JP2016141659A - Norovirus deactivator and production method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、ノロウイルス不活化剤及びその製法に関し、より詳細には、卵白リゾチームの部分配列を利用したノロウイルス不活化剤及びその製法に関する。 The present invention relates to a norovirus inactivating agent and a method for producing the same, and more particularly to a norovirus inactivating agent using a partial sequence of egg white lysozyme and a method for producing the same.
ノロウイルスはヒトに感染して非細菌性急性胃腸炎を引き起こすウイルスである。日本で報告されている非細菌性食中毒事例のうち、最も症例が多いのは本ウイルスを原因とした症例であり、冬に大流行するため問題視されている。ノロウイルスは食品製造現場で多く利用されるエタノール製剤で不活化することができないウイルスであり、通常不活化のためには次亜塩素酸が用いられる。しかし、有機物が共存する場合には不活化効果が劣るなどの原因により、次亜塩素酸を効果的に使用できる現場は限られる。
一方、リゾチームはグラム陽性菌の細胞壁を分解する酵素として知られていた（非特許文献１）が、加熱を行うことによってタンパクの立体構造が変化し、細胞壁の薄いグラム陰性菌に対しても殺菌効果を有することが明らかとなった（非特許文献２）。これは、酵素として細胞壁を分解するというメカニズムではなく、構造の変化により特定のアミノ酸残基が露出、細胞膜に作用することに起因することが示されている。
発明者らは、このような新規のノロウイルス不活化剤を開発するための一連の研究の成果として、加熱変性した卵白リゾチームが、ノロウイルスの代替ウイルスであるMNV-1に不活化効果を持つことを明らかにした（特許文献1、非特許文献３）。
Norovirus is a virus that infects humans and causes non-bacterial acute gastroenteritis. Among the cases of non-bacterial food poisoning reported in Japan, the most common cases are those caused by this virus, and it is regarded as a problem because it is a pandemic in winter. Norovirus is a virus that cannot be inactivated by ethanol preparations frequently used in food production sites, and hypochlorous acid is usually used for inactivation. However, when organic substances coexist, the site where hypochlorous acid can be effectively used is limited due to the inactivation effect being poor.
On the other hand, lysozyme was known as an enzyme that degrades the cell wall of Gram-positive bacteria (Non-patent Document 1), but the three-dimensional structure of the protein is changed by heating, and it is sterilized against Gram-negative bacteria with thin cell walls. It became clear that it had an effect (nonpatent literature 2). This is not due to the mechanism of degrading the cell wall as an enzyme, but is attributed to the fact that specific amino acid residues are exposed due to structural changes and act on the cell membrane.
As a result of a series of studies for developing such a novel norovirus inactivating agent, the inventors have found that heat-denatured egg white lysozyme has an inactivating effect on MNV-1, which is a norovirus alternative virus. Clarified (Patent Document 1, Non-Patent Document 3).
発明者らは、上記報告（非特許文献１、２）を検討した結果、そこに記載のメカニズムに従えば、卵白リゾチームがウイルスの外殻を構成しているキャプシドプロテインにも何らかの作用をする可能性が高いという発想のもとに研究を行った。
本発明は、卵白リゾチームを利用して、ノロウイルスを不活化する手段を提供することを目的とする。
As a result of examining the above reports (Non-Patent Documents 1 and 2), the inventors have found that egg white lysozyme can also act on the capsid protein that constitutes the outer shell of the virus according to the mechanism described therein. I conducted research based on the idea of high nature.
An object of the present invention is to provide means for inactivating norovirus using egg white lysozyme.
発明者らは、卵白リゾチームを鋭意検討した結果、卵白リゾチーム自体にはノロウイルスを不活化する効果がないにもかかわらず、卵白リゾチームにノロウイルス不活化活性を付与する手段が２つあることを見出した。
その一つとして、発明者らは、既に、加熱変性した卵白リゾチームが、ノロウイルスの代替ウイルスであるMNV-1に不活化効果を持つことを明らかにしている（特許文献1、非特許文献1）。
二つ目として、卵白リゾチームの全長ペプチドのうちLzP1と名付けた部分のみを合成したペプチドがMNV-1に不活化効果を持つことを見出した（後記の実施例）。
卵白リゾチームは、高次構造において、その活性部分（即ち、ノロウイルスを不活化する部分）はその内部に隠蔽され外部に表出していないと推測されるところ、前者は、加熱されることによる卵白リゾチーム高次構造の変化により、その活性部分が表出したものと考えられ、後者は、その活性部分を取り囲んで活性部分を表出させなかった部分を除去することにより得られたペプチドがノロウイルス不活化活性を示したものと考えられた。
本願は、この二つめの発明に関するものである。
As a result of intensive investigation of egg white lysozyme, the inventors have found that there are two means for imparting norovirus inactivating activity to egg white lysozyme, even though egg white lysozyme itself has no effect of inactivating norovirus. .
As one of them, the inventors have already clarified that heat-denatured egg white lysozyme has an inactivating effect on MNV-1, which is a substitute virus for Norovirus (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). .
Secondly, it was found that a peptide obtained by synthesizing only the portion named LzP1 among the full length peptides of egg white lysozyme has an inactivating effect on MNV-1 (Examples described later).
Egg white lysozyme is assumed to have an active part (ie, a part that inactivates Norovirus) in a higher-order structure and is concealed inside and not exposed to the outside. It is thought that the active part was expressed by the change of the higher-order structure, and the latter is a norovirus inactivated peptide obtained by removing the part surrounding the active part but not showing the active part. It was thought that the activity was shown.
The present application relates to the second invention.
即ち、本願発明は、以下(a)〜(c)のいずれかのペプチドから成るノロウイルス不活化剤である。
(a) 配列番号１の１９〜６３番目のアミノ酸配列において少なくとも２３〜５１番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成るペプチド
(b) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
(c) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
また、本発明は、上記(a)〜(c)のいずれかのペプチドを合成することから成るノロウイルス不活化剤の製法である。
That is, the present invention is a norovirus inactivating agent comprising any of the following peptides (a) to (c).
(a) a peptide comprising an amino acid sequence containing at least the 23rd to 51st amino acid sequence in the 19th to 63rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence constituting the peptide of (a), and having norovirus inactivating activity
(c) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence constituting the peptide of (a) and having norovirus inactivating activity. This is a method for producing a norovirus inactivating agent comprising synthesizing any peptide of c).
本願発明のペプチドは、ノロウイルス不活化剤として使用できる。
本願発明のペプチドは、容易に合成でき、量産も容易である。
鶏卵や卵白には食物アレルギーを引き起こすアレルゲンが含まれているが、本願発明のペプチドは鶏卵又はその卵白の全体ではないため、このペプチドは食物アレルギーを引き起こすアレルゲンを含まない可能性がある。
The peptide of the present invention can be used as a norovirus inactivating agent.
The peptide of the present invention can be easily synthesized and mass-produced easily.
Chicken eggs and egg whites contain allergens that cause food allergies, but since the peptides of the present invention are not whole chicken eggs or egg whites, these peptides may not contain allergens that cause food allergies.
本願発明で用いるペプチドは、下記(a)〜(c)のいずれかのペプチドである。なお、配列番号１のアミノ酸配列(accession no. AAL69327.1）から成るペプチドは、ニワトリ型のリゾチームである。
(a) 配列番号１の１９〜６３番目のアミノ酸配列（KV FGRCELAAAM KRHGLDNYRG YSLGNWVCAA KFESNFNTQA TNR）において少なくとも２３〜５１番目のアミノ酸配列（RCELAAAM KRHGLDNYRG YSLGNWVCAA K）を含むアミノ酸配列から成るペプチド
このペプチドは、配列番号１の２３〜５１番目のアミノ酸配列を含んだ配列番号１の１９〜６３番目のアミノ酸配列の全体又はその部分配列であり、配列番号１の２３〜５１番目のアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列における１９〜６３番目のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含まないところに特徴がある。このペプチドは、配列番号１の２３〜５１番目のアミノ酸配列であってもよく、配列番号１の２３〜５７番目のアミノ酸配列（Lz-P1）等であってもよい。
The peptide used in the present invention is any one of the following peptides (a) to (c). The peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (accession no. AAL69327.1) is chicken lysozyme.
(a) a peptide comprising an amino acid sequence comprising at least the 23rd to 51st amino acid sequence (RCELAAAM KRHGLDNYRG YSLGNWVCAA K) in the 19th to 63rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (KV FGRCELAAAM KRHGLDNYRG YSLGNWVCAA KFESNFNTQA TNR) The whole or a partial sequence of the 19th to 63rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 including the 23rd to 51st amino acid sequence of 1, including the 23rd to 51st amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, It is characterized in that no amino acid sequence other than the 19th to 63rd amino acid sequences in the amino acid sequence is included. This peptide may be the 23rd to 51st amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 23rd to 57th amino acid sequence (Lz-P1) of SEQ ID NO: 1, or the like.
図１に、ニワトリ型のリゾチームのアミノ酸配列とその二次構造を示す。
これらから、後記の実施例において効果を確認した範囲（即ち、配列番号１の２３〜５７番目のアミノ酸配列）からＮ末端方向には4残基、Ｃ末端方向には6残基を含む部分まで（即ち、配列番号１の１９〜６３番目のアミノ酸配列）が、ノロウイルス不活化活性を有しうる領域であると考えられる。
FIG. 1 shows the amino acid sequence of chicken lysozyme and its secondary structure.
From these, from the range in which the effect was confirmed in the examples described later (that is, the 23rd to 57th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) to the portion containing 4 residues in the N-terminal direction and 6 residues in the C-terminal direction. (That is, the 19th to 63rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) is considered to be a region that may have norovirus inactivating activity.
(b) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個、例えば、１又は２個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
本発明においては、上記(a)のペプチドの代わりに機能的等価なペプチドである上記(b)のペプチドを使用することができる。
(c) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
本発明においては、(a)のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、80％以上、好ましくは90％ 以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチドを使用してもよい。
このノロウイルス不活化活性は、ネズミマクロファージ細胞を用いた細胞アッセイによる感染価測定や、リアルタイムPCRによるウイルスRNAの残存を測定することによる粒子数の測定により評価することができる。
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several, for example, one or two amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence constituting the peptide of (a), and having norovirus inactivating activity In the present invention, the peptide of the above (b) which is a functionally equivalent peptide can be used instead of the peptide of the above (a).
(c) A peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence constituting the peptide of (a) and having norovirus inactivating activity In the present invention, the peptide of (a) is constituted. A peptide comprising an amino acid sequence having an identity of 80% or more, preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and having norovirus inactivating activity may be used.
This norovirus inactivating activity can be evaluated by measuring the infectious titer by a cell assay using murine macrophage cells, or by measuring the number of particles by measuring the residual of viral RNA by real-time PCR.
このペプチドを合成することにより得ることが好ましい。例えば、有機合成化学の手法によって合成してもよい。または、このアミノ酸配列をコードするDNAを細胞に導入して、細胞内のペプチド合成機構を利用して、所望のアミノ酸配列を持つペプチドを合成してもよい。この細胞を増殖させることにより、このペプチドを容易に量産することができる。 It is preferable to obtain this peptide by synthesis. For example, you may synthesize | combine by the method of organic synthetic chemistry. Alternatively, DNA encoding this amino acid sequence may be introduced into a cell, and a peptide having a desired amino acid sequence may be synthesized using an intracellular peptide synthesis mechanism. By proliferating the cells, the peptide can be easily mass-produced.
このペプチドの塩としては、食品添加物として許容可能又は薬学的に許容可能な塩が挙げられ、例えば、塩酸、炭酸、リン酸、ホウ酸、へキサメタリン酸、硝酸、硫酸などの無機酸の塩、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、グルタミン酸、グリセロリン酸、グルコン酸などの有機酸の塩が挙げられる。この塩のなかで、無機酸の塩が好ましく、塩酸塩がより好ましい。 Examples of the salt of the peptide include a salt that is acceptable as a food additive or a pharmaceutically acceptable salt. For example, a salt of an inorganic acid such as hydrochloric acid, carbonic acid, phosphoric acid, boric acid, hexametaphosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, and the like. And salts of organic acids such as citric acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, acetic acid, glutamic acid, glycerophosphoric acid and gluconic acid. Among these salts, inorganic acid salts are preferable, and hydrochlorides are more preferable.
このペプチド及び／又はその塩に、そのノロウイルス不活化活性を害さない限り、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、酵素処理、有機溶剤処理、界面活性剤処理、酸化処理、還元処理、高圧力処理等の変性処理を施してもよい。この加熱処理として、このペプチド又はその塩を５０℃以上、好ましくは６０℃以上、より好ましくは７０℃以上で、上限を１３０℃又は１１０℃として、加熱することが好ましい。 Unless this peptide and / or its salt impairs its norovirus inactivation activity, heat treatment, acid treatment, alkali treatment, enzyme treatment, organic solvent treatment, surfactant treatment, oxidation treatment, reduction treatment, high pressure treatment, etc. You may perform the modification | denaturation process. As this heat treatment, it is preferable to heat the peptide or a salt thereof at 50 ° C. or higher, preferably 60 ° C. or higher, more preferably 70 ° C. or higher, and an upper limit of 130 ° C. or 110 ° C.
本発明のノロウィルス不活化剤において、このペプチド又はその塩を適当な配合素材と共に配合してもよい。この配合素材は、ノロウィルス不活化剤の剤型等に応じて適宜選択することができ、例えば、水；エタノール、イソプロパノール等の炭素数５以下の低級アルコール；グリセリン、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール；グリシン、有機酸、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、デヒドロ酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化アルキルジアミノエチルグリシン、ヨードチンキ、ポピドンヨード、セチル酸化ベンザルコニウム、トリクロサン、クロルキシレノール、イソプロピルメチルフェノール、ε-ポリリシン、ラクトフェリン、ナイシン、バクテリオシン、ウド抽出物、エゴノキ抽出物、カワラヨモギ抽出物、酵素分解ハトムギ抽出物、しらこタンパク抽出物、ツヤプリシン、ペクチン分解物等の静菌剤を適宜組み合わせて使用することができる。
これらの中で、水、低級アルコール及び多価アルコールの少なくなくとも１種を使用することが好ましい。特に、本発明のノロウィルス不活化剤が殺菌効果を併せ持つことができるため、低級アルコール及び多価アルコールの少なくなくとも１種を含有するアルコール製剤を使用することがより好ましい。
In the norovirus inactivating agent of the present invention, this peptide or a salt thereof may be blended with an appropriate blending material. This blending material can be appropriately selected according to the dosage form of the norovirus inactivating agent, etc., for example, water; lower alcohols having 5 or less carbon atoms such as ethanol and isopropanol; glycerin, polyethylene glycol, butylene glycol, propylene Polyhydric alcohols such as glycol, dipropylene glycol, sorbitol; glycine, organic acid, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, sodium benzoate, sodium sorbate, sodium propionate, sodium dehydroate, sodium paraoxybenzoate, sodium sulfite , EDTA, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, chlorhexidine gluconate, alkyldiaminoethylglycine chloride, iodo tincture, popidone iodine, cetyl oxide benzalkonium chloride, trichloro , Chloroxylenol, Isopropylmethylphenol, ε-Polylysine, Lactoferrin, Nisin, Bacteriocin, Udo extract, Sphagnum extract, Kawara mugi extract, Enzymatic decomposition barley extract, Shirako protein extract, Tsuyaprisin, Pectin degradation product, etc. These bacteriostatic agents can be used in appropriate combination.
Among these, it is preferable to use at least one of water, lower alcohol and polyhydric alcohol. In particular, since the norovirus inactivating agent of the present invention can have a bactericidal effect, it is more preferable to use an alcohol preparation containing at least one of a lower alcohol and a polyhydric alcohol.
この他、本発明のノロウィルス不活化剤には、必要に応じてクエン酸、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤、トコフェロール酢酸エステル等の酸化防止剤、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース等の増粘剤などの添加剤を配合してもよい。 In addition, the norovirus inactivating agent of the present invention includes, as necessary, pH adjusters such as citric acid, sodium citrate, sodium hydroxide, triethanolamine, antioxidants such as tocopherol acetate, carboxyvinyl polymer An additive such as a thickener such as hydroxyethyl cellulose may be blended.
本発明のノロウィルス不活化剤は、必用に応じて種々の剤型をとることができ、例えば、液剤としてもよく、粉末、錠剤、カプセル等の固形剤としてもよい。
液剤とする場合、その粘度は使用方法に応じて適宜定めることができる。例えば、噴霧可能な粘度の液剤とし、トリガースプレーヤー、スクイズ容器、エアゾル容器等のスプレー容器に充填することにより、手指、食品、調理器具、住居環境、嘔吐物、排泄物等へ該ノロウィルス不活化剤を含む液滴を噴霧することにより、ノロウィルスの不活化を手軽に行うことができ、ノロウィルス不活化剤を含む液剤に、不活化の対象物（例えば、手指、食品、医療機器、医療器具、調理器具、住居環境）を浸すことにより、ノロウィルスの不活化を手軽に行うこともできる。また、ノロウィルス不活化剤を含む液剤を湿潤させたシートとして使用することができる。さらに、ローション、クリーム等とすることにより皮膚外用剤として使用することができ、これにより、ノロウィルスが手指に付着してもその場で不活化し、ノロウィルスが経口感染することを防止する感染予防薬として使用することができる。
The norovirus inactivating agent of the present invention can take various dosage forms as necessary. For example, the norovirus inactivating agent may be a liquid agent or a solid agent such as a powder, a tablet or a capsule.
In the case of a liquid agent, the viscosity can be appropriately determined according to the method of use. For example, a liquid agent with a sprayable viscosity is filled into a spray container such as a trigger sprayer, squeeze container, aerosol container, etc., so that the norovirus can be transferred to fingers, food, cooking utensils, living environment, vomit, excrement, etc. By spraying the droplets containing the activator, it is possible to easily inactivate the norovirus. The solution containing the norovirus inactivator is added to the inactivation target (for example, fingers, food, medical devices, Norovirus can be easily inactivated by immersing medical equipment, cooking equipment, and living environment. Moreover, it can be used as a sheet wetted with a solution containing a norovirus inactivating agent. In addition, it can be used as an external preparation for skin by making it into a lotion, cream, etc., which inactivates the norovirus even if it adheres to the fingers and prevents it from being orally infected. Can be used as a prophylactic agent.
一方、固形剤とする場合、例えば、予め経口摂取しておくことにより、ノロウィルスが口に入ったとしても、それを不活化して感染を予防する感染予防薬として使用することができ、また、ノロウィルスによる感染症が発症した場合にも体内のノロウィルスを不活化する治療薬として使用することができる。本発明のノロウィルス不活化剤の摂取方法としては、例えば、経口摂取、坐薬、点滴、静脈注射等が挙げられる。 On the other hand, in the case of a solid preparation, for example, by ingesting in advance, even if norovirus enters the mouth, it can be used as an infection preventive agent to inactivate it and prevent infection, Even when norovirus infection occurs, it can be used as a therapeutic agent for inactivating norovirus in the body. Examples of the method for ingesting the norovirus inactivating agent of the present invention include oral ingestion, suppository, infusion, intravenous injection and the like.
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
卵白リゾチームを構成するアミノ酸配列（配列番号１）を、Lz-P1（配列番号１の23~57番目のアミノ酸配列)、Lz-P2（配列番号１の58~81番目のアミノ酸配列)、Lz-P3（配列番号１の98~132番目のアミノ酸配列)の三領域に分け、それぞれのペプチドを人工合成した。それぞれが同じモル濃度になるよう水溶液を調整し、評価用サンプルとした。調整した濃度は卵白リゾチームを終濃度１％に調整した時と同じモル濃度になるよう調整した。
比較のため、卵白リゾチーム（非変性）の同濃度の溶液も用意した。
ノロウィルスとして、MNV-1（ワシントン大学（Washington University）のハーバート．Ｗ．ヴァージン博士（Dr. Herbert W. Virgin）より供与）を使用し、培地成分を除去したノロウィルス液（MNV-1溶液）を作製した。
上記の評価用サンプル（ペプチド溶液）とMNV-1溶液とを等量で混和し、1分間曝露した。
The following examples illustrate the invention but are not intended to limit the invention.
Example 1
The amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) that constitutes egg white lysozyme is represented by Lz-P1 (23rd to 57th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), Lz-P2 (58th to 81st amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), Lz- Each peptide was artificially synthesized by dividing into three regions of P3 (the 98th to 132rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1). The aqueous solution was adjusted so that each had the same molar concentration, and it was set as the sample for evaluation. The adjusted concentration was adjusted to the same molar concentration as when the egg white lysozyme was adjusted to a final concentration of 1%.
For comparison, a solution having the same concentration of egg white lysozyme (non-denatured) was also prepared.
As norovirus, MNV-1 (provided by Dr. Herbert W. Virgin of Washington University) and norovirus solution (MNV-1 solution) from which medium components have been removed Was made.
The above sample for evaluation (peptide solution) and MNV-1 solution were mixed in an equal amount and exposed for 1 minute.
各溶液のMNV-1の感染価（PFU/mL）を、プラークアッセイにより測定した。プラークアッセイは次のように行った。
6ウェルプレートに、マウスマクロファージ株化細胞（RAW264.7細胞）をコンフルエントの60〜80%まで培養した。
曝露後の各評価用サンプルを希釈し、反応を停止したのち、この培養細胞へ500μL/wellになるよう接種した。
評価用サンプルを接種した細胞は、室温で１時間インキュベートし、ノロウィルスを感染させた。その後、プレート上の接種液を全量除去し、1.5% Sea Plaque Agarose-DMEM(37℃）を2ml/wellで重層し、37℃、5%CO2条件下で２日間培養した。
培養後、プレートに0.03%ニュートラルレッド溶液を加えることで細胞を染色し、プラーク数をカウントした。得られたプラーク数と希釈倍率から感染価(PFU/mL)を算出した。
ペプチドを加えないMNV-1溶液の感染価(106〜107 PFU/mL程度）から、MNV-1溶液を加えた評価用サンプルの感染価を引いた値を、感染価の減少量（PFU/mL）とした。
The infectious titer (PFU / mL) of MNV-1 in each solution was measured by plaque assay. The plaque assay was performed as follows.
Mouse macrophage cell lines (RAW264.7 cells) were cultured to 6-80% confluent in 6-well plates.
After diluting each sample for evaluation after exposure and stopping the reaction, the cultured cells were inoculated at 500 μL / well.
Cells inoculated with the sample for evaluation were incubated at room temperature for 1 hour to be infected with norovirus. Thereafter, the entire inoculum on the plate was removed, and 1.5% Sea Plaque Agarose-DMEM (37 ° C.) was overlaid at 2 ml / well, followed by culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 for 2 days.
After culturing, cells were stained by adding 0.03% neutral red solution to the plate, and the number of plaques was counted. The infectivity titer (PFU / mL) was calculated from the number of plaques obtained and the dilution factor.
The value obtained by subtracting the infectious titer of the sample for evaluation to which the MNV-1 solution was added from the infectious titer of the MNV-1 solution to which no peptide was added (about 106 to 107 PFU / mL) ).
結果を図２に示す。
卵白リゾチーム（図中、「全長」で示す。）では、感染価の実質的な減少は見られなかったが（0.23 log）、Lz-P1は、MNVの感染価の顕著な減少を示した（1.49 log）。一方、Lz-P2とLz-P3の感染価の減少は、それぞれ0.21 log及び0.17 logであり、感染価の実質的な減少は見られなかった。
この結果から、卵白リゾチームのアミノ酸配列領域のうち、Lz-P1とした領域は、高いノロウィルス不活化効果を持っていることが分かる。
The results are shown in FIG.
In egg white lysozyme (shown as “full length” in the figure), there was no substantial decrease in infectious titer (0.23 log), but Lz-P1 showed a significant decrease in infectious titer of MNV ( 1.49 log). On the other hand, the decrease in infectivity titers of Lz-P2 and Lz-P3 was 0.21 log and 0.17 log, respectively, and no substantial decrease in infectivity titer was observed.
From this result, it can be seen that, among the amino acid sequence regions of egg white lysozyme, the region designated Lz-P1 has a high norovirus inactivating effect.
実施例２
2％の卵白リゾチーム溶液及び上記Lz-P1、Lz-P2及びLz-P3の同濃度溶液をそれぞれ100℃で30分間加熱した。
これらの溶液について、実施例１と同様に、MNV-1溶液と等量で混和して1分間曝露し、MNV-1の感染価を、プラークアッセイにより確認した。
結果を図３に示す。
卵白リゾチーム（図中、「全長」で示す。）とLz-P1は、感染価の顕著な減少を示したが（5.24 log、2.56 log）、Lz-P2とLz-P3は感染価の実質的減少を示さなかった(0.18 log及び0.29 log)。
加熱処理後も、Lz-P1はノロウイルス不活化活性を有していることが分かる。
Example 2
A 2% egg white lysozyme solution and the same concentration solutions of Lz-P1, Lz-P2 and Lz-P3 were each heated at 100 ° C. for 30 minutes.
These solutions were mixed with the MNV-1 solution in an equal amount and exposed for 1 minute in the same manner as in Example 1, and the infectious titer of MNV-1 was confirmed by plaque assay.
The results are shown in FIG.
Egg white lysozyme (shown as “full length” in the figure) and Lz-P1 showed a significant decrease in infectious titer (5.24 log, 2.56 log), while Lz-P2 and Lz-P3 had a substantial infectious titer. There was no decrease (0.18 log and 0.29 log).
It can be seen that Lz-P1 has norovirus inactivating activity even after heat treatment.
Claims (5)
(a) 配列番号１の１９〜６３番目のアミノ酸配列において少なくとも２３〜５１番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成るペプチド
(b) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
(c) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド A norovirus inactivating agent comprising the peptide of any one of (a) to (c) below.
(a) a peptide comprising an amino acid sequence containing at least the 23rd to 51st amino acid sequence in the 19th to 63rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence constituting the peptide of (a), and having norovirus inactivating activity
(c) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence constituting the peptide of (a) and having norovirus inactivating activity
(a)' 配列番号１のアミノ酸配列において、配列番号１の２３〜５１番目のアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列における１９〜６３番目のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列から成るペプチド
(b) (a)'のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
(c) (a)'のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド A norovirus inactivating agent comprising any of the following peptides (a) ′ to (c):
(a) 'From the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 comprising the 23rd to 51st amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and not including the amino acid sequence other than the 19th to 63rd amino acid sequence in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Peptide consisting of
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence constituting the peptide of (a) 'and having norovirus inactivating activity
(c) A peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence constituting the peptide of (a) 'and having norovirus inactivating activity
(a) 配列番号１の１９〜６３番目のアミノ酸配列において少なくとも２３〜５１番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成るペプチド
(b) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
(c) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド A method for producing a norovirus inactivating agent, comprising synthesizing a peptide of any one of (a) to (c) below.
(a) a peptide comprising an amino acid sequence containing at least the 23rd to 51st amino acid sequence in the 19th to 63rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence constituting the peptide of (a), and having norovirus inactivating activity
(c) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence constituting the peptide of (a) and having norovirus inactivating activity
(a)' 配列番号１のアミノ酸配列において、配列番号１の２３〜５１番目のアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列における１９〜６３番目のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列から成るペプチド
(b) (a)'のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
(c) (a)'のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド The manufacturing method of the norovirus inactivating agent which synthesize | combines the peptide in any one of the following (a) '-(c).
(a) 'From the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 comprising the 23rd to 51st amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and not including the amino acid sequence other than the 19th to 63rd amino acid sequence in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Peptide consisting of
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence constituting the peptide of (a) 'and having norovirus inactivating activity
(c) A peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence constituting the peptide of (a) 'and having norovirus inactivating activity
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