JP2016090554A - Sensing method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、圧電振動子を用いて感知対象物を感知する技術に関する。 The present invention relates to a technique for sensing a sensing object using a piezoelectric vibrator.
臨床分野において、例えば血糖値の自己モニタリングやインフルエンザウイルス検査等に代表されるPOCT(Point of core TEST)と呼ばれる簡便な検査方法が普及しており、この検査において、特許文献1に記載されているようなQCM(Quartz Crystal Microbalance)を利用した手法が知られている。QCMについて簡単に説明すると、感知装置に設けられた水晶振動子の表面に試料液中の感知対象物が吸着され、感知対象物の吸着量に応じた質量付加効果により水晶振動子の発振周波数が変化する。当該発振周波数の変化に基づいて、試料液中の感知対象物の検出又は定量が行われる。
近年では例えばウイルスの拡散防止や癌マーカーの早期発見等を目的として、更に微量な感知対象物の検出が求められており、1ml当たりの質量がpgオーダーの質量の測定が求められている。
In the clinical field, for example, a simple test method called POCT (Point of core TEST) typified by self-monitoring of blood glucose level and influenza virus test is widespread, and is described in
In recent years, for the purpose of, for example, preventing the spread of viruses and early detection of cancer markers, detection of a minute amount of a sensing object is demanded, and the mass per ml is demanded to be measured in the order of pg.
このような問題に対し、感知対象物である低分子物質に結合する性質を有する低分子物質よりも大きな分子を添加し、低分子物質に結合させることにより周波数変化量を増大させる手法、いわゆる増感と呼ばれる技術が知られている。しかしながら感知対象物にある大きさ以上の粒子を結合させる場合には、非特許文献1及び2にて述べられているように、水晶振動子の表面に付着した粒子が水晶とは異なる固有の周波数で振動するようになり、質量付加効果が得られない現象が知られている。このため増感を目的として粒子を添加したにもかかわらず却って感度が減少することがあった。
To solve this problem, a method of increasing the amount of frequency change by adding a molecule larger than the low molecular weight substance that has the property of binding to the low molecular weight substance to be detected and binding to the low molecular weight substance, so-called increase. A technique called feeling is known. However, when particles of a size larger than a certain size are bonded to the sensing object, as described in
特許文献2には、測定対象に比して粒径の大きな分子、及び架橋性化合物を添加して周波数振幅を増感する方法が記載されている。また特許文献3には、測定対象を吸着する薄膜に対して粒子を付着させ、当該粒子を除去することにより薄膜の表面積を増加させ、周波数振幅の増感を図る方法が開示されている。しかしながら本発明の課題を解決するものではない。
本発明はこのような事情の下になされたものであり、その目的は、圧電振動子の周波数変化に基づいて試料液中の感知対象物を感知するにあたって、信頼性の高い測定を行うことができる技術を提供することにある。 The present invention has been made under such circumstances, and an object of the present invention is to perform a highly reliable measurement when sensing a sensing object in a sample liquid based on a frequency change of a piezoelectric vibrator. It is to provide a technology that can be used.
本発明の感知方法は、試料液中の感知対象である成分を吸着する吸着層を圧電振動子の電極表面に形成してなる感知センサを用い、試料液を感知センサの測定領域に供給して、前記成分の量を吸着前後の圧電振動子の周波数変化量として測定する感知方法において、
前記圧電振動子を発振回路により発振させて、前記測定領域を液相とする前の発振周波数を測定する工程と、
次いで前記測定領域に試料液を供給する工程と、
その後前記測定領域から液体を除去して当該測定領域を気相とする工程と、
しかる後、前記圧電振動子を発振回路により発振させて発振周波数を測定し、当該発振周波数と前記測定領域を液相とする前の発振周波数との周波数変化量を測定する工程と、を含むことを特徴とする。
The sensing method of the present invention uses a sensing sensor in which an adsorption layer that adsorbs a component to be sensed in a sample liquid is formed on the electrode surface of the piezoelectric vibrator, and supplies the sample liquid to the measurement area of the sensing sensor. In the sensing method of measuring the amount of the component as a frequency change amount of the piezoelectric vibrator before and after adsorption,
Oscillating the piezoelectric vibrator by an oscillation circuit and measuring an oscillation frequency before the measurement region is in a liquid phase;
Next, supplying a sample solution to the measurement region;
Thereafter, removing the liquid from the measurement region to make the measurement region a gas phase,
Thereafter, the step of oscillating the piezoelectric vibrator with an oscillation circuit to measure the oscillation frequency and measuring the amount of change in frequency between the oscillation frequency and the oscillation frequency before making the measurement region a liquid phase is included. It is characterized by.
また本発明の感知方法は、前記測定領域に試料液を供給した後、前記測定領域を気相とする工程の前に、前記感知対象物の対応する部位に吸着する性質を有する増感用の粒子の群を含む液を前記測定領域に供給する工程を含んでもよく、前記測定領域に試料液を供給する工程の後、前記測定領域を気相とする工程の前に、感知対象物と吸着層との間に架橋を形成する架橋剤を前記測定領域に供給する工程を含むことを特徴としてもよい。
さらに感知対象物の対応する部位に吸着する性質を有する粒子の群を含む液を前記測定領域に供給した後、前記測定領域を気相とする工程の前に、感知対象物の対応する部位に吸着する性質を有する増感用の粒子と感知対象物との間、及び感知対象物と吸着層との間に架橋を形成する架橋剤を前記測定領域に供給する工程を含むことを特徴としてもよい。
Further, the sensing method of the present invention is a sensitizing method having a property of adsorbing to a corresponding part of the sensing object after supplying a sample solution to the measurement area and before making the measurement area a gas phase. A step of supplying a liquid containing a group of particles to the measurement region may be included. After the step of supplying the sample solution to the measurement region, and before the step of setting the measurement region to a gas phase, the object to be detected is adsorbed. A step of supplying a cross-linking agent that forms a cross-linkage with the layer to the measurement region may be included.
Furthermore, after supplying a liquid containing a group of particles having a property of adsorbing to a corresponding part of the sensing object to the measurement region, before the step of setting the measurement region to a gas phase, the liquid is contained in the corresponding part of the sensing object. Including a step of supplying, to the measurement area, a crosslinking agent that forms a bridge between the sensitizing particles having the property of adsorbing and the sensing object and between the sensing object and the adsorption layer. Good.
あるいは本発明の感知方法は、前記測定領域に対して試料液を供給する工程の前に、前記測定領域に薄め液を供給する工程を含んでもよく、前記測定領域を気相とする工程の前に、前記測定領域に有機溶媒を供給する工程を含み、前記測定領域を気相とする工程は、前記有機溶媒を除去して測定領域を気相とする工程であることを特徴としてもよい。 Alternatively, the sensing method of the present invention may include a step of supplying a dilute solution to the measurement region before the step of supplying a sample solution to the measurement region, and before the step of setting the measurement region to a gas phase. The step of supplying an organic solvent to the measurement region, wherein the step of setting the measurement region to the gas phase may be a step of removing the organic solvent to set the measurement region to the gas phase.
本発明は、圧電振動子に感知対象物を付着させ、質量付加効果による周波数変化により感知対象物の量を測定する感知方法において、前記圧電振動子の測定領域を液相とする前に発振周波数を測定し、その後測定領域に試料液を供給する。しかる後測定領域の液体成分を除去して気相として、発振周波数を測定し、測定領域に試料液を供給する前の発振周波数との周波数差を測定するようにしている。従って圧電振動子が気相中で発振するため、圧電振動子が液相に接することに起因する発振周波数の誤差や発振周波数の変化量の低下が抑制され、感知対象物を高精度に感知することができる。 The present invention relates to a sensing method in which a sensing object is attached to a piezoelectric vibrator and the amount of the sensing object is measured by a frequency change due to a mass addition effect, and an oscillation frequency before the measurement region of the piezoelectric vibrator is set to a liquid phase. Then, a sample solution is supplied to the measurement region. Thereafter, the liquid component in the measurement region is removed to form a gas phase, the oscillation frequency is measured, and the frequency difference from the oscillation frequency before the sample liquid is supplied to the measurement region is measured. Therefore, since the piezoelectric vibrator oscillates in the gas phase, an oscillation frequency error and a decrease in the amount of change in the oscillation frequency caused by the piezoelectric vibrator contacting the liquid phase are suppressed, and the sensing object is sensed with high accuracy. be able to.
以下本発明の実施の形態に係る感知センサを用いた感知装置について説明する。この感知装置は、マイクロ流体チップを利用し、例えば人間の鼻腔の拭い液から得られた試料液中のウイルスなどの抗原の有無を検出し、人間のウイルスの感染の有無を判定することができるように構成されている。図1の外観斜視図に示すように、感知装置は本体部12と、感知センサ2と、を備えている。感知センサ2は、本体部12に形成された差込口17に着脱自在に接続されている。本体部12の上面には、例えば液晶表示画面により構成される表示部16が設けられており、表示部16は例えば本体部12内に設けられた後述する発振回路の出力周波数あるいは、周波数の変化分等の測定結果もしくは、ウイルスの検出の有無等を表示する。
A sensing device using a sensing sensor according to an embodiment of the present invention will be described below. This sensing device uses a microfluidic chip, and can detect the presence or absence of an antigen such as a virus in a sample liquid obtained from, for example, a wiping liquid of a human nasal cavity, and determine the presence or absence of a human virus infection. It is configured as follows. As shown in the external perspective view of FIG. 1, the sensing device includes a
続いて感知センサ2について説明する。図2は図1に示した感知センサ2における上側カバー体21を外した状態を示す斜視図、図3、図4は夫々感知センサ2の各部材の表側(上面側)及び一部の部材の裏側(下面側)を示した斜視図、図5は感知センサ2を長さ方向に沿って切断した縦断面図を示す。
感知センサ2は、図1に示すように上側カバー体21と下側ケース22とで構成される容器20を備えている。下側ケース22の上方には、長さ方向に延伸された形状の配線基板3が設けられ、配線基板3における長さ方向の一端側には前述の発振回路ユニット12の差込口17に差し込まれる差込部31が形成されている。
Next, the
As shown in FIG. 1, the
配線基板3には貫通孔32が形成されており、配線基板3は下側ケース22の上方に、貫通孔32が下側ケース22の底面によって塞がれると共に、下側ケース22の外側に差込部31が突出するように配置される。配線基板3の表面側には、長さ方向に伸びる3本の配線25〜27が設けられており、各配線25〜27の一端側は、差込部31において、夫々端子部252、262、272が形成されており、他端側は貫通孔32の外縁にて、夫々端子部251、261及び271が形成されている。
A through-
水晶振動子4は、例えばATカットの円板状の水晶片41を備えており、水晶片41の表面側には、例えばAu(金)により形成される励振電極42A、42Bが互いに平行に伸びるように設けられている。励振電極42A、42Bは、長さ方向一端側が接続され、接続された部分から水晶片41の周縁部に向かって引き出し電極36が伸ばされている。この引き出し電極36は、水晶片41の側面を引き回され、裏面の周縁部にて端子部36aが形成されている。水晶振動子4の裏面側には、例えばAuにより、励振電極42A、42Bに対向するように夫々励振電極43A、43Bが平行に伸びている。励振電極43A、43Bからは、夫々水晶片30の周縁に向かって引き出し電極35、37が引き出されており、水晶片41の周縁部にて夫々端子部35a、37aが形成されている。
The
水晶振動子4の表側における励振電極42Aの表面には、例えば抗原である感知対象物を吸着するための抗体からなる吸着層46が形成されている。一方励振電極42Bの表面は吸着層46が形成されずに剥き出しの状態となっている。
水晶振動子4は、裏面側の励振電極43A,43Bが配線基板3の貫通孔32に臨み、端子部35a、36a、37aが配線基板4上に設けられた夫々対応する端子部251、261、271に重なるように配置され、導電性接着剤により接着される。これにより水晶振動子4は、配線基板3に略水平な状態で固定される。
On the surface of the
In the
配線基板3の表側における、差込部31の反対側に、水晶振動子4を挟み込むように流路形成部材5が積層される。流路形成部材5の裏側には、図4に示すように水晶振動子4が収まるように凹部51が形成されている。この凹部51には、水晶振動子4に流路形成部材5を厚さ方向に貫通する貫通孔52、53が形成され、これら貫通孔52,53を囲む枠部54が設けられている。
A flow
流路形成部材5が水晶振動子4の上方から積層されると、励振電極が42A,42Bが枠部54の囲まれた領域に収まり、貫通孔52、53が励振電極42A,42Bの長さ方向に並んで配置される。この枠部54と水晶振動子4とに囲まれた領域は水平な天井面を備え、底面が水晶振動子4により構成された供給流路57を形成する。
When the flow
また図3に示すように前記貫通孔52、53には、夫々多孔質の部材で構成された入口側毛細管部材55と出口側毛細管部材56が着脱自在に設けられている。
入口側毛細管部材55は、貫通孔52を塞ぐように配置され、その上端が後述する上側カバー体21に形成されたインジェクト口23に露出し、下端が供給流路57内に進入するように設けられている。出口側毛細管部材56は、上方に伸びた後、屈曲して水平に伸びるL字型に形成される。出口側毛細管部材56は、貫通孔53を塞ぎ、その下端が供給流路57内に進入するように配置されている。更に出口側毛細管部材56の下端には、傾斜が形成されている。
Further, as shown in FIG. 3, the through
The inlet-
出口側毛細管部材56の他端側は、ガラス管で構成される廃液流路59の一端側に接続されている。廃液流路59の他端側には、例えば廃液流路59から流出する液体を吸引する毛細管シート71と、毛細管シート71で吸引された液体を吸収する吸収部材72と、から構成される廃液吸収部7が接続されており、廃液吸収部7の外側には、吸収部材72からの液漏れを防ぐためのケース体73が設けられている。なお図中75は廃液流路59を支持する支持部材である。
The other end side of the outlet
上側カバー体21は、差込部31を除いた配線基板3、流路形成部材5及び廃液吸収部7を上方側から覆うように設けられる。上側カバー体21の上面側にはすり鉢状に傾斜したインジェクト口23が形成されており、インジェクト口23の底部に前述の入口側毛細管部材55が露出する。またこの時上側カバー体21の下面に設けられた押圧部58により、流路形成部材5が配線基板3に押圧される。この感知センサ2では、インジェクト口23に供給された処理液は、インジェクト口23→入口側毛細管部材55→供給流路40→出口側毛細管部材56→廃液流路59→廃液吸収部7と続く一連の流路を毛細管現象により流れる。
The
続いて感知装置の全体構成について説明する。上記の感知センサ2の差込部31が、本体部12に差し込まれると、差込部31に形成された端子部252、262、272が本体部12に、これらの端子部252、262、272と対応するように形成された図示しない接続端子部に電気的に接続されて、感知装置を構成する。図6に示すように本体部12には、例えばコルピッツ回路で構成された第1の発振回路63及び第2の発振回路64が設けられており、第1の発振回路63は水晶振動子4における励振電極42Aと励振電極43Aとに挟まれた領域である第1の振動領域61を、第2の発振回路64は励振電極42Bと励振電極43Bとに挟まれた領域である第2の振動領域62を夫々発振させるように構成されている。また端子272は発振時にアース電位となるように接続される。この表面側における第1の振動領域61と、第2の振動領域62との表面は測定領域に相当する。
Next, the overall configuration of the sensing device will be described. When the
第1及び第2の発振回路63、64の出力側は、スイッチ部65と接続され、スイッチ部65の後段にはデータ処理部66が設けられる。データ処理部66は、入力信号である周波数信号のディジタル処理を行い、第1の発振回路63により出力される発振周波数「F1」の時系列データと、第2の発振回路64により出力される発振周波数「F2」の時系列データと、を取得する。
The output sides of the first and
本発明の感知装置では、スイッチ部65により、データ処理部66と第1の発振回路63とを接続するチャンネル1と、データ処理部66と第2の発振回路64とを接続するチャンネル2とを交互に切り替えた間欠発振を行うことにより、感知センサ2の2つの振動領域61、62間の干渉を避け、安定した周波数信号を取得できるようにしている。そしてこれらの周波数信号は、例えば時分割されて、データ処理部66に取り込まれる。データ処理部66では、周波数信号を例えばディジタル値として算出し、算出されたディジタル値の時分割データに基づいて、演算処理を行い、例えば、抗原の有無などの演算結果を表示部16に表示する。
In the sensing device of the present invention,
続いて本発明の実施の形態の作用について説明する。図7は、第1の振動領域61と第2の振動領域62との間の発振周波数の周波数差の時間変化を模式的に表した特性図であり、図8〜図13は感知センサ2における水晶振動子4の表面の様子を段階的に示す説明図である。なお図7の模式図において、周波数差の変化量は、説明の便宜上誇張して描いており、正確な周波数を示すものではない。まず時刻t0において感知センサ2を発振回路ユニット12に接続し、第1及び第2の発振回路を起動すると水晶振動子4の第1及び第2の振動領域61、62が発振され、供給流路57が液相となる前における夫々の発振周波数に対応する周波数信号F1a、F2bが取り出される。次いで時刻t1において例えば純水、リン酸緩衝液、生理食塩水などの緩衝液を、スポイトによりインジェクト口23から供給すると、緩衝液が供給流路57を満たし、水晶振動子44における供給流路57側の面が液相に変わり、発振周波数が大きく低下し、周波数差F1−F2も大きく低下する。
Next, the operation of the embodiment of the present invention will be described. FIG. 7 is a characteristic diagram schematically showing the time change of the frequency difference of the oscillation frequency between the
次いで時刻t2において、ユーザーがスポイトにより感知対象となる試料液をインジェクト口23に滴下すると、試料液は入口側毛細管部材55から供給流路57内へと流れる。試料液中の抗原は水晶とは直接反応しない。また第2の振動領域62における供給流路57側は、励振電極42Bが剥き出しであるため、当該領域にも抗原は反応しない。一方第1の振動領域61における表面側の励振電極42Aの表面には、図8に示すように抗原と選択的に反応する抗体49により吸着層46が形成されている。従って供給流路57に感知対象物である抗原を含む試料液50が供給されると、図9に示すように試料液50に含まれる抗原81は第1の振動領域61における励振電極42Aに設けられた吸着層46に形成された抗体49に対して反応して、吸着層46に結合される。この時吸着した抗原81の質量分の質量付加効果により発振周波数が変化数することになるが、試料液50に含まれる抗原81が微量である場合には、発振周波数の変化量はわずかである。
Next, at time t <b> 2, when the user drops the sample liquid to be detected by the dropper onto the
試料液を供給した後、抗体80bにビオチン80aを結合させたビオチン化抗体80を含んだ液90をインジェクト口23に滴下し、抗原81に対してビオチン化抗体80を結合させる。この結果、図10に示すように抗原81とビオチン化抗体80とが結合して、吸着層46に形成した抗体49上に抗原81とビオチン化抗体80とが結合した状態となる。
After supplying the sample solution, a
その後、時刻t3にて増感体粒子82を含んだ液91をインジェクト口23に注入する。増感体粒子82は例えば200nm〜3000nm程度の大きさの金コロイドで構成され、表面がビオチン化抗体80上のビオチン80aと結合するようにアビジン粒子48により処理されている。
Thereafter, the liquid 91 containing the
アビジン粒子48とビオチン化抗体80とは、1:1で結合することから、供給流路57に増感体粒子82を含んだ溶液91が供給されると、増感体粒子82は、図11に示すようにビオチン化抗体80を介して吸着層46に対して結合している抗原81に重畳して結合する。増感体粒子82は抗原81よりも大きさが大きく重量が重いため質量付加効果による周波数の変化が大きく図7に示すように出力される発振周波数の周波数差が低下する。
Since the
増感体粒子82を含んだ溶液91を供給して、所定の時間が経過した後、例えばEDC(1‐エチル‐3(3‐ジメチルアミノプロピル)‐カルボヂイミド)などの架橋剤を含む溶液をインジェクト口23に供給する。EDCは、アミノ基とカルボキシル基を脱水縮合してアミド結合を形成する。従ってビオチン化抗体80と抗原81との間、抗原81と抗体49との間の各タンパク質の分子間におけるアミノ基とカルボキシル基の間で架橋が形成され、増感体粒子82、ビオチン化抗体80、抗原81が吸着層から離れにくくなる。
更にインジェクト口23に純水を滴下する。これにより図12に示すように供給流路57内を満たす架橋剤を含む溶液92が純水93に押し出され、過剰な増感体粒子82や、架橋剤が洗い流される。その後インジェクト口23に有機溶剤、例えばメタノールを滴下すると、供給流路57を満たしている純水がメタノールに置換される。
A
Further, pure water is dropped into the
そして時刻t4において図13に示すようにインジェクト口23に例えばポリビニルアルコールにより構成されたスポンジ10を載置すると、供給流路57内を満たすメタノール94が、入口側毛細管部材55を流れて、スポンジ10に吸引されて除去されるため、供給流路57内が気相になる。更に予め純水をメタノール94に置換し、スポンジ10により供給流路57内の液体成分を吸引している。そのため流路を満たしている純水92の大部分が除去され、更に励振電極42A、42Bや供給流路57の壁面に付着する水分もメタノール94に溶けこむ。その後メタノール94をスポンジ10により吸引して除去すると、残存する励振電極42A、42Bや供給流路57の壁面に付着するメタノール94の液滴も速やかに揮発して除去される。従って水晶振動子4の励振電極42A、42Bの表面全体から液体成分が除去され、気相に接するようになる。
When the
また励振電極42A、42Bに増感体粒子82を含んだ液91を供給した後、架橋剤により、架橋を形成し結合を強くしているため、吸着層46に吸着した増感体粒子82は、メタノール94と共に流されずに吸着層46に残る。そのため第1の振動領域61上の吸着層46は、抗原81が吸着され、更に増感体粒子82が抗原に重畳して結合された状態となっている。従って第1の振動領域61の発振周波数は、気相下における水晶振動子4の発振周波数から増感体粒子82、ビオチン化抗体80、抗原81の付着による質量付加効果により低下した周波数F1bとなる。一方第2の振動領域62上には抗原81及び増感体粒子82は吸着されない。従って図7に示すように第2の振動領域61の発振周波数は、気相下において、質量付加効果に起因する発振周波数の低下を含まない発振周波数F2bとなる。従って周波数差は、F1b−F2bと演算される
In addition, since the liquid 91 containing the
そして当該発振周波数の周波数差F1b−F2bと、同じく気相にて取得した、供給流路57に緩衝液を供給する前に測定した第1の振動領域61と第2の振動領域62との間の発振周波数の差F1a−F2aとの差分を取得する。そして例えば予め当該差分と試料液中の感知対象物の濃度との関係式を取得しておき、この関係式と測定により得られた差分とから試料液中の感知対象物の濃度を求める。
And between the
ここで、水晶振動子4の雰囲気を気相として発振させることの効果について説明するが、まず圧電振動子の表面における質量付加効果について説明する。圧電振動子の表面に対して質量が付加される前後における、付加質量と周波数との関係について、一般的には次式(1)で表される関係式(Sauerbreyの式)が成立する。背景技術の項にて述べた増感効果は当該関係式を利用している。
ここで、Δmは付加質量(g)、Sは電極面積(cm2)、ρは圧電振動子の密度(g/cm3)、μは圧電振動子の剪断応力(g/cm・sec2)、Nはオーバートーン次数、Fは公称周波数(Hz)、ΔFは反応前後の圧電振動子における周波数変化(Hz)である。
しかし、圧電振動子に対して質量を付加する物質がある程度の大きさを超えると、質量を付加する物質が圧電振動子とは異なる固有の周波数にて振動するようになり、上述の(1)式の関係、即ち発振周波数の低下が成り立たなくなる現象が知られている。
Here, the effect of oscillating the atmosphere of the
Here, Δm is the additional mass (g), S is the electrode area (cm 2 ), ρ is the density of the piezoelectric vibrator (g / cm 3 ), and μ is the shear stress of the piezoelectric vibrator (g / cm · sec 2 ). , N is the overtone order, F is the nominal frequency (Hz), and ΔF is the frequency change (Hz) in the piezoelectric vibrator before and after the reaction.
However, if the substance that adds mass to the piezoelectric vibrator exceeds a certain size, the substance that adds mass starts to vibrate at a unique frequency different from that of the piezoelectric vibrator, and the above (1) It is known that there is a relationship between the equations, that is, a phenomenon in which a decrease in oscillation frequency does not hold.
当該現象について図14を用いて説明する。図14のように、水晶振動子8に単に球体83を結合させた状態を考える。水晶振動子8の質量をM、球体83の質量をmとおき、水晶振動子8及び球体83の単体での振動について、夫々がばね定数K及びkであるばねの振動であると仮定する。水晶振動子8と球体83とは結合しているので、図14によって示すようにばねを2つ直列に結合させた状態の共振が発生する。
液相中の場合には、増感体粒子82、ビオチン化抗体80、抗原81及び励振電極42Aの間に液体が介在するため、水晶振動子4を振動をさせたときに増感体粒子82、ビオチン化抗体80及び抗原81に振動が伝わりやすくなり、結合共振が起こりやすい。従って上述のように供給流路の液体成分を除去して、気相に接した状態で発振させることにより、結合共振を抑制することができる。この結果増感体粒子82を吸着させることによる増感効果を確実に得ることができ、感知対象物を高精度に感知することができる。
This phenomenon will be described with reference to FIG. Consider a state in which a sphere 83 is simply coupled to the crystal resonator 8 as shown in FIG. It is assumed that the mass of the crystal resonator 8 is M and the mass of the sphere 83 is m, and the vibrations of the crystal resonator 8 and the sphere 83 are spring vibrations having spring constants K and k, respectively. Since the crystal unit 8 and the sphere 83 are coupled, resonance occurs in a state where two springs are coupled in series as shown in FIG.
In the liquid phase, since the liquid is interposed between the
更に水晶振動子4を発振させる場合に、水晶振動子4が液相に接している場合には液相の粘性などの影響によりクリスタルインピーダンス(CI値)が大きくなり、発振がしにくい。例えば、図15に示すように、まず時刻t1にて感知センサ2に緩衝液を供給して、励振電極42A、42Bが液相に接するようにした後、発振周波数の測定を行う。その後、試料液50、増感体粒子82を含んだ液91及び架橋剤を含んだ液92を供給して、発振周波数の測定を行い、発振周波数の変化量を求めた場合について説明する。
Further, when the
この場合における試料液50、増感体粒子82を含んだ液91及び架橋剤を含んだ液92の供給を行う前後の第1の振動領域61の周波数の変化量は、液相下において水晶振動子4の発振周波数から増感体粒子82、ビオチン化抗体80、抗原81の付着による質量付加効果により低下した周波数となる。しかしながら励振電極42A、42Bが液相に接した状態では発振が弱くなるため、図7に示した励振電極42A、42Bが気相に接した状態で発振させたときと比較して、周波数差の変化量は少なくなる。従って、励振電極42A、42Bが気相に接した状態で発振することで、質量付加効果による周波数の変化量が検出しやすくなる。
In this case, the amount of change in the frequency of the
また励振電極42A、42Bの表面を液相にして、計測を行う場合には液を供給流路57に注入する際のインジェクションショックなどの励振電極42A、42Bが液相に曝されることに起因するノイズを除去することができる。従って供給流路57内を気相に置換して、励振電極42A、42Bが液相に接しないようにすることで、クリスタルインピーダンスの低下が抑制され、発振周波数の測定誤差が抑制される。
Further, when measurement is performed with the surfaces of the
また励振電極42A、42Bに液滴が付着すると液滴の質量付加効果により発振周波数が低下するおそれがある。純水を気化しやすいメタノール94に置換することで供給流路57から液体成分を吸引した後も、液滴が残らず発振周波数の測定精度が上がる。
また試料液50と、ビオチン化抗体を含む液90と、増感体粒子を含む液91と、は、予め混合して感知センサ2に供給してもよく、さらに当該混合液に架橋剤を含む液92も混合した後、感知センサ2に供給するようにしてもよい。
Further, when a droplet adheres to the
The
あるいは増感体粒子を含む液91を感知センサ2に供給した後、架橋剤を含む液92を加えなくてもよい。この場合には、その後の感知センサ2の表面のせんじょうを穏やかに行うことが望ましく、純水を供給する工程及びエタノールを供給する工程において、それぞれ純水及びエタノールを緩やかに供給して、増感体粒子を吸着層から離脱させないようにすることで同様の効果が得られる。しかしながら洗浄作業を作業者が行う場合には、作業者の熟練度にばらつきがあることから、架橋剤を用いることが好ましく、また洗浄作業を自動で行う場合にも処理を速やかに行う観点から架橋剤を用いることが好ましい。
また増感体粒子を含む液91を加えずに、架橋剤を含む液92のみを加えてもよい。さらに抗体と増感体粒子との間の結合は、ビオチン化抗体とアビジンとの結合を利用した構造に限らず、増感体粒子に直接抗体を付加させた構造であっても良い。また増感体粒子は金コロイドに限らず、ラテックスや磁気ビーズなどでも良い。
Alternatively, after supplying the liquid 91 containing the sensitizer particles to the
Moreover, you may add only the liquid 92 containing a crosslinking agent, without adding the liquid 91 containing a sensitizer particle. Furthermore, the bond between the antibody and the sensitizer particle is not limited to the structure using the bond between the biotinylated antibody and avidin, and may be a structure in which the antibody is directly added to the sensitizer particle. The sensitizer particles are not limited to gold colloid but may be latex or magnetic beads.
本発明の実施の形態に係る感知方法の効果を確認するために以下の試験を行った。
実施例として100ng/mlの抗原を含む試料液を用い、実施の形態に示した工程において、試料液、ビオチン化抗体を含む液及び増感体粒子を含む液を予め混合して、感知センサに注入し、上述の実施例と同様の処理を行い発振周波数の測定を行った。
比較例として、実施例の抗原を含む溶液を供給前であって、供給流路が緩衝液で満たされているときと、増感体粒子の供給後であって、架橋剤の供給前とにおいて発振周波数の測定を行い周波数の変化量を求めた。
In order to confirm the effect of the sensing method according to the embodiment of the present invention, the following test was performed.
As an example, a sample solution containing an antigen of 100 ng / ml is used, and in the process shown in the embodiment, a sample solution, a solution containing a biotinylated antibody, and a solution containing sensitizer particles are mixed in advance to form a sensor. The oscillation frequency was measured by performing the same processing as in the above-described embodiment.
As a comparative example, before supplying the solution containing the antigen of Example, when the supply channel is filled with a buffer solution, after supplying the sensitizer particles and before supplying the cross-linking agent The oscillation frequency was measured to determine the amount of change in frequency.
比較例では、試料溶液の供給の前後における周波数の変化量は29Hzであったが、実施例においては、周波数変化量は1021Hzであった。よって試料溶液を通流させた後、電極の表面を気相化した後発振周波数の測定を行うことで、周波数変化量が35倍程度大きくなり検出感度がよくなるといえる。従って本発明の実施の形態に係る感知方法を用いることにより大きな効果を得ることができるといえる。 In the comparative example, the amount of change in frequency before and after the supply of the sample solution was 29 Hz, but in the example, the amount of change in frequency was 1021 Hz. Therefore, it can be said that the measurement sensitivity is improved by increasing the frequency change amount by about 35 times by measuring the oscillation frequency after allowing the sample solution to flow and then vaporizing the electrode surface. Therefore, it can be said that a great effect can be obtained by using the sensing method according to the embodiment of the present invention.
2 感知センサ
4 水晶振動子
10 スポンジ
12 発振回路ユニット
13 本体部
42A、42B 励振電極
46 吸着層
47 供給流路
63 第1の発振回路
64 第2の発振回路
80 ビオチン化抗体
81 抗原
82 増感体粒子
2
Claims (6)
前記圧電振動子を発振回路により発振させて、前記測定領域を液相とする前の発振周波数を測定する工程と、
次いで前記測定領域に試料液を供給する工程と、
その後前記測定領域から液体を除去して当該測定領域を気相とする工程と、
しかる後、前記圧電振動子を発振回路により発振させて発振周波数を測定し、当該発振周波数と前記測定領域を液相とする前の発振周波数との周波数変化量を測定する工程と、を含むことを特徴とする感知方法。 Using a sensing sensor that forms an adsorption layer on the electrode surface of the piezoelectric vibrator that adsorbs the component to be sensed in the sample liquid, supplying the sample liquid to the measurement area of the sensing sensor, and adsorbing the amount of the component In the sensing method to measure the frequency change amount of the front and rear piezoelectric vibrators,
Oscillating the piezoelectric vibrator by an oscillation circuit and measuring an oscillation frequency before the measurement region is in a liquid phase;
Next, supplying a sample solution to the measurement region;
Thereafter, removing the liquid from the measurement region to make the measurement region a gas phase,
Thereafter, the step of oscillating the piezoelectric vibrator with an oscillation circuit to measure the oscillation frequency and measuring the amount of change in frequency between the oscillation frequency and the oscillation frequency before making the measurement region a liquid phase is included. Sensing method characterized by.
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