JP2016154542A - Method for producing holoprotein by use of silkworms - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カイコを用いた組換えタンパク質の生産に関する。 The present invention relates to the production of recombinant proteins using silkworms.
カイコ（Bombyx mori）核多角体病ウイルス（BmNPV）発現系（BES）は、昆虫細胞または幼虫における組換えタンパク質産生のために、特に真核生物由来のタンパク質合成のために広く用いられ、他の真核生物発現系に比較して、高い生産性を期待できることで利用されている（非特許文献1、2）。 The Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) expression system (BES) is widely used for the production of recombinant proteins in insect cells or larvae, especially for the synthesis of eukaryotic proteins. Compared to eukaryotic expression systems, it is used because it can be expected to have high productivity (Non-patent Documents 1 and 2).
一方、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase, HRP）は周知のヘム酵素であり、酵素免疫測定法など、臨床試験における診断ツールや基礎研究分野における標識酵素（可視化酵素）として使用されているほか、工業排水の処理に用いられるなど、産業上の需要がとても高い。酵素免疫測定法においては、ある特定の生体分子に直接結合できる一次抗体や、その抗体を介して間接的に生体分子に結合するタンパク質、例えば二次抗体などと組み合わせて利用されている（非特許文献3）。しかし、組換えHRPの産生は一般的には困難なので、上記目的のために抗体または抗体結合性タンパク質とコンジュゲート化するには、天然HRPが化学的修飾されて用いられてきた。 On the other hand, peroxidases such as horseradish peroxidase (HRP) are well-known heme enzymes and are used as diagnostic tools in clinical trials such as enzyme immunoassay and labeling enzymes (visualization enzymes) in basic research fields. Demand for industry is very high, such as used in the treatment of industrial wastewater. In enzyme immunoassay, it is used in combination with a primary antibody that can directly bind to a specific biomolecule or a protein that indirectly binds to a biomolecule via the antibody, such as a secondary antibody (non-patented). Reference 3). However, since production of recombinant HRP is generally difficult, native HRP has been used with chemically modifications for conjugation with antibodies or antibody-binding proteins for the above purposes.
本発明者らは、アルスロマイセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）由来のペルオキシダーゼ（ARP）、ならびに抗体結合タンパク質としての黄色ブドウ球菌（Staphylococcal aureus）プロテインAおよびストレプトコッカス属（Streptococcus）プロテインG（PG）の部分的ドメインで構成される融合タンパク質、ARP-PGを開発してきた。ARPのペルオキシダーゼ活性は、特に検出試薬として化学発光基質を用いた場合、HRPより高いことが報告された（非特許文献4）。ARPもHRP同様、ヘムタンパク質である。 We have peroxidase (ARP) from Arthromyces ramosus and partial domains of Staphylococcal aureus protein A and Streptococcus protein G (PG) as antibody binding proteins. ARP-PG, a fusion protein composed of It has been reported that the peroxidase activity of ARP is higher than that of HRP, particularly when a chemiluminescent substrate is used as a detection reagent (Non-patent Document 4). ARP, like HRP, is a heme protein.
ヘムタンパク質の生産に関し、特許文献１は、糸状菌におけるヘムタンパク質生産を増加させる方法を提案する。より具体的には、ヘムタンパク質の製造方法であって、（ａ）糸状菌細胞中に、（ｉ）前記糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列によりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令することができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に作用可能に連結されている、及び／又は（ii）5-アミノレブリン酸（5-ALA）シンターゼをコードする核酸配列もしくはポルホビリノーゲンシンターゼをコードする核酸配列又はそれらの組み合わせであるヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピー、を導入し、ここで、前記１もしくは複数の第１制御配列及び／又は前記１もしくは複数の第２核酸配列の導入が前記糸状菌細胞により生産されるヘムの量を増加させ、その結果ヘムタンパク質の生産を増強させる；（ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のために適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そして（ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク質を回収する；ことを含んで成る方法、を提案する。 Regarding production of heme protein, Patent Document 1 proposes a method for increasing heme protein production in filamentous fungi. More specifically, a method for producing a heme protein comprising (a) a filamentous fungal cell and (i) a heme biosynthetic enzyme encoded by a first nucleic acid sequence endogenous to the filamentous fungal cell One or more first control sequences capable of directing the expression of wherein the one or more first control sequences are operably linked to the first nucleic acid sequence and / or (ii) 5 One or more of one or more second nucleic acid sequences encoding a heme biosynthetic enzyme which is a nucleic acid sequence encoding aminolevulinic acid (5-ALA) synthase or a nucleic acid sequence encoding porphobilinogen synthase or a combination thereof Wherein the introduction of the one or more first regulatory sequences and / or the one or more second nucleic acid sequences increases the amount of heme produced by the filamentous fungal cell; (B) culturing the filamentous fungal cells in a nutrient medium suitable for the production of heme protein and heme biosynthetic enzymes; and (c) from the nutrient medium of the filamentous fungal cells. A method comprising recovering said heme protein is proposed.
また特許文献２は、大腸菌を用いたバクテリア由来のペルオキシダーゼの大量生産方法を提案している。具体的には、従来の脱色能力（分解能力）が高い糸状菌Geotrichum candidium Dec 1由来のペルオキシターゼがカビ由来すなわち真核生物由来であり、かつ、糖タンパクであるので、大腸菌により効率よく生産することは極めて困難であるという問題点に鑑み、Anabacna PC7120alr1585由来の新規なペルオキシダーゼを提案している。またalr1585がヘムタンパク質であるとの事実に基づき、大腸菌をトランスフォーメーションする際に、培地にヘムの原料物質である5-ALAを添加し、発現量が20〜30％増大することが確認できたと報告している。 Patent Document 2 proposes a mass production method of bacterial peroxidase using Escherichia coli. Specifically, the peroxidase derived from the filamentous fungus Geotrichum candidium Dec 1, which has a high decoloring ability (decomposition ability), is derived from fungi, that is, from eukaryotes, and is a glycoprotein, so it can be produced efficiently by E. coli. Has proposed a new peroxidase derived from Anabacna PC7120alr1585. Also, based on the fact that alr1585 is a heme protein, when transforming E. coli, it was confirmed that 5-ALA, the raw material for heme, was added to the medium and the expression level increased by 20-30%. Reporting.
昆虫細胞を用いたBESに関しては、以前の研究によって、添加物として塩化ヘミンを、またはヘム前駆体として5-ALAを用いると、ペルオキシダーゼ産生に正の影響がありうることが立証されてきている。例えば、HartmannおよびSeguraは、ヨウトガ由来のSf9昆虫細胞株におけるBESによるHRP産生を示した。この特定の場合には、彼らは、添加物としてヘミンのみを用いていた（非特許文献5、6）。他方で、ShinおよびFragosoは、イラクサギンウワバ由来のHigh FiveTM昆虫細胞株において、5-ALAを用いて、ラクトペルオキシダーゼを産生した（非特許文献7、8）。 For BES using insect cells, previous studies have demonstrated that using hemin chloride as an additive or 5-ALA as a heme precursor can have a positive effect on peroxidase production. For example, Hartmann and Segura demonstrated HRP production by BES in the Sf9 insect cell line from Itoga. In this particular case, they used only hemin as an additive (Non-Patent Documents 5 and 6). On the other hand, Shin and Fragoso produced lactoperoxidase using 5-ALA in the High Five ™ insect cell line derived from nettle wabas (Non-patent Documents 7 and 8).
上で述べたように、ペルオキシダーゼを抗体または抗体結合性タンパク質とコンジュゲート化するには、天然HRPが化学的に修飾されて用いられてきた。化学的修飾法の反応は非特異的なため、その架橋点を制御することはできず、ペルオキシダーゼや抗体または抗体結合性タンパク質の性能を劣化させてしまう可能性がある。またさらに、化学的修飾法は、化学的活性化、コンジュゲート化および精製手段を含み、その手順は煩雑である。このような労力を要する方法とタンパク質の機能劣化を回避するためには、化学的に修飾する代わりに、ペルオキシダーゼを構成要素とする組換え融合タンパク質として調製することは、好適であるだろう。 As mentioned above, native HRP has been used chemically modified to conjugate peroxidase to antibodies or antibody binding proteins. Since the reaction of the chemical modification method is non-specific, the cross-linking point cannot be controlled, and the performance of peroxidase, antibody, or antibody-binding protein may be deteriorated. Still further, chemical modification methods include chemical activation, conjugation and purification means, and the procedure is cumbersome. In order to avoid such labor-intensive methods and protein functional degradation, it may be preferable to prepare a recombinant fusion protein containing peroxidase as a constituent instead of chemical modification.
また、BESが組換えタンパク質産生のために用いられてきているが、ヘムタンパク質に代表されるような、補助因子を必要とするアポタンパク質の生産に関しては、昆虫細胞を用いて検討した報告が数例あるに過ぎず、カイコ個体を用いた報告は見当たらない。前掲非特許文献5〜8も昆虫細胞を用いており、幼虫を用いる系への応用については、記載も示唆もない。 In addition, BES has been used for the production of recombinant proteins, but there are a number of reports examined using insect cells regarding the production of apoproteins that require cofactors such as heme proteins. There are only examples, and there are no reports using silkworm individuals. The aforementioned non-patent documents 5 to 8 also use insect cells, and there is no description or suggestion about application to a system using larvae.
本発明者らは、ここに、カイコ幼虫を用いた組換えヘムタンパク質産生において、タンパク質発現中に塩化ヘミンおよび5-ALAを幼虫に直接投与することによってそれらの影響を調べた。また、BESを用いて、融合ペルオキシダーゼ-抗体結合タンパク質、ARP-PGを異種性に発現させた。得られた知見は、カイコ幼虫を用いたホロタンパク質生産への応用が期待できる。 The inventors herein examined the effects of recombinant heme protein production using silkworm larvae by directly administering hemin chloride and 5-ALA to the larvae during protein expression. In addition, the fusion peroxidase-antibody binding protein, ARP-PG, was heterologously expressed using BES. The obtained knowledge can be expected to be applied to holoprotein production using silkworm larvae.
本発明は、以下を提供する。
[１] ホロタンパク質の生産方法であって：
（１）アポンパク質を産生可能に操作されたカイコを準備し；そして
（２）準備したカイコに少なくとも一の補助因子を投与し、カイコにおけるヘムタンパク質の産生を上昇させる
工程を含む、生産方法。
[２] ホロタンパク質が、ヘムタンパク質であり、補助因子がヘム化合物またはその前駆体もしくは誘導体である、１に記載の生産方法。
[３] ヘムタンパク質が、オキシドレダクターゼである、２に記載の生産方法。
[４] オキシドレダクターゼが、ペルオキシダーゼである、３に記載の生産方法。
[５] ペルオキシダーゼが、アルスロマイセス・ラモサス由来ペルオキシダーゼ（ARP）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である、４に記載の生産方法。
[６] ホロタンパク質が、融合タンパク質として生産される、１〜５のいずれか１項に記載の生産方法。
[７] 融合タンパク質が、ペルオキシダーゼと標的結合ドメインとの融合タンパク質である、６に記載の生産方法。
[８] 標的結合ドメインが、抗体結合ドメインである、７に記載の生産方法。
[９] 抗体結合ドメインが、プロテインＡのＢドメイン、ならびにストレプトコッカス属由来プロテインＧのＣ２およびＣ３ドメインからなる群から選択されるいずれかである、８に記載の生産方法。
[１０] 抗体結合ドメインが、プロテインＡのＢドメイン、ならびにストレプトコッカス属由来プロテインＧのＣ２およびＣ３ドメインを含む、９に記載の生産方法。
[１１] 少なくとも一の補助因子の投与が、カイコの血体腔内に注射することによる、１〜１０のいずれか１項に記載の生産方法。
[１２] 少なくとも一の補助因子が、５−アミノレブリン酸である、１１に記載の生産方法。
[１３] アポンパク質を産生可能に操作されたカイコが、組換えバキュロウイルスを用いてアポンパク質を産生可能に操作されたカイコである、１〜１２のいずれかに記載の生産方法。
[１４] カイコが、カイコ核多角体病ウイルス（BmNPV）高感受性の系統である、１〜１３のいずれか１項に記載の生産方法。
The present invention provides the following.
[1] A method for producing a holoprotein comprising:
(1) preparing a silkworm that is engineered to produce an apoprotein; and (2) administering at least one cofactor to the prepared silkworm to increase production of heme protein in the silkworm.
[2] The production method according to 1, wherein the holoprotein is a heme protein and the cofactor is a heme compound or a precursor or derivative thereof.
[3] The production method according to 2, wherein the heme protein is oxidoreductase.
[4] The production method according to 3, wherein the oxidoreductase is peroxidase.
[5] The production method according to 4, wherein the peroxidase is Arthromyces ramosus-derived peroxidase (ARP) or horseradish peroxidase (HRP).
[6] The production method according to any one of 1 to 5, wherein the holoprotein is produced as a fusion protein.
[7] The production method according to 6, wherein the fusion protein is a fusion protein of peroxidase and a target binding domain.
[8] The production method according to 7, wherein the target binding domain is an antibody binding domain.
[9] The production method according to 8, wherein the antibody binding domain is any one selected from the group consisting of the B domain of protein A and the C2 and C3 domains of protein G derived from Streptococcus.
[10] The production method according to 9, wherein the antibody-binding domain includes the B domain of protein A and the C2 and C3 domains of protein G derived from Streptococcus.
[11] The production method according to any one of 1 to 10, wherein the administration of at least one cofactor is performed by injection into the blood body cavity of a silkworm.
[12] The production method according to 11, wherein at least one cofactor is 5-aminolevulinic acid.
[13] The production method according to any one of 1 to 12, wherein the silkworm engineered so as to be able to produce an apoprotein is a silkworm engineered to be capable of producing an apoprotein using a recombinant baculovirus.
[14] The production method according to any one of 1 to 13, wherein the silkworm is a silkworm nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) hypersensitive strain.
また、BESを用いて、融合ペルオキシダーゼ-抗体結合タンパク質、ARP-PGを異種性に発現させた。酵素イムノアッセイのための融合タンパク質の潜在的な適用もまた立証した。 In addition, the fusion peroxidase-antibody binding protein, ARP-PG, was heterologously expressed using BES. The potential application of fusion proteins for enzyme immunoassays has also been demonstrated.
数値範囲「Ｘ〜Ｙ」は、特に記載した場合を除き、両端の数値ＸおよびＹを含む。「Ａおよび／またはＢ」は、特に記載した場合を除き、ＡおよびＢのうちのすくなくとも一方の意である。
本発明は、カイコ個体を用いた、ヘムタンパク質の生産方法を提供する。本発明の生産方法は、少なくとも下記の工程を含む。
（１）ホロタンパク質を産生可能に操作されたカイコを準備し；そして
（２）準備したカイコに少なくとも一の補助因子を投与し、カイコにおけるホロタンパク質の産生を上昇させる工程。
The numerical range “X to Y” includes the numerical values X and Y at both ends unless otherwise specified. “A and / or B” means at least one of A and B, unless otherwise specified.
The present invention provides a method for producing heme proteins using silkworm individuals. The production method of the present invention includes at least the following steps.
(1) preparing a silkworm that is engineered to produce a holoprotein; and (2) administering at least one cofactor to the prepared silkworm to increase the production of the holoprotein in the silkworm.
［ホロタンパク質］
本発明の生産方法により生産されるタンパク質は、ホロタンパク質である。ホロタンパク質は、本体となるタンパク質分子に、非タンパク質性の分子が結合して機能する。非タンパク質性の分子の部分を補助因子（補欠因子、補因子、補欠分子）という。本発明の生産方法により生産されるホロタンパク質の好ましい例は、ヘムタンパク質である。なお以下では、本発明を、生産されるタンパク質がヘムタンパク質である場合を例に説明することがあるが、当業者であれば、その説明をホロタンパク質に適用して理解することができる。ヘムタンパク質は、ヘムを補欠因子族とするタンパク質である。ヘムは、通常、2価の鉄とIX型プロトポルフィリンからなるプロトヘムであるフェロヘムのことを指すが、フェリヘムやヘモクロム、ヘミン、ヘマチンなど、その他のポルフィリンの鉄錯体もヘムと総称されることがある。本発明でヘムというときは、これらすべてを包含する。
[Holoprotein]
The protein produced by the production method of the present invention is a holoprotein. A holoprotein functions by binding a non-proteinaceous molecule to a protein molecule as a main body. The part of the non-proteinaceous molecule is called a cofactor (prosthetic factor, cofactor, prosthetic molecule). A preferred example of the holoprotein produced by the production method of the present invention is heme protein. In the following, the present invention will be described by taking the case where the produced protein is a heme protein as an example, but those skilled in the art can understand the description by applying the description to a holoprotein. Heme protein is a protein having heme as a prosthetic factor family. Heme usually refers to ferroheme, a protoheme composed of divalent iron and type IX protoporphyrin, but other porphyrin iron complexes such as ferriheme, hemochrome, hemin, and hematin may also be collectively referred to as heme. . In the present invention, the term “heme” includes all of them.
ヘムタンパク質の例としては、オキシドレダクターゼ、薬物代謝酵素（P450）、カタラーゼ、一酸化窒素合成酵素、ミトコンドリアの電子伝達系（シトクロム）、ヘモグロビン、ミオグロビンが挙げられる。これらのうち、本発明の好ましい態様の一つにおいて生産されるヘムタンパク質は、診断目的等において標識として用いることができる点で有用である、オキシドレダクターゼである。オキシドレダクターゼの例は、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、オキシダーゼカタラーゼであり、標識として用いることができる点で特に有用な例は、ペルオキシダーゼであり、より特定すると、アルスロマイセス・ラモサス由来ペルオキシダーゼ（ARP）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。これらのタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、当業者であれば、公知の配列を利用して、後述するタンパク質の生産方法の項に記載した生産系を構築することができる。 Examples of heme proteins include oxidoreductase, drug metabolizing enzyme (P450), catalase, nitric oxide synthase, mitochondrial electron transport system (cytochrome), hemoglobin, and myoglobin. Of these, the heme protein produced in one of the preferred embodiments of the present invention is an oxidoreductase that is useful in that it can be used as a label for diagnostic purposes and the like. Examples of oxidoreductases are peroxidase, haloperoxidase, oxygenase, oxidase catalase, and a particularly useful example in that it can be used as a label is peroxidase, more specifically, Arthromyces ramosas peroxidase (ARP) or Western Horseradish peroxidase (HRP). The amino acid sequences of these proteins are known, and those skilled in the art can use the known sequences to construct the production system described in the section of the protein production method described later.
［融合タンパク質］
本発明の好ましい態様の一つにおいては、ホロタンパク質は、融合タンパク質として生産される。融合されるものの例は、標的結合ドメインである。標的結合ドメインとは、標的とする物質に結合する能力を有するポリペプチドである。標的は、特に限定されず、例えば、タンパク質、糖、脂質、核酸等であり得る。生産された融合タンパク質を診断等の場面において目的物質の検出のために用いる場合は、標的は、目的物質、目的物質を抗原とする一次抗体、または一次抗体を抗原とする二次抗体であり得る。標的結合ドメインは、例えば、抗体、抗体結合ドメイン、抗体断片（例えば、scFv（単鎖抗体）、Fab等）、糖鎖に結合するレクチン、ビオチンに結合するアビジンまたはストレプトアビジン等であり得る。
[Fusion protein]
In one preferred embodiment of the invention, the holoprotein is produced as a fusion protein. An example of what is fused is a target binding domain. A target binding domain is a polypeptide that has the ability to bind to a target substance. The target is not particularly limited, and can be, for example, a protein, sugar, lipid, nucleic acid, or the like. When the produced fusion protein is used for detection of a target substance in a scene such as diagnosis, the target can be a target substance, a primary antibody having the target substance as an antigen, or a secondary antibody having the primary antibody as an antigen. . The target binding domain can be, for example, an antibody, an antibody binding domain, an antibody fragment (eg, scFv (single chain antibody), Fab, etc.), a lectin that binds to a sugar chain, avidin that binds to biotin, or streptavidin.
本発明の好ましい態様の一つにおいては、標的結合ドメインは、抗体結合ドメインである。抗体結合ドメインの例は、プロテインＡ（免疫グロブリンＧのFc領域に対する特異的結合活性を有することが知られている）の抗体結合活性を示すドメインであるＡ, Ｂ, Ｃ, Ｄ, Ｅドメイン、ストレプトコッカスの菌由来のプロテインＧ（免疫グロブリンＧのFc領域に対する特異的結合活性を有することが知られている）の、抗体結合活性を示すドメインであるＣ１、Ｃ２、Ｃ３（文献によっては、Ｂドメインとも表記される。）である。ストレプトコッカス属プロテインＧ由来のタンデム抗体結合ドメインＣ２およびＣ３を組み合わせて用いることは、単一のドメイン自体各々よりも、より高い結合能を示し得る（後掲の非特許文献９参照）点で好ましい。また、それらに併せてプロテインＡのＡ, Ｂ, Ｃ, Ｄ, Ｅドメインを用いてもよい。本発明の他の好ましい態様は、標的ドメインが抗体断片、例えばscFv（単鎖抗体）であるものである。 In one preferred embodiment of the invention, the target binding domain is an antibody binding domain. Examples of antibody-binding domains include A, B, C, D, E domains that are antibody-binding activities of protein A (known to have specific binding activity to the Fc region of immunoglobulin G), C1, C2, and C3 of domains showing antibody-binding activity of protein G (known to have specific binding activity to the Fc region of immunoglobulin G) derived from Streptococcus bacteria (the B domain depending on the literature) Is also written.). The combined use of tandem antibody binding domains C2 and C3 derived from Streptococcus protein G is preferable in that it can exhibit higher binding ability than each of the single domains themselves (see Non-Patent Document 9 below). In addition, the A, B, C, D, and E domains of protein A may be used together. Another preferred embodiment of the invention is one in which the target domain is an antibody fragment, eg scFv (single chain antibody).
本発明の特に好ましい態様の一つにおいては、ヘムタンパク質がペルオキシダーゼであり、抗体結合ドメインがプロテインＡのＢドメイン、ならびにストレプトコッカス属由来プロテインＧのＣ２およびＣ３ドメインを含む。これは、プロテインＡのＢドメインが持つ3つのアルファらせんの強剛性を用いて、ペルオキシダーゼから抗体結合部分を分離するための役割も果たしうるからである。他の特に好ましい例は、ヘムタンパク質がペルオキシダーゼであり、標的結合ドメインが抗体断片、例えばscFv（単鎖抗体）であるものである。 In one particularly preferred embodiment of the present invention, the heme protein is peroxidase, and the antibody binding domain comprises the B domain of protein A and the C2 and C3 domains of protein G from Streptococcus. This is because the strong rigidity of the three alpha helices of the protein A B domain can also be used to separate the antibody binding moiety from the peroxidase. Another particularly preferred example is one in which the heme protein is peroxidase and the target binding domain is an antibody fragment, eg scFv (single chain antibody).
［カイコ］
本発明ではカイコを用いる。カイコは、特に記載した場合を除き、カイコガ（Bombyx mori）の個体を指し、幼虫個体のみならず、卵、蛹、繭又は成虫である個体も含む。系統は、その特性（卵、幼虫、蛹、繭、成虫の形質、遺伝子型）及び起源の全部又は一部によって他の系統の集合と区別することができ、かつ、その特性の全部を保持しつつ繁殖させることができる一のカイコの集合をいう。なお、本明細書における系統分類は、遺伝資源開発研究センターの方法に従っている。系統はまずその主要目的形質によってアルファベットで分類され、それに2位数を附して、また同一起源の分枝系は3位数を附して、系統を表す。
[Silkworm]
In the present invention, silkworms are used. Unless otherwise specified, silkworm refers to Bombyx mori individuals and includes not only larval individuals but also eggs, pupae, pupae or adults. A strain can be distinguished from a collection of other strains by all or part of its characteristics (egg, larva, pupa, pupa, adult trait, genotype) and origin, and retains all of its characteristics. A set of silkworms that can be bred while breeding. In addition, the systematic classification in this specification follows the method of the genetic resource development research center. Lines are first classified alphabetically according to their main target traits, followed by a 2-digit number, and branch systems of the same origin are represented by a 3-digit number to represent the lineage.
カイコがウイルスに対して感受性であるとは、特に記載した場合を除き、そのウイルスに感染することができ、かつ増殖させることができる能力をいう。感受性であるか否かは、例えば、増殖を容易に評価可能とするようなタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、GFP）の遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを作製し、対象とするカイコに感染させ、適切な時期にカイコ中の該タンパク質量を評価することにより、判断することができる。本発明に用いられるカイコは、BmNPV感受性またはAcNPV感受性であり得る。本発明の好ましい態様の一つにおいては、カイコとして、BmNPV感受性、より好ましくはBmNPV高感受性の系統を用いる。好ましく用いることのできるカイコ系統の例には、a49、c11、c51、c60、d17、e15、f10、f38、g05、g30、g32、l31、l311、l312、n41、r02、r21、t70、w601及びfylu、並びにc11、d17、f10又はf38系統の生物学的特性と同一の生物学的特性を有するそれらの変異体が含まれる。これらの系統の飼育及び繁殖は、当業者に慣用の条件で行うことができる。生物学的特性については、特開２００７−１５９４０６の記載が参照できる。 A silkworm is susceptible to a virus, unless otherwise specified, refers to the ability to infect and propagate the virus. Whether it is sensitive or not can be determined by, for example, preparing a recombinant virus incorporating a protein (for example, luciferase, GFP) gene that allows easy evaluation of growth, infecting the target silkworm, It can be judged by evaluating the amount of the protein in the silkworm at the time. The silkworm used in the present invention may be BmNPV sensitive or AcNPV sensitive. In one of the preferable embodiments of the present invention, a strain that is sensitive to BmNPV, more preferably highly sensitive to BmNPV is used as a silkworm. Examples of silkworm strains that can be preferably used include a49, c11, c51, c60, d17, e15, f10, f38, g05, g30, g32, l31, l311, l312, n41, r02, r21, t70, w601 and fylu and variants thereof having biological properties identical to those of the c11, d17, f10 or f38 strains are included. Breeding and breeding of these lines can be carried out under conditions customary for those skilled in the art. Regarding the biological characteristics, the description in JP-A-2007-159406 can be referred to.
カイコ系統は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）の中核機関である九州大学・遺伝資源開発研究センター（九州大学大学院農学研究院；〒812-8581 福岡市東区箱崎6-10-1；(Tel) 092-621-4991；(Fax) 092-624-1011）として、出願人より、特許法施行規則の第27条の3の規定に準じて、又はブタペスト条約に基づく規則の第11規則に準じて、分譲可能である（http://www.nbrp.jp/report/reportProject.jsp;jsessionid=BE73451C6E54680014762FD194C0F721?project=silkworm参照）。 Silkworm strains are the core organization of the National BioResource Project (NBRP), Kyushu University, Research Center for Genetic Resources (Kyushu University Graduate School of Agriculture; 6-10-1 Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka 812-8581) (Tel) 092- (621-4991; (Fax) 092-624-1011) from the applicant in accordance with Article 27-3 of the Enforcement Regulations of the Patent Law or according to Rule 11 of the Rules under the Budapest Treaty Yes (see http://www.nbrp.jp/report/reportProject.jsp;jsessionid=BE73451C6E54680014762FD194C0F721?project=silkworm).
［タンパク質の生産方法］
本発明の生産方法は、（１）ホロタンパク質を産生可能に操作されたカイコを準備する工程を含むが、この工程は、組換えウイルスを作製する工程、ウイルスをカイコへ感染させる工程、カイコ体内でウイルスを増殖させる工程を含んでいてもよい。
[Protein production method]
The production method of the present invention includes (1) a step of preparing a silkworm manipulated so as to be able to produce a holoprotein. This step comprises a step of producing a recombinant virus, a step of infecting a silkworm with a virus, A step of propagating the virus may be included.
組換えウイルスを作製する工程には、従来技術を用いることができる。バキュウロウイルスのゲノムは、通常130kbpの環状DNAであるため、直接目的遺伝子を導入することはできず、目的遺伝子を一旦トランスファープラスミドに組込み、相同組換えによって導入することとなるが、この点に関しては、種々の技術が開発されている。本発明においては、市販の構築システムを利用してもよい。 Conventional techniques can be used for the step of producing the recombinant virus. Since the genome of baculovirus is usually a circular DNA of 130 kbp, the target gene cannot be directly introduced. The target gene is once integrated into a transfer plasmid and then introduced by homologous recombination. Various technologies have been developed. In the present invention, a commercially available construction system may be used.
通常、外来遺伝子をBmNPV又はAcNPVに組み込むことにより組換えウイルスが作製されるが、BmNPV又はAcNPVのみならずこれらの変異体、例えば、病症発現を抑制するために特定の遺伝子を欠損させたもの、細胞にエントリーしやすくするために特定の遺伝子を過剰発現させたもの等を、本発明において用いることができる。 Usually, a recombinant virus is produced by incorporating a foreign gene into BmNPV or AcNPV, but not only BmNPV or AcNPV but also mutants thereof, for example, those lacking a specific gene to suppress disease expression, Those in which a specific gene is overexpressed in order to facilitate entry into cells can be used in the present invention.
組換えウイルスは、必要に応じ、培養細胞を用いて増殖させてから、次の感染工程に用いてもよい。また、必要に応じ、得られたウイルスを、懸濁液、凍結乾燥粉末等の形態としてもよい。 If necessary, the recombinant virus may be propagated using cultured cells and then used in the next infection step. If necessary, the obtained virus may be in the form of a suspension, lyophilized powder or the like.
目的遺伝子を導入した組換えウイルスの本発明のカイコへの感染は、概ね5齢の幼虫に対して行うことができる。接種量、感染経路等は当業者であれば適宜設定することができる。例えば、1×106 pfu/mLに調整した組換えウイルス液10μLを注射針を用いて胸部皮下に注射することによって実施することができる。接種労力を軽減する観点からは、人工飼料に混合して経口接種する方法（特許第3030430号等参照）も有用であろう。 The infection of the silkworm of the present invention with the recombinant virus introduced with the target gene can be carried out on approximately 5th instar larvae. A person skilled in the art can appropriately set the inoculation amount and the infection route. For example, it can be carried out by injecting 10 μL of the recombinant virus solution adjusted to 1 × 10 6 pfu / mL subcutaneously into the chest using an injection needle. From the viewpoint of reducing the inoculation labor, a method of inoculating the artificial feed with oral feeding (see Japanese Patent No. 3030430 etc.) will also be useful.
感染前の本発明のカイコの飼育、及び感染後にカイコ体内でウイルスを増殖させ、目的タンパク質を産生させる工程における本発明のカイコの飼育は、人工飼料を用いることもでき、桑の葉を用いることもできる。 Breeding of the silkworm of the present invention before infection, and breeding of the silkworm of the present invention in the process of growing the virus in the silkworm body after infection and producing the target protein, can also use artificial feed, using mulberry leaves You can also.
本発明の生産方法は、（２）準備したカイコに少なくとも一の補助因子を投与し、カイコにおけるホロタンパク質の産生を上昇させる工程を含む。補欠因子の例は、補助因子には、共有結合した色素（補欠分子族という。）、金属イオンおよび補酵素（非共有結合でアポ酵素に結合した有機化合物）が含まれる。本発明で補助因子というときは、補助因子自体のほか、誘導体または前駆体も含まれる。補欠分子族の例は、ヘム（シトクローム類，カタラーゼ，ヘモグロビンなどの補助因子）である。金属イオンの例は、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+である。補酵素の例は、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）、NAD+、NADP+、フラビンモノヌクレオチド（FMN）、チアミンピロリン酸（TPP）、ピロロキノリンキノン、ピリドキサールリン酸、ビオチン、メチルコバラミン、モリブドプテリン、リポ酸である。 The production method of the present invention includes the step of (2) administering at least one cofactor to the prepared silkworm to increase the production of holoprotein in the silkworm. Examples of cofactors include cofactors including covalently linked dyes (referred to as prosthetic groups), metal ions and coenzymes (organic compounds that are non-covalently bound to an apoenzyme). In the present invention, the term “cofactor” includes derivatives and precursors in addition to the cofactor itself. An example of a prosthetic group is heme (cofactors such as cytochromes, catalase, hemoglobin). Examples of metal ions are Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ and Cu 2+ . Examples of coenzymes are flavin adenine dinucleotide (FAD), NAD + , NADP + , flavin mononucleotide (FMN), thiamine pyrophosphate (TPP), pyrroloquinoline quinone, pyridoxal phosphate, biotin, methylcobalamin, molybdopterin, lipo It is an acid.
本発明の好ましい態様の一つにおいて、補助因子は、ヘムタンパク質またはその前駆体もしくは誘導体である。ヘムタンパク質の前駆体には、ヘム合成経路における種々のヘム前駆体が含まれる。例えば、５−アミノレブリン酸、ポルフォビリノーゲン、ヒドロメキシメチルビラン、ウロポルフィリノーゲンIおよびIII、コプロポルフィリノーゲンIII、プロトポルフィリノーゲンIX、プロトポルフィリンIXである。ヘム化合物には、塩化ヘミンが含まれる。投与経路にも拠るが、投与されるヘム化合物またはその前駆体もしくは誘導体は、細胞内取り込みがよい形態であることが好ましいであろう。このような例の一つは、５−アミノレブリン酸である。 In one preferred embodiment of the invention, the cofactor is a heme protein or a precursor or derivative thereof. Heme protein precursors include various heme precursors in the heme synthesis pathway. For example, 5-aminolevulinic acid, porphobilinogen, hydroxymethylmethyl bilane, uroporphyrinogen I and III, coproporphyrinogen III, protoporphyrinogen IX, protoporphyrin IX. Heme compounds include hemin chloride. Depending on the route of administration, it may be preferred that the heme compound or precursor or derivative thereof to be administered is in a form that allows for good cellular uptake. One such example is 5-aminolevulinic acid.
補助因子の投与経路は、特に限定されないが、カイコの血体腔内に注射することによることができる。 The administration route of the cofactor is not particularly limited, but can be by injection into the blood body cavity of the silkworm.
本発明のカイコから目的タンパク質を回収する時期は、カイコ体液中の組換えタンパク質濃度、カイコ一個体当たりの目的タンパク質の絶対量等により、決定することができる。通常、日が経つにつれ幼虫体が大きくなるので、１頭あたりのタンパク質生産の絶対量は増加する。しかし一方で、７日目以降は死亡する個体が出現することがある。回収時の本発明のカイコの状態は、外見上はウイルス感染させていない場合とほとんど同じであるが、カイコ系統によっては若干異なることがある。ウイルス感染したカイコは、通常、長期飼育しても通常蛹にならない。 The time for recovering the target protein from the silkworm of the present invention can be determined by the recombinant protein concentration in the silkworm body fluid, the absolute amount of the target protein per individual silkworm, and the like. Usually, as the day passes, the larvae grow larger, so the absolute amount of protein production per head increases. However, on the other hand, individuals who die after the 7th day may appear. The state of the silkworm of the present invention at the time of recovery is almost the same as when it is not virus-infected, but it may be slightly different depending on the silkworm strain. Virus-infected silkworms usually do not become pupae even when kept for a long time.
目的タンパク質は、個体のすべての組織から回収することができる。分泌系では、分泌されたタンパク質を含む体液を回収することもできる。
目的タンパク質の回収は、注射針等を使用して個体から直接体液を得る方法、必要に応じ適当な溶液を加えて個体を磨砕する方法、個体を凍結・融解することにより収縮現象を利用して体液を抽出する方法等を利用することができる。
The target protein can be recovered from all tissues of the individual. In the secretory system, body fluids containing secreted proteins can also be recovered.
The target protein can be collected using a method such as obtaining a body fluid directly from an individual using an injection needle or the like, a method of adding an appropriate solution as needed to grind the individual, or a contraction phenomenon by freezing / thawing the individual. For example, a method for extracting a body fluid can be used.
回収した目的タンパク質を含む液は、必要に応じ、分離、精製、凍結乾燥、結晶化等の工程に供してもよい。 The recovered solution containing the target protein may be subjected to steps such as separation, purification, lyophilization, and crystallization as necessary.
回収したタンパク質中の、目的のホロタンパク質の有無や目的のホロタンパク質の量は、目的のホロタンパク質が有すべき活性を確認することにより、評価できる。例えば、ペルオキシダーゼの生産を目的とする場合は、回収した精製タンパク質を、ABTS（2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸））法によって、ペルオキシダーゼ活性を測定することにより、評価できる。 The presence or absence of the target holoprotein and the amount of the target holoprotein in the collected protein can be evaluated by confirming the activity that the target holoprotein should have. For example, for the purpose of producing peroxidase, the collected purified protein should be measured for peroxidase activity by the ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) method. Can be evaluated.
1. 方法
ARP-PGを以下のように調製した:黄色ブドウ球菌プロテインAのBドメイン、ストレプトコッカス属プロテインGのC2およびC3ドメインを、抗体結合ドメインとして用いた。著者らは、ストレプトコッカス属プロテインG由来のタンデム抗体結合ドメインC2およびC3を用いてきたが、これは、この組み合わせが、単一のドメイン自体各々よりも、より高い結合能を示したためである（非特許文献9）。プロテインAのBドメインもまた抗体結合ドメインであるが、本研究において、これはまた、3つのアルファらせんの強剛性を用いて、ARP-PGの構造において、酵素から抗体結合部分を分離するための役割も果たしうる（非特許文献10）。合成ARP遺伝子、ならびにプロテインAのBドメイン、プロテインGのC2およびC3ドメインからなる抗体結合タンパク質遺伝子を用いた（医学生物学研究所、日本・名古屋）。in-Fusion（登録商標）PCR（Clontech Laboratories、米国カリフォルニア州）を用いることによって、抗体結合ドメイン遺伝子とARPの遺伝子を融合させた。最後に、融合タンパク質の遺伝子を、修飾pENTR11（pENTR11L2130k6GH8STREPTEVcSTOP）ベクター中に挿入した（図1）。上述のエントリークローンおよびpEDST8ベクターの間で、Gateway LR反応（ライフテクノロジーズジャパン、日本・東京）を用いることによって、バキュロウイルス・トランスファー・ベクターを得て、そして次いで、先に記載されるプロトコルにしたがって、組換えバキュロウイルス（BmNPV）を生成した（非特許文献11）。
1. Method
ARP-PG was prepared as follows: the B domain of S. aureus protein A and the C2 and C3 domains of Streptococcus protein G were used as antibody binding domains. The authors have used tandem antibody binding domains C2 and C3 from Streptococcus protein G because this combination showed a higher binding capacity than each single domain itself (non- Patent Document 9). The B domain of protein A is also an antibody-binding domain, but in this study it also used the rigidity of three alpha helices to separate the antibody-binding portion from the enzyme in the structure of ARP-PG. It can also play a role (Non-Patent Document 10). We used a synthetic ARP gene and an antibody binding protein gene consisting of the B domain of protein A and the C2 and C3 domains of protein G (National Institute for Medical Biology, Nagoya, Japan). The antibody binding domain gene and the ARP gene were fused by using in-Fusion® PCR (Clontech Laboratories, California, USA). Finally, the gene for the fusion protein was inserted into a modified pENTR11 (pENTR11L2130k6GH8STREPTEVcSTOP) vector (FIG. 1). By using Gateway LR reaction (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan) between the above entry clone and pEDST8 vector, baculovirus transfer vector was obtained, and then according to the protocol described above, Recombinant baculovirus (BmNPV) was generated (Non-patent Document 11).
本研究で用いたカイコ株f38は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）によって援助される九州大学カイコ・ストック・センターによって供給された。30ゲージ針を付けたMicroliterTMシリンジ（Hamilton Co、米国ネバダ州）を用いて、組換えバキュロウイルス（幼虫あたり1x105プラーク形成単位）を5齢の3日目のカイコ幼虫血体腔内に注射して接種した。組換えバキュロウイルス接種2日後、10 μLの塩化ヘミン（5 mg/mL、Merck Millipore、米国マサチューセッツ州）または10μLの5-ALA（5 mg/mL、和光純薬、日本・大阪）をカイコの血体腔内に注射した。 The silkworm strain f38 used in this study was supplied by the Kyushu University Silkworm Stock Center, supported by the National BioResource Project (NBRP). Using a Microliter TM syringe with a 30 gauge needle (Hamilton Co, NV, USA), recombinant baculovirus (1x10 5 plaque-forming units per larva) was injected into the 5th instar silkworm larvae body cavity at day 3. And inoculated. Two days after vaccination with recombinant baculovirus, 10 μL of hemin chloride (5 mg / mL, Merck Millipore, Massachusetts, USA) or 10 μL of 5-ALA (5 mg / mL, Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan) Injection into the body cavity.
用語「ARP-PG（-）」は、添加物を伴わないARP-PGと定義され、「ARP-PG（ヘム+）」は塩化ヘムが注射されたARP-PGと定義され、そして「ARP-PG（5-ALA+）」は5-ALAが注射されたARP-PGと定義される。 The term “ARP-PG (−)” is defined as ARP-PG without additives, “ARP-PG (hem +)” is defined as ARP-PG injected with heme chloride, and “ARP-PG”. “PG (5-ALA +)” is defined as ARP-PG injected with 5-ALA.
組換えバキュロウイルス接種4日後、25匹のカイコ幼虫から10 mLの血リンパを、20 mM 1-フェニル-2-チオ尿素を含有する15 mL試験管内に収集した。血リンパを8,000 rpmで、4℃で30分間遠心分離して、血球および破片を除去した。上清を使用するまで-80℃で凍結した。先に記載されるプロトコル（非特許文献11）にしたがって、Ni-NTAカラム（HisTrapTM Excel、GEヘルスケア・ジャパン、日本・東京）およびStrep-タグカラム（IBA、ドイツ・ゲッチンゲン）によって、組換えタンパク質を精製した。溶出された組換えタンパク質溶液を、限外濾過膜（Merck Millipore）を用いて、約10倍濃縮した。ビシンコニン酸アッセイ（BCAアッセイ）、および標準としてウシ血清アルブミンを用いて、精製タンパク質を定量化した。 Four days after inoculation with the recombinant baculovirus, 10 mL of hemolymph from 25 silkworm larvae was collected in a 15 mL test tube containing 20 mM 1-phenyl-2-thiourea. Hemolymph was centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. to remove blood cells and debris. The supernatant was frozen at -80 ° C until use. In accordance with the protocol described earlier (Non-Patent Document 11), the recombinant protein can be obtained using a Ni-NTA column (HisTrap ™ Excel, GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan) and a Strep-tag column (IBA, Gottingen, Germany). Was purified. The eluted recombinant protein solution was concentrated about 10 times using an ultrafiltration membrane (Merck Millipore). Purified protein was quantified using the bicinchoninic acid assay (BCA assay) and bovine serum albumin as a standard.
2. 結果
10 mLのカイコ血リンパから、それぞれ、少なくとも5 mgの各精製タンパク質を回収した（図4）。ABTS（2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸））法によって、精製融合タンパク質のペルオキシダーゼ活性を決定した。タンパク質溶液を酵素希釈緩衝液（40 mMリン酸カリウム、0.25％（w/v）ウシ血清アルブミン、0.5％TritonTM X-100、pH6.8）で100倍希釈した。その後、ABTSアッセイを行い、ここで、最終濃度は、96 mMリン酸カリウム、8.7mM ABTS（ロシュ・ダイアグノスティックス、日本・東京）、0.01％（w/w）過酸化水素、0.004％（w/v）ウシ血清アルブミン、0.008％（v/v）TritonTM X-100および0.01〜0.04単位ペルオキシダーゼであった。酸化ABTSを405nmの吸光度で測定した。pH5.0、25℃で、1分あたり、1.0 μmolのABTSを酸化させる酵素量を、1単位のペルオキシダーゼと定義した。ドットブロット分析によって、ARP-PGが酵素免疫測定法に利用なことを示した。モデリング抗原として、連続希釈したヒト・トランスフェリンをポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜（HybondTM-P、GEヘルスケア）上にブロッティングし、そして膜を乾燥させることによって固定した。1スポットあたり32 pg〜10 ngのトランスフェリンを含有する、トランスフェリン溶液をブロッティングした。0.1％Tween（登録商標）-20を含むTris緩衝生理食塩水中（TBS-T）の5％スキムミルク（和光純薬）溶液中、室温で1時間、膜をインキュベーションして、膜上の残った結合部位をブロッキングして、次いで、TBS-Tによって洗浄した。
2. Results
At least 5 mg of each purified protein was recovered from 10 mL of silkworm hemolymph (FIG. 4). The peroxidase activity of the purified fusion protein was determined by the ABTS (2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) method. The protein solution was diluted 100-fold with enzyme dilution buffer (40 mM potassium phosphate, 0.25% (w / v) bovine serum albumin, 0.5% Triton ™ X-100, pH 6.8). The ABTS assay was then performed, where final concentrations were 96 mM potassium phosphate, 8.7 mM ABTS (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan), 0.01% (w / w) hydrogen peroxide, 0.004% ( w / v) bovine serum albumin, 0.008% (v / v) Triton ™ X-100 and 0.01-0.04 units peroxidase. Oxidized ABTS was measured by absorbance at 405 nm. The amount of enzyme that oxidizes 1.0 μmol of ABTS per minute at pH 5.0 and 25 ° C. was defined as 1 unit of peroxidase. Dot blot analysis showed that ARP-PG was useful for enzyme immunoassay. As a modeling antigen, serially diluted human transferrin was blotted onto a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Hybond ™ -P, GE Healthcare) and fixed by drying the membrane. Transferrin solution containing 32 pg to 10 ng transferrin per spot was blotted. Incubate the membrane in 5% skim milk (Wako Pure Chemicals) solution in Tris-buffered saline (TBS-T) containing 0.1% Tween®-20 for 1 hour at room temperature to leave any remaining binding on the membrane The site was blocked and then washed with TBS-T.
抗原に直接結合する一次抗体として、TBS-T中で1:2,000希釈したウサギ抗ヒト・トランスフェリン・ポリクローナル抗体（DAKOジャパン、日本・東京）と、室温で1時間、膜をインキュベーションした。TBS-Tで膜を洗浄し、そしてTBS-T中の0.5 μg/mLのARP-PGと、室温で1時間、インキュベーションし、そして次いで、最後に、TBST-Tで洗浄した。ECLTM Primeウェスタンブロッティング検出試薬（GEヘルスケア）を化学発光検出に用いた。試薬セットの過酸化水素を含有する溶液Bを、溶液Aによって、この特定の実験に関しては1:15の希釈率で、希釈した。膜のペルオキシダーゼによる化学発光シグナルを冷却CCDカメラ（ChemiDocTM XRS+、Bio-rad、米国カリフォルニア州）によって捕捉した。 Membranes were incubated for 1 hour at room temperature with a rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody (DAKO Japan, Tokyo, Japan) diluted 1: 2,000 in TBS-T as a primary antibody directly binding to the antigen. Membranes were washed with TBS-T and incubated with 0.5 μg / mL ARP-PG in TBS-T for 1 hour at room temperature and then finally washed with TBST-T. ECL ™ Prime Western blotting detection reagent (GE Healthcare) was used for chemiluminescence detection. Solution B containing hydrogen peroxide in the reagent set was diluted with Solution A at a dilution ratio of 1:15 for this particular experiment. Membrane peroxidase chemiluminescence signals were captured by a cooled CCD camera (ChemiDoc ™ XRS +, Bio-rad, CA, USA).
ARP-PGのペルオキシダーゼ活性を図2Aに示す。ARP-PG（5-ALA+）の比活性は1090 U/mgであり、ARP-PG（-）の175 U/mgより6倍高かった。対照的に、ARP-PG（ヘム+）は、ARP-PG（-）と類似の活性を示し、およそ155 U/mgであった。すべてのARP-PGのUV-可視スペクトルを図2Bに示す。405 nm（ソーレー帯）でのピークは、ARP-PG（5-ALA+）の場合に増加し、これはヘム補欠分子族およびARPのアポタンパク質の間の結合のためである可能性が高い。405 nmおよび280 nmの比（Rz値として知られる）は、タンパク質中のヘム含量に相当する。市販の天然ARP（Mw 37,800）のRz値は約2.7である（非特許文献12）。ARP-PG（5-ALA+）の得られるRz値は0.48であったため、アポタンパク質分画が残存していることが予想された。融合タンパク質のPG領域も、ARP領域と同様に280 nmで吸収を持ち、融合タンパク質ARP-PGの分子量（MW 67,400）を考慮すると、ARP-PGのおよそ32％がヘムに結合したホロ体として存在している可能性が高い。アポタンパク質およびヘムの間の結合が細胞質で起こると仮定すると、5-ALA（Mw 167.6）の細胞取り込みが塩化ヘミン（Mw 652.0）よりも高いと推定するのが妥当であるようである。 The peroxidase activity of ARP-PG is shown in FIG. 2A. The specific activity of ARP-PG (5-ALA +) was 1090 U / mg, 6 times higher than 175 U / mg of ARP-PG (-). In contrast, ARP-PG (hem +) showed similar activity as ARP-PG (-), approximately 155 U / mg. The UV-visible spectra for all ARP-PGs are shown in Figure 2B. The peak at 405 nm (Soray band) increases with ARP-PG (5-ALA +), which is likely due to binding between the heme prosthetic group and the ARP apoprotein. The ratio of 405 nm and 280 nm (known as the Rz value) corresponds to the heme content in the protein. Commercially available natural ARP (Mw 37,800) has an Rz value of about 2.7 (Non-patent Document 12). Since the Rz value obtained for ARP-PG (5-ALA +) was 0.48, it was predicted that the apoprotein fraction remained. The PG region of the fusion protein also has an absorption at 280 nm like the ARP region, and considering the molecular weight of the fusion protein ARP-PG (MW 67,400), approximately 32% of the ARP-PG exists as a holobody bound to heme. It is highly possible that Assuming that the binding between apoprotein and heme occurs in the cytoplasm, it seems reasonable to assume that the cellular uptake of 5-ALA (Mw 167.6) is higher than that of hemin chloride (Mw 652.0).
最後に、モデルターゲットタンパク質としてのトランスフェリンの検出のため、ドットブロッティングにおいて、検出試薬としてのARP-PGの成績を検証した。ドットブロット分析の結果を図3に示す。ARP-PG（-）およびARP-PG（ヘム+）によって、1 ngまでのトランスフェリンが検出された。一方、ARP-PG（5-ALA+）は、32 pgのトランスフェリンを検出可能であった。したがって、ARP-PGの検出限界は、5-ALAを幼虫内に注射した際、30倍以上、改善された。この改善のありうる理由は、ARP-PG（-）またはARP-PG（ヘム+）よりもARP-PG（5ALA+）の比活性がより高いことである。 Finally, in order to detect transferrin as a model target protein, the results of ARP-PG as a detection reagent were verified in dot blotting. The results of dot blot analysis are shown in FIG. Up to 1 ng of transferrin was detected by ARP-PG (-) and ARP-PG (heme +). On the other hand, ARP-PG (5-ALA +) was able to detect 32 pg of transferrin. Therefore, the detection limit of ARP-PG was improved more than 30 times when 5-ALA was injected into larvae. A possible reason for this improvement is the higher specific activity of ARP-PG (5ALA +) than ARP-PG (-) or ARP-PG (hem +).
3. 結語
要約すると、著者らは、プロテインAおよびGの部分的ドメインからなる抗体結合タンパク質とARPを用いて、酵素イムノアッセイ適用可能な融合タンパク質、ARP-PGをBES-カイコ幼虫発現系を用いて異種発現することに成功した。タンパク質発現に加えて、著者らは、ヘム前駆体として5-ALAを用いることによって、ヘムタンパク質活性の顕著な増進を立証した。他の発現系よりも、バキュロウイルス仲介性カイコタンパク質発現系を用いて、より高いタンパク質収量が示されてきており（非特許文献13）、それによって、生物医学的イムノアッセイにおける検出試薬として用いられる、融合タンパク質の費用効率的な産生が可能になりうる。
3. Conclusion In summary, the authors used an antibody-binding protein consisting of partial domains of protein A and G and ARP, and an enzyme immunoassay fusion protein, ARP-PG, using the BES- silkworm larva expression system. Successfully expressed in different species. In addition to protein expression, the authors demonstrated a significant enhancement of heme protein activity by using 5-ALA as a heme precursor. Higher protein yields have been shown using baculovirus-mediated silkworm protein expression systems than other expression systems (13), thereby being used as detection reagents in biomedical immunoassays. Cost-effective production of the fusion protein may be possible.
4. 実施例の項で引用したその他の文献
非特許文献9：Ha, T.H. Jung, S. O. Lee, J. M. Lee, K. Y. Lee, Y. Park, J.S., and Bong Hyun Chung.: Oriented immobilization of antibodies with GST-fused multiple Fc-specific B-domains on a gold surface, Anal. Chem., 79, 546-556 (2007)
非特許文献10：Maeda, Y. Ueda, H. Kazami, J. Kawano, G. Suzuki, E., and T. Nagamune.: Engineering of functional chimeric protein G-Vargulaluciferase, Anal. Biochem., 249, 147-152 (1997)
非特許文献11：Mitsudome, T. Xu, J., Nagata, Y., Masuda, A., Iiyama, K., Morokuma, D., Li, Z., Mon, H., Lee, J.M., and Kusakabe, T.: Expression, Purification, and Characterization of Endo-β-N-acetylglucosaminidase H using baculovirus-mediated silkworm protein expression system, Appl. Biochem. Biotechnol.,172, 3978-3988 (2014).
非特許文献12：Shinmen, Y., Asami, S., Amachi, T., Shimizu, S., and Yamada, H.: Crystallization and characterization of an extracellular fungal peroxidase, Agric. Biol. Chem., 50,247-249 (1986).
非特許文献13：Nagaya, H., Kanaya, T., Kaki, H., Tobita, Y., Takahashi, M., Takahashi, H., Yokomizo, Y., and Inumaru, S.: Establishment of a large-scale purification procedure for purified recombinant bovine interferon-τ produced by a silkworm-baculovirus gene expression system, J. Vet. Med. Sci., 66, 1395-1401 (2004).
4. Other references cited in the Examples section Non-patent document 9: Ha, TH Jung, SO Lee, JM Lee, KY Lee, Y. Park, JS, and Bong Hyun Chung .: Oriented immobilization of antibodies with GST- fused multiple Fc-specific B-domains on a gold surface, Anal. Chem., 79, 546-556 (2007)
Non-Patent Document 10: Maeda, Y. Ueda, H. Kazami, J. Kawano, G. Suzuki, E., and T. Nagamune .: Engineering of functional chimeric protein G-Vargulaluciferase, Anal. Biochem., 249, 147- 152 (1997)
Non-Patent Document 11: Mitsudome, T. Xu, J., Nagata, Y., Masuda, A., Iiyama, K., Morokuma, D., Li, Z., Mon, H., Lee, JM, and Kusakabe , T .: Expression, Purification, and Characterization of Endo-β-N-acetylglucosaminidase H using baculovirus-mediated silkworm protein expression system, Appl. Biochem. Biotechnol., 172, 3978-3988 (2014).
Non-Patent Document 12: Shinmen, Y., Asami, S., Amachi, T., Shimizu, S., and Yamada, H .: Crystallization and characterization of an extracellular fungal peroxidase, Agric. Biol. Chem., 50, 247-249 (1986).
Non-Patent Document 13: Nagaya, H., Kanaya, T., Kaki, H., Tobita, Y., Takahashi, M., Takahashi, H., Yokomizo, Y., and Inumaru, S .: Establishment of a large -scale purification procedure for purified recombinant bovine interferon-τ produced by a silkworm-baculovirus gene expression system, J. Vet. Med. Sci., 66, 1395-1401 (2004).
Claims (14)
（１）アポンパク質を産生可能に操作されたカイコを準備し；そして
（２）準備したカイコに少なくとも一の補助因子を投与し、カイコにおけるヘムタンパク質の産生を上昇させる工程を含む、生産方法。 A method for producing a holoprotein comprising:
(1) preparing a silkworm that is engineered to produce an apoprotein; and (2) administering at least one cofactor to the prepared silkworm to increase production of heme protein in the silkworm.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017029039A (en) * | 2015-07-30 | 2017-02-09 | シスメックス株式会社 | Method for producing hemoprotein |
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2016
- 2016-02-22 JP JP2016031204A patent/JP2016154542A/en active Pending
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