JP2016059369A

JP2016059369A - 細胞培養基材、細胞培養基材の製造方法、細胞培養方法、及び細胞培養装置

Info

Publication number: JP2016059369A
Application number: JP2014192763A
Authority: JP
Inventors: 守相澤; Mamoru Aizawa; まり子中村; Mariko Nakamura; マリ子中村; 清貴山田; Kiyotaka Yamada; 重徳永井; Shigenori Nagai
Original assignee: Meiji University
Current assignee: Meiji University
Priority date: 2014-09-22
Filing date: 2014-09-22
Publication date: 2016-04-25
Anticipated expiration: 2034-09-22
Also published as: JP6474219B2

Abstract

【課題】免疫細胞等の細胞を培養可能な細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び細胞培養装置を提供する。
【解決手段】１）少なくとも表面に、イノシトールリン酸４、又はその塩が結合された金属化合物２を有する細胞培養基材１。２）金属化合物に、イノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させる前記細胞培養基材の製造方法。３）前記細胞培養基材に細胞を接触させて、前記細胞を培養する細胞培養方法。４）前記細胞培養基材と、前記細胞培養基材を収容するための培養槽とを備えた細胞培養装置。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養基材、細胞培養基材の製造方法、細胞培養方法、及び細胞培養装置に関する。

現在、日本人の死亡原因の第一位は悪性新生物 (がん) である。がんの治療法としては外科的療法、化学療法、放射線療法といった三大療法が主に用いられているが、これらの療法には人体への悪影響や副作用が報告されており、患者の生活の質 (Quality of Life; QOL) の低下が懸念されている。そこで、QOL 向上が期待されるがんの治療法として、現在「免疫療法」が注目されている。この療法は人体への副作用が少ないことやがんの部位を選ばないことなどで新規のがん治療法として期待されている。
考案されている免疫療法としては、大きく２種類の免疫療法に分類されている。１つは、「能動免疫療法」と呼ばれ、患者の体にサイトカインや免疫賦活剤を取り入れることで免疫細胞を活性化させ、がんを治療する方法である。
もう一方の免疫療法は、「養子免疫療法」と呼ばれ、患者自身の免疫細胞を体外で培養、増殖、又は活性化し、患者にその免疫細胞を戻すことで、体内の免疫細胞を活性化させがんを治療する方法である。養子免疫療法には、高額なサイトカインを利用することなく、患者の回復力を増強させて病気を治癒させることが可能であるという利点がある。そのため、免疫細胞を体外で培養可能であり、免疫賦活作用を備えた細胞培養基材の登場が求められている。

イノシトールリン酸は、イノシトールの水酸基がリン酸化されたものである。イノシトールリン酸としては、リン酸エステル化された水酸基の数により、イノシトール一リン酸（ＩＰ）、イノシトール二リン酸（ＩＰ_２）、イノシトール三リン酸（ＩＰ_３）、イノシトール五リン酸（ＩＰ_５）、イノシトール六リン酸（ＩＰ_６）（フィチン酸とも呼ばれる）が知られている。イノシトール六リン酸 (inositol hexaphosphate; IP₆)は、抗がん作用や免疫細胞を活性化させる機能を有するということが報告されている（非特許文献１）。

A.M. Shamsuddin, I. Vucenik, K. E. Cole, Life Science, 61, 343-354 (1997).

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、免疫細胞等の細胞を培養可能な細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び細胞培養装置の提供を課題とする。

本発明は、下記の特徴を有する細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び細胞培養装置を提供するものである。

（１）少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有する細胞培養基材。
（２）前記金属化合物が第２族元素を含むセラミックスである前記（１）に記載の細胞培養基材。
（３）前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物である前記（１）又は（２）に記載の細胞培養基材。
（４）前記イノシトールリン酸がイノシトール六リン酸である前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の細胞培養基材。
（５）金属化合物に、イノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させる前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の細胞培養基材の製造方法。
（６）前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の細胞培養基材に細胞を接触させて、前記細胞を培養する細胞培養方法。
（７）前記細胞が免疫細胞である前記（６）に記載の細胞培養方法。
（８）前記免疫細胞がＴ細胞である前記（７）に記載の細胞培養方法。
（９）前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の細胞培養基材と、前記細胞培養基材を収容するための培養槽とを備えた細胞培養装置。

本発明によれば、免疫細胞等の細胞を培養可能な細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び上記細胞培養基材を備えた細胞培養装置を提供できる。

本発明に係る細胞培養基材の一実施形態を示す模式図である。本発明に係る細胞培養基材の一実施形態を示す模式図である。本発明の細胞培養方法と別法の細胞培養の様子の一例を示す模式図である。本発明の細胞培養装置の一実施形態を示す構成図である。実施例において、水酸アパタイト（ＨＡｐ）セラミックスの表面粗さ及び相対密度を測定した結果を示すグラフである。実施例において、ＩＰ_６を表面修飾したＨＡｐセラミックス（ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックス）のＸ線回折（ＸＲＤ）の分析を行った結果を示すグラフである。実施例において、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）の分析を行った結果を示すグラフである。実施例において、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）の分析を行い、ナロースペクトルを比較した結果を示すグラフである。実施例において、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）の分析を行い、ナロースペクトルを比較し、さらにピーク分離を行った結果を示すグラフである。実施例において細胞培養を行った際の、ヘルパーＴ細胞の増減率の結果を示すグラフである。実施例において細胞培養を行った際の、キラーＴ細胞の増減率の結果を示すグラフである。

≪細胞培養基材≫
本実施形態の細胞培養基材は、少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有するものである。

イノシトールリン酸は、イノシトール（１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサオール）の６つの水酸基の少なくとも１つがリン酸エステル化されたものである。本実施形態では、水酸基の３つ以上がリン酸エステル化されたイノシトールリン酸が好ましく、水酸基の４つ以上がリン酸エステル化されたイノシトールリン酸がより好ましく、イノシトールの水酸基全部がリン酸エステル化されたフィチン酸（イノシトール六リン酸、ＩＰ_６）が最も好ましい。イノシトールリン酸を単独で使用しても、２種以上を混合して使用してもよい。

また、免疫賦活作用を有するものであれば、イノシトールリン酸の塩であっても、イノシトールリン酸と同様に本実施形態の細胞培養基材の構成要素としてもよい。
イノシトールリン酸の塩としては、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が好ましく、ナトリム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等が挙げられ、より好ましくはナトリム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩である。これらの中でも、特に好ましくはイノシトール六リン酸ナトリウム塩、イノシトール六リン酸カリウム塩である。なお、イノシトール六リン酸ナトリウム塩には、結晶水含有量の異なる水和物が知られているが、いずれも好ましく用いることができる。また、イノシトールリン酸の塩を単独で使用しても、２種以上を混合して使用してもよい。

上記金属化合物は、金属元素を含む化合物であり、有機金属化合物であっても、無機金属化合物であってもよく、好ましくは無機金属化合物である。イノシトールリン酸は、強いキレート作用を有する。イノシトール六リン酸は、様々な金属イオンと、キレート結合を形成することが知られている。イノシトール六リン酸と、キレート結合を形成することが知られている金属イオンとして、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、銀イオン、鉄イオン、亜鉛イオン等がある。したがって、金属化合物とイノシトールリン酸とはキレート結合により結合し得る。

上記金属化合物に含まれる金属元素は、第２族元素であることが好ましい。第２族元素とは、周期表の第２族に分類される元素であり、例えば、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムが挙げられ、カルシウムが好ましい。
また、上記金属化合物は、セラミックスであることが好ましい。セラミックスは安定な材料であり、滅菌操作が容易である。滅菌操作により微生物等のコンタミネーションの恐れを低減できることは、細胞培養基材として大変に有用である。
したがって、前記金属化合物としては、第２族元素を含むセラミックスであることがより好ましい。

また、上記金属化合物は、リン酸カルシウム系化合物であることが好ましい。代表的なリン酸カルシウム系化合物として、水酸アパタイト（Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂;ＨＡｐ）、α―リン酸三カルシウム、β―リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ニ水素カルシウム、非結晶リン酸カルシウム、フルオロアパタイトが挙げられ、好ましくは水酸アパタイト、α―リン酸三カルシウム、β―リン酸三カルシウムであり、より好ましくは水酸アパタイトである。なお、アパタイトとはリン酸塩の無機質結晶物質であり、生体適合性に優れる。

本実施形態の細胞培養基材が有する前記金属化合物としては、カルシウムを構成元素とするリン酸カルシウム系化合物のセラミックスであることがより好ましい。前記金属化合物を、カルシウムを構成元素とするリン酸カルシウム系化合物のセラミックスとすることにより、滅菌容易性、免疫細胞培養性能、及びイノシトールリン酸結合性能に優れる細胞培養基材とすることができる。更には、高い生体適合性を有することから、水酸アパタイトのセラミックスであることがさらに好ましい。

細胞培養基材の形状は特に制限されず、粒状、微粒子状、シート状、板状、円板状、棒状、円柱状、多角柱状などいずれの形状であってもよい。少なくとも表面にイノシトールリン酸、又はその塩が結合された金属化合物を有するものであれば、例えば、細胞培養基材全体が該金属化合物で構成され、その表面にイノシトールリン酸、又はその塩が結合されたものでもよく、基材表面層が該金属化合物で構成され、基材内部は該金属化合物以外のもので構成されていてもよい。
細胞培養基材は緻密体であっても、多孔質であってもよい。多孔質である場合、少なくとも表面にイノシトールリン酸、又はその塩が結合された金属化合物を有するものであれば、孔内部にイノシトールリン酸が配置されていてもよい。

図１は、本発明に係る細胞培養基材の一実施形態を示す模式図である。細胞培養基材１は、円板状の金属化合物２に、イノシトールリン酸４が結合した構造になっている。
図２は、本発明に係る細胞培養基材の一実施形態を示す模式図である。細胞培養基材１１は、中心層１３の表面に水酸アパタイト（Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂）層１２が形成されており、水酸アパタイト層１２に、イノシトールリン酸４が結合した構造になっている。

上記図１及び上記図２に示されるように、本発明に係る細胞培養基材は、少なくとも表面にイノシトールリン酸が結合された金属化合物を有するので、細胞培養を行うために該細胞培養基材と細胞とを接触させると、細胞はイノシトールリン酸と接触し、効率的に細胞が活性化され、免疫が賦活化され得る。

≪細胞培養基材の製造方法≫
本発明の細胞培養基材の製造方法は、金属化合物に、イノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させるものである。

イノシトールリン酸を含有する溶液は、水、各種緩衝液等の液とイノシトールリン酸とを混合することにより得られる。イノシトールリン酸を含有する溶液のｐＨは、ｐＨ６〜８程度とすればよい。

イノシトールリン酸を含有する溶液中のイノシトールリン酸の濃度は、５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上であることが好ましく、２５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上であることがより好ましい。溶液中のイノシトールリン酸の濃度の上限は特に制限されず、飽和濃度とすればよい。ただし、後述する実施例において、金属化合物を３０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上のイノシトールリン酸を含有する溶液に浸漬させたとき、金属化合物へのイノシトールリン酸の結合量が飽和していると考えられる傾向がみられたことから、イノシトールリン酸を含有する溶液中のイノシトールリン酸の濃度は、５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上６０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以下であることが好ましく、２５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上６０００ｐｐｍ以下であることがより好ましく、２５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上４０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以下であることがさらに好ましい。

金属化合物に、イノシトールリン酸を含有する溶液を接触させる方法は、特に制限されず、金属化合物にイノシトールリン酸を含有する溶液を塗布する、金属化合物にイノシトールリン酸を含有する溶液を噴霧する、イノシトールリン酸を含有する溶液に金属化合物を浸漬する等の方法が挙げられる。

上記に挙げた方法のなかでは、イノシトールリン酸を含有する溶液に金属化合物を浸漬することが好ましい。この場合、イノシトールリン酸を含有する溶液に金属化合物を浸漬する時間は、０．１時間〜１００時間が好ましく、１時間〜７５時間がより好ましく、１０時間〜５０時間がさらに好ましい。イノシトールリン酸を含有する溶液の温度は、１０℃〜６０℃が好ましく、より好ましくは２０℃〜５０℃であり、特に好ましくは３０℃〜４０℃である。
イノシトールリン酸を含有する溶液中に金属化合物を浸漬する方法は特に制限されず、例えば、水中に金属化合物を浸漬した後に該水中にイノシトールリン酸を添加する方法、水にイノシトールリン酸を添加した後に該水中に金属化合物を浸漬させる方法等が例示できる。
上記浸漬の状態は特に制限されず、例えば、該溶液中で金属化合物を静置すること、該溶液中で金属化合物を撹拌すること、該溶液中で静置された金属化合物に対して溶液を撹拌すること等の方法により行うことが挙げられる。

金属化合物にイノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させると、イノシトールリン酸が金属化合物に含まれる金属元素とキレート結合を形成し、金属化合物表面にイノシトールリン酸が結合される。

本発明の細胞培養基材の製造方法は、金属化合物にイノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させて得られた基材から、金属化合物と結合していないイノシトールリン酸又はその塩を取り除くための洗浄工程を有していてもよい。当該製造方法において、当該洗浄工程を有している方法が、金属化合物と結合していない、高濃度のイノシトールリン酸による細胞の活性化の阻害を防止する観点から好ましい。
洗浄工程としては、例えば、金属化合物にイノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させて得られた基材に、イノシトールリン酸を含まない液、又は金属化合物に接触させた上記溶液よりも低いイノシトールリン酸濃度の溶液に浸漬させることが挙げられ、イノシトールリン酸を含まない液としては、水、各種緩衝液等を例示できる。

上記イノシトールリン酸に係る説明は、上記イノシトールリン酸の塩についても同様である。

≪細胞培養方法≫
本発明の細胞培養方法は、本発明の細胞培養基材に細胞を接触させて、前記細胞を培養するものである。本発明の細胞培養基材に細胞を接触させることで、細胞培養基材の金属化合物に結合された前記イノシトールリン酸又はその塩に細胞が接触することとなる。

図３は、本発明の細胞培養方法と別法とにおける、細胞培養の様子の一例を模式的に示した図である。図３（ａ）は、イノシトールリン酸を含有する液体培地中で、細胞培養を行う場合を示す。図３（ｂ）は、本発明の細胞培養方法の一例であり、イノシトールリン酸が結合された金属化合物を有する細胞培養基材上で、細胞培養を行う場合を示している。

発明者らは、後述する参考例３〜１２において示されるように、図３（ａ）に示すような培養系を用いて、イノシトールリン酸を含有する液体培地中で細胞を培養したとき、本発明の細胞培養方法に比べて細胞培養系（細胞培養液）に存在するイノシトールリン酸の濃度が高くなければ、良好な細胞の培養が達成されないことを見出した。また細胞培養系（細胞培養液）に存在するイノシトールリン酸の濃度が高すぎることで、むしろ細胞の良好な培養が妨げられる場合があることを、本願で初めて明らかにした。
これに対して、発明者らは、図３（ｂ）に一例として示す本発明の細胞培養方法では、イノシトールリン酸が結合されている基材上で細胞を培養することで、図３（ａ）に示すような培養系と比べて、基材に結合された少量のイノシトールリン酸によって良好な細胞の培養が達成されることを見出した。また、少量のイノシトールリン酸の使用であっても良好な細胞の培養が達成されることから、細胞の培養が妨げられるおそれもない。図３（ｂ）に示すような培養系における細胞培養基材の表面に結合されたイノシトールリン酸の量は、ＨＡｐ粉体に対するＩＰ_６の飽和吸着量０．４２７ｍｇ・ｍ^−２を用いて計算すると、直径１５ｍｍ、厚さ 1 ｍｍのセラミックスを利用した場合、約９５ｎｇとなる。

上記の細胞培養における、細胞とイノシトールリン酸との関係を考察する。
図３（ａ）に示すような培養系では、培養液中にイノシトールリン酸が溶解している。このとき細胞は、培養液中に溶解するイノシトールリン酸と、次々に接触すると考えられる。細胞がイノシトールリン酸との反応により細胞が活性化される一方で、高濃度のイノシトールリン酸との反応により細胞の活性化が阻害されると考えられる。そして、このことが細胞培養液に存在するイノシトールリン酸の濃度が高くなければ、良好な細胞の培養が達成されないこと、及び、イノシトールリン酸の濃度が高すぎることで、細胞の良好な培養が妨げられることが生じるものと考えられる。
これに対して、図３（ｂ）に示すような培養系では、イノシトールリン酸が表面に結合されている基材を用いている。このとき細胞は、基材表面のイノシトールリン酸と接触するので、細胞は培養系に適量のイノシトールリン酸が存在しているものと感知することができ、更にはイノシトールリン酸との反応による細胞の活性化についても良好な結果を生むものと考えられる。

本発明の細胞培養方法としては、培養対象の細胞及び本発明の細胞培養基材を液体培地中で培養することが挙げられる。培養対象の細胞及び本発明の細胞培養基材を同じ培養液中に共存させることで、細胞が細胞培養基材に接触する。

本発明の細胞培養方法で培養される対象の細胞は特に制限されないが、前記細胞は免疫細胞であることが好ましく、Ｔ細胞であることがより好ましい。
免疫細胞としては、白血球、リンパ球、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、樹状細胞、及びそれらに分化可能な前駆細胞若しくは幹細胞等が挙げられる。

≪細胞培養装置≫
本発明の細胞培養装置は、本発明の細胞培養基材と、前記細胞培養基材を収容するための培養槽とを備える。
図４は、本発明の細胞培養装置の一実施形態を示す構成図である。細胞培養装置２０は、培養槽２５を備え、培養槽の内部に細胞培養基材１が配置されている。細胞培養基材１は、円板状の金属化合物２に、イノシトールリン酸４が結合している。

本実施形態の細胞培養装置２０は、前述の少なくとも表面にイノシトールリン酸が結合された金属化合物を有する細胞培養基材１を有するので、培養槽２５に細胞を添加し、該培養基材と細胞とを接触させると、細胞はイノシトールリン酸と接触し、効率的に細胞が活性化され、免疫が賦活化される。

以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１−１．ＨＡｐセラミックスの作製
ＨＡｐ成形体は既報(Z. Zhuang, T. J. Fujimi, M. Nakamura, T. Konishi, H.Yoshimura and M. Aizawa, Acta Biomaterialia, 9, 6732-6740 (2013).)に従って作製した。ＨＡｐ−１００（太平化学製）１ｇを秤量し、直径２１ｍｍΦ、高さ〜２ｍｍ、成形圧５０ＭＰａの条件で加圧成形し、ＨＡｐ成形体を得た。このＨＡｐ成形体を、温度１２００ ℃、保持時間５時間、昇温速度１０ ℃・ｍｉｎ^−１焼成することでＨＡｐセラミックスを得た。得られたＨＡｐセラミックスは、直径１５〜１６ｍｍ、高さ１〜２ｍｍの円板状であった。
ＨＡｐセラミックスをエタノール中で超音波洗浄し、その後、耐水研磨紙（＃４００，＃１０００，＃２０００の順）で鏡面研磨を行ない、研磨した試料を再度エタノール中で超音波洗浄し、１６０ ℃で１．５時間乾熱滅菌を行なった。

１−１−２．ＨＡｐセラミックスのキャラクタリゼーション
上記超音波洗浄、鏡面研磨、超音波洗浄、及び乾熱滅菌の工程を経たＨＡｐセラミックスの表面粗さ及び相対密度を測定した。表面粗さは、Ｒａ＝約０．１μｍであり、測定機（ミツトヨ社製ＳＵＲＦＴＥＳＴＳＶ−３１００ＪＩＳＢ０６０１：２００１）を用いて行った。相対密度は、製造した上記ＨＡｐセラミックスのかさ密度を測定し、ＨＡｐセラミックスのかさ密度の理論値３．１６ｇ／ｃｍ³を１００％として算出した。
結果を図５に示す。鏡面研磨により、ＨＡｐセラミックスサンプル間での誤差が少ない均一な表面にすることができた。また、ＨＡｐセラミックスは、相対密度が９７．７１％の緻密体であることがわかった。

１−２．ＩＰ_６溶液の調製
５０重量％ＩＰ_６溶液を、ＩＰ_６の濃度がそれぞれ１０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ），２０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ），３０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ），５０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）となるように希釈し、ＮａＯＨ水溶液で、ｐＨをすべて７．３に調整して、上記各濃度のＩＰ_６溶液を得た。なお細胞培養実験に用いたＩＰ_６溶液は０．２μｍ滅菌フィルターで滅菌を行なった。

１−３．ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスの作製
（実施例１）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１２ｗｅｌｌｐｌａｔｅを用い、上記１−２．項で得られた１０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液３ｃｍ^３に浸漬させた。
浸漬は３７ ℃，５％ＣＯ_２雰囲気のインキュベーター内で、２４時間行なった。浸漬後は滅菌した超純水により３回洗浄し、乾燥後培養基材とした。作製したＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを、浸漬させたＩＰ_６溶液の濃度に応じて「ＩＰ_６−ＨＡｐ（１０００）」、と表記する。

（実施例２）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液の代わりに、上記１−２．項で得られた２０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液３ｃｍ^３に浸漬させた以外は、上記実施例１と同様にして、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを作製した。作製したＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを、浸漬させたＩＰ_６溶液の濃度に応じて「ＩＰ_６−ＨＡｐ（２０００）」と表記する。
（実施例３）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液の代わりに、上記１−２．項で得られた３０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液３ｃｍ^３に浸漬させた以外は、上記実施例１と同様にして、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを作製した。作製したＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを、浸漬させたＩＰ_６溶液の濃度に応じて「ＩＰ_６−ＨＡｐ（３０００）」と表記する。
（実施例４）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液の代わりに、上記１−２．項で得られた５０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液３ｃｍ^３に浸漬させた以外は、上記実施例１と同様にして、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを作製した。作製したＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを、浸漬させたＩＰ_６溶液の濃度に応じて「ＩＰ_６−ＨＡｐ（５０００）」と表記する。

（参考例１）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液の代わりに、０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ_６溶液として滅菌した超純水３ｃｍ^３に浸漬させた以外は、上記実施例１と同様にして、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを作製した。作製したＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを、「ＩＰ_６−ＨＡｐ（０）」と表記する。

２．ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスのキャラクタリゼーション
ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスの結晶構造を確認するため、Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いて分析を行なった。図６にＸＲＤにて得られたスペクトルを示す。実施例１〜４の全てのセラミックスにおいて、ＨＡｐ単一相であることが確認された。

ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックス表面のＩＰ_６の存在を確認するため、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いて化学状態分析を行なった。図７にＸＰＳにおけるワイドスペクトルを示す。全てのサンプルにおいて、ＨＡｐに起因するＣａ、Ｐ及びＯのピークが確認された。
さらに、炭素のピークに注目し、各サンプルのナロースペクトルを比較したもの図８に示す。それぞれのスペクトルはＣ１ｓで確認された表面にコンタミネーションするハイドロキシカーボンの値（２８５．２ｅＶ）を基準値とし、その値でサンプルのチャージアップを補正した。
また、ナロースペクトルはガウス−ローレンツ複合関数を用いてピーク分離を行なった。ピーク分離前後のＩＰ_６−ＨＡｐ（５０００）のナロースペクトルを図９に示す。不純物およびＩＰ_６の分子構造中に存在するＣ−ＣおよびＣ−Ｈ結合由来であると思われるＣ１ｓの大きなピークの左側に重なった小さなピークが観測された。このピークはＣ−Ｏ結合由来のものであると考えられ、これはＩＰ_６の分子構造中に存在するＣ−Ｏ結合由来のものであるといえる。したがって、実施例１〜４の全てのＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスで、ＩＰ_６がＨＡｐセラミックス上に存在しているものと推定される。

上記ＨＡｐセラミックス上に存在するＩＰ_６の量をＨＡｐ粉体に対するＩＰ_６の飽和吸着量０．４２７ｍｇ・ｍ^−２を用いて計算すると、約９５ｎｇとなった。

３．マウス由来脾臓細胞のＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスにおける培養
（実施例５）
１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ・ｃｍ^−３のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を上記１−３．項で得られたＩＰ_６−ＨＡｐ（１０００）上に播種し、１日後にフローサイトメーターを用いて、脾臓細胞の割合を調査した。コントロールとして２４ｗｅｌｌのポリスチレンプレートを使用した。上記脾臓細胞にLive/Dead細胞染色（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を行い、取り分けた生細胞に対して下記抗体と反応させ、細胞を分別した。
抗体は、Ｔ細胞の表面マーカーとして抗ＣＤ３抗体（ＢＤ製）、成熟Ｔ細胞のヘルパーサブセットマーカーとして抗ＣＤ４抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ製）、Ｂ細胞の表面マーカーとして抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ製）および成熟Ｔ細胞の細胞障害性サブセットマーカーとして抗ＣＤ８抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用した。

（実施例６）
ＩＰ_６−ＨＡｐ（１０００）に代えて、上記ＩＰ_６−ＨＡｐ（２０００）上にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を播種した以外は、実施例５と同様にして、培養を行った。
（実施例７）
ＩＰ_６−ＨＡｐ（１０００）に代えて、上記ＩＰ_６−ＨＡｐ（３０００）上にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を播種した以外は、実施例５と同様にして、培養を行った。
（実施例８）
ＩＰ_６−ＨＡｐ（１０００）に代えて、上記ＩＰ_６−ＨＡｐ（５０００）上にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を播種した以外は、実施例５と同様にして、培養を行った。
（参考例２）
ＩＰ_６−ＨＡｐ（１０００）に代えて、上記ＩＰ_６−ＨＡｐ（０）上にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を播種した以外は、実施例５と同様にして、培養を行った。

結果をコントロールにおける細胞の割合に対する増減率として表１に示す。

表１中の細胞の増減率は、上記コントロールの細胞を基準として、以下の式により算出した。

表１に示される結果から、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞の増加率がＩＰ_６−ＨＡｐ（３０００）およびＩＰ_６−ＨＡｐ（５０００）において顕著に高くなっていることがわかる。

Ｂ細胞については、Ｔ細胞と逆の傾向を示した。これは、サンプル中に占めるＢ細胞の割合がコントロールと比較して相対的に減少したことを示すものであり、Ｔ細胞の割合増加の結果とも考えられる。
ＩＰ_６−ＨＡｐ（０）においてヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞の割合が上記コントロールよりも増加しているのは、ＨＡｐセラミックスの細胞に対する親和性に加えて、ＨＡｐセラミックスから僅かに溶出されるカルシウムイオンが、細胞の培養効率を高めた結果であると考えられる。

４．ＩＰ_６含有培地におけるマウス由来脾臓細胞の応答性
（参考例３）
実験方法
培地の調製
培地にはＲＰＭＩ培地を用いた。ＲＰＭＩ培地はＲＰＭＩ５．２０ｇ，ペニシリン０．０３５ｇ，ストレプトマイシン０．０７０ｇ，メルカプトエタノール１．７６９ μｌを５００ｃｍ^３の超純水に加え撹拌したのちＮａＨＣＯ_３０．８ｇを加え、ｐＨを調整しＦＢＳを５５ｃｍ^３加えたものを用いた。
また、ＲＰＭＩ培地１０ｃｍ^３中に５ｖｏｌ％以内でＩＰ_６溶液を加え、ＩＰ_６濃度が１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）となるように、ＩＰ_６含有培地を調製した。

マウス脾臓細胞の培養
１２週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ）１匹をジエチルエーテルで屠殺し、脾臓を４ ℃に冷却したＲＰＭＩ培地（６ｃｍシャーレ）に取り出した。滅菌したナイロンメッシュシートにはさみ、潰すことで脾臓細胞を取り出し、１５ｍｌ遠沈管にナイロンメッシュシートを通して移した。培地をシャーレに加え細胞を遠沈管に２回洗い込んだ。ＡｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎを加え、５分間赤血球をバーストさせ、２倍量のＰＢＳを加え１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４ ℃で遠心分離する操作を２回行なうことで赤血球を取り除いた。ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地を加え懸濁液を調製し、懸濁液をトリパンブルーで１０倍希釈し、血球計数盤を用いて細胞数を求めた。
１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁液を調製し、２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種した。３７ ℃，５％ＣＯ_２雰囲気のインキュベーター内で２４時間培養したのち、上記３．項と同様にＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞染色を行い、抗体と反応させ、フローサイトメーターにより解析を行なった。

（参考例４）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を５０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例５）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を１００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例６）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を１５０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例７）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を３００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例８）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例９）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を１０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例１０）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を２０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例１１）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を３０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例１２）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を４０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例１３）
ＩＰ_６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地に代えて、ＩＰ_６を５０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ_６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。

結果を図１０及び図１１に示す。図１０のグラフの縦軸は、播種した細胞の培養1日後のコントロールにおけるヘルパーＴ細胞の割合に対する、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックス上又はＩＰ_６含有培地中で培養後のヘルパーＴ細胞の増減率である。上記３．項の参考例２及び実施例５〜８でのＩＰ_６−ＨＡｐセラミックス上で培養されたヘルパーＴ細胞の増減率の結果を図１０（ａ）に、参考例３〜７及び参考例９〜１３でのＩＰ_６含有培地中で培養されたヘルパーＴ細胞の増減率の結果を図１０（ｂ）に示す。
ＩＰ_６含有培地中で細胞を培養させた場合、ＩＰ_６濃度が３０００ｐｐｍの条件のとき、細胞の増減率が１２％程度であった。ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックス上で細胞を培養させた場合、ＩＰ_６−ＨＡｐ（３０００）を用いたとき、細胞の増減率が約１４％であり、培地中とほぼ同程度の値であった。しかし、ＩＰ_６−ＨＡｐ（３０００）は、ＩＰ_６濃度が３０００ｐｐｍのＩＰ_６溶液に浸漬させて得られた基材であるので、実際にＩＰ_６―ＨＡｐ（３０００）に結合しているＩＰ_６の総量は、３０００ｐｐｍでＩＰ_６を含有するＩＰ_６含有培地中のＩＰ_６の総量と比較して、極めて少量である。
したがって、ＩＰ_６が結合されたＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスを用いることで、ＩＰ_６含有培地を使用した場合と比較して、少量のＩＰ_６の使用で同程度の効果が得られることがわかる。

上記３．項又は上記４．項において培養した脾臓細胞に対して、Live/Dead細胞染色を行った結果を示す。ＩＰ_６含有培地で、ＩＰ_６濃度が、１０，５０, １００，１５０，３００, １０００, ２０００，３０００，４０００，５０００ｐｐｍの各条件で培養された細胞全体における生細胞の割合は、平均で４９．１５％であった。
対して、ＩＰ_６−ＨＡｐ（０）、ＩＰ_６−ＨＡｐ（１０００）、ＩＰ_６−ＨＡｐ（２０００）、ＩＰ_６−ＨＡｐ（３０００）、ＩＰ_６−ＨＡｐ（５００００）の各条件で培養された細胞全体における生細胞の割合は、平均で７３．４６％であった。
したがって、ＩＰ_６‐ＨＡｐセラミックス上では、ＩＰ_６含有培地中よりも、細胞の生存率が高まっており、良好に細胞を培養可能であることが分かる。

図１１のグラフの縦軸は、播種した細胞の培養1日後のコントロールにおけるキラーＴ細胞の割合に対する、ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックス上又はＩＰ_６含有培地中で培養後のキラーＴ細胞の増減率である。上記３．項の参考例２及び実施例５〜８でのＩＰ_６−ＨＡｐセラミックス上で培養されたキラーＴ細胞の増減率の結果を図１１（ａ）に、参考例３〜１３でのＩＰ_６含有培地中で培養されたキラーＴ細胞の増減率の結果を図１１（ｂ）に示す。
ＩＰ_６−ＨＡｐセラミックス上で細胞を培養させた場合、ＩＰ_６―ＨＡｐ（３０００）を用いたときの細胞の増減率が約１０％であった。しかし、ＩＰ_６含有培地中で細胞を培養させた場合では、ＩＰ_６濃度が５０００ｐｐｍの条件のとき、細胞の増減率がマイナス１５％程度と著しく低下していた。
この結果から、高すぎるＩＰ_６濃度は、細胞死を誘発する傾向にあることがわかる。ＩＰ_６がＨＡｐに結合されたＩＰ_６−ＨＡｐセラミックスでは、実際にＩＰ_６―ＨＡｐ（３０００）に結合しているＩＰ_６の総量は、極めて少量であるため、このような細胞死を誘発するリスクが低く、良好に細胞を培養できることが分かる。

以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

本発明によれば、免疫細胞を培養可能であり、免疫賦活作用を備えた細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び上記細胞培養基材を備えた細胞培養装置を提供できる。

１，１１…細胞培養基材、２…金属化合物、１２…水酸アパタイト層、１３…中心層、４…イノシトールリン酸、２０…細胞培養装置、２５…培養槽

Claims

少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有する細胞培養基材。
前記金属化合物が第２族元素を含むセラミックスである請求項１に記載の細胞培養基材。
前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物である請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
前記イノシトールリン酸がイノシトール六リン酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
金属化合物に、イノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させる請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養基材の製造方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養基材に細胞を接触させて、前記細胞を培養する細胞培養方法。
前記細胞が免疫細胞である請求項６に記載の細胞培養方法。
前記免疫細胞がＴ細胞である請求項７に記載の細胞培養方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養基材と、前記細胞培養基材を収容するための培養槽とを備えた細胞培養装置。