JP2016185102A - Nucleic acid amplifying device - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、核酸増幅装置に関する。 The present application relates to a nucleic acid amplification apparatus.
従来、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid：デオキシリボ核酸）等の核酸にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）を起こさせて、核酸を増幅させる核酸増幅装置が知られている。また、核酸の増幅機構に加えて核酸の検出部を備え、増幅した核酸をリアルタイムに検出することができる核酸増幅装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。このような核酸増幅装置は、リアルタイムＰＣＲ装置と呼ばれている。 2. Description of the Related Art Conventionally, nucleic acid amplification apparatuses that amplify nucleic acids by causing a polymerase chain reaction (PCR) to occur in nucleic acids such as DNA (Deoxyribonucleic Acid) are known. In addition, a nucleic acid amplification apparatus that includes a nucleic acid detection unit in addition to a nucleic acid amplification mechanism and can detect amplified nucleic acid in real time is known (for example, see Patent Document 1). Such a nucleic acid amplification device is called a real-time PCR device.
リアルタイムＰＣＲ装置は、ＤＮＡや蛍光物質等を含む反応試料の温度を制御してＤＮＡを増幅させる。また、リアルタイムＰＣＲ装置は、反応試料を励起させる励起光を照射し、その際に反応試料から発生する蛍光に基づいて増幅されたＤＮＡを測定する。 The real-time PCR apparatus amplifies DNA by controlling the temperature of a reaction sample containing DNA, a fluorescent substance, and the like. The real-time PCR apparatus irradiates excitation light that excites the reaction sample, and measures the amplified DNA based on the fluorescence generated from the reaction sample.
上述した核酸増幅装置では、反応試料を収容する窪みが複数設けられている樹脂製の反応容器が用いられていた。また、反応容器は、一般にアルミニウムを材料とする反応ブロックの上に置かれ、反応ブロックの加熱、冷却によって反応試料の温度が制御されていた。 In the nucleic acid amplification apparatus described above, a resin reaction vessel provided with a plurality of depressions for accommodating reaction samples has been used. Further, the reaction vessel is generally placed on a reaction block made of aluminum, and the temperature of the reaction sample is controlled by heating and cooling the reaction block.
核酸は、所定の温度サイクルを繰り返すことで増幅する。反応容器のすべての窪みで同じように核酸を増幅させるためには、反応容器のいずれの位置においても反応試料が正確に同じ温度とされることが望ましい。しかしながら、従来の核酸増幅装置では、反応容器の窪みの位置、すなわち反応ブロック上の位置によって温度差が生じるおそれがあった。反応ブロック上の位置によって温度差が生じた場合、各窪みで核酸の増幅率にばらつきが生じ得る。 The nucleic acid is amplified by repeating a predetermined temperature cycle. In order to amplify the nucleic acid in the same manner in all the depressions of the reaction vessel, it is desirable that the reaction sample be at exactly the same temperature at any position of the reaction vessel. However, in the conventional nucleic acid amplification apparatus, there is a possibility that a temperature difference may occur depending on the position of the recess in the reaction container, that is, the position on the reaction block. When a temperature difference occurs depending on the position on the reaction block, the nucleic acid amplification rate may vary in each depression.
本願はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、反応容器全体でより均一に核酸を増幅させる技術を提供することにある。 The present application has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a technique for amplifying nucleic acids more uniformly in the entire reaction vessel.
上記課題を解決するために、本願のある態様の核酸増幅装置は、核酸を含む反応試料を収納する窪みが複数配列される反応容器を保持する保持部と、保持部を加熱及び冷却して、反応試料の温度を調節する熱電素子と、保持部の温度を検出する温度センサと、温度センサの検出結果に基づいて、保持部が所定の温度サイクルで加熱及び冷却されるよう熱電素子を制御する制御部と、を備える。熱電素子は、熱電素子と保持部とが重なる方向から見て、保持部の第１領域と重なる第１熱電素子と、保持部の第１領域とは異なる第２領域と重なる第２熱電素子とを少なくとも含む。温度センサは、第２熱電素子に対してよりも第１熱電素子に対してより近接する第１温度センサと、第１熱電素子に対してよりも第２熱電素子に対してより近接する第２温度センサとを少なくとも含む。制御部は、少なくとも第１温度センサの検出結果と第２温度センサの検出結果とを組み合わせて得られる温度情報に基づいて、第１熱電素子及び第２熱電素子を制御する。 In order to solve the above problems, a nucleic acid amplification device according to an aspect of the present application includes a holding unit that holds a reaction vessel in which a plurality of depressions that store nucleic acid-containing reaction samples are arranged, and heating and cooling the holding unit, Based on the thermoelectric element that adjusts the temperature of the reaction sample, the temperature sensor that detects the temperature of the holding part, and the detection result of the temperature sensor, the thermoelectric element is controlled so that the holding part is heated and cooled in a predetermined temperature cycle. A control unit. The thermoelectric element includes a first thermoelectric element that overlaps the first area of the holding part and a second thermoelectric element that overlaps a second area different from the first area of the holding part when viewed from the direction in which the thermoelectric element and the holding part overlap. At least. The temperature sensor includes a first temperature sensor closer to the first thermoelectric element than to the second thermoelectric element and a second closer to the second thermoelectric element than to the first thermoelectric element. And at least a temperature sensor. The control unit controls the first thermoelectric element and the second thermoelectric element based on temperature information obtained by combining at least the detection result of the first temperature sensor and the detection result of the second temperature sensor.
本願によれば、反応容器全体でより均一に核酸を増幅させる技術を提供することができる。 According to the present application, it is possible to provide a technique for amplifying a nucleic acid more uniformly in the entire reaction container.
以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。 The present invention will be described below based on preferred embodiments with reference to the drawings. The embodiments do not limit the invention but are exemplifications, and all features and combinations described in the embodiments are not necessarily essential to the invention.
図１は、実施の形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す側面図である。図２は、実施の形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す平面図である。図１及び図２では、核酸増幅装置１の内部を透視した状態が図示されている。また、構造の一部は断面図で描かれている。本実施の形態に係る核酸増幅装置１は、ＤＮＡ等の核酸と蛍光物質等を含む液体状の反応試料の温度を制御して核酸を増幅させ、増幅した核酸の状態を光学的な測定方法により検出することができる装置である。 FIG. 1 is a side view schematically showing a nucleic acid amplification apparatus according to an embodiment. FIG. 2 is a plan view schematically showing the nucleic acid amplification device according to the embodiment. In FIG.1 and FIG.2, the state which saw through the inside of the nucleic acid amplifier 1 is shown in figure. A part of the structure is drawn in a sectional view. The nucleic acid amplification device 1 according to the present embodiment controls the temperature of a liquid reaction sample containing a nucleic acid such as DNA and a fluorescent substance to amplify the nucleic acid, and the state of the amplified nucleic acid is measured by an optical measurement method. It is a device that can detect.
核酸増幅装置１は、本体１５と、本体１５の前方に取り付けられたカバー１６とを備える。本体１５には、反応容器２０、カバー２２、反応ユニット１００、制御部２４、光源３０、回転部３１、フィルタ部３２，３３、モータ３４、及びカメラ３５が設けられる。 The nucleic acid amplification device 1 includes a main body 15 and a cover 16 attached to the front of the main body 15. The main body 15 is provided with a reaction vessel 20, a cover 22, a reaction unit 100, a control unit 24, a light source 30, a rotation unit 31, filter units 32 and 33, a motor 34, and a camera 35.
カバー１６は、核酸増幅装置１の使用者が反応容器２０を取替えられるよう、前後に移動可能に本体１５に設置される。カバー１６は、後方に移動した際に本体１５の内部に収納される。図１では、カバー１６が前方に移動された状態が図示されている。本体１５とカバー１６との間には、遮光部材（図示せず）が取付けられる。これにより、核酸増幅装置１の内部空間が遮光される。カバー１６の内側には、反射鏡２５、フレネルレンズ２６が設置される。 The cover 16 is installed on the main body 15 so as to be movable back and forth so that the user of the nucleic acid amplification device 1 can replace the reaction container 20. The cover 16 is housed inside the main body 15 when moved backward. FIG. 1 illustrates a state where the cover 16 is moved forward. A light shielding member (not shown) is attached between the main body 15 and the cover 16. Thereby, the internal space of the nucleic acid amplification device 1 is shielded from light. A reflection mirror 25 and a Fresnel lens 26 are installed inside the cover 16.
反応容器２０には、核酸と蛍光物質等を含む液体状の反応試料を収納する窪みが、複数配列されている。本実施の形態では、縦横等間隔で縦に６個、横に１０個の計６０個の窪みが反応容器２０に形成されている。なお、窪みの数は特に限定されず、例えば縦に８個、横に１２個の計９６個の窪みが形成されていてもよい。反応容器２０は、後述する保持部の熱を効率よく反応試料に伝えるために樹脂製の薄板からなる。反応容器２０の裏面側は、窪みに応じた凸形状になっている。本実施の形態では、反応試料中の核酸は、蛍光物質が励起されると２種類の異なる波長の蛍光Ｌ１，Ｌ２を発生するように、蛍光標識されている。 In the reaction container 20, a plurality of depressions for storing liquid reaction samples containing nucleic acids and fluorescent substances are arranged. In the present embodiment, a total of 60 depressions are formed in the reaction vessel 20 in the vertical and horizontal equal intervals, 6 vertically and 10 horizontally. In addition, the number of depressions is not particularly limited, and for example, a total of 96 depressions of 8 vertically and 12 horizontally may be formed. The reaction vessel 20 is made of a thin resin plate in order to efficiently transfer the heat of the holding unit described later to the reaction sample. The back side of the reaction vessel 20 has a convex shape corresponding to the depression. In the present embodiment, the nucleic acid in the reaction sample is fluorescently labeled so as to generate two different types of fluorescence L1 and L2 when the fluorescent substance is excited.
反応ユニット１００は、反応容器２０を保持し、制御部２４の指示に基づいて反応容器２０の温度を調節する。反応ユニット１００については後に詳細に説明する。 The reaction unit 100 holds the reaction vessel 20 and adjusts the temperature of the reaction vessel 20 based on an instruction from the control unit 24. The reaction unit 100 will be described in detail later.
カバー２２は、反応容器２０を覆う部材である。カバー２２により、反応容器２０が加熱された際に反応試料が蒸発することを防ぐことができる。カバー２２には、反応試料を励起させる励起光や、反応試料からの蛍光が透過するよう、光透過性のフィルム等が用いられる。 The cover 22 is a member that covers the reaction vessel 20. The cover 22 can prevent the reaction sample from evaporating when the reaction vessel 20 is heated. The cover 22 is made of a light-transmitting film or the like so that excitation light for exciting the reaction sample and fluorescence from the reaction sample are transmitted.
制御部２４は、ハードウェア構成としてはコンピュータのＣＰＵやメモリをはじめとする素子や回路で実現され、ソフトウェア構成としてはコンピュータプログラム等によって実現される。制御部２４には、各種プログラム及びデータが記憶される。制御部２４は、記憶されているプログラムを実行して、核酸増幅装置１の各部を制御する。例えば、制御部２４は、核酸が増幅するように反応ユニット１００による反応容器２０の温度調節を制御する。また、制御部２４は、光源３０の点消灯やモータ３４の回転を制御する。なお、制御部２４は、本体１５の外部に設けられてもよい。制御部２４については後に詳細に説明する。 The control unit 24 is realized by an element and a circuit including a CPU and a memory of a computer as a hardware configuration, and is realized by a computer program and the like as a software configuration. The control unit 24 stores various programs and data. The control unit 24 executes each stored program to control each unit of the nucleic acid amplification device 1. For example, the control unit 24 controls the temperature adjustment of the reaction container 20 by the reaction unit 100 so that the nucleic acid is amplified. Further, the control unit 24 controls turning on / off of the light source 30 and rotation of the motor 34. The control unit 24 may be provided outside the main body 15. The controller 24 will be described later in detail.
反射鏡２５は、フィルタ部３２，３３からの励起光をフレネルレンズ２６に向けて反射する。また、反射鏡２５は、反応試料からの蛍光をカメラ３５に向けて反射する。フレネルレンズ２６は、反射鏡２５で反射される励起光を、フレネルレンズ２６の光軸に平行な状態に収束させて透過させる。 The reflecting mirror 25 reflects the excitation light from the filter units 32 and 33 toward the Fresnel lens 26. The reflecting mirror 25 reflects the fluorescence from the reaction sample toward the camera 35. The Fresnel lens 26 converges and transmits the excitation light reflected by the reflecting mirror 25 in a state parallel to the optical axis of the Fresnel lens 26.
光源３０は、本体１５の側面（−Ｙ側の側面）に設置される。光源３０は、例えばハロゲンランプであり、励起光を含む光を照射する。 The light source 30 is installed on the side surface (the side surface on the −Y side) of the main body 15. The light source 30 is a halogen lamp, for example, and irradiates light including excitation light.
回転部３１は、いわゆるターレット式の回転装置である。回転部３１には、反応試料からの蛍光を観測する際に用いられるフィルタ部３２，３３が装着される。回転部３１は、回転板６０，６１、及び回転軸６２を有する。回転部３１は、回転板６０と回転板６１との間に、例えば最大６つのフィルタ部を装着することができる。 The rotating unit 31 is a so-called turret type rotating device. The rotating unit 31 is equipped with filter units 32 and 33 used when observing fluorescence from the reaction sample. The rotating unit 31 includes rotating plates 60 and 61 and a rotating shaft 62. For example, a maximum of six filter units can be mounted between the rotating plate 60 and the rotating plate 61 in the rotating unit 31.
回転板６０は、カメラ３５側に配置される。回転板６０には、フィルタ部３２，３３が装着される位置に、蛍光を通過させる丸窓が設けられる。回転板６１は、反射鏡２５側に配置される。回転板６１には、フィルタ部３２，３３が装着される位置に、励起光及び蛍光を通過させる角窓が設けられる。回転軸６２は、回転板６０，６１と、回転板６０，６１に装着されたフィルタ部３２，３３とを回転させる。 The rotating plate 60 is disposed on the camera 35 side. The rotary plate 60 is provided with a round window through which fluorescence passes at a position where the filter parts 32 and 33 are mounted. The rotating plate 61 is disposed on the reflecting mirror 25 side. The rotating plate 61 is provided with a square window that allows excitation light and fluorescence to pass through at positions where the filter portions 32 and 33 are mounted. The rotating shaft 62 rotates the rotating plates 60 and 61 and the filter portions 32 and 33 attached to the rotating plates 60 and 61.
本実施の形態では、フィルタ部３３は、フィルタ部３２が設置される位置から回転軸６２周りに１８０度ずれた位置に装着される。回転部３１は、フィルタ部３２，３３のいずれかを光源３０と対向する位置に移動させ、光源３０からの光をフィルタ部に入射させる。なお、「光源３０と対向する位置」とは、光源３０の光軸と、フィルタ部が有する光学フィルタとが交わる位置をいう。図２では、フィルタ部３２が光源３０と対向する位置にある状態が図示されている。 In the present embodiment, the filter unit 33 is mounted at a position shifted by 180 degrees around the rotation shaft 62 from the position where the filter unit 32 is installed. The rotating unit 31 moves one of the filter units 32 and 33 to a position facing the light source 30 and causes light from the light source 30 to enter the filter unit. The “position facing the light source 30” refers to a position where the optical axis of the light source 30 and the optical filter included in the filter section intersect. In FIG. 2, a state in which the filter unit 32 is in a position facing the light source 30 is illustrated.
フィルタ部３２は、蛍光Ｌ１を観測する際に用いられる。フィルタ部３２は、箱状のフィルタキューブ７０と、光学フィルタ７１，７３と、ダイクロイックミラー７２とを有する。光学フィルタ７１，７３及びダイクロイックミラー７２は、フィルタキューブ７０に取り付けられる。 The filter unit 32 is used when observing the fluorescence L1. The filter unit 32 includes a box-shaped filter cube 70, optical filters 71 and 73, and a dichroic mirror 72. The optical filters 71 and 73 and the dichroic mirror 72 are attached to the filter cube 70.
光学フィルタ７１は、光源３０からの光のうち反応試料を励起させる励起光を透過させるバンドパスフィルタである。ダイクロイックミラー７２は、反応試料に励起光を照射すべく、光学フィルタ７１を透過した励起光を反射鏡２５に向けて反射する。ダイクロイックミラー７２で反射された励起光は、反射鏡２５でさらに反射され、フレネルレンズ２６を透過して反応容器２０に照射される。また、ダイクロイックミラー７２は、励起される反応試料から発生する蛍光Ｌ１，Ｌ２を透過させる。光学フィルタ７３は、ダイクロイックミラー７２を透過した蛍光Ｌ１を選択的に透過させるバンドパスフィルタである。 The optical filter 71 is a band-pass filter that transmits excitation light that excites the reaction sample in the light from the light source 30. The dichroic mirror 72 reflects the excitation light transmitted through the optical filter 71 toward the reflection mirror 25 so as to irradiate the reaction sample with excitation light. The excitation light reflected by the dichroic mirror 72 is further reflected by the reflecting mirror 25, passes through the Fresnel lens 26, and is irradiated on the reaction vessel 20. Further, the dichroic mirror 72 transmits the fluorescence L1 and L2 generated from the excited reaction sample. The optical filter 73 is a band-pass filter that selectively transmits the fluorescence L1 that has passed through the dichroic mirror 72.
フィルタ部３３は、蛍光Ｌ２を観測する際に用いられる。フィルタ部３３は、箱状のフィルタキューブ８０と、光学フィルタ８１，８３と、ダイクロイックミラー８２とを有する。光学フィルタ８１，８３及びダイクロイックミラー８２は、フィルタキューブ８０に取り付けられる。 The filter unit 33 is used when observing the fluorescence L2. The filter unit 33 includes a box-shaped filter cube 80, optical filters 81 and 83, and a dichroic mirror 82. The optical filters 81 and 83 and the dichroic mirror 82 are attached to the filter cube 80.
光学フィルタ８１は、光学フィルタ７１と同様に、光源３０からの光のうち反応試料を励起させる励起光を透過させるバンドパスフィルタである。ダイクロイックミラー８２は、光学フィルタ８１を透過した励起光を反射鏡２５に向けて反射するとともに、反応試料からの蛍光Ｌ１，Ｌ２を透過させる。光学フィルタ８３は、ダイクロイックミラー８２を透過した蛍光Ｌ２を選択的に透過させるバンドパスフィルタである。 Similar to the optical filter 71, the optical filter 81 is a bandpass filter that transmits excitation light that excites the reaction sample in the light from the light source 30. The dichroic mirror 82 reflects the excitation light transmitted through the optical filter 81 toward the reflecting mirror 25 and transmits the fluorescence L1 and L2 from the reaction sample. The optical filter 83 is a bandpass filter that selectively transmits the fluorescence L2 that has passed through the dichroic mirror 82.
モータ３４は、制御部２４の指示により回転軸６２を回転させる。モータ３４は、例えばステッピングモータである。カメラ３５は、蛍光Ｌ１，Ｌ２を受光して撮影する。この結果、核酸増幅装置１の使用者は、増幅された核酸の量等を検出することができる。 The motor 34 rotates the rotating shaft 62 according to an instruction from the control unit 24. The motor 34 is, for example, a stepping motor. The camera 35 receives and captures the fluorescence L1 and L2. As a result, the user of the nucleic acid amplification device 1 can detect the amount of amplified nucleic acid and the like.
続いて、反応ユニット１００の構造について詳細に説明する。図３は、反応ユニット１００を模式的に示す斜視図である。図４は、反応ユニット１００の分解斜視図である。図５は、温度調節部１０６の構造と、保持部１０２及び温度調節部１０６の位置関係とを模式的に示す平面図である。図５では、制御部２４を、ハードウェア構成及びソフトウェア構成の連携によって実現される機能ブロックとして描いている。反応ユニット１００は、保持部１０２、保持部ベース１０４、温度調節部１０６及び放熱部１０８を主な構成として有する。 Next, the structure of the reaction unit 100 will be described in detail. FIG. 3 is a perspective view schematically showing the reaction unit 100. FIG. 4 is an exploded perspective view of the reaction unit 100. FIG. 5 is a plan view schematically showing the structure of the temperature control unit 106 and the positional relationship between the holding unit 102 and the temperature control unit 106. In FIG. 5, the control unit 24 is depicted as a functional block realized by cooperation of the hardware configuration and the software configuration. The reaction unit 100 includes a holding unit 102, a holding unit base 104, a temperature adjusting unit 106, and a heat radiating unit 108 as main components.
保持部１０２は、温調ブロックあるいは反応ブロックとも称され、反応容器２０を保持する平板状の部材である。保持部１０２の一方の主表面には、反応容器２０の裏面側の凸部が収納される穴が設けられる。反応容器２０は、保持部１０２の一方の主表面上に裁置される。保持部１０２は、熱伝導性を有する。保持部１０２の材料としては、アルミニウム等の熱伝導性の高い金属を用いることができる。 The holding unit 102 is also called a temperature control block or a reaction block, and is a flat plate-like member that holds the reaction vessel 20. One main surface of the holding part 102 is provided with a hole for accommodating the convex part on the back side of the reaction vessel 20. The reaction vessel 20 is placed on one main surface of the holding unit 102. The holding part 102 has thermal conductivity. As a material of the holding portion 102, a metal having high thermal conductivity such as aluminum can be used.
保持部ベース１０４は、保持部１０２からの放熱を抑制するための断熱部材である。保持部ベース１０４は、上側パッキン１１４を介して保持部１０２上に設置される。保持部ベース１０４は、枠形状を有し、保持部１０２の周囲を覆う。保持部ベース１０４の中央の開口において、保持部１０２が露出する。 The holding unit base 104 is a heat insulating member for suppressing heat dissipation from the holding unit 102. The holding unit base 104 is installed on the holding unit 102 via the upper packing 114. The holding unit base 104 has a frame shape and covers the periphery of the holding unit 102. In the central opening of the holding unit base 104, the holding unit 102 is exposed.
温度調節部１０６は、保持部１０２を加熱及び冷却し、これにより反応容器２０中の反応試料の温度を調節する。温度調節部１０６は、保持部１０２の鉛直方向下方に配置され、熱伝導部材１１０を介して保持部１０２に熱的に接続される。熱伝導部材１１０は、シリコンシート等の熱伝導性を有する部材であり、保持部１０２と温度調節部１０６との間の熱伝達を仲介する。温度調節部１０６は、熱電素子プレート１１６と、基板１１８とを有する。図５に示すように、熱電素子プレート１１６は、保持部１０２を加熱及び冷却する熱電素子１２０〜１２５と、保持部１０２の温度を検出する温度センサ１３０〜１３２とを有する。熱電素子１２０〜１２５は、例えばペルチェ素子である。温度センサ１３０〜１３２は、例えばサーミスタである。 The temperature adjusting unit 106 heats and cools the holding unit 102, thereby adjusting the temperature of the reaction sample in the reaction vessel 20. The temperature adjustment unit 106 is disposed below the holding unit 102 in the vertical direction, and is thermally connected to the holding unit 102 via the heat conducting member 110. The heat conducting member 110 is a member having thermal conductivity such as a silicon sheet, and mediates heat transfer between the holding unit 102 and the temperature adjusting unit 106. The temperature adjustment unit 106 includes a thermoelectric element plate 116 and a substrate 118. As shown in FIG. 5, the thermoelectric element plate 116 includes thermoelectric elements 120 to 125 that heat and cool the holding unit 102, and temperature sensors 130 to 132 that detect the temperature of the holding unit 102. The thermoelectric elements 120 to 125 are Peltier elements, for example. The temperature sensors 130 to 132 are, for example, thermistors.
基板１１８には、熱電素子プレート１１６が搭載される。基板１１８は、コネクタ形状の外部接続端子１１８ａを有する。外部接続端子１１８ａに制御部２４及び電源（図示せず）が接続される。基板１１８を介して、制御部２４からの制御信号が熱電素子プレート１１６に送信され、また温度センサ１３０〜１３２の出力信号が制御部２４に送信される。熱電素子プレート１１６の熱電素子１２０〜１２５は、制御部２４からの指示に基づいて保持部１０２を加熱及び冷却する。また、制御部２４は、温度センサ１３０〜１３２の出力値に基づいて、熱電素子１２０〜１２５による加熱及び冷却を制御する。 A thermoelectric element plate 116 is mounted on the substrate 118. The board 118 has connector-shaped external connection terminals 118a. The control unit 24 and a power source (not shown) are connected to the external connection terminal 118a. A control signal from the control unit 24 is transmitted to the thermoelectric element plate 116 via the substrate 118, and output signals of the temperature sensors 130 to 132 are transmitted to the control unit 24. The thermoelectric elements 120 to 125 of the thermoelectric element plate 116 heat and cool the holding unit 102 based on instructions from the control unit 24. The control unit 24 controls heating and cooling by the thermoelectric elements 120 to 125 based on the output values of the temperature sensors 130 to 132.
放熱部１０８は、温度調節部１０６を放熱する部材である。具体的には、放熱部１０８は、温度調節部１０６の熱電素子１２０〜１２５を放熱する。放熱部１０８は、例えば複数の放熱フィンを有するヒートシンクである。放熱部１０８は、温度調節部１０６の鉛直方向下方に配置され、下側パッキン１３４及び熱伝導部材１１２を介して温度調節部１０６に接続される。熱伝導部材１１２は、シリコンシート等の熱伝導性を有する部材であり、温度調節部１０６と放熱部１０８との間の熱伝達を仲介する。 The heat dissipation unit 108 is a member that radiates heat from the temperature adjustment unit 106. Specifically, the heat dissipation unit 108 radiates heat from the thermoelectric elements 120 to 125 of the temperature adjustment unit 106. The heat radiation part 108 is a heat sink having a plurality of heat radiation fins, for example. The heat dissipating unit 108 is disposed vertically below the temperature adjusting unit 106 and is connected to the temperature adjusting unit 106 via the lower packing 134 and the heat conducting member 112. The heat conducting member 112 is a member having thermal conductivity such as a silicon sheet, and mediates heat transfer between the temperature adjusting unit 106 and the heat radiating unit 108.
保持部ベース１０４、保持部１０２、温度調節部１０６及び放熱部１０８は、固定部材１３６ａ，１３６ｂによって固定される。 The holding unit base 104, the holding unit 102, the temperature adjusting unit 106, and the heat radiating unit 108 are fixed by fixing members 136a and 136b.
続いて、核酸増幅装置１の動作について説明する。ここでは、一例として核酸増幅装置１を用いて核酸を増幅させ、蛍光Ｌ１を検出する場合を説明する。まず制御部２４は、光源３０からの光がフィルタ部３２に入力されるよう、回転部３１を回転させる。次に、制御部２４は、反応試料中の核酸を増幅させるべく、温度センサ１３０〜１３２の検出結果に基づいて熱電素子１２０〜１２５の温度を制御する。これにより、熱電素子１２０〜１２５は、所定の温度サイクルで保持部１０２の加熱と冷却とを繰り返す。この結果、反応試料の加熱と冷却が繰り返され、核酸は増幅される。 Next, the operation of the nucleic acid amplification device 1 will be described. Here, as an example, a case where a nucleic acid is amplified using the nucleic acid amplification device 1 and the fluorescence L1 is detected will be described. First, the control unit 24 rotates the rotating unit 31 so that the light from the light source 30 is input to the filter unit 32. Next, the control unit 24 controls the temperature of the thermoelectric elements 120 to 125 based on the detection results of the temperature sensors 130 to 132 in order to amplify the nucleic acid in the reaction sample. Thereby, the thermoelectric elements 120 to 125 repeat heating and cooling of the holding unit 102 in a predetermined temperature cycle. As a result, the heating and cooling of the reaction sample are repeated, and the nucleic acid is amplified.
光源３０から出射される光に含まれる励起光は、光学フィルタ７１を透過してダイクロイックミラー７２で反射される。反射された励起光は反射鏡２５でさらに反射され、フレネルレンズ２６、カバー２２を透過して反応容器２０の反応試料に照射される。この結果、反応試料は励起され、蛍光Ｌ１，Ｌ２が発生する。蛍光Ｌ１，Ｌ２は、反射鏡２５で反射されてダイクロイックミラー７２を透過する。ダイクロイックミラー７２を透過した蛍光Ｌ１，Ｌ２は光学フィルタ７３に入射し、蛍光Ｌ１のみが選択的に光学フィルタ７３を透過してカメラ３５に入射する。この結果、カメラ３５は、リアルタイムで蛍光Ｌ１を検出することができる。なお、蛍光Ｌ２を検出する場合には、フィルタ部３３が用いられる。 Excitation light included in the light emitted from the light source 30 passes through the optical filter 71 and is reflected by the dichroic mirror 72. The reflected excitation light is further reflected by the reflecting mirror 25, passes through the Fresnel lens 26 and the cover 22, and is irradiated on the reaction sample in the reaction vessel 20. As a result, the reaction sample is excited and fluorescence L1 and L2 are generated. The fluorescent lights L 1 and L 2 are reflected by the reflecting mirror 25 and pass through the dichroic mirror 72. The fluorescence L1 and L2 that have passed through the dichroic mirror 72 enter the optical filter 73, and only the fluorescence L1 selectively passes through the optical filter 73 and enters the camera 35. As a result, the camera 35 can detect the fluorescence L1 in real time. Note that the filter unit 33 is used to detect the fluorescence L2.
上述した温度サイクルでの保持部１０２の温度調節において、制御部２４は、以下に説明する制御を実行する。まず、図５に示すように、保持部１０２は第１領域１０２ａ〜第３領域１０２ｃの３つの領域に区分けされる。第１領域１０２ａ、第２領域１０２ｂ及び第３領域１０２ｃはこの順に並び、隣り合う領域同士は接している。なお、第１領域１０２ａ〜第３領域１０２ｃは、仮想的に区分けされた領域である。 In the temperature adjustment of the holding unit 102 in the temperature cycle described above, the control unit 24 executes the control described below. First, as shown in FIG. 5, the holding unit 102 is divided into three regions, a first region 102 a to a third region 102 c. The first region 102a, the second region 102b, and the third region 102c are arranged in this order, and adjacent regions are in contact with each other. The first area 102a to the third area 102c are virtually divided areas.
熱電素子１２０〜１２５と保持部１０２とが重なる方向から見て、熱電素子１２０，１２１（第１熱電素子）は、保持部１０２の第１領域１０２ａと重なるように配置される。また、熱電素子１２２，１２３（第２熱電素子）は、保持部１０２の第２領域１０２ｂと重なるように配置される。また、熱電素子１２４，１２５（第３熱電素子）は、保持部１０２の第３領域１０２ｃと重なるように配置される。 The thermoelectric elements 120 and 121 (first thermoelectric elements) are arranged so as to overlap the first region 102 a of the holding unit 102 when viewed from the direction in which the thermoelectric elements 120 to 125 and the holding unit 102 overlap. Further, the thermoelectric elements 122 and 123 (second thermoelectric elements) are arranged so as to overlap the second region 102 b of the holding unit 102. Further, the thermoelectric elements 124 and 125 (third thermoelectric elements) are arranged so as to overlap the third region 102 c of the holding unit 102.
温度センサ１３０（第１温度センサ）は、熱電素子１２２，１２３及び熱電素子１２４，１２５に対してよりも熱電素子１２０，１２１に対してより近接する。すなわち、温度センサ１３０は、反応ユニット１００が有する温度センサ１３０〜１３２のなかで最も熱電素子１２０，１２１の近くに配置される。温度センサ１３１（第２温度センサ）は、熱電素子１２０，１２１及び熱電素子１２４，１２５に対してよりも熱電素子１２２，１２３に対してより近接する。すなわち、温度センサ１３１は、温度センサ１３０〜１３２のなかで最も熱電素子１２２，１２３の近くに配置される。温度センサ１３２（第３温度センサ）は、熱電素子１２０，１２１及び熱電素子１２２，１２３に対してよりも熱電素子１２４，１２５に対してより近接する。すなわち、温度センサ１３２は、温度センサ１３０〜１３２のなかで最も熱電素子１２４，１２５の近くに配置される。 The temperature sensor 130 (first temperature sensor) is closer to the thermoelectric elements 120 and 121 than to the thermoelectric elements 122 and 123 and the thermoelectric elements 124 and 125. That is, the temperature sensor 130 is disposed closest to the thermoelectric elements 120 and 121 among the temperature sensors 130 to 132 included in the reaction unit 100. The temperature sensor 131 (second temperature sensor) is closer to the thermoelectric elements 122 and 123 than to the thermoelectric elements 120 and 121 and the thermoelectric elements 124 and 125. That is, the temperature sensor 131 is disposed closest to the thermoelectric elements 122 and 123 among the temperature sensors 130 to 132. The temperature sensor 132 (third temperature sensor) is closer to the thermoelectric elements 124 and 125 than to the thermoelectric elements 120 and 121 and the thermoelectric elements 122 and 123. That is, the temperature sensor 132 is disposed closest to the thermoelectric elements 124 and 125 among the temperature sensors 130 to 132.
具体的には、温度センサ１３０は、温度センサ１３０〜１３２と保持部１０２とが重なる方向から見て、第１領域１０２ａと重なるように配置される。さらには、温度センサ１３０は熱電素子１２０と熱電素子１２１との間に配置される。温度センサ１３１は、第２領域１０２ｂと重なるように配置される。さらには、温度センサ１３１は熱電素子１２２と熱電素子１２３との間に配置される。温度センサ１３２は、第３領域１０２ｃと重なるように配置される。さらには、温度センサ１３２は熱電素子１２４と熱電素子１２５との間に配置される。 Specifically, the temperature sensor 130 is disposed so as to overlap the first region 102a when viewed from the direction in which the temperature sensors 130 to 132 and the holding unit 102 overlap. Furthermore, the temperature sensor 130 is disposed between the thermoelectric element 120 and the thermoelectric element 121. The temperature sensor 131 is disposed so as to overlap the second region 102b. Further, the temperature sensor 131 is disposed between the thermoelectric element 122 and the thermoelectric element 123. The temperature sensor 132 is disposed so as to overlap the third region 102c. Further, the temperature sensor 132 is disposed between the thermoelectric element 124 and the thermoelectric element 125.
したがって、温度センサ１３０は、主に熱電素子１２０及び熱電素子１２１によって加熱及び冷却される第１領域１０２ａの温度を検知することができる。温度センサ１３１は、主に熱電素子１２２及び熱電素子１２３によって加熱及び冷却される第２領域１０２ｂの温度を検知することができる。温度センサ１３２は、主に熱電素子１２４及び熱電素子１２５によって加熱及び冷却される第３領域１０２ｃの温度を検知することができる。 Therefore, the temperature sensor 130 can detect the temperature of the first region 102a heated and cooled mainly by the thermoelectric element 120 and the thermoelectric element 121. The temperature sensor 131 can detect the temperature of the second region 102 b heated and cooled mainly by the thermoelectric element 122 and the thermoelectric element 123. The temperature sensor 132 can detect the temperature of the third region 102 c heated and cooled mainly by the thermoelectric element 124 and the thermoelectric element 125.
第１領域１０２ａ〜第３領域１０２ｃのそれぞれの温度は、各領域に含まれる熱電素子によって主に調節される。しかしながら、第１領域１０２ａ〜第３領域１０２ｃは互いに熱的に接続されている。このため、各領域の温度は、隣接する領域に含まれる熱電素子の影響を受ける。このため、各領域に含まれる温度センサの検出結果に基づいて各領域に含まれる熱電素子を独立に制御しようとすると、各領域の温度を正確に制御することが困難である。 The temperatures of the first region 102a to the third region 102c are mainly adjusted by thermoelectric elements included in each region. However, the first region 102a to the third region 102c are thermally connected to each other. For this reason, the temperature of each area | region receives to the influence of the thermoelectric element contained in an adjacent area | region. For this reason, when it is going to control the thermoelectric element contained in each area | region independently based on the detection result of the temperature sensor contained in each area | region, it is difficult to control the temperature of each area | region correctly.
そこで、制御部２４は、温度センサ１３０の検出結果と温度センサ１３１の検出結果と温度センサ１３２の検出結果とを組み合わせて得られる温度情報に基づいて、熱電素子１２０〜１２５を制御する。このように、各温度センサの検出結果を組み合わせることで、各領域に対応する温度センサ単独の検出結果に基づいて各領域の温度を独立に制御する場合に比べて、保持部１０２の温度をより高精度に制御することができる。 Therefore, the control unit 24 controls the thermoelectric elements 120 to 125 based on temperature information obtained by combining the detection result of the temperature sensor 130, the detection result of the temperature sensor 131, and the detection result of the temperature sensor 132. In this way, by combining the detection results of the temperature sensors, the temperature of the holding unit 102 can be further increased compared to the case where the temperature of each region is independently controlled based on the detection result of the temperature sensor alone corresponding to each region. It can be controlled with high accuracy.
より詳細には、制御部２４は、温度センサ１３０〜１３２の検出結果そのものではなく、これらの検出結果を組み合わせて物理的、熱的に干渉しにくいパラメータの値に変換する。次に、この値を擬似的な制御対象として、この値が予め定められる目標値に近づくよう補正処理を行う。そして、得られた補正値に基づいて各熱電素子１２０〜１２５の出力値を決定する。 More specifically, the control unit 24 converts the detection results of the temperature sensors 130 to 132 into parameters that are difficult to interfere physically and thermally by combining these detection results. Next, using this value as a pseudo control target, correction processing is performed so that this value approaches a predetermined target value. And the output value of each thermoelectric element 120-125 is determined based on the acquired correction value.
具体的には、制御部２４は、第１変換部２４１と、補正部２４２と、第２変換部２４３とを有する。制御部２４の第１変換部２４１は、物理的、熱的に干渉しにくいパラメータの値として、温度センサ１３０〜１３２の検出結果から以下の３つの値を算出する。すなわち、第１変換部２４１は第１の値として、温度センサ１３０の検出結果である第１温度Ｔｌｅｆｔと、温度センサ１３１の検出結果である第２温度Ｔｃｅｎｔｅｒと、温度センサ１３２の検出結果である第３温度Ｔｒｉｇｈｔとの平均値Ｔａｖｇを算出する。また、第１変換部２４１は第２の値として、第１温度Ｔｌｅｆｔと第３温度Ｔｒｉｇｈｔとの平均値Ｔｓｉｄｅと、第２温度Ｔｃｅｎｔｅｒとの差Ｔｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒを算出する。さらに、第１変換部２４１は第３の値として、第１温度Ｔｌｅｆｔと第３温度Ｔｒｉｇｈｔとの差Ｔｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔを算出する。 Specifically, the control unit 24 includes a first conversion unit 241, a correction unit 242, and a second conversion unit 243. The first conversion unit 241 of the control unit 24 calculates the following three values from the detection results of the temperature sensors 130 to 132 as parameter values that are difficult to physically and thermally interfere. That is, the first conversion unit 241 uses the first temperature T left as a detection result of the temperature sensor 130, the second temperature T center as a detection result of the temperature sensor 131, and the detection result of the temperature sensor 132 as the first value. An average value T avg with the third temperature T right is calculated. Further, the first conversion unit 241 calculates, as the second value, a difference T side-center between the average value T side of the first temperature T left and the third temperature T right and the second temperature T center . Further, the first conversion unit 241 calculates a difference T left-right between the first temperature T left and the third temperature T right as the third value.
すなわち、第１変換部２４１は以下の式（１）に基づいて、第１温度Ｔｌｅｆｔ、第２温度Ｔｃｅｎｔｅｒ及び第３温度Ｔｒｉｇｈｔを、平均値Ｔａｖｇ、差Ｔｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び差Ｔｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔに変換する。 That is, the first conversion unit 241 converts the first temperature T left , the second temperature T center and the third temperature T right into an average value T avg , a difference T side-center and a difference T based on the following formula (1). Convert to left-right .
次に、制御部２４の補正部２４２は、平均値Ｔａｖｇ、差Ｔｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び差Ｔｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔを、予め定められる目標値に近づくよう補正して、補正後の平均値Ｏａｖｇ、補正後の差Ｏｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び補正後の差Ｏｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔを算出する。具体的には、補正部２４２は、平均値Ｔａｖｇが温度サイクルにおける設定温度に近づくように補正する。温度サイクルにおける設定温度とは、アニーリングでは例えば６０℃であり、変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）及び伸長（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）では例えば９５℃である。また、補正部２４２は、差Ｔｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び差Ｔｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔが０に近づくように補正する。 Next, the correction unit 242 of the control unit 24 corrects the average value T avg , the difference T side-center and the difference T left-right so as to approach a predetermined target value, and corrects the average value O avg , The corrected difference O side-center and the corrected difference O left-right are calculated. Specifically, the correction unit 242 corrects the average value T avg so as to approach the set temperature in the temperature cycle. The set temperature in the temperature cycle is, for example, 60 ° C. for annealing, and is, for example, 95 ° C. for denaturation and elongation. Further, the correction unit 242 corrects the difference T side-center and the difference T left-right so as to approach zero.
補正部２４２は、例えばＰＩＤ制御により平均値Ｔａｖｇ、差Ｔｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び差Ｔｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔをそれぞれ補正する。各値のＰＩＤ制御に用いられる制御パラメータを表１に示す。制御パラメータは、設計者による実験やシミュレーションに基づき適宜設定することができる。 The correcting unit 242 corrects the average value T avg , the difference T side-center and the difference T left-right by, for example, PID control. Table 1 shows control parameters used for PID control of each value. Control parameters can be set as appropriate based on experiments and simulations by the designer.
制御対象である平均値Ｔａｖｇ、差Ｔｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び差Ｔｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔは、熱的な特性がそれぞれ異なる。このため、各値に対するＰＩＤ制御器の制御パラメータは、それぞれ異なったものが用いられる。 The average value T avg , the difference T side-center, and the difference T left-right that are controlled objects have different thermal characteristics. For this reason, different control parameters are used for the PID controller for each value.
平均値Ｔａｖｇがその目標値から所定量以上乖離している場合や、目標値に対して放熱部１０８の温度が高すぎるために放熱部１０８が冷却されるまで熱電素子への出力を控えるべき場合等には、制御部２４は平均値Ｔａｖｇの補正に用いる制御パラメータとして、表１に挙げたものとは異なるパラメータを用いることができる。例えば、制御部２４には、平均値Ｔａｖｇと目標値との乖離量のしきい値と、放熱部１０８の温度と目標値との乖離量のしきい値とが予め記憶されている。また、制御部２４は、放熱部１０８の温度を検出する温度センサ（図示せず）の検出結果を取得することができる。補正部２４２は、これらのしきい値と必要に応じて放熱部１０８の温度情報とに基づいて、平均値Ｔａｖｇの補正に用いる制御パラメータを選択することができる。また、温度センサ１３０〜１３２が断線した場合等に実行される保護動作では、熱電素子１２０〜１２５への出力は、例えばデューティ比０でＰＷＭ制御される。 If the average value T avg deviates from the target value by more than a predetermined amount, or the temperature of the heat radiating unit 108 is too high relative to the target value, the output to the thermoelectric element should be refrained until the heat radiating unit 108 is cooled In some cases, the control unit 24 can use parameters different from those listed in Table 1 as control parameters used for correcting the average value T avg . For example, the control unit 24 stores in advance a threshold value for the deviation amount between the average value T avg and the target value and a threshold value for the deviation amount between the temperature of the heat radiating unit 108 and the target value. Further, the control unit 24 can acquire a detection result of a temperature sensor (not shown) that detects the temperature of the heat dissipation unit 108. The correction unit 242 can select a control parameter used for correcting the average value T avg based on these threshold values and, if necessary, the temperature information of the heat dissipation unit 108. Further, in the protection operation executed when the temperature sensors 130 to 132 are disconnected, the outputs to the thermoelectric elements 120 to 125 are PWM controlled with a duty ratio of 0, for example.
続いて、制御部２４の第２変換部２４３は、補正後の平均値Ｏａｖｇ、補正後の差Ｏｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び補正後の差Ｏｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔに基づいて熱電素子１２０〜１２５の目標温度を決定する。すなわち、第２変換部２４３は以下の式（２）に基づいて、補正後の平均値Ｏａｖｇ、補正後の差Ｏｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び補正後の差Ｏｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔを、目標第１温度Ｏｌｅｆｔ、目標第２温度Ｏｃｅｎｔｅｒ及び目標第３温度Ｏｒｉｇｈｔに変換する。なお、式（２）の右辺の行列（演算子）における第１列の値は、全て同一であればよく、例えば全てが「１／３」であってもよい。 Subsequently, the second conversion unit 243 of the control unit 24 calculates the target temperature of the thermoelectric elements 120 to 125 based on the corrected average value O avg , the corrected difference O side-center, and the corrected difference O left-right. To decide. That is, the second conversion unit 243 calculates the corrected average value O avg , the corrected difference O side-center, and the corrected difference O left-right as the target first temperature O Conversion into left , target second temperature O center and target third temperature O right . Note that the values in the first column in the matrix (operator) on the right side of Expression (2) may be all the same, for example, all may be “1/3”.
本実施の形態では、第２変換部２４３は、第１領域１０２ａに含まれる熱電素子１２０と熱電素子１２１とに同一の目標第１温度Ｏｌｅｆｔを設定する。また、第２変換部２４３は、第２領域１０２ｂに含まれる熱電素子１２２と熱電素子１２３とに同一の目標第２温度Ｏｃｅｎｔｅｒを設定する。さらに、第２変換部２４３は、第３領域１０２ｃに含まれる熱電素子１２４と熱電素子１２５とに同一の目標第３温度Ｏｒｉｇｈｔを設定する。 In the present embodiment, second conversion unit 243 sets the same target first temperature O left for thermoelectric element 120 and thermoelectric element 121 included in first region 102a. The second conversion unit 243 sets the same target second temperature O center in the thermoelectric element 122 and the thermoelectric element 123 included in the second region 102b. Further, the second conversion unit 243 sets the same target third temperature O right for the thermoelectric element 124 and the thermoelectric element 125 included in the third region 102c.
そして、制御部２４は、得られた目標温度となるよう熱電素子１２０〜１２５を制御する。具体的には、制御部２４は、目標第１温度Ｏｌｅｆｔに対応する電流を熱電素子１２０，１２１に出力するよう、核酸増幅装置１が備えるスイッチング電源回路（図示せず）を制御する。また、制御部２４は、目標第２温度Ｏｃｅｎｔｅｒに対応する電流を熱電素子１２２，１２３に出力するようスイッチング電源回路を制御する。さらに、制御部２４は、目標第３温度Ｏｒｉｇｈｔに対応する電流を熱電素子１２４，１２５に出力するようスイッチング電源回路を制御する。 And the control part 24 controls the thermoelectric elements 120-125 so that it may become the obtained target temperature. Specifically, the control unit 24 controls a switching power supply circuit (not shown) included in the nucleic acid amplification device 1 so as to output a current corresponding to the target first temperature O leftt to the thermoelectric elements 120 and 121. Further, the control unit 24 controls the switching power supply circuit so as to output a current corresponding to the target second temperature O center to the thermoelectric elements 122 and 123. Further, the control unit 24 controls the switching power supply circuit so as to output a current corresponding to the target third temperature O right to the thermoelectric elements 124 and 125.
以上説明したように、本実施の形態に係る核酸増幅装置１は、反応容器２０を保持する保持部１０２と、保持部１０２を加熱及び冷却して、反応試料の温度を調節する熱電素子１２０〜１２５と、保持部１０２の温度を検出する温度センサ１３０〜１３２と、熱電素子１２０〜１２５を制御する制御部２４とを備える。熱電素子１２０，１２１は、保持部１０２の第１領域１０２ａと重なるように配置され、熱電素子１２２，１２３は、第２領域１０２ｂと重なるように配置され、熱電素子１２４，１２５は、第３領域１０２ｃと重なるように配置される。また、温度センサ１３０は、第１領域１０２ａの温度を検出するように配置され、温度センサ１３１は、第２領域１０２ｂの温度を検出するように配置され、温度センサ１３２は、第３領域１０２ｃの温度を検出するように配置される。 As described above, the nucleic acid amplification device 1 according to the present embodiment includes the holding unit 102 that holds the reaction vessel 20 and the thermoelectric elements 120 to 120 that adjust the temperature of the reaction sample by heating and cooling the holding unit 102. 125, temperature sensors 130 to 132 that detect the temperature of the holding unit 102, and a control unit 24 that controls the thermoelectric elements 120 to 125. The thermoelectric elements 120 and 121 are disposed so as to overlap the first region 102a of the holding unit 102, the thermoelectric elements 122 and 123 are disposed so as to overlap the second region 102b, and the thermoelectric elements 124 and 125 are disposed in the third region. It is arranged so as to overlap with 102c. The temperature sensor 130 is arranged to detect the temperature of the first region 102a, the temperature sensor 131 is arranged to detect the temperature of the second region 102b, and the temperature sensor 132 is arranged to detect the temperature of the third region 102c. Arranged to detect temperature.
そして、制御部２４は、温度センサ１３０〜１３２のそれぞれの検出結果を組み合わせて得られる温度情報に基づいて、熱電素子１２０〜１２５を制御する。これにより、隣接する領域からの熱的な影響を加味して熱電素子１２０〜１２５の温度を決定することができる。このため、各温度センサ単独の検出結果に基づいて第１領域１０２ａ〜第３領域１０２ｃの温度を制御する場合に比べて、保持部１０２の各領域の温度をより高精度に調節することができる。この結果、保持部１０２の全体をより均一な温度とすることができるため、反応容器２０全体でより均一に核酸を増幅させることができる。 And the control part 24 controls the thermoelectric elements 120-125 based on the temperature information obtained by combining each detection result of the temperature sensors 130-132. Thereby, the temperature of the thermoelectric elements 120-125 can be determined in consideration of the thermal influence from the adjacent region. For this reason, compared with the case where the temperature of the 1st field 102a-the 3rd field 102c is controlled based on the detection result of each temperature sensor alone, the temperature of each field of holding part 102 can be adjusted with higher accuracy. . As a result, since the temperature of the entire holding unit 102 can be made more uniform, nucleic acids can be amplified more uniformly in the entire reaction container 20.
すなわち、本実施の形態に係る核酸増幅装置１では、温度制御の観点から保持部１０２が３つの温度制御帯に分けられる。そして、制御目標値に収束させるための主要な温度域では、ＰＩＤ制御により各温度制御帯の温度が制御される。核酸増幅装置１は、保持部１０２を加熱及び冷却する熱電素子と、保持部１０２の温度を検出する温度センサとの組み合わせを、各温度制御帯に対応して３系統備える。 That is, in the nucleic acid amplification device 1 according to the present embodiment, the holding unit 102 is divided into three temperature control zones from the viewpoint of temperature control. In the main temperature range for convergence to the control target value, the temperature of each temperature control zone is controlled by PID control. The nucleic acid amplification device 1 includes three combinations of thermoelectric elements that heat and cool the holding unit 102 and temperature sensors that detect the temperature of the holding unit 102 corresponding to each temperature control zone.
ここで、各温度制御帯は互いに熱的に接続されている。したがって、隣接する２つの温度制御帯のそれぞれに対応する制御系統において、一方の制御系統は、他方の制御系統にとってノイズとなりうる。このため、各制御系統を独立にＰＩＤ制御する場合は、保持部１０２の全体の温度を高精度に制御することが困難である。これに対し、本実施の形態では、３つの温度制御帯の温度を物理的、熱的に干渉しにくいパラメータの値に変換し、この値を擬似的な制御対象としてＰＩＤ制御を行う。そして、ＰＩＤ制御がなされた擬似的な制御対象を熱電素子１２０〜１２５への出力値に変換する。これにより、３つの制御系統の互いの干渉を考慮した温度制御を実施することができるため、各温度制御帯の温度を高精度に調節することができる。 Here, the temperature control zones are thermally connected to each other. Therefore, in a control system corresponding to each of two adjacent temperature control zones, one control system can be a noise for the other control system. For this reason, when carrying out PID control of each control system independently, it is difficult to control the whole temperature of the holding | maintenance part 102 with high precision. In contrast, in the present embodiment, the temperatures of the three temperature control zones are converted into parameter values that are difficult to physically and thermally interfere, and PID control is performed using these values as pseudo control targets. And the pseudo | simulated control object by which PID control was made is converted into the output value to the thermoelectric elements 120-125. Thereby, since temperature control which considered the mutual interference of three control systems can be implemented, the temperature of each temperature control zone can be adjusted with high accuracy.
なお、本実施の形態では、保持部１０２が３つの領域に分けられ、各領域に対応して３系統の熱電素子と温度センサとが設けられている。しかしながら、特にこの構成に限定されず、保持部１０２が少なくとも２つの領域に分けられ、各領域に対応して少なくとも２組の熱電素子及び温度センサが設けられ、少なくとも２つの温度センサの検出結果を組み合わせて得られる温度情報に基づいて熱電素子を制御すれば、各系統の温度センサの検出結果を単独で用いて温度制御する場合に比べて、反応容器２０全体での温度の均一化を図ることができる。 In the present embodiment, holding unit 102 is divided into three regions, and three systems of thermoelectric elements and temperature sensors are provided corresponding to each region. However, the present invention is not particularly limited to this configuration, and the holding unit 102 is divided into at least two regions, and at least two sets of thermoelectric elements and temperature sensors are provided corresponding to each region, and the detection results of the at least two temperature sensors are obtained. If the thermoelectric elements are controlled based on the temperature information obtained in combination, the temperature of the entire reaction vessel 20 can be made uniform as compared with the case where the temperature control is performed using the detection results of the temperature sensors of each system alone. Can do.
２つの温度センサの検出結果を組み合わせて温度情報を得る場合は、例えば次のような制御がなされる。すなわち、制御部２４は、第１温度センサの検出結果である第１温度と第２温度センサの検出結果である第２温度との平均値、及び第１温度と第２温度との差を算出する。次いで、制御部２４は、算出された平均値が温度サイクルにおける設定温度に近づくように補正し、また算出された差が０に近づくように補正する。そして、制御部２４は、補正後の平均値及び補正後の差に基づいて第１熱電素子及び第２熱電素子の目標温度を決定し、当該目標温度となるよう第１熱電素子及び第２熱電素子を制御する。 In the case of obtaining temperature information by combining the detection results of the two temperature sensors, for example, the following control is performed. That is, the control unit 24 calculates the average value of the first temperature that is the detection result of the first temperature sensor and the second temperature that is the detection result of the second temperature sensor, and the difference between the first temperature and the second temperature. To do. Next, the control unit 24 corrects the calculated average value so as to approach the set temperature in the temperature cycle, and corrects the calculated difference so as to approach 0. Then, the control unit 24 determines the target temperatures of the first thermoelectric element and the second thermoelectric element based on the corrected average value and the corrected difference, and the first thermoelectric element and the second thermoelectric element are set to the target temperature. Control the element.
本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更などのさらなる変形を加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれる。上述した実施の形態への変形の追加によって生じる新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態、及び変形それぞれの効果をあわせもつ。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications such as various design changes can be added based on the knowledge of those skilled in the art. Forms are also included within the scope of the present invention. A new embodiment generated by adding a modification to the above-described embodiment has the effects of the combined embodiment and the modification.
上述した実施の形態では、核酸増幅装置１は、核酸の増幅機構と検出機構とを備えるが、核酸増幅装置１は核酸の増幅機構のみを備えてもよい。 In the embodiment described above, the nucleic acid amplification device 1 includes a nucleic acid amplification mechanism and a detection mechanism. However, the nucleic acid amplification device 1 may include only a nucleic acid amplification mechanism.
１ 核酸増幅装置、 ２０ 反応容器、 ２４ 制御部、 １０２ 保持部、 １０２ａ 第１領域、 １０２ｂ 第２領域、 １０２ｃ 第３領域、 １２０，１２１，１２２，１２３，１２４，１２５ 熱電素子、 １３０，１３１，１３２ 温度センサ。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Nucleic acid amplifier, 20 Reaction container, 24 Control part, 102 Holding part, 102a 1st area | region, 102b 2nd area | region, 102c 3rd area | region, 120,121,122,123,124,125 Thermoelectric element, 130,131, 132 Temperature sensor.
Claims (3)
前記保持部を加熱及び冷却して、前記反応試料の温度を調節する熱電素子と、
前記保持部の温度を検出する温度センサと、
前記温度センサの検出結果に基づいて、前記保持部が所定の温度サイクルで加熱及び冷却されるよう前記熱電素子を制御する制御部と、
を備え、
前記熱電素子は、前記熱電素子と前記保持部とが重なる方向から見て、前記保持部の第１領域と重なる第１熱電素子と、前記保持部の前記第１領域とは異なる第２領域と重なる第２熱電素子とを少なくとも含み、
前記温度センサは、前記第２熱電素子に対してよりも前記第１熱電素子に対してより近接する第１温度センサと、前記第１熱電素子に対してよりも前記第２熱電素子に対してより近接する第２温度センサとを少なくとも含み、
前記制御部は、少なくとも前記第１温度センサの検出結果と前記第２温度センサの検出結果とを組み合わせて得られる温度情報に基づいて、前記第１熱電素子及び前記第２熱電素子を制御することを特徴とする核酸増幅装置。 A holding unit for holding a reaction vessel in which a plurality of recesses for storing reaction samples containing nucleic acids are arranged;
A thermoelectric element that adjusts the temperature of the reaction sample by heating and cooling the holding unit;
A temperature sensor for detecting the temperature of the holding unit;
A control unit for controlling the thermoelectric element so that the holding unit is heated and cooled in a predetermined temperature cycle based on a detection result of the temperature sensor;
With
The thermoelectric element includes a first thermoelectric element that overlaps the first area of the holding part and a second area that is different from the first area of the holding part when viewed from the direction in which the thermoelectric element and the holding part overlap. At least a second thermoelectric element overlapping,
The temperature sensor is closer to the first thermoelectric element than to the second thermoelectric element, and to the second thermoelectric element than to the first thermoelectric element. At least a second temperature sensor that is closer,
The control unit controls the first thermoelectric element and the second thermoelectric element based on temperature information obtained by combining at least a detection result of the first temperature sensor and a detection result of the second temperature sensor. A nucleic acid amplification apparatus characterized by the above.
前記平均値が前記温度サイクルにおける設定温度に近づくように補正し、前記差が０に近づくように補正し、
補正後の前記平均値及び補正後の前記差に基づいて前記第１熱電素子及び前記第２熱電素子の目標温度を決定し、当該目標温度となるよう前記第１熱電素子及び前記第２熱電素子を制御する請求項１に記載の核酸増幅装置。 The control unit includes an average value of a first temperature that is a detection result of the first temperature sensor and a second temperature that is a detection result of the second temperature sensor, and a difference between the first temperature and the second temperature. To calculate
The average value is corrected so as to approach the set temperature in the temperature cycle, and the difference is corrected so as to approach 0,
Based on the corrected average value and the corrected difference, target temperatures of the first thermoelectric element and the second thermoelectric element are determined, and the first thermoelectric element and the second thermoelectric element are set to be the target temperatures. The nucleic acid amplification device according to claim 1, wherein the nucleic acid amplification device is controlled.
前記温度センサは、前記第１熱電素子及び前記第２熱電素子に対してよりも前記第３熱電素子に対してより近接する第３温度センサをさらに含み、
前記第１領域、前記第２領域及び前記第３領域はこの順に並び、
前記制御部は、前記第１温度センサの検出結果である第１温度と前記第２温度センサの検出結果である第２温度と前記第３温度センサの検出結果である第３温度との平均値Ｔａｖｇ、前記第１温度と前記第３温度との平均値と前記第２温度との差Ｔｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ、及び前記第１温度と前記第３温度との差Ｔｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔを算出し、
前記平均値Ｔａｖｇが前記温度サイクルにおける設定温度に近づくように補正し、前記差Ｔｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び前記差Ｔｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔが０に近づくように補正し、
補正後の平均値Ｏａｖｇ、補正後の差Ｏｓｉｄｅ−ｃｅｎｔｅｒ及び補正後の差Ｏｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔに基づいて前記第１熱電素子、前記第２熱電素子及び前記第３熱電素子の目標温度を決定し、当該目標温度となるよう前記第１熱電素子、前記第２熱電素子及び前記第３熱電素子を制御する請求項１又は２に記載の核酸増幅装置。 The thermoelectric element further includes a third thermoelectric element that overlaps a third region different from the first region and the second region of the holding portion when viewed from the direction in which the thermoelectric element and the holding portion overlap.
The temperature sensor further includes a third temperature sensor closer to the third thermoelectric element than to the first thermoelectric element and the second thermoelectric element,
The first region, the second region, and the third region are arranged in this order,
The control unit includes an average value of a first temperature that is a detection result of the first temperature sensor, a second temperature that is a detection result of the second temperature sensor, and a third temperature that is a detection result of the third temperature sensor. Calculating T avg , a difference T side-center between the average value of the first temperature and the third temperature and the second temperature, and a difference T left-right between the first temperature and the third temperature;
The average value T avg is corrected so as to approach the set temperature in the temperature cycle, the difference T side-center and the difference T left-right are corrected so as to approach 0,
Based on the corrected average value O avg , the corrected difference O side-center and the corrected difference O left-right , target temperatures of the first thermoelectric element, the second thermoelectric element, and the third thermoelectric element are determined. The nucleic acid amplification device according to claim 1, wherein the first thermoelectric element, the second thermoelectric element, and the third thermoelectric element are controlled so that the target temperature is reached.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020014462A (en) * | 2018-07-24 | 2020-01-30 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Method for monitoring and controlling temperature of sample holder of laboratory instrument |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011250714A (en) * | 2010-05-31 | 2011-12-15 | Sanyo Electric Co Ltd | Amplification apparatus and detecting device |
| JP2013523165A (en) * | 2010-04-09 | 2013-06-17 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | Improving thermal uniformity for thermocycler instruments using dynamic control |
-
2015
- 2015-03-27 JP JP2015066783A patent/JP6525665B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013523165A (en) * | 2010-04-09 | 2013-06-17 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | Improving thermal uniformity for thermocycler instruments using dynamic control |
| JP2011250714A (en) * | 2010-05-31 | 2011-12-15 | Sanyo Electric Co Ltd | Amplification apparatus and detecting device |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020014462A (en) * | 2018-07-24 | 2020-01-30 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Method for monitoring and controlling temperature of sample holder of laboratory instrument |
| CN110777069A (en) * | 2018-07-24 | 2020-02-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | Method for monitoring and controlling temperature of laboratory instrument sample holder |
| US11517905B2 (en) | 2018-07-24 | 2022-12-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method to monitor and control the temperature of a sample holder of a laboratory instrument |
| CN110777069B (en) * | 2018-07-24 | 2023-10-10 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | Method for monitoring and controlling the temperature of a laboratory instrument sample holder |
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