JP2016156838A - Screening method of richness giving material, richness giving material, and use of the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コク味付与物質のスクリーニング方法、コク味付与物質、飲食品の評価方法又は製造工程管理方法、及びコク味付与物質の検出用キットに関するものである。 The present invention relates to a screening method for a body taste imparting substance, a body taste imparting substance, a method for evaluating a food or drink or a manufacturing process management method, and a kit for detecting a body taste imparting substance.
飲食品分野において、呈味物質は古くから使用されてきた。特に、甘味、塩味、酸味、苦味に加え、２０００年に舌の味蕾にある感覚細胞にグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ４）が発見されたうま味を加えた５基本味を有する物質又はこれらを増強する物質が調味料として広く利用されている。さらに、上記では表せない重要な味覚に「コク味」があり、これは、味の強さ（飲み応え）、味のひろがり（厚み）及び味の経時変化（余韻）が合わさったものである。 In the food and drink field, taste substances have been used for a long time. In particular, in addition to sweet taste, salty taste, sour taste, and bitter taste, a substance having five basic tastes in which a glutamate receptor (mGluR4) was found in a sensory cell in the taste bud of the tongue in 2000, or a substance that enhances these substances Widely used as a seasoning. Furthermore, there is “kokumi” as an important taste that cannot be expressed above, which is a combination of taste strength (drinking response), taste spread (thickness), and temporal change in taste (resonance).
従来、コク味を付与するための物質として、グルタチオン誘導体、ゼラチン及びトロポミオシンの加熱物、スルホン基含有化合物、ペプチド性物質などがいくつか報告されている。特に、コク味を増強する方法として、ペプチド性のものは、分子量１０００〜５０００のペプチドとカルボニル化合物とのアミノ−カルボニル反応物を飲食品に添加することを特徴とする、飲食品の風味改良方法が開示されている（特許文献１）。また、１０００Ｄａ〜５０００Ｄａの画分から調製される糖鎖を有するメイラード反応産物がコク味付与作用を有することも開示されている（非特許文献１）。 Conventionally, several substances for imparting a rich taste have been reported, such as glutathione derivatives, heated products of gelatin and tropomyosin, sulfone group-containing compounds, and peptide substances. In particular, as a method for enhancing the body taste, a peptide-like one is characterized in that an amino-carbonyl reaction product of a peptide having a molecular weight of 1000 to 5000 and a carbonyl compound is added to the food or drink. Is disclosed (Patent Document 1). It is also disclosed that a Maillard reaction product having a sugar chain prepared from a fraction of 1000 Da to 5000 Da has a rich taste imparting action (Non-patent Document 1).
また、有効成分として、分子量が１，０００から３０，０００である糖鎖とペプチドが結合してなる糖ペプチドを含有するコク味付与機能を有する調味料などが開示されている（特許文献２）が、その例は少なく、未だ満足できるコク味付与物質は得られていない。 In addition, as an active ingredient, a seasoning having a rich taste imparting function containing a glycopeptide formed by binding a peptide with a sugar chain having a molecular weight of 1,000 to 30,000 is disclosed (Patent Document 2). However, there are only a few examples, and a satisfactory body taste imparting substance has not yet been obtained.
かかる現状から、より優れたコク味付与作用を有する物質の開発が望まれており、このため、簡便かつ高感度でコク味付与物質をスクリーニングできる方法が望まれている。例えばカルシウム受容体活性を指標とするスクリーニング方法（特許文献３）が開示されているが、この評価指標は、基本的にカルシウムのホメオスタシスに関して行われる生体機能・疾患病因に関する指標であり、目的とする「コク味」の指標としては、十分ではない。つまり、味わい又はコク味に寄与する成分の良好な指標がないことがコク味付与物質の開発の難しさにつながっていると言える。従って優れた指標を提示できるコク味付与物質のスクリーニング方法を提供することも必要とされている。 Under such circumstances, development of a substance having a more excellent kokumi imparting action is desired, and therefore, a method capable of screening a kokumi imparting substance simply and with high sensitivity is desired. For example, a screening method (Patent Document 3) using calcium receptor activity as an index is disclosed. This evaluation index is an index related to biological function / disease pathogenesis basically performed in relation to calcium homeostasis. It is not enough as an indicator of “kokumi”. That is, it can be said that the lack of a good index of a component that contributes to taste or richness leads to difficulty in developing a richness imparting substance. Therefore, it is also necessary to provide a screening method for a body taste imparting substance that can present an excellent index.
本発明は、少量で優れたコク味付与作用を発揮するコク味付与物質の新規なスクリーニング方法、及び少量で優れたコク味付与作用を発揮するコク味付与物質を提供することを課題とする。さらに、コク味付与物質を指標とする飲食品の評価方法及び製造工程管理方法、並びにコク味付与物質の検出用キットを提供することも課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel screening method for a kokumi imparting substance that exhibits an excellent kokumi imparting action in a small amount, and a kokumi imparting substance that exhibits an excellent kokumi imparting action in a small quantity. Furthermore, it is another object of the present invention to provide a food / beverage product evaluation method and a production process management method using a body taste imparting substance as an index, and a kit for detecting a body taste imparting substance.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、タンパク質又はペプチド中の側鎖アミノ基とカルボニル化合物とがアミノ−カルボニル反応（糖化反応又はメイラード反応ともいう）して生成するアミノ−カルボニル反応物である終末糖化産物ＡＧＥ（Advanced Glycation End Products）、さらに好ましくはカルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体と反応性を有する（該抗体と結合する）物質に、優れたコク味付与作用があることを見出した。また、カルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体と反応性を有する物質の中でも、麦汁煮沸液に由来する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドが特に強いコク味付与作用を有することを見出した。背景技術にも記載したが、国際公開ＷＯ２００６／１０４０２２に開示された調味料は、糖ペプチド（分子量が１，０００から３０，０００）を含有するが、本発明のスクリーンニング方法により得られるコク味付与物質は、タンパク質又はペプチド中の側鎖アミノ基とカルボニル化合物とがアミノ−カルボニル反応（糖化反応又はメイラード反応ともいう）して生成するアミノ−カルボニル反応物である終末糖化産物ＡＧＥであるため、前記糖ペプチドとは構造的にも全く異なるコク味付与物質である。また、本発明のスクリーニング方法で得られたコク味付与物質を飲食品に添加することにより飲食品にコク味を付与する又は該飲食品のコク味を増強させることができること、このような物質を指標として、飲食品のコク味等の定量的な評価及び飲食品の製造工程管理をすることができることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that an amino-carbonyl reaction (also referred to as a saccharification reaction or a Maillard reaction) is generated between a side chain amino group in a protein or peptide and a carbonyl compound. -A glycation end product AGE (Advanced Glycation End Products) which is a carbonyl reaction product, more preferably a substance reactive with an antibody against carboxyalkyl amino acid (binding to the antibody) has an excellent body taste imparting action. I found it. Moreover, it discovered that the peptide of the molecular weight 10-20 kDa derived from wort boiling liquid has especially strong kokumi imparting effect | action among the substances reactive with the antibody with respect to a carboxyalkyl amino acid. Although described in the background art, the seasoning disclosed in International Publication WO2006 / 104022 contains a glycopeptide (molecular weight of 1,000 to 30,000), but is rich in taste obtained by the screening method of the present invention. Since the imparting substance is a terminal glycation product AGE that is an amino-carbonyl reaction product generated by an amino-carbonyl reaction (also referred to as a saccharification reaction or a Maillard reaction) between a side chain amino group in a protein or peptide and a carbonyl compound, It is a body taste imparting substance that is completely different from the glycopeptide in terms of structure. In addition, by adding the body taste imparting substance obtained by the screening method of the present invention to a food or drink, the body taste can be imparted to the food or drink, or the body taste of the food or drink can be enhanced. As an index, it discovered that quantitative evaluation, such as the rich taste of food-drinks, and the manufacturing process management of food-drinks could be performed.
The present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.
That is, the present invention includes the following inventions.
（１）カルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体を使用し、該抗体に対する反応性を指標とすることを特徴とするコク味付与物質のスクリーニング方法。
（２）カルボキシアルキルアミノ酸が、カルボキシメチルリジン又はカルボキシエチルリジンである前記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）コク味付与物質が、甘味、塩味、酸味、苦味及びうま味の少なくとも一種を増強するものである前記（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法。
（４）（ａ）抗体と被験物質とを接触させる工程、（ｂ）被験物質に対する該抗体の結合を検出する工程、及び（ｃ）該抗体に結合した被験物質を候補物質として選択する工程をこの順に含む前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）抗体が、モノクローナル抗体である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）被験物質が、麦汁由来のものである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により得られるコク味付与物質。
（８）麦芽煮沸液由来のものである前記（７）に記載のコク味付与物質。
（９）カルボキシメチルリジンを含み、かつ分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドである前記（７）又は（８）に記載のコク味付与物質。
（１０）前記（７）〜（９）のいずれかに記載のコク味付与物質を指標とした、飲食品の評価方法又は製造工程管理方法。
（１１）前記（７）〜（９）のいずれかに記載のコク味付与物質の量を測定する工程を含む前記（１０）に記載の方法。
（１２）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うためのカルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体を含むコク味付与物質検出用キット。
(1) A screening method for a body taste imparting substance, characterized by using an antibody against a carboxyalkyl amino acid and using the reactivity to the antibody as an index.
(2) The screening method according to (1), wherein the carboxyalkyl amino acid is carboxymethyllysine or carboxyethyllysine.
(3) The screening method according to (1) or (2) above, wherein the body taste imparting substance enhances at least one of sweet taste, salty taste, sour taste, bitter taste and umami taste.
(4) (a) contacting the antibody with the test substance, (b) detecting the binding of the antibody to the test substance, and (c) selecting the test substance bound to the antibody as a candidate substance. The method according to any one of (1) to (3), which is included in this order.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the test substance is derived from wort.
(7) A body taste imparting substance obtained by the method according to any one of (1) to (6).
(8) The richness imparting substance according to (7), which is derived from a malt boiling solution.
(9) The rich taste imparting substance according to (7) or (8), which contains carboxymethyllysine and is a peptide having a molecular weight of 10 to 20 kDa.
(10) A method for evaluating a food or drink or a manufacturing process management method using the body taste imparting substance according to any one of (7) to (9) as an index.
(11) The method according to (10), including a step of measuring the amount of the body taste imparting substance according to any one of (7) to (9).
(12) A kit for detecting a body taste imparting substance comprising an antibody against a carboxyalkyl amino acid for performing the screening method according to any one of (1) to (5).
本発明によれば、少量で優れたコク味付与作用を発揮するコク味付与物質を効果的にスクリーニングすることができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られるコク味付与物質は、優れたコク味付与作用を有するものであるため、該物質を少量使用するだけで飲食品のコク味を効果的に増強することができる。さらに、該コク味付与物質を指標とすることにより、飲食品の品質等の評価、飲食品の製造工程における管理等を効果的に行なうことができる。 According to the present invention, a kokumi imparting substance that exhibits an excellent kokumi imparting action in a small amount can be effectively screened. Moreover, since the body taste imparting substance obtained by the screening method of the present invention has an excellent body taste imparting action, it is possible to effectively enhance the body taste of food and drink only by using a small amount of the substance. it can. Furthermore, by using the body taste imparting substance as an index, it is possible to effectively evaluate the quality and the like of the food and drink, and manage the food and drink in the manufacturing process.
本発明のコク味付与物質のスクリーニング方法は、タンパク質又はペプチドのアミノ−カルボニル反応産物（メイラード反応したタンパク質）に対する抗体を使用するものであり、カルボキシアルキルアミノ酸（以下、ＣＭ化アミノ酸ともいう）、ペントシジンなどのＡＧＥに対する抗体を使用し、該抗体に対する反応性を指標とする。好ましくは、カルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体を使用し、該抗体に対する反応性を指標とする。 The screening method for a body taste imparting substance of the present invention uses an antibody against an amino-carbonyl reaction product of a protein or peptide (a protein subjected to Maillard reaction), and is a carboxyalkyl amino acid (hereinafter also referred to as CM-modified amino acid), pentosidine. An antibody against AGE such as is used, and the reactivity to the antibody is used as an index. Preferably, an antibody against a carboxyalkyl amino acid is used, and the reactivity with the antibody is used as an index.
カルボキシアルキルアミノ酸として、好ましくは、当該カルボキシアルキルアミノ酸のアルキル部分が炭素原子１個から炭素原子４個の低級アルキルであるものであり、より好ましくは、メチル又はエチルであり、特に好ましくは、メチルである。当該カルボキシアルキルアミノ酸のアミノ酸部分は、側鎖にアミノ基を有するアミノ酸であり、リジン、アルギニン、アスパラギン、又はグルタミンが好ましい。特に好ましくは、リジンである。
例えば、カルボキシアルキルアミノ酸中、カルボキシメチルリジン（以下、ＣＭＬともいう）は、側鎖アミノ基がカルボキシメチル化（以下、ＣＭ化ともいう）されたリジン（Ｎ−ε−カルボキシメチルリジン）であり、本発明におけるカルボキシアルキルアミノ酸として好ましい。同様に、アルキル部分がエチルであるカルボキシエチルリジン（以下、ＣＥＬともいう）、アミノ酸部分がアルギニンであるカルボキシメチルアルギニン（以下、ＣＭＡともいう）なども好適である。
As the carboxyalkyl amino acid, preferably, the alkyl part of the carboxyalkyl amino acid is a lower alkyl having 1 to 4 carbon atoms, more preferably methyl or ethyl, and particularly preferably methyl. is there. The amino acid part of the carboxyalkyl amino acid is an amino acid having an amino group in the side chain, and lysine, arginine, asparagine, or glutamine is preferable. Particularly preferred is lysine.
For example, in a carboxyalkyl amino acid, carboxymethyl lysine (hereinafter also referred to as CML) is lysine (N-ε-carboxymethyl lysine) in which a side chain amino group is carboxymethylated (hereinafter also referred to as CM), Preferred as the carboxyalkyl amino acid in the present invention. Similarly, carboxyethyl lysine (hereinafter also referred to as CEL) in which the alkyl portion is ethyl, carboxymethyl arginine (hereinafter also referred to as CMA) in which the amino acid portion is arginine are suitable.
本発明における抗体は、カルボキシメチルリジン又はカルボキシエチルリジンに対する抗体が好ましく、中でも、カルボキシメチルリジンに対する抗体がより好ましい。 The antibody in the present invention is preferably an antibody against carboxymethyllysine or carboxyethyllysine, and more preferably an antibody against carboxymethyllysine.
上記のカルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体は、遊離のカルボキシアルキルアミノ酸に反応し、かつタンパク質又はペプチドを構成するアミノ酸であって側鎖にアミノ基を有するアミノ酸全体の内、アミノ基が１つでもカルボキシアルキル化された形で存在するカルボキシアルキルアミノ酸にも反応する抗体であることが好ましい。すなわち本発明で用いられる抗体は、遊離のカルボキシアルキルアミノ酸、カルボキシアルキルアミノ酸を含むタンパク質及びカルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチドと反応性を有する（結合する）抗体である。中でも、本発明で用いられるカルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体として、カルボキシアルキルアミノ酸を含むタンパク質及びカルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチドと反応性を有する（結合する）抗体がより好ましい。 The antibody against the above carboxyalkyl amino acid reacts with a free carboxyalkyl amino acid and is a carboxyalkylated amino acid that constitutes a protein or peptide and has an amino group in the side chain. Preferably, the antibody is also reactive with carboxyalkyl amino acids present in the form. That is, the antibody used in the present invention is an antibody having reactivity (binding) with a free carboxyalkyl amino acid, a protein containing a carboxyalkyl amino acid, and a peptide containing a carboxyalkyl amino acid. Among them, as the antibody against the carboxyalkyl amino acid used in the present invention, an antibody having reactivity (binding) with a protein containing carboxyalkyl amino acid and a peptide containing carboxyalkyl amino acid is more preferable.
本発明におけるカルボキシアルキルアミノ酸を含むタンパク質及びカルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチドは、通常、タンパク質又はペプチド中のリジン残基等の側鎖アミノ基とカルボニル化合物とが、アミノ−カルボニル反応（糖化反応又はメイラード反応ともいう）して生成するアミノ−カルボニル反応物であり、終末糖化産物ＡＧＥ（Advanced Glycation End Products）の一種である。カルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチドは、２個以上のアミノ酸を含めばよい。 In the present invention, a protein containing a carboxyalkyl amino acid and a peptide containing a carboxyalkyl amino acid usually have an amino-carbonyl reaction (glycation reaction or Maillard reaction) between a side chain amino group such as a lysine residue in the protein or peptide and a carbonyl compound. (Also referred to as an amino-carbonyl reaction product) and is a kind of advanced glycation end product (AGE). A peptide containing a carboxyalkyl amino acid may contain two or more amino acids.
本発明の方法において用いられる抗体は、抗原であるカルボキシアルキルアミノ酸、カルボキシアルキルアミノ酸を含むタンパク質、及びカルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチドに結合し得る抗体分子全体又はその断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、モノクローナル抗体である。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である（例えばSambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照）。 The antibody used in the method of the present invention may be a whole antibody molecule or a fragment thereof (for example, Fab or F (ab ′), which can bind to antigen carboxyalkyl amino acids, proteins containing carboxyalkyl amino acids, and peptides containing carboxyalkyl amino acids. ) 2 fragments), which may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies. Preferably, it is a monoclonal antibody. Polyclonal and monoclonal antibodies can be produced by any of a variety of methods. Methods for producing such antibodies are well known in the art (see, eg, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
本発明の方法において用いられるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、市販のものを購入して使用することができる。例えば、トランスジェニック社から供給されているＡＧＥ抗体が挙げられる。また、カルボキシアルキルアミノ酸を含むタンパク質又はカルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチドを抗原として用いて製造することもできる。例えば、カルボキシメチルアミノ酸に対する抗体は、特開２０００−２１９７００号公報、特開２００３−１６０５９９号公報、特許第４０１２７２２号明細書、特開２００７−２７７２６３号公報、特開２００７−３２６８７０号公報、特開２００９−９６７３１号公報等に記載されている方法に従って製造することができる。カルボキシエチルアミノ酸に対する抗体は、例えば、特開２００８−２６６２７１号公報、特開２０００−７７００号公報等に記載されている方法に従って製造することができる。
以下に、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）等のＣＭ化アミノ酸に対する抗体を例に、抗体の具体的な製造方法の一例を示す。
Commercially available monoclonal antibodies and polyclonal antibodies used in the method of the present invention can be purchased. For example, the AGE antibody supplied from the transgenic company is mentioned. It can also be produced using a protein containing a carboxyalkyl amino acid or a peptide containing a carboxyalkyl amino acid as an antigen. For example, antibodies against carboxymethyl amino acids are disclosed in JP 2000-219700, JP 2003-160599, JP 4012722, JP 2007-277263, JP 2007-326870, JP It can be produced according to the method described in, for example, 2009-96731. Antibodies against carboxyethyl amino acids can be produced, for example, according to the methods described in JP 2008-266271 A, JP 2000-7700 A, and the like.
Hereinafter, an example of a specific method for producing an antibody will be described by taking an antibody against a CM amino acid such as carboxymethyllysine (CML) as an example.
１．ＣＭ化タンパク質、ＣＭ化ペプチド及びＣＭ化アミノ酸の調製
ＣＭ化する対象となるタンパク質は、複合タンパク質、単純タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質などいずれのものでもよい。これらのタンパク質としては、例えばアルブミン（ＢＳＡ等）、ヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、β２マイクログロブリン、ヒストン、コラーゲン、血球膜タンパク質、又は低密度若しくは高密度リポタンパク質などが挙げられる。また、タンパク質に限らず、ペプチド、例えばオリゴペプチド、ポリペプチドも用いることができ、タンパク質から修飾又は分解を受けて合成されたものも使用可能である。例えば、ＣＭＬに対する抗体を製造する場合には、リジンを含むタンパク質、ペプチド又はリジンをＣＭ化して用いる。
1. Preparation of CMized protein, CMized peptide and CMated amino acid The protein to be CMized may be a complex protein, a simple protein, a glycoprotein, a lipoprotein, or the like. These proteins, such as albumin (BSA, etc.), hemoglobin, keyhole limpet hemocyanin (KLH), human serum albumin (HSA), ribonuclease (RNase), beta 2 microglobulin, histone, collagen, blood cell membrane proteins, or Examples thereof include low density or high density lipoprotein. In addition to proteins, peptides such as oligopeptides and polypeptides can also be used, and those synthesized by modification or degradation from proteins can also be used. For example, when an antibody against CML is produced, a protein, peptide, or lysine containing lysine is used as a CM.
上記のタンパク質又はペプチド中の側鎖アミノ基をＣＭ化するには、ＢＳＡなどのタンパク質数十ｍｇ／ｍＬ（例えば５〜５０ｍｇ／ｍＬ）と数十ｍｇ／ｍＬ（例えば１０〜１００ｍｇ／ｍＬ）のグリオキシル酸をリン酸緩衝液中（グリオキシル酸の５倍のモル量のＮａＣＮＢＨ３を含む、ｐＨ７．４）で、室温で２４時間程度反応させる方法などが好適である。上記方法によって得られたＣＭ化タンパク質は、透析、液体カラムクロマトグラフィーなどによって精製された後、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の作製に供される。 In order to convert the side chain amino group in the above protein or peptide into CM, several tens mg / mL (for example, 5 to 50 mg / mL) of protein such as BSA and tens of mg / mL (for example, 10 to 100 mg / mL) are used. A method in which glyoxylic acid is reacted in a phosphate buffer solution (containing NaCNBH 3 in a molar amount 5 times that of glyoxylic acid, pH 7.4) at room temperature for about 24 hours is preferable. The CM protein obtained by the above method is purified by dialysis, liquid column chromatography, or the like, and then subjected to production of a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
ＣＭ化ペプチド及びＣＭ化アミノ酸は、上述したように得られたＣＭ化タンパク質をトリプシン、ペプシン、パパイン、アプロチニン、ロイペプチン等のプロテアーゼ又は、塩酸、硫酸などの酸による加水分解処理で得ることができる。例えば、数十ｍｇ／ｍＬ（例えば５〜７０ｍｇ／ｍＬ）の上記ＣＭ化タンパク質数十μＬ（例えば１０〜５０μＬ）と数十ｍｇ／ｍＬ（例えば１０〜８０ｍｇ／ｍＬ）のトリプシン溶液数十μＬ（例えば２０〜５０μＬ）とを混合し、３７℃水浴中で３時間反応させる。５ｍＭのＡＥＢＳＦで反応を停止させ、これにより、上記ＣＭ化タンパク質を酵素処理することができ、ＣＭ化ペプチド及びＣＭ化アミノ酸を得ることができる。なお、上記混合溶液にトリプシン阻害剤（例えば4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonylfluoride,HCL（AEBSF））を添加することによって、トリプシンによる加水分解反応を停止させることができる。 The CMized peptide and the CMated amino acid can be obtained by subjecting the CMized protein obtained as described above to a hydrolysis treatment with a protease such as trypsin, pepsin, papain, aprotinin or leupeptin, or an acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid. For example, several tens of μL (for example, 10 to 50 μL) of the above-mentioned CM protein of tens of mg / mL (for example, 5 to 70 mg / mL) and tens of μL of trypsin solution of several tens of mg / mL (for example, 10 to 80 mg / mL) ( For example, 20 to 50 μL) is mixed and reacted in a 37 ° C. water bath for 3 hours. The reaction is stopped with 5 mM AEBSF, whereby the C-merized protein can be enzymatically treated to obtain a C-merized peptide and a C-merized amino acid. The trypsin hydrolysis reaction can be stopped by adding a trypsin inhibitor (for example, 4- (2-Aminoethyl) benzenesulfonylfluoride, HCL (AEBSF)) to the mixed solution.
２．ＣＭ化タンパク質に対する抗体の作製方法
（１）ＣＭ化タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
前記のようにして作製したＣＭ化タンパク質、ＣＭ化ペプチド又はＣＭ化ペプチドを抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１０ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、例えば、好ましくは数日から数週間間隔、より好ましくは２〜５週間間隔で、好ましくは１〜１０回、より好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から、好ましくは１〜６０日後、より好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
2. Preparation method of antibody against CM protein (1) Preparation of monoclonal antibody against CM protein (i) Collection of antibody-producing cells Using the CM protein, CM peptide or CM peptide prepared as described above as an antigen Administration to animals such as rats, mice, rabbits and the like. The dose of the antigen per animal is 0.1 to 10 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 μg when an adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. The immunization interval is not particularly limited, and for example, immunization is preferably performed at intervals of several days to several weeks, more preferably at intervals of 2 to 5 weeks, preferably 1 to 10 times, more preferably 2 to 5 times. Then, antibody-producing cells are collected preferably 1 to 60 days later, more preferably 1 to 14 days after the final immunization day. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
（ｉｉ） 細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウス等の動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−Ｉ等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
(Ii) Cell fusion Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed to obtain hybridomas. As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred. Examples of myeloma cells include P3X63-Ag. 8). Examples include mouse myeloma cell lines such as U1 (P3U1) and NS-I.
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の動物細胞培養用培地中で、好ましくは約１×１０６〜１×１０７個／ｍＬの抗体産生細胞と約２×１０５〜２×１０６個／ｍＬのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１程度が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量約１０００〜６０００ダルトン（Ｄａ）のポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。 Next, the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused. Cell fusion is preferably performed at about 1 × 10 6 to 1 × 10 7 antibody-producing cells and about 2 × 10 5 to about 1 × 10 6 to 1 × 10 7 cells / mL in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 medium. 2 × 10 6 cells / mL myeloma cells are mixed (a cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably about 5: 1), and a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter. As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of about 1000 to 6000 daltons (Da) can be used. Alternatively, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
（ｉｉｉ） ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等で適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０５個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
(Iii) Selection and cloning of hybridoma The target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment. As a method for this, the cell suspension is appropriately diluted with, for example, fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, then plated on a microtiter plate at about 3 × 10 5 cells / well, a selection medium is added to each well, and thereafter The culture is carried out with the selective medium changed. As a result, cells that grow from about 10 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ＣＭ化タンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。 Next, the culture supernatant of the hybridoma that has grown is screened for the presence of antibodies that react with the CM protein. Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by enzyme immunoassay, radioimmunoassay or the like.
具体的には、ＥＬＩＳＡ法等により複数種のＣＭ化タンパク質に反応し、複数種のＣＭ化されていないタンパク質を抗原として、前者に反応し後者に反応しないモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。そして、最終的に、複数種のＣＭ化タンパク質とは反応するがＣＭ化されていないタンパク質に反応しないモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。 Specifically, a hybridoma that is a cell that produces a monoclonal antibody that reacts with a plurality of types of CM-modified proteins by ELISA, etc., reacts with the former and does not react with the latter, using a plurality of types of non-CM-converted proteins as antigens. Establish. Cloning of fused cells is performed by the limiting dilution method or the like. Finally, a hybridoma that is a cell producing a monoclonal antibody that reacts with a plurality of types of CM proteins but does not react with non-CM proteins is established.
（ｉｖ） モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、得られたハイブリドーマを無血清の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
(Iv) Collection of monoclonal antibody As a method of collecting a monoclonal antibody from an established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed. In the cell culture method, the obtained hybridoma is cultured in a serum-free animal cell culture medium for 7 to 14 days under normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration), and an antibody is obtained from the culture supernatant. To get.
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。 In the case of the ascites formation method, about 1 × 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a mammal derived from a myeloma cell and the same strain, and the hybridomas are proliferated in large quantities. And ascitic fluid is collected after 1-2 weeks. When antibody purification is required in the antibody collection method, known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography are appropriately selected, or a combination thereof is used. Can be purified.
本発明においては、上記方法により得られるモノクローナル抗体等を好適に使用することができる。例えば、ＣＭＬに対する抗体として、特許第４０１２７２２及び特開２００３−１６０５９９号公報の実施例１に記載されているＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＦ−１Ｇ（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号）に、平成１３年１１月６日付でＦＥＲＭ Ｐ−１８５８９として寄託されている）；特開２０００−２１９７００号の実施例１に記載されているＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＣＭＳ−１０（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号）に、平成１１年１月２０日付でＦＥＲＭ Ｐ−１７１５３として寄託されている）等のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を好適に使用できる。より好ましくは、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＦ−１Ｇ（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号）に、平成１３年１１月６日付でＦＥＲＭ Ｐ−１８５８９として寄託されている）により産生されるモノクローナル抗体である。ＣＥＬに対する抗体として、例えば、特開２０００−７７００号公報の実施例１に記載されているハイブリドーマＫＮＨ−３０（名称：「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＫＮＨ−３０」、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号）に、平成１０年６月１６日付でＦＥＲＭ Ｐ−１６８４２として寄託されている）等により産生されるモノクローナル抗体等を好適に使用できる。 In the present invention, a monoclonal antibody obtained by the above method can be suitably used. For example, as an antibody against CML, Mouse-Mouse hybridoma NF-1G (Independent Administrative Institution National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Japan), which is described in Patent No. 4012722 and Example 1 of JP-A-2003-160599, is disclosed. No. 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) was deposited as FERM P-18589 on November 6, 2001); Mouse-Mouse described in Example 1 of JP-A-2000-219700 hybridoma CMS-10 (incorporated administrative agency National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center (1-1-1, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan) deposited as FERM P-17153 on January 20, 1999 Prefer monoclonal antibodies produced by hybridomas such as It can be used for. More preferably, Mouse-Mouse hybridoma NF-1G (Independent Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) (Deposited as -18589). As an antibody against CEL, for example, the hybridoma KNH-30 (name: “Mouse-Mouse hybridoma KNH-30” described in Example 1 of JP-A-2000-7700, patented organism of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) Monoclonal antibodies produced by the Deposit Center (deposited as FERM P-16842 on June 16, 1998) at Tsukuba City East 1-1-1 Tsukuba, Ibaraki, Japan, etc. can be suitably used.
（２）ＣＭ化タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製
前記ＣＭ化タンパク質又はＣＭ化ペプチドを抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法(ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)又は EIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA；radioimmuno assay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。
(2) Preparation of polyclonal antibody against CM protein: The CM protein or peptide is used as an antigen and administered to a mammal such as a rat, mouse, rabbit or the like. The dose of the antigen per animal is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 μg when an adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or the like. The immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. And 6 to 60 days after the last immunization, the antibody titer is measured by enzyme immunoassay (ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) or EIA (enzyme immunoassay)), radioimmunoassay (RIA), etc. On the day when the maximum antibody titer is shown, blood is collected to obtain antiserum.
その後は、ＣＭ化タンパク質（ＢＳＡなど）を用い、これらタンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。そして、ＣＭ化タンパク質に反応し、ＣＭ化されていないタンパク質に反応しない画分を集めることで、ＣＭ化されたタンパク質のみに反応するポリクローナル抗体を得ることができる。 Thereafter, CM-modified proteins (such as BSA) are used, and the reactivity of polyclonal antibodies in the antiserum against these proteins is measured by ELISA or the like. By collecting fractions that react with the CM protein and do not react with the non-CM protein, a polyclonal antibody that reacts only with the CM protein can be obtained.
上述した抗体の製造方法において、例えば、ＣＭ化タンパク質に替えてカルボキシエチル（ＣＥ化）タンパク質、ＣＥ化ペプチド、又はＣＥ化アミノ酸を用いると、カルボキシエチルアミノ酸に対する抗体を製造することができる。 In the above-described antibody production method, for example, when carboxyethyl (CE) protein, CE peptide, or CE amino acid is used instead of CM protein, an antibody against carboxyethyl amino acid can be produced.
本発明においては、上記カルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体を使用し、該抗体に対する反応性を指標としてコク味付与物質をスクリーニングする。該抗体に対する反応性とは、通常、該抗体と結合することを意味する。本発明の方法は、例えば、味の強さ（飲み応え）、味のひろがり（厚み）及び味の経時変化（余韻）の少なくとも一種を増強するコク味付与物質のスクリーニングに好適である。また、飲食品等において味の強さ（飲み応え）、味のひろがり（厚み）及び味の経時変化（余韻）の少なくとも一種が増強されると、甘味、塩味、酸味、苦味及びうま味のいずれか又はこれらの２以上も増強されることから、本発明の方法は、甘味、塩味、酸味、苦味及びうま味の少なくとも一種を増強するコク味付与物質のスクリーニングにも好適である。 In the present invention, an antibody against the carboxyalkyl amino acid is used, and a body taste imparting substance is screened using the reactivity to the antibody as an index. The reactivity with the antibody usually means binding with the antibody. The method of the present invention is suitable, for example, for screening for a body taste imparting substance that enhances at least one of taste intensity (drinking response), taste spread (thickness), and temporal change in taste (resonance). In addition, when at least one of the strength of the taste (drinking response), the spread of the taste (thickness), and the change in taste over time (the reverberation) is enhanced in foods and beverages, etc. Alternatively, since two or more of these are enhanced, the method of the present invention is also suitable for screening for a body taste imparting substance that enhances at least one of sweet taste, salty taste, sour taste, bitter taste and umami taste.
本発明の方法は、例えば、（ａ）カルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体と被験物質とを接触させる工程、（ｂ）被験物質に対する該抗体の結合を検出する工程、及び（ｃ）該抗体に結合した被験物質を候補物質として選択する工程をこの順に含むことが好ましい。本発明の方法は、さらに、（ｄ）選択した候補物質のコク味付与効果を評価する工程を含んでもよい。 The method of the present invention includes, for example, (a) contacting an antibody against a carboxyalkyl amino acid with a test substance, (b) detecting the binding of the antibody to the test substance, and (c) a test bound to the antibody. It is preferable to include the process of selecting a substance as a candidate substance in this order. The method of the present invention may further include a step (d) of evaluating the body taste imparting effect of the selected candidate substance.
工程（ａ）における抗体と被験物質との接触（反応）は、通常溶液中で行われる。工程（ａ）において、抗体及び被験物質を溶液中で反応させる条件は特に限定されず、例えば、後述する工程（ｂ）で使用される検出方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法などの免疫検出法）における通常の条件を用いればよい。 The contact (reaction) between the antibody and the test substance in the step (a) is usually performed in a solution. In the step (a), the conditions for reacting the antibody and the test substance in the solution are not particularly limited. For example, the detection method used in the step (b) described later (for example, an immunodetection method such as an ELISA method) These conditions may be used.
工程（ｂ）において、被験物質に対する抗体の結合（被験物質と抗体との結合）を検出する方法は特に限定されず、通常、公知の免疫検出法を用いることができる。例えば、酵素標識抗体を用いる方法のほか、抗体と抗原との結合を検出する公知の方法を好適に採用することができる。
例えば、酵素標識抗体等を用いて、被験物質を添加した場合と添加しなかった場合との発色の程度を比較し、被験物質を添加した場合の発色の程度が大きい（又は小さい）場合に該被験物質が抗体と結合したと判定される。
一例として、例えば、工程（ａ）で被験物質と上記抗体とを反応させた後、酵素標識抗体（二次抗体）を添加して反応させる工程、次いで該酵素の基質を添加して酵素による発色反応をさせる工程、発色の程度を比色計等により測定する工程、該発色の程度を、被験物質を添加しない場合と比較する工程を行ない、該被験物質を添加した場合の発色の程度が、被験物質を添加しない場合と比較して大きい場合に該被験物質が抗体と結合したと判定される。
このような方法として、例えば、工程（ａ）で被験物質と上記抗体とを反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）をさらに反応させる方法が挙げられ、ＣＭ化アミノ酸、ＣＭ化ペプチド及びＣＭ化タンパク質等のカルボキシアルキルアミノ酸又は該アミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質を検出及び定量することが可能である。
In the step (b), the method for detecting the binding of the antibody to the test substance (the bond between the test substance and the antibody) is not particularly limited, and generally known immunodetection methods can be used. For example, in addition to a method using an enzyme-labeled antibody, a known method for detecting the binding between an antibody and an antigen can be suitably employed.
For example, using an enzyme-labeled antibody or the like, the degree of color development is compared between when the test substance is added and when the test substance is not added, and when the degree of color development when the test substance is added is large (or small), It is determined that the test substance has bound to the antibody.
As an example, for example, after reacting the test substance and the antibody in step (a), an enzyme-labeled antibody (secondary antibody) is added and reacted, and then a substrate for the enzyme is added to cause color development by the enzyme. The step of reacting, the step of measuring the degree of color development with a colorimeter, the step of comparing the degree of color development with the case where no test substance is added, the degree of color development when the test substance is added, When the test substance is larger than when no test substance is added, it is determined that the test substance is bound to the antibody.
As such a method, for example, after reacting the test substance with the antibody in step (a), an anti-mouse IgG antibody (secondary antibody) labeled with horseradish peroxidase (HRP) or the like is further reacted. It is possible to detect and quantify carboxyalkyl amino acids such as C-merized amino acids, C-merized peptides and C-merized proteins, or peptides or proteins containing the amino acids.
また、酵素標識抗体を用いる方法として、例えば、競合ＥＬＩＳＡ法（好ましくは間接競合ＥＬＩＳＡ法）によって被験物質に対する抗体の結合を検出することができる。ＣＭ化アミノ酸に対する抗体を用いる場合を例に挙げて説明すると、間接競合ＥＬＩＳＡ法においては、既知のＣＭ化タンパク質、ＣＭ化ペプチド又はＣＭ化アミノ酸（例えば、上記抗体の製造に用いたＣＭ化アミノ酸等）をマイクロプレート、試験管等にコーティング（固定化）したものに、被験物質を含む試料及び上記ＣＭ化アミノ酸に対する抗体（一次抗体）を添加し競合反応をさせ、固定化したＣＭ化アミノ酸等と結合しなかった被験物質及び一次抗体を洗浄除去後、二次抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などで標識した抗マウスＩｇＧ抗体）を加えて一次抗体と結合させる。コントロールにおいては、被験物質を含む試料を添加しない以外は同様の手順を行う。次いで、酵素基質を添加して酵素による発色反応をさせ、発色の程度を比色計等で測定し、被験物質を添加した場合と被験物質を添加しなかった場合（コントロール）との発色度を比較する。被験物質の添加により、コントロールと比較して発色度が減少する場合には、該被験物質がＣＭ化アミノ酸に対する抗体に結合したと判定される。
ＣＭ化アミノ酸に対する抗体への結合が検出された被験物質は、候補物質として選択される。
In addition, as a method using an enzyme-labeled antibody, for example, binding of an antibody to a test substance can be detected by a competitive ELISA method (preferably an indirect competitive ELISA method). The case of using an antibody against a CM-modified amino acid will be described as an example. In the indirect competitive ELISA method, a known CM-protein, CM-peptide or CM-amino acid (for example, the CM-amino acid used for the production of the above-described antibody, etc.) ) Is coated (immobilized) on a microplate, test tube, etc., a sample containing a test substance and an antibody (primary antibody) against the CM-modified amino acid are added to cause a competitive reaction, After washing away the test substance and the primary antibody that did not bind, a secondary antibody (for example, an anti-mouse IgG antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP) or the like) is added to bind to the primary antibody. In the control, the same procedure is performed except that the sample containing the test substance is not added. Next, an enzyme substrate is added to cause a color reaction with the enzyme, the degree of color development is measured with a colorimeter or the like, and the degree of color development when the test substance is added and when the test substance is not added (control) is determined. Compare. When the color development degree is decreased as compared with the control due to the addition of the test substance, it is determined that the test substance is bound to the antibody against the CM amino acid.
The test substance in which the binding to the antibody against the C-merized amino acid is detected is selected as a candidate substance.
本発明の方法においては、１種又は２種以上の被験物質を含む試料を用いてスクリーニングを行なうことができる。試料は特に限定されないが、例えば、飲食品、その原料、中間原料等を好適に用いることができ、例えば、加熱や熟成などの工程によりメイラード反応が進行した飲食品、その原料、中間原料を好適に用いることができ、発泡酒等のビールテイスト飲料、ビール、及びその原料（麦汁、麦芽等）等のほか、シチュー、カレー、ラーメンや蛋白質加水分解調味料など、長時間加熱する食品も好適に用いることができる。さらに、日本酒、ワイン、熟成チーズ、味噌、醤油、塩辛などの熟成発酵食品も好適に用いることができる。試料は、好ましくは、麦汁、ワイン、ビール、味噌、日本酒、熟成チーズ等であり、特に好ましくは麦汁である。 In the method of the present invention, screening can be performed using a sample containing one or more test substances. Although the sample is not particularly limited, for example, foods and drinks, their raw materials, intermediate raw materials, etc. can be suitably used. For example, foods and drinks whose Maillard reaction has progressed through processes such as heating and aging, their raw materials, and intermediate raw materials are suitable. In addition to beer-taste beverages such as happoshu, beer, and their raw materials (wort, malt, etc.), stew, curry, ramen and protein hydrolyzed seasonings are also suitable for foods that are heated for a long time Can be used. Furthermore, aged fermented foods such as sake, wine, aged cheese, miso, soy sauce, and salted spices can also be suitably used. The sample is preferably wort, wine, beer, miso, Japanese sake, aged cheese, etc., and particularly preferably wort.
選択した候補物質のコク味付与効果の評価は、例えば、官能評価等により行なうことができる。例えば、選択した候補物質の水溶液を調製し、該水溶液の官能評価を行なうことによりコク味付与効果を判定できる。また、例えば、飲食品に該候補物質を添加し、該候補物質を添加しない場合と比較してコク味が増強されると、コク味付与効果があると判定される。本発明におけるコク味付与物質は、例えば、味の強さ（飲み応え）、味のひろがり（厚み）及び味の経時変化（余韻）の少なくとも一種を増強するものであることが好ましい。例えば、飲食品に該候補物質を添加し、該候補物質を添加しない場合と比較して、味の強さ（飲み応え）、味のひろがり（厚み）及び味の経時変化（余韻）の少なくとも一種が増強されると、コク味付与効果があると判定される。コク味付与効果が確認された候補物質は、本発明におけるコク味付与物質として好適に用いられる。 Evaluation of the body taste imparting effect of the selected candidate substance can be performed, for example, by sensory evaluation. For example, the body taste imparting effect can be determined by preparing an aqueous solution of the selected candidate substance and performing sensory evaluation of the aqueous solution. In addition, for example, when the candidate substance is added to a food or drink and the body is enhanced compared to the case where the candidate substance is not added, it is determined that there is a body taste imparting effect. The body taste imparting substance in the present invention is preferably, for example, a substance that enhances at least one of taste strength (drinking response), taste spread (thickness), and taste change with time (roughness). For example, as compared with the case where the candidate substance is added to food and drink and the candidate substance is not added, at least one of the strength of taste (drinking response), the spread of taste (thickness), and the change in taste over time (afterglow) If it is enhanced, it is determined that there is a rich taste imparting effect. Candidate substances that have been confirmed to have a kokumi imparting effect are preferably used as kokumi imparting substances in the present invention.
スクリーニング方法により得られた１種又は２種以上のコク味付与物質は、タンパク質及びペプチドの精製に用いられる公知の手法、例えば、ゲルろ過等によりさらに精製することができる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、二次元電気泳動、アミノ酸分析等のタンパク質及びペプチドの分析に用いられる公知の手法により、その構造、アミノ酸組成等を適宜決定できる。 One or two or more rich taste imparting substances obtained by the screening method can be further purified by a known technique used for purification of proteins and peptides, for example, gel filtration. In addition, the structure, amino acid composition, and the like can be appropriately determined by known techniques used for protein and peptide analysis such as SDS-PAGE, two-dimensional electrophoresis, and amino acid analysis.
本発明のスクリーニング方法で得られるコク味付与物質も、本発明の１つである。本発明のコク味付与物質は、通常、メイラード反応を受けたアミノ酸を含むタンパク質若しくはペプチド、又はメイラード反応を受けたアミノ酸である。中でも、メイラード反応を受けたアミノ酸を含むタンパク質又はペプチドが好ましい。また、好ましくは、カルボキシアルキルアミノ酸を含むタンパク質若しくはペプチド、又はカルボキシアルキルアミノ酸であり、より好ましくは、カルボキシアルキルアミノ酸を含むタンパク質又はペプチドである。中でも、好ましくは、カルボキシメチルアミノ酸を含むタンパク質若しくはペプチド、又はカルボキシメチルアミノ酸であり、特に好ましくは、カルボキシメチルリジンを含むタンパク質又はペプチドである。 The richness imparting substance obtained by the screening method of the present invention is also one aspect of the present invention. The body taste imparting substance of the present invention is usually a protein or peptide containing an amino acid that has undergone a Maillard reaction, or an amino acid that has undergone a Maillard reaction. Of these, proteins or peptides containing amino acids that have undergone Maillard reaction are preferred. Moreover, it is preferably a protein or peptide containing a carboxyalkyl amino acid, or a carboxyalkyl amino acid, and more preferably a protein or peptide containing a carboxyalkyl amino acid. Among them, preferred is a protein or peptide containing carboxymethyl amino acid or carboxymethyl amino acid, and particularly preferred is a protein or peptide containing carboxymethyl lysine.
本発明のコク味付与物質の好ましい態様の１つは、麦汁煮沸液由来のものである。また、本発明のコク味付与物質は、好ましくは、カルボキシメチルリジンを含むペプチドであり、中でも、分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドが好ましい。 One of the preferable embodiments of the body taste imparting substance of the present invention is derived from a wort boiling liquid. The body taste imparting substance of the present invention is preferably a peptide containing carboxymethyllysine, and among them, a peptide having a molecular weight of 10 to 20 kDa is preferable.
このようなカルボキシメチル化ペプチドは、例えば、試料として麦汁煮沸液を用い、カルボキシメチルリジンに対する抗体を用いて上記スクリーニング方法を行ない、選択された候補物質を含む組成物からＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により分子量約１０〜２０ｋＤａのペプチドを分離することにより容易に得ることができる。 Such a carboxymethylated peptide is obtained by, for example, using a wort boiling solution as a sample, performing the above screening method using an antibody against carboxymethyllysine, and then analyzing the molecular weight of the selected candidate substance from the composition by SDS-PAGE or the like. It can be easily obtained by separating a peptide of about 10-20 kDa.
上記コク味付与物質は、飲食品の評価方法、飲食品の製造工程管理における指標としても好適に用いられるものである。
上記コク味付与物質を指標とした、飲食品の評価方法又は製造工程管理方法も、本発明の１つである。指標として用いられるコク味付与物質は、１種又は２種以上であってよい。本発明の方法においては、コク味付与物質の量を指標とすることが好ましい。コク味付与物質の量を指標とすることにより、官能評価とは異なり、コク味を定量的に評価することができる。
The above-mentioned richness imparting substance is also suitably used as an index in food and beverage evaluation methods and food and beverage manufacturing process management.
A method for evaluating a food or drink or a method for managing a production process using the above-described richness imparting substance as an index is also one aspect of the present invention. The richness imparting substance used as an index may be one kind or two or more kinds. In the method of the present invention, the amount of the richness imparting substance is preferably used as an index. Unlike the sensory evaluation, the richness can be quantitatively evaluated by using the amount of the richness imparting substance as an index.
本発明の方法は、コク味付与物質の量を測定する工程を含むことが好ましい。本発明におけるコク味付与物質、すなわちＣＭ化アミノ酸、ＣＭ化ペプチド又はＣＭ化タンパク質等のカルボキシアルキルアミノ酸又は該アミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質（好ましくは、ＣＭ化ペプチド又はＣＭ化タンパク質等のカルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質）の量は、上述したスクリーニング方法で用いた抗体を用いて、酵素免疫測定法等の公知の方法により定量することができる。例えば、上述したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と試料とを反応させ、次いで酵素標識抗体を用いることにより、コク味付与物質であるＣＭ化アミノ酸、ＣＭ化ペプチド及びＣＭ化タンパク質等のカルボキシアルキルアミノ酸又は該アミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質を定量することができる。また、上述したスクリーニング方法で用いた抗体を用いて競合ＥＬＩＳＡ法を行なうことによっても、コク味付与物質であるＣＭ化アミノ酸、ＣＭ化ペプチド及びＣＭ化タンパク質等を定量することができる。 The method of the present invention preferably includes a step of measuring the amount of the richness imparting substance. The rich taste imparting substance in the present invention, that is, a carboxyalkyl amino acid such as a CM-modified amino acid, a CM-modified peptide or a CM-modified protein, or a peptide or protein containing the amino acid (preferably a carboxyalkyl amino acid such as a CM-modified peptide or a CM-modified protein) The amount of the peptide or protein to be contained can be quantified by a known method such as an enzyme immunoassay using the antibody used in the screening method described above. For example, by reacting the above-described monoclonal antibody or polyclonal antibody with a sample and then using an enzyme-labeled antibody, a carboxyalkyl amino acid such as a CM-modified amino acid, a CM-modified peptide, or a CM-modified protein, which is a body taste imparting substance, or the amino acid Peptides or proteins containing can be quantified. In addition, by performing competitive ELISA using the antibodies used in the above-described screening methods, CM rich amino acids, CMized peptides, CMized proteins, and the like, which are body taste imparting substances, can also be quantified.
飲食品等に含まれるコク味付与物質の量の測定は、より具体的には、飲食品等そのものを試料溶液として、又は該飲食品等から調製した試料溶液を用いて、例えば、カルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体と試料溶液とを接触させる工程、及び（ｂ）試料溶液中のカルボキシアルキルアミノ酸、又はそれを含むペプチド若しくはタンパク質に対する該抗体の結合を検出する工程を含む方法等により行うことができる。 More specifically, the amount of the body taste imparting substance contained in the food or drink is measured by using the food or drink itself as a sample solution or a sample solution prepared from the food or drink, for example, carboxyalkyl amino acid. And (b) detecting the binding of the antibody to a carboxyalkyl amino acid in the sample solution, or a peptide or protein containing the antibody, and the like.
このような定量方法の一例として、競合ＥＬＩＳＡ法（好ましくは間接競合ＥＬＩＳＡ法）によってカルボキシアルキルアミノ酸、カルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を定量する方法について説明する。ＣＭ化アミノ酸に対する抗体を用いる場合を例に挙げて説明すると、間接競合ＥＬＩＳＡ法においては、既知のＣＭ化タンパク質、ＣＭ化ペプチド又はＣＭ化アミノ酸（例えば、上記抗体の製造に用いたＣＭ化アミノ酸等）をマイクロプレート、試験管等にコーティング（固定化）したものに、試料溶液及び上記ＣＭ化アミノ酸に対する抗体（一次抗体）を添加し競合反応をさせ、固定化したＣＭ化アミノ酸等と結合しなかった試料溶液画分及び一次抗体を洗浄除去後、二次抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などで標識した抗マウスＩｇＧ抗体）を加えて一次抗体と結合させる。コントロールにおいては、試料溶液を添加しない以外は同様の手順を行う。次いで、酵素基質を添加して酵素による発色反応をさせ、発色の程度を比色計等で測定し、試料溶液を添加した場合と試料溶液を添加しなかった場合（コントロール）との発色度を比較する。試料溶液の添加により、コントロールと比較して発色度が減少する場合には、該試料溶液中のＣＭ化アミノ酸、ＣＭ化アミノ酸を含むペプチド又はタンパク質に結合したと判定される。つまり試料溶液中にＣＭ化アミノ酸、ＣＭ化アミノ酸を含むペプチド及びタンパク質の１種又は２種以上が含まれることが確認できる。また、競合ＥＬＩＳＡ法においては、ＣＭ化アミノ酸、ＣＭ化アミノ酸含むペプチド及びＣＭ化アミノ酸を含むタンパク質量が多いほど発色度の減少の度合いが大きくなる。従って、ＣＭ化アミノ酸、ＣＭ化アミノ酸含むペプチド及びＣＭ化アミノ酸を含むタンパク質の量は、発色度の減少の度合いにより測定される。 As an example of such a quantification method, a method for quantifying a carboxyalkyl amino acid, a peptide or protein containing a carboxyalkyl amino acid by a competitive ELISA method (preferably an indirect competitive ELISA method) will be described. The case of using an antibody against a CM-modified amino acid will be described as an example. In the indirect competitive ELISA method, a known CM-protein, CM-peptide or CM-amino acid (for example, the CM-amino acid used for the production of the above-described antibody, etc.) ) Is coated (immobilized) on a microplate, test tube, etc., and a sample solution and an antibody (primary antibody) against the above-mentioned CM amino acid are added to cause a competitive reaction, and it does not bind to the immobilized CM amino acid, etc. After washing and removing the sample solution fraction and the primary antibody, a secondary antibody (for example, an anti-mouse IgG antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP) or the like) is added to bind to the primary antibody. In the control, the same procedure is performed except that the sample solution is not added. Next, an enzyme substrate is added to cause a color reaction by the enzyme, the degree of color development is measured with a colorimeter, etc., and the degree of color development when the sample solution is added and when the sample solution is not added (control) is determined. Compare. When the color development degree is decreased as compared with the control due to the addition of the sample solution, it is determined that the sample solution is bound to the CM-containing amino acid, the CM-containing amino acid-containing peptide or protein. That is, it can be confirmed that the sample solution contains one or more of CM-modified amino acids, peptides and proteins containing CM-ized amino acids. Further, in the competitive ELISA method, the degree of decrease in the degree of color development increases as the amount of the CM-containing amino acid, the peptide containing the CM-converted amino acid, and the protein containing the CM-converted amino acid increases. Therefore, the amount of the CM-containing amino acid, the peptide containing the CM-converted amino acid and the protein containing the CM-converted amino acid is measured by the degree of decrease in the degree of color development.
また、例えば、濃度既知の既知カルボキシアルキルアミノ酸、若しくは該アミノ酸を含むペプチド溶液（又は該アミノ酸を含むタンパク質溶液）を試料溶液の代わりに用いて上記と同様の手順を行って得られた発色度の減少に対する試料溶液の発色度の減少の割合から、カルボキシアルキルアミノ酸、該アミノ酸を含むペプチド又はタンパク質濃度を、既知のカルボキシアルキルアミノ酸を含むペプチド溶液（又はタンパク質溶液）に対して得ることができる。 In addition, for example, a carboxyalkyl amino acid having a known concentration, or a peptide solution containing the amino acid (or a protein solution containing the amino acid) is used instead of the sample solution, and the color development degree obtained by performing the same procedure as described above From the ratio of the decrease in chromogenicity of the sample solution to the decrease, the carboxyalkyl amino acid, the peptide or protein concentration containing the amino acid can be obtained for the peptide solution (or protein solution) containing a known carboxyalkyl amino acid.
飲食品の評価方法においては、飲食品中のコク味付与物質の量を測定することにより、飲食品のコク味、味の厚み等を定量的に評価することができる。例えば、ある飲食品中のコク味付与物質の量（濃度）が他の飲食品と比較して多いと、コク味付与物質量が多い飲食品の方が、コク味において優れ、味の厚みがあると評価される。また、飲食品中のコク味付与物質量が一定値以上であると、コク味において優れ、味の厚みがある飲食品であると評価できため、飲食品の品質管理を容易にかつ効率的に行なうこともできる。 In the method for evaluating a food or drink, the body taste or taste thickness of the food or drink can be quantitatively evaluated by measuring the amount of the body taste imparting substance in the food or drink. For example, when the amount (concentration) of the richness-imparting substance in a certain food or drink is large compared to other foods or drinks, the food or drink with a large amount of richness-imparting substance is superior in richness and has a thick taste. Evaluated as being. In addition, if the amount of the body taste imparting substance in the food or drink is a certain value or more, it can be evaluated that the food has a rich taste and has a thick taste, so the quality control of the food and drink can be easily and efficiently performed. It can also be done.
飲食品の製造工程管理方法においては、例えば、製造工程の１又は２以上の時点において、原料、中間生成物、又は最終製品をサンプリングし、サンプリングした試料中のコク味付与物質量（濃度）を測定することが好ましい。これにより、原料、中間生成物、又は最終製品のコク味を定量的に評価できるため、最終製品の品質を容易にかつ効率的に管理することができる。また、製造工程の各段階におけるコク味付与物質量の変化をモニターすることによっても、製品の品質を評価及び管理することができる。
このように飲食品の製造工程を管理することにより、一定の品質の飲食品を効率よく製造することができる。
In the manufacturing process management method for foods and drinks, for example, at one or more points in the manufacturing process, a raw material, an intermediate product, or a final product is sampled, and the amount (concentration) of the body taste imparting substance in the sampled sample is calculated. It is preferable to measure. Thereby, since the richness of a raw material, an intermediate product, or a final product can be evaluated quantitatively, the quality of a final product can be managed easily and efficiently. In addition, the quality of the product can be evaluated and managed by monitoring changes in the amount of the body taste imparting substance at each stage of the manufacturing process.
Thus, by managing the manufacturing process of food / beverage products, the food / beverage products of fixed quality can be manufactured efficiently.
本発明は、上記スクリーニング方法を行うためのカルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体を含むコク味付与物質検出用キットも包含する。抗体は、ＡＧＥ産物に対する抗体であれば良く、上述したカルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体が好ましいものの１つである。
このようなキットは、上述したスクリーニング方法、飲食品の評価方法、製造工程管理方法等に好適に使用されるものである。
The present invention also includes a kit for detecting a body taste imparting substance containing an antibody against a carboxyalkyl amino acid for performing the screening method. The antibody may be an antibody against the AGE product, and the above-described antibody against the carboxyalkyl amino acid is one of the preferable ones.
Such a kit is suitably used for the screening method, the evaluation method for food and drink, the manufacturing process management method, and the like described above.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to these Examples at all.
参考例１
欧州産麦芽を市販の穀類粉砕機で乾式粉砕し、その４倍の重量の水を加え、常法に従い５２℃で２０分、６５℃で６０分撹拌した後、遠心分離及び濾紙濾過によって麦汁を得た（サンプル１）。サンプル１をオートクレーブで１００℃で９０分間加熱して得られた液体をサンプル２とした。サンプル１にカラメル色素（池田糖化工業株式会社製）を加えることにより４３０ｎｍにおける吸光度をサンプル２と等しくしたものをサンプル３とした。なお、麦汁の色調による評価は一般的に４３０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行われる。サンプル１〜３の吸光度（４３０ｎｍ）の測定は分光光度計（島津製作所製）により測定した。
Reference example 1
European malt is dry pulverized with a commercially available cereal grinder, water four times its weight is added, and the mixture is stirred at 52 ° C. for 20 minutes and at 65 ° C. for 60 minutes, followed by centrifugation and filter paper filtration. (Sample 1). Sample 2 was obtained by heating Sample 1 with an autoclave at 100 ° C. for 90 minutes. Sample 3 was prepared by adding caramel dye (Ikeda Gakka Kogyo Co., Ltd.) to Sample 1 so that the absorbance at 430 nm was equal to Sample 2. In addition, evaluation by the color tone of wort is generally performed by measuring the light absorbency in 430 nm. The absorbance (430 nm) of samples 1 to 3 was measured with a spectrophotometer (manufactured by Shimadzu Corporation).
上記で製造したサンプル１から３を用いて、訓練されたパネラー２０人により味の強さ（飲み応え）、味のひろがり（厚み）及び味の経時変化（余韻）について官能評価を実施した。その結果、サンプル２が最も評価が高く、サンプル１及び３は同程度の評価であり、サンプル２と比較すると低かった。 Using samples 1 to 3 produced as described above, sensory evaluation was performed on the strength of the taste (drinking response), the spread of the taste (thickness), and the change with time of the taste (resonance) by 20 trained panelists. As a result, sample 2 had the highest evaluation, samples 1 and 3 had the same evaluation, and were lower than sample 2.
上記試験から、従来から指標とされている麦汁の色調（４３０ｎｍにおける吸光度）は、麦汁を加熱することによって生成する味わい及びコクの指標とならないことが明らかとなった。 From the above test, it was revealed that the color tone of wort (absorbance at 430 nm), which has been conventionally used as an index, does not serve as an index of taste and richness produced by heating wort.
実施例１
１．麦汁調製方法
欧州産麦芽を市販の穀類粉砕機で乾式粉砕し、その４倍の重量の水を加え、常法に従い５２℃で２０分、６５℃で６０分撹拌した後、遠心分離及び濾紙濾過によって麦汁を得た。得た麦汁をオートクレーブで１００℃で９０分間加熱して得られた液体を煮沸麦汁とした。
Example 1
1. Wort preparation method European malt was dry pulverized with a commercially available cereal grinder, water four times its weight was added, and the mixture was stirred at 52 ° C. for 20 minutes and at 65 ° C. for 60 minutes, followed by centrifugation and filter paper. The wort was obtained by filtration. The liquid obtained by heating the obtained wort in an autoclave at 100 ° C. for 90 minutes was used as boiling wort.
２．競合ＥＬＩＳＡ法
ＣＭ化リジンに対する抗体（一次抗体）は、特許第４０１２７２２号明細書の実施例１に記載の方法に従って調製した。
特許第４０１２７２２号明細書の実施例１に記載の方法に従って得たＣＭ化アルブミンを含む溶液をマイクロプレートに加え、２時間静置しＣＭ化タンパク質等をプレート上に固定化（コーティング）した。溶液とコーティングされていないＣＭ化タンパク質等を洗浄除去後、ゼラチンを含む溶液をプレート上に加え、１時間静置し、以後の工程でプレート上にその他の成分が固定化されないようにゼラチンを固定化した（ブロッキング）。ゼラチン溶液とコーティングされていないゼラチンを洗浄除去後、被験物質を含む試料溶液（上記の煮沸麦汁）及び上記ＣＭ化アミノ酸（ＣＭ化リジン）に対する抗体（一次抗体）を添加し、１時間静置し競合反応をさせた。固定化したＣＭ化アミノ酸等と結合しなかった被験物質及び一次抗体を洗浄除去後、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））で標識した抗マウスＩｇＧ抗体を加えて一次抗体と結合させた。コントロールにおいては、煮沸麦汁を添加しない以外は同様の手順を行った。溶液と一次抗体に結合していない二次抗体を洗浄除去後、酵素基質を添加して酵素による発色反応をさせ発色を確認後、濃硫酸により発色を停止させた後に、発色の程度（４９２ｎｍの吸光度）を比色計等で測定し、煮沸麦汁を添加した場合と煮沸麦汁を添加しなかった場合（コントロール）との発色度を比較した。この方法においては、被験物質の添加によりコントロールと比較して発色度が減少する場合に、該被験物質がＣＭ化アミノ酸に対する抗体に結合したと判定される。煮沸麦汁の添加により、コントロールと比較して発色度が減少したことから、煮沸麦汁中に含まれる物質がＣＭ化アミノ酸に対する抗体に結合したと判定した。ＣＭ化アミノ酸に対する抗体と結合した物質を、ＡＧＥ産物（終末糖化産物）として選択した。
2. Competition ELISA method An antibody against C-lysine (primary antibody) was prepared according to the method described in Example 1 of Japanese Patent No. 4012722.
A solution containing C-albumin obtained according to the method described in Example 1 of Japanese Patent No. 4012722 was added to a microplate, and allowed to stand for 2 hours to immobilize (coat) C-M protein and the like on the plate. After washing away the solution and uncoated CM protein, add a solution containing gelatin onto the plate and let stand for 1 hour. Fix the gelatin so that other components are not immobilized on the plate in the subsequent steps. (Blocking). After washing and removing the gelatin solution and uncoated gelatin, a sample solution containing the test substance (above boiling wort) and an antibody against the CM-modified amino acid (CM-lysine) (primary antibody) are added and allowed to stand for 1 hour. Then, a competitive reaction was performed. After washing and removing the test substance and the primary antibody that did not bind to the immobilized CMized amino acid or the like, an anti-mouse IgG antibody labeled with a secondary antibody (horseradish peroxidase (HRP)) was added to bind to the primary antibody. In the control, the same procedure was performed except that the boiling wort was not added. After washing and removing the secondary antibody that is not bound to the solution and the primary antibody, an enzyme substrate is added to cause a color reaction with the enzyme to confirm color development, and after color development is stopped with concentrated sulfuric acid, the degree of color development (at 492 nm) (Absorbance) was measured with a colorimeter or the like, and the degree of color development was compared between when boiling wort was added and when boiling wort was not added (control). In this method, it is determined that the test substance is bound to an antibody against the CM-modified amino acid when the color development degree is decreased as compared with the control due to the addition of the test substance. The addition of boiling wort decreased the degree of color development compared to the control, so it was determined that the substance contained in the boiling wort was bound to the antibody against the CM amino acid. The substance that bound to the antibody against the CM amino acid was selected as an AGE product (terminal glycation product).
該煮沸麦汁中のＡＧＥ産物の濃度は、濃度既知の既知のＣＭ化タンパク質（特許第４０１２７２２号明細書の実施例１に記載の方法に従って得たＣＭ化アルブミン）溶液を被験物質を含む試料溶液（煮沸麦汁）の代わりに用いて上記と同様の手順を行って得られた発色度の減少に対する試料溶液の発色度の減少の割合から、該ＡＧＥ産物が含まれている濃度を既知のＣＭ化タンパク質溶液に対して得た。 The concentration of the AGE product in the boiled wort is a sample solution containing a test substance from a known CM-modified protein (CM-albumin obtained according to the method described in Example 1 of Patent No. 4012722) having a known concentration. The concentration of the AGE product is determined from the ratio of the decrease in the color development degree of the sample solution to the decrease in the color development degree obtained by performing the same procedure as described above using (boiled wort) instead of the above-mentioned boiled wort. Obtained for a modified protein solution.
図１に結果を示す。図１のグラフの縦軸は、コントロールとの発色度の差（４９２ｎｍにおける吸光度の差：ΔＡｂｓ．＠４９２ｎｍ）である。ＡＧＥ産物含量が多いほど４９２ｎｍにおける吸光度の差が大きくなる。図１より、麦汁中のＡＧＥ産物は、煮沸により増加することが分かった。図１中、既知ＡＧＥタンパク質は、ＡＧＥ−ＨＳＡ（タンパク質濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ）である。 The results are shown in FIG. The vertical axis of the graph in Fig. 1 represents the difference in color development from the control (absorbance difference at 492 nm: ΔAbs. @ 492 nm). The greater the AGE product content, the greater the difference in absorbance at 492 nm. From FIG. 1, it was found that the AGE product in the wort increased by boiling. In FIG. 1, the known AGE protein is AGE-HSA (protein concentration: 0.2 mg / mL).
３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング
煮沸前麦汁及び煮沸後麦汁をそれぞれ濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った。同一ゲルにサンプル及び分子量マーカーを２セットアプライして電気泳動を行った後ゲルを分割し、１セットはクマシーブルー染色を行い、もう１セットはウェスタンブロッティングに供した。ウェスタンブロッティングは常法に従って行い、一次抗体としては抗カルボキシメチルリジン抗体、二次抗体としてはペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体を用いてＡＧＥ産物（メイラード反応したタンパク質）の検出を行った。
3. SDS-PAGE and Western Blotting Pre-boiling wort and post-boiling wort were each concentrated and subjected to electrophoresis by SDS-PAGE. Two sets of samples and molecular weight markers were applied to the same gel, followed by electrophoresis, the gel was divided, one set was subjected to Coomassie blue staining, and the other set was subjected to Western blotting. Western blotting was performed according to a conventional method, and an AGE product (Maillard reacted protein) was detected using an anti-carboxymethyllysine antibody as a primary antibody and a peroxidase-labeled goat antibody as a secondary antibody.
図２のＡに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図２のＡ中、ＳＴＤは、分子量マーカーである。（１）は、煮沸前麦汁であり、（２）は、煮沸後麦汁である。
図２のＢに、ウェスタンブロッティングの結果を示す。図２のＢ中、（１）は、煮沸前麦汁であり、（２）は、煮沸後麦汁である。図２のＢに矢印で示す１５ｋｄのバンドが、検出されたＡＧＥ産物（メイラード反応したタンパク質）であり、麦汁中の多くのタンパク質の中から、ＡＧＥ産物（メイラード反応したタンパク質）を特異的に検出することが出来た。
FIG. 2A shows the result of SDS-PAGE. In FIG. 2A, STD is a molecular weight marker. (1) is the wort before boiling, and (2) is the wort after boiling.
FIG. 2B shows the results of Western blotting. In FIG. 2B, (1) is the wort before boiling, and (2) is the wort after boiling. The 15 kd band indicated by the arrow in FIG. 2B is the detected AGE product (Maillard reacted protein), and the AGE product (Maillard reacted protein) is specifically selected from many proteins in wort. I was able to detect it.
実施例２
麦汁中の成分の分子量による分取
実施例１と同様にして得られた煮沸麦汁を、ゲルろ過により分子量で分画分取した。
すなわち、煮沸麦汁を透析膜（SPECTRUM LABS社製、Spectra/Por（登録商標）７、分画分子量１０ｋＤａ）を用いて２日間透析を行い、低分子成分を麦汁中から除去した。得られた透析麦汁を、減圧下溶媒を留去することによって４倍程度に濃縮した後、ゲル濾過分画の大型カラム（長さ３０ｃｍ、内径２ｃｍ）を用いて、水を移動相として分子量分画フラクションを得た。フラクションは各４ｍＬとし、得られたフラクションをＮｏ．１〜Ｎｏ．１０とした。この操作を１０回繰り返し、各操作で得られた同じ番号のフラクションを合一して官能実験及び競合ＥＬＩＳＡに用いた。フラクション中のＡＧＥ産物（メイラード反応したタンパク質）量は実施例１の競合ＥＬＩＳＡ法により測定した。なお、合一した各フラクションは凍結乾燥により乾燥固体重量を測定した。
Example 2
Fractionation according to molecular weight of components in wort Boiled wort obtained in the same manner as in Example 1 was fractionated by molecular weight by gel filtration.
That is, the boiled wort was dialyzed for 2 days using a dialysis membrane (SPECTRUM LABS, Spectra / Por (registered trademark) 7, fractional molecular weight 10 kDa) to remove low molecular components from the wort. The obtained dialyzed wort was concentrated about 4 times by distilling off the solvent under reduced pressure, and then using a large column (length 30 cm, inner diameter 2 cm) of gel filtration fraction, water as the mobile phase and the molecular weight A fraction fraction was obtained. The fractions were 4 mL each, and the obtained fractions were No. 1-No. It was set to 10. This operation was repeated 10 times, and fractions with the same number obtained in each operation were combined and used for sensory experiments and competition ELISA. The amount of AGE product (Maillard reacted protein) in the fraction was measured by the competitive ELISA method of Example 1. The combined fractions were measured for dry solid weight by lyophilization.
その結果、フラクションＮｏ．７、Ｎｏ．９及びＮｏ．１１中にタンパク質が検出された。結果を図３に示す。図３の縦軸は、フラクションあたりの乾燥固体重量を示す。さらに、分取した各フラクション中に含まれるメイラードタンパク質量を、競合ＥＬＩＳＡにより測定した結果を図４に示す。図４から分かるように、ＡＧＥ産物（メイラード反応したタンパク質）はフラクションＮｏ．９からのみ検出された。 As a result, fraction no. 7, no. 9 and no. In 11 the protein was detected. The results are shown in FIG. The vertical axis in FIG. 3 represents the dry solid weight per fraction. Furthermore, the result of having measured the amount of Maillard protein contained in each fraction collected by competitive ELISA is shown in FIG. As can be seen from FIG. 4, the AGE product (Mailard-reacted protein) is fraction No. Only 9 were detected.
実施例３
官能評価
上記のゲル濾過で得られたフラクションのうち、固体乾燥物が含まれているがＡＧＥ産物（メイラード反応したタンパク質）を含まないフラクションＮｏ．７及びＮｏ．１１の画分とＡＧＥ産物（メイラード反応したタンパク質）を含むフラクションＮｏ．９について、官能評価を行なった。具体的には各フラクションの固体乾燥物を市販のビール（サントリー酒類製）にそれぞれ１０ｐｐｍ増加するように添加したものをサンプルとし、該市販ビールをコントロールとして、訓練されたパネラーにより飲み応え、味の厚み、及び余韻の量を評価した。コントロールの値を１とし、各フラクションの飲み応え、味の厚み、及び余韻の量がコントロールよりも高く感じたときはスコアを２、強く感じたときのスコアは３として、それぞれのフラクションの固体乾燥物を評価した。
官能評価の平均スコアを、図５に示す。メイラード反応したタンパク質を多く含む画分（フラクションＮｏ．９）は、他の画分と比較して味わい付与に効果が大きいことが分かった。
Example 3
Sensory evaluation Among the fractions obtained by the above gel filtration, the fraction No. contains a solid dry product but does not contain an AGE product (Maillard reacted protein). 7 and no. Fraction No. 11 containing 11 fractions and AGE product (Maillard reacted protein) Sensory evaluation was performed on 9. Specifically, a sample obtained by adding a solid dried product of each fraction to a commercial beer (Suntory liquor) so as to increase by 10 ppm is used as a sample. Thickness and amount of reverberation were evaluated. When the control value is 1, the response of each fraction is drunk, the thickness of the taste, and the amount of reverberation is higher than the control, the score is 2. The thing was evaluated.
The average sensory evaluation score is shown in FIG. It was found that the fraction containing a large amount of Maillard-reacted protein (Fraction No. 9) is more effective for imparting taste than the other fractions.
実施例４
以下のワイン、ビール、味噌抽出液、日本酒及びチーズ抽出液を検体として用いて、実施例１と同様にして、各検体中のＡＧＥ産物（メイラード反応したタンパク質）の量を競合ＥＬＩＳＡ法により分析した。
Example 4
Using the following wine, beer, miso extract, sake and cheese extract as specimens, the amount of AGE product (Maillard reacted protein) in each specimen was analyzed by competitive ELISA in the same manner as in Example 1. .
１．ワイン
シャトームートンロートシルト2007（商品名、シャトームートンロートシルト製（フランス））
シャトームートンロートシルト1975（商品名、シャトームートンロートシルト製（フランス））
バローロボルゴーニュ2001（商品名、ボルゴーニュ製（イタリア））
バローロボルゴーニュ1967（商品名、ボルゴーニュ製（イタリア））
上記の各ワインを、競合ＥＬＩＳＡに供した。
1. Wine Chateau Mouton Rothschild 2007 (Product name, Made in Chateau Mouton Rothschild (France))
Chateau Mouton Rothschild 1975 (Product name, Made in Chateau Mouton Rothschild (France))
Barolo Borgogne 2001 (Brand name, Borgogne (Italy))
Barolo Borgogne 1967 (Brand name, Borgogne (Italy))
Each of the above wines was subjected to a competitive ELISA.
２．ビール
カンティヨン グーズ（商品名、カンティヨン醸造所製、ベルギー産の３年以上熟成したランビックビールと熟成の若いビールをブレンドしたビール）
カンティヨン グランクリュ ブルオクセラ（商品名、カンティヨン醸造所製、ベルギー産の３年以上熟成したランビックビールのみを使用したビール）
上記の各ビールを、競合ＥＬＩＳＡに供した。
2. Beer Cantillon Goose (trade name, manufactured by Cantillon Brewery, a blend of Belgian aged Lambic beer and aged young beer)
Cantillon Grand Cru Bruoxera (trade name, manufactured by Cantillon Brewery, beer using only Belgian beer aged 3 years or more)
Each of the above beers was subjected to a competitive ELISA.
３．味噌抽出液
石井味噌三年蔵白(一年熟成）（商品名、石井味噌社製）
石井味噌三年蔵赤（三年熟成）（商品名、石井味噌社製）
サンプル（上記の各味噌）５ｇに１５ｇの水を加えて、１００００ｒｐｍ、２分ホモゲナイザーにて十分に攪拌を行った。その後に５０００ｒｐｍ、３０分４℃、で遠心分離を実施し、その上澄み液を０．４５μｍの径のフィルター（商品名ＧＬクロマトディスク 水系０．４５μｍ、クラボウ社製）でろ過したものを競合ＥＬＩＳＡに供した。
3. Miso extract Ishii Miso 3 years old white (aged for 1 year) (trade name, manufactured by Ishii Miso)
Ishii Miso 3 years old red (aged 3 years) (trade name, manufactured by Ishii Miso)
15 g of water was added to 5 g of the sample (each miso), and the mixture was sufficiently stirred with a homogenizer at 10000 rpm for 2 minutes. Thereafter, centrifugation was carried out at 5000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was filtered through a 0.45 μm diameter filter (trade name: GL Chromatodisc Water System 0.45 μm, manufactured by Kurabo Industries) for competitive ELISA. Provided.
４．日本酒
月桂冠ＰＲＥＭＩＵＭ 山田錦大吟醸（商品名、月桂冠社製）
月桂冠ＰＲＥＭＩＵＭ 雄町純米吟醸（商品名、月桂冠社製）
月桂冠浪漫 超特選秘蔵酒十年（商品名、月桂冠社製）
月桂冠王冠（商品名、月桂冠社製）
木戸泉二十五年古酒（商品名、木戸泉酒造社製）
達磨正宗千歳不易十五年古酒（商品名、白木恒助商店より購入）
上記の各日本酒を、競合ＥＬＩＳＡに供した。
4). Japanese sake laurel wreath PREMIUM Yamada Nishiki Daiginjo (trade name, manufactured by laurel wreath)
Laurel wreath PREMIUM Omachi Junmai Ginjo (brand name, manufactured by laurel wreath)
Laurel Wreath Romantic Super Selected Treasured Liquor Decade (Product Name, Made by Laurel Wreath)
Laurel Wreath Crown (trade name, manufactured by Laurel Wreath Co.)
Izumi Kido 25-year old sake (trade name, manufactured by Izumi Sake Brewery)
Masamune Tatsuma Chitose Fifteen Years Old Sake (Brand name, purchased from Shiraki Tsunesuke Shop)
Each of the above sakes was subjected to a competitive ELISA.
５．チーズ抽出液
ベームスターゴーダ（Vlaskaas）（商品名、CONO社製（オランダ）、熟成なし）
ベームスターゴーダpremier（商品名、CONO社製（オランダ）、６ヶ月熟成タイプ）
ベームスターゴーダclassic（商品名、CONO社製（オランダ）、１８ヶ月熟成タイプ）
ベームスターゴーダX-O-ExtraOld（商品名、CONO社製（オランダ）、２６ヶ月熟成タイプ）
サンプル（上記の各チーズ）３０ｇに水９０ｇを加えて、１５０００ｒｐｍ、２分ホモゲナイザーにて十分に攪拌を行った。その後に３５００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離を行った。遠心分離後、３層に分かれたうちの真ん中の水層をデカンテーションにより分けとり、さらにその水層を再度遠心分離し上澄み液を得た。その上澄み液を０．４５μｍの径のフィルター（商品名ＧＬクロマトディスク 水系０．４５μｍ、クラボウ社製）でろ過したものを競合ＥＬＩＳＡに供した。
5. Cheese extract Boehmstar Gouda (Vlaskaas) (trade name, manufactured by CONO (Netherlands), no aging)
Boehm Star Gouda premier (trade name, manufactured by CONO (Netherlands), aged for 6 months)
Boehm Star Gouda classic (trade name, manufactured by CONO (Netherlands), 18-month aging type)
Boehm Star Gouda XO-ExtraOld (trade name, manufactured by CONO (Netherlands), 26-month aging type)
90 g of water was added to 30 g of each sample (each cheese described above), and the mixture was sufficiently stirred with a homogenizer at 15000 rpm for 2 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 3500 rpm for 15 minutes at 4 ° C. After centrifugation, the middle aqueous layer of the three layers was separated by decantation, and the aqueous layer was centrifuged again to obtain a supernatant. The supernatant was filtered through a 0.45 μm diameter filter (trade name: GL Chromatodisc aqueous 0.45 μm, manufactured by Kurabo Industries) and subjected to competitive ELISA.
検体中のＡＧＥ産物の量の比較は、実施例１と同様に、コントロールとの発色度の比較（４９２ｎｍにおける吸光度の差：ΔＡｂｓ．＠４９２ｎｍ）により行った。４９２ｎｍにおける吸光度の差は、ＡＧＥ産物を競合ＥＬＩＳＡ法にて測定した際に、その含有量に応じて大きくなる吸光度測定値の差異である。つまり、ＡＧＥ産物含量が多いほど４９２ｎｍにおける吸光度の差が大きくなる。 The amount of the AGE product in the sample was compared with the control (the difference in absorbance at 492 nm: ΔAbs. @ 492 nm) in the same manner as in Example 1. The difference in absorbance at 492 nm is a difference in absorbance measurement value that increases according to the content of the AGE product measured by the competitive ELISA method. That is, the greater the AGE product content, the greater the difference in absorbance at 492 nm.
結果を、図６〜１０に示す。図６〜１０のグラフの縦軸は、図１と同様に、コントロールとの発色度の差（４９２ｎｍにおける吸光度の差：ΔＡｂｓ．＠４９２ｎｍ）である。 The results are shown in FIGS. The vertical axis of the graphs in FIGS. 6 to 10 represents the difference in color development from the control (difference in absorbance at 492 nm: ΔAbs. @ 492 nm), as in FIG.
検体に用いたワイン、ビール、味噌、日本酒及びチーズは、いずれも熟成を経て製造された飲食品であるが、いずれの検体にもＡＧＥ産物が含まれていた。さらに、図６〜１０より、飲食品の熟成が進むほど、ＡＧＥ産物量が多くなることが分かる。 The wine, beer, miso, sake and cheese used for the samples are all foods and beverages produced through aging, but all samples contained AGE products. Furthermore, from FIGS. 6-10, it turns out that the amount of AGE products increases, so that maturing of food-drinks advances.
実施例５
訓練されたパネラー５名（パネラーＡ〜Ｅ）により、実施例４の各検体について官能評価を行った。評価基準は、以下のとおりである。
コク味を感じない：１、コク味をあまり感じない：２、コク味を感じる：３、コク味をやや強く感じる：４、コク味を強く感じる：５の評点で評価を行った。
Example 5
Sensory evaluation was performed on each specimen of Example 4 by 5 trained panelists (panelists A to E). The evaluation criteria are as follows.
I did not feel the rich taste: 1, I did not feel the rich taste very much: 2, I felt the rich taste: 3, I felt a little bit rich, the taste was strong: 4, I felt a strong taste: I rated it with a rating of 5.
官能評価の結果を、表１〜５に示す。表１〜５に示す官能評価の結果は、実施例４のＡＧＥ産物の分析結果と一致した。つまり、ＡＧＥ産物の含有量が多いほど、官能評価の官能点（評価点）が高く、コク味があると判定された。従って、カルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体を使用するスクリーニング方法により検出されるカルボキシアルキル化ペプチド、カルボキシアルキル化タンパク質等は、実際にコク味付与に効果的な物質であること、該カルボキシアルキル化ペプチド、カルボキシアルキル化タンパク質等の量を測定することにより、飲食品等のコク味を定量的に評価できることが確認された。 The results of sensory evaluation are shown in Tables 1-5. The sensory evaluation results shown in Tables 1 to 5 coincided with the analysis results of the AGE product of Example 4. That is, it was determined that the higher the content of the AGE product, the higher the sensory point (evaluation point) of sensory evaluation and the rich taste. Therefore, the carboxyalkylated peptide, carboxyalkylated protein, etc. detected by the screening method using an antibody against carboxyalkylamino acid are actually substances effective for imparting rich taste, the carboxyalkylated peptide, carboxyalkyl It was confirmed that the richness of foods and beverages and the like can be quantitatively evaluated by measuring the amount of modified protein and the like.
本発明は、コク味付与物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって得られるコク味付与物質、飲食品の評価方法又は製造工程管理方法、及びコク味付与物質の検出用キットとして、食品分野等において有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in the food field and the like as a screening method for a body taste imparting substance, a body taste imparting substance obtained by the screening method, a method for evaluating food or drink or a manufacturing process management method, and a kit for detecting a body taste imparting substance It is.
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