JP2016101124A - Tuberculosis vaccine - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規なリコンビナントＢＣＧ菌とそれを用いた結核ワクチンに関するものである。特に、結核菌のＭＭＰ−ＩＩとＰＥＳＴ配列が導入されたリコンビナントＢＣＧ菌とそのワクチン用途に関するものである。 The present invention relates to a novel recombinant BCG bacterium and a tuberculosis vaccine using the same. In particular, the present invention relates to a recombinant BCG bacterium into which MMP-II and PEST sequences of Mycobacterium tuberculosis have been introduced and its vaccine application.
世界人口の１／３が感染し、毎年８８０万人が新たに発症し、１００万人が死亡する結核は、２０世紀最大の恐怖を与えた細菌感染症であり、エイズ・マラリアとともにＷＨＯにより世界３大感染症として数えられている。さらに、多剤耐性結核菌の出現・拡散は地球規模の恐怖となっており、世界の如何なる国もこの恐怖から逃れられないと考えられている。これまでＷＨＯが中心となって、より効果の高い次世代結核ワクチンの開発を進めてきた。しかし、現在結核の発症を的確に予防できるワクチンは存在せず、新しい結核ワクチンの開発は世界的に切望されている。
何故なら、従来のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ菌（以下ＢＣＧと略す）は、成人あるいは高齢者の肺結核の発症を的確に予防し得ないものであった。即ち、従来のＢＣＧでは、ヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいはヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する力が弱く、インターフェロンガンマの産生を十分誘導し得るものではなかった。
Tuberculosis, in which 1/3 of the world's population is infected, 8.8 million new cases occur every year, and 1 million die, is the bacterial infection that caused the greatest fear of the 20th century. It is counted as three major infectious diseases. Furthermore, the emergence and spread of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis has become a global horror, and it is believed that no country in the world can escape this horror. So far, WHO has led the development of more effective next generation tuberculosis vaccine. However, there is currently no vaccine that can accurately prevent the development of tuberculosis, and the development of a new tuberculosis vaccine is eagerly desired worldwide.
This is because the conventional Mycobacterium bovis BCG bacteria (hereinafter abbreviated as BCG) cannot accurately prevent the onset of pulmonary tuberculosis in adults or elderly people. That is, conventional BCG has a weak ability to activate human naïve CD4-positive T cells or human naive CD8-positive T cells, and cannot sufficiently induce interferon gamma production.
ＢＣＧが有効に作用しない最大の理由は、ＢＣＧには固有の欠点、即ち抗原提示細胞（ＡＰＣ）に感染した際にファゴゾーム中に局在し、ファゴゾームとライソゾームとの融合を阻止し免疫応答を抑制することに起因している。そこで、この問題を解決するためにＢＣＧに対して色々な改良が加えられてきた（特許文献１〜３、非特許文献１〜４）。
ＢＣＧはウレアーゼを保有するため、尿素からアンモニアを産生し、ファゴゾームのｐＨをアルカリ側に傾けることで、ファゴゾームの酸性化を抑制し、ライソゾームとの融合を阻止している。そこで、ＢＣＧからウレアーゼをコードするＵｒｅＣ遺伝子を除去した組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）を作製すると、この組換えＢＣＧは容易にファゴ−ライソゾームを形成した。その結果、ヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞を強く活性化することが報告されている（非特許文献1）。
The main reason why BCG does not work effectively is that BCG has its own drawbacks, namely, it is localized in phagosomes when infected with antigen-presenting cells (APCs), preventing fusion of phagosomes and lysosomes and suppressing immune responses Is due to In order to solve this problem, various improvements have been made to BCG (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Documents 1 to 4).
Since BCG possesses urease, it produces ammonia from urea and tilts the pH of the phagosome toward the alkali side to suppress acidification of the phagosome and prevent fusion with lysosomes. Thus, when recombinant BCG (BCG-ΔUT-11-3) in which the UreC gene encoding urease was removed from BCG was produced, this recombinant BCG easily formed a phago-lysosome. As a result, it has been reported that human naive CD4 positive T cells are strongly activated (Non-patent Document 1).
また、抗原提示細胞やＴ細胞を活性化するためには、ＢＣＧの中で病原性抗酸菌の主要な表面抗原を分泌させることが重要であることが見出され、そこで、らい菌のＭＭＰ−ＩＩ（Ｍａｊｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を分泌でき、更にウレアーゼが欠損した組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−Ｄ７０Ｍ）を作製した。この組換えＢＣＧは、ヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化し、インターフェロンγの産生を誘導した (非特許文献２)。
そこで、結核菌に対する免疫効果を高めるために、結核菌のＭＭＰ−ＩＩを発現できるウレアーゼ欠損型の組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ＤＨＴＭ）が作製された（非特許文献３）。この組換えＢＣＧは、メモリーＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を効果的に産生することが報告されている。
In addition, in order to activate antigen-presenting cells and T cells, it has been found that it is important to secrete major surface antigens of pathogenic mycobacteria in BCG. Recombinant BCG (BCG-D70M) that can secrete -II (Major Membrane Protein) and is deficient in urease was prepared. This recombinant BCG activated human naive CD4-positive T cells and CD8-positive T cells, and induced production of interferon γ (Non-patent Document 2).
Therefore, in order to enhance the immune effect against M. tuberculosis, a urease-deficient recombinant BCG (BCG-DHTM) capable of expressing MMP-II of M. tuberculosis was produced (Non-patent Document 3). This recombinant BCG has been reported to effectively produce memory CD4-positive and CD8-positive T cells.
更に効果を高めるために、結核菌の活動期に強く発現する遺伝子であるＣｙｓＯをＭＭＰ−ＩＩに融合させた組換えＢＣＧ（ＢＣＧ-ｄＨＣＭ）が作製された（非特許文献４）。この組換えＢＣＧは、未感作Ｔ細胞の多クローン性活性化を惹起することが報告されている。
しかし、結核菌の噴霧感染試験においては、まだ十分なものではなく、ヒトに対する結核ワクチンとしては更なる効果のあるものが求められている状況である。
In order to further enhance the effect, recombinant BCG (BCG-dHCM) was prepared by fusing CysO, which is a gene that is strongly expressed during the active period of M. tuberculosis, with MMP-II (Non-patent Document 4). This recombinant BCG has been reported to elicit polyclonal activation of naïve T cells.
However, the spray infection test for M. tuberculosis is not sufficient yet, and a tuberculosis vaccine for humans is required to have a further effect.
本発明は、結核ワクチンとして実用可能な高い効果を有する組換えＢＣＧの作製を目的とする。特に、本発明の結核ワクチンでは、ヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいはヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を強く活性化し、インターフェロンγの産生を十分誘導すると共に、生体内でメモリーＴ細胞を効率的に産生することによって、生体内での結核菌の肺内増殖を強く抑制することを目的とする。 An object of the present invention is to produce a recombinant BCG having a high effect that can be practically used as a tuberculosis vaccine. In particular, the tuberculosis vaccine of the present invention strongly activates human naïve CD4 positive T cells or human naïve CD8 positive T cells, sufficiently induces production of interferon γ, and efficiently uses memory T cells in vivo. It is intended to strongly suppress the growth of Mycobacterium tuberculosis in the lung in vivo.
本発明者らは、これまでの知見（非特許文献１〜４）に基づき、新たな組換えＢＣＧの作製を検討した。その際の指標として、組換えＢＣＧがヒト末梢血未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいは未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を強く活性化してインターフェロンγを産生し、かつＣ５７ＢＬ／６マウス生体内でメモリーＴ細胞を効率的に産生し、その結果として空気感染させた各種結核菌の肺内増殖を抑制することを目指した。
そこで、これまでの知見から、抗原提示細胞やＴ細胞を活性化するためには、ＢＣＧの中で結核菌のＭＭＰ−ＩＩを分泌させることが重要であるので、分泌されたＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白の分解を加速させることを検討した。そのために、蛋白の不安定化配列として知られているＰＥＳＴ配列（蛋白質分解シグナルとして作用するＰ；プロリン、Ｅ；グルタミン酸、Ｓ；セリン、Ｔ；スレオニンを多く含む配列、本発明ではＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来ｈｌｙ遺伝子に存在するＰＥＳＴ配列）を用いて、上記融合蛋白のN側とC側に更に融合した蛋白を分泌できるようにした。この目的のために即ち、ウレアーゼ欠損型ＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）を宿主ＢＣＧとして用い、ＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合遺伝子をＨＳＰ６０プロモーターの制御のもとに導入して組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）を作製した。
The present inventors examined the production of a new recombinant BCG based on the previous knowledge (Non-Patent Documents 1 to 4). As an index in that case, recombinant BCG strongly activated human peripheral blood naïve CD4 positive T cells or naïve CD8 positive T cells to produce interferon γ, and memory T cells in vivo in C57BL / 6 mice. As a result, we aimed to suppress the growth of various Mycobacterium tuberculosis infected with air in the lung.
In view of the above, it is important to secrete MMP-II of Mycobacterium tuberculosis in BCG in order to activate antigen-presenting cells and T cells, so that the secreted MMP-II fusion protein We studied to accelerate the decomposition of Therefore, a PEST sequence known as a protein destabilizing sequence (P acting as a proteolytic signal; P; proline, E; glutamic acid, S; serine, T; a sequence rich in threonine, in the present invention, derived from L. monocytogenes The PEST sequence present in the hly gene) was used to secrete a protein further fused to the N side and C side of the fusion protein. For this purpose, urease-deficient BCG (BCG-ΔUT-11-3) is used as the host BCG, and the PEST-HSP70-MMP-II-PEST fusion gene is introduced under the control of the HSP60 promoter. Replacement BCG (BCG-PEST) was produced.
本発明の組換えＢＣＧの機能、効果を評価すると、次のことが見出された。
ａ）組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）が樹状細胞に感染しファゴゾームを形成した際、アンモニアが産生されないためファゴゾームが酸性となり、容易にライソゾームと融合してファゴ‐ライソゾームを形成する。更に、ＢＣＧ−ＰＥＳＴはファゴ‐ライソゾームの中でＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白を分泌する。
ｂ）ファゴ‐ライソゾームの中で分泌された融合蛋白のうち一部はライソゾーム由来の酵素によって分解され、またＰＥＳＴ配列の作用により分解を促進されＴ細胞を刺激する際に必要なエピトープとなる。一方、ライソゾームの酵素によって分解されなかった蛋白は融合蛋白のＰＥＳＴ配列の作用によってファゴ-ライソゾームから細胞質へ放出され、やがてプロテアゾームへ取り込まれ、プロテアゾーム内の酵素によって分解されエピトープを作る。
ｃ）そのため、ＢＣＧ−ＰＥＳＴから分泌された融合蛋白はファゴ-ライソゾームおよびプロテアゾームの両者で分解され多種類のエピトープを産生し、強力にヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞および未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化しインターフェロンγを産生するとともに、Ｃ５７ＢＬ／６マウス生体内でメモリータイプＴ細胞を効率的に産生し、その結果として空気感染した結核菌の肺内増殖を抑制する効果を発揮する。
本発明者らは、以上の知見により本発明を完成した。
When the function and effect of the recombinant BCG of the present invention were evaluated, the following was found.
a) When recombinant BCG (BCG-PEST) infects dendritic cells to form phagosomes, ammonia is not produced, so phagosomes become acidic and easily fuse with lysosomes to form phago-lysosomes. Furthermore, BCG-PEST secretes the PEST-HSP70-MMP-II-PEST fusion protein in the phago-lysosome.
b) A part of the fusion protein secreted in the phago-lysosome is degraded by an enzyme derived from lysosome, and the degradation is promoted by the action of the PEST sequence to become an epitope necessary for stimulating T cells. On the other hand, the protein that was not degraded by the lysosomal enzyme is released from the phago-lysosome into the cytoplasm by the action of the PEST sequence of the fusion protein, and is eventually taken into the proteasome, where it is degraded by the enzyme in the proteasome to produce an epitope.
c) Therefore, the fusion protein secreted from BCG-PEST is degraded by both phago-lysosome and proteasome to produce many kinds of epitopes, and strongly human naïve CD4 positive T cells and naïve CD8 positive T cells are produced. It activates cells and produces interferon γ, and also efficiently produces memory type T cells in vivo in C57BL / 6 mice, and as a result, exerts the effect of suppressing the proliferation of air-infected tuberculosis bacteria in the lung.
The present inventors have completed the present invention based on the above findings.
本願発明の要旨は以下のとおりである。
（１）ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子のＮ末端とＣ末端に、４つのアミノ酸（P：プロリン、E：グルタミン酸、S：セリン、T：スレオニン）の直列連結ペプチドＰＥＳＴをコードする遺伝子を結合させた融合遺伝子を含有する蛋白発現プラスミドで、
ＵｒｅＣ遺伝子をノックアウトしたウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌を形質転換して得られる組換えＢＣＧ菌。
（２）上記ＨＳＰ７０蛋白をコードする遺伝子が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来である、上記（１）記載の組換えＢＣＧ菌。
（３）上記ＭＭＰ−ＩＩ蛋白をコードする遺伝子が、結核菌Ｈ３７Ｒｖである、上記（１）又は（２）に記載の組換えＢＣＧ菌。
（４）上記プラスミドのプロモーターがＨＳＰ６０プロモーターであることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（５）上記ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来のものである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（６）更に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（７）ＰＥＡＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白が分泌されることを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（８）融合蛋白の分泌がファゴ‐ライソゾームの中であることを特徴とする、上記（７）に記載の組換えＢＣＧ菌。
The gist of the present invention is as follows.
(1) It encodes a serially linked peptide PEST of four amino acids (P: proline, E: glutamic acid, S: serine, T: threonine) at the N-terminal and C-terminal of the gene encoding the HSP70-MMP-II fusion protein. A protein expression plasmid containing a fusion gene to which a gene is bound,
Recombinant BCG obtained by transforming urease-deficient BCG that knocked out the UreC gene.
(2) The recombinant BCG bacterium according to (1), wherein the gene encoding the HSP70 protein is derived from a BCG-Tokyo strain.
(3) The recombinant BCG bacterium according to (1) or (2) above, wherein the gene encoding the MMP-II protein is Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
(4) The recombinant BCG bacterium according to any one of (1) to (3) above, wherein the promoter of the plasmid is an HSP60 promoter.
(5) The recombinant BCG bacterium according to any one of (1) to (4) above, wherein the urease-deficient BCG bacterium is derived from a BCG-Tokyo strain.
(6) The recombinant BCG bacterium according to any one of (1) to (5), further having a hygromycin resistance gene.
(7) The recombinant BCG bacterium according to any one of (1) to (6) above, wherein the PEAT-HSP70-MMP-II-PEST fusion protein is secreted.
(8) The recombinant BCG according to (7) above, wherein secretion of the fusion protein is in phago-lysosome.
（９）ＰＥＳＴ配列をコードする遺伝子が、
ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子のＮ側とＣ側に融合していることを特徴とする、蛋白発現プラスミド。
（１０）上記プラスミドのプロモーターがＨＳＰ６０プロモーターであることを特徴とする、上記（９）に記載の蛋白発現プラスミド。
（１１）上記ＨＳＰ７０蛋白をコードする遺伝子が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来である、上記（９）又は（１０）に記載の蛋白発現プラスミド。
（１２）上記ＭＭＰ−ＩＩ蛋白をコードする遺伝子が、結核菌Ｈ３７Ｒｖである、上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の蛋白発現プラスミド。
（１３）更に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、（９）〜（１２）のいずれかに記載の蛋白発現プラスミド。
(9) The gene encoding the PEST sequence is
A protein expression plasmid characterized by being fused to the N side and C side of a gene encoding an HSP70-MMP-II fusion protein.
(10) The protein expression plasmid according to (9) above, wherein the promoter of the plasmid is an HSP60 promoter.
(11) The protein expression plasmid according to (9) or (10) above, wherein the gene encoding the HSP70 protein is derived from the BCG-Tokyo strain.
(12) The protein expression plasmid according to any one of (9) to (11), wherein the gene encoding the MMP-II protein is Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
(13) The protein expression plasmid according to any one of (9) to (12), further having a hygromycin resistance gene.
（１４）ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌に、上記（９）〜（１３）のいずれかを満たす一つの蛋白発現プラスミドを遺伝子導入することで得られる組換えＢＣＧ菌。
（１５）ウレアーゼ欠損は、ＵｒｅＣ遺伝子をノックアウトすることである、上記（１４）に記載の組換えＢＣＧ菌。
（１６）ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌は、カナマイシン及びハイグロマイシン感受性である、上記（１４）又は（１５）に記載の組換えＢＣＧ菌。
（１７）ファゴ-ライソゾームの中でＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白を分泌する、上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（１８）上記（１４）〜（１７）のいずれか一つの組換えＢＣＧ菌を用いることを特徴とする、結核ワクチン。
（１９）上記組換えＢＣＧ菌を、リン酸バッファー生理食塩水に、１×１０５〜１×１０６細胞／ｍＬ含有する、上記（１８）に記載の結核ワクチン。
(14) A recombinant BCG bacterium obtained by gene transfer of one protein expression plasmid that satisfies any of the above (9) to (13) into a urease-deficient BCG bacterium.
(15) The recombinant BCG according to (14), wherein the urease deficiency is a knockout of the UreC gene.
(16) The recombinant BCG bacterium according to (14) or (15) above, wherein the urease-deficient BCG bacterium is sensitive to kanamycin and hygromycin.
(17) The recombinant BCG according to any one of (14) to (16) above, which secretes a PEST-HSP70-MMP-II-PEST fusion protein in phago-lysosome.
(18) A tuberculosis vaccine characterized by using any one of the recombinant BCG bacteria described in (14) to (17) above.
(19) The tuberculosis vaccine according to (18), wherein the recombinant BCG bacterium is contained in phosphate buffered saline in an amount of 1 × 10 5 to 1 × 10 6 cells / mL.
（２０）ＵｒｅＣ遺伝子をノックアウトしたウレアーゼ欠損ＢＣＧに、以下の蛋白発現プラスミドを遺伝子導入することを特徴とする、組換えＢＣＧの製造方法；
a）ＨＳＰ６０プロモーターの下流に、
b）ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子の両端（Ｎ末側とＣ末側）に、ＰＥＳＴ配列をコードする遺伝子を結合した融合遺伝子（ＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ）が挿入されている。
（２１）上記ＨＳＰ７０蛋白をコードする遺伝子が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来である、上記（２０）記載の組換えＢＣＧの製造方法。
（２２）上記ＭＭＰ−ＩＩ蛋白をコードする遺伝子が、結核菌Ｈ３７Ｒｖである、上記（２０）又は（２１）に記載の組換えＢＣＧの製造方法。
（２３）上記蛋白発現プラスミドは、更に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載の組換えＢＣＧの製造方法。
（２４）上記ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来のものである、上記（２０）〜（２３）のいずれかに記載の組換えＢＣＧの製造方法。
(20) A method for producing a recombinant BCG, characterized by introducing the following protein expression plasmid into a urease-deficient BCG in which the UreC gene has been knocked out;
a) Downstream of the HSP60 promoter,
b) A fusion gene (PEST-HSP70-MMP-II-PEST) in which a gene encoding a PEST sequence is linked to both ends (N-terminal side and C-terminal side) of a gene encoding an HSP70-MMP-II fusion protein. Has been.
(21) The method for producing a recombinant BCG according to (20), wherein the gene encoding the HSP70 protein is derived from a BCG-Tokyo strain.
(22) The method for producing a recombinant BCG according to (20) or (21) above, wherein the gene encoding the MMP-II protein is Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
(23) The method for producing a recombinant BCG according to any one of (20) to (22), wherein the protein expression plasmid further has a hygromycin resistance gene.
(24) The method for producing a recombinant BCG according to any one of (20) to (23) above, wherein the urease-deficient BCG bacterium is derived from a BCG-Tokyo strain.
本発明の組換えＢＣＧ菌は、従来のＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株に比し結核菌の肺内増殖を強く抑制し、結核の発症を予防できることが分かった。更に、公知の組換えＢＣＧ菌であるＢＣＧ−ＤＨＴＭよりも有効に結核菌（Ｈ３７Ｒｖ株）の増殖を抑制することを示した。
また、本発明の組換えＢＣＧ菌は、ワクチン接種後６ヶ月においても、結核菌の増殖を抑制できることから、本発明の組換えＢＣＧ菌のワクチン効果は、長期持続することが分かった。
本発明の組換えＢＣＧ菌が、公知のものより効果が強く、長期の効果持続性を有するものであることから、本発明の組換えＢＣＧ菌を用いて、結核の発症を予防できる抗結核組換えＢＣＧワクチンが提供できるようになった。
The recombinant BCG bacterium of the present invention was found to be able to prevent the onset of tuberculosis by strongly suppressing the intrapulmonary growth of M. tuberculosis compared to the conventional BCG-Tokyo strain. Furthermore, it was shown that the growth of M. tuberculosis (H37Rv strain) was more effectively suppressed than BCG-DHTM, which is a known recombinant BCG bacterium.
Moreover, since the recombinant BCG bacterium of the present invention can suppress the growth of Mycobacterium tuberculosis even 6 months after vaccination, it was found that the vaccine effect of the recombinant BCG bacterium of the present invention lasts for a long time.
Since the recombinant BCG bacterium of the present invention is more effective than the known one and has a long-lasting effect, the anti-tuberculosis group that can prevent the onset of tuberculosis using the recombinant BCG bacterium of the present invention Replacement BCG vaccines can now be provided.
本発明の「ＰＥＳＴ」とは、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来ｈｌｙ遺伝子に存在するＰＥＳＴ配列(４つのアミノ酸Ｐ：プロリン、Ｅ：グルタミン酸、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニンを多く含む配列)のことを言う。
本発明の「ＨＳＰ７０」とは、７０ｋＤの分子量を持ち、シャペロン効果を有するｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ）７０のことである。ＨＳＰ７０は、タンパク質のフォールディングに関与し、熱に対する耐性を形成させる。タンパク質のミトコンドリアや葉緑体などへの翻訳後輸送に関与している蛋白である。抗酸菌には、それぞれ対応するＨＳＰ７０が存在し、好ましいものとしては、ＢＣＧ-Ｔｏｋｙｏ株由来のＨＳＰ７０を挙げることができる。
本発明の「ＭＭＰ−ＩＩ」とは、細胞膜に主に存在する膜タンパクＭａｊｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＭＰ）−ＩＩのことを言う。ＭＭＰ−ＩＩは、トールライクリセプター（ＴＬＲ）２に結合する能力を有し、ＮＦ−κＢを活性化する。このため、ＭＭＰ−ＩＩをパルスした樹状細胞（ＤＣ）は抗原特異的に未感作及びメモリータイプＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する。ＭＭＰ−ＩＩとしては、各種のものを使用可能であるが、らい菌由来のＭＭＰ−ＩＩと結核菌由来のＭＭＰ−ＩＩを挙げることができる。好ましくは結核菌（Ｈ３７Ｒｖ株）由来のＭＭＰ−ＩＩを挙げることができる。
“PEST” of the present invention refers to L.I. This refers to the PEST sequence (4 amino acids P: proline, E: glutamic acid, S: serine, T: a sequence rich in threonine) present in the hly gene derived from monocytogenes.
The “HSP70” of the present invention is a heat shock protein (HSP) 70 having a molecular weight of 70 kD and having a chaperone effect. HSP70 is involved in protein folding and forms resistance to heat. A protein involved in post-translational transport of proteins to mitochondria and chloroplasts. Each acid-fast bacterium has a corresponding HSP70, and preferable examples include HSP70 derived from the BCG-Tokyo strain.
The “MMP-II” of the present invention refers to a membrane protein Major Membrane Protein (MMP) -II mainly present in the cell membrane. MMP-II has the ability to bind to Tall Lycra Receptor (TLR) 2 and activates NF-κB. For this reason, dendritic cells (DC) pulsed with MMP-II activate unsensitized and memory-type CD4-positive and CD8-positive T cells in an antigen-specific manner. Various types of MMP-II can be used, and examples include MMP-II derived from leprosy and MMP-II derived from Mycobacterium tuberculosis. Preferred examples include MMP-II derived from Mycobacterium tuberculosis (H37Rv strain).
本発明の「蛋白発現プラスミド」とは、抗酸菌の菌体内でプラスミドとして維持されるものであって、好ましくはｐＭＶ２６１に蛋白をコードする遺伝子が組み込まれたものを言う。遺伝子を組み込む位置としては、ｈｓｐ６０のプロモーター領域の下流に挿入する。更に、本発明では、菌体内でのプラスミドの安定性を維持するために、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されている。
本発明の「ｈｓｐ６０プロモーター」とは、６０ｋＤの熱ショック蛋白（ＨＳＰ）を発現させるプロモーターのことを言う。
本発明の「ウレアーゼ欠損ＢＣＧ」とは、ウレアーゼがノックアウトされたＢＣＧ菌のことを言う。ウレアーゼをノックアウトするために、ＵｒｅＣ遺伝子のノックアウトを行った。このために、ハイグロマイシン耐性遺伝子を挟むようにＵｒｅＣ遺伝子の上流及び下流の塩基配列をプラスミドｐＹＵＢ８５４へ導入した。このプラスミドを導入した組換えファージを作製し、このファージとＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株とを反応させて、ウレアーゼ欠損ＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１）を作製した。更に、ゲノムに組み込まれたハイグロマイシン耐性遺伝子を切り出し、親株と同じカナマイシン、ハイグロマイシン感受性のウレアーゼ欠損ＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）を作製した。
The “protein expression plasmid” of the present invention refers to a plasmid that is maintained as a plasmid in the mycobacteria and preferably has a gene encoding a protein incorporated in pMV261. The gene is inserted downstream of the promoter region of hsp60. Furthermore, in the present invention, a hygromycin resistance gene is introduced in order to maintain the stability of the plasmid in the microbial cells.
The “hsp60 promoter” of the present invention refers to a promoter that expresses a 60 kD heat shock protein (HSP).
The “urease-deficient BCG” of the present invention refers to a BCG bacterium in which urease is knocked out. In order to knock out urease, the UreC gene was knocked out. For this purpose, the upstream and downstream nucleotide sequences of the UreC gene were introduced into the plasmid pYUB854 so as to sandwich the hygromycin resistance gene. A recombinant phage introduced with this plasmid was prepared, and this phage was reacted with a BCG-Tokyo strain to prepare urease-deficient BCG (BCG-ΔUT-11). Furthermore, the hygromycin resistance gene integrated into the genome was excised, and the same kanamycin and hygromycin sensitive urease-deficient BCG (BCG-ΔUT-11-3) as the parent strain was prepared.
本発明の「結核ワクチン」とは、結核に対して充分なワクチン効果を上げるために、本発明の組換えＢＣＧを有効量含有し、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、または他のビヒクルを必要に応じて含有する組成物である。本発明のワクチンは、公知の方法で作製することができ、通常、液状溶液又は懸濁溶液として調製される。担体としては、水、生理食塩水、デキストロース、ラフィノース等が挙げられ、ｐＨ緩衝剤、等張剤、界面活性剤等の助剤を必要に応じて添加することができる。
本発明のワクチンは、アジュバントを含むことができ、その適切な例は、セピック（Ｓｅｐｐｉｃ）、クイルＡ（Ｑｕｉｌ Ａ）、アルハイドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）等を含むが、それらに限定されることはない。
本発明のワクチンにおける組換えＢＣＧの含量は、免疫応答を惹起するために、約１×１０３〜約１×１０６菌／１回の範囲にあり、最も好適には約１×１０４〜約１×１０５菌／１回の範囲を挙げることができる。また、本発明のワクチンは、適切な手段で投与することができ、それらには、注射、経口投与、鼻腔投与等が含まれるがそれらに限定されない。好適な態様においては、皮内、皮下または筋肉内への注射が望ましい。
The “tuberculosis vaccine” of the present invention contains an effective amount of the recombinant BCG of the present invention in order to increase the vaccine effect against tuberculosis, and is a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, adjuvant, or others. The composition contains a vehicle as required. The vaccine of the present invention can be prepared by a known method and is usually prepared as a liquid solution or a suspension solution. Examples of the carrier include water, physiological saline, dextrose, raffinose and the like, and auxiliary agents such as pH buffering agents, isotonic agents and surfactants can be added as necessary.
The vaccine of the present invention can include an adjuvant, suitable examples include, but are not limited to, Seppic, Quil A, Alhydrogel, and the like. .
The content of recombinant BCG in the vaccines of the present invention ranges from about 1 × 10 3 to about 1 × 10 6 bacteria / dose, most preferably from about 1 × 10 4 to raise an immune response. A range of about 1 × 10 5 bacteria / once can be mentioned. In addition, the vaccine of the present invention can be administered by any suitable means, including but not limited to injection, oral administration, nasal administration and the like. In a preferred embodiment, intradermal, subcutaneous or intramuscular injection is desirable.
以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples and test examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１：新規なリコンビナントＢＣＧ菌（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）の作製
（１）ウレアーゼをコードするＵｒｅＣ遺伝子を欠損するリコンビナントＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）の作製：
公知方法（Med. Microbiol. ５３：９６−１０６）に基づき、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株より作製した。まず、抗酸菌に感染するファージの中で温度感受性変異株を使用し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を挟むようにＵｒｅＣ遺伝子の上流及び下流の塩基配列をプラスミドｐＹＵＢ８５４へ導入した。更に、迅速発育抗酸菌Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓを用いて、ＵｒｅＣ破壊用ファージの調整を行った。
上記組換えファージをＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株に感染させ、ハイグロマイシンを含む平面培地に撒き３０℃で培養を行った。約３週間後、形成されたコロニーを培養し、ウレアーゼ試験が陰性であることを確認した。このようにして、ＵｒｅＣ遺伝子欠損の組換えＢＣＧ株（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１）を得た。
更に、ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１に含有されるハグロマイシン遺伝子カセットを削除するため、γδリゾルバーゼ（γδｔｎｐＲ）をコードするｐＹＵＢ８７０を使用して削除した。そして、親株と同じカナマイシン、ハイグロマシン感受性のＢＣＧ株（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）を選択した。
Example 1 Production of Novel Recombinant BCG Bacteria (BCG-PEST) (1) Production of Recombinant BCG Deficient in UreC Gene Encoding Urease (BCG-ΔUT-11-3):
Based on a known method (Med. Microbiol. 53: 96-106), it was prepared from BCG-Tokyo strain. First, a temperature-sensitive mutant was used among phages infected with acid-fast bacteria, and upstream and downstream nucleotide sequences of the UreC gene were introduced into the plasmid pYUB854 so as to sandwich the hygromycin resistance gene. Furthermore, the rapidly growing mycobacteria Using smegmatis, UreC disruption phages were prepared.
The recombinant phage was infected with the BCG-Tokyo strain, spread on a flat medium containing hygromycin, and cultured at 30 ° C. After about 3 weeks, the formed colonies were cultured, and it was confirmed that the urease test was negative. In this manner, a UreC gene-deficient recombinant BCG strain (BCG-ΔUT-11) was obtained.
Furthermore, in order to delete the hagromycin gene cassette contained in BCG-ΔUT-11, it was deleted using pYUB870 encoding γδ resolvase (γδtnpR). Then, the same kanamycin and hygromachine sensitive BCG strain (BCG-ΔUT-11-3) as the parent strain was selected.
（２）２種類のコントロールＢＣＧ（ベクターコントロールＢＣＧ（ＢＣＧ−２６１Ｈ）とＢＣＧ−ＤＨＴＭ）の作製：
公知方法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２１（１）、 １−１１（２０１４））に準じて作製した。ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株と結核菌Ｈ３７Ｒｖ株からゲノムＤＮＡを得た。ＢＣＧ由来のｈｓｐ７０遺伝子を増幅するため、オリゴヌクレオチドのプライマーとして、Ｆ−Ｍｂ７０Ｂａｌ（５‘−ａａａＴＧＧＣＣＡｔｇｇｃｔｃｇｔｇｃｇｇｔｃｇｇｇ−３’）とＲ−Ｍｂ７０Ｅｃｏ（５‘−ａａａＧＡＡＴＴＣｃｔｔｇｇｃｔｃｃｃｇｇｃｃｇ−３’）を使用した。結核菌由来のＭＭＰ−ＩＩの遺伝子を増幅するため、プライマーとして、Ｆ−ＭＭＰＴＢＥｃｏ（５‘−ａａｔｔＧＡＡＴＴＣａｔｇｃａａｇｇｔｇａｔｃｃｃｇａｔｇｔ−３’）とＲ−ＭＭＰＴＢＳａｌ（５‘−ａａｔｔＧＴＣＧＡＣｔｃａｇｇｔｃｇｇｔｇｇｇｃｇａｇａ−３’）を使用した。なお、プライマーの大文字部分は、制限酵素での切断面を表す。増幅されたものは、適切な制限酵素で切断され、ｐＭＶ２６１プラスミドに導入された。ハイグロマシン抵抗性の遺伝子カセットをカナマイシン抵抗性の遺伝子と置換するため、ｐＹＵＢ８５４プラスミドのＸｂａＩ−ＮｈｅＩ断片を、ｐＭＶ２６１プラスミドのＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片に挿入した。
ＢＣＧのｈｓｐ７０と結核菌のＭＭＰ−ＩＩの融合蛋白を発現するベクターをエレクトロポレーションによってＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３に導入した。ｐＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩを核外プラスミドとして含有するＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３をＢＣＧ−ＤＨＴＭと名付けた。ｐＭＶ−２６１−ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎを含有するＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株をＢＣＧ−２６１Ｈ（ＢＣＧベクターコントロール）と名付けた。これらの組換えＢＣＧは、１０８ＣＦＵ／ｍＬ、−８０℃で保存された。なお、これら組換えＢＣＧの間で、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養に関して大きな相違は見られなかった。
(2) Preparation of two types of control BCG (vector control BCG (BCG-261H) and BCG-DHTM):
It produced according to the well-known method (Clinical and Vaccine Immunology, 21 (1), 1-11 (2014)). Genomic DNA was obtained from the BCG-Tokyo strain and the Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain. In order to amplify the BCG-derived hsp70 gene, F-Mb70Bal (5'-aaaTGGCCCtggctcgtgcgggtgggg-3 ') and R-Mb70Eco (5'-aaaGAATTCctgtggtccgtgggccg-3') were used as oligonucleotide primers. In order to amplify the MMP-II gene derived from Mycobacterium tuberculosis, F-MMPTBEco (5′-aattGAATTCatgcaaggtgaccccgagt-3 ′) and R-MMPTBSal (5′-aattGTCGACTcgggtgggtgggcgaga-3 ′) were used as primers. In addition, the capital letter part of a primer represents the cut surface in a restriction enzyme. The amplified product was cut with an appropriate restriction enzyme and introduced into the pMV261 plasmid. In order to replace the hygroma resistance gene cassette with the kanamycin resistance gene, the XbaI-NheI fragment of the pYUB854 plasmid was inserted into the SpeI-NheI fragment of the pMV261 plasmid.
A vector expressing a fusion protein of BCG hsp70 and M. tuberculosis MMP-II was introduced into BCG-ΔUT-11-3 by electroporation. BCG-ΔUT-11-3 containing pHSP70-MMP-II as an extranuclear plasmid was named BCG-DHTM. The BCG-Tokyo strain containing pMV-261-hyromycin was named BCG-261H (BCG vector control). These recombinant BCG were stored at 10 < 8 > CFU / mL at -80 <0> C. There was no significant difference between these recombinant BCGs regarding in vitro culture.
（３）結核菌のＭＭＰ−ＩＩとＰＥＳＴ配列を含有し、ＵｒｅＣ遺伝子を欠損するリコンビナントＢＣＧ（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）の作製：
ＨＳＰ６０プロモーター制御の下、ＢＣＧ由来のＨＳＰ７０遺伝子と結核菌由来ＭＭＰ−ＩＩ遺伝子を連結し、そのＮ側とＣ側にＰＥＳＴ配列（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来ｈｌｙ遺伝子に存在するＰＥＳＴ配列）を融合し、細胞内でＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白を分泌させるためのリコンビナントＢＣＧを次のように作製した。
まず、公知方法（ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１４、 １４：１７９）に準じて作製した。ＢＣＧ由来のｈｓｐ７０遺伝子と結核菌由来のＭＭＰ−ＩＩの遺伝子は、上記（２）の方法で取得した。ＰＥＳＴ配列は、エムエステクノシステムズ社に依頼し人工合成遺伝子として合成した。
ＰＥＳＴ配列遺伝子をＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ配列に組み込むために、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（クローンテック研究所製）を使用した。カナマイシン抵抗性の遺伝子をハイグロマイシン抵抗性の遺伝子カセットに置換するために、ｐＹＵＢ８５４のＸｂａＩ−ＮｈｅＩ断片を、ｐＭＶ２６１のＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片に挿入した。
ＰＥＳＴ−ＢＣＧＨＳＰ７０-結核ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴの融合蛋白を発現するベクターをエレクロトポレーションでＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３に導入した。ｐＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴを核外プラスミドとして含有するＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３をＢＣＧ−ＰＥＳＴと名付けた。この組換えＢＣＧは、１０８ＣＦＵ／ｍＬ、−８０℃で保存された。
なお、ＢＣＧ−ＰＥＳＴは、菌体培養液中にＰＥＳＴ−ＢＣＧｈｓｐ７０-結核ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴの融合蛋白を分泌することを、ウェスタンブロット法を用いて確認した。
(3) Production of recombinant BCG (BCG-PEST) containing MMP-II and PEST sequences of Mycobacterium tuberculosis and lacking the UreC gene:
Under the control of the HSP60 promoter, the BCG-derived HSP70 gene and M. tuberculosis-derived MMP-II gene are linked, and the Nest and C-side PEST sequences (PEST sequences present in the L. monocytogenes-derived hly gene) are fused, A recombinant BCG for secreting the PEST-HSP70-MMP-II-PEST fusion protein was prepared as follows.
First, it produced according to the well-known method (BMC Infectious Diseases 2014, 14: 179). BCG-derived hsp70 gene and Mycobacterium tuberculosis-derived MMP-II gene were obtained by the method of (2) above. The PEST sequence was synthesized as an artificially synthesized gene at the request of MESTEKNO SYSTEMS.
In-Fusion HD cloning kit (Clontech Laboratories) was used to incorporate the PEST sequence gene into the HSP70-MMP-II sequence. In order to replace the kanamycin resistance gene with the hygromycin resistance gene cassette, the XbaI-NheI fragment of pYUB854 was inserted into the SpeI-NheI fragment of pMV261.
A vector expressing a fusion protein of PEST-BGHSP70-tuberculosis MMP-II-PEST was introduced into BCG-ΔUT-11-3 by electroporation. BCG-ΔUT-11-3 containing pPEST-HSP70-MMP-II-PEST as an extranuclear plasmid was named BCG-PEST. This recombinant BCG was stored at 10 8 CFU / mL at −80 ° C.
BCG-PEST was confirmed to secrete a fusion protein of PEST-BCGhsp70-tuberculosis MMP-II-PEST into the cell culture medium using Western blotting.
試験例１：ＢＣＧ−ＰＥＳＴの作用効果の評価
（１）樹状細胞（ＤＣ）を用いたＢＣＧ−ＰＥＳＴの効果：
ＢＣＧ−ＰＥＳＴを感染させたＤＣとマクロファージによるＴ細胞の増殖能が、自家のＡＰＣ−Ｔ細胞を用いて評価された（Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ７０：５１６７−５１７６（２００２））。
ＣＤ４陽性とＣＤ８陽性のＴ細胞の精製は、ネガテイブ単離キット（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ４５０）を使用して行なった。ナイーブなＣＤ４陽性とＣＤ８陽性Ｔ細胞は、これらのＴ細胞をＣＤ４５ＲＯに対する抗体で更に処理し、次いで、ヒツジの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で被覆したビーズで処理することによって得られる。９８％以上のＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞は、ＣＣＲ７分子の発現が陽性になっている。メモリーＴ細胞は、細胞をＣＤ４５ＲＡ抗原に対する抗体で同様に処理をすることによって得られる。精製されたナイーブあるいはメモリータイプＴ細胞（１×１０５細胞／ｗｅｌｌ）が９６穴の丸底細胞培養皿に入れられた。そして組換えＢＣＧで感作させたＤＣとマクロファージを添加すると、ＡＰＣ／Ｔ細胞の比が出ることになる。ＡＰＣとＴ細胞の共培養の上澄みを４日間集めて、サイトカインの濃度レベルを測定した。
ある場合には、組換えＢＣＧを感染させたＤＣとマクロファージを更にＨＬＡ−ＡＢＣに対する抗体（Ｗ６／３２、マウスＩｇＧ２ｂ、カッパ）や、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体（Ｌ２４３、マウスＩｇＧ２ｂ、カッパ）又はＣＤ８６に対する抗体（ＩＴ２．２、マウスＩｇＧ２ｂ、カッパ；ＢＤバイオサイエンス製）又は通常のマウスＩｇＧで処理する。
Test Example 1: Evaluation of effect of BCG-PEST (1) Effect of BCG-PEST using dendritic cells (DC):
The proliferation ability of T cells by DCs and macrophages infected with BCG-PEST was evaluated using autologous APC-T cells (Infect. Immun. 70: 5167-5176 (2002)).
Purification of CD4 positive and CD8 positive T cells was performed using a negative isolation kit (Dynabeads 450). Naive CD4-positive and CD8-positive T cells are obtained by further treating these T cells with an antibody against CD45RO and then with beads coated with sheep anti-mouse IgG antibody (Dynal Biotech). Over 98% of CD45RA positive T cells are positive for CCR7 molecule expression. Memory T cells are obtained by similarly treating cells with an antibody against the CD45RA antigen. Purified naïve or memory type T cells (1 × 10 5 cells / well) were placed in a 96-well round bottom cell culture dish. Addition of DCs and macrophages sensitized with recombinant BCG will result in an APC / T cell ratio. Supernatants of APC and T cell co-cultures were collected for 4 days to determine cytokine concentration levels.
In some cases, DC and macrophages infected with recombinant BCG are further directed against antibodies against HLA-ABC (W6 / 32, mouse IgG2b, kappa), antibodies against HLA-DR (L243, mouse IgG2b, kappa) or CD86. Treat with antibody (IT2.2, mouse IgG2b, kappa; manufactured by BD Biosciences) or normal mouse IgG.
（２）ＢＣＧ−ＰＥＳＴに関するサイトカインの産生能の評価：
次のサイトカインの産生能が測定された。ＣＤ４陽性とＣＤ８陽性のＴ細胞から産生されるインターフェロンガンマ、インターロイキン−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、及び組換えＢＣＧを２４時間又は４８時間感染させたＤＣ又はマクロファージから産出されるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−１βである。これらサイトカインの濃度は、酵素アッセイキット（Ｏｐｔ ＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット：ＢＤバイオサイエンス製）を用いて定量された。
(2) Evaluation of cytokine production ability for BCG-PEST:
The following cytokine production ability was measured. Produced from DCs or macrophages infected with interferon gamma, interleukin-12p70 (IL-12p70), TNFα, IL-1β, and recombinant BCG produced from CD4 positive and CD8 positive T cells for 24 or 48 hours GM-CSF and IL-12, TNFα, IL-1β. The concentrations of these cytokines were quantified using an enzyme assay kit (Opt EIA ELISA kit: manufactured by BD Bioscience).
（３）ＢＣＧ−ＰＥＳＴに関する動物感染防御試験の評価：
生きている菌の濃度を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０寒天プレートに植えることで決定した。1グループ３匹の５週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１×１０３又は１×１０４の組換えＢＣＧを含有するリン酸バッファー食塩水又はリン酸バッファーの０．１ｍＬを皮下接種した。マウスは特定の病原体のいない条件で飼育され、滅菌した食料と水を供給した。接種後４週間後又は１２週間後、脾臓を取り出し、脾臓細胞を２×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように培地に分散させる。脾臓細胞は、９６穴の丸底マイクロプレートの中で、組換えＭＭＰ−ＩＩ蛋白、組換えＨＳＰ７０又はＨ３７Ｒｖ由来の細胞蛋白質の指定された濃度で刺激を行った。刺激後の３〜４日の個々の培養上清を集めた。
結核感染に関するＢＣＧワクチンの効果を観察するために、１グループ５匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＢＣＧ−２６１Ｈ、ＢＣＧ−ＤＨＴＭ、ＢＣＧ−ＰＥＳＴを、それぞれ１×１０４又は１×１０５ＣＦＵ／マウスを用いて接種した。６週間後、結核菌Ｈ３７Ｒｖ株を用いて、自動吸入暴露装置（０９９ｃ Ａ４２１２型、グラス−コール社製）でのエアロゾル感染を行った。６週間後、肺と脾臓での細菌負荷を、ＰＢＳ溶液中で組織破砕し、コロニーアッセイによって計算した。動物実験は、国立感染研究所の実験動物に関する動物研究委員会によってチェックされ、承認を得て、ガイドラインに従って実施されている。
(3) Evaluation of animal infection protection test for BCG-PEST:
The concentration of live bacteria was determined by planting on a Middlebrook 7H10 agar plate. Three 5-week-old C57BL / 6J mice per group were inoculated subcutaneously with 0.1 mL of phosphate buffered saline or phosphate buffer containing 1 × 10 3 or 1 × 10 4 recombinant BCG. Mice were raised in the absence of specific pathogens and fed sterile food and water. Four or 12 weeks after inoculation, the spleen is removed and the spleen cells are dispersed in the medium to a concentration of 2 × 10 6 cells / mL. Spleen cells were stimulated in a 96-well round bottom microplate with the specified concentrations of recombinant MMP-II protein, recombinant HSP70 or H37Rv-derived cellular protein. Individual culture supernatants were collected 3-4 days after stimulation.
To observe the effect of the BCG vaccine on tuberculosis infection, one group of 5 C57BL / 6J mice received 1 × 10 4 or 1 × 10 5 CFU / mouse of BCG-261H, BCG-DHTM, BCG-PEST, respectively. Was used to inoculate. Six weeks later, the Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain was used for aerosol infection with an automatic inhalation exposure apparatus (099c A4212 type, manufactured by Glass-Cole). After 6 weeks, bacterial load in the lungs and spleen was tissue disrupted in PBS solution and calculated by colony assay. Animal experiments are checked and approved by the Animal Research Committee on Laboratory Animals at the National Institute of Infectious Diseases, and are conducted according to guidelines.
（４）ＢＣＧ−ＰＥＳＴの作用および効果のまとめ：
図１〜図９に基づいてＢＣＧ−ＰＥＳＴの作用と効果を次に説明する。
図1においては、ＢＣＧ−２６１Ｈ、ＢＣＧ−ＤＨＴＭおよびＢＣＧ−ＰＥＳＴを試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養した際得られた培養上清をＨＳＰ７０あるいはＭＭＰ−ＩＩに対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法で解析した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは両抗体と反応する９０ｋＤａの蛋白を分泌していることが判明した。
図２においては、ＢＣＧ−２６１Ｈ、ＢＣＧ−ＤＨＴＭあるいはＢＣＧ−ＰＥＳＴで、ヒト末梢血単球由来（ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を用いて産生する）樹状細胞を刺激すると、ＢＣＧ−ＰＥＳＴが最も強くＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βを産生した。また、ＢＣＧ−ＰＥＳＴが最も強く樹状細胞表面のＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３抗原の発現を増強させた。以上より、ＢＣＧ−ＰＥＳＴは強く樹状細胞を活性化し得ることが判明した。
図３においては、各種ＢＣＧ（上記３種）を用いヒト末梢単球よりＭ−ＣＳＦを用いて分化誘導したマクロファージを刺激すると、ＢＣＧ−ＰＥＳＴが最も強くＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦを産生した。以上より、ＢＣＧ−ＰＥＳＴは強くマクロファージを活性化し得ることが判明した。
(4) Summary of actions and effects of BCG-PEST:
The operation and effect of BCG-PEST will be described below with reference to FIGS.
In FIG. 1, the culture supernatant obtained when BCG-261H, BCG-DHTM, and BCG-PEST were cultured in vitro (in vitro) was analyzed by Western blotting using monoclonal antibodies against HSP70 or MMP-II. did. BCG-PEST was found to secrete a 90 kDa protein that reacts with both antibodies.
In FIG. 2, when BCG-261H, BCG-DHTM, or BCG-PEST stimulates human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells (produced using GM-CSF and IL-4), BCG-PEST is the most Strongly produced IL-12p70, TNFα and IL-1β. Moreover, BCG-PEST strongly enhanced the expression of HLA-ABC, HLA-DR, CD86 and CD83 antigens on the surface of dendritic cells. From the above, it was found that BCG-PEST can strongly activate dendritic cells.
In FIG. 3, BCG-PEST produced the strongest TNFα, IL-1β and GM-CSF when various BCG (the above three types) were used to stimulate differentiation-induced macrophages from human peripheral monocytes using M-CSF. did. From the above, it was found that BCG-PEST can strongly activate macrophages.
図４においては、上記の各種ＢＣＧのヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化能および活性化機構を解析した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは最も強く未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化してインターフェロンガンマの産生を誘導した。その活性化は樹状細胞をＨＬＡ−ＤＲあるいはＣＤ８６抗原に対するモノクローナル抗体で処理した場合や樹状細胞をクロロキニンやラクトシスティンで処理した場合阻害された。以上より、ＢＣＧ−ＰＥＳＴはヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞を強く活性化する能力を有し、その活性化は抗原特異的であり、かつファゴゾームの成熟化（ファゴ-ライソゾームの形成）やプロテアゾームでの蛋白分解に依存していることが判明した。
図５においては、上記の各種ＢＣＧのマクロファージを介したメモリータイプＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化能および活性化機構を解析した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは最も強くＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化してインターフェロンガンマの産生を誘導し、その活性化はＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６抗原に依存した抗原特異的反応であり、またマクロファージを予めクロロキニンで処理することにより阻害されることから、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化はファゴゾームの成熟化に依存していることが判明した。
In FIG. 4, the human naïve CD4-positive T cell activation ability and activation mechanism of the various BCGs were analyzed. BCG-PEST most strongly activated naïve CD4 positive T cells and induced the production of interferon gamma. The activation was inhibited when dendritic cells were treated with a monoclonal antibody against HLA-DR or CD86 antigen, or when dendritic cells were treated with chloroquinine or lactocystine. From the above, BCG-PEST has the ability to strongly activate human naïve CD4 positive T cells, the activation is antigen-specific, and phagosome maturation (formation of phago-lysosome) and proteasome It turned out to be dependent on proteolysis in
In FIG. 5, the activation ability and activation mechanism of memory type CD4-positive T cells via macrophages of the various BCGs described above were analyzed. BCG-PEST most strongly activates CD4-positive T cells to induce the production of interferon gamma, which activation is an antigen-specific reaction dependent on HLA-DR and CD86 antigen, and macrophages are pre-treated with chloroquinine It was found that activation of CD4 positive T cells depends on phagosome maturation.
図６においては、上記の各種ＢＣＧの樹状細胞を介したヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化能および活性化機構を解析した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは最も強くヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化してインターフェロンガンマの産生を誘導した。その活性化はＨＬＡ−ＡＢＣおよびＣＤ８６抗原依存性であり抗原特異的であった。さらに、樹状細胞を予めクロロキニン、ブレフェルディンＡあるいはラクトシスティンで処理することで阻害されたことから、本活性化にはファゴゾームの成熟化および樹状細胞内のクロスプレゼンテーション回路の活性化が強く関与していることが判明した。
図７においては、上記ＢＣＧによるＣ５７ＢＬ／６マウス生体内でのメモリーＴ細胞産生能を解析した。図に示すＢＣＧをマウスに皮下接種し６週間後（図７（ａ））あるいは１２週間後（図７（ｂ））にマウス脾Ｔ細胞を調整し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＭＰ−ＩＩ、ＨＳＰ７０あるいは結核菌Ｈ３７Ｒｖ由来の細胞質蛋白あるいは膜蛋白で再刺激を加えると、ＢＣＧ−ＰＥＳＴを感染させたマウスから得たＴ細胞が上記再刺激蛋白に最も強く反応してインターフェロンガンマを産生した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは効率的にメモリーＴ細胞を産生し、かつ産生期間は長いことが判明した。
In FIG. 6, the activation ability and activation mechanism of human naive CD8-positive T cells via the above-mentioned various BCG dendritic cells were analyzed. BCG-PEST most strongly activated human naive CD8 + T cells and induced the production of interferon gamma. Its activation was HLA-ABC and CD86 antigen dependent and antigen specific. Furthermore, since dendritic cells were inhibited by pretreatment with chloroquinine, brefeldin A or lactocystine, this activation was strongly accompanied by maturation of phagosomes and activation of the cross-presentation circuit in dendritic cells. Turned out to be involved.
In FIG. 7, the memory T cell production ability in the C57BL / 6 mouse living body by BCG was analyzed. BCG shown in the figure was subcutaneously inoculated into mice and mouse spleen T cells were prepared 6 weeks later (FIG. 7 (a)) or 12 weeks later (FIG. 7 (b)), and MMP-II, HSP70 or tuberculosis was in vitro. When restimulation was applied with cytoplasmic protein or membrane protein derived from fungus H37Rv, T cells obtained from a mouse infected with BCG-PEST reacted most strongly with the restimulation protein to produce interferon gamma. It was found that BCG-PEST efficiently produces memory T cells and has a long production period.
図８においては、ＢＣＧ−ＰＥＳＴの抗結核ワクチン効果を検討した。図に示す量のＢＣＧをＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種し、６週間後に図に示す結核菌を空気感染させ、その４週間後に肺を取り出し、肺内に存在する結核菌の数をコロニーアッセイで産出したものである。図８（ａ）では、ＢＣＧ−ＰＥＳＴはＢＣＧ−２６１Ｈに比し結核菌Ｈ３７Ｒｖの増殖を抑制することを示し、図８（ｂ）ではＢＣＧ−ＰＥＳＴは臨床分離株である北京株の増殖を抑制することを示し、図８（ｃ）ではＢＣＧ−ＰＥＳＴはＢＣＧ−ＤＨＴＭよりも有効に結核菌Ｈ３７Ｒｖの増殖を抑制することを示した。
図９においては、ＢＣＧ−ＰＥＳＴのワクチン効果が長期持続するか解析した。ワクチン接種３ケ月後には、ＢＣＧ−２６１ＨもＢＣＧ−ＰＥＳＴも結核菌Ｈ３７Ｒｖの肺内増殖を抑制し得るものの、その効果はＢＣＧ−ＰＥＳＴの方が強いことを示している（図９（ａ））。しかし、ワクチン接種後６ヶ月に達するとＢＣＧ−２６１Ｈのワクチン効果は認められず、ＢＣＧ−ＰＥＳＴのみが結核菌の増殖を抑制することを示している。ＢＣＧ−ＰＥＳＴのワクチン効果は長期持続することが判明した。
In FIG. 8, the anti-tuberculosis vaccine effect of BCG-PEST was examined. The amount of BCG shown in the figure is subcutaneously inoculated into C57BL / 6 mice, 6 months later, the tuberculosis bacteria shown in the figure are air-infected, and 4 weeks later, the lungs are removed, and the number of tuberculosis bacteria present in the lungs is determined by colony assay. It has been produced. FIG. 8 (a) shows that BCG-PEST suppresses the growth of Mycobacterium tuberculosis H37Rv compared to BCG-261H, and FIG. 8 (b) shows that BCG-PEST suppresses the growth of Beijing strain, which is a clinical isolate. FIG. 8 (c) shows that BCG-PEST more effectively suppresses the growth of Mycobacterium tuberculosis H37Rv than BCG-DHTM.
In FIG. 9, it was analyzed whether the vaccine effect of BCG-PEST lasted for a long time. Three months after vaccination, both BCG-261H and BCG-PEST can suppress the growth of M. tuberculosis H37Rv in the lung, but the effect is stronger in BCG-PEST (FIG. 9 (a)). . However, when 6 months have passed since vaccination, the vaccine effect of BCG-261H was not observed, indicating that only BCG-PEST suppresses the growth of Mycobacterium tuberculosis. It was found that the vaccine effect of BCG-PEST is long-lasting.
本発明の組換えＢＣＧ（特にＢＣＧ−ＰＥＳＴ）は、公知のＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株やＢＣＧ−ＤＨＴＭよりも、感染防御能が高く、免疫賦活効果の長い結核ワクチンになることが分かった。それ故本発明の組換えＢＣＧを用いて、結核の発症を予防できる有効な抗結核組換えＢＣＧワクチンが提供できるようになった。
The recombinant BCG of the present invention (particularly BCG-PEST) was found to be a tuberculosis vaccine having a higher ability to protect against infection and a longer immunostimulatory effect than known BCG-Tokyo strains and BCG-DHTM. Therefore, an effective anti-tuberculosis recombinant BCG vaccine capable of preventing the onset of tuberculosis can be provided by using the recombinant BCG of the present invention.
Claims (11)
a）ＨＳＰ６０プロモーターの下流に、
b）ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子の両端（Ｎ末側とＣ末側）に、ＰＥＳＴ配列をコードする遺伝子を結合した融合遺伝子（ＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ）が挿入されている。
A method for producing a recombinant BCG, characterized by introducing the following protein expression plasmid into a urease-deficient BCG in which the UreC gene has been knocked out;
a) Downstream of the HSP60 promoter,
b) A fusion gene (PEST-HSP70-MMP-II-PEST) in which a gene encoding a PEST sequence is linked to both ends (N-terminal side and C-terminal side) of a gene encoding an HSP70-MMP-II fusion protein. Has been.
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