KR20190036839A - A composition for early diagnosis of cardiovascular disease using a peptide derived from Obscurin or Titin protein, a kit for early diagnosis of cardiovascular disease, and method for information for early diagnosis of cardiovascular disease - Google Patents
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Abstract
Description
본 명세서는 옵스큐린 단백질 유래 펩타이드 및 티틴 단백질 유래 펩타이드 중 어느 하나 이상을 이용한 심혈관 질환 조기 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단키트, 및 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for early diagnosis of cardiovascular diseases using any one or more of peptides derived from opsuculin protein and tinctin protein, a diagnostic kit comprising the same, and a method for providing information for early diagnosis of cardiovascular diseases.
심혈관 질환은 우리나라에서 세 번째로 높은 사망률을 기록하고 있는 질병으로 우리나라의 식생활 습관이 서구화되면서, 고혈압 비만과 같은 만성질환의 발병률이 급속하게 증가하면서, 심혈관 질환의 빈도도 급하게 증가하고 있다. 급성 심근경색은 발병 후 예후가 매우 좋지 않아, 재발 및 사망률이 2번째로 높은 질환으로, 관상동맥 혈류가 막히고, 취약성 경화반이 파열되어 혈전성 폐색으로 증상이 나타난다. 현재, 취약성 경화반 (vulnerable plaque)의 진단은 혈관 내심 초음파 방법 (intravascular ultrasound)으로 이루어지고 있는데, 비만이 심하거나 부종이 심한 경우, 초음파가 잘 통과하지 못하므로, 조기진단에 어려움이 있으며, 아직까지 조기 진단용 바이오 마커가 사용되지 못하고 있는 실정이다. 급성 심근경색 고위험군에 관한 조기 진단용 바이오 마커가 발굴된다면, 환자에게 위험한 급성 심근경색을 조기에 예방하거나, 심혈관 질환의 조기 단계에서 치료할 수 있는 가능성을 제공할 수 있을 것이다. Cardiovascular disease is the third highest death rate in Korea. As the eating habits of Korea are westernized, the incidence of chronic diseases such as hypertension and obesity is rapidly increasing, and the frequency of cardiovascular diseases is rapidly increasing. Acute myocardial infarction is the second most common cause of recurrence and mortality because of poor prognosis after onset. Coronary blood flow is blocked, and the vulnerable sclerosis ruptures, resulting in thrombotic occlusion. At present, the diagnosis of vulnerable plaque is made by intravascular ultrasound. If severe obesity or edema is severe, ultrasound can not pass through well, so it is difficult to diagnose early. The early diagnosis biomarkers have not been used. If a biomarker for early diagnosis of an acute myocardial infarction is identified, the patient may be able to prevent a dangerous acute myocardial infarction early or to treat it at an early stage of cardiovascular disease.
본 발명에서는 현재 급성심근경색의 바이오 마커로 사용되고 있는 CK-MB, Myoglobin, Troponin I, Troponin T를 대체할 수 있는 민감하고 특이도가 높은 바이오 마커를 개발하는 연구 중에 발굴된 바이오 마커 후보군 중, 급성 심근경색 고위험군을 협심증 단계에서 조기에 진단하는데 정보를 제공할 수 있는 바이오 마커를 선별하는데 역점을 두었다.In the present invention, among the biomarker candidates discovered at the time of developing a sensitive and specific biomarker capable of replacing CK-MB, Myoglobin, Troponin I, and Troponin T, which are currently used as biomarkers for acute myocardial infarction, The emphasis was placed on the selection of biomarkers that could provide information to diagnose high risk myocardial infarction early in the stage of angina.
위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 발명자들은 생체시료에 주 단백질인 알부민 (Albumin)과, 면역글로불린 G (IgG)를 효율적으로 제거하기 위해 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심 분리하거나, 상업적 키트인 ProteExtract™를 사용하였고, 정상인과 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI) 환자의 혈장 시료에서 Albumin과 IgG 제거 후, 얻은 소량의 단백질들을 트립신으로 분해하고 염을 제거하여, 고분해능 액체크로마토그래피 (LTQ Orbitrap)로 펩타이드를 정성분석하고, 이를 마스코트 (Mascot)로 데이터베이스를 검색하여, 정상인과 환자에게서 차이가 나게 발현된 단백질을 발굴하였다. 이렇게 스크리닝된 바이오마커 후보군을 액체크로마토그래피-질량분석기 (LC-MS/MS)의 Multi Reaction Monitoring (MRM) 방법으로 정량 분석하여, AMI의 바이오 마커로 활용 가능한지 검증하였다. 마지막으로 상업적으로 판매하는 ELISA Kit를 구매하여, 바이오 마커 후보군의 혈중 농도에 대해서, 정상인과 심혈관 환자군을 비교 분석한 결과, 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI) 또는 심근경색 발병 이전 징후인 불안정형 협심증 (Unstable Angina, UA) 또는 안정형 협심증 (Stable Angina, SA) 단계에서 정상인과 구별되어 조기에 급성 심근경색 환자 위험 군을 진단할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.In order to solve the above problems, the inventors of the present invention have proposed a method for efficiently removing albumin (albumin) and immunoglobulin G (IgG), which are main proteins, in a biological sample at a temperature of -70 ° C to 0 ° C ProteinExtract ™, a commercial kit, was used to remove the albumin and IgG from plasma samples from patients with acute myocardial infarction (AMI), and small amounts of proteins obtained from trypsin , The salt was removed, and the peptide was qualitatively analyzed with high resolution liquid chromatography (LTQ Orbitrap). The peptide was then analyzed by Mascot to identify proteins differentially expressed in normal subjects and patients. The screened biomarker candidates were quantitatively analyzed by Multi-Reaction Monitoring (MRM) method of liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS / MS) and verified as biomarkers of AMI. Finally, a commercially available ELISA kit was purchased and compared to normal subjects and cardiovascular patients for blood marker concentrations of the biomarker candidates. Results showed that acute myocardial infarction (AMI) or anxiety The present inventors have discovered that the risk of acute myocardial infarction can be diagnosed early in the stage of unstable angina (UA) or stable angina (SA) stage, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명은 급성 심근경색 환자를 진단하거나, 협심증 단계에서 AMI를 조기에 예측하는 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는데 있다.Accordingly, the present invention is to provide a diagnostic biomarker composition for diagnosing an acute myocardial infarction patient or for predicting AMI early in an angina pectoris.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 급성 심근경색 진단용 키트 또는 AMI 고위험군 예측 진단 키트를 제공하는데 있다. The present invention also provides an acute myocardial infarction diagnostic kit or AMI high risk group predictive diagnostic kit comprising the composition.
또한, 본 발명은 급성 심근경색 고위험군 환자를 협심증 단계에서 조기에 진단하는데 필요한 정보를 제공 하는데 있다.The present invention also provides information necessary for early diagnosis of acute myocardial infarction high risk patients in the stage of angina.
위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 옵스큐린과 티틴 단백질 또는 이들의 트립신 분해 후 펩타이드 조각 (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 급성 심근경색 진단용 또는 협심증 단계에서의 조기 진단용 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for diagnosing an acute myocardial infarction or an early diagnosis in an angina pectoris stage comprising the step of measuring the level of expression of opsuculin and a ttin protein or a peptide fragment thereof (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR) Lt; / RTI >
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 급성 심근경색 진단 키트 또는 AMI 고위험군 예측용 조기 진단 키트를 제공한다.The present invention also provides an acute myocardial infarction diagnostic kit or an early diagnosis kit for predicting high risk of AMI, which comprises the above composition.
본 발명은 생체시료 특히, 혈장에서 80% 이상 존재하는 다량 단백질을 제거하고, 미량의 단백질을 추출한 후, 정상인과 환자군(대상자)의 시료 속에 존재하는 특정 단백질 농도의 증감을 비교하여, 급성 심근경색 환자의 조기진단에 유용한 신규 바이오 마커를 발굴하였다.The present invention relates to a method for detecting a specific protein concentration in a sample of a normal person and a patient (subject) by removing a large amount of protein present in a biological sample, particularly, plasma, more than 80% New biomarkers useful for early diagnosis of patients were identified.
선별한 세종의 신규 바이오 마커 후보군은 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI)과 불안정 협심증 (Unstable Angina, UA) 환자의 진단에 관한 정보를 제공하는데 유용하게 사용할 수 있을 것이다. 이는 기존 바이오 마커 대비 10% 이상 향상된 특이도 및 민감도를 보여 경쟁력이 있음을 확인하였다.Sejong's new biomarker candidates may be useful in providing information about the diagnosis of acute myocardial infarction (AMI) and unstable angina (UA) patients. It is confirmed that it has a competitive edge by showing a specificity and sensitivity improved by more than 10% compared to existing biomarkers.
도 1은 정상인과 급성심근경색 환자의 혈장 시료를 발명한 주단백질 제거 (albumin, IgG), 염 제거 후, 트립신을 활용한 단백질 분해를 거쳐, 고분해능 액체크로마토그래피로 시료를 분석하여 얻은 크로마토그램이다. 화살표로 표시된 머무름 시간에서 급성 심근경색 바이오 마커 후보군인 옵스큐린, 티틴, 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1이 도출되었다. (A) Healthy Control (정상인) (B) AMI patient (급성 심근경색 환자).
도 2는 도 1과 같이 급성 심근경색 환자의 혈장 시료로부터 얻어진 크로마토그램을 Mascot database search를 거쳐 얻은 단백질 list 이다. 이 실험에서, p 값이 26보다 큰 경우 단백질 동정 결과가 유의미하다는 통계 결과를 얻었고, p 값이 26이상인 단백질의 펩타이드 조각에 대하여 정량분석을 실시하였다. 급성 심근경색 환자 시료에서는 총 40개의 단백질이 확인되었다. Titin의 경우, 크로마토그램상에서 정상인과 급성 심근경색 환자에게서 피크면적의 차이가 확연하여, p 값이 기준을 넘지 못하였으나, 확인된 단백질 리스트에 포함하였다.
도 3은 정상인과 급성 심근경색 환자 시료에 대해 차이가 나게 발현된 증가 바이오 마커 후보군의 마스코트 결과를 정리한 것이다. (도 3a) 단백질과 트립신 분해 후 정량 분석한 펩타이드의 질량 (m/z), 충돌 에너지로 충돌하여 얻은 조각 이온의 질량 (m/z), 그리고 머무름 시간 (min) (도 3b) 마스코트에서 검출된 단백질의 트립신 분해 후 펩타이드 리스트, z값 (분자의 전하량), 그리고 intensity의 증감 유무이다.
도 4는 정상인과 급성 심근경색 환자 시료에 대해 차이가 나게 발현된 증가 바이오 마커 후보군을 면역학적 어세이 (ELISA Kit)로 정량 분석한 결과이다. 정상인 22명과 급성심근경색 환자군 14명의 혈장시료를 정량분석하고 t-test로 유의성을 분석하였다. (도 4a) 옵스큐린 (Obscurin) (도 4b) 티틴 (Titin) (도 4c) 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1 (alpha-1-acid glycoprotein 1)의 세종 바이오 마커의 정량분석 결과, 옵스큐린은 협심증환자 (UA, SA)와 급성 심근경색 환자 (AMI) 에게서 모두 정상인과 유의성 있게 차이가 남을 확인하였고, 티틴의 경우, 불안정형 협심증환자와 급성 심근경색 환자에게서만 정상인과 유의성 있는 차이를 보였다. 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1의 경우, 액체 크로마토그래피의 정량분석 결과와는 달리, 정상인과 환자의 정량분석결과가 통계적으로 유의미하지 않았다.
도 5는 정상인과 급성심근경색 환자 시료에 대해 차이가 나게 발현된 증가 바이오 마커 후보군의 ROC (Receiver Operating Curve) 결과이다. 정상인 22명과 급성심근경색 환자군 14명의 혈장시료를 정량 분석한 결과를 통계적으로 분석한 결과이다. (도 5a) 옵스큐린 (Obscurin) (도 5b) 티틴 (Titin) (도 5c) 알파-1-에시드-글라이코프로테인 1 (alpha-1-acid glycoprotein 1)의 세종 바이오 마커에 대하여 정상인과 모든 심혈관 환자 (UA, SA, AMI) 비교결과, 정상인과 SA, AMI의 비교결과, 정상인과 AMI환자의 비교결과를 보여주는 ROC 결과이다.
도 6은 본 발명에서 발굴한 바이오 마커인 옵스큐린과 티틴을 기존의 골드 스탠다드인 트로포닌 I (Troponin I)와 비교하여 ELISA Kit로 분석한 것이다. 민감도, 특이도, AUC (Area Under Curve), 정확도, 진단의 기준 (Cut-off value (ng/ml)을 보여준다. 발굴한 옵스큐린과 티틴의 민감도와 특이도가 모두 트로포닌 I 보다 높았고, 이 둘을 조합 할 경우, 급성 심근경색 진단에 매우 우수한 진단결과를 (특이도 100%, 민감도 86%) 확보할 수 있음을 보여 주었다.
도 7은 발굴한 옵스큐린과 티틴의 심장 조직에서의 역할을 Scheme으로 작성한 것이다. 티틴은 Z-band로부터 I, A, M band를 통과하여 actin, myosin, myomesin과 α-actin을 연결시키고, 옵스큐린은 Sarcoplasmic reticulum 또는 T-tubule과 actin, α-actin을 연결시켜주는 역할을 하고 있는 것으로 알려진 단백질로, 기 상업적으로 사용되고 있는 골드 스탠다드인 트로포닌과 함께 심장 근육의 구조를 이루는 단백질이어서, 심근조직에 이상이 생기면서 혈중으로 방출되는 양이 증가하는 것으로 판단된다.FIG. 1 is a chromatogram obtained by analyzing samples by high resolution liquid chromatography after proteolytic cleavage using trypsin, followed by removal of the main protein (albumin, IgG), salt removal, and plasma samples from normal people and acute myocardial infarction patients . In the retention time indicated by the arrows, a candidate for acute myocardial infarction biomarker, opsucilin, tithine, alpha-1-
FIG. 2 is a list of proteins obtained from a plasma sample obtained from acute myocardial infarction patients as shown in FIG. 1 through a Mascot database search. In this experiment, statistical results were obtained that the result of protein identification was significant when p value was greater than 26, and quantitative analysis of peptide fragments of protein having p value of 26 or more was performed. A total of 40 proteins were identified in patients with acute myocardial infarction. In the case of Titin, the peak area difference between the normal person and the acute myocardial infarction patient on the chromatogram was evident, and the p value was included in the confirmed protein list although it did not exceed the standard.
Figure 3 summarizes the mascot results of the increased biomarker candidates that are differentially expressed in normal subjects and acute myocardial infarction samples. (Fig. 3a) mass (m / z) of the peptide quantitatively analyzed after decomposition of protein and trypsin, mass (m / z) of the fragment ion obtained by collision with impact energy, and retention time (min) The list of peptides after trypsin degradation, the z value (the charge of the molecule), and the increase or decrease in intensity.
FIG. 4 is a result of quantitative analysis of an increased number of biomarker candidates that are differentially expressed in normal human subjects and acute myocardial infarction samples using an immunoassay (ELISA kit). Twenty-two normal subjects and 14 acute myocardial infarction patients were analyzed for plasma samples and t-test for significance. (Fig. 4a) Obscurin (Fig. 4b) Titin (Fig. 4c) Quantitative analysis of the alpha- 1-acid glycoprotein 1 (UA, SA) and acute myocardial infarction (AMI) patients were significantly different from normal subjects. In the case of ticin, there was a significant difference only in patients with unstable angina and acute myocardial infarction. In the case of alpha-1-
FIG. 5 is a ROC (Receiver Operating Curve) result of a group of increased biomarker candidates that are differentially expressed from normal subjects and acute myocardial infarction samples. Statistical analysis of the results of quantitative analysis of plasma samples from 22 normal subjects and 14 acute myocardial infarction patients. (Fig. 5a) Obscurin (Fig. 5b) Titin (Fig. 5c) Alpha-1-
FIG. 6 is a graph showing ELISA kit comparing opsucilin and titin, which are biomarkers discovered in the present invention, with troponin I, which is a gold standard. Sensitivity, Specificity, Area Under Curve (AUC), Accuracy, Diagnostic Criteria (Cut-off value (ng / ml)) were shown. The sensitivity and specificity of Obcurin and Tin were higher than those of Troponin I The combination of the two showed excellent diagnostic results (100% specificity and 86% sensitivity) for the diagnosis of acute myocardial infarction.
Fig. 7 shows the role of the excised obscurin and ttin in cardiac tissue by Scheme. Tryptin binds actin, myosin, and myomesin to α-actin through the I, A, and M bands from the Z-band, while opsuculin plays a role in connecting sarcoplasmic reticulum or T-tubule to actin and α-actin This protein is known to be a protein that forms the structure of cardiac muscle along with troponin, a gold standard used commercially. It is thought that the amount of released blood into the myocardial tissue is increased due to abnormalities in the myocardial tissue.
본 발명은 심혈관 질환 환자의 혈장에서 증가되어 발현한 신규 바이오 마커로서, 옵스큐린과 티틴 단백질 또는 이들의 트립신 분해 후 펩타이드 조각 (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR)이 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI) 환자의 혈장시료에서, 이들의 생체시료 내 농도가 현저하게 증가하므로, 그 농도를 비교하여 간단하면서도 정확하게 급성 심근경색을 진단할 수 있다. 더욱이 발굴된 바이오 마커는 급성 심근경색의 전단계인 불안정형 협심증 (Unstable Angina, UA)이나 안정형 협심증 (Stable Angina, SA) 환자에게서도 정상인에 비해 유의성 있게 증가하여, 급성 심근경색 환자 위험 군을 조기에 찾아 낼 수 있는 매우 유용한 조기 진단 마커로, 기존의 급성 심근경색 바이오 마커인 Troponin I 나, 심혈관 질환 고위험군 바이오 마커인 BNP 와 비교한 실험 결과에서 보다 높은 진단의 민감도, 특이도, 정확성을 확인하였다.The present invention relates to a novel biomarker which is expressed in plasma of a patient with cardiovascular disease, wherein a peptide fragment (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR) of opsucillin and ttin protein or their trypsin-degraded peptide is used as a plasma of acute myocardial infarction (AMI) Since the concentration of these samples in the sample increases remarkably in the sample, acute myocardial infarction can be diagnosed simply and accurately by comparing the concentrations thereof. Furthermore, the biomarkers identified were significantly increased in patients with unstable angina (UA) or stable angina (SA), which preceded acute myocardial infarction, compared with healthy controls, and early detection of acute myocardial infarction The sensitivity, specificity, and accuracy of the diagnosis were higher than those of the conventional acute myocardial infarction biomarker Troponin I and cardiovascular high risk biomarker BNP.
이하, 본 발명을 하나의 구현 예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail as an embodiment.
먼저, 본 발명의 발명자들은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심 분리하여 주 단백질인 알부민과 IgG를 제거하거나, 종래의 상업적 키트(ProteExtract™)를 이용하여 주 단백질인 알부민과 IgG를 제거한 후, 생체시료 내에 존재하는 미량의 특정 단백질로 존재하는 바이오 마커 후보군을 발굴하는데 유용한 기술을 보유하고 있다 (특허출원 제2016-108525호 참조). 이에 본 발명의 발명자들은 미량의 특정 단백질을 효과적으로 발굴할 수 있는 상기 기술을 이용하여, 정상인과 심혈관 질환 환자 (대상자)의 생체시료 (특히, 혈장)에서, 미량으로 존재하는 급성 심근경색 조기 진단용 바이오 마커를 발굴하였다.First, the inventors of the present invention have found that when a solution of chilled acetone having a concentration of 50 to 80% at a temperature of -70 ° C to 0 ° C is added to a biological specimen and centrifuged to remove albumin and IgG as main proteins or a conventional commercial kit (ProteExtract (See patent application no. 2016-108525) after removing albumin and IgG, which are major proteins, using biomarkers (see Patent Application No. 2016-108525). Therefore, the inventors of the present invention have found that, by using the above-described technique capable of effectively extracting a specific amount of a specific protein, the inventors of the present invention have found that, in a biological sample (particularly plasma) of a normal person and a cardiovascular disease subject Markers were excavated.
구체적으로, 본 발명은 상기 냉장 아세톤 침전법 (특허출원 제2016-108525호) 또는 종래의 상업적 키트 (ProteExtract™)를 이용하여 주단백질 알부민과 면역글로불린 G (Ig G)를 제거하고, 트립신으로 단백질을 분해한 후, 다량의 염을 제거하고 고분해능 액체크로마토그래피-질량분석기 (LTQ Orbitrap)로 조각 펩타이드를 분석하였다. 분석하여 얻은 크로마토그램과 매스스펙트로메트리 결과를 Mascot database를 사용하여 분석하여, 단백질을 동정하고, 정상인과 환자 시료에서 차이가 나게 발현된 단백질의 조각 펩타이드 이온을 정량 분석하여, 바이오 마커 후보군이 통계적으로 유의미 한지 검증하였다. 아울러, 고분해능 질량분석기 (LTQ-Orbitrap)를 사용 하면서, MS/MS scan analyzer의 조건을 FTMS를 Ion Trap으로 바꾸거나, Dynamic Exclusion Parameter를 최적화하고, Minimum Signal Threshold를 증가시켜 분석하였다.Specifically, the present invention is characterized by removing main protein albumin and immunoglobulin G (IgG) using the above-described cold acetone precipitation method (Patent Application No. 2016-108525) or a conventional commercial kit (ProteExtract ™) After removing the large amount of salt, the fragment peptide was analyzed with a high resolution liquid chromatography-mass spectrometer (LTQ Orbitrap). Analyzes of the chromatogram and mass spectrometry obtained using the Mascot database were performed to identify proteins and quantitatively analyze fragment peptide ions expressed in differentiated proteins from normal and patient samples to determine whether the biomarker candidates were statistically , Respectively. In addition, the MS / MS scan analyzer conditions were changed to FTMS, Ion Trap, Dynamic Exclusion Parameter, and Minimum Signal Threshold by using a high-resolution mass spectrometer (LTQ-Orbitrap).
본 발명의 구체적인 실시 예에서는 급성 심근경색 환자와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린 (Obscurin); m/z 561.27 --> 861.31, 티틴 (Titin); m/z 520.82 --> 765.40, 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1 (alpha-1-acid glycoprotein 1); m/z 871.90--> 853.52 의 세종 유명 단백질을 선별하였고, 이들 심혈관 질환 바이오 마커들은 정상인에서보다 급성심근경색 환자의 혈장에서 현저히 증가한 것을 확인하였다 (도 3).In a specific example of the present invention, Obscurin, which specifically expresses the expression difference from plasma of acute myocardial infarction patients and normal persons; m / z 561.27 - > 861.31, Titin; m / z 520.82 - > 765.40, alpha-1-
다른 한편으로는, 액체 크로마토그래피-질량분석기를 사용하여 급성 심근경색 환자와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린 (Obscurin); m/z 561.27 --> 861.31, 티틴 (Titin); m/z 520.82 --> 765.40, 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1 (alpha-1-acid glycoprotein 1); m/z 871.90--> 853.52 의 세종 단백질의 조각 펩타이드를 합성하고, 이를 MRM (multi reaction monitoring) 방법으로 정량 분석하였다. 정량 분석결과, 세종의 바이오 마커 후보군이 정상인에 비해 AMI 환자 군에서 유의미하게 증가 또는 감소되어있음을 확인하였다.On the other hand, Obscurin, which specifically expresses differentiation from plasma of acute myocardial infarction patients and normal persons using liquid chromatography-mass spectrometry; m / z 561.27 - > 861.31, Titin; m / z 520.82 - > 765.40, alpha-1-
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 심혈관 질환의 발병 여부를 확인하거나, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.As used herein, the term "diagnosis" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purpose of the present invention, diagnosis may refer to the identification of the onset of cardiovascular disease, and further, whether the disease progresses or intensifies.
본 발명에서 발굴한 바이오 마커 후보군을 검증하기 위하여, 상업적으로 판매하는 면역학적 에세이 (ELISA Kit)를 구매하여, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하였으며, 이 결과에서는 옵스큐린과 티틴만 정상인과 구별되게 AMI환자에게서 유의미하게 증가하였음을 확인하였다 (도 4). ELISA Kit를 구성할 때에는 급성 심근경색 환자와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린과 티틴 단백질 또는 이들의 트립신 분해 후 펩타이드 조각 (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR)에 특이적인 항체를 메인 구성성분으로 하였다.In order to verify the biomarker candidates excavated in the present invention, a commercially-available immunoassay (ELISA Kit) was purchased and the expression level of the protein was measured. In this result, only AMC And significantly increased in the patients (Fig. 4). When ELISA kit was constructed, the main component was opsucurin and ttin protein, which showed specific expression differences from plasma of acute myocardial infarction patients and normal persons, or antibodies specific to peptide fragments (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR) after their cleavage of trypsin .
본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미하는 것으로, 단 클론항체, 다 클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.In the present invention, the term "antibody" means a protein molecule specific for an antigenic site and includes both monoclonal antibodies, polyclonal antibodies and recombinant antibodies.
단 클론항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법 (Kohler 및 Milstein(1976) European journal of Immunology 6:511-519), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clarkson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 다 클론항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다 클론항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 또한, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함된다.Monoclonal antibodies can be prepared by hybridoma methods well known in the art (Kohler and Milstein (1976) European journal of Immunology 6: 511-519), or phage antibody libraries (Clarkson et al, Nature, 352: 624-628, 1991 ; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991). Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for injecting the above protein antigens into animals and obtaining blood from animals to obtain sera containing antibodies. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cows, dogs, and the like. The antibody of the present invention also includes a special antibody such as a chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 포함하는 급성 심근경색 고위험군 예측용 조기 진단 키트에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 심혈관 질환 조기 진단용 마커로서, 급성 심근경색 환자 또는 협심증 (불안정형 협심증, 안정형 협심증) 환자를 정상인의 혈장으로부터 구별하여 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린과 티틴 단백질 또는 이들의 트립신 분해 후 펩타이드 조각 (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항원의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다. In another aspect, the present invention relates to an early diagnosis kit for predicting acute myocardial infarction at high risk, comprising the composition for early diagnosis of cardiovascular diseases. Accordingly, the present invention provides a marker for early diagnosis of cardiovascular disease, which is a marker for acute myocardial infarction or angina pectoris (unstable angina pectoris, stable angina pectoris) from normal plasma, And fragments of peptide after digestion (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR).
바람직한 일례로, 본 발명에서의 키트는 환자 시료 내 상기 이종의 특정 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제뿐만 아니라, 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지 된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.As a preferred example, the kit according to the present invention may include one or more suitable compositions, solutions or devices suitable for measuring the level of expression of the heterologous specific protein in a patient sample. For example, the kit may comprise a substrate, a suitable buffer solution, a secondary antibody labeled with a detection label, and a chromogenic substrate for immunological detection of the antibody.
또 다른 양태로서, 본 발명은 급성 심근경색 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
대상자로부터 채취한 생체시료로부터 급성 심근경색 환자와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린 (Obscurin); m/z 561.27 --> 861.31, 티틴 (Titin); m/z 520.82 --> 765.40, 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1 (alpha-1-acid glycoprotein 1); m/z 871.90--> 853.52로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 액체크로마트그래피-질량분석기를 이용하여 측정하고, 상기 단백질의 함량을 정상 대조 군과 대비하여 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method for diagnosing acute myocardial infarction,
Obscurin, which specifically expresses different expression levels from plasma of acute myocardial infarction patients and normal persons from biological samples collected from subjects; m / z 561.27 - > 861.31, Titin; m / z 520.82 - > 765.40, alpha-1-
보다 바람직한 양태로, 대상자의 급성 심근경색 환자 또는 와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린과 티틴 단백질 또는 이들의 트립신 분해 후 펩타이드 조각 (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR) 중 하나 이상의 수치가 정상 대조 군에 비하여 현저하게 높게 발현되어 있는 바이오 마커로 환자의 심혈관 질환 유무/ 급성 심근경색 고위험군에 관한 정보를 제공하는 것이다.In a more preferred embodiment, the level of one or more of the opsucillin and ttin protein or their peptide fragments (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR), which specifically express the difference in expression from the plasma of the subject's acute myocardial infarction or of the normal person, , Which is a highly biomarker that provides information on the presence of cardiovascular disease / acute myocardial infarction in patients.
또한 본 발명에서의 상기 생체시료는 혈장(plasma), 뇨(urine), 객담(sputum), 세럼(serum)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈장이다. 아울러, 본 발명에서의 심혈관 질환은 급성 심근경색(acute myocardial infarction), 불안정형 협심증 (Unstable Angina), 또는 안정형 협심증 (Stable Angina)이다.Further, the biological sample in the present invention may be plasma, urine, sputum, serum, and more preferably plasma. In addition, the cardiovascular diseases in the present invention are acute myocardial infarction, unstable angina, or stable angina.
따라서, 본 발명에 따른 신규 바이오 마커 후보군로서 급성 심근경색 환자와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린과 티틴 단백질 또는 이들의 트립신 분해 후 펩타이드 조각 (FIEDVKNQE, IVVPLKDTR)을 각각 또는 동시에 측정함으로써, 민감도 85% 이상, 특이도 94% 이상의 높은 예측 적중률을 얻을 수 있는 진단 키트로 제공될 수 있으며(도 5, 도 6), 이는 급성 심근경색을 불안정형 협심증 또는 안정형 협심증 단계에서 조기에 예측, 진단하는데 관한 정보를 제공하는데 유용하게 이용될 것이다(도 6). Therefore, as a candidate for a new biomarker according to the present invention, it is possible to measure each of the opsucillin and the ttin protein or the peptide fragments (FIEDVKNQE and IVVPLKDTR) thereof, which specifically express the difference in expression from the plasma of the acute myocardial infarction patient and the normal person, (FIG. 5, FIG. 6), which can provide a high predictive accuracy rate of 85% or more and a specificity of 94% or more (FIGS. 5 and 6) , And will be useful for providing information about diagnosis (Fig. 6).
본 발명의 일 측면은 서열번호 1(FIEDVKNQE)의 펩타이드 조각 및 서열번호 2(IVVPLKDTR)의 펩타이드 조각으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention is a composition for early diagnosis of cardiovascular diseases comprising an agent for measuring the expression level of at least one protein selected from the group consisting of a peptide fragment of SEQ ID NO: 1 (FIEDVKNQE) and a peptide fragment of SEQ ID NO: 2 (IVVPLKDTR) to provide.
서열번호 1: FIEDVKNQESEQ ID NO: 1: FIEDVKNQE
서열번호 2: IVVPLKDTRSEQ ID NO: 2: IVVPLKDTR
본 발명의 일 측면에서, 상기 단백질은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심 분리하여 주단백지인 알부민과 IgG를 제거하여 추출된 시료로부터 선별된 것인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the protein is prepared by adding an aqueous solution of chilled acetone having a temperature of -70 ° C to 0 ° C at a concentration of 50 to 80% to a biological sample, centrifuging it to remove albumin and IgG, Wherein the composition is selected from the group consisting of:
본 발명의 일 측면에서, 상기 생체시료는 혈장(plasma), 뇨(urine), 객담(sputum), 세럼(serum)인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the biological sample provides a composition for early diagnosis of cardiovascular disease, which is plasma, urine, sputum, serum.
본 발명의 일 측면에서, 상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 및 상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질에 대하여 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular diseases including a protein comprising a peptide fragment of SEQ ID NO: 1, and an agent for measuring the expression level of a protein against at least one protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: A composition for early diagnosis is provided.
본 발명의 일 측면에서, 상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 옵스큐린(Obscurin) 단백질이며, 상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 티틴(Titin) 단백질인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 is Obscurin protein, and the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 is a Titin protein for early diagnosis of cardiovascular disease Lt; / RTI >
본 발명의 일 측면에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 서열번호 1(FIEDVKNQE)의 펩타이드 조각 및 서열번호 2(IVVPLKDTR)의 펩타이드 조각으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 특이적인 항체인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.In one aspect of the invention, the agent for measuring the level of expression of said protein is an antibody specific for one or more selected from the group consisting of a peptide fragment of SEQ ID NO: 1 (FIEDVKNQE) and a peptide fragment of SEQ ID NO: 2 (IVVPLKDTR) A composition for early diagnosis of cardiovascular diseases is provided.
본 발명의 일 측면에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 서열번호 1(FIEDVKNQE)의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 및 서열번호 2(IVVPLKDTR)의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 특이적인 항체인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.In one aspect of the invention, the agent for measuring the level of expression of said protein is selected from the group consisting of a protein comprising a peptide fragment of SEQ ID NO: 1 (FIEDVKNQE) and a peptide fragment of SEQ ID NO: 2 (IVVPLKDTR) A composition for early diagnosis of cardiovascular diseases, which is an antibody specific for one or more of the above.
본 발명의 일 측면에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 서열번호 1(FIEDVKNQE)의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 및 서열번호 2(IVVPLKDTR)의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 특이적인 항체인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다. 일 구현 예에서, 상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 옵스큐린(Obscurin) 단백질이며, 상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 티틴(Titin) 단백질일 수 있다.In one aspect of the invention, the agent for measuring the level of expression of said protein is selected from the group consisting of a protein comprising a peptide fragment of SEQ ID NO: 1 (FIEDVKNQE) and a peptide fragment of SEQ ID NO: 2 (IVVPLKDTR) A composition for early diagnosis of cardiovascular diseases, which is an antibody specific for one or more of the above. In one embodiment, the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 is an Obscurin protein, and the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 is a Titin protein.
본 발명의 일 측면에서, 상기 항체는 단 클론항체 또는 다 클론항체인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물일 수 있다.In one aspect of the present invention, the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, a composition for early diagnosis of cardiovascular diseases.
본 발명의 일 측면에서, 상기 심혈관 질환은 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI), 불안정형 협심증 (Unstable Angina, UA) 및 안정형 협심증 (Stable Angina, SA)중 어느 하나 이상인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물일 수 있다.In one aspect of the invention, the cardiovascular disease is selected from the group consisting of acute myocardial infarction (AMI), unstable angina (UA), and stable angina (SA) Lt; / RTI >
본 발명의 다른 측면은, 상기 심혈관 질환 조기 진단용 조성물 중 어느 하나 이상을 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for early diagnosis of cardiovascular diseases comprising at least one of the compositions for early diagnosis of cardiovascular diseases.
본 발명의 또 다른 측면은, 심혈관 질환 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자로부터 채취한 생체시료로부터 서열번호 1(FIEDVKNQE)의 펩타이드 조각 및 서열번호 2(IVVPLKDTR)의 펩타이드 조각으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 함량을 측정하고 정상 대조 군과 대비하여 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.Another aspect of the present invention relates to a method for diagnosing cardiovascular diseases, comprising the steps of: (1) isolating a peptide fragment of SEQ ID NO: 1 (FIEDVKNQE) and a peptide fragment of SEQ ID NO: 2 (IVVPLKDTR) from a biological sample obtained from a subject, Measuring the content of at least one selected protein, and diagnosing that there is a cardiovascular disease as compared with a normal control group.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 및 상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질의 함량을 측정하고 정상 대조 군과 대비하여 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.In another aspect of the present invention, the content of at least one of the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 and the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 is measured and compared with the normal control group, The method comprising the steps of: (a) diagnosing cardiovascular diseases;
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 옵스큐린(Obscurin) 단백질이며, 상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 티틴(Titin) 단백질인, 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.In another aspect of the present invention, the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 is Obscurin protein, and the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 is a protein of Titin, And provides a method of providing information for diagnosis.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 대상자의 생체시료 내에 서열번호 1(FIEDVKNQE)의 펩타이드 조각 및 서열번호 2(IVVPLKDTR)의 펩타이드 조각 중 어느 하나 이상의 수치가 정상 대조 군에 비하여 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for diagnosing a cardiovascular disease, comprising the steps of: (a) detecting the presence of a cardiovascular disease if the number of the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 (FIEDVKNQE) and the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 (IVVPLKDTR) Which provides information for early diagnosis of cardiovascular disease.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 펩타이드 조각은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심 분리하여 주 단백질인 알부민과 IgG를 제거하여 추출된 시료로부터 선별된 것인 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.In another aspect of the present invention, the peptide fragments are obtained by adding an aqueous solution of chilled acetone having a temperature of -70 ° C to 0 ° C at a concentration of 50 to 80% to a biological sample and centrifuging to remove albumin and IgG, Provides a method of providing information for early diagnosis of cardiovascular disease, selected from the sample.
본 발명의 또 다른 측면에서, 생체시료는 혈장(plasma), 뇨(urine), 객담(sputum), 세럼(serum)인 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.In another aspect of the present invention, a biological sample provides a method of providing information for early diagnosis of cardiovascular disease, such as plasma, urine, sputum, and serum.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 심혈관 질환은 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI), 불안정형 협심증 (Unstable Angina, UA) 및 안정형 협심증 (Stable Angina, SA)중 어느 하나 이상인, 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.In another aspect of the invention, the cardiovascular disease is selected from the group consisting of acute myocardial infarction (AMI), unstable angina (UA), and stable angina (SA) To provide an information providing method.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 단백질의 함량 측정은 단백질의 발현량을 측정하는 것이며, 상기 단백질의 발현량 측정은 액체 크로마토그래피 및 면역학적 에세이 법 중 어느 하나 이상을 사용하여 단백질의 발현량을 측정하는, 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.In yet another aspect of the present invention, the amount of the protein is measured by measuring the amount of expression of the protein, and the amount of expression of the protein is measured by using at least one of liquid chromatography and immunoassay, And provides an information providing method for early diagnosis of cardiovascular diseases.
이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일실시예에 따른 급성 심근경색 환자, 협심증 환자와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린, 티틴, 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1 이 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 진단 바이오 마커로서의 기능을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.Acute myocardial infarction in patients with acute myocardial infarction, angina pectoris, and normal persons according to an embodiment of the present invention, in which opsucilin, ttin, alpha-1-
1. 실험대상 선정 및 재료 준비1. Selection of subjects and preparation of materials
정상인과 심근경색 환자의 혈장시료 (44 ~ 75세, 남, 여 혼합)를 준비하였다. 정상인 22명, 급성심근경색환자 14명, 불안정 협심증 환자 14명, 안정 협심증 환자 14명의 혈장시료를 고대 병원에서 받았다. 모든 환자의 동의를 받아 혈액을 채취하였으며, 고려대 병원의 Institutional Review Board (KUGH12118-005)로부터 심혈관 진단 바이오 마커 발굴에 관한 허가를 받았다. 혈장에 존재하는 알부민 (Albumin)과 면역글로불린 G (Immunoglobulin G)를 제거하기 위해 ProteoExtract™ Albumin/IgG removal kit (EMD bioscience, Darm stadt, Germany)를 구입하였다. 아울러, 특허출원 제2016-108525호에 따른 냉장 아세톤 침전법을 수행하기 위해서 아세톤 (Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea)을 구입하였다. 트립신 분해에 필요한 암모니윰 바이카보네이트 (Ammonium bicarbonate), DL-디티오트레이톨 (DL-Dithiothreitol), 요오드아세트아미드 (Iodoacetamide), 및 트립신 (trypsin)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.Plasma samples (44-75 years old, male and female) of normal and myocardial infarction patients were prepared. We received plasma samples from 22 hospitals, 14 patients with acute myocardial infarction, 14 patients with unstable angina, and 14 patients with stable angina. Blood was collected with the consent of all patients, and the institutional review board (KUGH12118-005) of Korea University Hospital was authorized for the identification of cardiovascular diagnosis biomarkers. ProteoExtract ™ Albumin / IgG removal kit (EMD bioscience, Darmstadt, Germany) was purchased to remove albumin and immunoglobulin G from plasma. In addition, acetone (Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea) was purchased to carry out the refrigerated acetone precipitation method according to Patent Application No. 2016-108525. Ammonium bicarbonate, DL-Dithiothreitol, Iodoacetamide, and trypsin required for trypsin digestion were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., USA) .
2. 혈장으로부터 주 단백질인 알부민과 2. Plasma from the main protein albumin and IgG의Of IgG 제거 remove
2-1. 종래의 상업적 2-1. Conventional commercial 키트인KIT IN ProteoExtractProteoExtract ™ Albumin/™ Albumin / IgGIgG removal kit 이용하여 알부민과 Using a removal kit, IgG를IgG 제거 remove
정상인 22명과 심혈관 질환 환자 42명의 혈장 35 μl을 각각 준비하고 ProteoExtract™ Albumin/IgG removal kit에서 제공된 바인딩 버퍼 (binding buffer)로 혈장시료를 10배 희석한 후, 컬럼에 주입하여 중력으로 흘러내려가게 하였다. 여기에 바인딩 버퍼 (binding buffer) 600 μl씩 2번 주입하여 알부민, 또는 면역글로불린G의 항체에 결합하지 않은 미량의 단백질들을 씻어서 분리하였다. 두 번 추출하여 모아진 샘플은 동결건조기를 이용하여 밤새 말린 후, 분석 전까지 - 20℃ 냉동고에 넣어 보관하였다.Twenty-two normal subjects and 42 patients with cardiovascular disease were each prepared with 35 μl of plasma, diluted 10-fold with the binding buffer provided in the ProteoExtract ™ Albumin / IgG removal kit, and injected into the column to flow down gravity . In this case, 600 μl of binding buffer was injected two times to separate albumin or a small amount of proteins not bound to the antibody of immunoglobulin G by washing. The collected samples were dried overnight in a freeze dryer, and stored in a freezer at -20 ° C until analysis.
2-2. 냉장 아세톤 침전법을 이용하여 알부민과 2-2. Using the chilled acetone precipitation method, albumin and IgG를IgG 제거 remove
농도가 70%인 아세톤을 만들어 -20℃에 보관한 -10℃ 온도를 갖는 차가운 아세톤 수용액을 준비하였다. 정상인 22명과 심혈관 질환 환자 42명의 혈장시료 1.8 ml에 아세톤 수용액 7.2 ml을 넣고 잘 섞은 후, -20℃에 시료를 2시간 동안 보관하였다. 이후, 원심분리기를 이용하여 13000 g, 4℃에서 10분 동안 원심분리를 하였다. 상층 액은 따로 분주하였고 펠렛은 아세톤수용액 3.6 ml로 세척하여 같은 조건으로 원심분리를 한 후 분리된 상층 액을 첫 번째 분주한 상층 액과 혼합하였다. 펠렛은 위의 방법으로 다시 한번 세척하여 분리된 상층 액은 첫 번째, 두 번째 상층 액과 혼합하여 기체질소(Sinyang, Seoul, Korea)로 아세톤을 증발시키고 동결건조기(Freeze-Dryer)로 수용액을 밤새 건조하여, 분말상태로 -20℃에 분석 시까지 보관하였다. 펠렛은 상온에서 5 ~ 10분 동안 말린 후, -20℃에서 분석 시까지 보관하였다.Acetone having a concentration of 70% was prepared to prepare a cold acetone aqueous solution having a temperature of -10 캜 and stored at -20 캜. Twenty-two normal subjects and 42 cardiovascular patients (1.8 ml) were mixed with 7.2 ml of aqueous acetone solution and stored at -20 ° C for 2 hours. Thereafter, centrifugation was carried out at 13000 g and 4 ° C for 10 minutes using a centrifuge. The supernatant was dispensed separately. The pellet was washed with 3.6 ml of acetone aqueous solution, centrifuged under the same conditions, and the separated supernatant was mixed with the first supernatant. The pellet was washed again by the above method. The separated supernatant was mixed with the first and second supernatant, and the acetone was evaporated with gaseous nitrogen (Sinyang, Seoul, Korea) and the aqueous solution was treated with freeze- Dried and stored in powder at -20 ° C until analysis. The pellet was dried at room temperature for 5 to 10 minutes and stored at -20 ° C until analysis.
3. 단백질의 트립신 분해3. Trypsin digestion of protein
상기 2-1에서 얻은 시료 (알부민, IgG제거 혈장 단백질)와 상기 2-2에서 얻은 시료인 분말상태의 상층 액과 펠렛을 각각 50 mM 암모니윰 바이카보네이트 버퍼 (ammonium bicarbonate buffer) 100 μl와 1 ml로 녹였다. 500 mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 준비하여 시료에 넣어 최종농도를 20 mM로 만든 후, 60℃에서 한 시간 동안 보관하였다. 이후, 1 M 요오드아세트아미드 (Iodoacetamide)를 만들어 최종농도가 40 mM이 되도록 시료에 넣어준 후, 상온에서 30분 동안 어두운 곳에서 보관하였다. 다시 500 mM 디티오트레이톨 (Dithiothreitol)의 최종농도가 10 mM이 되도록 시료에 넣은 후, 트립신 (trypsin)을 1:30 비율(트립신: 단백질, w/w)로 처리하여 37℃에서 24시간 동안 보관하였다. 24시간 반응 후에는 분석 전까지 20℃에 보관하였다.The sample (albumin, IgG-removed plasma protein) obtained in 2-1 and the powdered supernatant and pellet obtained in 2-2 above were dissolved in 100 μl of 50 mM ammonium bicarbonate buffer and 1 ml Respectively. 500 mM dithiothreitol was prepared and put into a sample to make a final concentration of 20 mM and stored at 60 ° C for one hour. Then, 1 M iodoacetamide was added to the sample to give a final concentration of 40 mM, and then stored at room temperature for 30 minutes in a dark place. Then, trypsin was treated with trypsin at a ratio of 1:30 (trypsin: protein, w / w) for 24 hours at 37 ° C after being added to the sample so that the final concentration of 500 mM dithiothreitol was 10 mM Respectively. After 24 hours of reaction, the cells were stored at 20 ° C until analysis.
4. 염의 제거4. Removal of salts
상기 3에서 트립신 처리된 시료를 10% 아세토나이트릴 (J.T Baker, Center Valley, PA, USA)로 10배 희석한 후, 14000 g, 4℃에서 5분 동안 원심 분리하여 펠렛을 제거하였다. Oasis®1 cc extraction cartridges (Waters corporation, Milford, MA, USA)는 1 ml 메탄올 (J.T Baker, Center Valley, PA, USA)과 1 ml 증류수 (Millipore, Mosheim, France)를 주입하여 먼저 활성화시켰다. 준비된 시료를 주입하여 천천히 흘러내려가게 한 후, 1 ml 증류수로 두 번 세척하였다. 1 ml 의 50% 메탄올로 시료를 천천히 추출하여 분주하였다. 추출된 시료는 동결건조기로 밤새 건조하여 분말상태로 -20℃에 분석 시까지 보관하였다.The sample treated with trypsin in 3 above was diluted 10-fold with 10% acetonitrile (J.T Baker, Center Valley, PA, USA) and centrifuged at 14000 g for 5 minutes at 4 ° C to remove the pellet.
5. 고분해능 액체크로마토그래피-질량분석기 (LC-MS/MS)를 이용한 분석5. Analysis by high resolution liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS / MS)
상기 4에서 준비된 시료인 알부민과 IgG가 제거되고 트립신으로 분해된 혈장시료를 0.2% 포름산 (formic acid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 포함된 증류수 35 μl로 녹인 후, LTQ Orbitrap Velos Pro 질량분석기 (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA)와 연결된 Ultimate 3000 액체크로마토그래피 (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 용매는 0.2% 포름산(formic acid)과 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN)이 포함된 90% 증류수와 0.2% 포름산 (formic acid)이 포함된 10% 증류수를 제조하였다. 컬럼 (Aeris widepore 3.6 μm XB-C18, 100 x 1.7 mm)은 SUNGMOON SYSTECH LTD., CO. (Seoul, Korea)에서 구입하여 연결하였고, 두 용매는 0.350 ml/min으로 30분 동안 흘려주었다. 사용된 용매는 A: 10 % ACN with 0.2 % FA; B: 90 % ACN with 0.2 % FA 였고, 용매의 조성과 이동속도는 아래 표 1과 같다.Albumin and IgG were removed and the tryptic-degraded plasma samples were dissolved in 35 μl of distilled water containing 0.2% formic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, Calif., USA) coupled to a Velos Pro mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA). The solvent was 10% distilled water containing 0.2% formic acid and acetonitrile (ACN) containing 90% distilled water and 0.2% formic acid. The column (Aeris widepore 3.6 μm XB-C18, 100 x 1.7 mm) is available from SUNGMOON SYSTECH LTD., CO. (Seoul, Korea), and the two solvents were flowed at 0.350 ml / min for 30 minutes. The solvents used were A: 10% ACN with 0.2% FA; B: 90% ACN with 0.2% FA, and the composition and movement speed of the solvent are shown in Table 1 below.
정상인과 환자시료의 정량분석을 위해서는 multi reaction monitoring (MRM) 방법이 사용되었고, 표 2에서 보여진 것처럼 parent ion을 잡아서 collision energy 25~35%로 fragment ions를 만든 후, 가장 intensity가 높은 fragment ion을 검출하는 방법으로 정량분석을 진행하였다.Multi-reaction monitoring (MRM) was used for the quantitative analysis of normal and patient samples. As shown in Table 2, fragment ions were obtained with 25 ~ 35% collision energy by the parent ion as shown in Table 2, And the quantitative analysis was carried out.
(Parent Ion, m/z)(Parent Ion, m / z)
(Collision Energy, CE)(Collision Energy, CE)
(Fragment Ion, m/z)(Fragment Ion, m / z)
도면 1은 위의 방법으로 측정한 정상인과 AMI 환자시료의 크로마토그램이다.Figure 1 is the chromatogram of normal and AMI patient samples as measured by the above method.
6. Mascot를 이용한 단백질 및 펩타이드 동정6. Identification of proteins and peptides using Mascot
액체크로마토그래피-질량분석기를 통해 검출된 피크는 Mascot (Matrix science Inc. Boston, MA, USA) 프로그램을 이용하여 단백질 동정을 실시하였다. NCBI human data base를 사용하였고, 서로 다른 그룹간의 통계적 처리는 chi-square test를 사용하였고, 정상인과 환자 군의 바이오 마커 조각 펩타이드의 측정값을 비교하는 그래프는 Tukey multiple comparison을 사용하였다. 특이도 (specificity), 민감도 (sensitivity), 및 ROC (receiver operating curves)는 MedCalc ver 7.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium)를 사용하여 계산하였다. P값은 student's-test를 사용하였고, 계산된 P값이 0.05보다 작으면 통계적으로 유의미하다고 판단하였다. Liquid chromatography - Peaks detected by mass spectrometry were identified by protein analysis using Mascot (Matrix science Inc. Boston, Mass., USA) program. The NCBI human data base was used. The chi-square test was used for the statistical treatment between the different groups. Tukey multiple comparison was used for graphs comparing the measurements of the biomarker fragment peptides in the normal and patient groups. Specificity, sensitivity, and receiver operating curves (ROC) were calculated using MedCalc ver 7.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium). Student's test was used for the P value and statistically significant if the calculated P value was less than 0.05.
도면 2은 위의 방법으로 발견한 단백질의 조각 펩타이드 리스트이다. 심혈관 질환 환자와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 옵스큐린 (Obscurin); m/z 561.27 --> 861.31, 티틴 (Titin); m/z 520.82 --> 765.40, 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1 (alpha-1-acid glycoprotein 1); m/z 871.90--> 853.52 가 정상인에 비해 급성 심근경색 환자에게서 높게 발현되어 있음을 확인하였다. 마스코트를 사용하여 동정한 바이오 마커 후보군 중에 정상인과 환자시료를 MRM을 사용하여 정량 분석하여 통계적으로 분석한 후, 의미 있는 바이오 마커 후보군을 선정하였다. Figure 2 is a fragment peptide list of proteins found by the above method. Obscurin, which specifically expresses differentiation from plasma of cardiovascular disease patients and normal people; m / z 561.27 - > 861.31, Titin; m / z 520.82 - > 765.40, alpha-1-
7-1. 바이오 마커 후보군 선정7-1. Selection of candidates for biomarkers
정상인과 환자 군의 시료를 1-4의 방법으로 전처리 한 후, 레벨의 증감을 LC-MS/MS MRM (multi reaction monitoring)으로 정량 분석 하여, 유의미하게 증가한 단백질을 선정하여 최종적으로 도 3에 나타내었다. 옵스큐린 (Obscurin); m/z 561.27 --> 861.31, 티틴 (Titin); m/z 520.82 --> 765.40, 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1 (alpha-1-acid glycoprotein 1); m/z 871.90--> 853.52 의 세종의 단백질의 조각 펩타이드를 측정했을 때, P값이 0.0001보다 작고, 특이 도와 민감도가 높은 통계결과를 보여주었다 (표 3).After the samples of the normal and patient groups were pretreated by methods 1-4, the increase and decrease of the levels were quantitatively analyzed by LC-MS / MS MRM (multi reaction monitoring), and the significantly increased proteins were selected and finally shown in FIG. . Obscurin; m / z 561.27 - > 861.31, Titin; m / z 520.82 - > 765.40, alpha-1-
[표 3] 바이오 마커 후보군의 정상인과 환자에서의 MRM 정량분석 결과[Table 3] Quantitative analysis of MRM in normal subjects and patients in the biomarker candidate group
7-2. 면역학적 에세이를 통한 바이오 마커 후보군의 정량분석7-2. Quantitative analysis of biomarker candidates through immunological essay
본 발명에서 선정한 상기 세종의 심혈관 질환 바이오 마커 후보군 중 ELISA Kit를 구매할 수 있는 옵스큐린 (Obscurin), 티틴 (Titin), 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1 (alpha-1-acid glycoprotein 1)의 농도를 측정하여 도 4에 나타내었다. 도 4를 보면, 바이오 마커 후보군 중 옵스큐린 티틴은 단백질이 정상인 (Healthy Controls)에 비해, 급성심근경색(AMI), 안정형 협심증 (SA), 불안정형 협심증(UA) 환자 군에서 유의미하게 증가되었음을 보여준다. 옵스큐린은 협심증환자 (UA, SA)와 급성 심근경색 환자 (AMI) 에게서 모두 정상인과 유의성 있게 차이가 남을 확인하였고, 티틴의 경우, 불안정형 협심증환자와 급성 심근경색 환자에게서만 정상인과 유의성 있는 차이를 보였다. 알파-1-에시드 글라이코프로테인 1의 경우, 정상인과 환자의 정량분석결과가 통계적으로 유의미하지 않았다.The concentration of obscurin, titin, alpha-1-
따라서, 본 발명에 따른 신규 바이오 마커인 옵스큐린 (Obscurin)과 티틴 (Titin)은 단백질은 각각 또는 동시에 측정함으로써, 민감도 80% 이상, 특이도 90% 이상의 높은 정확도와 불안정 협심증 단계에서의 높은 예측 적중률 (70% 이상)을 얻을 수 있는 진단 키트로 제공될 수 있으며, 건강검진 단계에서 심혈관 질환 특히 급성 심근경색 고위험군에 관한 정보를 제공하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 실험결과를 도면에 보이지는 않았지만, 심혈관 질환 고위험군의 지표로 활용되고 있는 BNP를 본 발명에 사용한 정상인과 심혈관 질환 환자 시료를 활용하여 정량 분석한 결과, 정상인에 대한 심혈관 질환 환자의 민감도는 60%, 특이 도는 80%이고, 이는 협심증 단계에서 민감도 73%, 특이도 100%를 보인 옵스큐린에 비해 심혈관 질환 예측율이 낮은 편이다. Obscurin and Titin, which are novel biomarkers according to the present invention, have a high sensitivity of 80% or more and a specificity of 90% or more and a high prediction accuracy rate of unstable angina pectoris (70% or more), and may be useful for providing information about cardiovascular disease, especially acute myocardial infarction, at high risk. The results of the quantitative analysis of BNP, which is not shown in the drawing but used as an indicator of high risk of cardiovascular disease, using normal and cardiovascular disease patients used in the present invention, showed that the sensitivity of cardiovascular disease to normal persons was 60% The specificity is 80%, which is lower than the obsessive - compulsive obsessive - compulsive disorder with 73% sensitivity and 100% specificity.
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> A composition for early diagnosis of cardiovascular disease using
a peptide derived from Obscurin or Titin protein, a kif for early
diagnosis of cardiovascular disease, and method for information
for early diagnosis of cardiovascular disease
<130> K09040_DP-2017-00289
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide fragment of the Obscurin protein
<400> 1
Phe Ile Glu Asp Val Lys Asn Gln Glu
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide fragment of the Titin protein
<400> 2
Ile Val Val Pro Leu Lys Asp Thr Arg
1 5
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> A composition for early diagnosis of cardiovascular disease using
a peptide derived from Obscurin or Titin protein, a kif for early
diagnosis of cardiovascular disease, and method for information
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide fragment of the Obscurin protein
<400> 1
Phe Ile Glu Asp Val Lys
Claims (17)
A peptide fragment of SEQ ID NO: 1, and a peptide fragment of SEQ ID NO: 2. 2. The composition for early diagnosis of cardiovascular diseases according to claim 1, wherein the expression level of at least one protein selected from the group consisting of SEQ ID NO:
상기 단백질은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심 분리하여 주 단백질인 알부민과 IgG를 제거하여 추출된 시료로부터 선별된 것인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
The method according to claim 1,
The protein is obtained by adding an aqueous solution of chilled acetone having a concentration of 50 to 80% at a temperature of -70 ° C to 0 ° C to a biological specimen, centrifuging it to remove albumin and IgG as main proteins, Composition for early diagnosis.
상기 생체시료는 혈장(plasma), 뇨(urine), 객담(sputum) 또는 세럼(serum)인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
3. The method of claim 2,
Wherein the biological sample is plasma, urine, sputum or serum. 2. The composition for early diagnosis of cardiovascular diseases according to claim 1, wherein the biological sample is plasma, urine, sputum or serum.
상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 및 상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질에 대하여 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
The method according to claim 1,
A composition comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 1, and a protein fragment comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 2. 2. The composition for early detection of cardiovascular diseases according to claim 1,
상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 옵스큐린(Obscurin) 단백질이며,
상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 티틴(Titin) 단백질인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
5. The method of claim 4,
The protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 is an Obscurin protein,
Wherein the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 is a Titin protein.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 서열번호 1의 펩타이드 조각 및 서열번호 2의 펩타이드 조각으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 특이적인 항체인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the agent for measuring the expression level of the protein is an antibody specific to at least one selected from the group consisting of a peptide fragment of SEQ ID NO: 1 and a peptide fragment of SEQ ID NO: 2.
상기 항체는 단 클론항체 또는 다 클론항체인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
The method according to claim 6,
Wherein the antibody is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
상기 심혈관 질환은 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI), 불안정형 협심증 (Unstable Angina, UA) 및 안정형 협심증 (Stable Angina, SA)중 어느 하나 이상인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the cardiovascular disease is at least one of acute myocardial infarction (AMI), unstable angina (UA), and stable angina (SA).
A kit for early diagnosis of cardiovascular diseases comprising the composition of any one of claims 1 to 8.
In order to provide information necessary for early diagnosis of cardiovascular disease, the content of at least one protein selected from the group consisting of the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 and the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 was measured from the biological sample collected from the subject, A method for diagnosing cardiovascular disease as compared to a method for providing information for early diagnosis of cardiovascular disease.
상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 및 상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질의 함량을 측정하고 정상 대조군과 대비하여 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법.
11. The method of claim 10,
And measuring the content of at least one of the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 and the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 and diagnosing the presence of a cardiovascular disease as compared to the normal control, Information provision method for early diagnosis.
상기 서열번호 1의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 옵스큐린(Obscurin) 단백질이며,
상기 서열번호 2의 펩타이드 조각을 포함하는 단백질은 티틴(Titin) 단백질인, 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법.
12. The method of claim 11,
The protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 is an Obscurin protein,
Wherein the protein comprising the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 is a Titin protein.
상기 대상자의 생체시료 내에 서열번호 1의 펩타이드 조각 및 서열번호 2의 펩타이드 조각 중 어느 하나 이상의 수치가 정상 대조군에 비하여 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법.
11. The method of claim 10,
Wherein the number of the peptide fragments of SEQ ID NO: 1 and the peptide fragments of SEQ ID NO: 2 is higher than that of the normal control group in the biological specimen of the subject, thereby diagnosing a cardiovascular disease.
상기 펩타이드 조각은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심 분리하여 주 단백질인 알부민과 IgG를 제거하여 추출된 시료로부터 선별된 것인 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법.
11. The method of claim 10,
The peptide fragments were obtained by adding an aqueous solution of chilled acetone having a concentration of 50 to 80% at a temperature of -70 ° C to 0 ° C to a biological specimen and centrifuging to remove the main proteins albumin and IgG, Information provision method for early diagnosis.
생체시료는 혈장(plasma), 뇨(urine), 객담(sputum) 또는 세럼(serum)인 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법.
13. The method of claim 12,
Wherein the biological sample is plasma, urine, sputum or serum.
상기 심혈관 질환은 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI), 불안정형 협심증 (Unstable Angina, UA) 및 안정형 협심증 (Stable Angina, SA)중 어느 하나 이상인, 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법.
11. The method of claim 10,
Wherein the cardiovascular disease is at least one of acute myocardial infarction (AMI), unstable angina (UA), and stable angina (SA).
상기 단백질의 함량 측정은 단백질의 발현량을 측정하는 것이며, 상기 단백질의 발현량 측정은 액체 크로마토그래피 및 면역학적 에세이 법 중 어느 하나 이상을 사용하여 단백질의 발현량을 측정하는, 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법.
11. The method of claim 10,
The expression level of the protein is measured by measuring the expression level of the protein by using at least one of liquid chromatography and immunoassay. The expression level of the protein is measured by an early diagnosis of cardiovascular disease Information providing method.
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2017
- 2017-09-28 KR KR1020170126232A patent/KR102004694B1/en active IP Right Grant
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