を構成する各画素の座標に基づいて、当該微小粒子の中心位置および大きさを求めることによって、微小粒子の位置情報が判定される。

こうして、上記データ処理部３２によって判定された微小粒子の位置情報は、上記蛍光イメージング情報に付加されてバッファメモリ３３に一旦格納された後、データ転送部３４を介して記録装置３５に送出されて記録される。尚、ここで言う上記微小粒子の位置情報とは、微小粒子が位置する点(画素)の座標、または、ある程度の面積を有する範囲の座標である。

（２）高分解能測定(２次測定)
上記サンプル７における全ての走査範囲において、上記低分解能測定による微小粒子の位置情報の判定が終了した後に、高分解能での散乱光検出を行う。

この散乱光検出では、上記半導体レーザー８から出射された励起光によってサンプル７から出射された散乱光を、上記励起光と同じ波長の光成分をフィルタで除去することなく第２受光素子２４で検出される。

上記蛍光は、微小粒子を標識している蛍光物質に由来し、微小粒子の表面全体から均一に発せられるわけではなく、微小粒子の表面の一部から選択的に強い蛍光が発せられる。したがって、蛍光検出では微小粒子の全体像としての形状や大きさを測定することが難しい。つまり、散乱光検出の方が、微小粒子の全体像としての形状や大きさを測定するには適している。

本散乱光検出においては、上記サンプル７における走査面上に分散された微小粒子に対して、上記低分解能測定によって走査した場所と同位置を、上記低分解能測定の場合よりも狭いピッチで散乱光を読み取る。読み取りピッチは、上記低分解能測定の場合の１/２〜１/１０である。その場合、サンプリング間隔を狭くする方法としては、データ処理部３２中のＡＤ変換回路(図示せず)に逓倍回路(図示せず)を組み合わせて、ＡＤ変換周期を複数分割し狭いピッチにする方法を用いることができる。

尚、本高分解能測定(２次測定)は、上記低分解能測定(１次測定)の場合と同じ以下の手順で行われる。

(ｖi) 光学モジュール５の位置を、サンプル７における走査面に設定されたトラックｎの位置になるように位置決めを行う。
(ｖii) ディスク６の回転初期位置を、予め設定された位置まで回転移動する。
(ｖiii) ディスク６を回転駆動して、サンプル７のトラックｎ上を１回転スキャンする。その場合におけるディスク６の回転方向は、右回転と左回転との何れでも構わない。
(iｘ) 光学モジュール５を、ディスク６の半径方向内側に向かって１トラック分だけ移動する。その場合、光学モジュール５の移動方向は半径方向外側であっても差し支えない。
(ｘ) (ｖiii)と(iｘ)とを繰り返して、サンプル７の走査面をスキャニングする。

上記データ処理部３２で読み取られたサンプル７におけるトラック毎の散乱光の数値データは、バッファメモリ３３に送られて順次保存される。

ここで、本実施の形態では、高分解能測定(２次測定)において、高分解能での散乱光検出のみを行うようにしているが、高分解能での散乱光検出に加えて高分解能での蛍光検出を行うようにしてもよい。その場合には、高分解能での蛍光検出結果を上記低分解能測定結果の代わりとして用いることができるため、上記低分解能測定を省略して更なる時間短縮を図ることができる。

上述のようにして、上記高分解能測定(２次測定)が行われるに際して、データ処理部３２は、以下の手順によって上記低分解能測定(１次測定)において判定された微小粒子の位置との照合を行う。

先ず、上記低分解能測定の場合と同様に、二値化処理が行われる。

上記第２受光素子２４によって検出された散乱光の検出データに対し、二値化によって閾値を設けることにより、閾値に対する輝度の大小によってノイズと微小粒子とを判別することができる。ノイズには散乱光がサンプル７表面の凹凸に遮られて生ずる影も含まれており、これらの殆どは二値化処理によってオミットされる。但し、その場合、サンプル７に混入している粉塵にはサブミクロンサイズの粒子があり、散乱光検出の場合には、二値化処理のみでは、蛍光検出による微小粒子との対応の判別が非常に困難である。

次に、上記低分解能測定において判定された微小粒子の位置との照合が行われる。

上記データ処理部３２は、上記低分解能測定において判定されて記録装置３５に記録されている微小粒子の位置情報の読み込みを行う。そして、二値化された散乱光の検出データと上記読み込まれた微小粒子の位置情報とが照合され、上記読み込まれた位置情報に合致する位置の散乱光検出データが抽出される。こうすることによって、蛍光検出による微小粒子に対応する位置情報のみを選択的に抽出し、抽出されなかった位置情報は破棄される。具体的には、蛍光検出による微小粒子の位置情報と同一の領域またはその近傍の領域に位置する検出データを残し、それ以外の領域に位置する検出データを全て破棄するのである。

尚、上記蛍光検出による微小粒子の位置情報がない領域については、その領域に位置する検出データを単に「０」とするとデータ量を削減することができない。そのため、情報がない区間の検出データ数をカウントし、カウント値を記載することによってデータ量を圧縮する。その際に、上記カウント値を２進数等で記載しておけば、データ量を圧縮できると共に、表示装置３６においても再画像化可能となる。

上述の処理によって、上記検出情報処理装置３１から記録装置３５へのデータ転送量を大幅に削減することができる。さらに、上述の処理によって、二値化処理のみではオミットされなかったノイズの情報を削除することが可能になる。

こうして、上記データ処理部３２によって、上記低分解能測定で判定された微小粒子の位置との照合が行われる。その場合、上記照合の結果残った「二値化された散乱光の検出データ」のデータ量は、微小粒子の空間占有率は一般的に１/８以下であるため、例えサンプリング間隔を４倍としても上記データ量は通常の測定の場合に比して１/２以下であり、データ転送に支障はない。

したがって、通常の測定と同じ単位時間当たりのデータ量まで許容するのであれば、レーザー走査速度を２倍まで増加させることができ、サンプリング間隔０.５μmであってもレーザー走査速度が３７６.８mm/sec以上の条件で測定することができる。

よって、上記レーザー走査速度を３７６.８mm/secとして高分解能測定を行って、５分で完了させることが可能となる。その結果、上記低分解能測定をも含めたトータルの測定時間としても１５分で測定を完了することができる。

以上のごとく、上記蛍光は、微小粒子を標識している蛍光物質に由来している。そのため、微小粒子の位置検出には蛍光検出が適している。また、第１受光素子２０によって検出される蛍光の検出データに含まれた微弱なノイズは、二値化処理を行うことによって除去できる。

これに対し、上記散乱光は、微小粒子の全体から放射されている。そのため、微小粒子の全体像としての形状や大きさの検出には散乱光検出が適している。また、第２受光素子２４によって検出される散乱光の検出データには、微小粒子以外からのノイズが含まれ、二値化処理では除去できないノイズも含まれている。

そこで、本実施の形態においては、これらのことに注目して、上記蛍光検出による微小粒子の位置検出を行う上記低分解能測定(１次測定)と、上記散乱光検出による微小粒子の形状や大きさの検出を行う上記高分解能測定(２次測定)とを併用する。そして、上記高分解能測定での散乱光検出においては、上記低分解能測定での微小粒子の位置検出結果を利用することによって、微小粒子の位置情報の近傍に存在する二値化の散乱光検出データを抽出することができ、散乱光の検出データ量を削減して測定時間の短縮を図ることができる。

また、上記低分解能測定においては、連続した画素に同じ番号を割り当てるラベリング処理を行って、微小粒子の大きさを含む位置情報を判定する。そして、上記高分解能測定によって、二値化処理を行った散乱光の検出データと、上記低分解能測定において判定された微小粒子の位置情報との照合を行って、上記位置情報に合致する検出データを抽出する。したがって、上記散乱光検出の場合においては二値化処理では除去できないノイズを除去することができ、微小粒子の正確な形状や大きさを検出することが可能になる。

また、上記低分解能測定(１次測定)においては、サンプリング間隔とレーザー走査速度とをパラメータとするデータ転送速度の表１を参照して、サンプリング間隔を粗いサンプリング間隔に設定した場合において、データ転送速度が限界値を超えない範囲内で最大となるレーザー走査速度を設定する。そして、上記設定された粗いサンプリング間隔と高速のレーザー走査速度とで蛍光検出を行うようにしている。したがって、上記低分解能測定を短時間で行うことができる。

また、上記高分解能測定(２次測定)においては、散乱光検出で検出されて二値化された検出データから微小粒子の位置情報の近傍に位置する検出データのみを抽出するので記録装置３５に転送するデータ量は少ない。そのため、レーザー走査速度をデータ転送速度の限界値を超えて設定することができ、上記高分解能測定時間の短縮化、延いては上記低分解能測定をも含めたトータルの測定時間を短縮することができる。

すなわち、本実施の形態によれば、不要なデータの取得を減らし、保存/転送されるデータ量を削減し、測定時間の短縮を図ると共に、微小粒子のイメージ情報を精度よく測定することができるのである。

・第２実施の形態
上記第１実施の形態においては、上記高分解能測定(２次測定)時に、第２受光素子２４で検出され、検出情報処理装置３１のデータ処理部３２でサンプリングされた散乱光検出データを、一旦バッファメモリ３３に蓄積した後に、データ処理部３２によって、上記低分解能測定において判定された微小粒子の位置情報と照合することによって、散乱光の検出データ量を削減するようにしている。

本実施の形態においては、上記高分解能測定(２次測定)を行うに際して、上記低分解能測定において判定された微小粒子の位置情報を参照して、上記高分解能測定のオン/オフを制御するようにする。こうすることによって、バッファメモリ３３に当初から蓄積される上記サンプリングされた散乱光検出データのデータ量を、予め削減しておくのである。

本実施の形態における微小粒子検出装置の基本構成は、上記第１実施の形態において図１に示す微小粒子検出装置と同じである。そこで、本実施の形態においては図１を用い、上記第１実施の形態の場合と同一の構成については説明を省略する。そして、以下においては、上記第１実施の形態の場合とは異なる構成について説明する。

本実施の形態においては、図１に示すように、上記高分解能測定の際に、ＡＤ変換回路,光源または受光素子等をオン/オフ制御することによって、散乱光検出のオン/オフを制御する検出制御装置３７を備えている。

そして、上記検出制御装置３７は、先ず、上記検出情報処理装置３１のデータ処理部３２から、第２受光素子２４からの検出信号に呼応して上記高分解能測定の開始が指示されると、上記低分解能測定時に判定されて記録装置３５に記録されている微小粒子の位置情報の読み込みを行う。

次に、上記高分解能測定が開始されると、ディスク６におけるトラック毎に、上記エンコーダリングとヘッド２８とでなる上記エンコーダによって検出されるディスク６の現在の回転位置と、上記読み込まれた微小粒子の位置情報に付けられている上記エンコーダによる位置座標との照合を行う。ここで、上記エンコーダは、上記走査位置検知部の一例である。

そして、上記現在の回転位置が上記読み込まれた位置座標に一致すると、データ処理部３２の上記ＡＤ変換回路,半導体レーザー８および第２受光素子２４の何れか一つに対して駆動信号を送出してオンにし、散乱光検出を実行可能にする。また、上記現在の回転位置とトラックとが上記読み込まれた位置座標に一致しなくなると、上記駆動信号を停止してオフにし、散乱光検出を停止させる。具体的には、ディスク６上における上記微小粒子の位置情報と同一の領域またはその近傍の領域に対しては散乱光検出を行い、それ以外の領域においては散乱光データの取得を行わないようにするのである。

したがって、本実施の形態によれば、上記高分解能測定時において、不要な散乱光データを取得しないので、バッファメモリ３３に蓄積するデータ量を削減することができる。その結果、バッファメモリ３３の容量を削減することができる。さらに、上記読み込まれた位置座標に一致しない領域の散乱光データは取得されていないので、上記第１実施の形態の場合に上記高分解能測定時にデータ処理部３２によって行われていた「上記読み込まれた位置情報と合致しない散乱光の検出データの破棄」は、行う必要がなくなる。したがって、データ処理部３２によるデータ処理の負荷を軽減することができるのである。

尚、図１においては、分かり易くするために、上記検出制御装置３７と、上記ＡＤ変換回路を含むデータ処理部３２,半導体レーザー８および第２受光素子２４の夫々とを、制御ラインで接続している。しかしなが、実際には、データ処理部３２,半導体レーザー８および第２受光素子２４のうちの制御対象となる何れか一つのみとを制御ラインで接続することは言うまでもない。

・第３実施の形態
上記第２実施の形態においては、上記高分解能測定(２次測定)時において、上記ディスク６における現在の回転位置が上記読み込まれた位置座標に一致する場合に散乱光検出を実行することと、一致しない場合に散乱光検出を停止することとの何れの場合も、レーザー光による走査速度を一定にしている。しかしながら、散乱光検出を停止する場合には散乱光検出データの取得を行わないので、ディスク６を高速で走査することに支障はない。

そこで、本実施の形態においては、散乱光検出を停止する場合にはレーザー光の走査速度を高速にすることによって、全体の測定時間の短縮を図るようにする。

本実施の形態における微小粒子検出装置の基本構成は、上記第２実施の形態において図１に示す微小粒子検出装置と同じである。但し、本実施の形態においては、検出制御装置３７に走査速度制御部３８を設けている。

そして、上記検出制御装置３７は、上記ＡＤ変換回路,半導体レーザー８および第２受光素子２４のうちの何れかに対する駆動信号を停止して散乱光検出を停止させる場合に、走査速度制御部３８に対して信号を送出して上記駆動信号の停止を連絡する。

そうすると、上記走査速度制御部３８は、スピンドルモータ２７に対して、回転速度を所定速度に上げることを指示する制御信号を出力する。こうして、レーザー光による走査を高速で行うことによって散乱光データの取得を行わない時間の短縮を図る。

これに対し、上記ＡＤ変換回路,半導体レーザー８および第２受光素子２４対して駆動信号を送出して散乱光検出を実行させる場合には、検出制御装置３７は、走査速度制御部３８に対して信号を送出して上記駆動信号の送出を連絡する。

そうすると、上記走査速度制御部３８は、スピンドルモータ２７に対して、回転速度を走査時の速度に戻すことを指示する制御信号を出力する。こうして、レーザー光による走査を通常速度で行うことによって散乱光データの取得を正常に行うことができる。

このように、本実施の形態によれば、上記高分解能測定における全体の測定時間を短縮することができるのである。

但し、図１に示すように、上記スピンドルモータ２７によってディスク６を回転駆動する構成においては、ディスク６の回転速度を増減する場合には、回転運動に伴う大きな慣性モーメントによって、ディスク６の加速/減速時に、回転軸に大きなトルクが発生することになる。

したがって、より適切には、図４に示すように、光学モジュール５を、互いに直交する直線状の２軸ＸＹ方向に相対的に駆動させることによって走査する駆動機構を用いることが望ましい。

図３は、一例として、Ｙ方向に上記サンプル７を移動させながら上記Ｙ方向に直交するＸ方向にスキャンする微小粒子検出装置の斜視図を示す。

図３において、１は光源装置、２は対物レンズ、３は第１検出装置、１７はバンドパスフィルタである。ここで、図３では、第２検出装置４は他の部材の後方に存在するので見えないが、存在している。光源装置１,対物レンズ２,第１検出装置３,第２検出装置４およびバンドパスフィルタ１７は、図１における光源装置１,対物レンズ２,第１検出装置３,第２検出装置４およびバンドパスフィルタ１７と全く同様である。そして、図１の場合と同様に、光源装置１と対物レンズ２と第１検出装置３と第２検出装置４とバンドパスフィルタ１７とは、枠体内に収納されて上記光学モジュール５を構成している。

また、上記バンドパスフィルタ１７は、例えば回転フォルダ４１に配置されて、蛍光の波長に応じて他の波長のフィルタと交換可能になっている。

上記光学モジュール５の上方には対物レンズ２に対向してガラスステージ４２が配置され、ガラスステージ４２上にはサンプル４３がセットされている。

ここで、上記ガラスステージ４２は矩形を成しており、長辺方向の第１走査方向と、第１走査方向に直交する短辺方向の第２走査方向との、二次元方向に走査するように構成されている。その場合における走査方法については、特に限定するものではない。要は、ガラスステージ４２を上記第１走査方向に往復動作をさせる第１動作部と、上記第２走査方向に往復動作をさせる第２動作部とを備えていれば良いのである。あるいは、光学モジュール５側を二次元方向に走査してもよい。

このように、上記光学モジュール５に対してガラスステージ４２を相対的に第１走査方向(長辺方向)とこの第１走査方向に直交する第２走査方向(短辺方向)とに交互に二次元走査した場合に、矩形のサンプル４３上には、図４に示すように、対物レンズ２によって励起光の集光点の走査軌跡が描かれる。この走査軌跡は、間隔を空けて第２走査方向(短辺方向)に往復動する複数の直線状の走査ラインと、互いに隣接する走査ラインの終点と始点とを第１走査方向(長辺方向)につなぐ接続ラインとが、連続して繰り返して構成されている。

その場合、上記第２走査方向(短辺方向)に延在する複数の走査ラインの列は、図２における上記トラックに相当する。そこで、走査ラインの列と走査位置との二次元座標系を、図２におけるトラックと回転角度(θ)との二次元座標系に置き換えることができる。

尚、上記ガラスステージ４２における直線方向への走査駆動部としては、ステッピングモータやＤＣモータによる回転移動を直線方向の移動に変換可能なリニアステージ等を使用することができる。

以上のごとく、本実施の形態においては、上記第２実施の形態における検出制御装置３７に走査速度制御部３８を設けている。そして、走査速度制御部３８によって、上記高分解能測定時において散乱光検出が停止された場合に、スピンドルモータ２７を含む上記走査駆動部に対して、走査速度を所定速度に上げることを指示する制御信号を出力するようにしている。したがって、レーザー光による走査を高速で行うことによって散乱光データの取得を行わない時間の短縮を図ることができる。

すなわち、本実施の形態によれば、上記高分解能測定における全体の測定時間を短縮することができる。

・第４実施の形態
上記第１〜第３実施の形態において上記低分解能測定(１次測定)で検出される微小粒子は、唯１種類の微小粒子である。本実施の形態においては、上記低分解能測定での蛍光検出において、複数種類の蛍光サンプリングデータを取得するものに関する。

例えば、検体に種類の異なる微小粒子Ａと微小粒子Ｂとが含まれており、それらを同時に検出する場合には、夫々の種類に応じた蛍光物質で標識してその蛍光を検出する。その場合に、上記蛍光物質の蛍光波長が異なるので微小粒子Ａと微小粒子Ｂとは異なる波長の蛍光を発するため、夫々の蛍光波長に応じた蛍光サンプリングデータを取得する必要がある。

図５は、本実施の形態における微小粒子検出装置の概略構成を示す図である。図５において、上記第１実施の形態において図１に示す微小粒子検出装置と同じ部材には同じ番号を付して、詳細な説明は省略する。

本実施の形態においては、上述したように、測定前に、１つのサンプル７に対して、複数種類の微小粒子を種類に応じた蛍光物質で標識する。そして、光学モジュール５における蛍光検出の光学系には、バンドパスフィルタ１７として複数の蛍光物質からの蛍光波長に対応した複数のバンドパスフィルタ(図３の回転フォルダ４１を参照)を備えている。さらに、上記複数のバンドパスフィルタの中から測定に使用する１つのバンドパスフィルタ１７を選択するフィルタ選択装置４５を備えている。さらに、光源装置１には、上記複数種類の蛍光物質からの蛍光波長に対応した波長の複数の半導体レーザー８,４７を、光源として備えている。さらに、それらの複数の光源の中から測定に使用する１つの光源を選択する光源選択装置４６を備えている。

上記構成において、上記低分解能測定(１次測定)において蛍光検出を行う場合には、先ず初めに、微小粒子Ａを標識している蛍光物質の蛍光波長に対応する波長の半導体レーザー８およびバンドパスフィルタ１７を光源選択装置４６およびフィルタ選択装置４５で選択する。そして、上記第１実施の形態の場合と同様にして上記低分解能測定を行って、微小粒子Ａに関する上記蛍光イメージング情報と上記位置情報とを取得する。

続いて、上記微小粒子Ｂを標識している蛍光物質の蛍光波長に対応する波長の半導体レーザー４７および上記バンドパスフィルタを光源選択装置４６およびフィルタ選択装置４５で選択する。そして、上記微小粒子Ａの場合と同様にして上記低分解能測定を行って、微小粒子Ｂに関する上記蛍光イメージング情報と上記位置情報とを取得する。

こうして、全ての種類の微小粒子に対する低分解能測定による蛍光検出および位置情報の取得が終了すると、次に、取得した全ての微小粒子の位置情報の合成処理を行う。

次に、上記高分解能測定(２次測定)における散乱光検出を、上記第１実施の形態の場合と同様にして行う。その場合における上記低分解能測定において判定された微小粒子の位置との照合は、上記合成処理された微小粒子の位置情報を用いて行う。その際に、上記第１実施の形態に記載したような上記高分解能測定方法を適用することにより、微小粒子の位置近傍以外の検出データを破棄して検出データの削減を図ることができる。

以上のごとく、本実施の形態においては、上記低分解能測定での蛍光検出時に複数種類の微小粒子からの蛍光サンプリングデータを取得する場合に、複数種類の蛍光物質からの蛍光波長に対応した複数のバンドパスフィルタおよびその中から１つを選択する上記フィルタ選択装置４５と、複数の波長の半導体レーザーおよびその中から１つを選択する上記光源選択装置４６とを備える。そして、各蛍光物質の蛍光波長に対応する波長の上記半導体レーザーおよび上記バンドパスフィルタを順次選択して上記低分解能測定を行い、各微小粒子に関する上記蛍光イメージング情報と上記位置情報とを取得する。最後に、取得した全ての微小粒子の位置情報の合成処理を行う。

そして、上記高分解能測定での散乱光検出時には、合成された位置情報に基づいて微小粒子の位置との照合を行うようにしている。

したがって、上述のように、蛍光波長の異なる蛍光物質で標識された複数種類の微小粒子等の、１回の蛍光検出では網羅的に検出できない微小粒子群に対して、高分解能測定での散乱光サンプリング情報を得ることができる。

尚、上述の説明では、複数ある微小粒子の種類を異なる波長の蛍光で識別する場合を例に挙げたが、異なる波長の蛍光での識別が必要となる状況は、これに限定されるものではない。例えば、同一種の微小粒子の個体差を識別する場合等にも適用することが可能である。要は、波長の異なる蛍光を発する微小粒子の検出であれば、適用することが可能なのである。

また、本実施の形態においては、上記第１実施の形態にフィルタ選択装置４５および光源選択装置４６を備えて、上記第１実施の形態の場合と同様にして上記低分解能測定および上記高分解能測定を行う場合を例に挙げている。しかしながら、この発明はこれに限定されるものではなく、上記第２,第３実施の形態にフィルタ選択装置４５および光源選択装置４６を備えて、上記第２,第３実施の形態の場合と同様にして上記低分解能測定および上記高分解能測定を行うようにしても一向に構わない。

以上、この発明を纏めると、この発明の微小粒子検出装置は、
光源８,４７から出射された光を、微小粒子を含む検体７に対して照射する照射光学系１と、
上記光の照射によって上記検体７中の上記微小粒子から発せられた蛍光または散乱光を検出する光検出光学系３,４と、
上記照射光学系１を、上記検体７に対して相対的に走査させる走査駆動部２７と、
上記光検出光学系３,４によって検出された上記微小粒子からの蛍光または散乱光の強度を、予め設定された設定サンプリング間隔でサンプリングし、得られたサンプリング情報に基づいて上記微小粒子の位置情報またはイメージ情報を取得するデータ処理部３２と
を備え、
上記データ処理部３２は、
上記光検出光学系３,４によって検出された上記微小粒子からの蛍光の強度を、予め設定された第１サンプリング間隔でサンプリングし、得られた蛍光サンプリング情報に基づいて上記微小粒子における上記検体７上の位置を判定して位置情報を取得する１次測定モードと、
上記光検出光学系３,４によって検出された上記微小粒子からの散乱光の強度を、上記第１サンプリング間隔よりも小さく予め設定された第２サンプリング間隔でサンプリングし、得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する２次測定モードと
を実行可能になっている
ことを特徴としている。

上記蛍光は、微小粒子を標識している蛍光物質に由来している。そのため、微小粒子の位置検出には蛍光検出が適している。これに対し、上記散乱光は、微小粒子の全体から放射されている。そのため、微小粒子の全体像としての形状や大きさの検出には散乱光検出が適している。また、散乱光の検出データには、微小粒子以外からのノイズが含まれている。

上記構成によれば、上記データ処理部３２による上記１次測定モードの実行によって、微小粒子の位置をより正確に表している蛍光サンプリング情報に基づいて、上記微小粒子の上記検体上の位置情報を取得する。さらに、上記２次測定モードの実行によって、上記微小粒子の形状や大きさをより正確に表している散乱光サンプリング情報を得、この得られた散乱光サンプリング情報と上記位置情報とに基づいて、上記微小粒子の位置イメージ情報を取得するようにしている。

したがって、上記散乱光サンプリング情報に含まれている上記微小粒子以外からのノイズを、微小粒子の位置をより正確に表している上記位置情報を参照して削除することが可能になる。その結果、微小粒子の測定精度の向上を図ると共に、散乱光の検出データ量を削減して測定時間の短縮を図ることが可能になる。

すなわち、この発明によれば、不要なデータの取得を減らし、保存/転送されるデータ量を削減し、測定時間の短縮を図ると共に、微小粒子のイメージ情報を精度よく測定することができる。

また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記データ処理部３２は、上記２次測定モード時に、上記得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とを照合し、上記散乱光サンプリング情報のうち上記位置情報に合致しない位置の散乱光サンプリング情報を削除するようになっている。

この実施の形態によれば、上記２次測定モード時に、上記得られた散乱光サンプリング情報のうち上記位置情報に合致しない位置の散乱光サンプリング情報を削除するので、上記散乱光検出の場合には二値化処理では除去できない上記微小粒子以外からのノイズを除去することができ、微小粒子の正確な形状や大きさを検出することが可能になる。

さらに、後段の記録装置３５に転送するデータ量を少なくすることができる。そのために、上記走査駆動部２７の走査速度をデータ転送速度の限界値を超えて設定することができ、上記散乱光検出時間の短縮化、延いては上記１次測定モード時の時間をも含めたトータルの測定時間を短縮することができる。

また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記照射光学系１における上記検体７上の走査位置を検知する走査位置検知部と、
上記データ処理部３２によって上記２次測定モードが実行されている場合に、上記走査位置検知部で検知された照射光学系１の位置と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とを照合し、上記照射光学系１の位置が上記位置情報に合致する位置である場合には、上記散乱光サンプリング情報を取得する一方、合致しない位置である場合には、上記散乱光サンプリング情報を取得しないように、検出状態を制御する検出制御装置３７と
を備えている。

この実施の形態によれば、上記２次測定モード時において、上記照射光学系１の走査位置が上記１次測定モードで得られた上記位置情報に合致する場合にのみ、上記散乱光サンプリング情報を取得するようにしている。したがって、不要な散乱光サンプリング情報を取得しないようにして、後段のメモリ３３に蓄積するデータ量を削減することができる。さらに、上記位置座標に一致しない位置での散乱光サンプリング情報は取得されてはいないので、後に、上記得られた散乱光サンプリング情報と上記位置座標との対比等を行う必要がなくなる。したがって、上記データ処理部３２によるデータ処理の負荷を軽減することができる。

また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記照射光学系１の位置が上記位置情報に合致しないと判定された場合における走査速度が、上記照射光学系１の位置が上記位置情報に合致すると判定された場合における走査速度よりも速くなるように、走査速度を制御する走査速度制御部３８
を備えている。

この実施の形態によれば、上記２次測定モード時において、上記照射光学系１の位置が上記位置情報に合致しないと判定された場合に、上記照射光学系１の走査速度を、上記照射光学系１の位置が上記位置情報に合致すると判定された場合より速い走査速度になるようにしている。したがって、上記散乱光サンプリング情報の取得を行わない時間の短縮を図ることができる。すなわち、上記２次測定モード時における全体の測定時間を短縮することができる。

尚、上記散乱光サンプリング情報の取得を行わない場合には、上記検体７を高速で走査しても一向に支障はない。

また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記蛍光は、複数の波長の蛍光を含み、
上記データ処理部３２は、
上記１次測定モードを実行する場合には、上記蛍光の波長別に上記微小粒子の位置情報を得、この得られた全ての微小粒子の位置情報を合成し、
上記２次測定モードを実行する場合には、上記得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記合成された位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する
ようになっている。

この実施の形態によれば、上記１次測定モード時において、上記蛍光の波長別に得られた上記微小粒子の位置情報の全てを合成し、上記２次測定モード時には、上記得られた散乱光サンプリング情報と上記合成された位置情報とに基づいて、処理を行うようにしている。

したがって、波長の異なる蛍光物質で標識された複数種類の微小粒子等の、１回の蛍光検出では網羅的に検出できない粒子群に対しても、上記２次測定モードによって上記散乱光サンプリング情報を得ることができる。

また、この発明の微小粒子検出方法は、
走査駆動部２７によって、照射光学系１を、微小粒子を含む検体７に対して相対的に走査させ、
上記照射光学系１によって、光源８,４７から出射された光を上記検体７に対して照射し、
光検出光学系３,４によって、上記光の照射によって上記検体７中の上記微小粒子から発せられた蛍光または散乱光を検出し、
データ処理部３２によって、上記光検出光学系３,４によって検出された上記微小粒子からの蛍光または散乱光の強度を、予め設定された設定サンプリング間隔でサンプリングし、得られたサンプリング情報に基づいて上記微小粒子の位置情報またはイメージ情報を取得する
微小粒子検出方法であって、
上記データ処理３２による上記位置情報またはイメージ情報の取得では、
上記光検出光学系３,４によって検出された上記微小粒子からの蛍光の強度を、予め設定された第１サンプリング間隔でサンプリングし、得られた蛍光サンプリング情報に基づいて上記微小粒子における上記検体７上の位置を判定して位置情報を取得する１次測定モードと、
上記光検出光学系３,４によって検出された上記微小粒子からの散乱光の強度を、上記第１サンプリング間隔よりも小さく予め設定された第２サンプリング間隔でサンプリングし、得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する２次測定モードと
を実行する
ことを特徴としている。

上記構成によれば、上記散乱光サンプリング情報に含まれている上記微小粒子以外からのノイズを、微小粒子の位置をより正確に表している上記位置情報を参照して削除することが可能になる。その結果、微小粒子の測定精度の向上を図ると共に、散乱光の検出データ量を削減して測定時間の短縮を図ることが可能になる。

すなわち、この発明によれば、不要なデータの取得を減らし、保存/転送されるデータ量を削減し、測定時間の短縮を図ると共に、微小粒子のイメージ情報を精度よく測定することができる。

１…光源装置
２…対物レンズ
３,４…検出装置
５…光学モジュール
６…ディスク
７,４３…サンプル
８,４７…半導体レーザー
９,１８,２２…レンズ
１０,１６…ダイクロイックミラー
１５…プリズム
１７…バンドパスフィルタ
１９,２３…アパーチャ
２０,２４…受光素子
２１…ＮＤフィルタ
２６…ホルダ
２６a…ホルダの外周面
２７…スピンドルモータ
２８…ヘッド
３１…検出情報処理装置
３２…データ処理部
３３…バッファメモリ
３４…データ転送部
３５…記録装置
３６…表示装置
３７…検出制御装置
３８…走査速度制御部
４１…回転フォルダ
４２…ガラスステージ
４５…フィルタ選択装置
４６…光源選択装置

Claims (6)

1. 光源から出射された光を、微小粒子を含む検体に対して照射する照射光学系と、
   上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた蛍光または散乱光を検出する光検出光学系と、
   上記照射光学系を、上記検体に対して相対的に走査させる走査駆動部と、
   上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの蛍光または散乱光の強度を、予め設定された設定サンプリング間隔でサンプリングし、得られたサンプリング情報に基づいて上記微小粒子の位置情報またはイメージ情報を取得するデータ処理部と
   を備え、
   上記データ処理部は、
   上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの蛍光の強度を、予め設定された第１サンプリング間隔でサンプリングし、得られた蛍光サンプリング情報に基づいて上記微小粒子における上記検体上の位置を判定して位置情報を取得する１次測定モードと、
   上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの散乱光の強度を、上記第１サンプリング間隔よりも小さく予め設定された第２サンプリング間隔でサンプリングし、得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する２次測定モードと
   を実行可能になっている
   ことを特徴とする微小粒子検出装置。
2. 請求項１に記載の微小粒子検出装置において、
   上記データ処理部は、上記２次測定モード時に、上記得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とを照合し、上記散乱光サンプリング情報のうち上記位置情報に合致しない位置の散乱光サンプリング情報を削除するようになっている
   ことを特徴とする微小粒子検出装置。
3. 請求項１に記載の微小粒子検出装置において、
   上記照射光学系における上記検体上の走査位置を検知する走査位置検知部と、
   上記データ処理部によって上記２次測定モードが実行されている場合に、上記走査位置検知部で検知された照射光学系の位置と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とを照合し、上記照射光学系の位置が上記位置情報に合致する位置である場合には、上記散乱光サンプリング情報を取得する一方、合致しない位置である場合には、上記散乱光サンプリング情報を取得しないように、検出状態を制御する検出制御装置と
   を備えたことを特徴とする微小粒子検出装置。
4. 請求項３に記載の微小粒子検出装置において、
   上記照射光学系の位置が上記位置情報に合致しないと判定された場合における走査速度が、上記照射光学系の位置が上記位置情報に合致すると判定された場合における走査速度よりも速くなるように、走査速度を制御する走査速度制御部
   を備えたことを特徴とする微小粒子検出装置。
5. 請求項１から請求項４までの何れか一つに記載の微小粒子検出装置において、
   上記蛍光は、複数の波長の蛍光を含み、
   上記データ処理部は、
   上記１次測定モードを実行する場合には、上記蛍光の波長別に上記微小粒子の位置情報を得、この得られた全ての微小粒子の位置情報を合成し、
   上記２次測定モードを実行する場合には、上記得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記合成された位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する
   ようになっている
   ことを特徴とする微小粒子検出装置。
6. 走査駆動部によって、照射光学系を、微小粒子を含む検体に対して相対的に走査させ、
   上記照射光学系によって、光源から出射された光を上記検体に対して照射し、
   光検出光学系によって、上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた蛍光または散乱光を検出し、
   データ処理部によって、上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの蛍光または散乱光の強度を、予め設定された設定サンプリング間隔でサンプリングし、得られたサンプリング情報に基づいて上記微小粒子の位置情報またはイメージ情報を取得する
   微小粒子検出方法であって、
   上記データ処理部による上記位置情報またはイメージ情報の取得では、
   上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの蛍光の強度を、予め設定された第１サンプリング間隔でサンプリングし、得られた蛍光サンプリング情報に基づいて上記微小粒子における上記検体上の位置を判定して位置情報を取得する１次測定モードと、
   上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの散乱光の強度を、上記第１サンプリング間隔よりも小さく予め設定された第２サンプリング間隔でサンプリングし、得られた散乱光サンプリング情報と上記１次測定モードで得られた上記位置情報とに基づいて、上記微小粒子のイメージ情報を取得する２次測定モードと
   を実行する
   ことを特徴とする微小粒子検出方法。

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