JP2016188761A - Method and kit for detecting onset of diabetic nephropathy or onset risk - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法と、その検出キットに関する。 The present invention relates to a method for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy and a detection kit thereof.
近年、多くの国で糖尿病患者数が年々急増している。糖尿病腎症から腎不全となって透析導入となる患者が増加傾向にあり、透析導入の原因疾患の中で45％と第一位を占めている。透析療法の導入は、糖尿病患者のQOLを著しく低下させるばかりでなく、生命予後も不良となる。
糖尿病の国内患者は710万人、潜在的には推計2210万人であり、患者の90％以上を占める2型糖尿病がインスリン分泌低下及びインスリン抵抗性が合併して発症する多因子性疾患である。
糖尿病腎症の治療においては、腎機能障害の軽度の段階で治療を開始しなければ、腎機能不全が治療の有無に関わらず進行するが、自覚症状が全くないために治療可能な時期を逸することが多い。糖尿病腎症の診断には、尿検査が重要であるが、一般的な尿検査でタンパク尿が出た時には腎機能障害が既に進行していて完治することは不可能である。
In recent years, the number of diabetic patients is increasing rapidly year by year in many countries. The number of patients with diabetic nephropathy and renal failure leading to dialysis is increasing, accounting for 45% of the disease causing dialysis. The introduction of dialysis therapy not only significantly reduces the quality of life of diabetics, but also worsens the prognosis.
There are 7.1 million diabetic patients in Japan, potentially an estimated 22.1 million, and
In the treatment of diabetic nephropathy, if the treatment is not started at a mild stage of renal dysfunction, renal dysfunction progresses regardless of the presence or absence of treatment. Often to do. Although urinalysis is important for the diagnosis of diabetic nephropathy, renal dysfunction has already progressed and cannot be completely cured when proteinuria appears in a general urinalysis.
糖尿病性腎症は、糖尿病によって腎臓の糸球体が細小血管障害のため硬化して減少していく病気であり、次の第１期〜第５期に分類される。
第1期（腎症前期）：糸球体濾過量が増加する。第2期（早期腎症）：微量のアルブミンが尿に漏れ出す。第3期（顕性腎症）：持続的にタンパク尿になる。
第4期（腎不全期）：糸球体濾過量が減少し、血清クレアチニンが増加する。第5期（透析療法期）。
Diabetic nephropathy is a disease in which the glomeruli of the kidney are cured and decreased due to microangiopathy due to diabetes, and is classified into the following first to fifth stages.
Phase 1 (early nephropathy): Glomerular filtration rate increases. Stage 2 (early nephropathy): Trace amounts of albumin leak into the urine. Stage 3 (apparent nephropathy): Continuous proteinuria.
Stage 4 (renal failure stage): Glomerular filtration rate decreases and serum creatinine increases. 5th phase (dialysis therapy phase).
最近、尿中の微量アルブミンを測定して、初期腎症を診断する検査が行われるようになったが、現時点では糖尿病腎症による腎不全を減少させるまでは至っていない。
微量アルブミン尿は、動脈硬化性疾患との関連性が指摘されていて、糖尿病腎症の特異的なマーカーであるかは明らかではない（非特許文献１）。また、抗体非反応性アルブミン・酸化型アルブミン・質量の異なるアルブミンの存在が明らかとなり、免疫学的測定法にて把握しきれない尿中アルブミンの質的な変化が問題になりつつある。
微量アルブミン以外の尿マーカーとしては、IV型コラーゲンが既に臨床の現場で使われ出しているが、腎症の早期診断マーカーとしての意義は未だ十分には確立していない。
Recently, a test for diagnosing early nephropathy by measuring microalbumin in urine has been performed, but at present, it has not yet been reduced to renal failure due to diabetic nephropathy.
It has been pointed out that microalbuminuria is associated with arteriosclerotic disease, and it is not clear whether it is a specific marker for diabetic nephropathy (Non-patent Document 1). In addition, the presence of antibody non-reactive albumin, oxidized albumin, and albumin having different masses has been clarified, and qualitative changes in urinary albumin that cannot be grasped by immunoassay are becoming a problem.
As a urine marker other than microalbumin, type IV collagen has already been used in clinical practice, but its significance as an early diagnostic marker for nephropathy has not yet been fully established.
近年、質量分析計等の分析機器の進歩によって、生体試料のような多種類のタンパク質の混合物であるサンプルから微量タンパク質を検出して同定することが可能となった。このプロテオーム解析の技術を用いて様々な疾患の患者から採取した血清、組織等の臨床検体を試料として、その中に含まれるタンパク質を網羅的に同定することによって、疾患の病態の変動、治療に対する反応などの指標となるバイオマーカーの探索が盛んに行われている。
しかし、血液（血清または血漿）や尿タンパク質のプロテオーム解析では、タンパク質濃度のダイナミックレンジが広いことや高濃度タンパク質の存在が解析の障害となる。また、質量分析装置は、存在量の多いタンパク質から優先的に測定するという特徴を有するため、尿プロテオーム解析ではアルブミン、IgGなどをはじめとする多量タンパク質が多く同定されてしまう傾向にある。実際、CE-MSを用いた尿中ペプチドマーカーを探索した報告では、273ものペプチドバイオマーカーのうち74%がコラーゲン断片であることが報告されている（非特許文献２）。
In recent years, advances in analytical instruments such as mass spectrometers have made it possible to detect and identify trace proteins from samples that are a mixture of many types of proteins such as biological samples. Using this proteome analysis technique, we collect clinical samples such as sera and tissues collected from patients with various diseases as samples, and comprehensively identify the proteins contained in them, thereby responding to changes in disease pathology and treatment. Searches for biomarkers that serve as indicators such as reactions have been actively conducted.
However, in the proteome analysis of blood (serum or plasma) and urine protein, the wide dynamic range of protein concentration and the presence of high concentration protein are obstacles to analysis. In addition, since the mass spectrometer is characterized by preferential measurement from abundant proteins, urinary proteome analysis tends to identify a large amount of proteins such as albumin and IgG. In fact, in a report that searches for peptide markers in urine using CE-MS, 74% of 273 peptide biomarkers are reported to be collagen fragments (Non-patent Document 2).
そのため、ショットガンプロテオミクスによるバイオマーカー探索アプローチでは、機能性タンパク質に多く見られるng/mLオーダー以下の低濃度で存在する新規関連タンパク質を同定することは困難であり、二次元電気泳動 (非特許文献３、４）とSELDI-TOF
(非特許文献５)を用いた少数のタンパク質の検出・同定しか行われていない。
For this reason, it is difficult to identify novel related proteins that exist at low concentrations of ng / mL or less, which are often found in functional proteins, using the biomarker search approach by shotgun proteomics. 3, 4) and SELDI-TOF
Only a small number of proteins are detected and identified using (Non-patent Document 5).
糖尿病腎症に関連する従来技術には、特許文献１〜５もあるが、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する有用な手段は得られていない。 Although there exist patent documents 1-5 in the prior art relevant to diabetic nephropathy, the useful means of detecting the onset or onset risk of diabetic nephropathy is not obtained.
そこで、本発明は、糖尿病腎症の発症または発症リスクの指標となる低濃度の尿タンパク質を同定し、糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法及びそのキットを提供することを課題とする。 Therefore, an object of the present invention is to identify a low-concentration urine protein that serves as an index of the onset or onset risk of diabetic nephropathy, and to provide a method for detecting the onset or onset risk of diabetic nephropathy and a kit thereof.
本発明の糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法は、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有することを特徴とする。
The method for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy of the present invention uses a sample containing urine of a subject, afamin, alpha-1-
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid glycoprotein 1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用である。
Among the above proteins, afamin, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, alpha-1-antitrypsin, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, WAP four-disulfide
本発明の糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出するキットは、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備えることを特徴とする。
The kit for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy according to the present invention uses a sample containing urine of a subject, afamin, alpha-1-
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid glycoprotein 1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用である。
Among the above proteins, afamin, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, alpha-1-antitrypsin, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, WAP four-disulfide
ここで、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの染色剤を具備させてもよい。
Where afamin, alpha-1-
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの生物活性を測定する試薬を具備させてもよい。
afamin, alpha-1-
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を具備させてもよい。
afamin, alpha-1-
本発明によると、糖尿病腎症の発症または発症リスクが早期に容易に検出されるので、その予防や治療に寄与する。 According to the present invention, since the onset or risk of developing diabetic nephropathy is easily detected at an early stage, it contributes to the prevention and treatment thereof.
以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、先行技術文献や従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. The design of the embodiment can be changed as appropriate by using prior art documents and conventionally known techniques.
本発明者は、健常者、２型糖尿病患者、糖尿病腎症患者より採取した尿検体を用いて、糖尿病腎症のバイオマーカータンパク質を同定し評価を行った。
これにより、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知することによって、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出することが可能になった。
The present inventor has identified and evaluated a biomarker protein for diabetic nephropathy using urine samples collected from healthy subjects,
By using a sample containing urine of a subject, afamin, alpha-1-
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid glycoprotein 1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用であった。
Among the above proteins, afamin, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, alpha-1-antitrypsin, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, WAP four-disulfide
上記タンパク質の認識及び定量には、該当タンパク質そのものでもよいが、該当タンパク質を認識する固有の部分タンパク質やポリペプチドなどでもよい。 For the recognition and quantification of the protein, the protein itself may be used, or a specific partial protein or polypeptide that recognizes the protein may be used.
なお、ポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含み得る。ポリペプチドを検出するために抗体を作製する場合に、ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸や、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。その修飾には、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化などが挙げられる。 The polypeptide is a polypeptide in which two or more amino acids are linked by a peptide bond, and may include a relatively short chain peptide or oligopeptide to a long chain protein. When an antibody is produced to detect a polypeptide, the polypeptide may contain amino acids other than 20 kinds of genetically encoded amino acids or modified amino acids. The modifications include acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, biotinylation, covalent bonding with lipids and lipid derivatives, and cross-linking at the main chain, amino acid side chain, amino terminus, and carboxyl terminus of the peptide bond. Examples include formation, disulfide bond, addition of sugar chain, addition of GPI anchor, phosphorylation and prenylation.
ポリペプチドは、上記の遺伝子産物におけるアミノ酸置換の他に、ポリペプチドを認識する抗体の抗原として機能する限り、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、付加されたものであってもよい。抗体が認識するエピトープ以外の部位に、このような変異が含まれていてもよい。
このようなポリペプチドは、化学合成によって直接ペプチドを調製する方法の他に、これらをコードするポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発法などにより作製し、適当な系で発現させることによって調製することも可能である。
In addition to the amino acid substitution in the above gene product, the polypeptide may have one, several amino acids deleted, substituted, or added as long as it functions as an antigen of an antibody that recognizes the polypeptide. . Such a mutation may be contained in a site other than the epitope recognized by the antibody.
In addition to the method of directly preparing peptides by chemical synthesis, such a polypeptide should be prepared by producing a polynucleotide encoding them by site-directed mutagenesis and expressing it in an appropriate system. Is also possible.
ポリペプチドの検知は、例えば、本発明の抗体を用いたＥＩＡやＥＬＩＳＡなどの免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサーなどペプチドのアミノ酸配列分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳやＥＳＩ
Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法などの質量分析によって検出することができる。
The detection of the polypeptide includes, for example, a method using an immunological specific reaction such as EIA or ELISA using the antibody of the present invention, a peptide amino acid sequence analysis method such as a gas phase sequencer using Edman method, MALDI-TOF / MS and ESI
It can detect by mass spectrometry, such as Q-TOF / MS method.
本発明の検出キットは、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid glycoprotein 1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備えることを特徴とし、その検知手段としては、該当タンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの染色剤を具備するか、生物活性を測定する試薬を具備するか、抗体を具備するものが有用に利用できる。
尿による試料は、尿量等によって尿中のタンパク質濃度が影響を受けやすいから、その影響を低減するために、例えば尿中クレアチニン濃度を検知し補正することが好ましい。
The detection kit of the present invention uses a sample containing urine of a subject, afamin, alpha-1-
Since the sample of urine is easily affected by the protein concentration in urine depending on the amount of urine or the like, it is preferable to detect and correct the urinary creatinine concentration, for example, to reduce the influence.
上記タンパク質、その部分タンパク質、ポリペプチドの合成には、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。
その方法では、例えばタンパク質またはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくは公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
遊離型のものとして得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で塩に変換することができ、またそれらは塩として得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で遊離型のものまたは他の塩に変換することができる。塩としては、生理的に許容されるものまたは医薬として許容されるものが好ましいが、これらに限定されない。その塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。また、アンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエチルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
For the synthesis of the protein, its partial protein, and polypeptide, for example, a chemical synthesis method such as a liquid phase synthesis method or a solid phase synthesis method can be used.
In this method, for example, a resin for protein or peptide synthesis is used, and an appropriately protected amino acid is sequentially bonded to a desired amino acid sequence on the resin by various known condensation methods. For the condensation reaction, various known activating reagents are preferably used. As such reagents, for example, carbodiimides such as dicyclohexylcarbodiimide can be preferably used. When the product has a protecting group, the desired product can be obtained by removing the protecting group as appropriate.
When it is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method similar thereto, and when it is obtained as a salt, it can be converted by a known method or a method equivalent thereto. It can be converted to the free form or other salts. The salt is preferably physiologically acceptable or pharmaceutically acceptable, but is not limited thereto. Examples of the salt include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, such as acetic acid, formic acid, maleic acid, fumaric acid, succinic acid, citric acid, tartaric acid, malic acid, benzoic acid. And salts with organic acids such as acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and benzenesulfonic acid. Further, ammonium salts such as salts with organic bases such as ethylamine, dimethylamine, trimethylamine, and hydroxyethylamine are also included.
抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
なお、抗体としては、上記タンパク質及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、F(ab')2 , Fab' 及びFab といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはエピトープ結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えばクワドローム、トリオームなどの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾または加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合またはハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成または半合成技術を使用して得られた抗体、DNA組換え技術を用いて調製される抗体、標的抗原物質または標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体または結合特性を有する抗体を包含してもよい。
The antibody can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
The antibody may be a single monoclonal antibody against the protein and related peptide fragments or an antibody composition having specificity for various epitopes, and may be a monovalent antibody or a multivalent antibody, a polyclonal antibody, and a monoclonal antibody. And also represents naturally occurring molecules and fragments and derivatives thereof, including fragments such as F (ab ') 2, Fab' and Fab, and having at least two antigen or epitope binding sites Chimeric or hybrid antibodies, or bispecific recombinant antibodies such as quadromes and triomes, interspecific hybrid antibodies, anti-idiotypic antibodies, and those chemically modified or processed and considered as derivatives thereof Known cell fusion or hybridoma technology and antibody engineering Antibodies obtained using synthetic or semi-synthetic techniques, antibodies prepared using DNA recombination techniques, antibodies that have neutralizing properties with respect to target antigenic substances or epitopes, or binding properties An antibody having
好ましくは抗体は、天然型の上記タンパク質を特異的に識別できるものである。
ポリクローナル抗体として得るためには、免疫源である上記タンパク質またはそのフラグメント、配列の一部のペプチドを、哺乳動物、鳥類などに免疫し、その哺乳動物、鳥類などから抗血清を採取し、その抗血清に含まれるポリクローナル抗体を使用することができる。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなど、さらに、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、サルなどの霊長類、ニワトリなどの鳥類等が使用される。さらに、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、動物から採血した血液から調製することができる。
Preferably, the antibody is capable of specifically identifying the natural protein.
In order to obtain a polyclonal antibody, the above-mentioned protein that is an immunogen or a fragment thereof, a peptide having a part of the sequence is immunized to mammals, birds, etc., and antiserum is collected from the mammals, birds, etc. Polyclonal antibodies contained in serum can be used. Mammals immunized with a sensitizing antigen are generally rodent animals such as mice, rats, hamsters, and rabbits, sheep, goats, cows, horses, pigs, dogs, monkeys, etc. Birds such as primates and chickens are used. Furthermore, it may be preferable to select in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
In order to immunize an animal with a sensitizing antigen, a known method is performed. For example, the sensitizing antigen is injected by intraperitoneal or subcutaneous injection in a mammal or the like. In addition, an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen. The antiserum containing the polyclonal antibody can be prepared from blood collected from an animal after raising the immunized animal for a predetermined period.
モノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる公知の方法を用いて産生される。
個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なったエピトープに対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常のポリクローナル抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないかまたは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、または軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、またはヘテロジーニアスなタンパク質と融合させたりして得ることができる。
モノクローナル抗体を製造する方法の例には、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法
、トリオーマ法、EBV-ハイブリドーマ法などが挙げられる。
Monoclonal antibodies are produced using known methods that can provide for the production of antibody molecules by a series of cell lines in culture.
Individual monoclonal antibodies are those that contain a population of antibodies that are identical except that only a small amount of naturally occurring variants may be present. Monoclonal antibodies have a high specificity, which is directed against sites with a single antigenicity. In contrast to conventional polyclonal antibody preparations typically containing different antibodies directed against different epitopes, each monoclonal antibody is directed against a single antigenic determinant on that antigen. It is what. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are also superior in that they are synthesized by hybridoma culture and are free from or less contaminated with other immunoglobulins. Monoclonal antibodies include hybrid antibodies and recombinant antibodies. As long as they exhibit the desired biological activity, regardless of their origin, type of immunoglobulin class or subclass, variable region domains can be replaced with constant region domains, light chains can be replaced with heavy chains, Can be obtained by replacing it with a chain of another species or by fusing it with a heterogeneous protein.
Examples of a method for producing a monoclonal antibody include a hybridoma method, a human B cell hybridoma method, a trioma method, and an EBV-hybridoma method.
モノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されるかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるキメラ抗体（免疫グロブリン) を包含する。 Monoclonal antibodies are identical or homologous to the corresponding sequence of an antibody in which a portion of the heavy and / or light chain is derived from a particular species or belongs to a particular antibody class or subclass as long as they exhibit the desired biological activity. However, the remainder of the chain includes chimeric antibodies (immunoglobulins) that are the same or homologous to the corresponding sequences of antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass.
また、哺乳動物由来のハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものを挙げることができる。
抗体を産生するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して作製できる。すなわち、上記タンパク質またはそのフラグメントを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
上記タンパク質またはそのフラグメントの調製方法及び哺乳動物に対する免疫方法等に関しては、上述したポリクローナル抗体を含む抗血清を調製する手法に準じて行うことができる。この場合、特に、哺乳動物に対して免疫した後、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
Examples thereof include those produced by mammal-derived hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
Monoclonal antibody-producing hybridomas that produce antibodies can be prepared using cell fusion technology using myeloma cells. That is, using the protein or fragment thereof as a sensitizing antigen, immunizing it according to a normal immunization method, and fusing the obtained immune cells with a known parent cell by a normal cell fusion method, a normal screening method Can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells.
The method for preparing the protein or fragment thereof, the method for immunizing mammals, and the like can be performed in accordance with the above-described technique for preparing antisera containing polyclonal antibodies. In this case, in particular, after immunization against mammals, immune cells are collected from mammals that have been confirmed to increase the desired antibody level in the serum and subjected to cell fusion. Preferred immune cells include In particular, spleen cells.
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、哺乳動物のミエローマ細胞を利用できる。免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合などは、基本的には公知の方法、例えば、ケラー及びミルステイン方法等に準じて行うことができる。
モノクローナル抗体は例えば、次のような工程で作製できる。(1) 免疫原性抗原の調製、(2) 免疫原性抗原による動物の免疫、(3) ミエローマ細胞の調製、(4) 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合、(5)ハイブリドーマの選択及びモノクローン化、(6) モノクローナル抗体の製造。
Mammalian myeloma cells can be used as the other parent cell to be fused with the immune cells. Cell fusion between immune cells and myeloma cells can basically be performed according to known methods such as the Keller and Milstein methods.
For example, the monoclonal antibody can be prepared by the following steps. (1) Preparation of immunogenic antigens, (2) Immunization of animals with immunogenic antigens, (3) Preparation of myeloma cells, (4) Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells, (5) Selection of hybridomas And (6) production of monoclonal antibodies.
また、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明による免疫原ポリペプチド産物に対する抗体を発現するのに用いることができる。
また、こうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの公知の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたDNAは、発現ベクターに入れ、CHO, COSなどの宿主細胞に入れることができる。DNA は、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ネコの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である。所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。
また、抗体は、縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。さらに、トリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2といった抗体フラグメントにして使用してもよい。
Also, transgenic mice or other organisms, such as other mammals, can be used to express antibodies against the immunogenic polypeptide product according to the present invention.
It is also possible to determine the sequence of the antibody thus obtained in large quantities, or to produce an antibody by a gene recombination technique using a nucleic acid sequence encoding the antibody obtained from a hybridoma strain. A nucleic acid encoding a monoclonal antibody can be isolated and sequenced by a known technique such as using an oligonucleotide probe that can specifically bind to a gene encoding the heavy chain or light chain of a mouse antibody. Once isolated, the DNA can be put into an expression vector and put into a host cell such as CHO or COS. The DNA can be modified, for example, by substituting a sequence encoding a feline heavy chain or light chain constant region domain in place of the homogeneous mouse sequence. Chimeric antibodies and hybrid antibodies having the desired binding specificity can also be prepared.
The antibody can also be modified by applying a chemical protein synthesis technique including the use of a condensing agent to prepare a chimeric antibody or a hybrid antibody. Further, it may be used in the form of antibody fragments such as Fab, Fab ′, and F (ab ′) 2 obtained by treatment with an enzyme such as trypsin, papain, pepsin and optionally reduction.
抗体は、公知の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、免疫沈降検定に使用することができる。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、公知の方法を使用することができ、標識物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ-D- ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質または放射性同位元素などがある。
The antibodies can be used in known assays, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, immunoprecipitation assays.
In order to conjugate each antibody to a detectable atomic group, a known method can be used. As an antibody to give a label, an IgG fraction, or a specific product obtained by reduction after pepsin digestion is used. The connecting portion Fab ′ can be used. Examples of labels in these cases include enzymes (such as peroxidase, alkaline phosphatase or β-D-galactosidase), chemical substances, fluorescent substances or radioisotopes.
本発明での検知・測定は、免疫染色、例えば組織または細胞染色、免疫電子顕微鏡、免疫クロマトクグラフィー、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができる。好ましくは、放射免疫測定法(RIA), FIA, LIA, EIA, ELISA などを用いることができる。
例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明の上記タンパク質ポリペプチドに対する抗体または上記タンパク質の関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方を上記タンパク質のC末端側残基に対する抗体とし、一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわちポリペプチド抗原の量と比例する。このアッセイは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワードサンドイッチ型アッセイまたは逆サンドイッチ型アッセイなどと分類される。
Detection and measurement in the present invention can be performed by immunostaining such as tissue or cell staining, immunoelectron microscopy, immunochromatography, immunoassay such as competitive immunoassay or non-competitive immunoassay. Preferably, radioimmunoassay (RIA), FIA, LIA, EIA, ELISA, etc. can be used.
For example, in a sandwich type assay, one is an antibody against the protein polypeptide of the present invention or an antibody against a related peptide fragment of the protein, the other is an antibody against the C-terminal residue of the protein, and one is detectably labeled. . Other antibodies capable of recognizing the same antigen are immobilized on the solid phase. Incubation treatment is performed to sequentially react the sample, labeled antibody, and solid-phased antibody as necessary. After separating unbound antibody, the labeled product is measured. The amount of label measured is proportional to the amount of antigen, ie polypeptide antigen. This assay is classified as an insolubilized antibody, a simultaneous sandwich assay, a forward sandwich assay, or a reverse sandwich assay, depending on the order of addition of labeled antibodies.
本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識した抗血清、精製抗体またはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることも同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、標識した抗血清、精製抗体またはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
免疫学的測定法の際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製またはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子または試験管などの種々の材料及び形態を任意に選択し、使用することができる。
According to the measurement method of the present invention, a labeled antibody reagent such as an antiserum, a purified antibody or a monoclonal antibody labeled with an enzyme or the like to be measured, and an antibody bound to a carrier are allowed to react sequentially. You can also. The order in which reagents are added depends on the type of carrier system selected. When using beads such as sensitized plastics, place labeled antibody reagent, such as labeled antiserum, purified antibody or monoclonal antibody, together with the specimen sample containing the substance to be measured, together in the appropriate test tube. The measurement can then be performed by adding beads such as sensitized plastic.
As the solid phase carrier in the immunological measurement method, various materials such as polystyrene, polycarbonate, polypropylene or polyvinyl balls, microplates, sticks, fine particles or test tubes that adsorb proteins such as antibodies well, and Any form can be selected and used.
測定には、至適pH、例えばpH約４〜約９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０〜約６０℃の間の温度で行うことが好ましい。酵素などで標識された抗血清、精製抗体、またはモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合させられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりも早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相または固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。
測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように処置することができる。
The measurement can be performed in a suitable buffer system so as to maintain an optimum pH, for example, a pH of about 4 to about 9. Particularly suitable buffers include, for example, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, Tris buffer, triethanolamine buffer, borate buffer, glycine buffer, carbonate buffer, Tris-HCl. A buffering agent, a veronal buffering agent, etc. are mentioned. The buffering agents can be mixed and used at any ratio. The antigen-antibody reaction is preferably performed at a temperature between about 0 to about 60 ° C. Incubation treatment of an antibody reagent such as an antiserum labeled with an enzyme or the like, a purified antibody, or a monoclonal antibody and an antibody reagent bound to a carrier, or a substance to be measured can be performed until equilibrium is reached. Separation of the solid and liquid phases at a point earlier than the equilibrium of the antigen-antibody reaction is achieved and the reaction can be stopped after a limited incubation process, such as enzymes in either the liquid phase or the solid phase The degree of presence of the sign can be measured.
The measurement operation can be performed using an automated measuring device, and a luminescence detector, a photo detector or the like is used to detect and measure a display signal generated by converting a substrate by the action of an enzyme. You can also. In the antigen-antibody reaction, the reagent used, the substance to be measured, and the label such as an enzyme can be stabilized or the antigen-antibody reaction itself can be stabilized.
非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、または測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。非特異的結合反応を防ぐための公知のブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清や血清タンパク質、アルブミン、ヘモグロビン、オボアルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。
試料や固相などの洗浄には、緩衝液系や食塩液から適宜適当な液を選択でき、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤の他、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤などを添加して使用できる。
Proteins, stabilizers, surfactants, chelating agents, etc. can also be added to the incubation solution to eliminate non-specific reactions, reduce inhibitory effects, or activate measurement reactions. it can. Known blocking treatment to prevent non-specific binding reaction may be performed, for example, treatment with normal serum or serum protein such as mammals, albumin, hemoglobin, ovalbumin, skim milk, fermented milk, collagen, gelatin, etc. can do.
For washing samples and solid phases, an appropriate solution can be selected from buffer systems and saline solutions. In addition to nonionic surfactants and amphoteric surfactants, cationic surfactants and anions It can be used after adding a surfactant.
キットの基本構成としては、例えば、湿潤状態で物質の移動を可能にする担体に、(a) 検体を適用する部位、(b) 標識抗体を含有した部位、(c) 抗原検出部位、(d) 反応終了判定部位を順次形成してあるものから成る。(i) 標識抗体を含有した部位には、湿潤状態において該担体上を抗原検出部位、反応終了判定部位へと順次移動し得る、上記タンパク質に対する標識した抗体を含有させ、(ii) 検出部位には、固相化したコーキシンに対する抗体を存在させるようにし、(iii)
反応終了判定部位には、標識抗体として使用した抗体に対する第二抗体 を固相化した部位を形成して、検体を適用する部位に検体を適用することにより、検体を担体において移動させ、標識抗体を溶出させ、抗原検出部位の固相化抗体及び反応終了判定部位の第二抗体部位を通過させることにより、検体中の上記タンパク質を検出する。
The basic configuration of the kit includes, for example, (a) a site to which a specimen is applied, (b) a site containing a labeled antibody, (c) an antigen detection site, (d ) Consists of sequentially forming reaction end determination sites. (i) The site containing the labeled antibody contains a labeled antibody against the protein that can move sequentially to the antigen detection site and the reaction end determination site on the carrier in a wet state, and (ii) the detection site In the presence of an antibody against the immobilized cauxin, and (iii)
A site where the second antibody against the antibody used as the labeled antibody is solid-phased is formed at the reaction end determination site, and the sample is moved to the carrier by applying the sample to the site to which the sample is applied. And the protein in the sample is detected by passing the immobilized antibody at the antigen detection site and the second antibody site at the reaction end determination site.
更に、上記タンパク質またはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として具備させてもよい。
ハイブリダイゼーションする核酸としては、例えばプローブ及びプライマーなどが挙げられる。上記タンパク質遺伝子またはその産物とハイブリダイゼーションするプローブであれば、その目的に合致するかぎり制限なく利用できる。
Furthermore, a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid encoding the protein or a constituent domain thereof may be provided as an active ingredient.
Examples of nucleic acids that hybridize include probes and primers. Any probe that hybridizes to the protein gene or its product can be used without limitation as long as it meets the purpose.
本発明者は既に、尿タンパク質の限外濾過による濃縮と尿中アルブミン等の多量タンパク質除去を組み合わせた前処理を行ったサンプルを蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)及び質量分析機で分析すると、2000種前後のタンパク質を比較解析することが可能となる系を確立していた。
この解析系を用いて、現時点で早期腎症として診断可能な微量アルブミン尿を有する病期2期より早い段階の尿中タンパク質を多角的な視野から網羅的に解析することによって、微量アルブミン量より有用な糖尿病腎症の早期マーカーを探索した。
The present inventor has already carried out fluorescence-labeled two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mass spectrometry analysis on a sample that has been pretreated by combining urinary protein concentration by ultrafiltration and removal of a large amount of protein such as urinary albumin. As a result, a system that enables comparative analysis of around 2000 proteins has been established.
By using this analysis system, we can comprehensively analyze urinary proteins at a stage earlier than
図１は、解析に用いた2型糖尿病患者及び健常者対照群の臨床像を示す表である。
健常者(H)8名、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)16名、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)16名から随時尿を採取した。微量アルブミン尿の判定は尿アルブミン／クレアチニン比20mg/g Crを閾値として判定した。採取した尿を限外ろ過にて濃縮し、Albumin and IgG Removal Kit(GE)にてアルブミン、IgGを除去後のサンプルをCyDyeにてラベルし、尿タンパク質プロファイルを2D-DIGE法にて解析した。
FIG. 1 is a table showing clinical features of
Urine was collected at any time from 8 healthy subjects (H), 16 patients with
ゲルイメージの解析はDeCyderにより行い、各群間で有意に変化したスポットを切り出した。切り出したスポットからトリプシン消化後にペプチドを抽出しエレクトロスプレーイオン源を装備したLCQ-DECA XP Plus(Thermo Electron)にてLC-MS/MS解析を行った。得られたMS/MSスペクトルデータをMASCOTにてデータベース検索し、タンパク質を同定した。 Analysis of the gel image was performed by DeCyder, and spots that changed significantly between the groups were cut out. Peptides were extracted from the excised spots after trypsin digestion, and LC-MS / MS analysis was performed with LCQ-DECA XP Plus (Thermo Electron) equipped with an electrospray ion source. The obtained MS / MS spectrum data was searched in a database with MASCOT to identify proteins.
2D-DIGE解析とは独立した患者群（H 14名、T2DM 13名、DN2 15名、糖尿病腎症病期3期(DN3)患者 16名）から採取した尿検体58サンプルを用い、2D-DIGE解析にて同定されたタンパク質を対象にMRM法にて定量解析を行った。
MRM transitionの設定は、2D-DIGE解析にて得られたMSデータに基づきMRM Pilotソフトウェアにて行った。標的ペプチド配列が設定MRM transitionにより同定されているかの確認はenhanced product ion(EPI)-MS/MSにより行った。EPI-MS/MSにて標的ペプチド配列が同定できない場合には合成ペプチドを用いたLC-MRMを行い、分析用試料とMRM取得ピーク、溶出時間が一致することを確認した。
2D-DIGE analysis was performed using 58 urine samples collected from a patient group independent of 2D-DIGE analysis (14 H patients, 13 T2DM patients, 15 DN2 patients, 16 patients with
MRM transition was set using MRM Pilot software based on MS data obtained by 2D-DIGE analysis. Confirmation of whether the target peptide sequence was identified by the set MRM transition was performed by enhanced product ion (EPI) -MS / MS. When the target peptide sequence could not be identified by EPI-MS / MS, LC-MRM using a synthetic peptide was performed, and it was confirmed that the sample for analysis coincided with the MRM acquisition peak and elution time.
尿検体はAlbumin and IgG Removal Kitにてアルブミン、IgGを除去し、タンパク質変性、システイン残基の還元アルキル化後にトリプシンにて酵素消化した。酵素消化産物に内部標準ペプチドとして安定同位体元素標識ペプチド10 fmolを添加した。MRM解析は、nanoLCを接続した5500QTrap（ABSciex）システムにて行った。MRM測定により得られた各ペプチドのシグナル面積値を内部標準物質より得られたペプチドのシグナル面積値で補正し、相対タンパク質濃度を算出した。 Urine specimens were albumin and IgG removed with Albumin and IgG Removal Kit, protein denatured, and reductive alkylation of cysteine residues, followed by enzymatic digestion with trypsin. As an internal standard peptide, 10 fmol of stable isotope labeled peptide was added to the enzyme digestion product. MRM analysis was performed with a 5500QTrap (ABSciex) system connected to nanoLC. The signal area value of each peptide obtained by MRM measurement was corrected with the signal area value of the peptide obtained from the internal standard substance, and the relative protein concentration was calculated.
各測定値は平均値±標準偏差で示した。多群間の有意差検定はKruskal-Wallis検定にて行い、p＜0.05を有意とした。重回帰分析、ロジスティック回帰分析、receiver-operating characteristic（ROC）解析はIBM SPSS statistics 20ソフトウェアにて行った。
Each measured value was expressed as an average value ± standard deviation. The significant difference test between multiple groups was performed by Kruskal-Wallis test, and p <0.05 was considered significant. Multiple regression analysis, logistic regression analysis, and receiver-operating characteristic (ROC) analysis were performed with
図２は、DN2群にてH群と比較して増加した尿タンパク質スポットを示す写真であり、図３は、DN2群にてH群と比較して減少した尿タンパク質スポットを示す写真である。
糖尿病腎症患者由来尿タンパクを解析するにあたり、尿の限外濾過にて濃縮後に高含有量タンパク質の除去を行う前処理を行った後に、2D-DIGE法にてディファレンシャル解析を行うとゲル当たり約2000種のタンパク質スポットを検出することが可能となった。この系を用いて、T2DM 16名、DN2 16名、H 8名からの尿検体から尿タンパクを精製し、2D-DIGE法にて解析した。
FIG. 2 is a photograph showing an increased urine protein spot in the DN2 group as compared with the H group, and FIG. 3 is a photograph showing a decreased urine protein spot in the DN2 group as compared with the H group.
When analyzing urinary protein derived from diabetic nephropathy patients, pretreatment to remove high content protein after concentration by ultrafiltration of urine and then differential analysis by 2D-DIGE method will result in about 2000 kinds of protein spots can be detected. Using this system, urine proteins were purified from urine samples from
図４は、H群と比べてDN2群にて有意に増加した尿タンパク質を示す表であり、図５は、H群と比べてDN2群にて有意に減少した尿タンパク質を示す表であり、図６は、T2DM群と比べてDN2群にて有意に変動した尿タンパク質を示す表であり、図７は、H群と比べてT2DM群にて有意に変動した尿タンパク質を示す表である。
2D-DIGEの結果では、DN2群にてH群由来尿と比較して有意に変動するタンパク質スポットを増加227個、減少85個を認めた。DN2群由来尿とT2DM群由来尿の比較では、有意に増加するタンパク質スポットは93個、減少は30個であった。また、T2DM群由来尿とH群由来尿の比較では、有意に増加するタンパク質スポットは58個、減少は9個であった。
これらの有意に変動したタンパク質スポットをゲル内消化後にLC-MS/MSにて解析した結果、HとT2DM,HとDN2,T2DMとDN2の比較にて有意に発現上昇するタンパク質が24種、有意に発現減少するタンパク質が8種同定された。
FIG. 4 is a table showing urine proteins significantly increased in the DN2 group compared to the H group, and FIG. 5 is a table showing urine proteins significantly decreased in the DN2 group compared to the H group. FIG. 6 is a table showing urine proteins that significantly changed in the DN2 group compared to the T2DM group, and FIG. 7 is a table that shows urine proteins that significantly changed in the T2DM group compared to the H group.
As a result of 2D-DIGE, an increase of 227 protein spots and a decrease of 85 protein spots were observed in DN2 group, which significantly changed compared with urine derived from H group. In comparison between urine from DN2 group and urine from T2DM group, 93 protein spots increased significantly and 30 decreased. In comparison between urine from the T2DM group and urine from the H group, there were 58 protein spots that significantly increased and 9 protein spots that decreased.
These significantly altered protein spots were analyzed by LC-MS / MS after in-gel digestion. As a result, 24 types of proteins that significantly increased the expression of H and T2DM, H and DN2, and T2DM and DN2 were significantly compared. Eight proteins with decreased expression were identified.
2D-DIGE解析にて発現変動を示すタンパク質を対象に独立した糖尿病腎症患者由来の尿検体を用いて発現変動の検証を行った。
2D-DIGE解析にて得られたMSデータに基づきMRM transitionを選抜した結果、32タンパク質中30タンパク質(発現上昇タンパク質:23, 発現減少タンパク質:7)がMRM定量解析可能であった。H 17名、T2DM 13名、DN2 15名の尿検体を用いて相対定量解析を行った結果、25タンパク質がH,T2DM,DN2群間で有意な発現変動を示した。
このうち2D-DIGE解析と同様の発現変動が検証されたタンパク質は19種(発現上昇タンパク質:14, 発現減少タンパク質:5)であった。発現上昇タンパク質は、afamin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin-III、ceruloplasmin、complement C4、glutamyl aminopeptidase、haptoglobin、leucine-rich alpha-2-glycoprotein、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、plasma alpha-L-fucosidase、serotransferrin、throxine-binding globulin、zinc-alpha-2-glycoproteinであり、発現減少タンパク質は、calbindin、deoxyribonuclease-1、kininogen-1、pancreatic alpha-amylase、polymeric immunoglobulin receptorであった。
The expression fluctuation was verified using a urine sample derived from an independent diabetic nephropathy patient for a protein showing expression fluctuation in 2D-DIGE analysis.
As a result of selecting MRM transition based on MS data obtained by 2D-DIGE analysis, 30 out of 32 proteins (expression increased protein: 23, expression decreased protein: 7) could be quantitatively analyzed by MRM. As a result of relative quantitative analysis using urine samples from 17 H, 13 T2DM, and 15 DN2, 25 proteins showed significant expression fluctuations between the H, T2DM, and DN2 groups.
Among these, 19 proteins (expression increased protein: 14, expression decreased protein: 5) were verified for expression variation similar to 2D-DIGE analysis. Expression-enhanced proteins are afamin, alpha-1-antitrypsin, alpha-1B-glycoprotein, antithrombin-III, ceruloplasmin, complement C4, glutaamyl aminopeptidase, haptoglobin, leucine-rich alpha-2-glycoprotein, N-acetylglucosamine-6-sulfatase, Plasma alpha-L-fucosidase, serotransferrin, throxine-binding globulin, zinc-alpha-2-glycoprotein, and decreased expression proteins were calbindin, deoxyribonuclease-1, kininogen-1, pancreatic alpha-amylase, polymeric immunoglobulin receptor .
糖尿病腎症の早期尿中関連因子を絞り込む目的で、DN3患者16名における30タンパク質の尿中タンパク質濃度を追加測定し先のデータと併せて重回帰分析を行った。
その結果、尿中アルブミン・クレアチニン比にafamin(β:0.443,p＜0.001)、antithrombin III（β:0.286,p＜0.001)、ceruloplasmin(β:0.224,p＝0.002)の3タンパク質が関連することが示された。
In order to narrow down early urinary related factors of diabetic nephropathy, we additionally measured the urinary protein concentration of 30 proteins in 16 DN3 patients and performed multiple regression analysis with the previous data.
As a result, the urinary albumin / creatinine ratio is related to three proteins: afamin (β: 0.443, p <0.001), antithrombin III (β: 0.286, p <0.001), and ceruloplasmin (β: 0.224, p = 0.002). It has been shown.
これら3タンパク質に、性別、糖尿病罹病期間、BMI、収縮期血圧、トリグリセリド、空腹時血糖、HbA1c、eGFRを説明変数とした多重ロジスティック回帰分析を行った。
その結果、早期腎症以降への進展に及ぼす因子としてeGFR(オッズ比:0.968; 95% CI:0.941-0.995; p＝0.019)、afamin (オッズ比:2.808, 95% CI:1.223-6.447, p＝0.015)が選択された。
早期腎症以降への進展を基準評価としたROC解析では、afamin,antithrombin III,ceruloplasminのROC曲線下面積(AUC)はそれぞれ0.940,0.836,0.903であり、いずれのタンパク質もeGFR(AUC:0.745)に比べて高い診断能を示した。
These three proteins were subjected to multiple logistic regression analysis with gender, diabetes duration, BMI, systolic blood pressure, triglycerides, fasting blood glucose, HbA1c, and eGFR as explanatory variables.
As a result, eGFR (odds ratio: 0.968; 95% CI: 0.941-0.995; p = 0.019) and afamin (odds ratio: 2.808, 95% CI: 1.223-6.447, p = 0.015) was selected.
In the ROC analysis based on the progression to early nephropathy, the area under the ROC curve (AUC) of afamin, antithrombin III, and ceruloplasmin is 0.940, 0.836, and 0.903, respectively, and both proteins are eGFR (AUC: 0.745) High diagnostic ability compared to.
図８は、DN2及びDN3患者群とH及びT2DM群との間における３タンパク質のカットオフ値に対する感度、特異度、ROC曲線下面積を示す表である。
afamin, antithrombin III, ceruloplasminのそれぞれのカットオフ値に対する感度、特異度は、eGFRのカットオフ値を76.8とした場合の感度、特異度に比べていずれも高値を示した。
そのため、尿中アルブミン・クレアチニン比に関連するこの３タンパク質は、早期腎症以降への進展をeGFRよりも高い精度で判別したので、糖尿病腎症の発症及び進展をより早期に検出する診断及び予測マーカーとして使用可能である。
FIG. 8 is a table showing the sensitivity, specificity, and area under the ROC curve for the cut-off values of the 3 proteins between the DN2 and DN3 patient groups and the H and T2DM groups.
The sensitivity and specificity for the cutoff values of afamin, antithrombin III, and ceruloplasmin were all higher than the sensitivity and specificity when the eGFR cutoff value was 76.8.
Therefore, these three proteins related to the urinary albumin / creatinine ratio discriminate the progress after early nephropathy with higher accuracy than eGFR, so diagnosis and prediction for early detection of the onset and progress of diabetic nephropathy It can be used as a marker.
本発明者は、非標識定量法を用いた定量プロテオミクスにより尿中関連タンパク質の同定を行った。
非標識定量法を用いた定量プロテオミクスは、測定したサンプルのLC-MSデータをretention time, m/z, シグナル強度の3次元に集約し比較解析する方法であり、多検体の比較解析に有用な方法である。この方法では、比較サンプル群間で有意な変動を示すピークを拾い出し、拾い出したピークに標的を絞ってタンパク質同定を行うため、網羅的なショットガンプロテオミクス法では同定されにくいタンパク質を優先的に同定することが可能となる。
The present inventor identified urinary related proteins by quantitative proteomics using an unlabeled quantitative method.
Quantitative proteomics using unlabeled quantification is a method for collecting and analyzing LC-MS data of measured samples in three dimensions: retention time, m / z, and signal intensity, and is useful for comparative analysis of multiple samples. Is the method. In this method, peaks that show significant fluctuations between comparison sample groups are picked up, and protein identification is performed by focusing on the picked-up peaks. Therefore, proteins that are difficult to identify by the comprehensive shotgun proteomics method are given priority. It becomes possible to identify.
2型糖尿病患者、顕性タンパク尿を呈する糖尿病腎症患者から採取した尿検体を用いて非標識定量プロテオミクス解析を行い、両群間で発現変動を示すタンパク質群を同定した。独立した集団にて発現変動が検証されたタンパク質を対象に尿中アルブミン・クレアチニン比と関連するタンパク質を解析した結果、これまでに2型糖尿病や糖尿病腎症との関連が報告されていないタンパク質1種を含む6タンパク質の同定に成功した。
Unlabeled quantitative proteomic analysis was performed using urine specimens collected from
図９は、解析に用いた2型糖尿病患者及び健常者対照群の臨床像を示す表である。
微量アルブミン尿を呈していない2型糖尿病患者(T2DM, 男性4名、女性2名)、腎症病期3期の糖尿病腎症患者(DN3, 男性4名、女性2名)から採取した随時尿を探索用検体とした。検証用検体として、T2DM群（男性9名、女性10名）、DN3群（男性10名、女性5名）に加え、腎症病期2期の糖尿病腎症患者（DN2, 男性10名、女性10名）から採取した随時尿を解析対象とした。また、男性15名、女性9名より随時尿を採取し、検証用検体における健常者対照群（H）とした。
FIG. 9 is a table showing clinical features of
Urinary urine collected from
患者より採取した随時尿検体は、3000×g、10分、4℃で遠心分離を行い、不純物を取り除いたのち速やかに凍結し解析に用いるまで-80℃にて保管した。各群の検体は、3 kDa cut offのAmicon Ultrafreeの限外ろ過で脱塩と濃縮を行った後にAlbmin&IgG Drpletion SpinTrap (GE Healthcare) にて尿中多量タンパク質を除去した。再び、3 kDa cut offのAmicon Ultrafreeの限外ろ過で脱塩と濃縮を行い乾固した後に12 mM sodium deoxycholate(SDC)/12 mM sodium N-lauroylarcosinate(SLS)にて溶解し、95℃5分の変性、ならびに37℃にてLys-C、トリプシンによる酵素消化を行った。さらにDTTを加え37℃、1時間、ヨードアセトアミドで暗室1時間反応させ還元アルキル化を行った。界面活性剤の除去はPhase Transfer Surfactant法（非特許文献６）にて行い、Mono Spin C18(GE Healthcare)にて精製後、得られたペプチドをLC-MS解析用サンプルとした。 The occasional urine sample collected from the patient was centrifuged at 3000 × g for 10 minutes at 4 ° C., and after removing impurities, it was frozen immediately and stored at −80 ° C. until used for analysis. Samples in each group were desalted and concentrated by 3 kDa cut off Amicon Ultrafree ultrafiltration, and then a large amount of protein in urine was removed with an Albamin & IgG Drpletion SpinTrap (GE Healthcare). Again, after desalting and concentration with 3 kDa cut off Amicon Ultrafree ultrafiltration, it was dried and dissolved with 12 mM sodium deoxycholate (SDC) / 12 mM sodium N-lauroylarcosinate (SLS), 95 ° C for 5 minutes And enzymatic digestion with Lys-C and trypsin at 37 ° C. Furthermore, DTT was added, and reductive alkylation was carried out by reacting with iodoacetamide in a dark room for 1 hour at 37 ° C. The surfactant was removed by the Phase Transfer Surfactant method (Non-Patent Document 6), and after purification by Mono Spin C18 (GE Healthcare), the obtained peptide was used as a sample for LC-MS analysis.
断片化された尿ペプチドサンプルの測定は、QSTAR Elite system（Applied Biosystems）にPAL/Paradigm LC system（ARM）を接続した装置を用いた。カラムは0.3×5mm L-trap column と0.1×150mm L-column（財団法人化学物質評価研究機構）を用いて、流速300nL/min、A溶媒（2% CAN and0.1%FA）、B溶媒（90% CAN and 0.1%FA）で175min間（グラジエント5−30% B,20min);30−95% B,1 min;95% B,3min;95−5% B,1min;5% B,10min）測定を行った。
質量分析器のピーク検出と正規化、定量化は2DICALソフトウェア（三井情報株式会社）を用いた。ピークのターゲットは、保持時間（RT）10-100min、ピークの最大強度30以上、P値0.05未満のピークを選出した。選出されたピークはT2DM群とDN3群で強度比に差のあるピークを目視により選別しLC-MS/MS測定を行った。
The fragmented urine peptide sample was measured using a device in which a PAL / Paradigm LC system (ARM) was connected to a QSTAR Elite system (Applied Biosystems). The column is 0.3 x 5mm L-trap column and 0.1 x 150mm L-column (Chemicals Evaluation and Research Institute), flow rate 300nL / min, A solvent (2% CAN and 0.1% FA), B solvent ( 90% CAN and 0.1% FA) for 175 min (gradient 5-30% B, 20 min); 30-95% B, 1 min; 95% B, 3 min; 95-5% B, 1 min; 5% B, 10 min ) Measurement was performed.
For mass spectrometer peak detection, normalization, and quantification, 2DICAL software (Mitsui Information Co., Ltd.) was used. As the peak target, a peak having a retention time (RT) of 10 to 100 min, a peak maximum intensity of 30 or more, and a P value of less than 0.05 was selected. The selected peaks were subjected to LC-MS / MS measurement by visually selecting the peaks having a difference in intensity ratio between the T2DM group and the DN3 group.
タンパク質の同定に当たっては、2DICALのピーク情報をもとにm/zとRTをinclude listに設定しLC-MS/SM測定を行った。得られたターゲットピーク情報からSwissProtデータベースとMascotソフトウェア（Matrix science）を用いてタンパク質同定を行い、2DICAL上のピークに対応させた。Mascotソフトウェアの検索パラメーターには、MS の許容誤差0.1Da、MS/MSの許容誤差0.1Da、固定修飾carbamidomethyl (C)、可変修飾acetyl (N-term)、deamidated (NQ)、oxidation (M)、価数2+, 3+, 4+を用いた。T2DM群とDN3群の発現差異を認めるピークの選定には、（１）DN3群のピーク定量値がT2DM群のピーク定量値に対して3倍以上または3分の1以下、（２）RATIO P値＜0.05、（３）Mann-Whitney U検定によるP値＜0.05、（４）Mascot Score≧20の指標を用いた。
For protein identification, m-z and RT were set in the include list based on 2DICAL peak information, and LC-MS / SM measurement was performed. Protein identification was performed from the obtained target peak information using the SwissProt database and Mascot software (Matrix science), and was made to correspond to the peak on 2DICAL. Mascot software search parameters include MS tolerance 0.1 Da, MS / MS tolerance 0.1 Da, fixed modified carbaidomethyl (C), variable modified acetyl (N-term), deamidated (NQ), oxidation (M),
H群、T2DM群、DN2群、DN3群から構成される尿検体78サンプルを用いて、非標識定量解析にて同定された発現変動タンパク質群の検証を行った。
バイオマーカー候補タンパク質群の相対タンパク質濃度はMRM法により算出した。MRM transitionには、Mascotデータからペプチドの親イオンのm/zをQ1とし、フラグメントイオンのm/zをQ3とし設定した。また、Enhanced Product Ion（EPI）-MS/MSにてタンパク質の同定を行い、設定したMRM transitionにより標的ペプチド配列が同定されることを確認した。
Using the urine specimen 78 samples composed of the H group, the T2DM group, the DN2 group, and the DN3 group, the expression variable protein group identified by the unlabeled quantitative analysis was verified.
The relative protein concentration of the biomarker candidate protein group was calculated by the MRM method. In the MRM transition, from the Mascot data, the m / z of the peptide parent ion was set to Q1, and the m / z of the fragment ion was set to Q3. In addition, the protein was identified by Enhanced Product Ion (EPI) -MS / MS, and it was confirmed that the target peptide sequence was identified by the set MRM transition.
なお、EPI-MS/MSにて同定できないペプチド配列に関しては、合成ペプチドを用い分析用試料と同時測定してMRM取得ピーク、溶出時間が一致することを確認した。尿検体の酵素消化産物に内部標準ペプチドとして安定同位体元素標識ペプチド30fmolを加え、分析用試料としてMRM測定を行った。MRM定量解析は、4000QTrap（ABSciex）にLC800 HPLC system （ジーエルサイエンス）を接続したシステムを用いて行った。カラムはACQUITY UPLC BET C18 カラム（Waters）を用いて流速100nl/min, 0%-30% Bで90分直線濃度勾配にて溶出した。Multiquant Software 2.0（AB Sciex）にてMRM測定により得られた各ペプチドのシグナル面積値を内部標準物質より得られたペプチドのシグナル面積値で補正し、相対タンパク質濃度を算出した。 For peptide sequences that could not be identified by EPI-MS / MS, it was confirmed that the MRM acquisition peak and elution time coincided with each other using a synthetic peptide and simultaneously measured with an analytical sample. A stable isotope-labeled peptide (30 fmol) was added as an internal standard peptide to the enzyme digestion product of a urine sample, and MRM measurement was performed as an analysis sample. MRM quantitative analysis was performed using a system in which an LC800 HPLC system (GL Science) was connected to 4000QTrap (ABSciex). The column was eluted with an ACQUITY UPLC BET C18 column (Waters) at a flow rate of 100 nl / min, 0% -30% B for 90 minutes with a linear concentration gradient. The signal area value of each peptide obtained by MRM measurement with Multiquant Software 2.0 (AB Sciex) was corrected with the signal area value of the peptide obtained from the internal standard substance, and the relative protein concentration was calculated.
各測定値は平均値±標準偏差で示した。2群間の有意差検定はMann-Whitney U testにて、多群間の有意差についてはKruskal-Wallis検定にて行い、p＜0.05を有意とした。重回帰分析、receiver-operating characteristic（ROC）解析はIBM SPSS statistics 20ソフトウェアにて行った。
Each measured value was expressed as an average value ± standard deviation. The significant difference test between two groups was performed by Mann-Whitney U test, and the significant difference between multiple groups was determined by Kruskal-Wallis test, and p <0.05 was regarded as significant. Multiple regression analysis and receiver-operating characteristic (ROC) analysis were performed with
図１０は、MSピークの2次元ゲル画像であり、図１１は、図１０の２次元ゲル画像におけるID=512, 424のピークについて、T2DM群とDN3群でのシグナル強度を示すグラフである。
T2DM群及びDN3群の各6名ずつの検体から尿中タンパク質を精製しプロテアーゼ消化を行った。2DICALを用いた解析により合計3,334ピークが得られ、そのうち保持時間（RT）10-100min、ピークの最大強度30以上、P値0.05未満のピークは234であった。その全てのMSピークの2次元ゲル画像が図１０である。m/zをX軸、RTをY軸とし、最大強度30以上あった234ピークを赤色で強調した。選出された234ピークのなかで、DN1群とDN3群で強度比に有意な差のある107ピークを、図１１に示すように目視により選別した。
FIG. 10 is a two-dimensional gel image of the MS peak, and FIG. 11 is a graph showing signal intensities in the T2DM group and DN3 group with respect to the peaks of ID = 512, 424 in the two-dimensional gel image of FIG.
Urinary protein was purified from 6 samples each of T2DM group and DN3 group and digested with protease. Analysis using 2DICAL gave a total of 3,334 peaks, of which 234 were retention time (RT) 10-100 min,
図１２は、T2DM群に比べてDN3群にて有意な発現変動を示した尿タンパク質の表である。
その107ピークのLC-MS/MS測定により、T2DM群に対してDN3群で3倍以上、または3分の1以下の有意な発現変動を示すタンパク質が30種類同定された。
FIG. 12 is a table of urine proteins that showed significant expression fluctuations in the DN3 group compared to the T2DM group.
LC-MS / MS measurement of the 107 peaks identified 30 proteins that showed significant expression fluctuations of 3 times or more or 1/3 or less in the DN3 group compared to the T2DM group.
図１３は、検証用検体の臨床情報を示す表である。
図１４は、MRM法を用いて尿中相対タンパク質濃度を測定した25種類のタンパク質の表である。
2DICALにて選出された30種類のタンパク質のなかで、メチオニンの酸化もしくは、miss cleavageの存在が推定された5種類のタンパク質を除く25種類のタンパク質(発現上昇タンパク質：20、発現減少タンパク質：5)について、一斉分析が可能な定量解析法であるMRM法を用いて尿中相対タンパク質濃度を測定した。
FIG. 13 is a table showing clinical information of the sample for verification.
FIG. 14 is a table of 25 types of proteins whose relative protein concentrations in urine were measured using the MRM method.
Among the 30 proteins selected by 2DICAL, 25 proteins (excluded protein: 20; decreased expression protein: 5) except for 5 proteins that were estimated to be oxidized or miss cleavage of methionine The relative protein concentration in urine was measured using the MRM method, which is a quantitative analysis method capable of simultaneous analysis.
MRM法のtransition設定は以下に従って行った。すなわち、Mascotデータからペプチドの親イオンのm/zをQ1とし、フラグメントイオンのm/zをQ3の値とした111組のtransitionで測定した。EPI-MS/MS測定により、12種類の標的ペプチド配列が同定され、残り13種類のタンパク質については合成ペプチドを用いてMRM transitionの確認を行った。25種類のタンパク質を標的とするMRM transitionを用いて、T2DM群19名、DN3群15名の検体の尿中相対タンパク質濃度を測定した。
その結果、25種類のタンパク質中19種類のタンパク質が、T2DM群、DN3群間で有意な発現変動を示した。このうち非標識定量解析と同様の発現変動が検証されたタンパク質は16種類(発現上昇タンパク質：13、発現減少タンパク質：3)であった（図１４）。
発現上昇タンパク質は、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrinであり、発現減少タンパク質は、CD44、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2であった。
The transition setting of the MRM method was performed according to the following. That is, from the Mascot data, the measurement was performed with 111 sets of transitions where the peptide parent ion m / z was Q1, and the fragment ion m / z was Q3. EPI-MS / MS measurement identified 12 types of target peptide sequences, and the remaining 13 types of proteins were confirmed for MRM transition using synthetic peptides. Using MRM transition targeting 25 kinds of proteins, the relative protein concentrations in urine of 19 specimens in the T2DM group and 15 specimens in the DN3 group were measured.
As a result, 19 out of 25 proteins showed significant expression fluctuations between the T2DM group and the DN3 group. Of these, 16 proteins (expression increased protein: 13, expression decreased protein: 3) were verified for expression fluctuations similar to those of unlabeled quantitative analysis (FIG. 14).
Expression-enhanced proteins are afamin, alpha-1-
図１５は、尿中アルブミン・クレアチニン比と有意な関連を示すタンパク質の表である。
糖尿病腎症の早期尿中関連因子を絞り込む目的で、H群24名、DN2群20名における25タンパク質の尿中相対タンパク質濃度を追加測定し、尿中アルブミン・クレアチニン比との関連をステップワイズ多重回帰法にて解析した。
その結果、尿中アルブミン・クレアチニン比は、afamin(β:0.33,p＝1.8×10-7)、CD44 antigen（β:-0.17,p＝1.5×10-3)、alpha-1-antitrypsin (β:0.21,p＝7.5×10-5)、epiplakin(β:0.21,p＝4.9×10-6)、Ig alpha-1 chain C region（β:0.15,p＝1.5×10-3)、WAP four-disulfide core domain protein 2 (β:-0.15,p＝6.4×10-3)、alpha-1-acid glycoprotein 1(β:0.12,p＝0.027)の7タンパク質と有意に関連することが示された。
FIG. 15 is a protein table showing a significant association with the urinary albumin / creatinine ratio.
In order to narrow down early urinary related factors of diabetic nephropathy, additional urine relative protein concentrations of 25 proteins in 24 H group and 20 DN2 group were additionally measured, and the relationship with urinary albumin / creatinine ratio was stepwise multiplexed Analysis was performed by a regression method.
As a result, the ratio of urinary albumin to creatinine was afamin (β: 0.33, p = 1.8 × 10 -7 ), CD44 antigen (β: -0.17, p = 1.5 × 10 -3 ), alpha-1-antitrypsin (β : 0.21, p = 7.5 × 10 -5 ), epiplakin (β: 0.21, p = 4.9 × 10 -6 ), Ig alpha-1 chain C region (β: 0.15, p = 1.5 × 10 -3 ), WAP four -disulfide core domain protein 2 (β: -0.15, p = 6.4 × 10 -3 ), alpha-1-acid glycoprotein 1 (β: 0.12, p = 0.027) was shown to be significantly related to 7 proteins .
図１６は、早期腎症以降への進展を基準評価としたROC解析の結果を示す。
epiplakinを除くafamin (AUC:93.5%)、CD44 antigen（AUC:90.7%)、alpha-1-antitrypsin (AUC:81.4%)、Ig alpha-1 chain C region（AUC:75.2%)、WAP four-disulfide core domain protein 2 (AUC:77.3%)、alpha-1-acid glycoprotein 1 (AUC:87.6%)の6タンパク質が良好な診断能を示した。なお、腎機能評価に用いられるeGFRのROC曲線下面積は64.9％であり、本発明での検証集団における判定能はeGFRよりも上記6タンパク質の方が優れていた。
FIG. 16 shows the results of the ROC analysis with reference to the progression from early nephropathy onward.
afamin (AUC: 93.5%) excluding epiplakin, CD44 antigen (AUC: 90.7%), alpha-1-antitrypsin (AUC: 81.4%), Ig alpha-1 chain C region (AUC: 75.2%), WAP four-disulfide Six proteins, core domain protein 2 (AUC: 77.3%) and alpha-1-acid glycoprotein 1 (AUC: 87.6%) showed good diagnostic ability. In addition, the area under the ROC curve of eGFR used for renal function evaluation was 64.9%, and the judgment ability in the verification population in the present invention was superior to the above 6 proteins than eGFR.
さらに上記6タンパク質に加えて性別、糖尿病罹病期間、BMI、収縮期血圧、トリグリセリド、空腹時血糖、HbA1c、eGFRを説明変数とした多重ロジスティック回帰分析を行った。その結果、早期腎症以降への進展に及ぼす因子として、afamin (オッズ比:1.71; 95% CI:1.16-2.52; p＝0.007)と、CD44 (オッズ比:0.98,95% CI:0.96-0.99,p＝0.004)が選択された。 In addition to the above 6 proteins, multiple logistic regression analysis was performed using gender, diabetes duration, BMI, systolic blood pressure, triglycerides, fasting blood glucose, HbA1c, and eGFR as explanatory variables. As a result, afamin (odds ratio: 1.71; 95% CI: 1.16-2.52; p = 0.007) and CD44 (odds ratio: 0.98,95% CI: 0.96-0.99) , p = 0.004) was selected.
なお、afaminは、糖尿病及び糖尿病性血管合併症に関する血清・尿プロテオーム解析にてその発現が上昇することが報告されているものの、その機能や意義についての報告はなかった。CD44は、ヒアルロン酸をはじめとする細胞外マトリックスと結合する接着分子であり、(1)リンパ球ホーミング、(2)リンパ球活性化、(3)細胞-細胞間接着及び細胞-基質間接着、(4)細胞運動、(5)癌細胞増殖・転移などに深く関与していることが報告されている。CD44の機能は発現量だけでなく、alternative splicing variant isoformsの発現、糖鎖付加やリン酸化等の翻訳後修飾によっても制御される。CD44は癌幹細胞マーカーとしての役割ばかりでなく、糖尿病腎症モデルであるOVE26マウス腎尿細管、ラット虚血腎モデルでの浸潤炎症細胞、腎移植後の急性拒絶反応時の尿においても発現上昇するとの報告がある。 Although the expression of afamin has been reported to increase in serum and urine proteome analysis on diabetes and diabetic vascular complications, there has been no report on its function or significance. CD44 is an adhesion molecule that binds to extracellular matrix including hyaluronic acid, (1) lymphocyte homing, (2) lymphocyte activation, (3) cell-cell adhesion and cell-substrate adhesion, It has been reported that (4) cell motility and (5) cancer cell proliferation / metastasis are deeply involved. The function of CD44 is controlled not only by the expression level, but also by expression of alternative splicing variant isoforms, post-translational modifications such as glycosylation and phosphorylation. CD44 not only plays a role as a cancer stem cell marker, but also increases expression in diabetic nephropathy model OVE26 mouse renal tubule, infiltrating inflammatory cells in rat ischemic kidney model, and urine during acute rejection after kidney transplantation There is a report.
図１７は、図８及び１６の表中５タンパク質を対象に、糖尿病腎症患者尿を用いてウェスタンブロットした結果を示す写真である。
前記実施例１及び２において認められた発現上昇タンパク質及び発現減少タンパク質と同様の結果が検証された。なお、CD44, ceruloplasminについては、アミノ酸配列から予想される分子量よりも低分子量のバンドが検出され、細胞外ドメインが切断されたshedding formである可能性がある。これらのshedding formの発現変動が、2型糖尿病や糖尿病腎症の発症・進展と関連するとの報告はこれまでにない。
FIG. 17 is a photograph showing the results of Western blotting using the urine of diabetic nephropathy patients with respect to 5 proteins in the tables of FIGS. 8 and 16.
The same results as the increased expression protein and decreased expression protein observed in Examples 1 and 2 were verified. For CD44 and ceruloplasmin, there is a possibility that a band with a molecular weight lower than the molecular weight expected from the amino acid sequence is detected and the extracellular domain is cleaved form. To date, there has been no report that fluctuations in the expression of these shedding forms are associated with the onset and progression of
本発明によると、尿を試料とする簡便な手段で糖尿病腎症を検知でき、早期治療や予防に有効であり、産業上有用である。 According to the present invention, diabetic nephropathy can be detected by simple means using urine as a sample, which is effective for early treatment and prevention, and is industrially useful.
Claims (7)
被験者の尿を含む試料を用い、
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有する
ことを特徴とする糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法。 A method for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy, comprising:
Using a sample containing the subject's urine,
afamin, alpha-1-acid glycoprotein 1, alpha-1-antichymotrypsin, alpha-1-antitrypsin, alpha-1B-glycoprotein, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, NADPH: adrenodoxin oxidoreductase, at least selected from the group consisting of mitochondrial, obscurin, poly [ADP-ribose] polymerase 14, probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12, protein AMBP, serotransferrin, ubiquitin-40S ribosomal protein S27a, WAP four-disulfide core domain protein 2 A method for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy, comprising the step of detecting an expression variation in albumin / creatinine ratio for one protein.
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid glycoprotein 1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有する
請求項１に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法。 A method for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy, comprising:
Using a sample containing urine of the subject, afamin, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, alpha-1-antitrypsin, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, WAP four-disulfide core domain protein 2, alpha-1-acid glycoprotein 1 The method for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy according to claim 1, further comprising a step of detecting a change in the expression of the albumin / creatinine ratio for at least one protein selected from the protein group consisting of:
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose]polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備える
ことを特徴とする糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 A kit for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy,
Using a sample containing urine of the subject, afamin, alpha-1-acid glycoprotein 1, alpha-1-antichymotrypsin, alpha-1-antitrypsin, alpha-1B-glycoprotein, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, NADPH: adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial, obscurin, poly [ADP-ribose] polymerase 14, probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12, protein AMBP, serotransferrin, ubiquitin-40S ribosomal protein S27a, WAP four-disulfide core domain protein 2 A kit for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy, comprising means for detecting an expression fluctuation in the albumin / creatinine ratio for at least one protein selected from the protein group consisting of:
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid glycoprotein 1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 A kit for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy,
Using a sample containing urine of the subject, afamin, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, alpha-1-antitrypsin, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, WAP four-disulfide core domain protein 2, alpha-1-acid glycoprotein 1 The kit for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy according to claim 3, comprising means for detecting a change in the expression of the albumin / creatinine ratio for at least one protein selected from the group consisting of proteins.
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 afamin, alpha-1-acid glycoprotein 1, alpha-1-antichymotrypsin, alpha-1-antitrypsin, alpha-1B-glycoprotein, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, NADPH: adrenodoxin oxidoreductase, at least selected from the group consisting of mitochondrial, obscurin, poly [ADP-ribose] polymerase 14, probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12, protein AMBP, serotransferrin, ubiquitin-40S ribosomal protein S27a, WAP four-disulfide core domain protein 2 The kit for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy according to claim 3, comprising a staining agent for one protein or a unique partial protein or polypeptide that recognizes the protein.
four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの生物活性を測定する試薬を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 afamin, alpha-1-acid glycoprotein 1, alpha-1-antichymotrypsin, alpha-1-antitrypsin, alpha-1B-glycoprotein, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, NADPH: adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial, obscurin, poly [ADP-ribose] polymerase 14, probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12, protein AMBP, serotransferrin, ubiquitin-40S ribosomal protein S27a, WAP
The diabetes according to claim 3, comprising a reagent for measuring the biological activity of at least one protein selected from the protein group consisting of four-disulfide core domain protein 2 or a specific partial protein or polypeptide that recognizes the protein. Detection kit for the onset or risk of nephropathy.
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 afamin, alpha-1-acid glycoprotein 1, alpha-1-antichymotrypsin, alpha-1-antitrypsin, alpha-1B-glycoprotein, antithrombin III, ceruloplasmin, CD44, epiplakin, Ig alpha-1 chain C region, NADPH: adrenodoxin oxidoreductase, at least selected from the group consisting of mitochondrial, obscurin, poly [ADP-ribose] polymerase 14, probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12, protein AMBP, serotransferrin, ubiquitin-40S ribosomal protein S27a, WAP four-disulfide core domain protein 2 The kit for detecting the onset or risk of developing diabetic nephropathy according to claim 3, comprising an antibody of one protein or a unique partial protein or polypeptide that recognizes the protein.
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