JP2016049109A - 大腸菌の遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット - Google Patents
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Abstract
【課題】実際の産業（医療現場）利用に適した大腸菌の流行クローン同定法および／又は菌株識別法を提供すること、およびそれに用いるプライマーセットを提供すること。【解決手段】大腸菌の染色体上の、（１）genomic isletを構成するORFおよび（２）genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより流行クローン同定を行うステップを含む、大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。【選択図】なし
Description
本発明は、大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別法ならびにこれに用いるプライマーセットに関する。
大腸菌は、下痢症や尿路感染症など多様な感染症の原因として重要な病原細菌である。大腸菌の中には、食中毒の原因菌で有り、溶血性尿毒症症候群など重篤な感染症の原因ともなる腸管出血性大腸菌や、院内感染の原因となる第3世代セファロスポリン耐性を獲得した基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ESBL）産生大腸菌など、集団感染に関連しやすいグループも存在する。
病原性の高い大腸菌としてはO157をはじめとした腸管出血性大腸菌が挙げられ、ESBL産生菌が多いグループとしてはsequence type 131（ST131）の大腸菌が挙げられる。腸管出血性大腸菌や薬剤耐性菌は散発的に見られる感染症に加えて、食中毒や院内感染といった集団感染の原因となることが多く、感染管理が重要で、感染ルートの特定も必要とされる。
その一方、大腸菌は多様な遺伝的バックグラウンドの株が存在し、腸管病原性大腸菌とされるグループだけでも数十種類の血清型が挙げられ、血清型が異なる株はsequence typeが異なることが多い。
食中毒や院内感染が疑われる場合の感染ルートを特定には、異なる患者から分離された菌株が同一か否かを判定する必要がある。そのために菌株が保有するゲノムの特徴を検出し菌株を特定するが、これを菌株識別あるいは遺伝子型別分類という。
菌の遺伝子型別分類の方法としては、従来、パルスフィールドゲル電気泳動法（以下、PFGEという。）が多用されている。PFGEは菌のゲノムDNAを制限酵素で切断し、その断片の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、識別能力が高く、再現性があることから菌株識別の定法とされる。
菌の遺伝子型別分類の方法としては、従来、パルスフィールドゲル電気泳動法（以下、PFGEという。）が多用されている。PFGEは菌のゲノムDNAを制限酵素で切断し、その断片の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、識別能力が高く、再現性があることから菌株識別の定法とされる。
しかし、PFGEは結果が出るまでに早くても菌株分離同定後３日程度と時間がかかり、検査結果が出たときにはすでに感染拡大が終了していることが多い。また複雑なバンドパターンを比較することにより判定する必要があることに加え、大腸菌のPFGEパターンは変化しやすく同一集団感染由来株であっても時間経過に伴いバンドパターンが変化していることも多く、主観的な要素が入りがちである。そのため同時に泳動した菌株でさえも遺伝子型が同一か否かを判断するには熟練者が必要となる。したがって、異なる時刻または別の実験室で得られたPFGE解析の結果を比較することで、複数の分離株の遺伝子型が同等か否かを判定することは非常に困難である。加えて大腸菌のPFGEパターンは変化しやすく、判定が難しくなる傾向にある。さらに、PFGEは作業が煩雑で作業者の熟練を要するうえ、パルスフィールドゲル電気泳動装置などの特殊な高額の装置を必要とし、試薬などのコストも高い。したがって、より簡便かつ迅速に、幅広く大腸菌を遺伝子型別分類することができる方法の開発が依然として強く望まれている。
PFGEの問題点を克服するために、ゲノムに多コピー存在する、移動性の挿入配列の位置を挿入配列の内側と外側にプライマーを設定し、検出することで、効率よくタイピングする方法が考案されている。挿入配列を用いる方法の実現は、多コピーの挿入配列を保有する菌種またはクローンに限られ、大腸菌では腸管出血性大腸菌O157やO26など、特定のクローンのみ実現可能で有り、加えてO157やO26などといった血清型毎に検出位置を設定する必要があり、汎用性のあるプライマーを設計することは事実上できない。
また、菌株ごとに保有状態が異なるORFを検出し、その保有パターンから菌株識別を行う取り組みもなされている。しかし、文献の方法では腸管出血性大腸菌O157のみ菌株識別可能で、汎用性に乏しい（非特許文献１）。
また、多くの微生物で繰り返し配列を検出することで、効率よくタイピングする方法が考案されている。繰り返し配列は汎用性高く検出系を設計できる一方、タイピング結果の読み取りにはわずかなバンドサイズの違いを正確に決める必要があり、誤判定の原因となりやすい。
また大腸菌ではphylogenetic groupと呼ばれる系統解析も行われる。phylogenetic groupの決定にはchuA、yjaA、TspE4.C2と呼ばれる3つの遺伝子を検出し、その保有パターンから系統解析する。しかしphylogenetic group解析は病原性に関連した4つのグループに大分類することを目的としており、分子疫学解析としては補助的な役割にとどまる（非特許文献２）。
ここまでに記したように大腸菌の菌株識別を汎用的に、迅速かつ容易に実施する方法の開発は困難を極めてきた。
実施、データ管理が容易な分子疫学法として、菌株毎に保有状態が異なる遺伝子の読み枠（ORF）を検出し、その保有パターンから遺伝子型を決める方法が、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、およびアシネトバクターで実現されている（非特許文献３）。黄色ブドウ球菌と緑膿菌においてはORFの保有パターンから遺伝子型を決める方法では、小さな挿入配列であるgenomic isletを構成するORFと、ファージや病原アイラインドなどのgenomic islandを構成するORFを適宜組み合わせて検出する.ことで、必要な遺伝子型別法を実現している。大腸菌においても同様の方法で遺伝子型を決められる可能性があるが、自然界に存在する大腸菌のゲノム中に見いだされるgenomic isletやgenomic islandは多様であり、実用的な検出ORF数で、ほとんどの大腸菌に利用可能な遺伝子型別法を実現可能か否かは明確ではない。
他方、特許文献１には、黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献２には、緑膿菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献３には、微生物の識別方法、及び該方法に使用するプライマー並びに識別キットが、特許文献４には、病原性大腸菌用高分解能タイピングシステムが記載されている。
Applied and Environmental Microbilogy 2011, 77: 2458-2470
Applied and Environmental Microbilogy 2000, 66: 4555-4558
Journal of Clinical Microbiology 2014, 52 : 2925-2932
大腸菌はヒトにおける常在菌で、その一部のクローンは病原性が高く、消化管症状や尿路感染症、時には敗血症をはじめとした侵襲性の起炎菌となる。また、抗菌薬剤耐性を獲得したクローンも見いだされ医療現場において問題となっている。大腸菌は食中毒や院内感染といった集団感染を起こすことが有り、その際には感染ルートの特定や、感染規模の確定を行うために、分子疫学解析が必要となる。大腸菌の多様性は非常に高いため、感染症や集団感染の原因となった株の遺伝子的な特徴付けには、遺伝子型が同一化否かの判定に加え、どのようなクローンに分類される株であるかを決める必要がある。
本発明は、上記実情に鑑みて、迅速な大腸菌の流行クローンの識別および菌株識別のための手法を開発し、より実際の産業（医療現場）利用に適した大腸菌の流行クローン同定および／又は菌株識別のための方法を提供することを目的としている。また本発明は、さらに流行クローンの同定および／又は菌株識別のための方法に用いるプライマーセットを提供することをもその目的としている。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、データベース上に蓄積されつつある大腸菌の遺伝情報を比較し、clonal complexを反映する遺伝子を複数個検出、選択し、それらの遺伝子をPCRで増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定することなく、通常の電気泳動により遺伝子産物の泳動パターンを比較することにより大腸菌のクローンを大別すること、及び院内感染発生時の感染源調査に利用可能な株レベルでの識別に成功した。具体的には、本発明者は、（１）染色体上の、genomic isletを構成するORFならびに（２）染色体上の、genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うことにより、より有効に大腸菌のクローン同定及び遺伝子型別分類を行うことができることを見出した。
即ち、本発明によれば、大腸菌のゲノム上の、（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法が提供される。
本発明の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法においては、前記（１）のgenomic isletを構成するＯＲＦがECNA114＿4208、EC55989＿4085、EC55989＿0018、ECNA114＿1457、EC55989＿1089、LF82＿085、ECS4731、ECS2436、ECNA114＿0460、ECS0053、EC55989＿0068、EC55989＿0189、EC55989＿0636、EC55989＿0699、EC55989＿0830、EC55989＿1577、EC55989＿1649、EC55989＿1821、EC55989＿2719、EC55989＿4248、EC55989＿4374、EC55989＿4548、ECABU＿c34730、ECNA114＿0007、ECNA114＿0140、ECS0914、ECS3904、ECS4280、ECS4300、ECS4827およびLF82＿248からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも４種、特に好ましくはECNA114＿4208、EC55989＿4085、EC55989＿0018、ECNA114＿1457、EC55989＿1089、LF82＿085、ECS4731、ECS2436、ECNA114＿0460およびECS0053の１０種）の遺伝子であることが好ましく、前記（２）のＯＲＦにおけるgenomic islandがECS1190、Z2415、Z1432、ECS3501、ECH74115＿1587、EC55989＿2129、Z1797、EC55989＿2641、ECH74115＿2877、ECH74115＿1791、ECNA114＿0874、EC55989＿1406、ECNA114＿2097、ECNA114＿3979、ECNA114＿4026、S0497、ECNA114＿1225、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、ECH74115＿3039、ECH74115＿2899、ECH74115＿3056、ECH74115＿3024、Z2404、ECH74115＿3237、ECS1189、Z1456、ECH74115＿2915、Z2384、ECS1527、ECH74115＿1860、Z1854、Z3358、Z3362、、EC55989＿0314、EC55989＿0547、EC55989＿0685、EC55989＿0762、EC55989＿0766、EC55989＿0799、EC55989＿0805、EC55989＿1022、EC55989＿1258、EC55989＿1399、EC55989＿1636、EC55989＿2099、EC55989＿2104、EC55989＿2188、EC55989＿2249、EC55989＿2256、EC55989＿2311、EC55989＿3358、EC55989＿3371、EC55989＿3396、EC55989＿3400、EC55989＿3509、EC55989＿4034、EC55989＿4038、EC55989＿4041、EC55989＿4278、EC55989＿4878、EC55989＿4903、EC55989＿4941、EC55989＿4958、EC55989＿4963、EC55989＿4969、EC55989＿4972、EC55989＿5004、EC55989＿5006、ECS0288、ECS0797、ECS0813、ECS1102、ECS1176、ECS1299、ECS1301、ECS1516、ECS1564、ECS1592、ECS1597、ECS1662、ECS1663、ECS1694、ECS1933、ECS1937、ECS2171、ECS2283、ECS2792、ECS2927、ECS2996、ECS4458、ECS5272、ECS5304、ECS5305、ECSF＿3727、ECSF＿4152、ECSF2757、S0692、S0913、S1482、S2103、S3222、S4314、、S4832、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、P423＿16715c、P423＿16735c、P423＿16745c、P423＿16780c、ECNA114＿4753、P423＿10825c、配列番号376、配列番号377、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号382、配列番号383、配列番号384、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号389、配列番号390、配列番号455、配列番号456、および配列番号461からなる群より選ばれる少なくとも１種、より好ましくは少なくとも４種、より好ましくは少なくとも8種、特に好ましくはECS1190、Z2415、Z1432、ECS3501、ECH74115＿1587、EC55989＿2129、Z1797、EC55989＿2641、ECH74115＿2877、ECH74115＿1791、ECNA114＿0874、EC55989＿1406、ECNA114＿2097、ECNA114＿3979、ECNA114＿4026、S0497、ECNA114＿1225、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、P423＿10825c、P423＿16715c、配列番号376、配列番号380、配列番号381、配列番号389、配列番号390、および配列番号461の２９種の遺伝子であることが好ましい。
また、本発明のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法は、配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０または配列番号４１３と４１４、配列番号１１と１２または配列番号４１５と４１６、配列番号１３と１４または配列番号４１７と４１８、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８または配列番号４１９と４２０、配列番号１９と２０または配列番号４２１と４２２に示された１５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により前記（１）のＯＲＦの検出を行い、配列番号７６と７７、配列番号７８と７９、配列番号８０と８１、配列番号８２と８３、配列番号８４と８５、配列番号８６と８７、配列番号８８と８９、配列番号９０と９１、配列番号９２と９３、配列番号９４と９５、配列番号９６と９７、配列番号９８と９９、配列番号１００と１０１または配列番号４０３と４０４、配列番号１０２と１０３、配列番号１０４と１０５、配列番号１０６と１０７、配列番号１０８と１０９、配列番号１１０と１１１または配列番号３９１と３９２、配列番号１１２と１１３、配列番号１１４と１１５、配列番号１１６と１１７、配列番号３９３と３９４、配列番号３９５と３９６、配列番号３９７と３９８、配列番号４０１と４０２、配列番号４０５と４０６、配列番号４０７と４０８、配列番号４６２と４６３および配列番号４６４と４６５に示された３１組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる２９組のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により前記（２）のＯＲＦの検出を行うことによって実施することができる。
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
前記PCR法としてマルチプレックスPCR法を採用すると、遺伝子型別分類のコストを抑えることができる。
前記（１）及び（２）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化すると、検出結果が数値化され見やすくなる。
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより判別しやすくなるとともに、他の日時、他の検査室等で得られた結果と正確に比較することが可能となる。
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより判別しやすくなるとともに、他の日時、他の検査室等で得られた結果と正確に比較することが可能となる。
さらに本発明によれば、配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０または配列番号４１３と４１４、配列番号１１と１２または配列番号４１５と４１６、配列番号１３と１４または配列番号４１７と４１８、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８または配列番号４１９と４２０、配列番号１９と２０または配列番号４２１と４２２に示された１５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマー、配列番号７６と７７、配列番号７８と７９、配列番号８０と８１、配列番号８２と８３、配列番号８４と８５、配列番号８６と８７、配列番号８８と８９、配列番号９０と９１、配列番号９２と９３、配列番号９４と９５、配列番号９６と９７、配列番号９８と９９、配列番号１００と１０１または配列番号４０３と４０４、配列番号１０２と１０３、配列番号１０４と１０５、配列番号１０６と１０７、配列番号１０８と１０９、配列番号１１０と１１１または配列番号３９１と３９２、配列番号１１２と１１３、配列番号１１４と１１５、配列番号１１６と１１７、配列番号３９３と３９４、配列番号３９５と３９６、配列番号３９７と３９８、配列番号４０１と４０２、配列番号４０５と４０６、配列番号４０７と４０８、および配列番号４６２と４６３および配列番号４６４と４６５に示された３１組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる２９組のプライマーを含む、大腸菌の遺伝子型別分類用プライマーセットが提供される。
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
本発明によれば、大腸菌のクローン同定、及び／又は菌株識別を、特殊な装置や作業者の熟練を要さずに簡便に、迅速、客観的かつ高感度に行うことができるため、大腸菌食中毒発生時における分子疫学解析や、院内感染による同一菌株の拡散を追跡することを可能とし、その結果、速やかな感染拡大防止を達成することができる。
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明に係る大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法は、大腸菌の染色体上の（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、これら２種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのＯＲＦについて説明する。
本発明に係る大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法は、大腸菌の染色体上の（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、これら２種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのＯＲＦについて説明する。
［（１）genomic isletを構成するＯＲＦ］
（大腸菌の遺伝的特徴）
大腸菌の遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、multilocus sequence typing（MLST）解析が利用されている。大腸菌のMLST解析にはフランス、パスツール研究所が開発した方法と、Achtmanらが開発した方法(Molecular Microbiology 2006, 60:1136-1151)及びWhittamらが開発した方法(www.shigatox.net)があるが、ここではAchtmanらが開発した方法に従って解析した。
（大腸菌の遺伝的特徴）
大腸菌の遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、multilocus sequence typing（MLST）解析が利用されている。大腸菌のMLST解析にはフランス、パスツール研究所が開発した方法と、Achtmanらが開発した方法(Molecular Microbiology 2006, 60:1136-1151)及びWhittamらが開発した方法(www.shigatox.net)があるが、ここではAchtmanらが開発した方法に従って解析した。
MLST解析では7カ所のハウスキーピング遺伝子(adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA, recA)の塩基配列を決定し、sequence type (ＳＴ)を決定する。また近縁なＳＴの集団を集めたclonal complex (ＣＣ)とすることで、遺伝的バックグラウンドが同一の株、すなわちクローンをまとめることが可能であり、疫学調査には欠かせない。なお、ＣＣを推定するにはgenomic isletの保有パターンを検出することが有効であることが黄色ブドウ球菌、緑膿菌、及びアシネトバクターでは示されていたが、大腸菌でも同様の手法が有効であるか否かはこれまでは不明であった。
大腸菌にはさまざまな遺伝的バックグラウンドを持つものが存在する。実際の野生株における遺伝的バックグラウンドの調査結果（種々のＯＲＦの検出結果を含む）は文献として個々の研究施設における断片的な情報として利用できるが、それのみでは、最低限のＯＲＦを検出することにより流行クローンを同定できるクローン同定法を開発するには十分でない。
そこで本発明者は、臨床分離された大腸菌を収集しMLST解析を行い、それらの遺伝的バックグラウンドの調査を行った。その結果、日本で臨床分離される大腸菌には多様なＣＣに分類される株が存在することが判明し、分離株を大別するにはＣＣを識別できる程度の菌株識別能を実現する必要がある。
（genomic isletを構成するＯＲＦ）
前記のＣＣ型を区別するためには、大腸菌においてもgenomic isletを構成するＯＲＦを検出することが有用であることがわかった。表１に遺伝子データベース上の全ゲノム解析株におけるgenomic islet保有パターンを示す。genomic isletとは、細菌のゲノム同士を比較した場合に、５ｋｂｐ程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これはゲノム全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
前記のＣＣ型を区別するためには、大腸菌においてもgenomic isletを構成するＯＲＦを検出することが有用であることがわかった。表１に遺伝子データベース上の全ゲノム解析株におけるgenomic islet保有パターンを示す。genomic isletとは、細菌のゲノム同士を比較した場合に、５ｋｂｐ程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これはゲノム全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
表１からわかるように、大腸菌のＳＴ型の異なる株ではgenomic islet (ECNA114＿4208〜LF82＿248)の保有パターンが異なっている。
臨床分離株におけるgenomic islet保有状況を調査した結果を表２に示す。
臨床分離株におけるgenomic islet検出パターンを精査し、最適なORFを選び出すことで、クローン同定ならびに特定の流行クローンによらない集団感染の解析においては、10個以下と比較的少ない数のgenomic islet検出によるタイピングにおいても十分な菌株識別能が得られる。
なお、たとえば前記ECNA114＿4208はGenBankにおいて公開されているNA114株（Accession No. CP002797）の4208番目の遺伝子、EC55989＿4085 はE. coli 55989株（Accession No.CU928145）の4085番目の遺伝子、LF82＿085はLF82株（Accession No.CU651637）の85番目の遺伝子、ECS4731はSakai株(Accession No.BA000007)の4731番目の遺伝子、ECABU＿c34730はABU83972株（Accession No.CP001671）の3473番目の遺伝子である、ということを意味するが、この遺伝子はNA114株、E. coli 55989株、LF82株、Sakai株、ABU83972株のみにしか存在しないわけではなく、それから派生した菌株や、それとは異なる系統の大腸菌においても存在する可能性がある。
なお、遺伝子ECNA114＿4208は、配列表の配列番号１（フォワード）および２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4085は、配列表の配列番号３（フォワード）および４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0018は、配列表の配列番号５（フォワード）および６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿1457は、配列表の配列番号７（フォワード）および８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1089は、配列表の配列番号９（フォワード）および１０（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１３（フォワード）および４１４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子LF82＿085は、配列表の配列番号１１（フォワード）および１２（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１５（フォワード）および４１６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4731は、配列表の配列番号１３（フォワード）および１４（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１７（フォワード）および４１８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2436は、配列表の配列番号１５（フォワード）および１６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿0460は、配列表の配列番号１７（フォワード）および１８（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１９（フォワード）および４２０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0053は、配列表の配列番号１９（フォワード）および２０（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４２１（フォワード）および４２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子EC55989＿4085は、配列表の配列番号３（フォワード）および４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0018は、配列表の配列番号５（フォワード）および６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿1457は、配列表の配列番号７（フォワード）および８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1089は、配列表の配列番号９（フォワード）および１０（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１３（フォワード）および４１４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子LF82＿085は、配列表の配列番号１１（フォワード）および１２（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１５（フォワード）および４１６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4731は、配列表の配列番号１３（フォワード）および１４（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１７（フォワード）および４１８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2436は、配列表の配列番号１５（フォワード）および１６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿0460は、配列表の配列番号１７（フォワード）および１８（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１９（フォワード）および４２０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0053は、配列表の配列番号１９（フォワード）および２０（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４２１（フォワード）および４２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子EC55989＿0068は、配列表の配列番号２１（フォワード）および２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0189は、配列表の配列番号２３（フォワード）および２４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0636は、配列表の配列番号２５（フォワード）および２６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0699は、配列表の配列番号２７（フォワード）および２８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0830は、配列表の配列番号２９（フォワード）および３０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1577は、配列表の配列番号３１（フォワード）および３２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1649は、配列表の配列番号３３（フォワード）および３４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1821は、配列表の配列番号３５（フォワード）および３６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2719は、配列表の配列番号３７（フォワード）および３８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4248は、配列表の配列番号３９（フォワード）および４０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4374は、配列表の配列番号４１（フォワード）および４２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4548は、配列表の配列番号４３（フォワード）および４４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECABU＿c34730は、配列表の配列番号４５（フォワード）および４６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿0007は、配列表の配列番号４７（フォワード）および４８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿0140は、配列表の配列番号４９（フォワード）および５０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0914は、配列表の配列番号５１（フォワード）および５２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS3904は、配列表の配列番号５３（フォワード）および５４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4280は、配列表の配列番号５５（フォワード）および５６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4300は、配列表の配列番号５７（フォワード）および５８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4827は、配列表の配列番号５９（フォワード）および６０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子LF82＿248は、配列表の配列番号６１（フォワード）および６２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にＣＣ型の区別ができる。
遺伝子EC55989＿0189は、配列表の配列番号２３（フォワード）および２４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0636は、配列表の配列番号２５（フォワード）および２６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0699は、配列表の配列番号２７（フォワード）および２８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0830は、配列表の配列番号２９（フォワード）および３０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1577は、配列表の配列番号３１（フォワード）および３２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1649は、配列表の配列番号３３（フォワード）および３４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1821は、配列表の配列番号３５（フォワード）および３６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2719は、配列表の配列番号３７（フォワード）および３８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4248は、配列表の配列番号３９（フォワード）および４０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4374は、配列表の配列番号４１（フォワード）および４２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4548は、配列表の配列番号４３（フォワード）および４４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECABU＿c34730は、配列表の配列番号４５（フォワード）および４６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿0007は、配列表の配列番号４７（フォワード）および４８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿0140は、配列表の配列番号４９（フォワード）および５０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0914は、配列表の配列番号５１（フォワード）および５２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS3904は、配列表の配列番号５３（フォワード）および５４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4280は、配列表の配列番号５５（フォワード）および５６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4300は、配列表の配列番号５７（フォワード）および５８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4827は、配列表の配列番号５９（フォワード）および６０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子LF82＿248は、配列表の配列番号６１（フォワード）および６２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にＣＣ型の区別ができる。
またこれらを、後述するＰＣＲおよび電気泳動を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
以上では、ＰＣＲ法によりgenomic isletのＯＲＦ（１）を検出することを主に説明してきたが、genomic isletのＯＲＦ（１）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
［（２）genomic islandを構成するORF］
大腸菌の中には、腸管出血性大腸菌O157など病原性の高いクローンやST131など薬剤耐性遺伝子保有率の高いクローンが存在し、集団感染の原因となりやすいことが知られている。このような集団感染で問題となりやすいクローンによる集団感染の調査には、クローン識別より高い識別能力が必要な菌株識別法が必要となる。
大腸菌の中には、腸管出血性大腸菌O157など病原性の高いクローンやST131など薬剤耐性遺伝子保有率の高いクローンが存在し、集団感染の原因となりやすいことが知られている。このような集団感染で問題となりやすいクローンによる集団感染の調査には、クローン識別より高い識別能力が必要な菌株識別法が必要となる。
近年ゲノムの解読が進み、大腸菌には５〜１００個の外来遺伝子からなる遺伝子クラスターが見いだされる。このクラスターをgenomic islandという。genomic islandには溶原ファージや病原アイランド、耐性アイランドに加え機能が不明なものが含まれる。個々のgenomic islandはおよそ５ｋｂｐ程度、またはそれ以上の大きさで、５〜１００個のORFから構成されている。大腸菌のgenomic islandはモザイク状にORFが組み合わされ、genomic island内のORFの構成に多様性が見られる場合が多い。
しかし、大腸菌にはさまざまな株が存在する。実際の野生株における遺伝子型の調査結果（種々のＯＲＦの検出結果を含む）は文献あるいはゲノム塩基配列データベースとして個々の断片的な情報として利用できるが、それのみでは最低限のＯＲＦを検出することによる大腸菌の菌株同定法を開発するには十分でない。
そこで本発明者はGenBankの大腸菌についての公開遺伝子情報を利用し、多くのgenomic islandのORFを検出するためのプライマーを設計し、多様な遺伝的バックグラウンドを持つ大腸菌について、それらの保有するgenomic island遺伝子のORFの構成について検討した。
ゲノムデータベース登録株における全ゲノムデータの精査、および臨床分離株によるORF保有確認実験を繰り返した結果、genomic island遺伝子のORFをいくつか組み合わせて検出することが、大腸菌の菌株識別にきわめて有効であることが明らかとなった。
その結果、ECS1190、Z2415、Z1432、ECS3501、ECH74115＿1587、EC55989＿2129、Z1797、EC55989＿2641、ECH74115＿2877、ECH74115＿1791、ECNA114＿0874、EC55989＿1406、ECNA114＿2097、EC55989＿2129、ECNA114＿3979、ECNA114＿4026、S0497、ECNA114＿1225、配列番号63、配列番号64、配列番号65,配列番号66、ECH74115＿3039、ECH74115＿2899、ECH74115＿3056、ECH74115＿3024、Z2404、ECH74115＿3237、ECS1189、Z1456、ECH74115＿2915、Z2384、ECS1527、ECH74115＿1860、Z1854、Z3358、Z3362、、EC55989＿0314、EC55989＿0547、EC55989＿0685、EC55989＿0762、EC55989＿0766、EC55989＿0799、EC55989＿0805、EC55989＿1022、EC55989＿1258、EC55989＿1399、EC55989＿1636、EC55989＿2099、EC55989＿2104、EC55989＿2188、EC55989＿2249、EC55989＿2256、EC55989＿2311、EC55989＿3358、EC55989＿3371、EC55989＿3396、EC55989＿3400、EC55989＿3509、EC55989＿4034、EC55989＿4038、EC55989＿4041、EC55989＿4278、EC55989＿4878、EC55989＿4903、EC55989＿4941、EC55989＿4958、EC55989＿4963、EC55989＿4969、EC55989＿4972、EC55989＿5004、EC55989＿5006、ECS0288、ECS0797、ECS0813、ECS1102、ECS1176、ECS1299、ECS1301、ECS1516、ECS1564、ECS1592、ECS1597、ECS1662、ECS1663、ECS1694、ECS1933、ECS1937、ECS2171、ECS2283、ECS2792、ECS2927、ECS2996、ECS4458、ECS5272、ECS5304、ECS5305、ECSF＿3727、ECSF＿4152、ECSF2757、S0692、S0913、S1482、S2103、S3222、S4314、、S4832、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、P423＿10825c、P423＿16715c、P423＿16735c、P423＿16745c、P423＿16780c、ECNA114＿4753、配列番号376、配列番号377、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号382、配列番号383、配列番号384、配列番号385)、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号389、配列番号390、配列番号455、配列番号456、および配列番号461を検出の対象とすると、大腸菌の菌株を高精度で分類することができることを本発明者は見出した。上記のORFを検出することによって汎用性が高く広範なクローンに対する菌株識別が可能となっている。これらのgenomic islandを構成するORFをすべて検出することで最大の菌株識別能力を実現する。
なお、たとえば前記ECS1190は、GenBankにおいて公開されているSakai株（Accession No. BA000007）の1190番目の遺伝子、Z2415はEDL933株（Accession No. AE005174）の2415番目の遺伝子、ECH74115＿1587はEC4115株（Accession No. CP001164）の1587番目の遺伝子、EC55989＿2129はE. coli 55989株（Accession No. CU928145）の2129番目の遺伝子、ECNA114＿0874はNA114株（Accession No. CP002797）の874番目の遺伝子、S0497はShigella flexneri 2a str. 2457T株（Accession No. AE014073）の497番目の遺伝子、ECSF＿3727はSE15株（Accession No. AP009378）の3727番目の遺伝子である、P423＿16715cはJJ1886株（Accession No. CP006784）の3343番目の遺伝子ということを意味するが、この遺伝子はそれぞれSakai株、EDL933株、EC4115株、55989株、NA114株、Shigella flexneri 2a str. 2457T株、SE15株、JJ1886株のみにしか存在しないわけではなく、菌株によって保有している場合と、保有していない場合がある。
表３に全ゲノムデータ株におけるgenomic island保有パターンを示す。表３からわかるように、菌株ごとに異なるＯＲＦ構成パターンが得られる。
表４に全ゲノムデータ株におけるgenomic islandを構成するＯＲＦ保有パターンを示す。表４からわかるように、表４に掲載したgenomic islandを構成するＯＲＦはＳＴ１３１クローンの菌株識別に特に有効であり、特にＳＴ１３１クローンの菌株ごとに異なるＯＲＦ構成パターンが得られる。
臨床分離株におけるgenomic island保有状況を調査した結果を表５に示す。臨床分離株においても菌株に特異的なORF保有パターンとなった。臨床分離株におけるgenomic island検出パターンを精査し、最適なORFを選び出すことで、汎用性高く広範なクローンにおいて集団感染の解析する際に、１２個以下と比較的少ない数のgenomic island検出によるタイピングにおいても十分な菌株識別能が得られる。
臨床分離株におけるP423＿10825c、P423＿16715c、P423＿16735c、P423＿16745c、P423＿16780c、ECNA114＿4753、配列番号376、配列番号377、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号382、配列番号383、配列番号384、配列番号385)、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号389、配列番号390、配列番号455、配列番号456、および配列番号461の24種のgenomic island保有状況を調査した結果を表６に示す。表6に掲載したgenomic islandを構成するＯＲＦはＳＴ１３１クローンの菌株識別に特に有効であり、臨床分離株においても菌株に特異的なORF保有パターンとなった。臨床分離株におけるgenomic island検出パターンを精査し、上記genomic islandを構成するＯＲＦと組み合わせ、最適なORFを選び出すことで、特に薬剤耐性菌で問題となるＳＴ１３１クローンの集団感染の解析の際に、１５個以下と比較的少ない数のgenomic island検出によるタイピングにおいても十分な菌株識別能が得られる。
なお、遺伝子ECS1190は、配列表の配列番号７６（フォワード）および７７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z2415は、配列表の配列番号７８（フォワード）および７９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z1432は、配列表の配列番号８０（フォワード）および８１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS3501は、配列表の配列番号８２（フォワード）および８３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿1587は、配列表の配列番号８４（フォワード）および８５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z1797は、配列表の配列番号８６（フォワード）および８７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2641は、配列表の配列番号８８（フォワード）および８９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿2877は、配列表の配列番号９０（フォワード）および９１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿1791は、配列表の配列番号９２（フォワード）および９３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿0874は、配列表の配列番号９４（フォワード）および９５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1406は、配列表の配列番号９６（フォワード）および９７（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号３９９（フォワード）および４００（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿2097は、配列表の配列番号９８（フォワード）および９９（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１１（フォワード）および４１２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2129は、配列表の配列番号１００（フォワード）および１０１（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４０３（フォワード）および４０４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿3979は、配列表の配列番号１０２（フォワード）および１０３（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４０９（フォワード）および４１０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿4026は、配列表の配列番号１０４（フォワード）および１０５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S0497は、配列表の配列番号１０６（フォワード）および１０７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿1225は、配列表の配列番号１０８（フォワード）および１０９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号６３は、配列表の配列番号１１０（フォワード）および１１１（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号３９１（フォワード）および３９２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号６４は、配列表の配列番号１１２（フォワード）および１１３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号６５は、配列表の配列番号１１４（フォワード）および１１５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号６６は、配列表の配列番号１１６（フォワード）および１１７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿3039は、配列表の配列番号１１８（フォワード）および１１９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿2899は、配列表の配列番号１２０（フォワード）および１２１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿3056は、配列表の配列番号１２２（フォワード）および１２３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿3024は、配列表の配列番号１２４（フォワード）および１２５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z2404は、配列表の配列番号１２６（フォワード）および１２７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿3237は、配列表の配列番号１２８（フォワード）および１２９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1189は、配列表の配列番号１３０（フォワード）および１３１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z1456は、配列表の配列番号１３２（フォワード）および１３３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿2915は、配列表の配列番号１３４（フォワード）および１３５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z2384は、配列表の配列番号１３６（フォワード）および１３７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1527は、配列表の配列番号１３８（フォワード）および１３９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿1860は、配列表の配列番号１４０（フォワード）および１４１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z1854は、配列表の配列番号１４２（フォワード）および１４３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z3358は、配列表の配列番号１４４（フォワード）および１４５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z3362は、配列表の配列番号１４６（フォワード）および１４７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0314は、配列表の配列番号１４８（フォワード）および１４９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0547は、配列表の配列番号１５０（フォワード）および１５１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0685は、配列表の配列番号１５２（フォワード）および１５３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0762は、配列表の配列番号１５４（フォワード）および１５５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0766は、配列表の配列番号１５６（フォワード）および１５７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0799は、配列表の配列番号１５８（フォワード）および１５９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0805は、配列表の配列番号１６０（フォワード）および１６１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿1022は、配列表の配列番号１６２（フォワード）および１６３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿1258は、配列表の配列番号１６４（フォワード）および１６５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿1399は、配列表の配列番号１６６（フォワード）および１６７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿1636は、配列表の配列番号１６８（フォワード）および１６９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿2099は、配列表の配列番号１７０（フォワード）および１７１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿2104は、配列表の配列番号１７２（フォワード）および１７３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2188は、配列表の配列番号１７４（フォワード）および１７５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2249は、配列表の配列番号１７６（フォワード）および１７７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2256は、配列表の配列番号１７８（フォワード）および１７９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2311は、配列表の配列番号１８０（フォワード）および１８１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3358は、配列表の配列番号１８２（フォワード）および１８３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3371は、配列表の配列番号１８４（フォワード）および１８５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3396は、配列表の配列番号１８６（フォワード）および１８７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3400は、配列表の配列番号１８８（フォワード）および１８９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3509は、配列表の配列番号１９０（フォワード）および１９１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4034は、配列表の配列番号１９２（フォワード）および１９３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4038は、配列表の配列番号１９４（フォワード）および１９５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4041は、配列表の配列番号１９６（フォワード）および１９７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4278は、配列表の配列番号１９８（フォワード）および１９９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4878は、配列表の配列番号２００（フォワード）および２０１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4903は、配列表の配列番号２０２（フォワード）および２０３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4941は、配列表の配列番号２０４（フォワード）および２０５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4958は、配列表の配列番号２０６（フォワード）および２０７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4963は、配列表の配列番号２０８（フォワード）および２０９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4969は、配列表の配列番号２１０（フォワード）および２１１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4972は、配列表の配列番号２１２（フォワード）および２１３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿5004は、配列表の配列番号２１４（フォワード）および２１５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿5006は、配列表の配列番号２１６（フォワード）および２１７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0288は、配列表の配列番号２１８（フォワード）および２１９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0797は、配列表の配列番号２２０（フォワード）および２２１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0813は、配列表の配列番号２２２（フォワード）および２２３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1102は、配列表の配列番号２２４（フォワード）および２２５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1176は、配列表の配列番号２２６（フォワード）および２２７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1299は、配列表の配列番号２２８（フォワード）および２２９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1301は、配列表の配列番号２３０（フォワード）および２３１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1516は、配列表の配列番号２３２（フォワード）および２３３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1564は、配列表の配列番号２３４（フォワード）および２３５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1592は、配列表の配列番号２３６（フォワード）および２３７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1597は、配列表の配列番号２３８（フォワード）および２３９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1662は、配列表の配列番号２４０（フォワード）および２４１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1663は、配列表の配列番号２４２（フォワード）および２４３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1694は、配列表の配列番号２４４（フォワード）および２４５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1933は、配列表の配列番号２４６（フォワード）および２４７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1937は、配列表の配列番号２４８（フォワード）および２４９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2171は、配列表の配列番号２５０（フォワード）および２５１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2283は、配列表の配列番号２５２（フォワード）および２５３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2792は、配列表の配列番号２５４（フォワード）および２５５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2927は、配列表の配列番号２５６（フォワード）および２５７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2996は、配列表の配列番号２５８（フォワード）および２５９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4458は、配列表の配列番号２６０（フォワード）および２６１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS5272は、配列表の配列番号２６２（フォワード）および２６３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS5304は、配列表の配列番号２６４（フォワード）および２６５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS5305は、配列表の配列番号２６６（フォワード）および２６７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECSF＿3727は、配列表の配列番号２６８（フォワード）および２６９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECSF＿4152は、配列表の配列番号２７０（フォワード）および２７１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECSF2757は、配列表の配列番号２７２（フォワード）および２７３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S0692は、配列表の配列番号２７４（フォワード）および２７５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S0913は、配列表の配列番号２７６（フォワード）および２７７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S1482は、配列表の配列番号２７８（フォワード）および２７９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S2103は、配列表の配列番号２８０（フォワード）および２８１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S3222は、配列表の配列番号２８２（フォワード）および２８３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S4314は、配列表の配列番号２８４（フォワード）および２８５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S4832は、配列表の配列番号２８６（フォワード）および２８７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号67配列表の配列番号２８８（フォワード）および２８９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号68 は配列表の配列番号２９０（フォワード）および２９１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号69 は配列表の配列番号２９２（フォワード）および２９３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号70) は配列表の配列番号２９４（フォワード）および２９５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号71は配列表の配列番号２９６（フォワード）および２９７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号72 は配列表の配列番号２９８（フォワード）および２９９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号73 は配列表の配列番号３００（フォワード）および３０１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号74 は配列表の配列番号３０２（フォワード）および３０３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号75 は配列表の配列番号３０４（フォワード）および３０５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子Z2415は、配列表の配列番号７８（フォワード）および７９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z1432は、配列表の配列番号８０（フォワード）および８１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS3501は、配列表の配列番号８２（フォワード）および８３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿1587は、配列表の配列番号８４（フォワード）および８５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z1797は、配列表の配列番号８６（フォワード）および８７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2641は、配列表の配列番号８８（フォワード）および８９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿2877は、配列表の配列番号９０（フォワード）および９１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿1791は、配列表の配列番号９２（フォワード）および９３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿0874は、配列表の配列番号９４（フォワード）および９５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿1406は、配列表の配列番号９６（フォワード）および９７（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号３９９（フォワード）および４００（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿2097は、配列表の配列番号９８（フォワード）および９９（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４１１（フォワード）および４１２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2129は、配列表の配列番号１００（フォワード）および１０１（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４０３（フォワード）および４０４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿3979は、配列表の配列番号１０２（フォワード）および１０３（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号４０９（フォワード）および４１０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿4026は、配列表の配列番号１０４（フォワード）および１０５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S0497は、配列表の配列番号１０６（フォワード）および１０７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿1225は、配列表の配列番号１０８（フォワード）および１０９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号６３は、配列表の配列番号１１０（フォワード）および１１１（リバース）のプライマー、または配列表の配列番号３９１（フォワード）および３９２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号６４は、配列表の配列番号１１２（フォワード）および１１３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号６５は、配列表の配列番号１１４（フォワード）および１１５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号６６は、配列表の配列番号１１６（フォワード）および１１７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿3039は、配列表の配列番号１１８（フォワード）および１１９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿2899は、配列表の配列番号１２０（フォワード）および１２１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿3056は、配列表の配列番号１２２（フォワード）および１２３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿3024は、配列表の配列番号１２４（フォワード）および１２５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z2404は、配列表の配列番号１２６（フォワード）および１２７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿3237は、配列表の配列番号１２８（フォワード）および１２９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1189は、配列表の配列番号１３０（フォワード）および１３１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z1456は、配列表の配列番号１３２（フォワード）および１３３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿2915は、配列表の配列番号１３４（フォワード）および１３５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z2384は、配列表の配列番号１３６（フォワード）および１３７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1527は、配列表の配列番号１３８（フォワード）および１３９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECH74115＿1860は、配列表の配列番号１４０（フォワード）および１４１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z1854は、配列表の配列番号１４２（フォワード）および１４３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z3358は、配列表の配列番号１４４（フォワード）および１４５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子Z3362は、配列表の配列番号１４６（フォワード）および１４７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0314は、配列表の配列番号１４８（フォワード）および１４９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0547は、配列表の配列番号１５０（フォワード）および１５１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0685は、配列表の配列番号１５２（フォワード）および１５３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0762は、配列表の配列番号１５４（フォワード）および１５５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0766は、配列表の配列番号１５６（フォワード）および１５７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0799は、配列表の配列番号１５８（フォワード）および１５９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿0805は、配列表の配列番号１６０（フォワード）および１６１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿1022は、配列表の配列番号１６２（フォワード）および１６３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿1258は、配列表の配列番号１６４（フォワード）および１６５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿1399は、配列表の配列番号１６６（フォワード）および１６７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿1636は、配列表の配列番号１６８（フォワード）および１６９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿2099は、配列表の配列番号１７０（フォワード）および１７１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり
遺伝子EC55989＿2104は、配列表の配列番号１７２（フォワード）および１７３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2188は、配列表の配列番号１７４（フォワード）および１７５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2249は、配列表の配列番号１７６（フォワード）および１７７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2256は、配列表の配列番号１７８（フォワード）および１７９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿2311は、配列表の配列番号１８０（フォワード）および１８１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3358は、配列表の配列番号１８２（フォワード）および１８３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3371は、配列表の配列番号１８４（フォワード）および１８５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3396は、配列表の配列番号１８６（フォワード）および１８７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3400は、配列表の配列番号１８８（フォワード）および１８９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿3509は、配列表の配列番号１９０（フォワード）および１９１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4034は、配列表の配列番号１９２（フォワード）および１９３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4038は、配列表の配列番号１９４（フォワード）および１９５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4041は、配列表の配列番号１９６（フォワード）および１９７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4278は、配列表の配列番号１９８（フォワード）および１９９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4878は、配列表の配列番号２００（フォワード）および２０１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4903は、配列表の配列番号２０２（フォワード）および２０３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4941は、配列表の配列番号２０４（フォワード）および２０５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4958は、配列表の配列番号２０６（フォワード）および２０７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4963は、配列表の配列番号２０８（フォワード）および２０９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4969は、配列表の配列番号２１０（フォワード）および２１１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿4972は、配列表の配列番号２１２（フォワード）および２１３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿5004は、配列表の配列番号２１４（フォワード）および２１５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子EC55989＿5006は、配列表の配列番号２１６（フォワード）および２１７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0288は、配列表の配列番号２１８（フォワード）および２１９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0797は、配列表の配列番号２２０（フォワード）および２２１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS0813は、配列表の配列番号２２２（フォワード）および２２３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1102は、配列表の配列番号２２４（フォワード）および２２５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1176は、配列表の配列番号２２６（フォワード）および２２７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1299は、配列表の配列番号２２８（フォワード）および２２９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1301は、配列表の配列番号２３０（フォワード）および２３１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1516は、配列表の配列番号２３２（フォワード）および２３３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1564は、配列表の配列番号２３４（フォワード）および２３５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1592は、配列表の配列番号２３６（フォワード）および２３７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1597は、配列表の配列番号２３８（フォワード）および２３９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1662は、配列表の配列番号２４０（フォワード）および２４１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1663は、配列表の配列番号２４２（フォワード）および２４３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1694は、配列表の配列番号２４４（フォワード）および２４５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1933は、配列表の配列番号２４６（フォワード）および２４７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS1937は、配列表の配列番号２４８（フォワード）および２４９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2171は、配列表の配列番号２５０（フォワード）および２５１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2283は、配列表の配列番号２５２（フォワード）および２５３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2792は、配列表の配列番号２５４（フォワード）および２５５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2927は、配列表の配列番号２５６（フォワード）および２５７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS2996は、配列表の配列番号２５８（フォワード）および２５９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS4458は、配列表の配列番号２６０（フォワード）および２６１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS5272は、配列表の配列番号２６２（フォワード）および２６３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS5304は、配列表の配列番号２６４（フォワード）および２６５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECS5305は、配列表の配列番号２６６（フォワード）および２６７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECSF＿3727は、配列表の配列番号２６８（フォワード）および２６９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECSF＿4152は、配列表の配列番号２７０（フォワード）および２７１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECSF2757は、配列表の配列番号２７２（フォワード）および２７３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S0692は、配列表の配列番号２７４（フォワード）および２７５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S0913は、配列表の配列番号２７６（フォワード）および２７７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S1482は、配列表の配列番号２７８（フォワード）および２７９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S2103は、配列表の配列番号２８０（フォワード）および２８１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S3222は、配列表の配列番号２８２（フォワード）および２８３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S4314は、配列表の配列番号２８４（フォワード）および２８５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子S4832は、配列表の配列番号２８６（フォワード）および２８７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号67配列表の配列番号２８８（フォワード）および２８９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号68 は配列表の配列番号２９０（フォワード）および２９１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号69 は配列表の配列番号２９２（フォワード）および２９３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号70) は配列表の配列番号２９４（フォワード）および２９５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号71は配列表の配列番号２９６（フォワード）および２９７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号72 は配列表の配列番号２９８（フォワード）および２９９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号73 は配列表の配列番号３００（フォワード）および３０１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号74 は配列表の配列番号３０２（フォワード）および３０３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号75 は配列表の配列番号３０４（フォワード）および３０５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子P423＿16715cは、配列表の配列番号３９７（フォワード）および配列番号３９８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子P423＿16735cは、配列表の配列番号４２３（フォワード）および配列番号４２４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子P423＿16745cは、配列表の配列番号４２５（フォワード）および配列番号４２６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子P423＿16780cは、配列表の配列番号４２７（フォワード）および配列番号４２８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子P423＿10825cは、配列表の配列番号４６４（フォワード）および配列番号４６５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿4753は、配列表の配列番号４２９（フォワード）および配列番号４３０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号376は、配列表の配列番号４０７（フォワード）および配列番号４０８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号377は、配列表の配列番号４３１（フォワード）および配列番号４３２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号378は、配列表の配列番号４３３（フォワード）および配列番号４３４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号379は、配列表の配列番号４３５（フォワード）および配列番号４３６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号380は、配列表の配列番号４０１（フォワード）および配列番号４０２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号381は、配列表の配列番号３９３（フォワード）および配列番号３９４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号382は、配列表の配列番号４３７（フォワード）および配列番号４３８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号383は、配列表の配列番号４３９（フォワード）および配列番号４４０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号384は、配列表の配列番号４４１（フォワード）および配列番号４４２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号385は、配列表の配列番号４４３（フォワード）および配列番号４４４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号386は、配列表の配列番号４４５（フォワード）および配列番号４４６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号387は、配列表の配列番号４４７（フォワード）および配列番号４４８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号388は、配列表の配列番号４４９（フォワード）および配列番号４５０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号389は、配列表の配列番号４０５（フォワード）および配列番号４０６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号390は、配列表の配列番号３９５（フォワード）および配列番号３９６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号455は、配列表の配列番号４５１（フォワード）および配列番号４５２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号456は、配列表の配列番号４５３（フォワード）および配列番号４５４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号461は、配列表の配列番号４６２（フォワード）および配列番号４６３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子P423＿16735cは、配列表の配列番号４２３（フォワード）および配列番号４２４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子P423＿16745cは、配列表の配列番号４２５（フォワード）および配列番号４２６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子P423＿16780cは、配列表の配列番号４２７（フォワード）および配列番号４２８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子P423＿10825cは、配列表の配列番号４６４（フォワード）および配列番号４６５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ECNA114＿4753は、配列表の配列番号４２９（フォワード）および配列番号４３０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号376は、配列表の配列番号４０７（フォワード）および配列番号４０８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号377は、配列表の配列番号４３１（フォワード）および配列番号４３２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号378は、配列表の配列番号４３３（フォワード）および配列番号４３４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号379は、配列表の配列番号４３５（フォワード）および配列番号４３６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号380は、配列表の配列番号４０１（フォワード）および配列番号４０２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号381は、配列表の配列番号３９３（フォワード）および配列番号３９４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号382は、配列表の配列番号４３７（フォワード）および配列番号４３８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号383は、配列表の配列番号４３９（フォワード）および配列番号４４０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号384は、配列表の配列番号４４１（フォワード）および配列番号４４２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号385は、配列表の配列番号４４３（フォワード）および配列番号４４４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号386は、配列表の配列番号４４５（フォワード）および配列番号４４６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号387は、配列表の配列番号４４７（フォワード）および配列番号４４８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号388は、配列表の配列番号４４９（フォワード）および配列番号４５０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号389は、配列表の配列番号４０５（フォワード）および配列番号４０６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号390は、配列表の配列番号３９５（フォワード）および配列番号３９６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号455は、配列表の配列番号４５１（フォワード）および配列番号４５２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号456は、配列表の配列番号４５３（フォワード）および配列番号４５４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
配列番号461は、配列表の配列番号４６２（フォワード）および配列番号４６３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
またこれらを、後述するＰＣＲおよび電気泳動を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
以上では、ＰＣＲ法によりgenomic islandを構成するＯＲＦ（２）を検出することを主に説明してきたが、genomic islandを構成するＯＲＦ（２）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
［ORF検出手段］
上述した、大腸菌の染色体上の、genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、または、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、あるいは、全てのORFを同時に検出してもよい。ＯＲＦを検出する手段としては、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションが挙げられる。
上述した、大腸菌の染色体上の、genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、または、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、あるいは、全てのORFを同時に検出してもよい。ＯＲＦを検出する手段としては、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションが挙げられる。
＜ＰＣＲ＞
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する１組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いて、独立した系で、大腸菌のDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応などを行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光などをリアルタイムに検出する。
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する１組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いて、独立した系で、大腸菌のDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応などを行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光などをリアルタイムに検出する。
また、複数のORF毎にまとめて検出する場合には、たとえば、大腸菌マーカーとしてyhbX（例えばE. coli 55989株のEC55989＿3592に相当）を検出するプライマー（配列表の配列番号３０６と３０７）を加えた、複数のORFにそれぞれ対応する複数組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマーの組）を混合し、同一の反応系に入れてPCR反応を行うマルチプレックスPCRが実施可能である。この場合には、各ORFに対応するPCR増幅産物の有無は、反応後の液を電気泳動、たとえば、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などで泳動して得られたバンドの有無によって確認する。
全てのORFを同時に検出する場合には、たとえばmicro arrayを応用してＯＲＦを検出する。micro arrayによる検出では、各ＯＲＦとハイブリダイズするプローブをmicro arrayの各wellに作成しておき、培養菌からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをハイブリダイズさせ、未反応のＤＮＡを洗浄した後、２本鎖ＤＮＡと結合する蛍光色素でラベルし、蛍光を捉える機械で測定することで目的のＯＲＦが検出可能となる。
これらのうちでは、複数のORFを簡便な手法で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましい。
これらのうちでは、複数のORFを簡便な手法で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましい。
（プライマーの設計）
上記genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）については塩基配列が90％程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、臨床分離されることの多いほとんどの大腸菌に汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。
上記genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）については塩基配列が90％程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、臨床分離されることの多いほとんどの大腸菌に汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。
上記genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）に加え、大腸菌マーカーとしてのyhbXを検出するプライマー、phylogenetic group決定のプライマー、および薬剤耐性遺伝子検出のプライマーのそれぞれに対応するプライマーの設計にあたっては、プライマー自身が折れ曲がって相補的になっている部分が結合して２重鎖を形成したり、異なるプライマー同士が、互いに相補的になっている部分において結合して２量体またはそれ以上の結合体を形成したりしないような配列にする。
さらに、マルチプレックスPCRで検出することを考慮し、プライマーのGC比をおよそ50％とし、Tm値を合わせるよう工夫することが好ましい。また、増幅効率と、電気泳動の際に短時間で分離可能なよう、PCR増幅産物サイズがおよそ50bp〜700bp、好ましくは70bp〜600bpとなるように調整することが望ましい。なお、同じ反応系で検出するＯＲＦにおいては、ＰＣＲ増幅産物のサイズが同じにならないようにプライマーを設計することが重要である。
上記のような条件を設定することでマルチプレックスPCRにおいて再現性の高い増幅結果が得られるプライマーおよびプライマーセットを得ることができる。このようなプライマーの設計は、市販のソフトウェアあるいはウエブを通じて自由に入手し利用可能なソフトウェアにより行うことができるが、ソフトウェアが出力する多くのプライマー候補のなかから、同時検出するORF間の相互作用による増幅効率の悪化、および各ORFの増幅効率の適正化を検証するため、臨床分離株を用いた試行錯誤によって、最適なプライマーを見つけ出した。
具体的には、上記（１）〜（２）のORFの項目でそれぞれ述べたように、
（１）genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして３６組のプライマー、
（２）genomic islandを構成するORFためのプライマーとして１４４組のプライマー、の合計１８０組のプライマー（配列表の配列番号１〜６２、７６〜３０５、３９１〜４５４、４６２〜４６５）を本発明者は設計した。
（１）genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして３６組のプライマー、
（２）genomic islandを構成するORFためのプライマーとして１４４組のプライマー、の合計１８０組のプライマー（配列表の配列番号１〜６２、７６〜３０５、３９１〜４５４、４６２〜４６５）を本発明者は設計した。
なお、上記プライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行う場合には、下記表７にprimer mixtureとして示すように、１０組のプライマーセットに大腸菌のマーカーとしてのyhbXを検出するプライマー（配列表の配列番号３０６と３０７）および大腸菌の遺伝子型大分類としてのphylogenetic groupを決定するプライマー（配列表の配列番号３０８と３０９、配列番号３１０と３１１および配列番号３１２と３１３）を加えた１４組のプライマーを組み合わせて混合した反応系、および下記表８にprimer mixtureとして示すように、１０組のプライマーセットに大腸菌のマーカーとしてyhbXを検出するプライマー（配列表の配列番号３０６と３０７）を加えた１１組のプライマー、下記表９にprimer mixtureとして示すように、１２組のプライマーセットに大腸菌のマーカーとしてyhbXを検出するプライマー（配列表の配列番号３０６と３０７）を加えた１３組のプライマー、下記表１０にprimer mixtureとして示すように、１１組のプライマーセットに大腸菌のマーカーとしてyhbXを検出するプライマー（配列表の配列番号３０６と３０７）を加えた１２組のプライマー、および下記表１１にprimer mixtureとして示すように、９組のプライマーセットに大腸菌のマーカーとしてyhbXを検出するプライマー（配列表の配列番号３０６と３０７）、および薬剤耐性遺伝子（ＣＴＸ−Ｍ−１グループおよびＣＴＸ−Ｍ−９グループ）を検出するプライマー（配列番号４５７と４５８、および配列番号４５９と４６０）を加えた１２組のプライマーを組み合わせて混合した反応系にてＰＣＲを実施することが望ましい。なお、クローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。また菌株識別は腸管出血性大腸菌や種々のクローンの大腸菌などでは、それぞれ表８に示したプライマーセットあるいは表９に示したプライマーセットのどちらかを片方だけでも良い。ＳＴ１３１クローンの菌株識別には表８、および表９に示したプライマーセットに加えて、表１０および表１１に示したプライマーセットも同時に実施すると効果的である。また、配列番号１００と１０１は表６及び表７に示したプライマーセットの両方に含まれ、配列番号１と２および配列番号３と４は表７及び表１０に示したプライマーセットの両方に含まれ、配列番号１０６と１０７は表９及び表１０に示したプライマーセットの両方に含まれ、、配列番号９４と９５および配列番号１０４と１０５は表９及び表１１に示したプライマーセットの両方に含まれる。
なお、配列番号３０６と３０７で示された増幅ＯＲＦのyhbXとは、hydrolaseをコードする遺伝子であり、大腸菌に普遍的に見出されるので、大腸菌を識別する共通マーカーとして用いることができる。
以上に示した具体的なプライマーは、標的ＯＲＦを増幅するために最適化された配列であり、これらのプライマーに２塩基程度の付加、置換、欠失及び／又は挿入といった変更があっても、プライマーとしての機能は失われず、ＰＣＲによって標的ＯＲＦを増幅することができる。付加とは、表に示されたプライマーの５’側または３’側の末端に塩基が追加されることをいい、挿入とは、前記の末端ではなく、プライマーの内側において、塩基と塩基の間に塩基が追加されることを言う。
プライマーとして高い性能を発揮する観点からは、前記変更は、２塩基以下の付加、置換、欠失、挿入であることが好ましく、２塩基以下の付加または２塩基以下の５’側または３’側の末端における欠失であることがより好ましく、１塩基以下の標的ＯＲＦと相補的な塩基の付加または５’側または３’側の末端における１塩基以下の欠失であることが特に好ましい。一般的に、５’側の変更はプライマーとしての機能を失わせにくく、３’側の変更はプライマーの機能を失わせやすい傾向がある。
＜ハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイゼーションによりＯＲＦを検出する場合には、まず培養菌（大腸菌）からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のＯＲＦとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成ＤＮＡでも、上記で説明したプライマーを利用したＰＣＲで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出ＤＮＡとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ＯＲＦについて実施する。
ハイブリダイゼーションによりＯＲＦを検出する場合には、まず培養菌（大腸菌）からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のＯＲＦとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成ＤＮＡでも、上記で説明したプライマーを利用したＰＣＲで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出ＤＮＡとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ＯＲＦについて実施する。
［ORF検出によるクローン同定、及び菌株識別法の実施方法］
以下、マルチプックスPCRを行い、上記（１）〜（２）のＯＲＦのうち、上述した検出対象として好ましいＯＲＦを検出する場合を一例とし、本発明の大腸菌のクローン同定法、及び菌株識別法の手順を説明する。
以下、マルチプックスPCRを行い、上記（１）〜（２）のＯＲＦのうち、上述した検出対象として好ましいＯＲＦを検出する場合を一例とし、本発明の大腸菌のクローン同定法、及び菌株識別法の手順を説明する。
（菌種の同定）
便、血液、尿などの患者由来の検体あるいは患者に使用したカテーテルやガーゼ等の医療器具などの材料から、血液寒天培地（一般細菌分離用）、マッコンキー培地などの大腸菌を分離可能な培地を用いて大腸菌様の菌を分離する。その後、グラム染色による形態の確認、および生化学性状の確認により、大腸菌と同定する。
便、血液、尿などの患者由来の検体あるいは患者に使用したカテーテルやガーゼ等の医療器具などの材料から、血液寒天培地（一般細菌分離用）、マッコンキー培地などの大腸菌を分離可能な培地を用いて大腸菌様の菌を分離する。その後、グラム染色による形態の確認、および生化学性状の確認により、大腸菌と同定する。
大腸菌であると同定された菌株を、大腸菌を増殖可能な液体培地（Luria-Bertani broth、Brain Heart Infusion培地、トリプトソイブイヨン等）、あるいは寒天培地（Luria-Bertani寒天培地、Brain Heart Infusion寒天培地、トリプトソイ寒天培地、普通寒天培地等）を用いて37℃で一晩培養する。
（DNA抽出）
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、市販のDNA抽出キットによるDNA抽出、あるいは蒸留水またはTris-EDTAバッファーなどに菌体を懸濁し加熱して得られる熱抽出法などの方法でDNAを抽出し、PCR反応用の試料（テンプレート）とする。
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、市販のDNA抽出キットによるDNA抽出、あるいは蒸留水またはTris-EDTAバッファーなどに菌体を懸濁し加熱して得られる熱抽出法などの方法でDNAを抽出し、PCR反応用の試料（テンプレート）とする。
（PCR反応）
マルチプレックスPCRで上記表７、８、９、１０および１１に記載の、genomic isletを構成するORF １０個、genomic islandを構成するORF ２９個に加え、大腸菌マーカーとしてyhbX、Phylogenetic group検出部位としてchuA、yjaAおよびTspE4.C2および薬剤耐性遺伝子（ＣＴＸ−Ｍ−１グループおよびＣＴＸ−Ｍ−９グループ）の検出を行う。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を、１４組、１１組、１３組、１２組、および１２組の５群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ一括してPCR反応を行う。なお、クローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
マルチプレックスPCRで上記表７、８、９、１０および１１に記載の、genomic isletを構成するORF １０個、genomic islandを構成するORF ２９個に加え、大腸菌マーカーとしてyhbX、Phylogenetic group検出部位としてchuA、yjaAおよびTspE4.C2および薬剤耐性遺伝子（ＣＴＸ−Ｍ−１グループおよびＣＴＸ−Ｍ−９グループ）の検出を行う。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を、１４組、１１組、１３組、１２組、および１２組の５群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ一括してPCR反応を行う。なお、クローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
（電気泳動）
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるような条件下でアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、60分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどで染色して写真撮影を行う。また、たとえばAgilent 2100 バイオアナライザや島津製作所MultiNAのような各種のキャピラリー型電気泳動装置等を用いてPCR産物を分離し画像化することも可能である。
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるような条件下でアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、60分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどで染色して写真撮影を行う。また、たとえばAgilent 2100 バイオアナライザや島津製作所MultiNAのような各種のキャピラリー型電気泳動装置等を用いてPCR産物を分離し画像化することも可能である。
（結果判定）
それぞれ最大１４本、１１本、１３本、１２本、または１２本のバンドが現れる。本発明の遺伝子型タイピング法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異バンドは無視する。目的のサイズのバンド（各ＯＲＦに対応するバンドおよびポジティブコントロールに対応するバンド）が増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として２進法のコードを作成する。
それぞれ最大１４本、１１本、１３本、１２本、または１２本のバンドが現れる。本発明の遺伝子型タイピング法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異バンドは無視する。目的のサイズのバンド（各ＯＲＦに対応するバンドおよびポジティブコントロールに対応するバンド）が増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として２進法のコードを作成する。
このコードは（１）〜（２）の各ＯＲＦ毎に作成してもよいし、または、すべてをまとめて一つのコードとして作成してもよいし、あるいは（１）〜（２）のＯＲＦの一部をまとめて作成するなどしてもよい。本発明のクローン同定法が実際の医療の現場で使用される場合には、（１）〜（２）のＯＲＦすべてをまとめて一つのコードとして作成すると、桁数が大きくなって見にくいことから、いくつかのＯＲＦの結果はまとめて一つのコードとして作成することが好ましい。
ここで上述のとおり、遺伝子型の分類上、大腸菌は、clonal complex (ＣＣ)型にまとめると理解がしやすく流行クローンを同定する上でも有用である。（１）のＯＲＦの保有パターンはＣＣ型との相関が高く、ＣＣを推定するのに役立つ。（２）のORFの保有パターンを比較することで菌株識別が可能となる。
したがって、（１）のＯＲＦ検出結果を一つのコードとして作成することが好ましく、（２）のＯＲＦ検出結果はそれぞれ一つまたは二つまたは三つのコードとして作成することが好ましいが視認性の良さを考慮すると三つのコードとして作成することがより好ましい。
そして、たとえばこのようにして作成された２進法のコードを、より桁数を少なくして見やすくするため、たとえば１０進法に変換し、遺伝子型コードとする。以上のコード作成の一例を下記表１２および表１３に示す。表１２の例は表１および表３のEDL933株に対して、表７、８および９記載のプライマーセットを用いたものである。表１３の例は表１、表３および表４のＮＡ１１４株に対して、表１０および表１１記載のプライマーセットを用いたものである。
表８に示したプライマーセットは特に腸管出血性大腸菌において菌株識別能力が高く、表９に示したプライマーセットは腸管出血性大腸菌以外の広範なクローンの大腸菌で菌株識別能を発揮する。また表１０および表１１に示したプライマーセットはクローンを大別すると同時に、ＳＴ１３１クローンに対して高い菌株識別能を発揮するが、表８、表９、表１０および表１１にあげた検出ORFはそれぞれ腸管出血性大腸菌やST131に限定されるわけではなく、全てのクローンにおいて使用可能である。また、プライマーセットを表８、表９、表１０および表１１のように分けることで、検出された大腸菌の血清型などが判明している場合は、表８、表９、表１０または表１１に示したプライマーセットのいずれか１種類を実施するだけでも、必要な効果が得られる。
まず、適切なプライマーを使用したＰＣＲおよび電気泳動により、試験対象の大腸菌における各ＯＲＦの有無を検出し、それを２進法によりコード化する。そして、このコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードを得る。表１２の例ではコードは429−476−1９−1、表１３の例ではコードは７１−２０−１６６となる。
表１２および１３に示された例において、コード１およびコード５は（１）のORFの検出結果をまとめたものであるので、複数の大腸菌株について遺伝子型コードを作成した場合に、大腸菌のCCに相当する数値となる。この数値からMLST相当のクローナリティを判断することができる。コード２とコード3とコード4とコード６とコード７の組み合わせは菌株に固有のコードであり、計算上229種類の遺伝子型に分けることが可能である。コード２は特に腸管出血性大腸菌における菌株識別能が高くなるようORFが選択されており、コード3およびコード４は腸管出血性大腸菌以外の大腸菌における菌株識別能が高くなるようORFが選択されており、多くのクローンにおいて菌株識別が可能である。コード６とコード７はＳＴ１３１クローンに対して菌株識別能が高くなるようにＯＲＦが選択されており、薬剤耐性大腸菌の菌株識別に有効である。
具体的には、たとえば、大腸菌臨床分離株24株における（１）のORF １０個（ECNA114＿4208〜ECS0053）の保有の有無を、上記と同様にして２進法コード化、さらに１０進法コード化すると、下記表１４のとおりである。
表１４において、一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型、上から4番目及び5番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型およびclonal complex (CC)型である。なお、菌株番号１６〜１９のO157：H7はすべてST11、CC11、菌株番号２０〜２２のO26：H11またはO26：HNMは全てST21、CC29、菌株番号２３および２４のO111:H-はすべてST16、CC29と考えられる。
このように判定結果をコード化すると遺伝的に近縁な株や血清型が同じ株では同一値となり、近縁関係がわかる。また、市販血清による血清型が決められない場合においても、遺伝子型が得られるため、汎用性の高いデータが得られる。さらに得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。
このように判定結果をコード化すると遺伝的に近縁な株や血清型が同じ株では同一値となり、近縁関係がわかる。また、市販血清による血清型が決められない場合においても、遺伝子型が得られるため、汎用性の高いデータが得られる。さらに得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。
さらに（２）genomic islandを構成するORFのうちコード２を構成するORFの検出を行うと表１５のとおりである。
表１５において一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型、上から4番目及び5番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型およびclonal complex (CC)型である。
24株は19種類の遺伝子型に細分された。
24株は19種類の遺伝子型に細分された。
さらに（２）genomic islandを構成するORFのうちコード３およびコード４を構成するORFの検出を行うと表１６のとおりである。
表１６において、一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型、上から4番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型である。
24株は19種類の遺伝子型に細分された。
24株は19種類の遺伝子型に細分された。
具体的には、たとえば、ST１３１を中心とした大腸菌臨床分離株24株における（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic islandを構成するORFを組み合わせ、コード５、コード６およびコード７を構成するORFの検出を行うと表１７のとおりである。
表１７において、一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型、上から4番目及び5番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型およびclonal complex (CC)型である。
なお、菌株番号５５、５７〜６０および７５〜８７の株はすべてＳＴ１３１であると考えられる。また同一クローン（ＳＴ１３１）と考えられる１７株は１４種類の遺伝子型に細分された。
このように（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic islandを構成するORFを組み合わせることで、クローンの同定と菌株識別を同時に行うことが可能となる。
なお、菌株番号５５、５７〜６０および７５〜８７の株はすべてＳＴ１３１であると考えられる。また同一クローン（ＳＴ１３１）と考えられる１７株は１４種類の遺伝子型に細分された。
このように（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic islandを構成するORFを組み合わせることで、クローンの同定と菌株識別を同時に行うことが可能となる。
さらに、本発明で検出の対象としているＯＲＦの大部分は、大腸菌の病原性等に関連しないＯＲＦである。病原性に関連するなど、特定の機能を有する遺伝子は、その大腸菌が宿主内で増殖する確率を上げたり、あるいはその遺伝子産物が宿主の免疫システムのターゲットとなり、反対に生存確率を下げたりすることがある。つまりこのような遺伝子は、大腸菌の多くが持っている、あるいは反対にほとんど持っていないと考えられる。本発明では、このようなバイアスがかからないように適切なＯＲＦを選択して遺伝子型別分類を行っているのである。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
腸管出血性大腸菌、病院で臨床分離された大腸菌および健常者から分離された大腸菌の合計24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
腸管出血性大腸菌、病院で臨床分離された大腸菌および健常者から分離された大腸菌の合計24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜ORF検出によるクローン同定＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１４組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１４個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表１８のとおりである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１４本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１および表１４に示す。
１反応につき最大１４本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１および表１４に示す。
表９において、前述のようにコードから近縁な株が判明するが、たとえば菌株１，２および３はコードが５８７であることからESBL産生菌が多いとされるST131であることがわかる。また、菌株番号１６〜１９のO157：H7はすべてST11、CC11、菌株番号２０〜２２のO26：H11またはO26：HNMは全てST21、CC29、菌株番号２３および２４のO111:H-はすべてST16、CC29と考えられる。
実施例２
先の実施例と同じ大腸菌の合計24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜ORF検出（コード２）による菌株識別＞
（大腸菌の培養）
臨床分離された腸管出血性大腸菌２４株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
先の実施例と同じ大腸菌の合計24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜ORF検出（コード２）による菌株識別＞
（大腸菌の培養）
臨床分離された腸管出血性大腸菌２４株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１１組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１１個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表１９のとおりである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１１本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図２および表１５に示す。
１反応につき最大１１本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図２および表１５に示す。
表１５において、において、一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型、上から4番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型である。 24株は19種類の遺伝子型に細分された。
実施例3
先の実施例と同じ大腸菌の合計24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
先の実施例と同じ大腸菌の合計24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜ORF検出（コード３および４）による菌株識別＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１３組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１３個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表２０のとおりである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１３本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図３および表１６に示す。
１反応につき最大１３本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図３および表１６に示す。
表１６において、一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型、上から4番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型である。
24株は19種類の遺伝子型に細分された。
24株は19種類の遺伝子型に細分された。
実施例4
以下、プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ大腸菌24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
以下、プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ大腸菌24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１４組あるいは１１組あるいは１３組を組み合わせ３本の反応チューブを使用し、３８個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ（primer mixture 1、2および3）、及びその最終濃度は下記表２１、表２２および表２３のとおりである。
配列番号314は配列番号1に対して1塩基の置換したものであり、配列番号315は配列番号2に対して2塩基の付加したものであり、配列番号316は配列番号3に対して2塩基の置換したものであり、配列番号317は配列番号4に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号318は配列番号5に対して1塩基の置換したものであり、配列番号319は配列番号6に対して1塩基の置換したものであり、配列番号320は配列番号7に対して1塩基の欠失したものであり、配列番号321は配列番号8に対して1塩基の置換したものであり、配列番号322は配列番号9に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号323は配列番号10に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号324は配列番号11に対して2塩基の付加したものであり、配列番号325は配列番号12に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号326は配列番号13に対して1塩基の置換したものであり、配列番号327は配列番号14に対して1塩基の欠失したものであり、配列番号328は配列番号15に対して2塩基の付加したものであり、配列番号329は配列番号16に対して2塩基の付加したものであり、配列番号330は配列番号17に対して1塩基の付加と1塩基の欠失したものであり、配列番号331は配列番号18に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号332は配列番号19に対して1塩基の欠失したものであり、配列番号333は配列番号20に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号334は配列番号76に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号335は配列番号77に対して2塩基の欠失したものであり、配列番号336は配列番号78に対して2塩基の置換したものであり、配列番号337は配列番号79に対して1塩基の付加したものであり、配列番号338は配列番号80に対して2塩基の欠失したものであり、配列番号339は配列番号81に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号340は配列番号82に対して2塩基の置換したものであり、配列番号341は配列番号83に対して1塩基の置換したものであり、配列番号342は配列番号84に対して2塩基の置換したものであり、配列番号343は配列番号85に対して1塩基の欠失したものであり、配列番号344は配列番号100に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号345は配列番号101に対して2塩基の付加したものであり、配列番号346は配列番号86に対して2塩基の置換したものであり、配列番号347は配列番号87に対して2塩基の付加したものであり、配列番号348は配列番号88に対して1塩基の置換したものであり、配列番号349は配列番号89に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号350は配列番号90に対して1塩基の付加したものであり、配列番号351は配列番号91に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号352は配列番号92に対して1塩基の置換したものであり、配列番号353は配列番号93に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号354は配列番号94に対して2塩基の置換したものであり、配列番号355は配列番号95に対して2塩基の置換したものであり、配列番号356は配列番号96に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号357は配列番号97に対して2塩基の付加したものであり、配列番号358は配列番号98に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号359は配列番号99に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号360は配列番号102に対して2塩基の付加したものであり、配列番号361は配列番号103に対して2塩基の置換したものであり、配列番号362は配列番号104に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号363は配列番号105に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号364は配列番号106に対して2塩基の置換したものであり、配列番号365は配列番号107に対して1塩基の付加したものであり、配列番号366は配列番号108に対して2塩基の置換したものであり、配列番号367は配列番号109に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号368は配列番号110に対して1塩基の挿入したものであり、配列番号369は配列番号111に対して2塩基の置換したものであり、配列番号370は配列番号112に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号371は配列番号113に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号372は配列番号114に対して1塩基の付加したものであり、配列番号373は配列番号115に対して2塩基の置換したものであり、配列番号374は配列番号116に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号375は配列番号117に対して2塩基の欠失したものである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１４本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図４、５および６に示す。図1、２および３、表１４、１５および１６と同様の結果が得られた。
１反応につき最大１４本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図４、５および６に示す。図1、２および３、表１４、１５および１６と同様の結果が得られた。
実施例5
＜腸管出血性大腸菌の菌株識別＞
（大腸菌の培養）
集団感染２事例由来１８株を含む臨床分離された腸管出血性大腸菌２４株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
＜腸管出血性大腸菌の菌株識別＞
（大腸菌の培養）
集団感染２事例由来１８株を含む臨床分離された腸管出血性大腸菌２４株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１１組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１１個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は表１９のとおりである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１１本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図７および表１８に示す。
１反応につき最大１１本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図７および表１８に示す。
表２４において、一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型ある。 24株は９種類の遺伝子型に細分された。24株のうち菌株番号２６、２８、３０、３２，３４、３６、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６および４７、菌株番号２５および３３はそれぞれ同一の集団感染事例から採取された菌だが、同一遺伝子型に属することがわかる。
実施例6
病院で臨床分離された集団感染３事例由来７株を含む大腸菌および健常者から分離されたST131に相当する大腸菌の合計24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
病院で臨床分離された集団感染３事例由来７株を含む大腸菌および健常者から分離されたST131に相当する大腸菌の合計24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜ST131クローンの菌株識別＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１３組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１３個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は表２０のとおりである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１３本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図８および表２５に示す。
１反応につき最大１３本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図８および表２５に示す。
表２５において、一番上の行は菌株の番号である。24株は１４種類の遺伝子型に細分された。24株のうち菌株番号５１、５３、および５５、菌株番号５２および５４、菌株番号６８および７０はそれぞれ同一の集団感染事例から採取された菌だが、同一遺伝子型に属することがわかる。
実施例７
＜クローン同定とST131クローンの菌株識別＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
＜クローン同定とST131クローンの菌株識別＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１２組を組み合わせ２本の反応チューブを使用し、２３個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は表２６および２７のとおりである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１２本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１３と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図９、１０および表１７に示す。
１反応につき最大１２本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１３と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図９、１０および表１７に示す。
表１７において、一番上の行は菌株の番号である。
表１７において、一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型、上から4番目及び5番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型およびclonal complex (CC)型である。
24株は５種類のクローンに分類された。なお、菌株番号５５、５７〜６０および７５〜８７の株はすべてＳＴ１３１であると考えられる。また同一クローン（ＳＴ１３１）と考えられる１７株は１４種類の遺伝子型に細分された。
このように（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic islandを構成するORFを組み合わせることで、クローンの同定と菌株識別を同時に行うことが可能となる。
表１７において、一番上の行は菌株の番号、上から2番目の行はO血清型、上から3番目の行はH血清型、上から4番目及び5番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型およびclonal complex (CC)型である。
24株は５種類のクローンに分類された。なお、菌株番号５５、５７〜６０および７５〜８７の株はすべてＳＴ１３１であると考えられる。また同一クローン（ＳＴ１３１）と考えられる１７株は１４種類の遺伝子型に細分された。
このように（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic islandを構成するORFを組み合わせることで、クローンの同定と菌株識別を同時に行うことが可能となる。
実施例８
以下、表１０および表１１に示されるプライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
実施例７と同じ大腸菌24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
以下、表１０および表１１に示されるプライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
実施例７と同じ大腸菌24株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
＜プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例＞
（大腸菌の培養）
大腸菌であると同定された２４の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer (MgCl2含有) 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、25mM MgCl2 0.8μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl、蒸留水14.2μlおよびprimer mixtureを0.4μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１２組を組み合わせ２本の反応チューブを使用し、２３個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は表２８および２９のとおりである。
配列番号466は配列番号４１３に対して1塩基の置換したものであり、配列番号467は配列番号４１４に対して1塩基の置換したものであり、配列番号468は配列番号４１５に対して1塩基の付加したものであり、配列番号469は配列番号４１６に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号470は配列番号４１７に対して1塩基の欠失したものであり、配列番号471は配列番号４１８に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号472は配列番号４１９に対して1塩基の置換したものであり、配列番号473は配列番号４２０に対して1塩基の付加したものであり、配列番号474は配列番号４２１に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号475は配列番号４２２に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号476は配列番号３９１に対して1塩基の付加したものであり、配列番号477は配列番号３９２に対して1塩基の置換したものであり、配列番号478は配列番号３９３に対して1塩基の付加したものであり、配列番号479は配列番号３９４に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号480は配列番号４６２に対して2塩基の付加したものであり、配列番号481は配列番号４６３に対して2塩基の置換したものであり、配列番号482は配列番号３９５に対して1塩基の置換と1塩基の欠失したものであり、配列番号483は配列番号３９６に対して1塩基の置換したものであり、配列番号484は配列番号４６４に対して1塩基の置換したものであり、配列番号485は配列番号４６５に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号486は配列番号４０１に対して1塩基の置換したものであり、配列番号487は配列番号４０２に対して1塩基の置換したものであり、配列番号488は配列番号４０３に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号489は配列番号４０４に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号490は配列番号４０５に対して2塩基の欠失したものであり、配列番号491は配列番号４０６に対して1塩基の付加したものであり、配列番号492は配列番号４０７に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものであり、配列番号493は配列番号４０８に対して1塩基の欠失したものであり、配列番号494は配列番号３９７に対して1塩基の置換したものであり、配列番号495は配列番号３９８に対して1塩基の付加と1塩基の置換したものである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で4分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 90秒のサイクルを30回繰り返したのち、72℃ 7分のファイナルエクステンションを行った。サイクル反応終了後、PCR産物は４℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、120Vで60分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１２本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１１および１２に示す。図９および１０、表１７と同様の結果が得られた。
１反応につき最大１２本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表１２と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１１および１２に示す。図９および１０、表１７と同様の結果が得られた。
Claims (13)
- 大腸菌の染色体上の、
（１）genomic isletを構成するORF、および
（２）genomic islandを構成するORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。 - 前記（１）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、ECNA114＿4208、EC55989＿4085、EC55989＿0018、ECNA114＿1457、EC55989＿1089、LF82＿085、ECS4731、ECS2436、ECNA114＿0460、ECS0053、EC55989＿0068、EC55989＿0189、EC55989＿0636、EC55989＿0699、EC55989＿0830、EC55989＿1577、EC55989＿1649、EC55989＿1821、EC55989＿2719、EC55989＿4248、EC55989＿4374、EC55989＿4548、ECABU＿c34730、ECNA114＿0007、ECNA114＿0140、ECS0914、ECS3904、ECS4280、ECS4300、ECS4827およびLF82＿248からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子である請求項１に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 前記（２）のＯＲＦにおけるgenomic islandがECS1190、Z2415、Z1432、ECS3501、ECH74115＿1587、EC55989＿2129、Z1797、EC55989＿2641、ECH74115＿2877、ECH74115＿1791、ECNA114＿0874、EC55989＿1406、ECNA114＿2097、ECNA114＿3979、ECNA114＿4026、S0497、ECNA114＿1225、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、ECH74115＿3039、ECH74115＿2899、ECH74115＿3056、ECH74115＿3024、Z2404、ECH74115＿3237、ECS1189、Z1456、ECH74115＿2915、Z2384、ECS1527、ECH74115＿1860、Z1854、Z3358、Z3362、、EC55989＿0314、EC55989＿0547、EC55989＿0685、EC55989＿0762、EC55989＿0766、EC55989＿0799、EC55989＿0805、EC55989＿1022、EC55989＿1258、EC55989＿1399、EC55989＿1636、EC55989＿2099、EC55989＿2104、EC55989＿2188、EC55989＿2249、EC55989＿2256、EC55989＿2311、EC55989＿3358、EC55989＿3371、EC55989＿3396、EC55989＿3400、EC55989＿3509、EC55989＿4034、EC55989＿4038、EC55989＿4041、EC55989＿4278、EC55989＿4878、EC55989＿4903、EC55989＿4941、EC55989＿4958、EC55989＿4963、EC55989＿4969、EC55989＿4972、EC55989＿5004、EC55989＿5006、ECS0288、ECS0797、ECS0813、ECS1102、ECS1176、ECS1299、ECS1301、ECS1516、ECS1564、ECS1592、ECS1597、ECS1662、ECS1663、ECS1694、ECS1933、ECS1937、ECS2171、ECS2283、ECS2792、ECS2927、ECS2996、ECS4458、ECS5272、ECS5304、ECS5305、ECSF＿3727、ECSF＿4152、ECSF2757、S0692、S0913、S1482、S2103、S3222、S4314、、S4832、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、P423＿16715c、P423＿16735c、P423＿16745c、P423＿16780c、ECNA114＿4753、P423＿10825c、配列番号376、配列番号377、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号382、配列番号383、配列番号384、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号389、配列番号390、配列番号455、配列番号456、および配列番号461からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子である請求項１に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 前記（１）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、ECNA114＿4208、EC55989＿4085、EC55989＿0018、ECNA114＿1457、EC55989＿1089、LF82＿085、ECS4731、ECS2436、ECNA114＿0460、ECS0053、EC55989＿0068、EC55989＿0189、EC55989＿0636、EC55989＿0699、EC55989＿0830、EC55989＿1577、EC55989＿1649、EC55989＿1821、EC55989＿2719、EC55989＿4248、EC55989＿4374、EC55989＿4548、ECABU＿c34730、ECNA114＿0007、ECNA114＿0140、ECS0914、ECS3904、ECS4280、ECS4300、ECS4827およびLF82＿248からなる群より選ばれる少なくとも４種の遺伝子である請求項１に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 前記（２）のＯＲＦにおけるgenomic islandがECS1190、Z2415、Z1432、ECS3501、ECH74115＿1587、EC55989＿2129、Z1797、EC55989＿2641、ECH74115＿2877、ECH74115＿1791、ECNA114＿0874、EC55989＿1406、ECNA114＿2097、ECNA114＿3979、ECNA114＿4026、S0497、ECNA114＿1225、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、ECH74115＿3039、ECH74115＿2899、ECH74115＿3056、ECH74115＿3024、Z2404、ECH74115＿3237、ECS1189、Z1456、ECH74115＿2915、Z2384、ECS1527、ECH74115＿1860、Z1854、Z3358、Z3362、、EC55989＿0314、EC55989＿0547、EC55989＿0685、EC55989＿0762、EC55989＿0766、EC55989＿0799、EC55989＿0805、EC55989＿1022、EC55989＿1258、EC55989＿1399、EC55989＿1636、EC55989＿2099、EC55989＿2104、EC55989＿2188、EC55989＿2249、EC55989＿2256、EC55989＿2311、EC55989＿3358、EC55989＿3371、EC55989＿3396、EC55989＿3400、EC55989＿3509、EC55989＿4034、EC55989＿4038、EC55989＿4041、EC55989＿4278、EC55989＿4878、EC55989＿4903、EC55989＿4941、EC55989＿4958、EC55989＿4963、EC55989＿4969、EC55989＿4972、EC55989＿5004、EC55989＿5006、ECS0288、ECS0797、ECS0813、ECS1102、ECS1176、ECS1299、ECS1301、ECS1516、ECS1564、ECS1592、ECS1597、ECS1662、ECS1663、ECS1694、ECS1933、ECS1937、ECS2171、ECS2283、ECS2792、ECS2927、ECS2996、ECS4458、ECS5272、ECS5304、ECS5305、ECSF＿3727、ECSF＿4152、ECSF2757、S0692、S0913、S1482、S2103、S3222、S4314、、S4832、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、P423＿16715c、P423＿16735c、P423＿16745c、P423＿16780c、ECNA114＿4753、P423＿10825c、配列番号376、配列番号377、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号382、配列番号383、配列番号384、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号389、配列番号390、配列番号455、配列番号456、および配列番号461からなる群より選ばれる少なくとも４種の遺伝子である、請求項１に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 前記（１）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、ECNA114＿4208、EC55989＿4085、EC55989＿0018、ECNA114＿1457、EC55989＿1089、LF82＿085、ECS4731、ECS2436、ECNA114＿0460およびECS0053からなる１０種の遺伝子、及び／又はECNA114＿4208、EC55989＿4085、EC55989＿1089、LF82＿085、ECS4731、ECNA114＿0460およびECS0053からなる７種の遺伝子であり、前記（２）のＯＲＦにおけるgenomic islandがECS1190、Z2415、Z1432、ECS3501、ECH74115＿1587、EC55989＿2129、Z1797、EC55989＿2641、ECH74115＿2877、ECH74115＿1791からなる１０種の遺伝子、及び／又はECNA114＿0874、EC55989＿1406、ECNA114＿2097、EC55989＿2129、ECNA114＿3979、ECNA114＿4026、S0497、ECNA114＿1225、配列番号63、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる１２種の遺伝子、及び／又はS0497、ECNA114＿0874、P423＿10825c、EC55989＿2129、ECNA114＿4026、P423＿16715c、配列番号63、配列番号376、配列番号380、配列番号381、配列番号389、配列番号390および配列番号461からなる１３種の遺伝子である、請求項１に記載の大腸菌のクローン同定および菌株識別法。
- 配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０または配列番号４１３と４１４、配列番号１１と１２または配列番号４１５と４１６、配列番号１３と１４または配列番号４１７と４１８、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８または配列番号４１９と４２０、配列番号１９と２０または配列番号４２１と４２２に示された１５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーを用いて、PCR法により前記（１）のORFの検出を行い、配列番号７６と７７、配列番号７８と７９、配列番号８０と８１、配列番号８２と８３、配列番号８４と８５、配列番号８６と８７、配列番号８８と８９、配列番号９０と９１、配列番号９２と９３、配列番号９４と９５、配列番号９６と９７、配列番号９８と９９、配列番号１００と１０１または配列番号４０３と４０４、配列番号１０２と１０３、配列番号１０４と１０５、配列番号１０６と１０７、配列番号１０８と１０９、配列番号１１０と１１１または配列番号３９１と３９２、配列番号１１２と１１３、配列番号１１４と１１５、配列番号１１６と１１７、配列番号３９３と３９４、配列番号３９５と３９６、配列番号３９７と３９８、配列番号４０１と４０２、配列番号４０５と４０６、配列番号４０７と４０８、配列番号４６２と４６３、および配列番号４６４と４６５に示された３１組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる２９組のプライマーを用いて、PCR法により前記（２）のORFの検出を行う、請求項２から６の何れか１項に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項７に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 前記PCR法がマルチプレックスPCR法である、請求項７又は８に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 前記（４）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化する、請求項１〜９の何れか１項に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化する、請求項１０に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
- 配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０または配列番号４１３と４１４、配列番号１１と１２または配列番号４１５と４１６、配列番号１３と１４または配列番号４１７と４１８、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８または配列番号４１９と４２０、配列番号１９と２０または配列番号４２１と４２２に示された１５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーと、配列番号７６と７７、配列番号７８と７９、配列番号８０と８１、配列番号８２と８３、配列番号８４と８５、配列番号８６と８７、配列番号８８と８９、配列番号９０と９１、配列番号９２と９３、配列番号９４と９５、配列番号９６と９７、配列番号９８と９９、配列番号１００と１０１または配列番号４０３と４０４、配列番号１０２と１０３、配列番号１０４と１０５、配列番号１０６と１０７、配列番号１０８と１０９、配列番号１１０と１１１または配列番号３９１と３９２、配列番号１１２と１１３、配列番号１１４と１１５、配列番号１１６と１１７、配列番号３９３と３９４、配列番号３９５と３９６、配列番号３９７と３９８、配列番号４０１と４０２、配列番号４０５と４０６、配列番号４０７と４０８、配列番号４６２と４６３および配列番号４６４と４６５に示された３１組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる２９組のプライマーを含む、クローン同定法および／又は菌株識別のためのプライマーセット。
- 上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項１２に記載の大腸菌のクローン同定法および／又は菌株識別のためのプライマーセット。
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