JP2016146785A - 肝細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
S=4B/(ACD)
(1)平均繊維径がAμmで、繊維の密度がDg/cm3である時、繊維の単位質量あたりの表面積は、4/(AD)(単位:m2/g)と表すことができる。
(2)平均目付Bg/m2あたりの繊維のトータルの表面積は、4B/(AD)(単位:m2)と表すことができる。
(3)1m2(=目付)あたり、厚さがCμmの繊維集合体の空隙も含めた体積は、10−6C(単位:m3)と表すことができる。
(4)単位体積あたりの表面積は、4×106B/(ACD)(単位:m2/m3)=4B/(ACD)(単位:m2/cm3)と表すことができる。
P=[1−Ms/(V×SG)]×100
ここで、Pは空隙率(単位:%)、Msは繊維集合体の質量(単位:g)、Vは繊維集合体の占める見掛上の体積(単位:cm3)、SGは繊維集合体構成繊維の密度(単位:g/cm3)をそれぞれ表す。
P=[1−Mn/(t×SG)]×100
ここで、Pは空隙率(%)、Mnは繊維集合体の平均目付(g/m2)、tは繊維集合体の平均厚さ(μm)、SGは繊維集合体構成繊維の密度(単位:g/cm3)をそれぞれ表す。
型式:TSM−01−cre サーチ株式会社製
試験サイズ:5mm幅×40mm長
チャック間間隔:20mm
引張速度:20mm/min.
初荷重:50mg/1d
(参考文献)
George W S.,Determination of Specific Sufface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide,Anal.Cheam.;28,1981-1983,(1956)
(1)繊維集合体の融着部を含む厚さ方向断面の電子顕微鏡写真を撮影する。
(2)前記電子顕微鏡写真において、融着部における厚さを一辺(短辺)とし、前記厚さの5倍の長さを一辺(長辺)とする長方形の枠を任意の箇所に設定し、測定領域を確定する。
(3)前記測定領域内における粒状の塊(融着部)の占める面積、又は融着部の数を測定する。なお、粒状の塊(融着部)の占める面積の比率(Arc)は、次の式から算出する。
Arc=(Atc/Amc)×100
ここで、Atcは測定した融着部の面積の総和、Amcは測定領域の面積、をそれぞれ意味する。
(1)繊維集合体の主面全体の電子顕微鏡写真を撮影する。
(2)繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊(融着部)により囲まれた領域の面積を測定する。
(3)繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊(融着部)により囲まれた領域における、粒状の塊(融着部)の占める面積、又は融着部の数を測定する。なお、粒状の塊(融着部)の占める面積の比率(Ars)は、次の式から算出する。
Ars=(Ats/Ams)×100
ここで、Atsは繊維集合体の主面における融着部の占める面積の総和、Amsは繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊(融着部)により囲まれた領域の面積、をそれぞれ意味する。
(参考文献)
George W S.,Determination of Specific Surface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide,Anal.Cheam.;28,1981-1983,(1956)
金属化合物としてのテトラエトキシシラン、溶媒としてのエタノール、加水分解のための水、及び触媒として1規定の塩酸を、1:5:2:0.003のモル比で混合し、温度78℃で10時間の還流操作を行い、次いで、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去して濃縮した後、温度60℃に加熱して、粘度が2ポイズのゾル溶液を形成した。
(2)紡糸ノズルと対向電極との距離:200mm
(3)対向電極及びイオン発生電極(両電極を兼ねる):ステンレス板(誘起電極)上に厚さ1mmのアルミナ膜(誘電体基板)を溶射し、その上に直径30μmのタングステンワイヤ(放電電極)を10mmの等間隔で張った沿面放電素子(タングステンワイヤ面を紡糸ノズルと対向させると共に接地し、ステンレス板とタングステンワイヤ間に交流高電圧電源により50Hzの交流高電圧を印加)
(4)第1高電圧電源:−16kV
(5)第2高電圧電源:±5kV(交流沿面のピーク電圧:5kV、50Hz)
(6)気流:水平方向(紙面上、左から右方向)25cm/sec、鉛直方向(紙面上、捕集部材4の上から下方向)15cm/sec
(7)紡糸容器内の雰囲気:温度25℃、湿度40%RH以下
前記焼結シリカ連続繊維集合体を直径6.25mmの円形となるように打ち抜いた後、細胞低接着性96ウェルプレートの各ウェルに、前記円形の焼結シリカ連続繊維集合体を挿入し、各ウェルの底面に配置した。
細胞接着性96ウェルプレートの各ウェルに、33.3μg/mLのラミニン111溶液[=比較例2、マウスEHS細胞株由来(Wako製、120−05751)]、33.3μg/mLのフィブロネクチン溶液[=比較例3、ヒト血漿由来(BD,354008)]、又は33.3μg/mLのI型コラーゲン溶液[=比較例4、ラット尾由来(BD,354236)]のコート液を、それぞれ1ウェルあたり50μL注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、各ウェル底面をラミニン、フィブロネクチン又はコラーゲンでコートした。なお、いずれも底面積1cm2あたりの含有量は5μgであった。
前記焼結シリカ連続繊維集合体を直径6.25mmの円形となるように打ち抜いた後、細胞低接着性96ウェルプレートの各ウェルに、前記円形の焼結シリカ連続繊維集合体を挿入し、各ウェルの底面に配置した。
細胞接着性96ウェルプレートの各ウェルに、479.52μg/mLのラミニン111溶液[マウスEHS細胞株由来(Wako製、120−05751)]のコート液を、1ウェルあたり50μL注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、ウェル底面をラミニンでコートした。なお、底面積1cm2あたりの含有量は72.7μgであった。
培地交換時の培養上清を全量回収(各ウェル100μL)し、凍結保存を行った。全培養日程終了後、これらを解凍し、培養上清中に分泌されたラット由来アルブミン量を、ELISA法 (Enzyme−Linked Immuno Sorbent Assay)によって測定した。検出には、一次抗体として抗ラットアルブミンウサギ抗血清(MP Biomedicals,55711)、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットアルブミンヒツジIgG(MP Biomedicals,55776)を使用した。なお、測定値の取得には、マイクロプレートリーダー(コロナ電気,SH−9000)を使用し、付属のソフトウェアで解析した。この結果を示すグラフを図3(実施例1〜2及び比較例1〜4)及び図4(実施例1、3、比較例2、5)に示した。なお、グラフは4ウェルの平均値と標準偏差を示している。
実施例1と比較例2の肝細胞の培養において、3日又は5日間培養した後に、肝細胞の培養培地を除去し、肝細胞培養培地(図5〜8中、「定常状態」と表記)、0.1vol%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む肝細胞培養培地(図5〜8中、「溶媒のみ」と表記)、又は50mMデキサメサゾン(Dex)を溶解したDMSOを0.1vol%混和した肝細胞培養培地(Dex終濃度:50μM、図5〜8中、「誘導薬剤あり」と表記)を、各ウェルに100μL添加した。
2 紡糸ノズル
3 繊維回収容器
4 捕集部材
5 対向電極
5a イオン
6 ゾル溶液供給機
7 第1高電圧電源
8 第2高電圧電源
9 吸引機
25 沿面放電素子
26 誘電体基板
27 放電電極
28 誘起電極
29 交流電源
Claims (1)
- 単位体積あたりの表面積が0.01m2/cm3以上の繊維集合体を細胞培養担体として用い、肝細胞を培養する方法であり、前記繊維集合体を構成する繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有していることを特徴とする、肝細胞の培養方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2018061131A1 (ja) * | 2016-09-28 | 2018-04-05 | オリンパス株式会社 | 細胞状態計測装置 |
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- 2015-02-12 JP JP2015025866A patent/JP6454172B2/ja active Active
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TRIMPL, R., ET AL.: "Characterization of Protease-resistant Fragments of Laminin Mediaiting Attachment and Spreading of R", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 258(14), JPN6018039310, 1983, pages 8922-8927 * |
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