JP2016170154A

JP2016170154A - ＩｇＡ腎症検査法

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Publication number: JP2016170154A
Application number: JP2015051874A
Authority: JP
Inventors: 鈴木　仁; Hitoshi Suzuki; 仁鈴木; 祐介鈴木; Yusuke Suzuki
Original assignee: Juntendo University
Current assignee: Juntendo University
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2015-03-16
Publication date: 2016-09-23
Anticipated expiration: 2035-03-16
Also published as: JP6422161B2

Abstract

【課題】より早期にＩｇＡ腎症を発見するための非侵襲的な診断手法の提供。【解決手段】ＩｇＡ腎症の診断を目的として、尿潜血陽性被験者由来の血液中の糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値及び糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値を測定し、当該３種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することを特徴とする検査法。【選択図】なし

Description

本発明は、ＩｇＡ腎症を早期に発見診断する方法に関する。

ＩｇＡ腎症は、世界で最も多い慢性糸球体腎炎であり、糸球体メサンギウム領域へのＩｇＡの沈着を主体とする顆粒状沈着を特徴とするメサンギウム増殖性腎炎、と定義され、約２５年の経過で約半数が末期腎不全へと進行する予後不良な疾患である。メサンギウム領域には、しばしばＩｇＧの共沈着がみられる。その発症機序はいまだ十分に解明されておらず、その治療方法も、食事療法、抗血小板薬、降圧薬、副腎皮質ステロイド等による薬物治療が行なわれているが、十分な治療効果は得られていない。

ＩｇＡ腎症は、前記の定義に従い、現在、腎生検により診断されている。しかし、腎生検は、入院を要し、出血・感染のリスクを伴うために患者に対する負担が大きい、片腎の患者には腎生検施行が困難である等の問題がある。従って、採血や採尿などの非侵襲的な検者データによってＩｇＡ腎症を診断することは重要課題である。

一方、ＩｇＡ腎症には、ＩｇＡ及びＩｇＧがともに沈着する症例、ＩｇＡのみが沈着する症例が混在し、非侵襲的診断は困難である。また、ＩｇＡ腎症患者の血中には、糖鎖異常型ＩｇＡ１が増加している（非特許文献１）ことが知られている。しかし、糖鎖異常ＩｇＡ１だけで、本症の病態を説明することは困難であり、糖鎖異常ＩｇＡ１が高分子の免疫複合体を形成し、腎臓に沈着することが病態において重要であると考えられる。免疫複合体を形成するＩｇＡは糖鎖異常ＩｇＡ１であり、患者血中には、糖鎖異常ＩｇＡ１−ＩｇＡ、および糖鎖異常ＩｇＡ１−ＩｇＧ免疫複合体が増加していることが判明し、近年本発明者らは、糖鎖異常ＩｇＡ１を特異的に認識するＩｇＧ抗体を同定し、測定系を樹立した（非特許文献２）。さらに、本発明者らは、少なくとも血中ＩｇＡ値、血中糖鎖異常ＩｇＡ１値、血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、血中糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値及び尿中タンパク値の５種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することによりＩｇＡ腎症が診断できることを見出し、先に特許出願した（特許文献１）。

特開２０１３−２４６１２７号公報

Kidney Int, 2007, 71: 1148-1154 J Clin Invest, 2009, 119: 1668-1677

しかしながら、従来の診断法では、尿タンパク値が高いなどの腎疾患が疑われる被験者でなければＩｇＡ腎症の発見には至らなかった。前記のようにＩｇＡ腎症は、進行すると治療が困難であることから、早期に発見することが必要であり、より早期の診断手法が望まれる。
従って、本発明の課題は、より早期にＩｇＡ腎症を発見するための非侵襲的な診断手法を提供することにある。

尿潜血陽性者については、通常、尿路結石や尿路癌等が疑われるだけであり、慢性腎炎の検査対象とならないため、泌尿器科において異常なしと判断されることが多い。尿潜血陽性者が数年して蛋白尿が陽性になって初めて腎臓内科を受診し、腎炎と診断され、すでに進行している患者が少なくない。通常、蛋白尿が陽性にならなければ腎臓内科受診勧告はされない。
そこで本発明者は、蛋白尿は陽性ではないが、尿潜血陽性者に着目し、ＩｇＡ腎症を早期発見するための手段について種々検討したところ、尿潜血陽性者に対して、血中の３種のマーカーを測定し、その３種のマーカーをロジスティック回帰モデルにより解析したところ、当該解析スコアが高い被験者がＩｇＡ腎症であると早期に診断できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の〔１〕及び〔２〕を提供するものである。

〔１〕ＩｇＡ腎症の診断を目的として、尿潜血陽性被験者由来の血液中の糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値及び糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値を測定し、当該３種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することを特徴とする検査法。
〔２〕前記ロジスティック回帰モデルの解析スコアが、健常人に比べて高い場合にＩｇＡ腎症の可能性があると判定する〔１〕記載の検査法。

本発明の検査法によれば、蛋白尿が陽性になる前の早期にＩｇＡ腎症が発見でき、病態が進行する前に的確な治療を行うことが可能となる。

ロジスティック回帰モデル解析結果とカットオフポイントを示す。

本発明の検査法は、尿潜血陽性被験者を対象として、血液中の糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値及び糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値を測定し、当該３種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することを特徴とする。

本発明の検査法の対象者は、尿潜血陽性被験者である。尿潜血は、通常の健康診断等で行われる尿潜血試験紙による検査で測定することができる。尿潜血試験紙には、過酸化水素クメン等の過酸化物とｏ−トリジン等の還元型色原体が含まれている、尿中に赤血球由来のヘモグロビンが含まれていれば、ヘモグロビンにより過酸化物を分解し、活性酸素を遊離する。この遊離した活性酸素により還元型色原体が強化され、試験紙に色が発生する。

尿潜血陽性被験者の血液中の糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値及び糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値の３種を測定する。

糖鎖異常ＩｇＡ１値は、例えばレクチンを用いたアフィニティクロマト法、ＥＬＩＳＡ等の免疫測定法により測定することができる。このうち、ＥＬＩＳＡにより測定するのが、正確であり好ましい。糖鎖異常ＩｇＡ１値は、精製された糖鎖異常ＩｇＡ１蛋白を対象として測定され、血清約２００μＬ中に含まれる糖鎖異常ＩｇＡ１値が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値をＩｇＡ値と掛け合わせ、糖鎖異常ＩｇＡ１値を算出し（Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）、ロジスティックモデル解析に使用する。

ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値は、ＥＬＩＳＡ法より測定することができる。ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値は、通常血漿を対象として測定され、血清約２００μＬ中の濃度が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。

糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値は、ＥＬＩＳＡ法により測定することができる。ＥＬＩＳＡで測定するのが、正確であり好ましい。糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値は、通常血漿を対象として測定され、血清約２００μＬ中の濃度が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。

ロジスティック回帰モデルによる解析は、市販の統計解析ソフトに含まれる多変量解析（ロジスティック回帰モデル）を用いて、前記３種の変数を入力して解析すればよい。ロジスティック回帰モデルは、ＪＭＰｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅＪａｐａｎ株式会社）より入手できる。具体的には、ロジスティック回帰モデルの変数として、糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値を入力し、ＩｇＡ腎症患者と健常者の各々の数値を定量化する。

得られた解析結果を、健常者についての解析結果と対比すれば、さらに正確な診断が可能である。また、健常者の解析結果、ＩｇＡ腎症の患者の解析結果、他の腎疾患患者の解析結果を多数データベース化すれば、より正確な診断が可能となる。被験者の解析スコアが、健常者のそれに比べて高い場合にＩｇＡ腎症の可能性があると診断できる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

実施例
尿潜血陽性者２７４７名に対して、血中の糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値及び糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値を測定し、ロジスティック回帰モデル解析を行った。健常人７４名の同マーカー値をコントロールとして用いた。

（ａ）糖鎖異常ＩｇＡ１（ＥＬＩＳＡ法）
糖鎖異常ヒトＩｇＡ１に対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定系のキットを用いて測定した。

（ｂ）ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体（ＥＬＩＳＡ法）
１）抗ヒトＩｇＧ抗体＜Ｆ（ａｂ’）₂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｇｏａｔａ
ｎｔｉ−ｈｕｍａｎＩｇＧ（Ｆｃγ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ）＞をＰＢＳを用いて２μｇ／ｍＬに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）ＨＲＰ酵素標識抗ヒトＩｇＡ抗体をＰＢＳ−Ｔを用いて１００００倍に希釈し、１００μＬずつ各ウェルに添加する。３７℃で２時間インキュベートし、酵素標識を行う。
８）プレートを５回洗浄する。
９）発色基質液を用いて５分間発色する。１規定の硫酸で反応を止める。
10）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。

（ｃ）糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ法）
１）糖鎖異常ＩｇＡ１のＦａｂ領域・ヒンジ部をＰＢＳで１．０μｇ／ｍＬに調整し、４℃で一晩インキュベートしプレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）２％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）Ｆｃ領域特異的マウス抗ヒトＩｇＡ抗体＜ｍｏｕｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｔｏｈｕｍａｎＩｇＡ（Ｆｃｓｐｅｃｉｆｉｃ）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌｓＩｎｃ．）＞をＰＢＳ−Ｔで０．５μｇ／ｍＬに調整し、各ウェルに１００μＬずつ添加し３７℃で２時間インキュベートする。
８）プレートを５回洗浄する。
９）ペルオキシダーゼで酵素標識された抗マウスＩｇＧ抗体＜Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＧｏａｔＡｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）＞をＰＢＳ−Ｔで２００００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃２時間でインキュベートする。
10）プレートを５回洗浄する。
11）発色基質液を用いて１５分間発色する。１規定の硫酸で反応を停止する。
12）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。

用いたロジスティック回帰モデルは、実際には、透析解析ソフトに変数を入力し、自動的に算出されるものである。
ＩｇＡ腎症患者と健常人の測定結果を用いて、各々の９５％信頼区間を計算した。その結果、ＩｇＡ腎症の９５％信頼区間が７．７、健常人の９５％信頼区間が３．０と算出され、図１に示すように、解析スコアが３．０以下の場合にＩｇＡ腎症の可能性が低い、３．１以上７．７未満の場合には要観察、７．７以上の場合にＩｇＡ腎症の可能性が高いと判定できることが判明した。

Claims

ＩｇＡ腎症の診断を目的として、尿潜血陽性被験者由来の血液中の糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値及び糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値を測定し、当該３種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することを特徴とする検査法。
前記ロジスティック回帰モデルの解析スコアが、健常人に比べて高い場合にＩｇＡ腎症の可能性があると判定する請求項１記載の検査法。