JP2016047051A - Il-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof - Google Patents

Il-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof Download PDF

Info

Publication number
JP2016047051A
JP2016047051A JP2015187174A JP2015187174A JP2016047051A JP 2016047051 A JP2016047051 A JP 2016047051A JP 2015187174 A JP2015187174 A JP 2015187174A JP 2015187174 A JP2015187174 A JP 2015187174A JP 2016047051 A JP2016047051 A JP 2016047051A
Authority
JP
Grant status
Application
Patent type
Prior art keywords
polypeptides
novel
molecules
those
nucleic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2015187174A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
チェン,ジアン
Jian Chen
フィルバロッフ,エレン
Filvaroff Ellen
シャーマン フォン,
Fong Sherman
シャーマン フォン,
ゴッダード,オードリー
Audrey Goddard
ジェー. ゴドフスキー,ポール
J Godowski Paul
ジェー. ゴドフスキー,ポール
グリマルディ,クリストファー,ジェー.
J Christopher Grimaldi
ガーニー,オースティン,エル.
Austin L Gurney
リー,ハンチョン
Hanzhong Li
ヒラン,ケネス,ジェー.
Kenneth J Hillan
タマス,ダニエル
Daniel Tumas
ロッカレン,メノー バン
Van Lookeren Menno
ロッカレン,メノー バン
バンデレン,リチャード,エル.
L Vandlen Richard
ワタナベ,コリン,ケー.
Colin K Watanabe
ウィリアムズ,ピー.,ミッキー
P Mickey Williams
ウッド,ウィリアム,アイ.
William I Wood
ヤンスラ,ダニエル,ジー.
Daniel G Yansura
Original Assignee
ジェネンテック, インコーポレイテッド
Genentech Inc
ジェネンテック, インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date

Links

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide identification and isolation of novel DNA and recombinant production of novel polypeptides having sequence identity to interleukin-17 and to interleukin-17 receptor protein.SOLUTION: The present invention provides novel polypeptides and nucleic acid molecules encoding those polypeptides. Also provided herein are vectors and host cells comprising those nucleic acid sequences, chimeric polypeptide molecules comprising the polypeptides fused to heterologous polypeptide sequences, antibodies which bind to the polypeptides, and recombinant production methods for producing the polypeptides.SELECTED DRAWING: None

Description

(発明の分野) (Field of the Invention)
本発明は、概して、ここで「PRO」ポリペプチドと命名したインターロイキン-17及びインターロイキン-17レセプタータンパク質に対して配列同一性を有する新規なポリペプチドの組み換え法による生産、並びに新規なDNAの同定と単離に関する。 The present invention generally where "PRO" production by recombinant methods of a novel polypeptide having sequence identity to the polypeptide designated interleukin -17 and interleukin-17 receptor protein, as well as a novel DNA identification and about the isolation.

細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。 Extracellular proteins, formation of multicellular organisms and plays an important role in differentiation and maintenance. 多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取る情報に支配される。 The fate of many individual cells, the interaction with e.g. proliferation, migration, differentiation, or other cells, is typically governed by information received from other cells and / or the immediate environment. この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。 This information is often transmitted by secreted polypeptides (for instance, mitogenic factors, survival factors, cytotoxic factors, differentiation factors, neuropeptides, and hormones) which are, this is received by diverse cell receptors or membrane-bound proteins It is to be interpreted. これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。 These secreted polypeptides or signaling molecules normally pass through the cellular secretory pathway to reach their site of action in the extracellular environment.
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。 Secreted proteins, pharmaceuticals, diagnostics, including biosensors and bioreactors have various industrial applications. 血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。 Thrombolytic agents, interferons, such as interleukin, erythropoietin, colony stimulating factors, and various other cytokines, Most protein drugs available at present is a secreted protein. これらのレセプターは、膜タンパク質であり、治療又は診断用薬としての可能性をも有している。 These receptors are membrane proteins, also have potential as therapeutic or diagnostic agents.

膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。 Membrane-bound proteins and receptors, formation of multicellular organisms and plays an important role in differentiation and maintenance. 多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報に支配される。 The interaction of many fate of individual cells, eg, proliferation, migration, differentiation, or other cells, is typically governed by information received from other cells and / or the immediate environment. この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。 This information is often transmitted by secreted polypeptides (for instance, mitogenic factors, survival factors, cytotoxic factors, differentiation factors, neuropeptides, and hormones) which are, which is received by diverse cell receptors or membrane-bound proteins It is interpreted. このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。 Such membrane-bound proteins and cell receptors include, but are not limited to, cytokine receptors, receptor kinases, receptor phosphatases, cell - receptors involved in cell-cell interactions, and selectins and integrins such as cell adhesion including the molecule. 例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。 For instance, transduction of signals that regulate cell growth and differentiation is regulated in part by phosphorylation of various cellular proteins. そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。 Protein tyrosine kinases, enzymes that catalyze that process, can also act as growth factor receptors. 例えば、繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。 For example, it includes fibroblast growth factor and nerve growth factor receptor.
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。 Membrane-bound proteins and receptor molecules, including as pharmaceutical and diagnostic agents has various industrial applications. 例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター-リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。 Receptor immunoadhesins, for instance, receptors - can be used as therapeutic agents to block ligand interactions. 膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。 The membrane-bound proteins can also be used to screen for peptide or small molecule inhibitors of potential relevant receptor / ligand interaction.

新規な天然の分泌及び膜結合レセプタータンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の両方によってなされている。 Efforts to identify the secreted and membrane-bound receptor proteins of the novel natural have been made by both industry and academia. 多くの努力が新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質に対するコード化配列を同定するために哺乳動物の組換えDNAライブラリをスクリーニングすることに注がれている。 Many efforts are focused on the screening of mammalian recombinant DNA libraries to identify the coding sequences for novel secreted and membrane-bound receptor proteins. スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Kleinら, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108-7113 (1996);米国特許5,536,637を参照されたい]。 Examples of screening methods and techniques are described in the literature [see, for example, Klein et al., Proc.Natl.Acad.Sci, 93:. 7108-7113 (1996); see U.S. Patent 5,536,637].
この点から、本発明は、免疫媒介及び炎症疾患に関連することが示されているインターロイキン-17(IL-17)のレセプター及び新規分泌ポリペプチドに関する。 In this respect, the present invention relates to receptors and novel secreted polypeptides of the interleukin -17 (IL-17) which has been shown to be related to immune-mediated and inflammatory diseases. 免疫関連及び炎症疾患は、完全な複合現象の症状又は結果であり、これらの殆どは複合的に関連した生物学的経路であり、正常な生理機能において、発作又は損傷へ応答すること、発作又は損傷からの回復を開始すること、並びに外来生物に対する先天性及び後天性の防御を増すことにおいて絶対不可欠である。 Immune related and inflammatory diseases are the symptoms or the results of the complete complex phenomenon, most of these are biological pathways associated in a complex manner, in normal physiology, it responds to the stroke or injury, stroke or initiating the recovery from injury, as well as essential in increasing the innate and acquired defense against foreign organisms. 疾患や病理現象は、これら正常な生理学的経路が付加的発作や損傷を、応答の強度と直接に関連しているものとして、異常な制御又は過度の刺激の結果として、自己への反応として、又はこれらの組み合わせの何れかとして生じせしめる場合に起こる。 Diseases and pathological phenomena, these normal physiological pathways additional attack and damage, as being directly related to the intensity of the response, as a consequence of abnormal regulation or excessive stimulation, as a reaction to self, or it occurs when allowed to occur as either of these combinations.
これら疾患の起源には、殆どにおいて多段階経路及び複数の異なった生物学的系/経路が関与しているが、これらの一つ又は複数の経路の重要なポイントでの介入は、改善的又は治療的効果をもたらすことができる。 The origin of these diseases, but biological systems / pathways multistep pathways and several different is involved in most, intervention at critical points in these one or more paths, ameliorative or it can result in a therapeutic effect. 治療的介入は、有害なプロセス/経路の拮抗作用又は有益なプロセス/経路の刺激の何れかによって生じることができる。 Therapeutic intervention can occur by either stimulation of antagonism or beneficial process / pathway detrimental process / pathway.

多くの免疫関連疾患は知られていて、広く研究されてきた。 Many immune related diseases are known, have been extensively studied. このような疾患には、免疫媒介炎症疾患(例えば、リウマチ様関節炎、免疫媒介腎疾患、肝胆道疾患、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、及び喘息)、非免疫媒介炎症疾患、感染症、免疫不全症、腫瘍症などが含まれる。 Such diseases include immune-mediated inflammatory diseases (e.g., rheumatoid arthritis, immune mediated renal disease, hepatobiliary diseases, inflammatory bowel disease (IBD), psoriasis, and asthma), non-immune-mediated inflammatory diseases, infectious diseases, immunodeficiency disease, are included, such as a tumor disease.
Tリンパ球(T細胞)は、哺乳動物の免疫応答の重要な構成物である。 T lymphocytes (T cells) are an important constituent of the mammalian immune response. T細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)領域中の遺伝子によってコードされている自己分子と結合する抗原を認識する。 T cells recognize antigens which are associated with a self-molecule encoded by genes of the major histocompatibility complex (MHC) in area. 該抗原は、MHC分子とともに抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片などの表面に表示されうる。 The antigen, antigen presenting cells together with MHC molecules, virus infected cells, cancer cells, may be displayed on the surface of such implants. T細胞系は、宿主哺乳動物の健康へ脅威を与えるこれら改変細胞を除去する。 T cell lines, to remove these modified cells that pose a threat to the health of the host mammal. T細胞には、ヘルパーT細胞と細胞傷害性T細胞(キラーT細胞)が含まれる。 T cells include helper T cells and cytotoxic T cells (killer T cells). ヘルパーT細胞は、抗原表示細胞上の抗原-MHC複合体の認識の後に大々的に増殖する。 Helper T cells proliferate extensively following recognition of antigen -MHC complex on an antigen presenting cells. また、ヘルパーT細胞は、種々のサイトカイン、すなわちB細胞、細胞傷害性T細胞及び免疫応答に関与する種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を担うリンフォカインを分泌する。 Also, helper T cells secrete various cytokines, i.e. B cells, lymphokines play a central role in the activation of a variety of other cells involved in cytotoxic T cells and immune responses.
体液性及び細胞性免疫応答の双方における中心的現象は、ヘルパーT細胞の活性化とクローン性増殖である。 Central phenomena in both humoral and cellular immune responses is the activation of helper T cells and clonal expansion. ヘルパーT細胞活性化は、抗原表示細胞の表面におけるT細胞レセプター(TCR)-CD3複合体と抗原-MHCの相互作用によってはじまる。 Helper T cell activation is initiated by interaction of the T cell receptor (TCR)-CD3 complex with an antigen -MHC on the surface of antigen presenting cells. 該相互作用は、生成ヘルパーT細胞が細胞周期(G0からG1への移行)へ入ること、並びにIL-2及び時にはIL-4のための高親和性レセプターの発現が生じることを含む、生化学現象のカスケードを媒介する。 The interaction involves the generation helper T cells enter the (transition from G0 to G1) cell cycle, the well is the expression of the high affinity receptor for IL-2 and sometimes IL-4 occurs, Biochemistry It mediates the cascade of events. 活性化T細胞は、記憶細胞(免疫記憶細胞,メモリー細胞)又はエフェクター細胞へ増殖及び分化する周期を通して発達する。 Activated T cells, memory cells (immune memory cells, memory cells) develops through or period to proliferate and differentiate into effector cells.

TCRを通して媒介されるシグナルに加えて、T細胞の活性化には、抗原提示細胞によって、或いは抗原提示細胞上の膜結合分子とT細胞の相互作用を通してのサイトカイン放出によって誘導される付加的な共刺激が含まれる。 In addition to the signals mediated through the TCR, activation of T cells, an additional co-by antigen presenting cells, or induced by cytokine release through interaction of membrane bound molecules and T cell on an antigen presenting cell stimulus are included. サイトカインIL-1及びIL-6が、共刺激のシグナルを示すことが示されている。 Cytokines IL-1 and IL-6 have been shown to exhibit a signal costimulatory. また、抗原提示細胞の表面に発現するB7分子とT細胞表面に発現するCD28及びCTL-4分子の間の相互作用は、T細胞活性化に作用する。 Also, the interaction between CD28 and CTL-4 molecules expressed on B7 molecules and T cell surface expressed on the surface of antigen-presenting cells, acts on T-cell activation. 活性化T細胞は、かなりの量のICAM-1、インテグリン、VLA-4、LFA-1、CD56等の細胞接着分子を発現する。 Activated T cells express significant amounts of ICAM-1, integrins, the VLA-4, LFA-1, cell adhesion molecules CD56 and the like.
リンパ球混合培養又は混合リンパ球培養反応(MLR)におけるT細胞増殖は、免疫系を刺激する化合物の能力の定着した指標である。 T cell proliferation in a mixed lymphocyte culture or mixed lymphocyte culture reaction (MLR) is an entrenched indication of the ability of a compound to stimulate the immune system. 多くの免疫応答では、炎症細胞は損傷又は感染の部分へ浸潤する。 In many immune responses, inflammatory cells infiltrate the injured or infected part. この遊走細胞は、感染組織の組織学的検査によって判定することができる好中球、好酸球、単球又はリンパ球性の細胞でありうる。 The migrating cells, neutrophils can be determined by histological examination of infected tissues, eosinophils can be a monocytic or lymphocytic cells. Current Protocols in Immunology, John E. Coliganら編,1994, John Wiley & Sons, Inc. Current Protocols in Immunology, John E. Coligan et al., Eds., 1994, John Wiley & Sons, Inc.

免疫関連疾患は、免疫応答を抑制することで治療することができる。 Immune related diseases can be treated by suppressing the immune response. 免疫刺激活性を有する分子を阻害する中和抗体を用いることは、免疫媒介及び炎症疾患の治療において有益である。 The use of neutralizing antibodies that inhibit molecules having immune stimulatory activity would be beneficial in the treatment of immune-mediated and inflammatory diseases. 免疫応答を阻害する分子は、免疫応答を阻害するのに利用することが可能であり(直接に、或いは抗体アゴニストの利用を経由するタンパク質)、それ故に免疫関連疾患を改善する。 Molecules which inhibit the immune response, it is possible to use in inhibiting an immune response (either directly, or proteins via the use of antibody agonists), thus ameliorate immune related disease.
インターロイキン-17(IL-17)は、Tリンパ指向性ヘルペスウイルスサイミリによってコードされているタンパク質の細胞類似物として同定されている[Rouvierら, J. Immunol., 150(12): 5445-5466(19993);Yanoら, J. Immunol., 122(12): 5483-5486(1995)及びYanoら, Immunity, 3(6): 811-821(1995)を参照]。 . Interleukin -17 (IL-17) is, [Rouvier et al have been identified as a cell analogs of the protein encoded by the T lymphotropic Herpes virus saimiri, J. Immunol, 150 (12): 5445- . 5466 (nineteen thousand nine hundred and ninety-three); Yano et al, J. Immunol, 122 (12): 5483-5486 (1995) and Yano et al., Immunity, 3 (6): 811-821 (1995)]. 後のキャラクタリゼーションでは、このタンパク質が、末梢組織での広範にわたる炎症誘発性の応答を誘導する有力ななサイトカインであることが示されている。 After the characterization, this protein has been shown to be a potent Do cytokines that induce extensive proinflammatory response over in peripheral tissues. IL-17は、CD4 活性化記憶T細胞によってのみ合成及び分泌される約32kDaのホモ二量体のサイトカインである(Fossiezら., Int. Rev. Immunol., 16: 541-551[1998]にて概説)。 IL-17 is a cytokine of about 32kDa homodimer of which is only synthesized and secreted by CD4 + activated memory T cells (Fossiez et al., Int Rev. Immunol, 16:. .. 541-551 [1998] outlined in).

限定された組織分布にもかかわらず、IL-17は種々の型の細胞に対してpletropicな生物活性を示す。 Despite the restricted tissue distribution, IL-17 exhibits a pletropic biological activity against various types of cells. IL-17は、多くのサイトカインの生産を刺激することが見出されている。 IL-17 has been found to stimulate the production of many cytokines. それは、繊維芽細胞、ケラチノサイト、上皮及び内皮細胞のような接着細胞によってIL-6、IL-8、プロスタグランジンE2、MCP-1及びG-CSFの分泌を誘導する。 It induces fibroblasts, keratinocytes, IL-6 by adherent cells like epithelial and endothelial cells, IL-8, the secretion of prostaglandin E2, MCP-1 and G-CSF. また、IL-17は、ICAM-1の表層での発現、T細胞の増殖、並びにCD34 ヒト前駆体の好中球への成長及び分化を誘導する能力がある。 Moreover, IL-17 is expressed at the surface of ICAM-1, proliferation of T cells, as well as ability to induce the growth and differentiation of neutrophils in CD34 + human progenitors. IL-17は、骨代謝にも関係しており、リウマチ様関節炎及び骨移植片のルースニングなどの活性化T細胞及びTNF-α生成の存在によって特徴付けられる病理学的症状において重要な役割を担うことが示唆されている(Van Bezooijenら., J. Bone Miner. Res., 14: 1513-1521[1999])。 IL-17 is related to bone metabolism, an important role in pathological conditions characterized by the presence of activated T cells and TNF-alpha generation, such as loosening of rheumatoid arthritis and bone graft it has been suggested to play (Van Bezooijen et, J. Bone Miner Res, 14:... 1513-1521 [1999]). リウマチ様関節炎患者に由来する滑膜組織の活性化T細胞が、正常な個人又は変形関節炎患者に由来する滑膜組織の活性化T細胞よりもより多量のIL-17を分泌することが見出された(Chabaudら., Arthritis Rheum., 42: 963-970[1999])。 Heading that activated T cells of synovial tissue derived from rheumatoid arthritis patients, secrete higher amounts of IL-17 than activated T cells of synovial tissue derived from normal individuals or osteoarthritis patients It is (Chabaud et al., Arthritis Rheum, 42:.. 963-970 [1999]). このことは、この炎症誘発性のサイトカインが、リウマチ様関節炎の滑膜炎症へ活発に貢献することを示唆している。 This is, this pro-inflammatory cytokines, suggesting that actively contributes to synovial inflammation of rheumatoid arthritis. その炎症誘発性の作用を別にして、さらに他の機構によって、IL-17はリウマチ様関節炎の病理の一因となっていると思われる。 Apart from its proinflammatory effects by yet another mechanism, IL-17 appears to have contributed to the pathology of rheumatoid arthritis. 例えば、IL-17が、骨芽細胞において破骨細胞分化因子(ODF)mRNAの発現を誘導することが示されている(Kotakeら., J. Clin. Invest., 103: 1345-1352[1999])。 For example, IL-17 has been shown to induce the expression of osteoclast differentiation factor (ODF) mRNA in osteoblasts (Kotake et al., J. Clin Invest, 103:... 1345-1352 [1999 ]). ODFは、骨吸収に関与している細胞である、破骨細胞への前駆細胞の分化を刺激する。 ODF is a cell that are involved in bone resorption, stimulate the differentiation of progenitor cells into osteoclasts. リウマチ様関節炎患者の滑膜において、IL-17のレベルが顕著に増加することから、IL-17の誘導による破骨細胞の形成が、リウマチ様関節炎における骨吸収で重要な役割を担うと思われる。 In synovium of rheumatoid arthritis patients, because the level of IL-17 is significantly increased, the formation of osteoclasts by induction of IL-17 is believed to play an important role in bone resorption in rheumatoid arthritis . また、IL-17は、多発性硬化症のような特定の他の自己免疫疾患において重要な役割を担うものと考えられている(Matuseviciusら., Mult. Scler., 5: 101-104[1999])。 Moreover, IL-17 is believed to play an important role in certain other autoimmune disorders such as multiple sclerosis (Matusevicius et al., Mult Scler, 5:... 101-104 [1999 ]). IL-17が更に、細胞内シグナル伝達によって、ヒトマクロファージにおけるCa2 流入及び[cAMP] の減少を刺激することが示されている(Jovanovicら., J. Immunol., 160: 3513[1998])。 IL-17 is further by intracellular signaling has been shown to stimulate the reduction of Ca2 + entry and [cAMP] i in human macrophages (Jovanovic et al., J. Immunol, 160:.. 3513 [1998] ). IL-17で処理された繊維芽細胞は、NF-κBの活性化を誘導し[Yanoら., Immunity, 3: 811(1995), Jovanovicら., 上掲]、一方では、IL-17で処理されたマクロファージはNF-κB及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを活性化する(Shalom-Barekら., J. Biol. Chem., 273: 27467[1998])。 IL-17-treated fibroblasts, induce activation of NF-κB [Yano et al, Immunity, 3:.. 811 (1995), Jovanovic et al., Supra], on the one hand, by IL-17 treated macrophages activates NF-[kappa] B and mitogen-activated protein kinase (Shalom-Barek et al., J. Biol Chem, 273:... 27467 [1998]).

さらには、IL-17は、また、骨及び軟骨の成長に関わる哺乳類のサイトカイン様因子7との配列類似性を共有する。 Furthermore, IL-17 also shares sequence similarity with the cytokine-like factor 7 mammalian involved in bone growth and cartilage. IL-17ポリペプチドが配列類似性を共有する他のタンパク質には、ヒト胎児由来インターロイキン関連因子(EDIRF)及びインターロイキン-20がある。 Other proteins IL-17 polypeptides share sequence similarity, there is a human embryonic interleukin-related factor (EDIRF) and interleukin -20.
IL-17の幅広い作用と呼応し、IL-17に対する細胞表面レセプターが多くの組織及び細胞型において広く発現していることが見出されている(Yanoら., Cytokine, 9: 794[1997])。 Wide concert with the action of IL-17, a cell surface receptor for IL-17 has been found to be widely expressed in many tissues and cell types (Yano et al., Cytokine, 9:. 794 [1997] ). ヒトIL-17レセプター(IL-R)(866アミノ酸)のアミノ酸配列から、一本鎖の膜貫通ドメイン並びに525アミノ酸長の細胞内ドメインを有するタンパク質を予測できるが、このレセプター配列は独特であり、サイトカイン/成長因子レセプターファミリーのどのレセプターに対しても類似していない。 From human IL-17 receptor (IL-R) amino acid sequence of (866 amino acids), can be predicted a protein with an intracellular domain of a transmembrane domain and 525 amino acids long single-stranded, the receptor sequence is unique, not similar even to the cytokine / growth factor receptor family which receptors. IL-17そのものが他の既知のタンパク質との類似性を欠くことと相まって、このことは、IL-17及びそのレセプターが、シグナルタンパク質及びレセプターの新規なファミリーの一部であろうことを示す。 IL-17 together with that itself lacks similarity to other known proteins, this is, IL-17 and its receptor, indicating that would be part of a novel family of signaling proteins and receptors. これまでの研究では、T細胞とIL-17レセプターポリペプチドの可溶性型を接触させることが、PHA、コンカナバリンA及び抗-TCRモノクローナル抗体によって誘導されるT細胞増殖及びIL-2生成を阻害することを示しており、IL-17活性が、それに対する独特な細胞表面レセプターへの結合を通して媒介されることが示されている(Yanoら., J. Immunol., 155: 5483-5486[1995])。 Previous studies, contacting a soluble form of T cells and IL-17 receptor polypeptide, to inhibit PHA, a T cell proliferation and IL-2 generated induced by concanavalin A and anti -TCR monoclonal antibodies the shows, IL-17 activity, it has been shown to be mediated through binding to distinct cell surface receptors for (Yano et al., J. Immunol, 155:.. 5483-5486 [1995]) . よって、既知のサイトカインレセプター、特にIL-17レセプターに対して相同性を有する新規ポリペプチドを同定してキャラクタリゼーションすることに多大な関心が寄せられている。 Thus, the known cytokine receptors, and have great interest in characterizing and identifying novel polypeptides are asked with homology to particular IL-17 receptor.

最近、我々は、IL-17に明らかに関連するIL-17B及びIL-17Cと称する二つの新しいタンパク質を同定し、IL-17様分子のファミリーが存在することを明らかにした(Liら., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 97(2): 773-778[2000])。 Recently, we have identified two new proteins termed clearly related to IL-17B and IL-17C to IL-17, revealed that the family of IL-17-like molecules are present (Li et al., .... Proc Natl Acad Sci (USA), 97 (2): 773-778 [2000]). 興味あることに、これらがIL-17レセプターに対するリガンドとは思われず、このことは、これら因子に対する同族のレセプターとして作用する他の分子が存在することを示唆している。 Interestingly, these are not seem the ligand for IL-17 receptor, suggesting that other molecules that act as cognate receptors for these factors exists. IL-17がリウマチ様関節炎、免疫媒介腎疾患、肝胆道疾患、炎症性腸疾患、乾癬、喘息、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍成長の促進、又は変形性関節疾患を含む、免疫機能に関連する数々の重要な病状の一因となり得ることが明らかになるにつれて、このファミリーの分子に対する関心は増している。 IL-17 is as rheumatoid arthritis, immune mediated renal disease, hepatobiliary diseases, inflammatory bowel disease, psoriasis, asthma, multiple sclerosis, atherosclerosis, including promotion of tumor growth, or degenerative joint disease, as be can contribute to a number of important medical conditions related to immune function becomes apparent, interest in molecules of this family has increased. IL-17に関連する分子の潜在力が、免疫機能のコントロールにおける重要な役割を占めると仮定すると、このファミリーの他のメンバー、並びに特定の標的細胞集団を通してこれら分子の作用を方向づけるレセプターを同定することは興味あることである。 Potential of molecules related to IL-17 is, assuming occupy an important role in the control of immune function, to identify receptors that direct the actions of these molecules through other members as well as the particular target cell population, the family it would be of interest. この関点から、本発明は、IL-17に対してアミノ酸配列が類似している新規なポリペプチド(「PRO」ポリペプチドとここでは命名)のクローニング及びキャラクタリゼーション、その活性変異体、並びに新規IL-17タンパク質リガンドと相互作用することが示されている新規インターロイキンレセプター分子について記載する。 This Seki point, the present invention is cloning and characterization, the activity variants of novel polypeptides the amino acid sequence to IL-17 are similar ( "PRO" polypeptide and designated in this case), as well as new It describes novel interleukin receptor molecules have been shown to interact with IL-17 protein ligands.

(発明の概要) (Summary of the Invention)
A. A. 実施態様 本発明は、ヒトを含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断及び治療にとって有用な組成物及び方法に関する。 The invention embodiments, including humans, diagnosis and to compositions and methods useful for treatment of immune related disease in a mammal. 本発明は、哺乳動物の免疫応答を刺激又は阻害するタンパク質(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体)の同定に基づいている。 The present invention is based on the identification of proteins that stimulate or inhibit the immune response in a mammal (agonist and antagonist antibodies). 免疫関連疾患は、免疫応答を抑制又は高めることによって治療することができる。 Immune related diseases can be treated by suppressing or enhancing the immune response. 免疫応答を高める分子は、抗原に対する免疫応答を刺激又は増強する。 Molecule to enhance the immune response stimulate or potentiate the immune response to an antigen. 免疫応答の向上が有益である場合には、免疫応答を刺激する分子は治療的に用いることができる。 When improvement of the immune response would be beneficial, the molecules to stimulate an immune response can be used therapeutically. あるいは、免疫応答の緩和が有益である場合には(例えば炎症)、抗原に対する免疫応答を和らげる又は減じる免疫応答を抑制する分子(例えば中和抗体)を治療的に用いることができる。 Alternatively, if the relaxation of the immune response is beneficial (e.g. inflammation), it can be used relieve immune response or reducing suppress the immune response molecules (e.g. neutralizing antibodies) therapeutically to an antigen. 従って、本発明のPROポリペプチド、並びにそのアゴニスト及びアンタゴニストもまた、免疫関連及び炎症疾患の治療ののための医薬及び薬剤を調製するために有用である。 Therefore, PRO polypeptides of the present invention, and agonists and antagonists thereof are also useful to prepare medicines and medicaments for the treatment of immune-related and inflammatory diseases. 特別な側面では、そのような医薬及び薬剤は、製薬的に許容可能な担体を有するPROポリペプチド、アゴニスト又はそのアンタゴニストの治療的有効量を含む。 In a specific aspect, such medicines and medicaments, PRO polypeptide having a pharmaceutically acceptable carrier, comprising a therapeutically effective amount of an agonist or antagonist thereof. 好ましくは、混合物は無菌である。 Preferably, the mixture is sterile.
更なる実施態様では、本発明では、PROポリペプチドと候補化合物を接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物活性をモニタリングすることを含む、PROポリペプチドのアゴニスト又はPROポリペプチドに対するアンタゴニストを同定する方法に関する。 In a further embodiment, the present invention, the PRO polypeptide is contacted with a candidate compound involves monitoring a biological activity mediated by said PRO polypeptide, identifying antagonists to agonists or PRO polypeptide of a PRO polypeptide how to on. 好ましくは、PROポリペプチドは、天然配列PROポリペプチドである。 Preferably, PRO polypeptide is a native sequence PRO polypeptide. 特別な側面では、PROアゴニスト又はアンタゴニストは、抗-PRO抗体である。 In a specific aspect, PRO agonist or antagonist is an anti -PRO antibody.

その他の側面では、本発明は、PROポリペプチド、或いは担体又は賦形剤との混合物中のポリペプチドと結合するアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を含んでなる組成物に関する。 In another aspect, the present invention is, PRO polypeptide, or relates to a composition comprising an agonist or antagonist antibody which binds the polypeptide in admixture with a carrier or excipient. 一側面では、組成物が免疫刺激分子を含む場合には、(a)それを必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を高めること、(b)それを必要とする哺乳動物での免疫応答を刺激又は高めること、(c)抗原に対する応答において、それを必要とする哺乳動物でのTリンパ球の増殖を増加させること、(e)血管透過性を増加させることのために、この組成物は有用である。 In one aspect, when the composition comprises an immune stimulating molecule, (a) increasing the infiltration of inflammatory cells it to a mammal in need tissue, in a mammal in need thereof (b) an immune response stimulating or enhancing that, in response to (c) an antigen, increasing the proliferation of T-lymphocytes in a mammal in need thereof, for increasing the (e) vascular permeability, this the composition is useful. 更なる側面では、この組成物が免疫阻害分子を含む場合には、(a)それを必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を低下させること、(b)それを必要とする哺乳動物での免疫応答を阻害又は減じること、(c)Tリンパ球の活性を低下させること、或いは(d)抗原対する応答において、それを必要とする哺乳動物でのTリンパ球の増殖を低下させることのために、この組成物は有用である。 In a further aspect, the composition when comprises an immune inhibiting molecule, decreasing the infiltration of inflammatory cells into a tissue of a mammal in need thereof (a), in need thereof (b) mammalian reducing inhibition or an immune response in an animal, decreasing the proliferation of T lymphocytes in (c) reducing the activity of T-lymphocytes, or (d) in the antigen against response, a mammal in need thereof for that, the composition is useful. その他の側面では、この組成物は更に活性成分を含み、それは、例えば、更なる抗体、或いは細胞毒性又は化学療法剤であってもよい。 In another aspect, it includes a composition further active ingredient, which may, for example, be a further antibody, or may be a cytotoxic or chemotherapeutic agent. 好ましくは、この組成物は無菌である。 Preferably, this composition is sterile.

その他の実施態様では、本発明は、治療を必要とする哺乳動物における免疫関連疾患を治療する方法に関する。 In another embodiment, the present invention relates to a method of treating an immune related disease in a mammal in need of treatment. この方法は、PROポリペプチド、そのアゴニスト、又はそれに対するアンタゴニストの治療的有効量を哺乳動物へ投与することを含んでなる。 This method comprises the PRO polypeptide, an agonist thereof, or a therapeutically effective amount of an antagonist thereto administering to a mammal. 好ましい側面では、免疫関連疾患は、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、変形関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症性筋疾患、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、糖尿病、免疫媒介腎疾患、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変 、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、 水疱性皮膚病を含む自己免疫性又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬 、アレルギー性疾患 In a preferred aspect, the immune related disorder is systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, juvenile chronic arthritis, spondyloarthropathies, systemic sclerosis, idiopathic inflammatory myopathies, Sjogren's syndrome, systemic vasculitis, sarcoidosis , autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia, diabetes, immune-mediated renal disease, central and peripheral nervous system demyelinating diseases such as multiple sclerosis, idiopathic demyelinating polyneuropathy or Guillain-Barre syndrome, and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, hepatobiliary diseases such as infectious properties, autoimmune chronic active hepatitis, primary biliary cirrhosis, granulomatous hepatitis, and sclerosing cholangitis, inflammatory bowel disease, gluten-sensitive sex bowel disease, and Whipple's disease, autoimmune or immune-mediated skin diseases including bullous skin diseases, polymorphic exudative erythema and contact dermatitis, psoriasis, allergic diseases えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患から成る群から選択される。 Including example, if asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, food hypersensitivity and urticaria, pulmonary immune diseases for example eosinophilic pneumonia, idiopathic pulmonary fibrosis and hypersensitivity pneumonitis, rejection and graft-versus-host disease It is selected from the group consisting of transplantation associated diseases.

その他の実施態様では、本発明は、上記又は下記に記載のポリペプチドの何れかに特異的に結合する抗体を提供する。 In another embodiment, the present invention provides an antibody which specifically binds to any of the polypeptides described above or below. 随意的には、この抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。 Optionally, this antibody is a monoclonal antibody, humanized antibody, antibody fragment or single-chain antibody. 一側面では、本発明は、PROポリペプチドと結合する単離された抗体に関する。 In one aspect, the present invention relates to an isolated antibody that binds to PRO polypeptide. その他の側面では、抗体はPROポリペプチド(アゴニスト抗体)の活性を模倣するか、或いは逆に抗体はPROポリペプチド(アンタゴニスト抗体)の活性を阻害又は中和する。 In another aspect, the antibody is either mimics the activity of a PRO polypeptide (an agonist antibody) or antibodies conversely inhibits or neutralizes the activity of a PRO polypeptide (an antagonist antibody). その他の側面では、この抗体はモノクローナル抗体であり、それは好ましくは非ヒトの相補性決定領域(CDR)及びヒトフレームワーク領域(FR)残基を有する。 In another aspect, the antibody is a monoclonal antibody, which preferably has a complementarity determining region of a non-human (CDR) and human framework region (FR) residues. 抗体はラベル化されてもよいし、固体支持体へ固定されてもよい。 The antibody may be labeled and may be immobilized on a solid support. 更なる側面では、抗体は抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、又は抗-イディオタイプ抗体である。 In a further aspect, the antibody is an antibody fragment, a monoclonal antibody, single chain antibody, or an anti - idiotypic antibodies.
更なるその他の実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体との混合物である抗-PRO抗体を含んでなる組成物を提供する。 In yet another embodiment, the present invention provides a composition comprising an anti -PRO antibody is a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier. 一側面では、この組成物は治療的に有効量の抗体を含む。 In one aspect, the composition comprises a therapeutically effective amount of an antibody. 好ましくは、この組成物は無菌である。 Preferably, this composition is sterile. この組成物は、液体である製薬的製剤の形で投与され、それは貯蔵安定性を完遂できるように保存されてもよい。 The compositions are administered in the form of pharmaceutical preparations is liquid, it may be saved for complete storage stability. あるいは、この抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。 Alternatively, the antibody is a monoclonal antibody, an antibody fragment, a humanized antibody, or single-chain antibody.

またさらなる実施態様において、本発明は: In a further embodiment, the present invention is:
(a)PROポリペプチド又はアゴニスト、アンタゴニスト、或いはその前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体; (A) PRO polypeptide or agonist, antagonist, or antibody that specifically binds to the said polypeptide;
(b)前記組成物を収容する容器;並びに (B) a container containing said composition; and
(c)前記容器に添付されるラベル、又は免疫関連疾患の治療における前記PROポリペプチド又はアゴニスト又はそのアンタゴニストの使用を記した前記製薬品に含まれる包装挿入物を含んでなる製造品に関する。 (C) a label that is attached to the container, or to the PRO polypeptide or agonist or packaging insert the comprising at manufacturing products included in the pharmaceutical product that describes the use of the antagonists in the treatment of immune related diseases. この組成物は、PROポリペプチド、或いはアゴニスト又はそのアンタゴニストの治療的有効量を含みうる。 The composition may comprise a therapeutically effective amount of a PRO polypeptide or agonist or antagonist thereof.
その他の実施態様では、本発明は、(a)哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料、並びに(b)同じ細胞型の既知の正常組織細胞のコントロール試料からPROポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなる、哺乳動物における免疫関連疾患を診断する方法に関する。 In another embodiment, the present invention provides a gene encoding (a) a test sample of tissue cells obtained from the mammal, and (b) PRO polypeptide from a control sample of known normal tissue cells of the same cell type comprising detecting the level of expression relates to a method of diagnosing an immune related disease in a mammal. この方法では、コントロール試料と比較して試験試料でのより高い又は低い発現レベルが、試験組織細胞が得られた哺乳動物における免疫関連疾患の存在を示す。 In this way, higher or lower expression level in the test sample as compared to the control sample indicates the presence of immune related disease in the mammal from which the test tissue cells were obtained.

その他の実施態様では、本発明は、試験試料において、(a)哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料と抗-PRO抗体を接触せしめ、並びに(b)この抗体とPROポリペプチド間の複合体の形成を検出することを含んでなる、哺乳動物における免疫疾患を診断する方法に関する。 In another embodiment, the present invention provides a test sample, (a) contacted with the test sample and anti -PRO antibody of tissue cells obtained from the mammal, and (b) combined between the antibody and the PRO polypeptide comprising detecting the formation of the body, to a method of diagnosing an immune disease in a mammal. この方法では、前記複合体の形成が、前記疾患の存在の有無を示す。 In this way, formation of said complex is indicative of the presence or absence of said disease. 検出は定性的又は定量的であってもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞のコントロール試料における複合体の形成のモニターリングと比較して行われる。 Detection is carried out by comparing the qualitative or may be quantitative, monitoring the complex formation in a control sample of known normal tissue cells of the same cell type. 試験試料における多量の形成された複合体は、試験組織細胞が得られた哺乳動物における免疫疾患の存在の有無を示す。 A larger quantity of complexes formed in the test sample indicates the presence or absence of an immune disease in the mammal from which the test tissue cells were obtained. 抗体は、好ましくは検出可能なラベルを有する。 The antibody preferably carries a detectable label. 複合体の形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、或いは当該分野で知られている他の技術によってモニターすることができる。 Complex formation, for example, can be monitored by light microscopy, flow cytometry, other techniques known fluorometry, or in the art. 試験試料は、通常は、免疫系に欠損又は異常を有する個人から得られる。 The test sample is usually obtained from an individual suspected of having a deficiency or abnormality of the immune system. その他の実施態様では、本発明は、PROポリペプチドを含有すると思われる細胞の試験試料を抗-PRO抗体へ曝露し、前記抗体の前記細胞試料への結合を測定することを含んでなる、試料中のPROポリペプチドの存在を測定する方法を示す。 In another embodiment, the present invention provides a test sample of cells suspected of containing the PRO polypeptide to exposure to anti -PRO antibody, comprising measuring the binding of the cell sample of said antibody, sample It shows a method for determining the presence of PRO polypeptide in. 特別な側面では、この試料はPROポリペプチドを含有すると思われる細胞を含み、抗体は細胞へ結合する。 In a specific aspect, the sample comprises a cell suspected of containing the PRO polypeptide and the antibody binds to the cell. この抗体は、好ましくは検出可能にラベルされていて並びに/又は固体支持体へ結合している。 The antibody is preferably attached to a detectably have been labeled and / or solid support.

その他の実施態様では、本発明は、抗-PRO抗体並びに適切な包装体に含まれる担体を含んでなる、免疫関連疾患診断用キットに関する。 In another embodiment, the present invention is comprising a carrier contained in the anti--PRO antibodies and suitable packaging concerns an immune-related disease diagnostic kit. このキットは、好ましくは、PROポリペプチドを検出するために抗体を用いるための指示書を含む。 The kit preferably contains instructions for using the antibody to detect the PRO polypeptide. 好ましくは、この担体は製薬的に許容可能である。 Preferably, the carrier is pharmaceutically acceptable.
その他の実施態様では、本発明は、適切な包装体に含まれる抗-PRO抗体を含有する診断用キットに関する。 In another embodiment, the present invention relates to a diagnostic kit containing an anti -PRO antibody contained in suitable packaging. このキットは、好ましくは、この抗体をPROポリペプチドを検出するために用いるための指示書を含む。 The kit preferably contains instructions for using the antibody to detect the PRO polypeptide.
その他の実施態様では、本発明は、哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料におけるPROポリペプチドの存在有無を検出することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患を診断する方法を示し、その方法では、前記試験試料におけるPROポリペプチドの存否を検出することが、前記哺乳動物における免疫関連疾患の存在を示す。 In another embodiment, the invention comprises detecting the presence or absence of a PRO polypeptide in a test sample of tissue cells obtained from the mammal, shows a method of diagnosing an immune related disease in a mammal, the method thereof So detecting the presence or absence of the PRO polypeptide in said test sample indicates the presence of immune related disease in the mammal.
その他の実施態様では、本発明は: In another embodiment, the present invention is:
(a)通常は、PROポリペプチドによって誘導される細胞応答の誘導のために適した条件下でスクリーニングされる試験化合物と細胞を接触させること;並びに(b)前記細胞応答が有効アゴニストである前記試験化合物の徴候である場合に、試験化合物が有効アゴニストであるかどうかを確定するために、前記細胞応答の誘導を測定することを含んでなる、PROポリペプチドのアゴニストを同定する方法に関する。 (A) Normally, contacting cells and a test compound to be screened under conditions suitable for the induction of a cellular response normally induced by a PRO polypeptide; and (b) the cellular response is valid agonist wherein If a sign of the test compound, to the test compound is determined whether the effective agonist, comprising measuring the induction of said cellular response, relates to a method for identifying an agonist of a PRO polypeptide.

その他の実施態様では、本発明は、候補化合物とPROポリペプチドの相互作用を可能にする条件下及び十分な時間に渡ってこの二つの成分を接触させること、並びにPROポリペプチドの活性が阻害されるかどうかを測定することを含んでなる、PROポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する方法に関する。 In another embodiment, the present invention provides over the conditions and time sufficient to permit interaction of the candidate compound and the PRO polypeptide by contacting the two components, as well as the activity of the PRO polypeptide is inhibited comprising measuring whether relates to a method for identifying a compound capable of inhibiting the activity of the PRO polypeptide. 特別な側面では、候補化合物又はPROポリペプチドのいずれかが固体支持体上に固定されている。 In a specific aspect, either the candidate compound or the PRO polypeptide is immobilized on a solid support. その他の側面では、非固定化成分は検出可能なラベルを有する。 In another aspect, the non-immobilized component carries a detectable label. 好ましい側面では、この方法は: In a preferred aspect, this method comprises the steps of:
(a)通常は、PROポリペプチドによって誘導される細胞応答の誘導のために適した条件下でスクリーニングされる試験化合物と細胞を接触させること;並びに(b)試験化合物が有効アンタゴニストであるかどうかを確定するために、前記細胞応答の誘導を測定する段階を含む。 (A) Normally, contacting cells and a test compound to be screened under conditions suitable for the induction of a cellular response normally induced by a PRO polypeptide; whether and (b) the test compound is an effective antagonist to determine the includes the step of measuring the induction of the cellular response.
その他の実施態様では、本発明は、細胞と試験化合物を接触せしめて、PROポリペプチドの発現が阻害されるかどうかを確定することを方法が含む場合に、通常はポリペプチドを発現する細胞において、PROポリペプチドの発現を阻害する化合物を同定する方法を示す。 In another embodiment, the present invention provides contacted cell with a test compound, if the expression of the PRO polypeptide method comprises determining whether is inhibited, normally in cells expressing a polypeptide illustrates a method of identifying a compound that inhibits the expression of the PRO polypeptide. 好ましい側面では、この方法は: In a preferred aspect, this method comprises the steps of:
(a)PROポリペプチドの発現を可能にする条件下でスクリーニングされる試験化合物と細胞を接触させること;並びに(b)前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する段階を含む。 It comprises measuring the inhibition of and (b) the expression of the polypeptide; (a) PRO test compound to be screened under conditions to allow expression of the polypeptide and the cells that are contacted.

更にその他の実施態様では、本発明は、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストのいずれかをコードする核酸分子を哺乳動物へ投与することを含んでなる、免疫関連疾患を患っている哺乳動物においてこの疾患を治療する方法に関する。 In yet another embodiment, the present invention is administered to (a) PRO polypeptide, (b) PRO polypeptide agonist or (c) PRO polypeptide of any the encoding nucleic acid molecule mammalian antagonist it comprises a relates to a method of treating a disease in a mammal suffering from an immune-related disease. この方法では、アゴニスト及びアンタゴニストが抗-PROポリペプチドであってもよい。 In this way, agonists and antagonists may be anti -PRO polypeptide. 好ましい実施態様では、この哺乳動物はヒトである。 In a preferred embodiment, the mammal is a human. その他の好ましい実施態様では、この核酸はエキソビボ(生体外)遺伝子治療を経由して投与される。 In another preferred embodiment, the nucleic acid is administered via ex vivo (in vitro) gene therapy. 更なる好ましい実施態様では、この核酸は、ベクター、より好ましくはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスベクターである。 In a further preferred embodiment, the nucleic acid vector, more preferably an adenoviral, adeno-associated viral, lentiviral or retroviral vector.
更にその他の側面では、本発明は、プロモーター、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストをコードする核酸、並びにポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列で必須として構成されるウイルスベクターを含んでなる組み換えウイルス粒子を提供する。 In yet another aspect, the invention concerns a promoter, (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist polypeptide of a PRO polypeptide, as well as for cellular secretion of the polypeptide It provides a recombinant viral particle comprising a viral vector consisting as essential in the signal sequence. この方法では、ウイルスベクターがウイルス構造タンパク質に関連する。 In this method, the viral vector is associated with viral structural proteins. 好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然PROポリペプチドからのものである。 Preferably, the signal sequence is from a mammal, for example a native PRO polypeptide.

より更なる実施態様では、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸作成物を含んでなるエキソビボ産生細胞に関する。 In a still further embodiment, the present invention relates to an ex vivo producer cell comprising a nucleic acid construct that expresses retroviral structural proteins. そしてプロモーター、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストをコードする核酸、並びにポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列で必須として構成されるレトロウイルスベクターをも含み、この方法では、前記産生細胞は、組み換えレトロウイルス粒子を生産するように、構造タンパク質と関連するレトロウイルスベクターを包み込んでいる。 The promoter comprises (a) a PRO polypeptide, as an essential signal sequence for cellular secretion of (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist polypeptide of a PRO polypeptide, and polypeptide also include retroviral vectors, in this method, the producing cells, to produce recombinant retroviral particles, which encloses the retroviral vector in association with the structural proteins.
より更なる実施態様では、本発明は、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物の組織への脈管構造からの炎症性細胞の浸潤を高める方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention is comprising administering to a (a) PRO polypeptide, (b) PRO polypeptide agonist or (c) PRO polypeptide antagonist mammals, mammals It provides a method for enhancing the infiltration of inflammatory cells from the vasculature into tissue. この方法では、哺乳動物における脈管構造からの炎症性細胞の浸潤が高まる。 In this way, it increased infiltration of inflammatory cells from the vasculature in the mammal.
より更なる実施態様では、本発明は、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物の組織への脈管構造からの炎症性細胞の浸潤を減少させる方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention is comprising administering to a (a) PRO polypeptide, (b) PRO polypeptide agonist or (c) PRO polypeptide antagonist mammals, mammals It provides a method for the reduction of infiltration of inflammatory cells from the vasculature into tissue. この方法では、哺乳動物における脈管構造からの炎症性細胞の浸潤が減少する。 In this way, infiltration of inflammatory cells from the vasculature in the mammal is decreased.

より更なる実施態様では、本発明は、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物におけるTリンパ球の活性を増加させる方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention is comprising administering to a (a) PRO polypeptide, (b) PRO polypeptide agonist or (c) PRO polypeptide antagonist mammals, mammals It provides a method of increasing the activity of T lymphocytes in. この方法では、哺乳動物におけるTリンパ球の活性が増加する。 In this method, the activity of T-lymphocytes in the mammal is increased.
より更なる実施態様では、本発明は、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物におけるTリンパ球の活性を減少させる方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention is comprising administering to a (a) PRO polypeptide, (b) PRO polypeptide agonist or (c) PRO polypeptide antagonist mammals, mammals It provides a method of reducing the activity of T lymphocytes in. この方法では、哺乳動物におけるTリンパ球の活性が減少する。 In this way, reducing the activity of T-lymphocytes in a mammal.
より更なる実施態様では、本発明は、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物におけるTリンパ球の増殖を増加させる方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention is comprising administering to a (a) PRO polypeptide, (b) PRO polypeptide agonist or (c) PRO polypeptide antagonist mammals, mammals It provides a method of increasing the proliferation of T lymphocytes in. この方法では、哺乳動物におけるTリンパ球の増殖が増加する。 In this way, proliferation of T lymphocytes in the mammal is increased.

より更なる実施態様では、本発明は、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物におけるTリンパ球の増殖を減少させる方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention is comprising administering to a (a) PRO polypeptide, (b) PRO polypeptide agonist or (c) PRO polypeptide antagonist mammals, mammals It provides a method of reducing the proliferation of T lymphocytes in. この方法では、哺乳動物におけるTリンパ球の増殖が減少する。 In this way, it reduces the proliferation of T-lymphocytes in a mammal.
より更なる実施態様では、本発明は、T細胞をPRO1031又はPRO10272ポリペプチド又はそのアゴニストと接触させることを含んでなる、T細胞の増殖を刺激する方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention is comprising the step of contacting a T cell with PRO1031 or PRO10272 polypeptide or agonist thereof, provides a method of stimulating the proliferation of T cells. この方法では、T細胞の増殖が刺激される。 In this way, proliferation of T cells is stimulated.
より更なる実施態様では、本発明は、Tリンパ球をPRO1031又はPRO10272ポリペプチドのアンタゴニストと接触させることを含んでなる、Tリンパ球の増殖を減じる方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention is comprising contacting an antagonist of the T lymphocytes PRO1031 or PRO10272 polypeptide, provides a method of reducing the proliferation of T lymphocytes. この方法では、T細胞の増殖が減少する。 In this way, proliferation of T cells is reduced.
より更なる実施態様では、本発明は、PRO1031ポリペプチド又はそのアゴニストの有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の組織への炎症性細胞の浸潤を高める方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention provides a method for enhancing the infiltration of inflammatory cells into PRO1031 polypeptide or which comprises administering an effective amount of an agonist thereof, mammalian tissues. この方法では、浸潤が高まる。 In this way, infiltration increases.

より更なる実施態様では、本発明は、PRO1031ポリペプチドのアゴニストの有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の組織への炎症性細胞の浸潤を減じる方法を提供する。 In a still further embodiment, the present invention provides a method of reducing the infiltration of inflammatory cells into the PRO1031 effective amount of an agonist of the polypeptide comprising administering to a mammalian tissue. この方法では、浸潤が減少する。 In this way, infiltration is reduced.
更にその他の実施態様では、本発明は、哺乳動物への抗-PRO1031抗体の治療的有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物においてPRO1031ポリペプチド又はそのアゴニストによって誘導される血管新生を阻害する方法を提供する。 In yet another embodiment, the present invention is, comprising administering a therapeutically effective amount of an anti -PRO1031 the antibody to a mammal, inhibiting angiogenesis induced by PRO1031 polypeptide or agonist thereof in a mammal to provide a method for. 好ましくは、この哺乳動物はヒトであり、そしてより好ましくは、この哺乳動物は腫瘍又は網膜疾患を有する。 Preferably, the mammal is a human, and more preferably the mammal has a tumor or retinal disorder.
更にその他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO1031ポリペプチド又はそのアゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物においてPRO1031ポリペプチドによって誘導される血管新生を刺激する方法を提供する。 In yet another embodiment, the present invention is, comprising administering a therapeutically effective amount of a PRO1031 polypeptide or an agonist thereof to a mammal, to stimulate angiogenesis induced by PRO1031 polypeptide in the mammal to provide a method. 好ましくは、この哺乳動物はヒトであり、そしてより好ましくは、血管新生は組織再生又は創傷治癒を促進し得る。 Preferably, the mammal is a human, and more preferably, angiogenesis may promote tissue regeneration or wound healing.
その他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へPRO1031ポリペプチドのアゴニストの有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物における血管新生を阻害する方法を提供する。 In another embodiment, the present invention is, comprising administering an effective amount of an agonist of PRO1031 polypeptide to the mammal, a method of inhibiting angiogenesis in a mammal. この方法では、前記血管新生は阻害される。 In this method, the angiogenesis is inhibited.

より更なる実施態様では、PRO1031又はPRO1122ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニスト(例えば、抗-PRO1031又は抗-PRO1122)に対して応答性のある症状の治療に有用である薬剤の調製のための、PRO1031又はPRO1122ポリペプチド、或いは前文に記載のそのアゴニスト又はアンタゴニスト、或いは抗-PRO1031又は抗-PRO1122抗体の利用に関する。 In a still further embodiment, for the preparation of a medicament useful in treating conditions that are responsive against PRO1031 or PRO1122 polypeptide or agonist or antagonist (e.g., anti -PRO1031 or anti -PRO1122), PRO1031 or PRO1122 polypeptide, or an agonist or antagonist according to the preamble, or on the use of anti -PRO1031 or anti -PRO1122 antibody. 特定の側面では、退行性軟骨性疾患を治療するための方法における、PRO1031又はPRO1122ポリペプチド、或いはそのアゴニスト又はアンタゴニストの利用に関する。 In a particular aspect, in a method for treating a degenerative cartilaginous disorder, PRO1031 or PRO1122 polypeptide, or on the use of the agonist or antagonist.
より更なる実施態様では、本発明は、退行性軟骨性疾患を患う哺乳動物へPRO1031又はPRO1122ポリペプチド、アゴニスト、又はそのアンタゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる、前記哺乳動物における前記疾患を治療する方法に関連する。 In a still further embodiment, the present invention is, PRO1031 or PRO1122 polypeptide to the mammal suffering from degenerative cartilaginous disorder, comprising administering an agonist, or a therapeutically effective amount of the antagonist, in said mammal It relates to methods of treating the disease.

より更なる実施態様では、本発明は、退行性軟骨性疾患の治療において、製薬的に許容可能な担体との混合物であるPRO1031又はPRO1122ポリペプチド、或いはそのアゴニスト又はアンタゴニスト、前記組成物を含有する容器、並びに前記組成物の利用に言及する前記容器に添付されたラベルを含んでなる、キットに関連する。 In a still further embodiment, the present invention is in the treatment of degenerative cartilage diseases, pharmaceutically which is a mixture PRO1031 or PRO1122 polypeptide with an acceptable carrier, or an agonist or antagonist thereof, comprising said composition container, and comprising a label attached to the container referring to the use of said composition, associated with the kit.
更なる実施態様では、本発明は、A、B、又はCポリペプチドを含有すると思われる試料からA、B、又はCと命名されたポリペプチドを検出する方法であって、前記試料をここでD、E、又はFと命名されたポリペプチドと接触させ、前記試料中でのA/D、B/D、C/E又はC/Fポリペプチドコンジュゲートの形成を測定する前記方法に関連する。 In a further embodiment, the present invention is, A, B, or A from a sample suspected of containing the C polypeptide, B, or a method of detecting the designated polypeptide and C, the sample here D, E, or F and is contacted with named polypeptides, related to the method of measuring the a / D, B / D, C / E or C / F polypeptide formation of a conjugate with said sample . この方法では、前記コンジュゲートの形成が前記試料中でのA、B、Cポリペプチドの存在を示し、そしてAがPRO1031ポリペプチド(また、ここではIL-17Bと命名)、BがPRO10272ポリペプチド(また、ここではIL-17Eと命名)、CがPRO20110ポリペプチド(また、ここではIL-17Fと命名)、DがPRO5801ポリペプチド(また、ここではIL-17RH1と命名)、EがPRO1ポリペプチド(また、ここではIL-17Rと命名)、並びにFがPRO20040ポリペプチド(また、ここではIL-17RH2と命名)である。 In this way, the A of the formation of the conjugate in said sample, B, indicates the presence of C polypeptides, and A PRO1031 polypeptide (also here designated as IL-17B), B is PRO10272 polypeptide (also, here designated as IL-17E), C is PRO20110 polypeptide (also here designated as IL-17F), D is PRO5801 polypeptide (also here designated IL-17RH1), E is PRO1 polypeptide peptide (also here designated as IL-17R), and F is PRO20040 polypeptide (also here designated IL-17RH2) is. この実施態様の一側面では、前記試料は、前記A、B又はCポリペプチドを発現すると思われる細胞を含む。 In one aspect of this embodiment, said sample comprises a cell suspected of expressing said A, B or C polypeptide.

この実施態様のその他の側面では、D、E、又はFポリペプチドは検出可能なラベルで標識されており、D、E、又はFポリペプチドは固体支持体へ結合している。 In other aspects of this embodiment, D, E, or F polypeptide is labeled with a detectable label, D, E, or F polypeptide is attached to a solid support.
更なる実施態様では、本発明は、D、E、又はFポリペプチドを含有すると思われる試料からD、E、又はFと命名されたポリペプチドを検出する方法であって、前記試料をここでA、B,又はCと命名されたポリペプチドと接触させ、前記試料中でのA/D、B/D、C/E又はC/Fポリペプチドコンジュゲートの形成を測定する前記方法に関連する。 In a further embodiment, the present invention is, D, E, or D from a sample suspected of containing F polypeptide, E, or a method of detecting the designated polypeptide and F, the sample here a, B, or is contacted with C named polypeptides, related to the method of measuring the a / D, B / D, C / E or C / F polypeptide formation of a conjugate with said sample . この方法では、前記コンジュゲートの形成が前記試料中でのA、B、Cポリペプチドの存在を示し、そしてAがPRO1031ポリペプチド(また、ここではIL-17Bと命名)、BがPRO10272ポリペプチド(また、ここではIL-17Eと命名)、CがPRO20110ポリペプチド(また、ここではIL-17Fと命名)、DがPRO5801ポリペプチド(また、ここではIL-17RH1と命名)、EがPRO1ポリペプチド(また、ここではIL-17Rと命名)、並びにFがPRO20040ポリペプチド(また、ここではIL-17RH2と命名)である。 In this way, the A of the formation of the conjugate in said sample, B, indicates the presence of C polypeptides, and A PRO1031 polypeptide (also here designated as IL-17B), B is PRO10272 polypeptide (also, here designated as IL-17E), C is PRO20110 polypeptide (also here designated as IL-17F), D is PRO5801 polypeptide (also here designated IL-17RH1), E is PRO1 polypeptide peptide (also here designated as IL-17R), and F is PRO20040 polypeptide (also here designated IL-17RH2) is. この実施態様の一側面では、前記試料は、前記D、E、又はFポリペプチドを発現すると思われる細胞を含む。 In one aspect of this embodiment, said sample comprises a cell suspected of expressing said D, E, or F polypeptide. この実施態様のその他の側面では、前記A、B、又はCポリペプチドは検出可能なラベルで標識され、前記A、B、又はCポリペプチドは固体支持体へ結合している。 In other aspects of this embodiment, the A, B, or C polypeptide is labeled with a detectable label, wherein A, B, or C polypeptide is attached to a solid support.

より更なる実施態様では、本発明は、A、B、又はCと命名されたポリペプチドを発現する細胞と生物活性分子を結合させる方法であって、前記細胞と生物活性分子と結合しているD、E、又はFと命名されたポリペプチド接触させて、前記A、B、又はCと前記D、E、又はFポリペプチドが互いに結合することを可能にし、それによって前記生物活性分子と前記細胞を結合させることを含んでなる前記方法に関連する。 In a still further embodiment, the present invention provides a method of bonding A, B, or cells and bioactive molecules expressing the designated polypeptide is C, is bound to the cells and the biologically active molecule D, E, or named by the polypeptide contacted with F the said a, B, or C and said D, E, or allow the F polypeptide binds together, whereby said biologically active molecules associated with the process that comprises binding the cell. この方法では、AがPRO1031ポリペプチド(また、ここではIL-17Bと命名)、BがPRO10272ポリペプチド(また、ここではIL-17Eと命名)、CがPRO20110ポリペプチド(また、ここではIL-17Fと命名)、DがPRO5801ポリペプチド(また、ここではIL-17RH1と命名)、EがPRO1ポリペプチド(また、ここではIL-17Rと命名)、並びにFがPRO20040ポリペプチド(また、ここではIL-17RH2と命名)である。 In this way, A is PRO1031 polypeptide (also here designated as IL-17B), B is PRO10272 polypeptide (also here designated IL-17E), C is PRO20110 polypeptide (also here IL- 17F named), D is PRO5801 polypeptide (also here designated IL-17RH1), E is PRO1 polypeptide (also here designated as IL-17R), and F is PRO20040 polypeptide (also here IL-17RH2 named) it is. この実施態様の一側面では、前記生物活性分子は、トキシン、放射能標識又は抗体である。 In one aspect of this embodiment, the biologically active molecule, toxin, a radiolabel or an antibody. この実施態様のその他の側面では、前記生物活性分子は、前記細胞の死を生じせしめる。 In other aspects of this embodiment, the biologically active molecule, allowed to rise to the death of said cell.

更なる実施態様では、本発明は、D、E、又はFと命名されたポリペプチドを発現する細胞と生物活性分子を結合させる方法であって、前記細胞をA、B、又はCと命名された生物活性分子と結合しているポリペプチド接触させて、前記A、B、又はCと前記D、E、又はFポリペプチドが互いに結合することを可能にし、それによって前記生物活性分子と前記細胞を結合させることを含んでなる前記方法に関する。 In a further embodiment, the present invention is, D, E, or a method of binding cells and bioactive molecules expressing the designated polypeptide is F, named the cells A, B, or a C and by polypeptide contact bound to the biologically active molecule, wherein a, B, or C and said D, allows the E, or F polypeptide binds together, it said cell with said biologically active molecule by it about the process that comprises coupling the. この方法では、AがPRO1031ポリペプチド(また、ここではIL-17Bと命名)、BがPRO10272ポリペプチド(また、ここではIL-17Eと命名)、CがPRO20110ポリペプチド(また、ここではIL-17Fと命名)、DがPRO5801ポリペプチド(また、ここではIL-17RH1と命名)、EがPRO1ポリペプチド(また、ここではIL-17Rと命名)、並びにFがPRO20040ポリペプチド(また、ここではIL-17RH2と命名)である。 In this way, A is PRO1031 polypeptide (also here designated as IL-17B), B is PRO10272 polypeptide (also here designated IL-17E), C is PRO20110 polypeptide (also here IL- 17F named), D is PRO5801 polypeptide (also here designated IL-17RH1), E is PRO1 polypeptide (also here designated as IL-17R), and F is PRO20040 polypeptide (also here IL-17RH2 named) it is. この実施態様の一側面では、前記生物活性分子は、トキシン、放射能標識又は抗体である。 In one aspect of this embodiment, the biologically active molecule, toxin, a radiolabel or an antibody. この実施態様のその他の側面では、前記生物活性分子は、前記細胞の死を生じせしめる。 In other aspects of this embodiment, the biologically active molecule, allowed to rise to the death of said cell.

更にその他の実施態様では、本発明は、A、B、又はCと命名されたポリペプチドを発現する細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法であって、前記細胞をD、E、又はFと命名されたポリペプチド或いは抗-A、抗-B、又は抗-Cポリペプチド抗体と接触させ、それによって前記D、E、又はFポリペプチド或いは抗-A、抗-B、又は抗-Cポリペプチド抗体が前記A、B、又はCポリペプチドと結合し、それによって前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節することを含んでなる前記方法に関する。 In yet another embodiment, the present invention is, A, B, or a method of modulating at least one biological activity of cells expressing the designated polypeptide is C, the cells D, E, or F designated polypeptide or anti -A, anti -B, or is contacted with an anti--C polypeptide antibody, whereby said D, E, or F polypeptide or anti -A, anti -B, or anti--C polypeptide antibodies wherein a, B, or combines with C polypeptide, relating to the process that comprises thereby adjusting at least one biological activity of said cell. この方法では、AがPRO1031ポリペプチド(また、ここではIL-17Bと命名)、BがPRO10272ポリペプチド(また、ここではIL-17Eと命名)、CがPRO20110ポリペプチド(また、ここではIL-17Fと命名)、DがPRO5801ポリペプチド(また、ここではIL-17RH1と命名)、EがPRO1ポリペプチド(また、ここではIL-17Rと命名)、並びにFがPRO20040ポリペプチド(また、ここではIL-17RH2と命名)である。 In this way, A is PRO1031 polypeptide (also here designated as IL-17B), B is PRO10272 polypeptide (also here designated IL-17E), C is PRO20110 polypeptide (also here IL- 17F named), D is PRO5801 polypeptide (also here designated IL-17RH1), E is PRO1 polypeptide (also here designated as IL-17R), and F is PRO20040 polypeptide (also here IL-17RH2 named) it is. この実施態様の一側面では、前記細胞は死滅せしめられる。 In one aspect of this embodiment, the cells are caused to die.

更にその他の実施態様では、本発明は、D、E、又はFと命名されたポリペプチドを発現する細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法であって、前記細胞をA、B、又はCと命名されたポリペプチド或いは抗-D、抗-E、又は抗-Fポリペプチド抗体と接触させ、それによって前記A、B、又はCポリペプチド或いは抗-D、抗-E、又は抗-Fポリペプチド抗体が前記D、E、又はFポリペプチドと結合し、それによって前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節することを含んでなる前記方法に関する。 In yet another embodiment, the present invention provides a method of modulating D, E, or at least one biological activity of cells expressing the designated polypeptide and F, the cells A, B, or C named polypeptide or anti -D and anti -E, or contacted with anti -F polypeptide antibody, whereby said a, B, or C polypeptide or anti -D, anti -E, or anti -F polypeptide antibodies wherein D, E, or combined with F polypeptide, relating to the method whereby comprising adjusting at least one biological activity of said cell. この方法では、AがPRO1031ポリペプチド(また、ここではIL-17Bと命名)、BがPRO10272ポリペプチド(また、ここではIL-17Eと命名)、CがPRO20110ポリペプチド(また、ここではIL-17Fと命名)、DがPRO5801ポリペプチド(また、ここではIL-17RH1と命名)、EがPRO1ポリペプチド(また、ここではIL-17Rと命名)、並びにFがPRO20040ポリペプチド(また、ここではIL-17RH2と命名)である。 In this way, A is PRO1031 polypeptide (also here designated as IL-17B), B is PRO10272 polypeptide (also here designated IL-17E), C is PRO20110 polypeptide (also here IL- 17F named), D is PRO5801 polypeptide (also here designated IL-17RH1), E is PRO1 polypeptide (also here designated as IL-17R), and F is PRO20040 polypeptide (also here IL-17RH2 named) it is. この実施態様の一側面では、前記細胞は死滅せしめられる。 In one aspect of this embodiment, the cells are caused to die.

B. B. 更なる実施態様 本発明の他の実施態様では、本発明は、PROポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。 In another embodiment of the further embodiment the present invention, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding a PRO polypeptide.
一側面では、単離された核酸分子は、(a)ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示された膜貫通タンパク質の細胞外ドメインでシグナルペプチドを有する又は有しないもの、或いはここに開示された全長アミノ酸配列のその他の具体的に定義された断片を有するPROポリペプチドをコードするDNA分子、或いは(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86 In one aspect, the isolated nucleic acid molecule, (a) full-length amino acid sequence as disclosed herein, an amino acid sequence lacking the disclosed signal peptide herein, signal in the extracellular domain of the disclosed transmembrane proteins here those not having or have a peptide, or a DNA molecule encoding a PRO polypeptide having other specifically defined fragment of the disclosed full-length amino acid sequence herein, or (b) complementary DNA molecule of (a) relative chains, at least about 80% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 81% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 82% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 83% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 84% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 85% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 86 の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を含む。 Nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 87% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 88% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 89% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 90% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 91% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 92% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 93% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 94% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 95% Yes nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 96% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 97% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 98% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 99% nucleic acid sequence identity comprising an isolated nucleic acid molecule comprising by that nucleotide sequence is.

一側面では、単離された核酸分子は、(a)ここに開示された全長PROポリペプチドcDNAのコード化配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチドのコード化配列、ここに開示された膜貫通タンパク質の細胞外ドメインのコード化配列でシグナルペプチドを有する又は有しないもの、或いはここに開示された全長アミノ酸配列のその他の具体的に定義された断片のコード化配列を含んでなるDNA分子、或いは(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも In one aspect, the isolated nucleic acid molecule, (a) herein disclosed full-length PRO polypeptide cDNA coding sequences, coding sequences for PRO polypeptide lacking the disclosed signal peptide herein, disclosed that is not having or have a signal peptide, or comprise a coding sequence of other specifically defined fragment of the full-length amino acid sequences disclosed herein in film coding sequence of the extracellular domain of a transmembrane protein that has been DNA molecule, or to a complementary strand of the DNA molecule of (b) (a), at least about 80% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 81% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 82% nucleic acid sequence identity sex, alternatively at least about 83% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 84% nucleic acid sequence identity, alternatively at least 85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配 85% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 86% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 87% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 88% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 89% nucleic acid sequence identity sex alternatively at least about 90% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 91% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 92% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 93% nucleic acid sequence identity alternatively at least about 94, % nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 95% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 96% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 97% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 98% nucleic acid sequence identity or nucleotide distribution has at least about 99% nucleic acid sequence identity を含んでなる単離された核酸分子を含む。 Comprising an isolated nucleic acid molecule comprising a.

更なる側面では、本発明は、本発明は、(a)ここに開示したATCCへ寄託されているヒトタンパク質cDNAのいずれかによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、或いは(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、さらにある In a further aspect, the present invention, the present invention is (a) DNA molecules encoding the same mature polypeptide encoded by any of the human protein cDNA having been deposited into the ATCC as disclosed herein, or (b) to a complementary strand of the DNA molecule of (a), at least about 80% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 81% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 82% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 83% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 84% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 85% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 86% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 87% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 88% nucleic acid sequence identity, are more は少なくとも約89%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、さらにあるいは少なくとも約99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。 At least about 89% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 90% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 91% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 92% nucleic acid sequence identity, alternatively at least the about 93% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 94% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 95% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 96% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 97 % nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 98% nucleic acid sequence identity, alternatively relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence having at least about 99% sequence identity.

本発明のその他の側面は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性化のいずれかである、或いはそのようなコード化ヌクレオチド配列に対して相補的であるPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。 Other aspects of the present invention is either transmembrane domain-deleted or transmembrane domain-inactivated, or comprises a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide which is complementary to such encoding nucleotide sequence It provides an isolated nucleic acid molecule consisting of. そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインは、ここに開示されている。 Transmembrane domain (s) of such polypeptide are disclosed herein. 従って、ここに開示されたPROポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考察されている。 Therefore, soluble extracellular domains of the disclosed PRO polypeptide herein is discussed.

他の実施態様は、PROポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖に関し、それらは、例えば、場合によっては抗-PRO抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするPROポリペプチドのコード化断片のハイブリダイゼーションプローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされ得る。 Another embodiment is directed to fragments of a PRO polypeptide coding sequence, or the complement thereof, they are, for example, encoding a fragment of cases PRO polypeptide that may optionally encode a polypeptide comprising a binding site for an anti -PRO antibody as hybridization probes or as antisense oligonucleotide probes can be found. このような核酸断片は、通常は少なくとも約20ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約30ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約40ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約50ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約60ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約70ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約80ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約90ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約100ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約110ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約120ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約130ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約140ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約150ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約160ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約170ヌクレ Such nucleic acid fragments are usually at least about 20 nucleotides in length, alternatively at least about 30 nucleotides in length, alternatively at least about 40 nucleotides in length, alternatively at least about 50 nucleotides in length, alternatively at least about 60 nucleotides in length, alternatively at least about 70 nucleotides in length, alternatively at least about 80 nucleotides in length, alternatively at least about 90 nucleotides in length, alternatively at least about 100 nucleotides in length, alternatively at least about 110 nucleotides in length, alternatively at least about 120 nucleotides in length, alternatively at least about 130 nucleotides in length, alternatively at least about 140 nucleotides in length, or at least about 150 nucleotides in length, alternatively at least about 160 nucleotides in length, alternatively at least about 170 Nukure チド長、あるいは少なくとも約180ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約190ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約200ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約250ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約300ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約350ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約400ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約450ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約500ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約600ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約700ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約800ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約900ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約1000ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス Plastid length, alternatively at least about 180 nucleotides in length, alternatively at least about 190 nucleotides in length, alternatively at least about 200 nucleotides in length, alternatively at least about 250 nucleotides in length, alternatively at least about 300 nucleotides in length, alternatively at least about 350 nucleotides in length, alternatively at least about 400 nucleotides length, alternatively at least about 450 nucleotides in length, alternatively at least about 500 nucleotides in length, alternatively at least about 600 nucleotides in length, alternatively at least about 700 nucleotides in length, alternatively at least about 800 nucleotides in length, alternatively at least about 900 nucleotides in length, alternatively at least about 1000 nucleotides in length , and the length of plus or minus to see here in terms of the content of "about" 0%のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。 It is meant to refer to nucleotide sequence length 0%. PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法で同定してもよい。 It is noted that novel fragments of a PRO polypeptide-align the PRO polypeptide-encoding nucleotide sequence with other known nucleotide sequences using any of a number of well known sequence alignment programs were, either PRO polypeptide-encoding nucleotide sequence fragment by determining whether a new, may be identified by routine methods. このようなPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全ては、ここで考慮される。 All such PRO polypeptide-encoding nucleotide sequences are contemplated herein. また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗-PRO抗体に対する結合部位を含むPROポリペプチド断片によってコードされるPROポリペプチド断片も考慮される。 Further, these nucleotide molecule fragments, preferably those considered PRO polypeptide fragments encoded by the PRO polypeptide fragments that comprise a binding site for an anti -PRO antibodies.

他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の何れかによってコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。 In another embodiment, the present invention provides an isolated PRO polypeptide encoded by any of the isolated nucleic acid sequences herein above identified.
或る側面では、本発明は、ここに開示した全長アミノ酸配列、ここに開示したシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示したシグナルペプチドを有するか又は有しない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、或いはここに開示した全長アミノ酸配列のその他の具体的に定義された断片を有するPROポリペプチドに対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいはは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列 In one aspect, the present invention provides full length amino acid sequences disclosed herein, an amino acid sequence lacking the signal peptide as disclosed herein, an extracellular domain of either or without a transmembrane protein having a signal peptide as disclosed herein, or where against the PRO polypeptide with other specifically defined fragment of the disclosed full-length amino acid sequence, at least about 80% amino acid sequence identity, alternatively at least about 81% amino acid sequence identity, alternatively at least about 82% amino acid sequence identity, alternatively at least about 83% amino acid sequence identity, alternatively at least about 84% amino acid sequence identity, alternatively at least about 85% amino acid sequence identity, alternatively at least about 86% amino acid sequence identity sex, alternatively at least about 87% amino acid sequence 一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたPROポリペプチドに関する。 One, alternatively at least about 88% amino acid sequence identity, alternatively at least about 89% amino acid sequence identity, alternatively at least about 90% amino acid sequence identity, alternatively at least about 91% amino acid sequence identity, alternatively at least about 92% amino acid sequence identity, alternatively at least about 93% amino acid sequence identity, alternatively at least about 94% amino acid sequence identity, alternatively at least about 95% amino acid sequence identity, alternatively at least about 96% amino acid sequence identity sex, alternatively at least about 97% amino acid sequence identity, alternatively at least about 98% amino acid sequence identity and alternatively comprises the amino acid sequence having at least about 99% amino acid sequence identity, isolated PRO It relates to a polypeptide.

さらなる態様では、本発明は、ここに開示したATCCに寄託されているヒトタンパク質cDNAのいずれかによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるい In a further aspect, the present invention provides an amino acid sequence encoded by any of the human protein cDNA which has been deposited with the ATCC as disclosed herein, at least about 80% amino acid sequence identity, alternatively at least about 81% amino acid sequence identity, alternatively at least about 82% amino acid sequence identity, alternatively at least about 83% amino acid sequence identity, alternatively at least about 84% amino acid sequence identity, alternatively at least about 85% amino acid sequence identity, alternatively at least about 86% amino acid sequence identity, alternatively at least about 87% amino acid sequence identity, alternatively at least about 88% amino acid sequence identity, alternatively at least about 89% amino acid sequence identity, alternatively at least about 90% amino acid sequence identity, there have 少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。 At least about 91% amino acid sequence identity, alternatively at least about 92% amino acid sequence identity, alternatively at least about 93% amino acid sequence identity, alternatively at least about 94% amino acid sequence identity, alternatively at least about 95% amino acid sequence identity, alternatively at least about 96% amino acid sequence identity, alternatively at least about 97% amino acid sequence identity, alternatively at least about 98% amino acid sequence identity and alternatively at least about 99% amino acid sequence identity to an isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence having.

さらなる態様では、本発明は、ここに開示した全長アミノ酸配列、ここに開示したシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示したシグナルペプチドを有する又は有しない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、或いはここに開示した全長アミノ酸配列のその他の具体的に定義された断片を有するPROポリペプチドと比較し、少なくとも約80%ポジティブ、あるいは少なくとも約81%ポジティブ、あるいは少なくとも約82%ポジティブ、あるいは少なくとも約83%ポジティブ、あるいは少なくとも約84%ポジティブ、あるいは少なくとも約85%ポジティブ、あるいは少なくとも約86%ポジティブ、あるいは少なくとも約87%ポジティブ、あるいは少なくとも約88%ポジティブ、あるいは少なくとも約89%ポジティ In a further aspect, the present invention provides full length amino acid sequences disclosed herein, an amino acid sequence lacking the signal peptide as disclosed herein, an extracellular domain of or without a transmembrane protein having a signal peptide as disclosed herein, or disclosed herein was compared to the PRO polypeptide with other specifically defined fragment of the full-length amino acid sequence, at least about 80% positives, alternatively at least about 81% positives, alternatively at least about 82% positives, alternatively at least about 83% positives, alternatively at least about 84% positives, alternatively at least about 85% positives, alternatively at least about 86% positives, alternatively at least about 87% positives, alternatively at least about 88% positives, alternatively at least about 89% Pojiti, 、あるいは少なくとも約90%ポジティブ、あるいは少なくとも約91%ポジティブ、あるいは少なくとも約92%ポジティブ、あるいは少なくとも約93%ポジティブ、あるいは少なくとも約94%ポジティブ、あるいは少なくとも約95%ポジティブ、あるいは少なくとも約96%ポジティブ、あるいは少なくとも約97%ポジティブ、あるいは少なくとも約98%ポジティブ、そして、あるいは少なくとも約99%ポジティブのスコアとされるアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。 , Alternatively at least about 90% positives, alternatively at least about 91% positives, alternatively at least about 92% positives, alternatively at least about 93% positives, alternatively at least about 94% positives, alternatively at least about 95% positives, alternatively at least about 96% positives,,,,, alternatively at least about 97% positives, alternatively at least about 98% positives, and alternatively for at least about 99% are positive score comprising an amino acid sequence isolated PRO polypeptide.

特別な実施態様では、本発明は、N-末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを有しない、上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。 In a particular embodiment, the present invention is, N- terminal signal sequence and / or without the initiating methionine, provides an isolated PRO polypeptide encoded by a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence as described above. それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適したなコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からPROポリペプチドを回収することを含む。 Described herein a method of preparing them, the methods, a host cell comprising a vector which comprises a coding nucleic acid molecule Do suitable cultured under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide from the culture medium and recovering the PRO polypeptide.
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインの欠失した或いは膜貫通ドメインが不活性化している単離されたPROポリペプチドを提供する。 Another aspect of the invention provides an isolated PRO polypeptide deleted or the transmembrane domain of a transmembrane domain-inactivated. それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適したコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からPROポリペプチドを回収することを含む。 Described herein a method of preparing them, the methods, a suitable host cell comprising a vector which comprises a coding nucleic acid molecule and cultured under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, PRO from the culture medium and recovering the polypeptide.
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで定義される天然PROポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。 In yet another embodiment, the invention concerns agonists and antagonists of a native PRO polypeptide as defined herein. 特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体或いは小分子である。 In a particular embodiment, the agonist or antagonist is an anti -PRO antibody or a small molecule.

さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む。 In a further embodiment, the present invention relates to a method of identifying agonists or antagonists of a PRO polypeptide, which the PRO polypeptide with a candidate molecule, monitoring a biological activity mediated by said PRO polypeptide including. 好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。 Preferably, PRO polypeptide is a native PRO polypeptide.
またさらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチド、或いはここに記載したPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体を、担体と組み合わせて含んでなる組成物に関する。 In a still further embodiment, the present invention is, PRO polypeptide or agonist or antagonist of a PRO polypeptide as herein described, or an anti--PRO antibody, relates to a composition comprising in combination with a carrier. 場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。 Optionally, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.
本発明のその他の実施態様は、PROポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体を、PROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗-PRO抗体に対して反応する症状の治療において有用な医薬の調製のために用いることに関する。 Other embodiments of the invention, PRO polypeptide, or an agonist or antagonist thereof as described above, or an anti -PRO antibody, PRO polypeptide, the symptoms respond to an agonist or antagonist thereof or an anti -PRO antibody It relates to the use for the preparation of a medicament useful in the treatment.

本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載するポリペプチドの任意いずれかをコードするDNAを含んでなるベクターを提供する。 In a further embodiment of the present invention, the present invention provides any one comprising the DNA encoding the vector of the herein described polypeptides. また、そのようなベクターのいずれかを含む宿主細胞が提供される。 Host cell comprising any such vector is provided. 例として、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞でもよい。 By way of example, the host cells CHO cells, E. coli, or Vacu may be uronium infected insect cells. ここに記載した任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。 Here method for producing any polypeptide is further provided as described, it involves the host cells are cultured under conditions suitable for expression of the desired polypeptide and recovering the desired polypeptide from the cell culture medium.
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載した任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。 In another embodiment, the present invention is fused to a heterologous polypeptide or amino acid sequence, provides chimeric molecules comprising any of the herein described polypeptides. そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列或いは免疫グロブリンのFc領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。 Examples of such chimeric molecules comprise any of the herein described polypeptides fused to an epitope tag sequence or a Fc region of an immunoglobulin.
他の実施態様では、本発明は、任意の上記又は下記のポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。 In another embodiment, the present invention provides any of the above or below described polypeptides and antibodies specifically bind. 場合によっては、この抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。 Optionally, the antibody is a monoclonal antibody, humanized antibody, antibody fragment or single-chain antibody.
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びcDNAヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブを単離するために有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導され得る。 In yet another embodiment, the present invention provides genomic and cDNA nucleotide sequences or as antisense probes provides oligonucleotide probes useful for isolating, from any of the probes is above or below described nucleotide sequences induction may be.

(好ましい実施態様の詳細な説明) (Detailed Description of the Preferred Embodiment)
I. I. 定義 ここで使用される際の「PROポリペプチド」及び「PRO」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、PRO/番号)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。 The term when used defined herein "PRO polypeptide" and "PRO" refers to the various polypeptides when immediately followed by a numerical designation, the complete designation (e.g., PRO / number), here It refers to specific polypeptide sequences as described. 「数字」がここで使用される実際の数値符号である、ここで使用される「PRO/番号ポリペプチド」及び「PRO/番号」という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体(ここで更に詳細に定義する)を含む。 The actual numerical designation "number" is used herein, where the term "PRO / number polypeptide" and "PRO / number" as used herein, native sequence polypeptides and polypeptide variants (where more detailed including the defined) to. ここで記載されているPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。 Here it is described that PRO polypeptide may be isolated from a variety of sources, such as from human tissue types or from another source, or prepared by recombinant or synthetic methods. 「PROポリペプチド」という用語は、ここで開示されている各個々のPRO/番号ポリペプチドに指す。 The term "PRO polypeptide" refers to each individual PRO / number polypeptide disclosed herein. 「PROポリペプチド」を指すこの明細書中の全ての開示は、各ポリペプチドを個別にも組み合わせとしても言及する。 All disclosures in this specification which refer to the "PRO polypeptide" refer to each of the polypeptides individually as well as jointly. 例えば、調製の、精製の、誘導の、抗体の形成、投与の、含有する組成物、疾患の治療、などの記述は、本発明の各ポリペプチドに個別に関係する。 For example, the preparation, the purification of, derivation of, administration, compositions containing, treatment of a disease, of a disease with, etc., pertain individually to each polypeptide of the present invention. また、「PROポリペプチド」という用語は、ここに開示されているPRO/番号ポリペプチドの変異体を含む。 The term "PRO polypeptide" also includes variants of the PRO / number polypeptides disclosed herein.

「天然配列PROポリペプチド」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。 A "native sequence PRO polypeptide" comprises a polypeptide having the same amino acid sequence as the corresponding PRO polypeptide derived from nature. このような天然配列PROポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。 Such native sequence PRO polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant or synthetic means. 「天然配列PROポリペプチド」という用語には、特に、特定のPROポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。 The term "native sequence PRO polypeptide" specifically occurring truncated or secreted forms of the specific PRO polypeptide (e.g., an extracellular domain sequence), naturally (e.g., alternatively spliced form) and naturally-occurring allelic variants of the polypeptide are included. 本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列PROポリペプチドは、関連する図に示されている全長アミノ酸配列を含有する成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。 In various embodiments of the present invention, the native sequence PRO polypeptides disclosed herein are mature or full-length native sequence polypeptides comprising the full-length amino acid sequences shown in the accompanying figures. 開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中に示さている。 Start and stop codons are shown in bold font and underlined in the figures. しかし、関連する図に開示されているPROポリペプチドがメチオニン残基で開始すると図のアミノ酸位置1において示されている一方で、図のアミノ酸位置1より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、PROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。 However, in FIG the PRO polypeptide disclosed in the accompanying figures is started with methionine residues while shown at amino acid positions 1, other located either from amino acid position 1 in FIG upstream or downstream of the methionine residue, it is possible to be considered be used as the starting amino acid residue for the PRO polypeptides.

PROポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないPROポリペプチドの形態を意味する。 PRO polypeptide "extracellular domain" or "ECD" refers to a form of the PRO polypeptide which is essentially free of the transmembrane and cytoplasmic domains. 通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを1%未満、好ましくはそのようなドメインを0.5%未満しか持たない。 Usually, PRO polypeptide ECD will have less than 1% of such transmembrane and / or cytoplasmic domains and preferably, will have less than 0.5% of such domains. 本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。 Any transmembrane domains identified for the PRO polypeptides of the present invention will in the art will be identified according to criteria routinely employed is understood to identify that type of hydrophobic domain . 膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えない可能性が高い。 The exact boundaries of a transmembrane domain may vary but most likely by no more than about 5 amino acids at either end of the domain as initially identified. 従って、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又明細書おいてに同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約5を越えないアミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。 Therefore, PRO polypeptide extracellular domain may, in some cases, to can include amino acids not more than about 5 at either end the Examples or specification and identified transmembrane domains, with a signal peptide attached or a nucleic acid encoding such polypeptides and their no is contemplated in the present invention.

ここに開示する種々のPROポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書と添付の図面に示される。 Location of the "signal peptides" of the various PRO polypeptides disclosed herein are shown in the present specification and the accompanying drawings. しかし、注記するように、シグナルペプチドのC-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドC-末端境界のいずれかの側で約5アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのC-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる(例えば、Nielsenら, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinjeら, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986))。 It is noted, however, that although C- terminal boundary of a signal peptide may vary, where possible less than about 5 amino acids on either side of the first signal peptide C- terminal boundary as defined most high, C-terminal boundary of the signal peptide may be identified pursuant to criteria routinely employed in the art for identifying the that type of amino acid sequence element (e.g., Nielsen et al, Prot Eng 10:.. 1-6 (1997) and von Heinje et al., Nucl Acids Res 14:... 4683-4690 (1986)). さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、1つ以上の分泌種をもたらすことも認められる。 Furthermore, in some cases, cleavage of a signal sequence from a secreted polypeptide is not entirely uniform, also recognized to result in more than one secreted species. シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのC-末端境界の何れかの側の約5アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。 These mature polypeptides, where the signal peptide is cleaved within no more than about 5 amino acids on either side of the C- terminal boundary of the signal peptide as identified herein, and the polynucleotides encoding them, are contemplated by the present invention that.

「PROポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチドの他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する活性PROポリペプチドを意味する。 The "PRO polypeptide variant", as defined above or below, the full-length native sequence PRO polypeptides disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking the disclosed signal peptide herein, signal and other fragments of the extracellular domain or herein disclosed full-length PRO polypeptide of PRO as disclosed herein peptides existence, means an active PRO polypeptide having at least about 80% amino acid sequence identity. このようなPROポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のN-又はC-末端において一つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたPROポリペプチドが含まれる。 This is such PRO polypeptide variants include, for instance, one or more amino acid residues at the N- or C- terminus of the full-length native amino acid sequence are added, or deleted, the PRO polypeptide. 通常、PROポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチドの特に同定された他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、 Usually, PRO polypeptide variant full-length native amino acid sequence disclosed herein, wherein the disclosed full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking the signal peptide, the PRO as disclosed herein have a signal peptide or without and other fragments that are specifically identified in the extracellular domain or herein disclosed full-length PRO polypeptide, at least about 80% amino acid sequence identity, alternatively at least about 81% amino acid sequence identity, alternatively at least about 82% amino acid sequence identity, alternatively at least about 83% amino acid sequence identity, alternatively at least about 84% amino acid sequence identity, alternatively at least about 85% amino acid sequence identity, alternatively at least about 86% amino acid sequence identity, alternatively at least about 87% amino acid sequence identity, るいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。 Rui at least about 88% amino acid sequence identity, alternatively at least about 89% amino acid sequence identity, alternatively at least about 90% amino acid sequence identity, alternatively at least about 91% amino acid sequence identity, alternatively at least about 92% amino acid sequence identity, alternatively at least about 93% amino acid sequence identity, alternatively at least about 94% amino acid sequence identity, alternatively at least about 95% amino acid sequence identity, alternatively at least about 96% amino acid sequence identity, or has at least about 97% amino acid sequence identity, alternatively at least about 98% amino acid sequence identity and alternatively at least about 99% amino acid sequence identity. 通常は、PRO変異体ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸長、あるいは少なくとも約20アミノ酸長、あるいは少なくとも約30アミノ酸長、あるいは少なくとも約40アミノ酸長、あるいは少なくとも約50アミノ酸長、あるいは少なくとも約60アミノ酸長、あるいは少なくとも約70アミノ酸長、あるいは少なくとも約80アミノ酸長、あるいは少なくとも約90アミノ酸長、あるいは少なくとも約100アミノ酸長、あるいは少なくとも約150アミノ酸長、あるいは少なくとも約200アミノ酸長、あるいは少なくとも約300アミノ酸長、又はそれ以上である。 Typically, PRO variant polypeptides are at least about 10 amino acids in length, alternatively at least about 20 amino acids in length, alternatively at least about 30 amino acids in length, alternatively at least about 40 amino acids in length, alternatively at least about 50 amino acids in length, alternatively at least about 60 amino acids in length , alternatively at least about 70 amino acids in length, alternatively at least about 80 amino acids in length, alternatively at least about 90 amino acids in length, alternatively at least about 100 amino acids in length, alternatively at least about 150 amino acids in length, alternatively at least about 200 amino acids in length, alternatively at least about 300 amino acids in length, or is it more.

ここに定義されるPROポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、PROポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。 It has been identified here for PRO polypeptide as defined herein "percent (%) amino acid sequence identity", sequences are aligned, introducing gaps, if necessary to achieve the maximum percent sequence identity and, after aligning not considered part of the sequence identity is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with amino acid residues of the PRO polypeptide. パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。 Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be available those skilled in the art in various ways that are within the skill of, for example BLAST, the BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software such publicly It can be achieved by the use of computer software. 当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。 Those skilled in the art can determine appropriate parameters for including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared, to measure the alignment. しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。 However, for purposes herein, the% amino acid sequence identity values, by complete source code for the ALIGN-2 program uses Table 1 sequence comparison program is provided in ALIGN-2 below can get. ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンDC, 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。 ALIGN-2 sequence comparison computer program was authored by Genentech, Inc., and the source code shown in Table 1 below has been filed with the document for the user in the United States Copyright Office, Washington, DC, 20559, US copyright registration number TXU510087 where it is registered under. ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。 ALIGN-2 is Genentech, Inc., South San Francisco, preferably available from California or may be compiled from the source code provided in Table 1 below. ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。 The ALIGN-2 program, UNIX (registered trademark) operating system, preferably compiled for use on a Digital UNIX (registered trademark) V4.0D. 全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。 All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.

アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される: In situations where ALIGN-2 is employed for amino acid sequence comparisons, the given amino acid sequence A, the given amino acid sequence B, or the% amino acid sequence identity (or an amino acid sequence B given, or contrast can also be referred to as amino acid sequence a that has been given with or containing a certain% amino acid sequence identity) is calculated as follows:
分率X/Yの100倍ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。 100 times the fraction X / Y where, X is the number of amino acid residues scored as identical matches by alignment of A and B of the sequence alignment program ALIGN-2, Y is the total amino acid residues of the B is a number. アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。 If the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, the% amino acid sequence identity of A to B will be appreciated differs not equal the% amino acid sequence identity with A and B. この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、「PRO」が対象となる仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となる「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「X」、「Y」及び「Z」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表2及び3は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。 As an example of this method of% amino acid sequence identity with computing, "PRO" represents the amino acid sequence of a hypothetical PRO polypeptide of interest, "Comparison Protein" is compared are subject "comparison" protein represents the amino acid sequence are, and "X" represents a hypothetical amino acid residues, each different "Y" and "Z", Table 2 and 3, the amino acid sequence designated "comparison protein" "PRO It shows the% amino acid sequence identity calculation method to the amino acid sequence designated ".

特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。 Unless specifically stated otherwise, all% amino acid sequence identity values ​​used herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as described above. しかしながら、%アミノ酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480(1996))を用いて決定してもよい。 However,% amino acid sequence identity values ​​are, WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) may be determined using. さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。 Furthermore, most of the WU-BLAST-2 search parameters are set to the default values. 初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。 Those not set to default values, i.e., the adjustable parameters, are set with the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. WU-BLAST2が用いられた場合には、、%アミノ酸配列同一性値は、(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列(即ち、対象とするPROポリペプチドが比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。 ,,% amino acid sequence identity value when the WU-BLAST2 is employed is, (a) a native PRO amino acid sequence of the PRO polypeptide of interest having a sequence derived from the polypeptide and the comparison amino acid of interest sequence (i.e., a PRO polypeptide variant which may be a sequence PRO polypeptide is compared to a target) between the number of identical amino acid residues that match as determined by WU-BLAST-2, ( b) the quotient obtained by dividing by the total number of residues of the PRO polypeptide of interest. 例えば、「アミノ酸配列Bに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Aが対象である比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Bが対象であるPROポリペプチドのアミノ酸配列である。 For example, in the statement "a polypeptide comprising an amino acid sequence A which has or having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence B", a comparison amino acid sequence amino acid sequence A is the target, amino acid sequence B is the amino acid sequence of the PRO polypeptide of interest.

また、%アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。 The% amino acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al, Nucleic Acids Res 25:. 3389-3402 (1997)) may be determined using. NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。 The NCBI-BLAST2 sequence comparison program, http: can be downloaded from the //www.ncbi.nlm.nih.gov, or the United States National Institutes of Health in a different way, Bethesda, can be obtained from Maryland. NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe-値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。 NCBI-BLAST2 uses several search parameters, wherein all of those search parameters are set to default values ​​including, for example, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5 , including multi-pass e- value = 0.01, constant for multi-pass = 25, final gapped alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.

アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される: In situations where NCBI-BLAST2 is employed for amino acid sequence comparisons, the given amino acid sequence A, the given amino acid sequence B, or the% amino acid sequence identity (or an amino acid sequence B given, or contrast can also be referred to as amino acid sequence a that has been given with or containing a certain% amino acid sequence identity) is calculated as follows:
分率X/Yの100倍ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。 100 times the fraction X / Y where, X is the number of amino acid residues scored as identical matches by alignment of A and B of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, Y is the total amino acid residues of the B is a number. アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。 If the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, the% amino acid sequence identity of A to B will be appreciated differs not equal the% amino acid sequence identity with A and B.

「PRO変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性PROポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するPROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも約80%の核酸配列同一性、好ましくはあるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少な The "PRO variant polynucleotide" or "PRO variant nucleic acid sequence", as defined below, a nucleic acid molecule which encodes an active PRO polypeptide, the full-length native sequence PRO polypeptide sequence as disclosed herein, full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking the signal peptide as disclosed herein, any other PRO extracellular domain of the polypeptide, or full-length PRO polypeptide sequence as disclosed herein as disclosed herein have a signal peptide or without nucleic acid sequence encoding a fragment of at least about 80% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 81% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 82% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 83% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 84% nucleic acid sequence identity, alternatively less とも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している Least about 85% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 86% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 87% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 88% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 89% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 90% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 91% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 92% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 93% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 94% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 95% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 96% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 97% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 98% nucleic acid sequence have the identity and alternatively at least about 99% nucleic acid sequence identity 変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。 Variants do not encompass the native nucleotide sequence.

通常は、PRO変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約60ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約90ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約120ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約150ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約180ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約210ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約240ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約270ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約300ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約450ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約600ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約900ヌクレオチド長、又はそれ以上である。 Typically, PRO variant polynucleotides are at least about 30 nucleotides in length, alternatively at least about 60 nucleotides in length, alternatively at least about 90 nucleotides in length, alternatively at least about 120 nucleotides in length, alternatively at least about 150 nucleotides in length, alternatively at least about 180 nucleotides in length , alternatively at least about 210 nucleotides in length, alternatively at least about 240 nucleotides in length, alternatively at least about 270 nucleotides in length, alternatively at least about 300 nucleotides in length, alternatively at least about 450 nucleotides in length, alternatively at least about 600 nucleotides in length, alternatively at least about 900 nucleotides in length, or is it more.

ここで同定されるPROコード化核酸配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、PRO配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。 Here for PRO nucleic acid sequence identity "percent (%) nucleic acid sequence identity", aligning the sequences and introducing gaps, if necessary to achieve the maximum percent sequence identity, nucleotides PRO sequence it is defined as the percentage of nucleotides in a candidate sequence that are identical with. パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。 Alignment for purposes of determining percent nucleic acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for example BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software such publicly available computer It can be achieved by the use of software. ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラALIGN-2を使用することによって得られる。 For purposes herein, the% amino acid sequence identity values ​​are obtained by complete source code for the ALIGN-2 program using a sequence comparison are provided in Table 1 program ALIGN-2 below . ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所,ワシントン DC,20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。 ALIGN-2 sequence comparison computer program was authored by Genentech, Inc., and the source code shown in Table 1 below has been filed with the document for the user in the United States Copyright Office, Washington, DC, 20559, US copyright registration number TXU510087 where it is registered under. ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。 ALIGN-2 is Genentech, Inc., South San Francisco, preferably available from California or may be compiled from the source code provided in Table 1 below. ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。 The ALIGN-2 program, UNIX (registered trademark) operating system, preferably compiled for use on a Digital UNIX (registered trademark) V4.0D. 全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。 All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.

核酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される: In situations where ALIGN-2 is employed for nucleic acid sequence comparisons, of a given nucleic acid sequence C, with a given nucleic acid sequence D, or the% nucleic acid sequence identity (or the amino acid sequence D given, or contrast can also be referred to as nucleic acid sequence C that has been given with or containing a certain% nucleic acid sequence identity) is calculated as follows:
分率W/Zの100倍ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN-2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。 100 times the fraction W / Z where, W is the number of nucleotides scored as identical matches by the alignment of C and D of the sequence alignment program ALIGN-2, Z is the total nucleic acid residues of the D is a number. 核酸配列Cの長さがアミノ酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。 Where the length of nucleic acid sequence C is not equal to the length of amino acid sequence D, the% nucleic acid sequence identity to D of C is the% nucleic acid sequence identity to C of D will be appreciated by different. この方法を用いた%核酸配列同一性の計算の例として、「PRO−DNA」が対象となる仮説的PROコード化核酸配列を表し、「比較DNA」が対象となる「PRO−DNA」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「N」、「L」及び「V」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表4及び5が「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO−DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示す。 Examples of calculation of% nucleic acid sequence identity using this method, "PRO-DNA" represents a hypothetical PRO-encoding nucleic acid sequence of interest, "Comparison DNA" is subject "PRO-DNA" nucleic acid molecule There represents a nucleic acid sequence being compared, and "N" represents a hypothetical amino acid residues, each different "L" and "V", a nucleic acid sequence that tables 4 and 5 are designated "comparison DNA" It shows the "PRO-DNA" how to calculate the% nucleic acid sequence identity nucleic acid sequence designated.

特に断らない限りは、ここでの全ての%核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。 Unless specifically stated otherwise, all% nucleic acid sequence identity values ​​used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described in the immediately preceding paragraph. しかしながら、%核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて決定してもよい。 However,% nucleic acid sequence identity value, WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) may be determined using. さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。 Furthermore, most of the WU-BLAST-2 search parameters are set to the default values. 初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。 Those not set to default values, i.e., the adjustable parameters, are set with the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. WU-BLAST-2が用いられた場合、%核酸配列同一性値は、(a)天然配列PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列(即ち、対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子が比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一核酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。 If WU-BLAST-2 is employed, a% nucleic acid sequence identity value is determined, (a) a nucleic acid sequence of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest having a sequence derived from the native sequence PRO polypeptide-encoding nucleic acid If, between the comparison nucleic acid sequence of interest (i.e., a PRO polypeptide variant which may be a sequence PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest is being compared) as determined by WU-BLAST-2 the number of identical nucleic acid residues that match is determined by the quotient obtained by dividing the total number of nucleotides of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of (b) target. 例えば、「核酸配列Bに対して少なくとも80%の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Aが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Bが対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。 For example, in the statement "a polypeptide comprising a nucleic acid sequence A which has or having at least 80% nucleic acid sequence identity to the nucleic acid sequence B", a comparison nucleic acid sequence A is the target, nucleic acid sequence B is the nucleic acid sequence of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest.

また、%核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。 Also, the% nucleic acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al, Nucleic Acids Res 25:. 3389-3402 (1997)) may be determined using. NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。 The NCBI-BLAST2 sequence comparison program, http: can be downloaded from the //www.ncbi.nlm.nih.gov, or the United States National Institutes of Health in a different way, Bethesda, can be obtained from Maryland. NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe-値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。 NCBI-BLAST2 uses several search parameters, wherein all of those search parameters are set to default values ​​including, for example, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5 , including multi-pass e- value = 0.01, constant for multi-pass = 25, final gapped alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.

核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される: In situations where NCBI-BLAST2 is employed for nucleic acid sequence comparisons, of a given nucleic acid sequence C, with a given nucleic acid sequence D, or the% nucleic acid sequence identity (or a given nucleic acid sequence D, or contrast can also be referred to as nucleic acid sequence C that has been given with or containing a certain% nucleic acid sequence identity) is calculated as follows:
分率W/Zの100倍ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。 100 times the fraction W / Z where, W is the number of nucleotides scored as identical matches by the alignment of C and D of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, Z is the total nucleic acid residues of the D is a number. 核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。 Where the length of nucleic acid sequence C is not equal to the length of nucleic acid sequence D, the% nucleic acid sequence identity to D of C is the% nucleic acid sequence identity to C of D will be appreciated by different.

他の実施態様では、PRO変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性PROポリペプチドをコードし、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示する全長PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。 In other embodiments, PRO variant polypeptide nucleotides that encode an active PRO polypeptide, preferably under stringent hybridization and wash conditions, high to nucleotide sequences encoding the full-length PRO polypeptide as disclosed herein it is a nucleic acid molecule hybridization. PRO変異体ポリペプチドは、PRO変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。 PRO variant polypeptides may be those that are encoded by a PRO variant polynucleotide.
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。 By "isolated", wherein when used to describe the various polypeptides disclosed means the identified from a component of its natural environment separated and / or recovered polypeptide. その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。 Contaminant components of its natural environment, its typically with diagnostic or therapeutic uses for the polypeptide are materials which would interfere, enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. 好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。 In preferred embodiments, the polypeptide (1) by use of a spinning cup sequenator, a degree sufficient to obtain N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues, or (2) Coomassie blue or, preferably to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. 単離されたポリペプチドには、PROポリペプチドの自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。 Isolated polypeptide, since there is no at least one component of the natural environment of the PRO polypeptide includes polypeptide in situ within recombinant cells. しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。 Ordinarily, however, isolated polypeptide will be prepared by at least one purification step.

「単離された」PROポリペプチドコード化核酸は、同定され、PROポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。 An "isolated" PRO polypeptide-encoding nucleic acid is identified, at least one nucleic acid molecule that is identified and separated from contaminant nucleic acid molecule with which it is ordinarily associated in the natural source of the nucleic acid encoding the PRO polypeptide. 単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。 Isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule is other than in the form or setting in which it is found in nature. ゆえに、単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するPROポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。 Thus, an isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecules are distinguished from the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule as it exists in natural cells. しかし、単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるPROポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるPROポリペプチド核酸分子を含む。 However, an isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule include, for example, PRO polypeptide nucleic acid molecule nucleic acid molecule contained in cells that ordinarily express the PRO polypeptide is in a chromosomal location different from that of natural cells .
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。 The expression "control sequences" refers to DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. 例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。 Suitable for prokaryotes, for example control sequences include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. 真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。 Eukaryotic cells, promoters, are known to utilize polyadenylation signals and enhancers.

核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。 Nucleic acid is "operably linked" when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. 例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。 For example, DNA for a presequence or secretory leader is if it is expressed as a participating preprotein in the secretion of the polypeptide, the polypeptide is operably linked to the DNA; a promoter or enhancer is the transcription of the sequence if it affects, it is operably linked to a coding sequence; or a ribosome binding site, if it if is positioned so as to facilitate translation operably linked to a coding sequence. 一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。 In general, the "operably linked" are contiguous bound DNA sequences, in the case of a secretory leader, means that contiguous and in reading phase. しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。 However, enhancers do not necessarily have to be in close proximity. 結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。 Linking is accomplished by ligation at convenient restriction sites. そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。 If such sites do not exist, according to conventional techniques, the synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used.
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-PROポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-PRO抗体組成物、一本鎖抗-PRO抗体、及び抗-PRO抗体の断片を包含している(下記参照)。 The term "antibody" is used in the broadest sense, for example, (including agonist, antagonist, and neutralizing antibodies) single anti -PRO polypeptide monoclonal antibody, anti -PRO antibody compositions with polyepitopic specificity encompasses fragments of single chain anti -PRO antibodies, and anti -PRO antibody (see below). ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。 The term "monoclonal antibody" as used herein, a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the, are identical except for some mutations may occur naturally, which may be present in minor amounts It refers to an antibody obtained from a population.

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。 "Stringency" of hybridization reactions is readily determinable by one skilled in the art, are generally probe length, washing temperature, and empirical calculation dependent upon the salt concentration. 一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。 In general, longer probes require higher temperatures for proper annealing, while shorter probes need lower temperatures. ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。 Hybridization generally complementary strand is dependent on the ability of denatured DNA to reanneal If is close to its melting point present in lesser environment. プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。 The higher the degree of desired homology between the probe and hybridizable sequence, the higher the relative temperature which can be used. その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェンシーを低下させる。 As a result, it follows that higher relative temperatures would tend to make the reaction conditions more stringent, while lower temperatures less so stringency. さらに、ストリンジェンシーは塩濃度に逆比例する。 Moreover, stringency is inversely proportional to the salt concentration. ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明は、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。 For additional details and explanation of stringency of hybridization reactions are described in, for example, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度にストリンジェントな条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナ Defined here as "stringent conditions" or "high stringency conditions", (1) low ionic strength and high temperature for washing, for example, of 0.015M at 50 ° C. sodium chloride / 0. those using sodium dodecyl sulfate sodium citrate 0.1% of 0015M; (2) hybridization a denaturing agent such as formamide during, for example, 42 to 50% at ℃ (v / v) formamide with 0.1% bovine serum albumin 0.1% Ficoll 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM of pH6.5 sodium phosphate buffer, and sodium chloride 750 mM, those using 75mM sodium citrate; (3) 42 50% in ℃ formamide, 5xSSC (0.75 M of NaCl, citric of 0.075M Sanna リウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高度にストリンジェントな洗浄を用いるものによって同定される。 Potassium), sodium phosphate 50 mM (pH 6.8), 0.1 percent sodium pyrophosphate, 5x Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran and sulfuric acid, 50% formamide with washing and 55 ° C. in 0.2 × SSC (sodium chloride / sodium citrate) at 42 ° C., then those using high stringency wash consisting of 0.1xSSC containing EDTA at 55 ° C. They are identified by.

「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記のストリンジェンシーより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37−50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必 "Moderately stringent conditions" are, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 is identified as described in the above stringency lower wash solution than sea and high hybridization conditions (e.g., temperature, ionic strength and% SDS) less stringent stringent conditions. moderate, including the use of 20% formamide, 5xSSC (150 mM of NaCl, trisodium citrate 15 mM), 50mM sodium phosphate ( pH 7.6), 5x Denhardt's solution, conditions such as overnight incubation, followed by washing the filters at 37-50 ° C. in 1xSSC at 37 ° C. in a solution containing 10% dextran sulfate, and 20 mg / mL denatured sheared salmon sperm DNA . those skilled in the art, 必 to accommodate factors such as probe length に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。 Depending on recognize how to adjust the temperature, ionic strength, and the like.
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。 The term "epitope tagged" when used herein refers to a chimeric polypeptide comprising a PRO polypeptide fused to a "tag polypeptide", or their domain sequences. タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするPROポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。 Tag polypeptide, PRO polyepitopic an antibody can be made, or some have enough residues to provide an epitope that can be identified by other reagents, the length is of interest sufficiently short so as not to inhibit the activity of the peptide. また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。 The tag polypeptide preferably also is fairly unique so that the antibody does not substantially cross-react with other epitopes. 適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20の残基)を有する。 Suitable tag polypeptides generally have at least six amino acid residues and usually between about 8 and 50 amino acid residues (preferably from about 10 to about 20 residues).

ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。 The term "immunoadhesin" as used herein, refers to an antibody-like molecules which combine the binding specificity and immunoglobulin constant domains of the heterologous protein (an "adhesin"). 構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。 Structurally, immunoadhesins with the desired binding specificity, comprises a is other than the antigen recognition and binding site of an antibody (i.e. is "heterologous") amino acid sequence, fusions with immunoglobulin constant domain sequence . イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。 The adhesin part of an immunoadhesin molecule typically is a contiguous amino acid sequence comprising at least the binding site of a receptor or a ligand. イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA(IgA-1及びIgA-2を含む)、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。 The immunoglobulin constant domain sequence in the immunoadhesin, IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtypes, (including IgA-1 and IgA-2) IgA, IgE, any such IgD or IgM it can be obtained from the immunoglobulin.

「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。 The term "antagonist" is used in the broadest sense, blocks the biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein, inhibits, or any molecule that neutralizes. 同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。 Similarly, the term "agonist" is used in the broadest sense and includes any molecule that mimics a biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. 好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。 Suitable agonist or antagonist molecules specifically include agonist or antagonist antibodies or antibody fragments, fragments or amino acid sequence variants of native PRO polypeptides, peptides, small organic molecules, and the like. PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、PROポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、PROポリペプチドに通常は関連している一つ又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含んでもよい。 Methods for identifying agonists or antagonists of PRO polypeptide, the PRO polypeptide with a candidate antagonist or agonist, it is usually a PRO polypeptide which measures the change in one or more biological activities associated it may also include a.

「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又はしっかんを防止又は低下(減少)させられる。 "Treatment" curative treatment, refers to both prophylactic therapy, and preventative therapy, the patient is prevented or reduced the pathological condition or disease (lessen) the targeted is. 治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。 Those in need of treatment include those already with the disorder as well as those which are prevented from easily disorder or those in whom the disease.
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを意味する。 "Chronic" administration as opposed to an acute mode to administration of the agent in a continuous manner, which means that to maintain the initial therapeutic effect (activity) for an extended period of time. 「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。 "Intermittent" administration rather than not consecutively done without interruption, a process rather is cyclic in nature made.
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。 "Mammal" for purposes of treatment of the subject is classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, and zoo, sports, or pet animals, such as dogs, cats, cows, horses, sheep, pigs, rabbits, etc. It means any animal. 好ましくは、哺乳動物はヒトである。 Preferably, the mammal is a human.
一つ又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。 The one or more therapeutic agents "in combination with" administration, consecutive administration in simultaneous (concurrent) and in any order.

ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。 "Carriers" as used herein includes pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers which are nontoxic to the cell or mammal being exposed thereto at the dosages and concentrations employed . 生理学的に許容されうる担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。 Physiologically acceptable carrier is often an aqueous pH buffered solution. 生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商品名)を含む。 Examples of physiologically acceptable carriers are phosphate, buffer citrate and other organic acid salts; antioxidants including ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; glucose, monosaccharides containing mannose or dextran, disaccharides, and other carbohydrates; EDTA mannitol or its Rubitoru sugar alcohols such as; salt formed pair such as sodium ion; chelating agents like and / or non-ionic surfactants, e.g., TWEEN (trade name), polyethylene glycol (PEG), and PLURONICS (product including the name).

「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。 "Antibody fragments" comprise a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding or variable region of the intact antibody. 抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab') 、及びFv断片;ダイアボディ(diabodies);直鎖状抗体(Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]);一本鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。 Examples of antibody fragments, Fab, Fab ', F ( ab') 2, and Fv fragments; diabodies (diabodies); linear antibodies (Zapata et al, Protein Eng 8 (10): . 1057-1062 [1995] ); multispecific antibodies formed from antibody fragments; single-chain antibody molecules.
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。 Papain digestion of antibodies produces two identical antigen binding fragments, called "Fab" fragments, each with a single antigen-binding site, and a residual reflecting the ability to crystallize readily "Fc" It is named fragment. ペプシン処理はF(ab') 断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。 Pepsin treatment yields an F (ab ') 2 fragment that has two antigen-combining sites and is still capable of crosslinking antigen.
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。 "Fv" is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. この領域は、密接に非共有結合した1本の重鎖と1本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。 This region, closely consists of a dimer of the variable regions of one heavy chain and one light chain, non-covalent association. この配置において各ドメインの3つのCDRが相互作用してV −V に量体の表面に抗原結合部位を決定する。 Three CDR of each domain in this arrangement to define an antigen-binding site on the surface of the dimer to V H -V L interact. 正しくは、6つのCDRが抗体に対する抗原結合特異性を与える。 Collectively, the six CDR confer antigen binding specificity to the antibody. しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。 However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only specific three CDR antigen), although at a lower affinity than the entire binding site has the ability to recognize and bind antigen .

またFab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。 The Fab fragment also contains the first constant domain of the constant domain and the heavy chain of light chain (CH1). Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの一つ又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab'断片と相違する。 Fab fragments differ from Fab 'fragments by having additional few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. ここで、Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab'を表す。 Here, Fab'-SH is for Fab 'in which the cysteine ​​residue (s) of the constant domains bear a free thiol group. F(ab') 抗体断片は、最初はFab'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。 F (ab ') 2 antibody fragments originally were produced as pairs of Fab' fragments which have hinge cysteines between them. 抗体断片の他の化学的結合も知られている。 It is also known Other chemical couplings of antibody fragments.
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。 The "light chains" of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species, based on the amino acid sequences of their constant domains, are classified into one of two clearly distinct types, called kappa and lambda.
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。 The amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, immunoglobulins can be assigned to different classes. 免疫グロブリンの五つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に分類される。 There are five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several of these may be further divided into subclasses (isotypes), e.g. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, and IgA2.

「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のV 及びV ドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。 "Single-chain Fv" or "sFv" antibody fragments comprise the antibody fragments comprising the V H and V L domains of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. 好ましくは、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合とって望ましい構造の形成を可能にする、V 及びV ドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。 Preferably, Fv polypeptide, sFv to allow the formation of a desired structure for antigen binding further comprises a polypeptide linker between the V H and V L domains. sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。 For a review of sFv is, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) Pluckthun a reference to the thing.
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(V −V )内で軽鎖可変ドメイン(V )に結合した重鎖可変ドメイン(V )を含む。 The term "diabodies (diabodies)" refers to small antibody fragments with two antigen-binding sites, which fragments bind to the light chain variable domain (V L) in the same polypeptide chain (V H -V L) a heavy chain variable domain that contains the (V H). 同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。 By using a linker that is too short to allow pairing between the two domains on the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of another chain and create two antigen-binding sites. ダイアボディは、例えば、EP404,097;WO93/11161;及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。 Diabodies example, EP404,097; WO93 / 11161; and Hollinger et al, Proc Natl Acad Sci USA, 90:.... Is well described by 6444-6448 (1993).

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。 An "isolated" antibody is one that is identified from a component of its natural environment are separated and / or recovered. その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。 Contaminant components of its natural environment are materials which would interfere with diagnostic or therapeutic uses for the antibody, enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. 好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリー法で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。 In a preferred embodiment, the antibody is an antibody in excess of 95% when measured at (1) the Lowry method, and most preferably more than 99 wt%, by using (2) spinning cup sequenator, at least 15 residues a degree sufficient to obtain the N-terminal or internal amino acid sequence, or to homogeneity by (3) Coomassie blue or, preferably, SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. 単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。 Isolated antibody, since at least one component of the antibody's natural environment will not be present includes the antibody in situ within recombinant cells. しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。 Ordinarily, however, isolated antibody will be prepared by at least one purification step.
「特異的に結合する」抗体、又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ特異的な抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。 "Specifically binds to" an antibody, or a specific polypeptides or specific antibodies specific to an epitope on the polypeptide, without substantially binding to other polypeptide or polypeptide epitope specific one that binds to an epitope on the polypeptide or a specific polypeptide.

「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。 The word "label" when used herein as "labeled" antibody is produced, refers to a detectable compound or composition which is conjugated directly or indirectly to the antibody. 標識は、それ自身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。 The label may be detectable by itself (e.g., radioisotope labels or fluorescent labels) or, in the case of an enzymatic label, a chemical conversion of a detectable substrate compound or composition may catalyze.
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。 By "solid phase" is meant a non-aqueous matrix to which the antibody of the present invention can adhere. ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。 Examples of solid phases encompassed herein include those formed partially or entirely, glass (e.g., controlled pore glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamides, polystyrene, polyvinyl alcohol and silicones. 或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。 In certain embodiments, depending on the context, the solid phase can comprise the well of an assay plate; Elsewhere may be a purification column (e.g. an affinity chromatography column). また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。 Further, the term, such as those described in U.S. Patent No. 4,275,149, includes a discontinuous solid phase of discrete particles.
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(PROポリペプチド又はその抗体など)の輸送に有用である。 A "liposome" is various types of lipids, are small vesicles consisting of phospholipids and / or surfactant, useful in the transport of drugs (such as PRO polypeptide or antibody thereto) to a mammal. リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。 The components of the liposome are commonly arranged in a bilayer formation, similar to the lipid arrangement of biological membranes.
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つと定義される。 A "small molecule" is defined herein to have a molecular weight below about 500 Daltons.
ここで開示されたポリペプチドの「有効量」、或いはそのアゴニスト又はアンタゴニストとは、特別に言及された目的を実行するために十分な量のことである。 An "effective amount" herein disclosed polypeptides or an agonist thereof, or antagonist is an amount sufficient to perform specifically mentioned purpose. 「有効量」とは、言及された目的に関連して、経験的及び常套的方法によって決定することができる。 An "effective amount", in relation to the stated purpose may be determined empirically and in a routine manner.

ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるPROポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPROポリペプチドの形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生PROポリペプチドが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力以外の、天然又は天然発生PROポリペプチドによって引き起こされる生物機能(阻害又は刺激)を意味し、「免疫」活性とは、天然又は天然発生PROポリペプチドが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力を意味する。 "Active" or "activity" for the purposes herein, means a form of the PRO polypeptide which retain a biological and / or immunological activity of a PRO polypeptide native or naturally-occurring, in which the "biological" activity, other than the ability to induce the production of an antibody against an antigenic epitope possessed by a native or naturally-occurring PRO polypeptide retains, biological function caused by a native or naturally-occurring PRO polypeptide (inhibition or stimulation ) means, "immune" activity refers to the ability to induce the production of an antibody against an antigenic epitope possessed by a native or naturally-occurring PRO polypeptide is retained. 好ましい生物活性には、NF-κBの活性化を誘導すること、並びに炎症誘発性ケモカインIL-8の生産の刺激が含まれる。 Preferred biological activities, to induce the activation of NF-[kappa] B, as well as stimulating the production of proinflammatory chemokine IL-8. その他の好ましい生物活性には、末梢血単核細胞又はCD 4+の刺激が含まれる。 Other preferred biological activity includes stimulation of peripheral blood mononuclear cells or CD 4+. その他の生物活性には、例えば、THP1細胞からのTNF-αの放出が含まれる。 Other biological activities include, for example, the release of TNF-alpha from THP1 cells. 代替活性は、関節軟骨からのIL-1a誘導によるNO(一酸化窒素)生成の減少である。 Alternative activity is a reduction of NO (nitric oxide) production by IL-1a induced from articular cartilage. その他の活性には、関節軟骨でのマトリックス合成の増大が含まれる。 Other activity includes increased matrix synthesis in articular cartilage. あるいは、その他の活性には、マトリックス合成の阻害と並んで関節軟骨マトリックスの破壊の促進が含まれる。 Alternatively, other activity includes promoting breakdown of articular cartilage matrix along with the inhibition of matrix synthesis. その他の好ましい生物活性には、炎症性腸疾患の軽度から重度の段階の間、又は発作中のインターロイキン-17シグナル伝達経路のレベルを調節することが含まれる。 Another preferred biological activity includes modulating between mild inflammatory bowel disease severe stages, or levels of interleukin-17 signaling pathway during seizures.

「免疫学的」活性とは、単に、天然又は天然発生PROポリペプチドによって保持されている抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘導する能力を意味する。 An "immunological" activity, simply refers to the ability to induce the production of an antibody against an antigenic epitope which is held by a native or naturally-occurring PRO polypeptide.
「変性軟骨性疾患」は主に軟骨マトリックスの破壊によって特徴づけられる多くの疾患を記述している。 "Modified cartilaginous disorder" describes a number of diseases characterized primarily by the destruction of the cartilage matrix. 更なる症状には、一酸化窒素の生成及びプロテオグリカン分解の上昇が含まれる。 In a further condition, it includes generation and increased proteoglycan degradation of nitric oxide. この定義に包含される疾患の例には、例えば関節炎(例えば、変形性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎)が含まれる。 Examples of diseases to be encompassed by this definition, for example, arthritis (e.g., osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis) are included.
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の構成成分が哺乳動物の病的状態を引き起こし、媒介し、或いは寄与する疾患を意味する。 The term "immune related disease" is a component of the immune system of a mammal causes a pathological condition in a mammal, mediates or otherwise contributes to disease. また、免疫反応の刺激又は処置が、疾患の進行に対して改善的な効果を有するような疾患をも含む。 Further, stimulation or intervention of the immune response, including diseases such as have an ameliorative effect on progression of the disease. この用語には、免疫媒介炎症誘発性疾患、非免疫媒介炎症誘発性疾患、感染性疾患、免疫不全性疾患、腫瘍形成等が含まれる。 The term includes immune-mediated inflammatory diseases, non-immune-mediated inflammatory diseases, infectious diseases, immunodeficiency diseases, neoplasia, and the like.
「T細胞媒介疾患」という用語は、T細胞が哺乳動物の病的状態を直接、又は間接に媒介する、或いは寄与する疾患を意味する。 The term "T cell mediated disease", T cells directly pathological condition in a mammal, or indirectly mediate or otherwise contribute disease. T細胞媒介疾患は、細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等、そして例えば、T細胞によって分泌されたリンホカインによってB細胞が刺激された場合に、B細胞と関連している効果にさえも関連している。 T cell mediated disease is a cell mediated effects, lymphokine mediated effects, etc., and for example, if the B cells are stimulated by lymphokines secreted by T cells, and even also related to the effects associated with B cells .

そのうちの免疫又はT細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症性筋疾患(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症)、自己免疫性血小板減少症(溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症)、甲状腺炎(バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、糖尿病、免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症 Are immune or T cell mediated among them, examples of immune-related and inflammatory diseases that can be treated according to the invention include systemic lupus erythematosis, rheumatoid arthritis, juvenile chronic arthritis, spondyloarthropathies, systemic sclerosis sclerosis (scleroderma), idiopathic inflammatory myopathies (dermatomyositis, polymyositis), Sjogren's syndrome, systemic vasculitis, sarcoidosis, autoimmune hemolytic anemia (immune pancytopenia, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria urine disease), autoimmune thrombocytopenia (hemolytic thrombocytopenic purpura, immune-mediated thrombocytopenia), thyroiditis (Grave's disease, Hashimoto's thyroiditis, juvenile lymphocytic thyroiditis, atrophic thyroiditis), diabetes, immune-mediated renal disease (glomerulonephritis, tubulointerstitial nephritis), central and demyelinating diseases such as multiple sclerosis of the peripheral nervous system, idiopathic demyelinating polyneuropathy or Guillain-Barre syndrome 群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬 、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。 Group, and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, hepatobiliary diseases such as infectious hepatitis (A, B, C, D, E hepatitis, and other non-hepatotropic viruses), autoimmune chronic active hepatitis , primary biliary cirrhosis, granulomatous hepatitis, and sclerosing cholangitis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis: Crohn's disease), gluten-sensitive enteropathy, and Whipple's disease, autoimmune including bullous skin diseases or immune-mediated skin diseases, polymorphic exudative erythema and contact dermatitis, psoriasis, allergic diseases such as asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, food hypersensitivity and urticaria, immunologic diseases e.g. eosinophilic lung pneumonia, idiopathic pulmonary fibrosis and hypersensitivity pneumonitis, transplantation associated diseases including graft rejection and graft-versus-host disease. 感染症疾患には、ウイルス性疾患、例えばAIDS(HIV感染)、A、B、C、D及びE型肝炎、ヘルペス等、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。 The infectious diseases, viral diseases such as AIDS (HIV infection), contained A, B, C, D and E hepatitis, herpes, etc., bacterial infections, fungal infections, protozoal infections and parasitic infections .

「有効量」とは、特に定まった目的を達成することを引き起こすPROポリペプチド及び/又はアゴニスト/アンタゴニストの濃度又は量である。 An "effective amount" is a concentration or amount of a PRO polypeptide and / or agonist / antagonist results in achieving a particular stated purpose. 更には、「治療的有効量」とは、定まった治療的有効量を達成するために効果的なPROポリペプチド及び/又はアゴニスト/アンタゴニストの濃度又は量である。 Furthermore, a "therapeutically effective amount" is a concentration or amount effective PRO polypeptide and / or agonist / antagonist to achieve a stated therapeutic effect. また、この量は実験的に確定してもよい。 Moreover, this amount may be determined experimentally.
ここで用いられる「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び/又は細胞破壊を起こす物質を意味する。 Here "cytotoxic agent" as used herein, inhibits or prevents the function of cells and / or refers to a substance that causes destruction of cells. この用語は、放射性同位元素(例えば、I 131 、I 125 、Y 90及びRe 186 )、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。 The term is intended to include radioactive isotopes (e.g., I 131, I 125, Y 90 and Re 186), chemotherapeutic agents, and bacteria, means an enzyme activity toxins or fragments thereof from fungi, plants or animals.

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。 A "chemotherapeutic agent" is a chemical compound useful in the treatment of cancer. 化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、タキソイド類、例えばパクリタキセル(タキソール, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドセタキセル(docetaxel)(タキソテール(Taxotere), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン(vinorelbine)、カルボプラチン、テニポシド(teniposide)、ダウノマイシン、カルミノマイシン(carminomycin)、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン(esperamicins)(米国 Examples of chemotherapeutic agents include adriamycin, doxorubicin, epirubicin, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside ( "Ara-C"), cyclophosphamide, thiotepa, busulfan, taxoids, e.g. paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and docetaxel (docetaxel) (Taxotere (Taxotere), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France), toxotere, methotrexate, cisplatin, melphalan, vinblastine, bleomycin, etoposide, ifosfamide, mitomycin C, Mitokisan Tron, vincristine, vinorelbine (vinorelbine), carboplatin, teniposide (teniposide), daunomycin, carminomycin (carminomycin), aminopterin, dactinomycin, mitomycin, esperamicins (esperamicins) (U.S. 特許第4,675,187号参照)、メルファラン、及び他の関連したナイトロジェンマスタードが含まれる。 See Patent No. 4,675,187), melphalan and other related nitrogen mustards. またこの定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン及びオナプリストーン(onapristone)も含まれる。 Also included in this definition are hormonal agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as tamoxifen and Ona pre Stone (progesterone such as onapristone) are also included.

ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、特にここで同定された任意の遺伝子を過剰発現する細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指すものである。 Here, the "growth inhibitory agent" when used in either in vitro or in vivo, in particular those which refer to overexpressing compound to inhibit the growth of cells or the composition of any of the genes identified herein is there. よって、成長阻害剤とは、S期におけるそのような遺伝子の過剰発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。 Thus, the growth inhibitory agent is one which significantly reduces the percentage of cells overexpressing such genes in S phase. 成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(S期以外の場所において)、例えばG1停止及びM期停止を誘発する薬剤が含まれる。 Examples of growth inhibitory agents include (at a place other than S phase) agents that block cell cycle progression, such as agents that induce G1 arrest and M-phase arrest. 伝統的なM期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。 Classical M-phase blockers include the vincas (vincristine and vinblastine), taxol, and topo II inhibitors such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide, and bleomycin. G1を停止させるこれらの薬剤、例えばDNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、及びara-CがS期停止へ波及する。 Those agents that arrest G1, for example, DNA alkylating agents such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil, and ara-C is spread to S-phase arrest. 更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第1章(WB Saunders;Philadelphia, 1995)、特に13頁に見出すことができる。 Further information by Murakami et al., "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs (Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)," and entitled, The Molecular Basis of Cancer (The Molecular Basis of Cancer ), Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, (WB Saunders; Philadelphia, 1995), can be particularly found in 13 pages.

「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。 The term "cytokine" is a protein released by one cell population, is a generic term which act on another cell as intercellular mediators. このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。 Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and traditional polypeptide hormones. サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラクシン;プロリラクシン;卵胞刺激ホルモン(FSH)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(TSH)、及び黄体形成ホルモン(LH);肝臓成長因子;繊維芽細胞成長因子;プロラクチン;胎盤ラクトゲン;腫瘍壊死因子-α及び-β;ミュラー阻害物質;マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NGF−β等の神経成長因子;血小板成長因子;TGF-αあるいはTGF-βのような形質転換成長因子(TGF);インスリン様成長因子-I及び-II;エリスロポ Cytokines, growth hormones such as human growth hormone, N- methionyl human growth hormone, and bovine growth hormone; parathyroid hormone; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; Purorirakushin; glycoproteins, such as follicle stimulating hormone (FSH) hormones, secondary thyroid stimulating hormone (TSH), and luteinizing hormone (LH); hepatic growth factor; fibroblast growth factor; prolactin; placental lactogen; tumor necrosis factor -α and-beta; Mullerian inhibiting substance; mouse gonadotropin related peptide; inhibin; activin; vascular endothelial growth factor; integrin; thrombopoietin (TPO); nerve growth factors such as NGF-beta; platelet growth factor; transforming growth factors such as TGF-alpha or TGF-β (TGF); insulin-like growth factor -I and -II; Erisuropo エチン(EPO);オステオインダクティブ因子;インターフェロン-α、-β、及び-γのようなインターフェロン;マクロファージCSF(M-CSF)のようなコロニー刺激因子(CSF);顆粒球マクロファージCSF(GM−CSF)及び顆粒球CSF(G-CSF);IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、又はIL-17等のインターロイキン(IL);腫瘍壊死因子、例えばTNF-α又はTNF-β;及びLIF及びキットリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。 Ethyne (EPO); osteoprotegerin inductive factor; colony stimulating factors such as macrophage CSF (M-CSF) (CSF);; interferon-.alpha.,-beta, and interferons such as -γ granulocyte-macrophage CSF (GM-CSF) and granulocyte CSF (G-CSF); IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, include and LIF and kit ligand (KL) other polypeptide factors including; IL-11, IL-12, or IL-17 interleukin such (IL); tumor necrosis factor, for example TNF-alpha or TNF-beta It is. ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。 As used herein, the term cytokine includes biologically active equivalents of the protein and the native sequence cytokines from natural sources or from recombinant cell culture.

II. II. 本発明の組成物及び方法 A. The compositions of the present invention and methods A. 全長PROポリペプチド 本発明は、本出願でPROポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。 Full-length PRO Polypeptides The present invention provides a nucleic acid sequence that is newly identified and isolated encoding polypeptides referred to in the present application as PRO polypeptides. 特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のPROポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。 In particular, as disclosed in further detail in the Examples below, cDNA encoding various PRO polypeptides have been identified and isolated. 別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。 Although the proteins produced in separate expression rounds may be given different PRO numbers, UNQ number is unique for any given DNA and the encoded protein, previously noted that never change. しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のPROの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO/番号」で呼称する。 However, for simplicity, herein, further native homologues and variants included herein in the definition of the disclosed full-length native nucleic acid molecules encoded protein well above PRO is, their origin or mode of preparation regardless of the, referred to in the "PRO / number".
下記の実施例に開示するように、種々のcDNAクローンがATCCに寄託されている。 As disclosed in the Examples below, various cDNA clones have been deposited with the ATCC. これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。 The actual nucleotide sequences of those clones can readily be determined by sequencing of the deposited clone using routine methods in the art. 予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。 The predicted amino acid sequence can be determined from the nucleotide sequence using routine skill. ここに記載したPROポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。 For the PRO polypeptides and encoding nucleic acids described herein, Applicants have identified what is believed to be the reading frame best identifiable with the sequence information available at the time.

B. B. PROポリペプチド変異体 ここに記載した全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。 In addition to the full-length native sequence PRO polypeptides described herein PRO polypeptide variant, PRO variant also considered can be prepared. PRO変異体は、PROポリペプチドDNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。 PRO variants by introducing appropriate nucleotide changes into the PRO polypeptide DNA, or can be prepared by synthesizing the desired PRO polypeptide. 当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。 Those skilled in the art will appreciate that amino acid changes, such as changing or membrane anchoring characteristics the number or position of glycosylation sites may alter post-translational processes of the PRO polypeptide.
天然全長配列PRO又はここに記載したPROポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。 Any of the techniques and guidelines for mutations in various domains of the PRO polypeptides described native full-length sequence PRO or where, for example, for has been that conservative and non-conservative mutations set forth in U.S. Patent No. 5,364,934 it can be made using the. 変異は、結果として天然配列PROと比較してPROポリペプチドのアミノ酸配列が変化するPROポリペプチドをコードする一つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。 Variations may be a result as compared with the native sequence PRO substitution of one or more codons encoding the PRO polypeptide amino acid sequence of the PRO polypeptide changes, deletions or insertions. 場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPROポリペプチドの一つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。 Optionally the variation is by substitution with any other amino acid in one or more of the domains of the PRO polypeptide of at least one amino acid. いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。 Insert without any amino acid residues adversely affect the desired activity, or the guidance provided substituted or deleted are compared to the sequence of the protein molecule known homologous sequence of the PRO polypeptide, homology It found by minimizing the number of amino acid sequence changes made in high region. アミノ酸置換は、1つのアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。 Amino acid substitutions are substitutions at other amino acid having similar structural and / or chemical properties of one amino acid, for example the replacement of a leucine with a serine, i.e., can be the result of conservative amino acid substitutions. 挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。 Insertions or deletions may optionally be in the range from 1 to 5 amino acids. 許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。 Acceptable mutations determined by testing for activity in any of the in vitro assays described insertion of an amino acid in the sequence, deletions or substitutions systematically making, the resulting variant to the following examples It is.

PROポリペプチド断片がここに提供される。 PRO polypeptide fragments are provided herein. このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、N-末端又はC-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。 Such fragments may, for example, when compared with a full length native protein may be cleaved at the N- or C- terminus, or may lack internal residues. 或る種の断片は、PROポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。 Certain fragments lack amino acid residues that are not essential for a desired biological activity of the PRO polypeptide.
PRO断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。 PRO fragments may be prepared by any of a number of conventional techniques. 所望のペプチド断片は化学合成してもよい。 Desired peptide fragments may be chemically synthesized. 代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO断片の生成を含む。 Alternatively the method, enzymatic digestion, e.g., by treating the protein with an enzyme known to cleave proteins at sites defined by particular amino acid residues, or by digesting the DNA with suitable restriction enzymes including the generation of PRO fragments by isolating the desired fragment. さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。 Yet another suitable technique, by polymerase chain reaction (PCR), involves isolating and amplifying a DNA fragment encoding a desired polypeptide fragment. DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5'及び3'プライマーで用いられる。 Oligonucleotides that define the desired termini of the DNA fragment are employed at the 5 'and 3' primers for PCR. 好ましくは、PROポリペプチド断片は、ここに開示した天然PROポリペプチドと少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。 Preferably, PRO polypeptide fragments, a native PRO polypeptide disclosed herein that share at least one biological and / or immunological activity.
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表6に示す。 In particular embodiments, conservative substitutions of interest are shown in Table 6 under the heading of preferred substitutions. このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表6に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。 If such substitutions result in a change in biological activity, as described further exemplary substitutions named or below in reference to amino acid classes in Table 6, it was introduced more substitutional changes products screened It is.

ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。 Function or immunological identity of the substituent modification of a polypeptide, (a) the structure of the polypeptide backbone in the area of ​​the substitution, for example, as a sheet or helical conformation, charge or hydrophobicity of the (b) the target site, or (c) side while maintaining the bulk of the chain, it is achieved by selecting a substantially different substituents in their effects. 天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる: Naturally occurring residues are divided into groups based on common side-chain properties:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile; (1) hydrophobic: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr; (2) neutral hydrophilic: cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu; (3) acidic: asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg; (4) basic: asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び(6)芳香族:trp, tyr, phe。 (5) residues that influence chain orientation: gly, pro; and (6) aromatic: trp, tyr, phe.

非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。 Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another class. また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。 Also, substituted residue as such, conservative substitution sites may preferably be introduced into the remaining (non-conservative) sites.
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発[Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたDNAに実施してPRO変異体DNAを作成することもできる。 Mutations, oligonucleotide-mediated (site-directed) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis [Carter et al., Nucl Acids Res, 13:.. 4331 (1986); Zoller et al, Nucl Acids Res,.. 10: 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], restriction selection mutagenesis [Wells et al, Philos Trans R. Soc London SerA, 317:... 415 (1986)] methods known in the art can be made using the like, or other known techniques performed on the cloned DNA can also create a PRO variant DNA.

また、隣接配列に沿って一つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。 Further, it is possible to use Scanning amino acid analysis to identify one or more amino acids along a contiguous sequence. 好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。 Preferred scanning amino acids are relatively small, neutral amino acids. そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。 Such amino acids include alanine, glycine, serine, and cysteine. アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]。 Alanine is because it eliminates the side-chain beyond the beta-carbon and is less likely to alter the main-chain conformation of the variant, is typically a preferred scanning amino acid among this group [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。 Alanine is also typically preferred because it is the most common amino acid. さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)]。 Further, it is frequently found in both buried and exposed positions [Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. Mol Biol, 150:.. 1 (1976)]. アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。 If alanine substitution does not yield adequate amounts of variant, it can be used Aisoterikku (isoteric) amino.

C. C. PROの修飾 PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。 Covalent modifications of PRO modified PRO polypeptides are included within the scope of the present invention. 共有結合的修飾の1つの型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROポリペプチドの選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。 One type of covalent modification includes amino acid residues targeted for PRO polypeptide is reacted with PRO polypeptide selected side chains or the N-or C-terminal residue capable of reacting organic derivatizing agent is there. 二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-PRO抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。 Bifunctional derivatives of a reagent is useful for example PRO to crosslink the surface for use in the method for purifying or vice versa water-insoluble support matrix or anti -PRO antibody. 通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。 Commonly used crosslinking agents include, e.g., 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N- hydroxysuccinimide esters, for example esters with 4-azidosalicylic acid, 3,3'-dithiobis (disk succinimidyl propionate) homobifunctional imidoesters, including disuccinimidyl esters such as, bifunctional maleimides such as bis -N- maleimido-1,8-octane and methyl -3 - [(p-azido phenyl) - dithio] containing reagents such as propionitrile imidate.

他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。 Other modifications include deamidation of the corresponding glutamyl and aspartyl residues glutaminyl and asparaginyl residues, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, lysine, arginine, and histidine methylation of the α- amino groups of the side chains [TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)], acetylation of the N-terminal amine, and optionally amidation of C-terminal carboxyl group.
本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。 Another type of covalent modification of the PRO polypeptide included within the scope of this invention comprises altering the native glycosylation pattern of the polypeptide. 「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列PROに見られる一つ又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PROに存在しない一つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。 "Altering the native glycosylation pattern" is intended for purposes herein to mean one or more deletions (removal of glycosylation sites present or chemical and / or enzymatic carbohydrate moieties found in native sequence PRO manner either by deletion of glycosylation by means), and / or adding not present in the native sequence PRO one or more glycosylation sites. さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。 In addition, the phrase includes a change in the nature and proportions of the various carbohydrate moieties present, including qualitative changes in the glycosylation of the native proteins.

PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。 Addition of glycosylation sites to the PRO polypeptide may be accomplished by altering the amino acid sequence. この変更は、例えば、一つ又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO(O-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。 This change, for example, additions to the native sequence PRO one or more serine or threonine residues (O-linked glycosylation sites), or may be made by substitution. PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。 PRO amino acid sequence may optionally be altered through changes at the DNA level, particularly, PRO polypeptide mutated at preselected bases DNA encoding, is changed through the that codons are generated that will translate into the desired amino acids it may be.
PROポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。 Another means of increasing the number of carbohydrate moieties on the PRO polypeptide is by chemical or enzymatic coupling of glycosides to the polypeptide. このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。 Such methods are described in the art, for example, described in, issued September 11, 1987 WO87 / 05330, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306 (1981) It is.

PROポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。 Removal of carbohydrate moieties present on the PRO polypeptide may be made by mutational substitution of codons encoding for chemically or enzymatically or amino acid residues that serve as targets for glycosylation. 化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。 Chemical deglycosylation techniques are known in the art, for example, described by Hakimuddin et al., Arch Biochem Biophys, 259:... By 52 (1987), and Edge et al, Anal Biochem, 118:.. 131 (1981 It has been described by). ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。 Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties on polypeptides can, Thotakura et al., Meth Enzymol 138:.. 350 as described in (1987), is accomplished by the use of a variety of endo- and exo-glycosidase.
本発明のPROの共有結合的修飾の他の型は、PROポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。 Another type of covalent modification of the PRO of the present invention, PRO Poripe of peptide to one of a variety of nonproteinaceous polymers, such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polyoxyalkylenes, U.S. Patent No. 4, No. 640,835; No. 4,496,689; No. 4,301,144; No. 4,670,417; by the methods described in Patent No. 4,791,192 or 4,179,337 of including binding.
また、本発明のPROポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPROポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。 Also, the PRO polypeptides of the present invention may also be modified in a way to form a chimeric molecule comprises a fusion PRO polypeptide to another, heterologous polypeptide or amino acid sequence.

一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROポリペプチドとの融合を含む。 In one embodiment, such a chimeric molecule comprises a fusion of a tag polypeptide and PRO polypeptide which provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind. エピトープタグは、一般的にはPROポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。 The epitope tag is generally placed at the amino- or carboxyl- terminus of the PRO polypeptide. このようなPROポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。 The presence of such epitope-tagged forms of the PRO polypeptide can be detected using an antibody against the tag polypeptide. また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPROポリペプチドを容易に精製できるようにする。 Also, provision of the epitope tag to be readily purified PRO polypeptide by affinity purification using an another type of affinity matrix that binds to the anti-tag antibody or epitope tag. 種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。 Various tag polypeptides and their respective antibodies are well known in the art. 例としては、ポリ−ヒスチジン(ポリ-his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-his-gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)];c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。 Examples include poly - histidine (poly-his) or poly - histidine - glycine (poly-his-gly) tags; flu HA tag polypeptide and its antibody 12CA5 [Field et al., Mol Cell Biol, 8:... 2159 -2165 (1988)]; c-myc tag and 8F9,3C7,6E10 thereto, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; and the herpes simplex virus sugar protein D (gD) tag and its antibody [Paborsky et al., protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)] containing. 他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)];KT3エピトープペプチド[Martinら, Science, 255:192-194 (1992)];α-チューブリンエピトープペプチド[Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)]を含む。 Other tag polypeptides include the Flag-peptide [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 epitope peptide [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; α- tubulin epitope peptide [Skinner et al., J. Biol Chem, 266:.. 15163-15166 (1991)];.... and the T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87: 6393-6397 ( including the 1990)].

それに換わる実施態様では、キメラ分子はPROの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。 In an alternative embodiment, the chimeric molecule may comprise a fusion of the immunoglobulin or a particular region of an immunoglobulin of PRO. キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はIgG分子のFc領域であり得る。 For a bivalent form of the chimeric molecule (also referred to as an "immunoadhesin"), such a fusion could be to the Fc region of an IgG molecule. Ig融合体は、好ましくはIg分子内の少なくとも1つの可変領域に換えてPROポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。 The Ig fusions preferably include at least one substitution of a soluble (transmembrane domain deleted or inactivated) of a PRO polypeptide in place of the variable region form of the Ig molecule. 特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。 In a particularly preferred embodiment, the immunoglobulin fusion includes IgG1 molecules hinge, CH2 and CH3, or the hinge, CH1, CH2 and CH3 regions. 免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。 For the production of immunoglobulin fusions see also US Patent No. 5,428,130 issued June 27, 1995.
より更なる実施態様では、本発明のPROポリペプチドは、ロイシンジッパーに融合したPROポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法でも修飾してもよい。 In a still further embodiment, the PRO polypeptides of the present invention may also be modified in a way to form a chimeric molecule comprising a PRO polypeptide fused to a leucine zipper. 種々のロイシンジッパーポリペプチドがこの分野で記載されている。 Various leucine zipper polypeptides have been described in the art. 例えば、Landschulz等, Science, 240: 1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe等, FEBS Letters, 344: 1991 (1994); Maniatis等, Nature, 341: 24 (1989)を参照。 For example, Landschulz etc., Science, 240: 1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe, etc., FEBS Letters, 344: 1991 (1994); Maniatis, etc., Nature, 341: see 24 (1989). PRO364ポリペプチドに融合したロイシンジッパーの使用は、溶液中の可溶性PROポリペプチドの二量体化又は三量体化を助けると考えられる。 PRO364 Use of the fused leucine zipper polypeptide is believed to aid in dimerizing or trimerizing soluble PRO polypeptide in solution. 当業者は、ロイシンジッパーがPRO分子のN-又はC-末端のいずれかに融合することを認めるであろう。 Those skilled in the art will recognize that the leucine zipper is fused to either the N- or C- terminus of the PRO molecule.

D. D. PROの調製 以下の説明は、主として、PRO核酸を含むベクターで形質転換又はトランスフェクションされた細胞を培養することによりPROを生産する方法に関する。 The following description preparation of PRO relates primarily to production of PRO by culturing cells transformed or transfected cells with a vector containing PRO nucleic acid. もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROを調製することができると考えられる。 Of course, it is considered possible to prepare the PRO using other methods well known in the art. 例えば、PRO配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照]。 For example, PRO sequence, or portions thereof, may be produced by direct peptide synthesis using solid-phase techniques [see, eg, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco, California (1969) ; Merrifield, J. Am Chem Soc, 85:... 2149-2154 (1963) reference. 手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。 It may be performed using manual techniques or in vitro protein synthesis by automatic. 自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。 Automated synthesis, for example, Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) using may be performed by the manufacturer's instructions. PROの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROを生産してもよい。 Various portions of the PRO may separately be chemically synthesized, may be produced the full-length PRO by combined using chemical or enzymatic methods.

1. 1. PROをコードするDNAの単離 PROをコードするDNAは、PROmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。 DNA encoding the isolated PRO of DNA encoding PRO may be obtained from a cDNA library prepared from tissue believed to express it at a detectable level optionally bear PROmRNA. 従って、ヒトPRODNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。 Accordingly, human PRODNA, as described in the Examples can be conveniently obtained from a cDNA library prepared from human tissue. またPRO-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。 The PRO- encoding gene or known synthetic procedures from a genomic library (e.g., automated nucleic acid synthesis) can also be obtained by.
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PROに対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。 Libraries can be screened with probes (antibody or oligonucleotides of at least about 20-80 bases for PRO) designed to identify the protein encoded by the gene or its gene of interest. 選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。 Screening the cDNA or genomic library with the selected probe may be conducted using, for example Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) carried for using standard procedures described in be able to. 所望のPROポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はPCR法を使用するものである[Sambrookら,上掲;Dieffenbachら, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。 An alternative means to isolate the gene encoding the desired PRO polypeptide is to use PCR methodology [Sambrook et al., Supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ].

下記の実施例には、cDNAライブラリのスクリーニング技術を記載している。 The Examples below describe techniques for screening a cDNA library. プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。 The oligonucleotide sequences selected as probes, at sufficient length must be sufficiently unambiguous that false positives are minimized. オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。 The oligonucleotide is preferably labeled such that it can be detected upon hybridization to DNA in the library being screened. 標識化の方法は当該分野において良く知られており、 32 P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。 Methods of labeling are well known in the art, radiolabels like 32 P-labeled ATP, include the use of biotinylation or enzyme labeling. 中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら,に示されている。 Hybridization conditions, including moderate stringency and high stringency, are provided in Sambrook et al., Supra.
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbankら,の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。 Such library sequences identified in the screening methods can be compared and aligned to the known sequences are available to the public been deposited in Genbank et al, public databases or private sequence databases. 分子の決定された領域内又は全長に渡っての(アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。 Sequence identity (at either the amino acid or nucleotide level) over a determined area or full-length of the molecule, known in the art, and can be determined using the method described herein .
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されていないmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookら,に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。 Nucleic acid having protein coding sequence, using the deduced amino acid sequence disclosed here for the first time and, if necessary, Sambrook et al., Supra, to detect precursors and processing intermediates of mRNA that may not have been reverse-transcribed into cDNA obtained by screening selected cDNA or genomic libraries using conventional primer extension procedures as described in.

2. 2. 宿主細胞の選択及び形質転換 宿主細胞を、ここに記載したPRO生産のための発現又はクローニングベクターでトランスフェクション又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。 Selection and Transformation of Host Cells Host cells, expression or transfection or transformed with the cloning vector for PRO production described herein, as appropriate for inducing promoters, selecting transformants, or encoding the desired sequences suitably cultured in conventional nutrient media modified as to amplify the gene. 培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。 The culture conditions, such as media, temperature, pH, and the like, can be selected by the skilled artisan without undue experimentation. 一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。 In general, principles for maximizing the productivity of cell cultures, protocols, and practical techniques, Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., Be found supra it can.

原核生物細胞トランスフェクション及び真核生物細胞トランスフェクションの方法、例えば、CaCl 、CaPO 、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。 How prokaryotic cell transfection and eukaryotic cell transfection, for example, CaCl 2, CaPO 4, liposome-mediated and electroporation are known to those skilled in the art. 用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。 Depending on the host cell used, transformation is done using standard techniques appropriate to such cells. 前掲のSambrookら,に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。 Of Sambrook et al, supra, calcium treatment or electroporation employing calcium chloride, as described in is generally used for prokaryotes. アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開のWO89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。 Infection with Agrobacterium tumefaciens, Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) and as described in the 1989 of June 29, published WO89 / 05859, transformation of certain plant cells used in the conversion. このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。 For cells without such cell walls mammals, Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 calcium phosphate precipitation method of (1978) is preferred. 哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。 General aspects of mammalian cell host system transfections have been described in U.S. Patent No. 4,399,216. 酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。 Transformations into yeast are typically, Van Solingen et al., J. Bact, 130:. 946 (1977) and Hsiao et al., Proc Natl Acad Sci USA, 76:.... 3829 of (1979) It is carried out according to the process. しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。 However, DNA and other methods of introducing into cells such as by nuclear microinjection, electroporation, intact cells, or polycations, eg, polybrene, polyornithine, may also be used also bacterial protoplast fusion using. 哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。 For various techniques for transforming mammalian cells transformed, see Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988) reference.

ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。 Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors herein include prokaryote, yeast, or higher eukaryote cells. 適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。 Suitable prokaryotes include but are not limited to, eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobacteriaceae such as E. coli. 種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。 Various E. coli strains are publicly available, such as E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli strain W3110 (ATCC 27,325) and K5772 (ATCC53,635). 他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日発行のDD266,710に記載されたバチルス・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。 Other suitable prokaryotic host cells, E. coli, for example, E. Coli, Enterobacter, Erwinia (Erwinia), Klebsiella (Klebsiella), Proteus (Proteus), Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia Marce Sens ( Serratia marcescans), and Shigella, as well as bacilli, for example Bacillus subtilis (B. subtilis) and Bacillus licheniformis (B. licheniformis) (for example, has been described in DD266,710 issued Apr. 12, 1989 Bacillus licheniformis 41P), including Pseudomonas, for example Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae, such as Streptomyces. これらの例は限定ではなく例示である。 These examples are illustrative rather than limiting. 株W3110は、組換えDNA生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。 Strain W3110 is one particularly preferred host or parent host because it is a common host strain for recombinant DNA product fermentations. 好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。 Preferably, the host cell secretes minimal amounts of proteolytic enzymes. 例えば、株W3110は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA prt3 phoA E15 (argF−lac)169 degP ompT kan rを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (algF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan rを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月 For example, strain W3110 may be modified to effect a genetic mutation in the genes encoding proteins endogenous to the cell, with examples of such hosts including E. coli W3110 strain, which has the complete genotype tonA 1A2; complete a genotype tonA W3110 E. coli strain having ptr3 9E4; complete genotype tonA prt3 phoA E15 (argF-lac ) 169 degP ompT kan coli having r W3110 strain 27C7 (ATCC 55,244); complete genotype tonA ptr3 phoA E15 (algF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan E. coli that has a r W3110 strain 37D6; non-kanamycin resistant degP E. coli W3110 strain, which is a 37D6 shares with a deletion mutation 40B4; and August 1990 7日発行 米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。 An E. coli strain having disclosed mutated periplasmic protease 7 days issued U.S. Patent No. 4,946,783. あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。 Alternatively, in vitro methods of cloning, e.g., PCR or other nucleic acid polymerase reactions, are suitable.

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PROポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。 In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for PRO polypeptide-encoding vectors. サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。 Saccharomyces cerevisiae is a eukaryotic host microorganism commonly used lower. 他に、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP139,383);クルベロミセス宿主(Kluveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.154(2): 737-742 [1983])、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、クルベロミセスワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990)) Alternatively, Schizosaccharomyces Puronbu (Schizosaccharomyces prombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP139,383, issued May 2, 1985); Kuruberomisesu host (Kluveromyces hosts) (US 4 , No. 943,529; Fleer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)), for example, kuru Kluyveromyces lactis (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al, J. Bacteriol.154 (2): 737-742 [1983]), Kuruberomisesu fragilis (K. fragilis) (ATCC 12,424), Kuruberomisesu bulgaricus (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), Kuruberomisesu-Wikeramii (K. wickeramii ) (ATCC 24,178), kuru Kluyveromyces Walther position (K. waltii) (ATCC 56,500), Kuruberomisesu drosophilarum (K. drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 (1990)) 、クルベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226);ピチア・パストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]);カンジダ;トリコデル・マレーシア(Trichoderma reesia)(EP 244,234);アカパンカビ(Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]);シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日発行のEP394,538);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日発行のWO91/00357);及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス , Kuruberomisesu-Tim tolerance (K. thermotolerans) and Kuruberomisesu-Marukishianasu (K. marxianus); Yarrowia (yarrowia) (EP 402,226); Pichia pastoris (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al, J. Basic Microbiol, 28:.... 265-278 [1988]); Candida; Torikoderu Malaysia (Trichoderma reesia) (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc Natl Acad Sci USA, 76: 5259-5263 [1979 ]); Schwanniomyces (Schwanniomyces), for example Schwanniomyces occidentalis (Schwanniomyces occidentalis) (EP394,538 of issued Oct. 31, 1990); and filamentous fungi, for example, Neurospora, Penicillium, Toripoku radium (Tolypocladium) (WO91 / 00357 published Jan. 10, 1991); and Aspergillus hosts such as Aspergillus ニダランス(Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルス・ニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。 Nidulans (Ballance et al., Biochem Biophys Res Commun, 112:.... 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:.... 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 1470-1474 [1984]) and Aspergillus niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]) are included. ここで好ましいメチロトロピック(C1化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。 Presently preferred Mechirotoropikku (C1 compound materials resistant, Methylotropic) yeast include, but are not limited to, Hansenula (Hansenula), Candida, Kloeckera (Kloeckera), Pichia (Pichia), Saccharomyces, Torulopsis (Torulopsis), and methanol selected from the genera consisting of Rhodotorula (Rhodotorula) including viable yeast. この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。 A list of specific species that are exemplary of this class of yeast, C. Anthony, are described in The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

グリコシル化PROの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。 Suitable host cells for the expression of glycosylated PRO are derived from multicellular organisms. 無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドスペラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。 Examples of invertebrate cells include insect cells and plant cells, such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9. 有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。 Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) and COS cells. より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7,ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))ヒト肺細胞 (W138,ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2,HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562,ATCC CCL51)を含む。 More specific examples include strain monkey kidney CV1 transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); 293 cells subcloned for growth in human embryonic kidney line (293 or suspension culture, . Graham et al., J. Gen Virol, 36:59 (1977)); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc Natl Acad Sci USA, 77:.... 4216 (1980)); mouse (.. TM4, Mather, Biol Reprod, 23: 243-251 (1980)) of the Sertoli cells human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); and mouse mammary tumor cells ( MMT 060562, including the ATCC CCL51). 適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。 Selection of appropriate host cells is within the common general knowledge in the art.

3. 3. 複製可能なベクターの選択及び使用 PROポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。 Nucleic acid encoding a selectable and use PRO polypeptide replicable vector (e.g., cDNA or genomic DNA), cloned be inserted into a replicable vector for (DNA amplification) or expression. 様々なベクターが公的に入手可能である。 Various vectors are publicly available. ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。 The vector may, for example, can be the form of a plasmid, cosmid, viral particle, or phage. 適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。 The appropriate nucleic acid sequence may be inserted into the vector by a variety of techniques. 一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。 In general, DNA is inserted into an appropriate restriction endonuclease site using techniques well known in the art. ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、一つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。 The vector components generally include but are not limited to, one or more of a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. これらの成分の一つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。 Construction of suitable vectors containing one or more of these components employs standard ligation techniques which are known to the skilled artisan.

PROポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。 PRO polypeptide not only be produced directly by recombinant techniques, fusion with a heterologous polypeptide, which other polypeptide having a specific cleavage site at the N- terminus of the signal sequence or the mature protein or polypeptide but also as a peptide. 一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPRO-コード化DNAの一部である。 In general, the signal sequence may be a component of the vector, which is part of the PRO- encoding DNA that is inserted into the vector. シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。 Signal sequence, such as alkaline phosphatase, penicillinase, may be a prokaryotic signal sequence selected from the group of lpp, or heat-stable enterotoxin II leaders. 酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されているシグナルであり得る。 For yeast secretion the signal sequence may yeast invertase leader, including the alpha factor leader (Saccharomyces (Saccharomyces) and click Rui-be Roma Isis (Kluyveromyces) alpha factor leaders, the latter described in U.S. Patent No. 5,010,182 yl), or acid phosphatase leader, has been described in Candida albicans (C.albicans) glucoamylase leader (EP362179 issued Apr. 4, 1990), or was published on November 15, 1990 WO90 / 13646 It may be a signal. 哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。 In mammalian cell expression, mammalian signal sequences may be used to direct secretion of the protein, such as the same or related species, from secreted polypeptides of signal sequences as well as viral secretory leaders.

発現及びクローニングベクターは、共に一つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。 Expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。 Such sequences are well known for a variety of bacteria, yeast, and viruses. プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。 The origin of replication from the plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, 2.mu. plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are suckling it is useful for cloning vectors in mammalian cells.
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。 Expression and cloning vectors will typically contain a selection gene, also termed a selectable marker. 典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素、例えば桿菌のD-アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子を供給するタンパク質をコードする。 Typical selection genes, obtained from (a) ampicillin, neomycin, giving resistance to antibiotics or other toxins, methotrexate, or tetracycline, (b) auxotrophic deficiencies, or (c) complex media not important nutrient, encoding a protein for supplying a gene encoding, for example, bacilli D- alanine racemase.

哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのようにPRO-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。 Examples of suitable selectable markers for mammalian cells are those capable of identification of cells capable of capturing PRO- encoding nucleic acid, such as DHFR or thymidine kinase. 野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaubらにより Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。 An appropriate host cell when wild-type DHFR is employed, Proc by Urlaub et al. Natl Acad Sci USA, 77:.... Defects are prepared as described proliferated DHFR activity 4216 (1980) a CHO cell line with. 酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcombら, Nature, 282:39(1979);Kingsmanら, Gene, 7:141(1979);Tschemperら, Gene, 10:157(1980)]。 A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7 [Stinchcomb et al, Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al, Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。 The trp1 gene, for example, provides a selection marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, for example, ATCC No. 44076 or PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
発現及びクローニングベクターは、通常、PRO-コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を制御するプロモーターを含む。 Expression and cloning vectors usually operably linked to PRO- encoding nucleic acid sequence, including the promoter controlling mRNA synthesis. 種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。 And suitable promoters are known to be recognized by a variety of potential host cells. 原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Changら, Nature, 275:615 (1978); Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]を含む。 Promoters suitable for use with prokaryotic hosts include the β- lactamase and lactose promoter systems [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, a tryptophan (trp ) promoter system [Goeddel, Nucleic Acids Res, 8:. 4057 (1980); EP 36,776]...., and hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al., Proc Natl Acad Sci USA, 80: 21-25 (1983 )]including. 細菌系で使用するプロモータもまたPROポリペプチドをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(SD)配列を有する。 Promoters for use in bacterial systems also Shine operably linked to the DNA encoding the PRO polypeptide - having Dalgarno (SD) sequence.

酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。 Examples of suitable promoting sequences for use with yeast hosts include the promoters for 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al., J. Biol Chem, 255:.. 2073 (1980)] or other glycolytic enzymes [Hess et al., J. . Adv Enzyme Reg, 7:. 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1987)], such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, the trio serine phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase.
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。 Other yeast promoters, which are inducible promoters having the additional advantage of transcription controlled by growth conditions, are the alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, degradative enzymes associated acid phosphatase, and nitrogen metabolism, metallothionein, glyceryl glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and the promoter region of the enzyme that governs the use of maltose and galactose. 酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。 Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in EP 73,657.

哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのPROポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。 PRO polypeptide transcription from vectors in mammalian host cells is controlled, for example, polyoma virus, fowlpox virus (5 July 1989 published UK2,211,504), adenovirus (such as Adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, a retrovirus, B hepatitis virus and simian virus 40 (SV40) virus promoter derived from the genome, such as, heterologous mammalian promoters, e.g., the actin promoter or an immunoglobulin promoter , and the promoters from heat-shock promoters, provided such promoters are compatible with the host cell systems.
より高等の真核生物による所望のPROポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。 Transcription of a DNA encoding the desired PRO polypeptide by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。 Enhancers are usually about from 10 to 300 bp, cis-acting elements of DNA to increase its transcription act on a promoter. 哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。 Mammalian genes Many enhancer sequences are now known (globin, elastase, albumin, alpha-fetoprotein and insulin). しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。 Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. 例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。 Examples include the SV40 enhancer on the late side of (100-270 bp) of the replication origin, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer and adenovirus enhancer on the late side of the replication origin. エンハンサーは、PROコード化配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。 The enhancer may be spliced ​​into the vector at a position 5 'or 3' of the PRO coding sequence, but is preferably located at a site 5 'from the promoter.

また、真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。 Expression vectors used in eukaryotic host cells (yeast, fungi, insect, plant, animal, human or other multicellular organism-derived nucleated cells) is required to termination of transcription and for stabilizing the mRNA array also be included. このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5'、時には3'の非翻訳領域から取得できる。 Such sequences are commonly DNA or cDNA of eukaryotic or viral available from the 5 untranslated region of 'and, occasionally 3'. これらの領域は、PROポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the PRO polypeptide.
組換え脊椎動物細胞培養でのPROポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979);EP117,060;及びEP117,058に記載されている。 Other methods suitable for adaptation to the synthesis of PRO polypeptides in recombinant vertebrate cell culture, vectors, and host cells, described in Gething et al, Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); described and EP117,058; EP117,060.

4. 4. 遺伝子増幅/発現の検出 遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。 Amplification and / or expression of the detectable gene gene amplification / expression may be measured in a sample directly, using appropriately labeled probe, for example, by conventional Southern blotting, to quantitate the transcription of mRNA Northern blotting [Thomas, Proc Natl Acad Sci USA, 77:.... 5201-5205 (1980)], dot blotting (DNA analysis), or by in situ hybridization method, it is measured directly in the sample it can. あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。 Alternatively, DNA duplexes, including RNA duplexes, and DNA-RNA hybrid duplexes or DNA- protein duplexes, antibodies may be employed that can recognize specific duplexes. 次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。 The antibodies in turn may be labeled and the assay may be carried out where the duplex is bound to a surface, of the antibody bound to the duplex at the resulting formation on the surface of the double-stranded it is possible to detect the presence.
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。 Gene expression, alternatively, immunological methods to quantitate directly the expression of gene product, for example by the cells or assay of immunohistochemical staining and cell culture or body fluids, tissue sections, it can also be measured. 試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。 Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of sample fluids may be either monoclonal or polyclonal, and may be prepared in any mammal. 簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRO DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。 Conveniently, the antibodies may be prepared against a native sequence PRO polypeptide or against a synthetic peptide based on the DNA sequences provided herein, or PRO DNA fused to exogenous sequence encoding a specific antibody epitope It may be prepared against.

5. 5. ポリペプチドの精製 PROポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。 Form of the purified PRO polypeptide polypeptide may be recovered from culture medium or from host cell lysates. 膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。 If membrane-bound, it can be released from the membrane using a suitable detergent solution (e.g. Triton-X100) or enzymatic cleavage. PROポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。 Cells employed in expression of PRO polypeptides, freeze-thaw cycles, can be disrupted by various physical or chemical means, such as sonication, mechanical disruption, or cell lysing agents.
PROポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。 The PRO polypeptide may be desired to purify the recombinant cell proteins or polypeptides. 適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。 Is purified by the following examples of suitable purification procedures Procedure: i.e., fractionation on an ion-exchange column; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; silica or cation-exchange resins, for example, chromatography on DEAE; chromatofocusing; SDS- PAGE; ammonium sulfate precipitation; such as gel filtration using Sephadex G-75; a and metal chelating columns to bind epitope-tagged forms of the PRO polypeptide; protein a Sepharose columns to remove contaminants such as IgG. この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methodes in Enzymology, 182(1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。 This is known in the art, for example, Deutscher, Methodes in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, be used have been a number of protein purification methods described in New York (1982) it can. 選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROの性質に依存する。 The purification step (s) selected will depend, for example, on the nature of the particular PRO production methods and in particular is produced is used.

E. E. PROの用途 PROをコードする核酸配列(又はそれらの相補鎖)は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAの生成において種々の用途を有している。 Nucleic acid sequences encoding the application PRO of PRO (or their complement) in the art of molecular biology, including uses as hybridization probes, in chromosome and gene mapping, and various in the generation of anti-sense RNA and DNA It has a use. また、PRO核酸も、ここに記載される組換え技術によるPROポリペプチドの調製に有用である。 Further, PRO nucleic acid is also useful for the preparation of PRO polypeptides by the recombinant techniques described herein.
全長天然配列PRO遺伝子又はその一部は、全長PROcDNAの単離又はここに開示したPRO配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子(例えば、PROの天然発生変異体又は他の種からのPROをコードするもの)の単離のためのcDNAライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。 Full-length native sequence PRO gene, or portions thereof, still other genes (for example, naturally occurring variants, or other species of PRO having a desired sequence identity to isolated or PRO sequence disclosed herein for the entire length PROcDNA It can be used as hybridization probes for a cDNA library for the isolation of PRO those encoding) from. 場合によっては、プローブの長さは約20〜約50塩基である。 Optionally, the length of the probes will be about 20 to about 50 bases. ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列PROのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。 Hybridization probes may be derived from at least partially novel regions of the full length native nucleotide sequence wherein those regions may be determined without undue experimentation, genome comprising a promoter of the native sequence PRO, enhancer elements and introns It may be derived from the sequence. 例えば、スクリーニング法は、PROポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のDNA配列を用いて単離して約40塩基の選択されたプローブを合成することを含む。 For example, a screening method will comprise the synthesis of isolated selected probe of about 40 bases with a coding region of known DNA sequence of the PRO polypeptide gene. ハイブリダイゼーションプローブは、 32 P又は35 S等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン/ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。 Hybridization probes may be labeled by a variety of labels, including enzymatic labels such as alkaline phosphatase coupled to the probe via 32 P or 35 S radionucleotides such, or avidin / biotin coupling systems. 本発明のPROポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。 Labeled probes having a sequence complementary to PRO polypeptide gene of the present invention, determines to screen libraries of human cDNA, genomic DNA or mRNA, any members of the library to HYBRID formed probe It can be used to. ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。 Hybridization techniques are described in further detail in the following Examples.

本出願で開示する任意のESTはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。 Any EST sequences disclosed in the present application may similarly be employed as probes, using the methods disclosed herein.
PRO核酸の他の有用な断片は、標的PRO mRNA(センス)又はPRO DNA(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、PRO DNAのコード化領域の断片を含む。 Other useful fragments of the PRO nucleic acids include antisense or sense oligonucleotides comprising a target PRO mRNA (sense) or PRO DNA (antisense) single-stranded nucleic acid sequence capable of binding to sequence (either RNA or DNA) , antisense or sense oligonucleotides, according to the present invention, comprise a fragment of the coding region of PRO DNA. このような断片は、一般的には少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14から30ヌクレオチドを含む。 Such a fragment generally comprises at least about 14 nucleotides, preferably about 14 to 30 nucleotides. 与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krolら,(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。 The possibility of controlling the given protein based upon a cDNA sequence encoding the antisense or sense oligonucleotide, for example, Stein and Cohen (Cancer Res 48:. 2659: 1988) and van der Krol et al., (BioTechniques 6: described in 958, 1988).

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。 Binding of antisense or sense oligonucleotides to target nucleic acid sequences results in the formation of a duplex, it promotes the degradation of double-stranded, one of several ways, including degradation of the duplexes, or by other methods, to block transcription or translation of the target sequence. よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PROタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。 The antisense oligonucleotides thus may be used to block expression of PRO proteins. アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、WO91/06629に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。 Antisense or sense oligonucleotides, modified sugar - phosphodiester backbone (or other sugar linkages, such as those described in WO91 / 06629) further comprises an oligonucleotide having such sugar linkages are resistant to endogenous nucleases . そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。 Such oligonucleotides with resistant sugar linkages are stable in vivo (i.e., capable of resisting enzymatic degradation), sequence specificity to be able to bind to target nucleotide sequences are retained.
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(L-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。 Other examples of sense or antisense oligonucleotides, such as those described in WO90 / 10048, an organic moiety, and other moieties that increases affinity of the oligonucleotide for a target nucleic acid sequence, such as poly - (L - such as poly- lysine). さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。 Further still, intercalating agents, such as ellipticine, and alkylating agents or metal complexes is attached to sense or antisense oligonucleotides may modify binding specificities of the antisense or sense oligonucleotide for the target nucleotide sequence.

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、CaPO -媒介DNAトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。 Antisense or sense oligonucleotides, for example, CaPO 4 - mediated DNA transfection, by any gene conversion methods including electroporation, or Epstein - by using gene transformation vectors such as Barr virus, comprising a target nucleic acid sequence It is introduced into a cell. 好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。 In a preferred procedure, an antisense or sense oligonucleotide is inserted into a suitable retroviral vector. 標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。 Cell containing the target nucleic acid sequence is contacted with the recombinant retroviral vector, either in vivo or ex vivo. 好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスM-MuLVから誘導されるもの、N2(M-MuLVから誘導されたレトロウイルス)、又はDCT5A、DCT5B及びDCT5Cと命名されたダブルコピーベクター(WO90/13641参照)を含む。 Suitable retroviral vectors include, but are not limited to, those derived from the murine retrovirus M-MuLV, N2 (a retrovirus derived from M-MuLV), or DCT5A, was DCT5B and DCT5C double including a copy of vector (see WO90 / 13641).
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。 The sense or antisense oligonucleotide, as described in WO91 / 91/04753, may be introduced into a cell containing the target nucleotide sequence by formation of a conjugate with a ligand binding molecule. 適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。 Suitable ligand binding molecules include, but are not limited to, cell surface receptors, growth factors, other ligands that bind to other cytokines, or cell surface receptors. 好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。 Preferably, the complex formation of ligand binding molecule, ligand binding molecule to bind to its corresponding molecule or receptor, or the ability to block the entry of the sense or antisense oligonucleotide or its complex cellular substantially It does not inhibit.

あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。 Alternatively, a sense or an antisense oligonucleotide, as described in WO90 / 10448, oligonucleotide - may be introduced into a cell containing the target nucleic acid sequence by formation of a lipid complex. センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。 Sense or antisense oligonucleotides - lipid complex is preferably dissociated within the cell by an endogenous lipase.
アンチセンスRNA又はDNA分子は一般に少なくとも約5塩基長、約10塩基長、約15塩基長、約20塩基長、約25塩基長、約30塩基長、約35塩基長、約40塩基長、約45塩基長、約50塩基長、約55塩基長、約60塩基長、約65塩基長、約70塩基長、約75塩基長、約80塩基長、約85塩基長、約90塩基長、約95塩基長、約100塩基長、あるいはそれ以上である。 Antisense RNA or DNA molecules are generally at least about 5 bases in length, about 10 bases in length, about 15 bases in length, about 20 bases in length, about 25 bases in length, about 30 bases in length, about 35 bases in length, about 40 bases in length, about 45 bases in length, about 50 bases in length, about 55 bases in length, about 60 bases in length, about 65 bases in length, about 70 bases in length, about 75 bases in length, about 80 bases in length, about 85 bases in length, about 90 bases in length, about 95 bases in length, about 100 bases in length, or more.
また、プローブは、PCR技術に用いて、密接に関連したPROコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。 The probes may also be employed in PCR techniques to generate a pool of sequences for identification of closely related PRO coding sequences.
また、PROをコードするヌクレオチド配列は、そのPROをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。 Nucleotide sequences encoding a PRO can also be used to construct hybridization probes for that PRO for mapping the gene which encodes and for the genetic analysis of individuals with genetic disorders. ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。 The nucleotide sequences provided herein may be in situ hybridization, binding analysis against known chromosomal markers, and using well known techniques of hybridization screening or the like in the library is mapped to a specific region of the chromosome and chromosome .

PROのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合(例えば、PROがレセプターである場合)、PROは、そのリガンドを同定するアッセイに用いることができる。 If PRO coding sequence encodes a protein which binds to another protein (e.g., if the PRO is a receptor), PRO can be used in assays to identify its ligands. このような方法により、レセプター/リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。 By this method, it is possible to identify inhibitors of the receptor / ligand binding interaction. このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。 Proteins involved in such binding interactions can also be used to screen for peptide or small molecule inhibitors or agonists of the binding interaction. また、レセプターPROは関連するリガンドの単離にも使用できる。 Also, the receptor PRO can be used to isolate correlative ligand (s). スクリーニングアッセイは、天然PRO又はPROのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。 Screening assays can be designed to find lead compounds that mimic the biological activity of the receptor of the native PRO or PRO discovery. このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。 Such screening assays will include assays amenable to high-throughput screening of chemical libraries, making them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates. 考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。 Small molecules contemplated include synthetic organic or inorganic compounds. アッセイは、この分野で良く特徴付けられているされているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。 Assays, protein is which are well characterized in the art - protein binding assays, biochemical screening assays, are performed in a variety of formats, including immunoassays and cell based assays.

また、PRO又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。 Nucleic acids which encode PRO or its modified forms can also be used to generate either transgenic animals or "knock out" animals which, in turn, are useful in the development and screening of therapeutically useful reagents . トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。 The transgenic animal (e.g., a mouse or rat), prenatal, e.g., an embryonic stage is an animal having cells that contain a transgene, which transgene was introduced into the animal or an ancestor of the animal. 導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。 A transgene is a DNA which is integrated into the genome of a cell from which a transgenic animal develops. 一実施形態では、PROをコードするcDNAは、PROをコードするDNAを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、PROをコードするゲノムDNAをクローン化するために使用することができる。 In one embodiments, cDNA encoding a PRO on the basis of the genomic sequences and established techniques used to generate transgenic animals containing cells that express DNA encoding the PRO, genomic DNA encoding the PRO the can be used to clone. トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。 Transgenic animals, particularly methods of producing certain animals such as mice or rats, have become conventional in the art, it is described, for example, in U.S. Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009 ing. 典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのPRO導入遺伝子の導入の標的にする。 Typically, the targeted introduction of PRO transgene to particular cells in a tissue-specific enhancers. 胚段階で動物の生殖系列に導入されたPROコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はPROをコードするDNAの増大した発現の影響を調べるために使用できる。 Transgenic animals that include a copy of the PRO coding transgene introduced into the germ line of the animal at an embryonic stage can be used to examine the effect of increased expression of DNA encoding PRO. このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。 Such animals can be used as tester animals for reagents thought to confer protection from, for example, pathological conditions associated with its overexpression. 本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。 In this aspect of the present invention, an animal is treated with the reagent and the lower the incidence of the pathological condition, compared to untreated animals, the potential for a therapeutic treatment for the pathological condition shown with a transgene It is.

あるいは、PROの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたPROをコードする変更ゲノムDNAと、PROをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、PROをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するPRO「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。 Alternatively, the defect nonhuman homologue of PRO is encoding the modified genomic DNA encoding PRO introduced into an embryo of an animal cell by homologous recombination between the endogenous gene encoding the PRO, the PRO or it can be used to create a PRO "knock out" animals with altered gene. 例えば、PROをコードするcDNAは、確立された技術に従い、PROをコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。 For example, cDNA encoding PRO in accordance with established techniques can be used to clone genomic DNA encoding PRO. PROをコードするゲノムDNAの一部を欠失したり、組み込みをモニターするために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。 Or deletion of a portion of the genomic DNA encoding PRO, can be replaced with another gene, such as a gene encoding a selectable marker which can be used to monitor integration. 典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(5'と3'末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと]。 Typically, the vector comprises several kilobases of unaltered flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) [For example, for homologous recombination vectors Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) checking]. ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞が選択された[例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照]。 The vector into an embryonic stem cell (eg, by electroporation) and introduced, the introduced DNA is endogenous DNA and homologously recombined with cells are selected [see eg, Li et al., Cell, 69: 915 (1992 )reference]. 選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, EJ Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと]。 The selected cells are then animals are injected into a blastocyst of (e.g., a mouse or rat) to form aggregation chimeras [see eg, Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:. A Practical Approach, EJ Robertson, ed (IRL , Oxford, 1987), pp. 113-152 see]. その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。 Then, a chimeric embryos were implanted into a female nanny of appropriate false pregnancy, brought to term to create a "knock out" animal. 胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。 Progeny that have the germ cells homologously recombined DNA is identified by standard techniques, it is possible to them by using animal whole cells to breed animals containing the homologously recombined DNA . ノックアウト動物は、PROポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。 Knockout animals can be characterized for their ability to defend against the progression of certain pathological conditions and for their pathological conditions due to absence of the PRO polypeptide.

また、PROポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。 Nucleic acid encoding the PRO polypeptides may also be used in gene therapy. 遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。 In gene therapy applications, for example for replacement of a defective gene, genes are introduced in order to achieve in vivo synthesis of a therapeutically effective amount of the gene product. 「遺伝子治療」とは、1回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNA又はmRNAの1回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。 "Gene therapy" includes both conventional gene therapy where a lasting effect by a single treatment is achieved, and the administration of gene therapeutic agents, including one time or repeated administration of a therapeutically effective DNA or mRNA . アンチセンスRNA及びDNAは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。 Antisense RNA and DNA can be used as therapeutic agents for blocking the expression of certain genes in vivo. 短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。 Short antisense oligonucleotides, despite the low intracellular concentrations caused by restricted uptake by the cell membrane, it can be transferred into cells which act as inhibitors have already been shown (Zamecnik et al, Proc. Natl ... Acad Sci USA 83: 4143-4146 [1986]). オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。 Oligonucleotides may be modified to enhance their uptake by replacing the phosphodiester groups charged their negatively uncharged groups.

生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。 Various techniques for introducing nucleic acids into viable cells. これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。 The techniques vary depending upon whether the nucleic acid is transferred in vivo in the host cells in vitro, or intended to cultured cells. 核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。 Suitable methods for nucleic acid transferring in vitro into mammalian cells, liposomes, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE-dextran, the calcium phosphate precipitation method, etc.. 現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでのトランスフェクション及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介トランスフェクションである(Dzauら, Trends in Biotechnology 11, 205-210(1993))。 The currently preferred in vivo gene transfer techniques include transfection with viral (typically retroviral) transfection vectors and viral coat protein - a liposome mediated transfection (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). 幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。 In some situations, the nucleic acid source, antibody specific for a cell surface membrane protein or the target cell, is to provide with an agent that targets the target cells, such as a ligand for a receptor on the target cell desired. リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び/又は取り込みの促進のために用いられる。 When using liposomes, proteins which bind to a cell surface membrane protein associated with endocytosis, e.g., capsid proteins or fragments thereof tropic for a particular cell type, antibodies for proteins which undergo internalization in cycling, subcellular localization proteins to the enhance intracellular half-life and targeting is used to promote the targeting and / or uptake. レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。 Receptor-mediated endocytosis is described, see, eg, Wu et al., J. Biol Chem 262, 4429-4432 (1987); description and Wagner et al., Proc Natl Acad Sci USA 87, by 3410-3414 (1990)...... It is. 遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。 For review of gene marking and gene therapy protocols, Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).

ここに記載したPROポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよく、単離された核酸配列を、これらのマーカーを組み換え発現に用いてもよい。 May be used PRO polypeptides described herein as molecular weight markers for protein electrophoresis purposes and the isolated nucleic acid sequences may be used for recombinantly expressing those markers.
ここに記載したPROポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。 Nucleic acid molecules encoding the PRO polypeptides or fragments thereof described herein are useful for chromosome identification. この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要である。 In this regard, chromosome marking reagents based on actual sequence since relatively few available, it is necessary to identify new chromosome markers. 本発明の各PRO核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。 Each PRO nucleic acid molecule of the present invention can be used as a chromosome marker.
また、本発明のPROポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のPROポリペプチドは、好ましくは同じ型の正常組織に比較して疾患性組織において、一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。 Further, PRO polypeptides and nucleic acid molecules of the present invention may also be used diagnostically for tissue typing, PRO polypeptides of the present invention is preferably in the diseased tissue compared to a normal tissue of the same type, in one tissue as compared to another the Te different expression. PRO核酸分子には、PCR、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。 The PRO nucleic acid molecules, PCR, Northern analysis, will find use for Southern analysis and Western analysis probe generation.

ここに記載したPROポリペプチドは治療薬として用いてもよい。 PRO polypeptides described herein may also be employed as therapeutic agents. 本発明のPROポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、このPRO生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。 PRO polypeptides of the present invention can be formulated according to known methods to prepare pharmaceutically useful compositions, whereby the PRO product hereof is combined in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier vehicle. 治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980])、調製され保管される。 Therapeutic formulations in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions, optional pharmaceutically acceptable carriers, excipient or stabilizer, by mixing the active ingredient having the desired degree of purity ( Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980]), is prepared and stored. 許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(残基数10個未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。 Acceptable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, phosphoric acid, buffers such as citric acid and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid agents; low molecular weight (residues less than 10) polypeptide; hydrophilic polymers polyvinyl pyrrolidone; serum albumin, gelatin or proteins of immunoglobulins such as glycine, glutamine, asparagine, amino acids such as arginine or lysine; glucose, mannose or monosaccharides such as dextrin, disaccharides or other carbohydrates, chelating agents such as EDTA, mannitol or sorbitol sugars, salt formation pair such as sodium ion; and / or TWEEN (trade name), PLURONICS (trade name) or a nonionic surfactant such as polyethylene glycol (PEG).

インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。 The formulations to be used for in vivo administration must be sterile. これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。 This is prior to or following lyophilization and reconstitution, it is readily accomplished by filtration through sterile filtration membranes.
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。 Here, the pharmaceutical compositions of the present invention generally are placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。 Route of administration known methods, for example, intravenously, intraperitoneally, intracerebral, intramuscular, intraocular injection or infusion in intraarterial, or intralesional routes, topical administration, or by sustained release systems.
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。 Dosages and desired drug concentrations of pharmaceutical compositions of the present invention will vary depending on the particular use envisioned. 適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。 The determination of the appropriate dosage or route of administration is well within the skill of an ordinary physician. 動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。 Animal experiments provide reliable guidance for the determination of effective doses for human therapy. 有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。 Effective amount of interspecies scaling, Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96 of Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" It can be carried out in accordance with the principles described.

PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり1日に約10ng/kgから100mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10mg/kg/日である。 If the PRO polypeptide or in vivo administration of agonist or antagonist thereof is employed, the amount of normal dosage, depending on the route of administration, between about 10 ng / kg to 100 mg / kg of mammal body weight or more per day, preferably about 1μg / from kg / day is 10mg / kg / day. 特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている;例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。 Guidance as to particular dosages and methods of delivery is provided in the literature; for example, U.S. Patent No. 4,657,760, No. 5,206,344, or reference No. 5,225,212. 異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。 It is anticipated that different formulations will be effective for different treatment compounds and different disorders, that administration targeting one organ or tissue, expected to be required to be transported in a manner different from that to another organ or tissue It is.

PROポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でPROポリペプチドの持続放出が望まれる場合、PROポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。 If sustained release of the PRO polypeptide in a formulation with release characteristics suitable for the treatment of any disease or disorder requiring administration of the PRO polypeptide is desired, microencapsulation of the PRO polypeptide is contemplated. 持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(rhGH)、インターフェロン-(rhIFN-)、インターロイキン-2、及びMN rgp120で成功裏に実施されている。 Microencapsulation of recombinant proteins for sustained release, human growth hormone (rhGH), interferon- - (rhIFN-), has been implemented successfully in interleukin-2, and MN rgp120. Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p.439-462; WO97/03692,WO96/40072,WO96/07399;及び米国特許第5,564,010号。 Johnson et al., Nat Med, 2:.. 795-799 (1996); Yasuda, Biomed Ther, 27:.. 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio / Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland , "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems" Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), p.439-462; WO97 / 03692, WO96 / 40072, WO96 / 07399; and U.S. Pat. No. 5,564,010.
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸(PLGA)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。 Sustained-release formulations of these proteins, poly - acid - with co-glycolic acid (PLGA) polymer, was developed based on its biocompatibility and wide range of biodegradable properties. PLGAの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。 Lactic acid and glycolic acid degradation products of PLGA, can be cleared quickly within the human body. さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。 Moreover, the degradability of this polymer can be adjusted from months depending on the molecular weight and composition to several years. Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。 Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide / glycolide polymer": M. Chasin and R. Langer (eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems. (Marcel Dekker: New York, 1990), pp 1-41.

本発明は、PROポリペプチドに類似する(アゴニスト)又はPROポリペプチドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。 The present invention encompasses methods of screening PRO polypeptides analogous to (agonists) or prevent the effect of the PRO polypeptide (antagonists) compounds to identify those. アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるPROポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。 Screening assays for antagonist drug candidates, here identified by the PRO polypeptide with a binding or complex formation gene encoded compounds, or other compounds that inhibit the interaction of other cellular proteins encoded polypeptide It is designed to identify. このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。 Such screening assays, making them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates, include assays amenable to high-throughput screening of chemical libraries.
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。 The assay protein - protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays, and cell-based assays, are carried out in a variety of ways, including those known in the art.
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPROポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。 All assays for antagonists are required they and PRO polypeptide encoded by the nucleic acid drug candidate with, that these two components are contacted under conditions and for a time sufficient to interact common to the be.

結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。 In binding assays, the interaction is binding and the complex formed can be isolated or detected in the reaction mixture. 特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるPROポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。 In a particular embodiment, PRO polypeptide or the drug candidate is encoded by the gene identified herein is immobilized on a solid phase, eg, on a microtiter plate, by covalent or non-covalent bonds. 非共有結合は、一般的に固体表面をPROポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。 Non-covalent attachment generally solid surface is achieved by drying were coated with a solution of the PRO polypeptide. あるいは、固定化されるPROポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。 Alternatively, an immobilized antibody specific for the PRO polypeptide to be immobilized, eg, a monoclonal antibody, it can be used to anchor it to a solid surface. アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。 Assay, the immobilized component, e.g., the coated surface containing the anchored component, is carried out by adding a detectable label in labeled or may be non-immobilized component. 反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄によって除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。 When the reaction is complete, to remove the unreacted components such as washing, to detect complexes anchored on the solid surface. 最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。 When the originally non-immobilized component carries a detectable label, the detection of label immobilized on the surface indicates that complexing occurred. 最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。 Where the originally non-immobilized component does not carry a label, complexing can be detected, for example, by immobilized labeled antibody that specifically binds to the complex.

候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のPROポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られている方法によってアッセイすることができる。 If the candidate compound does not bind to a particular PRO polypeptide encoded by a gene interacts identified herein, its interaction with that polypeptide, protein - methods well known for detecting protein interactions it can be assayed by. そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。 Such assays include crosslinking, co-immunoprecipitation, and traditional approaches, such as co-purification through gradients or chromatographic columns. さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans[Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)]に開示されているように、Fields及び共同研究者ら[Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)]に記載された酵母ベースの遺伝子系を用いることによってモニターすることができる。 In addition, protein - protein interactions, Chevray and Nathans [... Proc.Natl Acad Sci USA 89, 5789-5793 (1991)] as disclosed in, NFL Fields and coworkers [Fiels and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989);... Chien et al, Proc.Natl Acad Sci USA 88, 9578-9582 (1991)] be monitored by using a yeast-based genetic system described in can. 酵母GAL4などの多くの転写活性化剤は、2つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。 Many transcriptional activators, such as yeast GAL4, consist of two physically discrete modular domains, one acting as the DNA-binding domain, the other one functioning as the transcription activation domain. 前出の文献に記載された酵母発現系(一般に「2-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用し、並びに2つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。 Supra yeast expression system described in the literature (generally referred to as the "two-hybrid system") takes advantage of this property, and employs two hybrid proteins, one DNA-binding domain of the target protein is GAL4 in fused to, on the other hand in which candidate activating proteins are fused to the activation domain. GAL1-lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。 Expression under the control of a GAL4-activated promoter GAL1-lacZ reporter gene, a protein - depends on reconstitution of GAL4 activity via protein-protein interaction. 相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。 Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substrate for β- galactosidase. 2-ハイブリッド技術を用いた2つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから商業的に入手可能である。 Protein between two specific proteins using the two-hybrid technique - complete kit for identifying protein-protein interactions (MATCHMAKER (trade name)) is commercially available from Clontech. また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定へ拡大適用することができる。 Also, this system can be extended to map protein domains involved in specific protein interactions as well as to pinpoint amino acid residues that are crucial for these interactions.

ここで同定されたPROポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる:通常、反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、これら2つの生成物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時間に渡って含むように調製される。 Here inhibiting the interaction of identified PRO gene encoding the polypeptide and the intra- or extracellular component compounds can be tested as follows: usually a reaction mixture is the gene product with an extracellular or intracellular the components are prepared to include over under conditions and for a time capable of interaction and binding of the two products. 候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。 Candidate compound to be tested for their ability to inhibit binding, the reaction is carried out in the absence and presence of the test compound. さらに、プラシーボを第3の反応混合物に添加してポジティブコトロールを提供してもよい。 It may also provide a positive thing roll by adding placebo to a third reaction mixture. 混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のようにモニターされる。 Binding of the test compound and the intra- or extracellular component present in the mixture (complex formation) is monitored as described above. 試験化合物を含有する反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。 But not in the reaction mixture containing the test compound, formation of a complex in the control reaction indicates that the test compound interferes with the interaction of the test compound and its reaction partner.

アンタゴニストをアッセイするためには、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともにPROポリペプチドを細胞へ添加してもよく、PROポリペプチド存在下における対象活性を阻害する化合物の能力は、化合物がPROポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。 To assay for antagonists, may be added PRO polypeptide to a cell along with the compound to be screened for a particular activity, the ability of compounds to inhibit the target activity in PRO polypeptide presence is compound PRO polypeptide indicating that it is an antagonist of. あるいは、PROポリペプチドと膜結合PROポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを有する潜在的アンタゴニストを競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることによって、アンタゴニストを検出してもよい。 Or by bonding under conditions suitable potential antagonist with PRO polypeptide and membrane-bound PRO polypeptide receptors or recombinant receptors a competitive inhibition assay, it may detect the antagonist. 放射活性などでPROポリペプチドを標識することが可能であり、潜在的アンタゴニストの有効性を判断するためにレセプターに結合したPROポリペプチドの数を利用することができる。 It is possible to label the PRO polypeptide such as radioactive, it can be used the number of PRO polypeptide molecules bound to the receptor in order to determine the effectiveness of the potential antagonist. レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びFACSソートによって同定できる。 The gene encoding the receptor, a number of methods known to those skilled in the art, for example, can be identified by ligand panning and FACS sorting. Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): 第5章(1991)。 Coligan et al., Current Protocols in Immun, 1 (2):. Chapter 5 (1991). 好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化RNAがPROポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このRNAから生成されたcDNAライブラリがプールに分配され、COS細胞又はPROポリペプチド反応性でない他の細胞のトランスフェクションに使用される。 Preferably, expression cloning is employed wherein polyadenylated RNA is prepared from a cell responsive to the PRO polypeptide, cDNA library created from this RNA is divided into pools, other non COS cells or PRO polypeptide reactive It is used for transfection of cells. スライドガラスで成長させたトランスフェクション細胞を、標識したPROポリペプチドで暴露する。 Transfected cells that are grown on glass slides are exposed to labeled PRO polypeptide. このPROポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手段で標識できる。 The PRO polypeptide can be labeled by a variety of means including iodination or inclusion of a recognition site for a site-specific protein kinase. 固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。 Following fixation and incubation, the slides are subjected to autoradiographic analysis. ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再トランスフェクションし、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。 Positive pools are identified and then re-transfected pools are prepared and using an interactive sub-pooling and re-screening process, yielding a single clone that encodes the final putative receptor.

レセプター同定の代替的方法として、標識化PROポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。 As an alternative approach for receptor identification, labeled PRO polypeptide can be photoaffinity-linked with cell membrane or extract preparations that express the receptor molecule. 架橋材料をPAGEで溶解させ、X線フィルムへ暴露する。 Cross-linked material is resolved by PAGE, exposed to X-ray film. レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片へ分解し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。 The labeled complex containing the receptor can decompose into peptide fragments, it can be subjected to protein micro-sequencing. マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するcDNAライブラリをスクリーニングする縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組の設計に用いられる。 The amino acid sequence obtained from micro-sequencing would be used a cDNA library to identify the gene encoding the putative receptor design a set of screening degenerate oligonucleotide probes.
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識PROポリペプチドとともにインキュベートする。 In another assay for antagonists, mammalian cells or a membrane preparation expressing the receptor would be incubated with labeled PRO polypeptide in the presence of the candidate compound. 次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。 Then, to measure the ability of the compound to enhance or block this interaction.
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとPROポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。 More specific examples of potential antagonists include an oligonucleotide that binds to the fusions of immunoglobulin with PRO polypeptide, and, in particular, but not limited, polypeptide - and monoclonal antibodies and antibody fragments, single-chain antibodies, anti - it contains idiotypic antibodies, and chimeric or humanized versions of such antibodies or fragments, as well as human antibodies and antibody fragments. あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってPROポリペプチドの作用を競合的に阻害するPROポリペプチドの変異形態であってもよい。 Alternatively, a potential antagonist may be a closely related protein, for example, without providing recognizes the receptor effects, thus may be a mutated form of the PRO polypeptide that competitively inhibits the action of the PRO polypeptide.

他の潜在的なPROポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスRNA又はDNA作成物であり、例えば、アンチセンスRNA又はDNAは、標的mRNAにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。 Another potential PRO polypeptide antagonist is an antisense RNA or DNA construct prepared using antisense technology, where, eg, an antisense RNA or DNA may interfere with hybridization and protein translation in the target mRNA act so as to prevent translation of mRNA directly by. アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスDNA又はRNAを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのDNA又はRNAへの結合に基づく。 Antisense technology can be used to control gene expression through helix formation or antisense DNA or RNA to triple, both of which methods are based on binding of a polynucleotide to DNA or RNA. 例えば、ここでの成熟PROポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の5'コード化部分は、約10から40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドの設計に使用される。 For example, where the mature PRO 5 'coding portion of the polypeptide nucleotide sequence encoding the polypeptide herein, is used to design from about 10 to 40 base pairs in length antisense RNA oligonucleotide. DNAオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりPROポリペプチドの転写及び生成を防止する。 A DNA oligonucleotide is designed to be complementary to a region of the gene involved in transcription (helix -Lee et triple-, Nucl, Acid Res, 6:. 3073 (1979); Cooney et al, Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), thereby preventing transcription and the production of the PRO polypeptide. アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイゼーションしてmRNA分子のPROポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (SRS Press: Boca Raton, FL, 1988))。 The antisense RNA oligonucleotide to prevent translation of the hybridization to the mRNA in vivo to the PRO polypeptide of mRNA molecules (antisense -Okano, Neurochem, 56:. 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression ( SRS Press: Boca Raton, FL, 1988)). 上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスRNA又はDNAをインビボで発現させて、PROポリペプチドの生産を阻害することもできる。 The oligonucleotides described above are delivered to cells such that the antisense RNA or DNA may be expressed in vivo, it is also possible to inhibit production of the PRO polypeptide. アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10から+10位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。 When antisense DNA is used, the translation initiation site, e.g., oligodeoxyribonucleotides derived from between -10 and +10 positions of the target gene nucleotide sequence, are preferred.

潜在的アンタゴニストは、PROポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりPROポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。 Potential antagonists include the active site of the PRO polypeptide, the receptor binding site, or binds to a growth factor or other relevant binding site, small molecules that thereby blocking the normal biological activity of the PRO polypeptide. 小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。 Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules, preferably soluble peptides, and synthetic non-peptidyl organic or inorganic compounds.
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。 Ribozymes are enzymatic RNA molecules capable of catalyzing the specific cleavage of RNA. リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。 Ribozymes sequence-specific hybridization to the complementary target RNA, followed act by endonucleolytic cleavage. 潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。 Specific ribozyme cleavage sites within a potential RNA target can be identified by known techniques. 更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びPCT公報、番号WO97/33551(1997年9月18日公開)を参照。 For further details see, for example, Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994) and PCT publication, referring to the number WO97 / 33551 (published on September 18, 1997).

転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。 Nucleic acid molecules in triple-helix formation used to inhibit transcription should be single-stranded and composed of deoxynucleotides. これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。 The base composition of these oligonucleotides is designed such that it promotes triple-helix formation via Hoogsteen base-pairing rules, which generally require sizeable stretches of purines or pyrimidines on one strand of a duplex . さらなる詳細は、例えば、PCT公報、番号WO97/33551、上掲を参照。 For further details see, eg, PCT publication No. WO97 / 97/33551, supra.
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの一つ又は複数の任意のものにより及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。 These small molecules can be identified by well known any other screening techniques and / or those skilled in the art that one or more of any of the screening assays discussed above.
また、ここで開示されている分子の診断的及び治療的利用は、下記に開示及び記載のポジティブ機能アッセイヒットに基づいている。 Also, diagnostic and therapeutic use of molecules disclosed herein are based on the positive functional assay hits disclosed and described below.

F. F. 組織分布 本発明のPROを発現する組織の位置は、、種々のヒト組織でのmRNA発現の測定により確認できる。 The location of tissues expressing the PRO tissue distribution present invention can be confirmed by measurement of mRNA expression in ,, various human tissues. そのような遺伝子の位置は、PROポリペプチドの活性の刺激及び阻害によって最も影響を受けやすい組織に関する情報を提供する。 The location of such genes provides information about which tissues are most likely to be affected by the stimulating and inhibiting activities of the PRO polypeptide. また、特定の組織中の遺伝子の位置は、下記において論じる活性遮断アッセイのための試料組織を提供する。 The location of a gene in a specific tissue also provides sample tissue for the activity blocking assays discussed below.
上記したように、種々の組織における遺伝子増幅又は遺伝子発現は、mRNAの転写の定量化のための従来のサザンブロット、ノーザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980])、ドットブロット(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、ここに提供する配列に基づき、適切な標識プローブを用いて測定できる。 As noted above, gene amplification, or gene expression in various tissues, by conventional Southern blotting for quantifying transcription of mRNA, northern blot (Thomas, Proc Natl Acad Sci USA, 77:.... 5201-5205 [1980]), dot blot (DNA analysis), or by in situ hybridization, based on the sequences provided herein, it can be measured using a suitable labeled probe. あるいは、DNA二重鎖、RNA二重鎖、及びDNA-RNAハイブリッド二重鎖又はDNA-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識する抗体を用いてもよい。 Alternatively, DNA duplexes, antibodies may be employed that can recognize specific duplexes, including RNA duplexes, and DNA-RNA hybrid duplexes or DNA- protein duplexes.
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片及び細胞培地又は体液の免疫組織学的染色などの免疫的方法によっても測定できる。 Alternatively, gene expression in various tissues, for quantifying the gene product directly, may be measured by immunological methods, such as immunohistochemical staining of tissue sections and assay of cell culture or body fluids. 免疫組織学的染色又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。 Antibodies useful assay for immunohistological staining or sample fluids may be either monoclonal or polyclonal, be prepared in any mammal. 都合良く、抗体は、PROポリペプチドの天然配列に対して、又は本発明のポリペプチドをコードするDNA配列に基づく合成ペプチドに対して、或いはPROポリペプチドをコードし、特異的抗体エピトープをコードするDNAと融合した外来配列に対して調製してもよい。 Conveniently, the antibodies may be prepared against a native sequence PRO polypeptide or against a synthetic peptide based on the DNA sequence encoding the polypeptide of the present invention, or encoding a PRO polypeptide, encoding a specific antibody epitope it may be prepared against exogenous sequence fused to DNA. 下記に、抗体を生成するための一般的な技術、並びにノーザンブロット及びインサイツハイブリダイゼーションのプロトコールを提供する。 The General techniques for generating antibodies, as well as Northern blot and in situ hybridization protocol.

G. G. 抗体結合の研究 本発明のPROポリペプチドの活性は、組織細胞に対するPROポリペプチドの効果を阻害する抗-PRO抗体の能力が試験される抗体結合の研究によって更に確認できる。 Activity of the PRO polypeptide of studies invention of antibody binding, can be further confirmed by studies of the ability antibody binding to be tested anti -PRO antibodies to inhibit the effect of the PRO polypeptides on tissue cells. 例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロコンジュゲート抗体を含み、その調製は以下に記載する。 Exemplary antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, heteroconjugate conjugated antibody bispecific, and, the preparation of which will be described below.
抗体結合の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。 Antibody binding studies, competitive binding assays may be performed in direct and indirect sandwich assays, and known assay method, such as immunoprecipitation assays. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。 Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。 Competitive binding assays, the labeled standards, by their ability to compete with the test sample analyte for binding with a limited amount of antibody. 試験試料中の(腫瘍細胞で増幅された遺伝子にコードされる)標的タンパク質の量は、抗体に結合し始める標準物の量に逆比例する。 The amount of the (encoded by the genes amplified in tumor cells) target protein test sample is inversely proportional to the amount of standard that becomes bound to the antibodies. 結合し始める標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に固定化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。 To facilitate determining the amount of standard that becomes bound, the antibodies preferably are immobilized after the previous competition or easily from the standard and analyte that the standard and analyte that are bound to the antibody is left unbound to be able to separate.

サンドウィッチアッセイは2つの抗体の使用を含み、各々が検出すべきタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。 Sandwich assays involve the use of two antibodies, each capable of binding to a different immunogenic portion, or epitope, of the protein to be detected. サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第1の抗体に結合し、その後第2の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の3成分複合体が形成される。 The test sample analyte in a sandwich assay is bound by a first antibody which is immobilized on a solid support, and thereafter a second antibody binds to the analyte, thus an insoluble three-part complex is formed. 例えば米国特許第4,376,110号参照。 For example see U.S. Pat. No. 4,376,110. 第2の抗体は検出可能部分で標識され(直接サンドウィッチアッセイ)、あるいは検出可能部分で標識された抗-免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい(間接サンドウィッチアッセイ)。 The second antibody may itself be labeled with a detectable moiety (direct sandwich assays) or anti labeled with a detectable moiety - may be measured using an immunoglobulin antibody (indirect sandwich assay). 例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はELISAアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。 For example, one type of sandwich assay is an ELISA assay, in which case the detectable moiety is an enzyme.
免疫組織学のためには、腫瘍試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。 For immunohistochemistry, the tissue sample may be obtained by freeze even fresh, and may be embedded in paraffin and fixed with a preservative such as formalin, for example.

H. H. 細胞ベースアッセイ 細胞ベースアッセイ及び免疫関連疾患の動物モデルを、ここで同定された遺伝子とポリペプチド、並びに免疫関連疾患の発達と病原性との関係をさらに理解するのに用いることができる。 Animal models of cell-based assays Cell-based assays and immune-related disorders, wherein the identified gene and polypeptide, and can be used to further understand the relationship between the development and pathogenesis of immune related disease.
異なる方法では、ここに記載されたcDNAを特定の免疫関連疾患に関与することが知られているある細胞型の細胞へトランスフェクションし、これらのcDNAの免疫機能を刺激又は阻害する能力を分析する。 In a different approach, here and there transfected into cell types of cells known to be involved in a particular immune related disease cDNA described, to analyze the ability to stimulate or inhibit the immune function of these cDNA . 適当な細胞は所望の遺伝子でトランスフェクションし、そして免疫機能をモニターすることができる。 Suitable cells can be monitored transfected with transfection and immune function in the desired gene. このようなトランスフェクション株化細胞は、例えばT細胞の増殖又は炎症性細胞の浸潤を調節する免疫機能を阻害又は刺激するポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに用いることができる。 Such transfected cell lines, such as poly inhibit or stimulate immune function to regulate the growth or infiltration of inflammatory cells T cell - be used to test the ability of the or monoclonal antibodies or antibody compositions it can. ここに同定した遺伝子のコード化配列でトランスフェクションした細胞は、さらに、免疫関連疾患の治療の候補薬の同定に用いることができる。 Cells transfected with the coding sequences of the genes identified herein can further be used to identify drug candidates for the treatment of immune-related diseases.
さらには、安定な株化細胞が好ましいが、トランスジェニック動物から誘導された一次培地を(下記のような)、ここでの細胞ベースアッセイに使用することができる。 Furthermore, although stable cell lines are preferred, can be used primary cultures derived from transgenic animals (as described below), the cell-based assays herein. トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術は、この分野で良く知られている(Smallら, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]参照)。 Techniques to derive continuous cell lines from transgenic animals are well known in the art (Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, see 642-648 [1985]).

一つの適切な細胞ベースアッセイは、混合リンパ球反応(MLR)である。 One suitable cell based assay is the mixed lymphocyte reaction (MLR). Current Protocols in Immunology, unit3.12;JE Coligan, AM Kruisbeek, DH Marglies, EM Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Inc。 Current Protocols in Immunology, unit3.12; JE Coligan, AM Kruisbeek, DH Marglies, EM Shevach, W Strober, eds., National Institutes of Health, John Wiley & Sons, Inc. このアッセイでは、活性T細胞の増殖を刺激又は阻害する試験化合物の能力が評価される。 In this assay, the ability of a test compound to stimulate or inhibit the proliferation of activated T cells is evaluated. レスポンダーT細胞の懸濁液を同種刺激細胞と培養し、T細胞の増殖をトリチウム化チミジンの取り込みによって測定する。 A suspension of responder T cells is cultured with allogeneic stimulator cells, proliferation of T cells is measured by uptake of tritiated thymidine. このアッセイは、T細胞反応性の一般的な測定法である。 This assay is a general measure of T cell reactivity. 活性化によって、T細胞の大多数がIL-2へ応答し、IL-2を生産することから、このアッセイでの応答性の相違の一部は、応答細胞によるIL-2生産の違いを反映する。 Activation, the majority of T cells respond to IL-2, since the production of IL-2, part of the response of the difference in this assay reflects the differences in IL-2 production by the responding cells to. MLRの結果は、標準的なリンフォカイン(IL-2)検出アッセイによって確かめられる。 The results of the MLR is confirmed by standard lymphokine (IL-2) detection assay. Current Protocols in Immunology, 上掲, 3.15,6.3。 Current Protocols in Immunology, supra, 3.15,6.3.

MLRアッセイにおける増殖性のT細胞応答は、アッセイされた分子の直接的な分裂促進特性又は外来性の抗原誘導活性化に起因する。 Proliferative T cell response in an MLR assay may be due to direct mitogenic properties or foreign antigens induced activation of the assayed molecules. 本発明のポリペプチドのT細胞刺激性活性の更なる確認は、同時刺激アッセイによって得ることができる。 Further confirmation of the T cell stimulatory activity of the polypeptides of the present invention can be obtained by co-stimulation assay. T細胞活性化には、T細胞レセプター(TCR)を通して媒介される抗原特異性シグナルと二番目のリガンド結合による相互作用を通して媒介される同時刺激シグナル、例えばB7(CD80,CD86)/CD28結合相互作用が必要される。 The T cell activation costimulatory signal mediated through interaction with antigen-specific signal and the second ligand binding mediated through T cell receptor (TCR), eg B7 (CD80, CD86) / CD28 binding interaction It is necessary. CD28架橋は、活性化T細胞によるリンフォカインの分泌を増加させる。 CD28 crosslinking increases the secretion of lymphokines by activated T cells. T細胞活性化は、ネガティブ又はポジティブ効果のあるリガンド結合を通して、ネガティブ及びポジティブコントロールの両方を有する。 T cell activation through ligand binding with negative or positive effects, has both negative and positive controls. CD28及びCTLA-4はB7と結合するIgスーパーファミリーの関連する糖タンパク質である。 CD28 and CTLA-4 are related glycoproteins in the Ig superfamily which bind to B7. B7へのCD28の結合には、T細胞活性化のポジティブ同時刺激効果がある;逆を言えば、B7へのCTLA-4の結合には、ネガティブなT細胞非活性化効果がある。 The binding of CD28 to B7, there is a positive costimulation effect of T cell activation; speaking Conversely, the CTLA-4 binding to B7, there is a negative T cell deactivating effect. Chambers, CA及びAllison, JP, Curr. Opin. Immunol.(1997) 9:396;Schwartz, RH, Cell(1992) 71: 1065;Linsey, PS及びLedbetter, JA, Annu. Rev. Immunol.(1993) 11:191;June, CHら., Immunol. Today(1994) 15:321;Jenkins, MK, Immunity(1994) 1:405。 Chambers, CA and Allison, JP, Curr Opin Immunol (1997) 9:... 396; Schwartz, RH, Cell (1992) 71:.. 1065; Linsey, PS and Ledbetter, JA, Annu Rev. Immunol (1993) 11: 191; June, CH et al., Immunol Today (1994) 15:.. 321; Jenkins, MK, Immunity (1994) 1: 405. 同時刺激アッセイでは、T細胞同時刺激性又は阻害活性について本発明のPROポリペプチドをアッセイする。 The costimulation assay, to assay the PRO polypeptide of the present invention for T cell costimulatory or inhibitory activity.

本発明の他の化合物と並んで、T細胞増殖の刺激剤(同時刺激剤)及びアゴニスト、例えばアゴニスト抗体あり、その上にMLR及び同時刺激アッセイによって確定されたように、PROポリペプチドは、例えば、弱く、最適状態には及ばない、或いは不十分な免疫機能として特徴付けられる免疫関連疾患の治療に有用である。 Along with other compounds of the present invention, T cell proliferation stimulators (costimulatory agent) and agonists, there example agonistic antibodies, on as was determined by MLR and costimulation assays that, PRO polypeptides, for example, , weak, optimally state beyond, or are useful in the treatment of characterized are immune related diseases as inadequate immune function. これらの疾患は、T細胞(並びにT細胞媒介免疫)の増殖及び活性化を刺激すること、並びに刺激PROポリペプチドのような刺激性化合物の投与を通して哺乳動物の免疫応答を高めることによって治療される。 These diseases are treated by increasing the stimulating proliferation and activation of T cells (and T cell mediated immunity), as well as the immune response of mammals through the administration of stimulatory compounds such as stimulation PRO polypeptide . この刺激ポリペプチドは、例えば、PROポリペプチド又はそのアゴニスト抗体でもよい。 This stimulation polypeptide may be, for example, a PRO polypeptide or an agonist antibody.
本発明におけるような刺激化合物の直接的用途は、初期T細胞上に発現するリガンド(4-1BBL)と結合し、T細胞活性化と成長の信号を伝達する、腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである4-1BB糖タンパク質をともなう実験において確かめられている。 Direct application of stimulating compound as in the present invention bind to a ligand expressed on early T cells (4-1BBL), it transmits a signal of T cell activation and growth, a member of the tumor necrosis factor receptor family It has been confirmed in experiments with a certain 4-1BB glycoprotein. Alderson, MEら., J. Immunol. 24:2219(1994) 。 Alderson, ME et al., J. Immunol 24:.. 2219 (1994).

アゴニスト刺激性化合物の用途も実験的に確かめられている。 Application of the agonist stimulatory compound has also been confirmed experimentally. アゴニスト抗-4-1BB抗体による治療での4-1BBの活性化は、腫瘍の根絶を促進する。 Activation of 4-1BB on treatment with agonist anti -4-1BB antibodies promote tumor eradication. Hellstrom, I.及びHellstrom, KE, Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1。 Hellstrom, I. and Hellstrom, KE, Crit Rev. Immunol (1998) 18:.. 1. 下記により詳しく記載されている免疫吸着剤療法による腫瘍の治療は、本発明の刺激性化合物の用途のもう一つの例である。 Treatment of tumors by immunoadsorption therapy as described in more detail below, is another example of application of stimulatory compounds of the invention. MLRアッセイにおいて阻害することが見出されているPROの活性と拮抗する、或いはそれを遮断することによって、免疫刺激又は促進効果も達成することができる。 Antagonizing the activity of the PRO that have been found to inhibit the MLR assay, or by blocking it, it can also be achieved immune stimulating or enhancing effect. 化合物の阻害活性を打ち消すことは、正味の刺激性効果を生み出す。 To counteract the inhibitory activity of the compound produces a net stimulatory effect. 適切なアンタゴニスト/遮断化合物は、阻害性タンパク質を認識してそれと結合するそれの抗体又は断片であり、このタンパク質のレセプターとの効果的な相互作用を遮断して、レセプターを通してのシグナル伝達を阻害する。 Suitable antagonists / blocking compounds is that of an antibody or fragment that binds it to recognize the inhibitory protein, to block an effective interaction with the receptor protein and inhibits signaling through the receptor . 恐らくはCTLA-4の結合による阻害シグナルを除くことによってT細胞の増殖を促進する抗-CTLA-4抗体を用いる実験において、この効果は確認されている。 Possibly in experiments using anti-CTLA-4 antibody that promotes proliferation of T cells by removing inhibitory signals by binding CTLA-4, this effect has been confirmed. Walunas, TLら, Immunity(1994) 1:405。 Walunas, TL, et al., Immunity (1994) 1: 405.
あるいは、免疫刺激又は増強効果は、また、血管透過性を高める特性を有するPROポリペプチドの投与によって達成することができる。 Alternatively, an immune stimulating or enhancing effect can also be achieved by administration of a PRO polypeptide having the property of increasing the vascular permeability. 高まった血管透過性は、免疫細胞(例えば、単球、好酸球、PMN)の局所的な浸潤によって和らげることが可能な疾患に対して有益である。 Increased vascular permeability, immune cells (e.g., monocytes, eosinophils, PMN) are beneficial for localized disease that can relieve the infiltration.

一方では、T細胞増殖/活性化、リンフォカイン分泌、及び/又は血管透過性の直接的阻害剤である本発明の他の化合物と同様にPROポリペプチドは、免疫応答を抑制へ直接に用いることができる。 On the one hand, T cell proliferation / activation, lymphokine secretion, and / or vascular permeability direct inhibitor other compounds as well as PRO polypeptides of the present invention, be used to direct the immune response to inhibit it can. これらの化合物は、免疫応答の程度を減じること、並びに異常に活発な、並外れに最適な、又は自己免疫性の応答によって特徴付けられる免疫関連疾患を治療するのに有用である。 These compounds, reducing the extent of the immune response, as well as unusually active, ideal for extraordinary or be useful in treating immune related diseases characterized by autoimmune responses. 本発明のこの化合物の用途は、レセプターB7へのCTLA-4の結合がT細胞を不活性化させる上記に記載の実験によって確認されている。 Application of the compounds of the present invention, CTLA-4 binding to receptor B7 has been confirmed by the experiments described above to inactivate the T cells. 本発明の直接的阻害性化合物は、類似の方法で機能する。 Direct inhibitory compounds of the present invention function in a similar manner. 血管透過性を抑制する化合物の用途は、炎症を減じることが期待できる。 Application of compound which suppress vascular permeability would be expected to reduce inflammation. そのような用途は、過度の炎症に関連する症状を治療するのに有益である。 Such applications are useful in treating conditions associated with excessive inflammation.
あるいは、例えば、本発明の刺激PROポリペプチドと結合し、これら分子の刺激効果を遮断する抗体は、正味の阻害性効果を生成し、T細胞増殖/活性化及び/又はリンフォカイン分泌を阻害することによってT細胞性免疫応答を抑制することに用いることができる。 Alternatively, for example, it is combined with stimulating PRO polypeptides of the present invention, antibodies that block the stimulating effect of these molecules, which generates a net inhibitory effect of inhibiting T cell proliferation / activation and / or lymphokine secretion it can be used to suppress the T cell mediated immune response by. このポリペプチドの刺激効果を遮断することは、哺乳動物の免疫応答を抑制する。 Blocking the stimulating effect of the polypeptides suppresses the immune response of the mammal. この用途は、抗-IL2抗体を用いる実験において確認されている。 This application has been confirmed in experiments using anti -IL2 antibody. これらの実験では、抗体はIL2と結合し、IL2のそのレセプターとの結合を遮断することでT細胞阻害効果を達成する。 In these experiments, the antibody binds to IL2, to achieve a T cell inhibitory effect by blocking the binding to its receptor IL2.

I. I. 動物モデル 細胞ベースインビトロアッセイの結果は、インビトロ動物モデル及びT細胞機能向けのアッセイを用いてさらに確かめることができる。 Results of animal models cell based in vitro assays can be further verified using the assays in vitro animal models and T cell function for. 免疫関連疾患の発達及び病理におけるここで同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。 To further understand the role of the genes identified herein in the development and pathogenesis of immune related disease, and test antibody, and the efficacy of candidate therapeutic agents, including other agonists of the native polypeptides, including small molecule agonists for a variety of well known animal models can be used. このようなモデルのインビボの性質によって、特にヒト患者における反応を予測できる。 By in vivo nature of such models makes them particularly predictive of responses in human patients. 免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。 Animal models of immune related diseases include both non-recombinant and recombinant (transgenic) animals. 非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。 Non-recombinant animal models include, for example, rodent, e.g., murine models. このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植などにより、細胞を導入することによって作成される。 Such models, standard techniques, e.g., subcutaneous injection, tail vein injection, spleen implantation, intraperitoneal implantation, the renal subcapsular transplantation is created by introducing a cell.

移植片対宿主疾患は、免疫担当細胞が免疫抑制又は寛容(トレランス)な患者に移植された際に起こる。 Graft-versus-host disease occurs when immunocompetent cells are transplanted into the patient immunosuppression or tolerance (tolerance). ドナー細胞が宿主抗原を認識し、これへ応答する。 Donor cells recognize host antigens and responds to it. この応答には、生命を脅かす重篤な炎症から下痢及び体重減少の穏やかな場合にまで変化し得る。 This response may vary from a mild cases of severe inflammation life-threatening diarrhea and weight loss. 移植片対宿主疾患モデルは、MHC抗原及び微量の移植抗原に対するT細胞の反応性を評価する手段を提供する。 Graft-versus-host disease models provide a means of assessing T cell reactivity against transplantation antigens of the MHC antigens and minor. 好適な手法は、上記のCurrent Protocols in Immunology unit 4.3に詳しく記載されている。 A suitable procedure is described in detail in the above Current Protocols in Immunology unit 4.3.
皮膚移植片拒絶の動物モデルは、T細胞がインビボ組織破壊を媒介する能力を試験する手段であり、移植片拒絶におけるそれらの役割の基準である。 Animal models of skin graft rejection is a means of testing the ability of T cells to mediate in vivo tissue destruction and a measure of their role in transplant rejection. 最も普通で許容されるモデルは、マウスの尾の皮膚移植である。 The most common model allowed is tail skin grafts in mice. 繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶はT細胞、ヘルパーT細胞尾キラー効果T細胞に媒介され、抗体ではないことが示された。 Repeated experiments, skin allograft rejection T cells is mediated helper T cell tail killer effect T cells, was shown to be not an antibody. Auchincloss, H. Jr.及びSachs, DH, Fundamental Immunology, 2版, WE Paul編, Raven Press, NY, 1989, 889-992。 Auchincloss, H. Jr. and Sachs, DH, Fundamental Immunology, 2 Edition, WE Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992. 好適な手法は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 4.4に詳細に記載されている。 A suitable procedure, the above Current Protocols in Immunology, are described in detail in Unit 4.4. 本発明の化合物の試験に使用できる他の移植片拒絶モデルは、Tanabe, M.ら, Transplantation (1994) 58: 23及びTinubu, SAら, J. Immunol. (1994) 4330-4338に記載されている同種心臓移植モデルである。 Other transplant rejection models which can be used to test the compounds of the present invention, Tanabe, M. et al., Transplantation (1994) 58: 23 and Tinubu, SA et al., Described in J. Immunol (1994) 4330-4338. is an allogeneic heart transplant models you are.

遅延型過敏症の動物モデルは、同様に細胞媒介免疫機能のアッセイ法を提供する。 Animal models for delayed type hypersensitivity, likewise provides an assay of cell mediated immune function. 詳細な型の過敏症反応は、抗原負荷後時間が経過するまでピークに達しない炎症を特徴とするT細胞媒介免疫反応である。 Illustrative types of hypersensitivity reactions are a T cell mediated immune response characterized by inflammation which does not reach a peak until after a period of time has elapsed after the antigen challenge. これらの反応はまた、組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(MS)及び実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE、MSのモデル)を起こす。 These reactions also occur in tissue specific autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, MS model). 好適な手法は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 4.5に詳細に記載されている。 A suitable procedure, the above Current Protocols in Immunology, are described in detail in Unit 4.5.
EAEは、T細胞及び単核球炎症、及びその結果生じた中枢神経系の軸索の脱髄によって特徴付けられるT細胞性自己免疫疾患である。 EAE is a T cell mediated autoimmune disease characterized by demyelination of the T cell and mononuclear inflammation and axons of the resulting central nervous system. EAEは、一般的には、ヒトのMSの関連する動物モデルであると考えられる。 EAE is generally considered to be a relevant animal model of human MS. Bolton, C., Multiple Sclerosis(1995) 1: 143。 Bolton, C., Multiple Sclerosis (1995) 1: 143. 急性及び再発性軽減モデルの両方が開発されている。 Both acute and recurrent reduce model has been developed. Current Protocols in Immunology, unit 15.1及び15.2に記載のプロトコールを用いて、本発明の化合物は、免疫性脱髄疾患に対するT細胞刺激性又は阻害性活性について試験することができる。 Current Protocols in Immunology, using the protocol described in Unit 15.1 and 15.2, the compounds of the invention can be tested for T cell stimulatory or inhibitory activity against immune demyelinating diseases. Duncan, IDら, Molec. Med. Today(1997) 554-561に記載されている、オリゴデンドログリア又はシュワン細胞が中枢神経系へ移植されるミエリン疾患のモデルも参照のこと。 Duncan, ID, et al., Molec. Med. Today (1997) 554-561 are described in, that oligodendroglial or Schwann cells See also the model of myelin disorder are transplanted into the central nervous system.

接触過敏症は、細胞性免疫機能の単純な遅延型過敏症インビボアッセイである。 Contact hypersensitivity is a simple delayed type hypersensitivity in vivo assay of cell mediated immune function. この手法では、遅延型過敏症反応を引き起こす外来性ハプテンへの皮膚被爆が測定そして定量化される。 In this approach, the skin exposure to exogenous haptens which give rise to delayed type hypersensitivity response is measured and quantified. 接触過敏症には、誘発期が後に続く初期感作期が含まれる。 The contact hypersensitivity, include the initial sensitization period followed by the induction period. この誘発期は、Tリンパ球が以前に接触した抗原と遭遇する際に起こる。 The elicitation phase occurs when encountering an antigen T lymphocytes have had previous contact. 腫れと炎症が起こり、それをヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルにする。 Occur swelling and inflammation, it is an excellent model of human allergic contact dermatitis. 好適な手法は、Current Protocols in Immunology, Eds. JE Cologan, AM Kruisbeek, DH Margulies, EM Shevach及びW. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unit 4.2に詳しく記載されている。 A suitable procedure, Current Protocols in Immunology, Eds. JE Cologan, AM Kruisbeek, DH Margulies, EM Shevach and W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., is described in detail in 1994, unit 4.2. Grabbe, S. 及びSchwarz, T, Immun. Today 19(1): 37-44(1998)も参照のこと。 Grabbe, S. and Schwarz, T, Immun Today 19 (1):. 37-44 (1998) See also.
関節炎の動物モデルはコラーゲン誘発関節炎である。 Animal models of arthritis is collagen-induced arthritis. このモデルは、ヒトの自己免疫性慢性関節リウマチと臨床的、組織学的及び免疫学的特徴を共有し、ヒトの自己免疫性関節炎の許容されるモデルである。 This model, clinical and autoimmune rheumatoid arthritis in humans, share histological and immunological characteristics, a model that is acceptable for human autoimmune arthritis. マウス及びラットモデルは、滑膜炎、軟骨及び肋軟骨下骨の浸食を特徴とする。 Mouse and rat models, for synovitis, erosion of cartilage and subchondral bone characterized. 本発明の化合物は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 15.5に記載されているプロトコールを用いて、自己免疫性関節炎に対する活性について試験できる。 The compounds of the present invention, the above Current Protocols in Immunology, using the protocol described in Unit 15.5, can be tested for activity against autoimmune arthritis. また、Issekutz, ACら, Immunology 88: 569 (1996)に記載されているCD18及びVLA-4インテグリンに対するモノクローナル抗体を用いたモデルも参照のこと。 Further, Issekutz, AC et al., Immunology 88: 569 (1996) that also reference model using a monoclonal antibody to CD18 and VLA-4 integrins described in.

喘息のモデルは記載され、そこでは抗原誘発気道過剰反応性、肺性好酸球増加症及び炎症が、動物をオボアルブミンで感作し、次いで動物にエアロゾルで運ばれる同じタンパク質を負荷することにより誘発される。 Model of asthma are described in which antigen-induced airway hyper-reactivity, by pulmonary eosinophilia and inflammation, the animals were sensitized with ovalbumin and then loaded with the same protein carried in aerosol animals It is induced. 幾つかの動物モデル(モルモット、ラット、非ヒト霊長類)は、エアロゾル抗原で負荷した際にヒトのアトピー性喘息に似た徴候を示す。 Several animal models (guinea pig, rat, non-human primate) show symptoms similar to atopic asthma in humans upon loading in aerosol antigens. マウスモデルは、ヒト喘息の多くの特徴を持つ。 Mouse model has many of the features of human asthma. 本発明の化合物の喘息治療における活性及び有効性を試験するための好適な方法は、Wolyniec, WWら, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 18: 777(1998) 及びその引用文献に記載されている。 Suitable methods for testing the activity and effectiveness in the treatment of asthma the compounds of the present invention, Wolyniec, WW et al., Am J. Respir Cell Mol Biol, 18:.... 777 (1998) and references therein Are listed.
さらに、本発明の化合物は、乾癬様疾患の動物モデルでも試験できる。 Furthermore, the compounds of the invention can also tested in animal models for psoriasis like diseases. 証拠は、乾癬についてのT細胞病原を示唆している。 Evidence suggests a T cell pathogenesis for psoriasis. 本発明の化合物は、Schon, MPら, Nat. Med. (1997)3: 183によって記載された、マウスが乾癬に類似する組織病原学的皮膚疾患を示すscid/scidマウスモデルでも試験できる。 The compounds of the present invention, Schon, MP et al., Nat Med (1997) 3:.. 183 described by the mouse can be also tested in scid / scid mouse model exhibits tissue etiological skin disorder similar to psoriasis. 他の好適なモデルは、Nickoloff, BJら, Am . J. Pathol. (1995) 146: 580に記載されたように調製されるヒト皮膚/scidマウスキメラである。 Other suitable models, Nickoloff, BJ et al, Am J. Pathol (1995) 146:.. A human skin / scid mouse chimera prepared as described in 580.

組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とする動物のゲノムに導入することにより加工できる。 Recombinant (transgenic) animal models, the coding portion of the genes identified herein, can be processed by using standard techniques for transgenic animals created and introduced into the genome of animals of interest. トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。 Including human primates, eg baboons, chimpanzees and monkeys - Animals that can serve as a target for transgenic manipulation include, without limitation, mice, rats, rabbits, guinea pigs, sheep, goats, pigs, and non. これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、全核マイクロインジェクション(Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号);胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移(例えば、Van der Puttenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]);胚性肝細胞での遺伝子標的化(Thompsonら, Cell 56, 313-321 [1989]);胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]);精子媒介遺伝子転移(Lavitranoら, Cell 57, 717-73 [1989])を含む。 Known technique in the art for introducing a transgene into such animals, Zenkaku microinjection (Hoppe and Wanger, U.S. Patent No. 4,873,191); retrovirus mediated gene transfer into germ line (e.g., Van der Putten et al, Proc Natl Acad Sci USA 82, 6148-615 [1985]);.... gene targeting in embryonic stem cells (Thompson et al., cell 56, 313-321 [1989]); electroporation of embryos configuration (Lo, Mol Cel Biol 3, 1803-1814 [1983]...); including sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 [1989]). 概説としては、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。 For a review, see, e.g., U.S. Patent No. 4,736,866.
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)を含む。 For the purposes of the present invention, transgenic animals include part only having a transgene ( "mosaic animals"). 導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。 Transgene can be integrated either as a single transgene, or concatamers, incorporated for example as a tandem head-to-head or head-to-tail. 特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Laskoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。 Selective introduction of a transgene into a particular cell type, for example, Lasko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, it is possible according to the techniques of 6232-636 (1992).

トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。 Expression of the transgene in transgenic animals can be monitored by standard techniques. 例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はPCR増幅が用いられる。 For example, Southern blot analysis or PCR amplification can be used to verify the integration of the transgene. 次いで、mRNA発現のレベルは、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、PCR、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。 The level of mRNA expression can then be analyzed using in situ hybridization, Northern blot analysis, PCR, or techniques such as immunohistochemistry.
例えば免疫細胞の特定の細胞への浸潤を確定するための組織学的検査によって、免疫疾患病理の兆候に関してこの動物を更に調べてもよい。 For example by histological examination to determine infiltration of immune cells into specific, The animals may be further examined for signs of immune disease pathology. 本発明の化合物によるT細胞増殖の刺激又は阻害の程度を確定するために、この化合物で処理したトランスジェニック動物で遮断実験をも行うことができる。 To determine the degree by the compound of stimulation or inhibition of T cell proliferation of the present invention, it is also possible to perform blocking experiments in transgenic animals treated with this compound. これらの実験では、上記に記載のようにして調製した本発明のポリペプチドと結合する遮断抗体が動物へ投与され、そして免疫機能への影響が測定される。 In these experiments, blocking antibodies which bind to the polypeptides of the present invention prepared as described above, it is administered to the animal and the effect on immune function is determined.

あるいは、「ノックアウト」動物は、ここで同定されたポリペプチドをコードする内在性の遺伝子と、動物の胚性細胞へ導入されたそのポリペプチドをコードする改変ゲノムDNAとの間の相同組み換えの結果として、ここで同定されたポリペプチドをコードする欠陥又は改変遺伝子を有するものとして構築することができる。 Alternatively, "knock out" animals as a result of homologous recombination between the endogenous gene encoding a polypeptide identified, a modified genomic DNA encoding that polypeptide introduced into an embryo of an animal cell, where as can be constructed as having a defective or altered gene encoding a polypeptide identified herein. 例えば、ある特定ポリペプチドをコードするcDNAは、確立されている技術によって、そのポリペプチドをコードするゲノムDNAのクローニングに利用できる。 For example, cDNA encoding a particular polypeptide in accordance with established techniques can be used to clone genomic DNA encoding that polypeptide. ある特定のポリペプチドをコードするゲノムDNAの一部は、その他の遺伝子、例えば組み込みをモニターするために利用できる選択可能なマーカーをコードする遺伝子によって置き換え又は除去できる。 There some specific genomic DNA encoding a polypeptide, other genes, for example, replaced or removed by a gene encoding a selectable marker which can be used to monitor integration. 概して、ベクターは無変化のフランキングDNA(5'と3'末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと]。 Generally, vectors Thomas and Capecchi for [e.g., homologous recombination vectors comprising several kilobases of unaltered flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends), Cell, 51: 503 and references (1987) about]. ベクターを胚性幹細胞へ(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞を選択する[例えば、Liほか, Cell, 69:915(1992)参照]。 The vector embryonic stem into cells (eg, by electroporation) is introduced, the introduced DNA has selected the endogenous DNA and homologously recombined with cells [e.g., Li addition, Cell, 69: 915 (1992 )reference]. 選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, EJ Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照]。 The selected cells are then injected into a blastocyst of an animal (e.g., a mouse or rat) to form aggregation chimeras [see eg, Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:. A Practical Approach, EJ Robertson, ed (IRL , Oxford, 1987), pp. 113-152 reference]. その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。 Then, a chimeric embryos were implanted into a female nanny of appropriate false pregnancy, put a term to create a "knock out" animal. 胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。 Progeny that have the germ cells homologously recombined DNA is identified by standard techniques, it is possible to them by using animal whole cells to breed animals containing the homologously recombined DNA . ノックアウト動物は、例えば腫瘍の発達を含む、ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けられる。 Knockout animals include, for example, tumor development, the polypeptide is characterized by certain pathological conditions and ability to defend against the development of the pathological conditions due to absence.

J. J. 免疫アジュバンド療法 一実施態様では、本発明の免疫刺激化合物を腫瘍(癌)治療のための免疫アジュバンド療法に利用することができる。 In immunoadjuvant therapy one embodiment, the immunostimulating compounds of the invention can be utilized in immunoadjuvant therapy for the tumor (cancer). T細胞がヒト腫瘍の特異的抗原を認識することは、現在は立証されている。 The T cells recognize specific antigens of human tumors has now been demonstrated. MAGE、BAGE及びGAGEファミリーの遺伝子によってコードされている腫瘍抗原の一群は、すべての成人の正常組織では沈黙しているが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺癌、頭頸部腫瘍、及び膀胱癌においてかなりの量が発現している。 MAGE, a group of tumor antigens, encoded by the genes of BAGE and GAGE ​​families, but in normal tissues of all adults are silent, a tumor, for example melanoma, a significant amount of lung cancer, head and neck tumors, and bladder cancer There has been an expression. DeSmet. C.ら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7149(1996)。 . DeSmet C., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93:..... 7149 (1996). インビトロとインビボの双方において、T細胞の同時刺激によって腫瘍の退行と抗腫瘍応答が誘導されることが示されている。 In vitro and in vivo both have been shown to regress and an antitumor response of the tumor is induced by costimulation of T cells. Melero, I.ら., Nature Medicine, 3: 682(1997);Kwon, EDら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8099(1997);Lynch, DHら., Nature Medicine, 3:625(1997);Finn, OJ及びLotze, MT, J. Immunol., 21:114(1998)。 Melero, I., et al., Nature Medicine, 3:. 682 (1997); Kwon, ED, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:...... 8099 (1997); Lynch, DH, et al., Nature Medicine, 3 :. 625 (1997); Finn, OJ and Lotze, MT, J. Immunol, 21: 114 (1998). 本発明の刺激性化合物は、アジュバンドとして、T細胞増殖/活性化及び腫瘍抗原への抗腫瘍応答を刺激するために、単独又は成長制御剤、細胞傷害性剤又は化学療法剤とともに投与することができる。 The stimulatory compounds of the invention may, as an adjuvant, to stimulate the anti-tumor responses to T cell proliferation / activation and tumor antigens, either alone or growth control agent, it is administered in conjunction with cytotoxic agents or chemotherapeutic agents can. 既知の投与処方によって、成長制御、細胞傷害性、又は化学療法剤を従来量で投与してもよい。 By known dosage formulations, the growth regulating, cytotoxic, or chemotherapeutic agent may be administered in conventional amounts. 本発明の化合物による免疫刺激活性によって、成長制御、細胞傷害性、又は化学療法剤の減量が可能となり、それによって患者の毒性が潜在的に低下する。 The immunostimulatory activity by the compounds of the present invention, the growth regulating, cytotoxic, or loss of chemotherapeutic agents is possible, whereby the patient toxicity potentially reduced.

K. K. 候補薬ためのスクリーニングアッセイ 候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされているポリペプチド、或いはその生物活性断片と結合又は複合化する化合物、或いはそうでなければコードされているポリペプチドと他の細胞性タンパク質の相互作用を妨害する化合物を同定するように設計されている。 Screening Assays Candidate agents screening assays for drug candidates are here encoded by the genes identified are to have a polypeptide, or compounds that bind or complex with a biologically active fragment thereof, or otherwise be encoded polypeptide It is designed to identify compounds that interfere with the interaction of the peptide with other cellular proteins. このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含み、特に、小分子候補薬の同定に適している。 Such screening assays will include assays amenable to high-throughput screening of chemical libraries, particularly suitable for identifying small molecule drug candidates. 考えられる小分子には、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、(ポリ)ペプチド-免疫グロブリン融合物を含む合成有機又は無機化合物を含み、そして特に限定することなく、ヒト抗体及び抗体断片と並んで、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそのような抗体又は断片のキメラ又はヒト化異形を含む抗体を含む。 Small molecules contemplated, peptides, preferably soluble peptides, (poly) peptide - include synthetic organic or inorganic compound comprises an immunoglobulin fusion, and in particular without limitation, along with human antibodies and antibody fragments, poly - and monoclonal antibodies and antibody fragments, single-chain antibodies, anti - including idiotypic antibodies, and antibodies including chimeric or humanized variant of such antibodies or fragments. このアッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。 This assay, proteins are well characterized in the art - protein binding assays, carried out in a variety of formats, including biochemical screening assays, immunoassays and cell based assays. すべてのアッセイは、候補薬とここで同定された核酸によってコードされているポリペプチドの相互作用を可能にする条件下及び十分な時間に渡って、これら二つの分子を接触させることを必要とするという点で共通である。 All assays over the conditions and time sufficient to permit interaction of the polypeptide encoded by the candidate agent and the nucleic acids identified herein, requires the contacting of these two molecules it is common in that.

結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、或いは反応混合物中で検出することができる。 In binding assays, the interaction is binding and the complex formed can be isolated or can be detected in the reaction mixture. 特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。 In a particular embodiment, the polypeptide or the drug candidate is encoded by the gene identified herein is a solid phase by covalent or non-covalent bonds, are immobilized, for example, a microtiter plate. 非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。 Non-covalent attachment is accomplished by generally coating the solid surface with a solution of the polypeptide and drying. あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。 Alternatively, an immobilized antibody specific for the peptide to be immobilized, for example, monoclonal antibodies can be used to anchor the peptide to a solid surface. アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。 Assay, the immobilized component, e.g., the coated surface containing the anchored component, is carried out by adding a detectable label in labeled or may be non-immobilized component. 反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。 When the reaction is complete, to remove unreacted components, eg, by washing, detecting the complexes anchored on the solid surface. 最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。 When the originally non-immobilized component carries a detectable label, the detection of label immobilized on the surface indicates that complexing occurred. 最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。 Where the originally non-immobilized component does not carry a label, complexing can be detected, for example, by immobilized labeled antibody that specifically binds to the complex.

候補化合物が相互作用するが特定のタンパク質に結合しない場合、そのレセプターとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。 If the candidate compound interacts not bind to a particular protein, interaction with its receptor, protein - it can be assayed by methods well known for detecting protein-protein interactions. そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。 Such assays include crosslinking, co-immunoprecipitation, and traditional approaches, such as co-purification through gradients or chromatographic columns. さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等[Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)]に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans[Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)]に開示されているようにモニターすることができる。 In addition, protein - protein interactions, NFL Fields and co-workers [Fiels and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989);... Chien et al, Proc.Natl Acad Sci USA 88, 9578-9582 (1991)] by using a yeast-based genetic system described, Chevray and Nathans [Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, is monitored as disclosed in based genetic system (1991)] be able to. 酵母菌GAL4などの多くの転写活性化剤は、2つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。 Many transcriptional activators, such as yeast GAL4, consist of two physically discrete modular domains, one acting as the DNA-binding domain, the other one functioning as the transcription activation domain. 以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「2-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、2つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。 Earlier has been yeast expression system described in the literature (generally referred to as the "two-hybrid system") takes advantage of this property, and employs two hybrid proteins, one DNA-binding domain of the target protein is GAL4 in fused to, on the other hand, in which candidate activating proteins are fused to the activation domain. GAL1-lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。 Expression under the control of a GAL4-activated promoter GAL1-lacZ reporter gene, a protein - depends on reconstitution of GAL4 activity via protein-protein interaction. 相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。 Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substrate for β- galactosidase. 2-ハイブリッド技術を用いた2つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから商業的に入手可能である。 Protein between two specific proteins using the two-hybrid technique - complete kit for identifying protein-protein interactions (MATCHMAKER (trade name)) is commercially available from Clontech. この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。 This system, map protein domains involved in specific protein interactions as well as can be extended to identify amino acid residues that are crucial for these interactions.

ここで同定された遺伝子の相互作用を妨害する化合物と、試験が可能な他の細胞内又は細胞外成分を見出すために、二つの産物の相互作用と結合を可能にする条件と時間の下で、遺伝子の生産物、並びに細胞内又は細胞外成分を含有するように、反応混合物は、通常は調製される。 Compounds that interfere with the interaction of a gene identified herein, in order to find other intra- or extracellular components can be tested, under conditions and for a time allowing for the interaction and binding of the two products , product of the gene, as well as to contain an intracellular or extracellular components, the reaction mixture is usually prepared. 試験化合物の結合を阻害する能力を試験するためには、反応を試験化合物が存在する場合と存在しない場合で実施する。 To test the ability to inhibit the binding of the test compound is conducted in the absence and if the test compound and the reaction is present. さらに、第3の反応混合物へプラシーボを添加してポジティブコントロールとしてもよい。 Furthermore, a placebo to a third reaction mixture may be as a positive control was added. コントロール反応において複合体の形成があり、試験化合物を含有しない反応混合物では複合体の形成がないことは、試験化合物が、試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。 The formation of a complex in the control reaction, the reaction mixture containing no test compound no formation of a complex indicates that the test compound interferes with the interaction of the test compound and its reaction partner.

L. L. 免疫関連疾患治療のための組成物及び方法 免疫関連疾患の治療に有用な組成物は、限定されないが、タンパク質、抗体、小有機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子などを含み、免疫機能、例えばT細胞増殖/活性化、リンフォカイン放出、又は免疫細胞浸潤を阻害又は刺激する。 Compositions and methods useful for compositions for the treatment of immune-related diseases for immune related diseases include, without limitation, proteins, antibodies, small organic molecules, peptides, phosphopeptides, antisense and ribozyme molecules, triple helix molecules, etc. hints, immune function, for example, T cell proliferation / activation, lymphokine release, or inhibit or stimulate immune cell infiltration.
例えば、アンチセンスRNA及びRNA分子は、標的mRNAにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を防止することによりmRNAの翻訳を直接阻止する。 For example, antisense RNA and RNA molecules act to directly block the translation of mRNA by preventing hybridization and protein translation in the target mRNA. アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10から+10位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。 When antisense DNA is used, the translation initiation site, e.g., oligodeoxyribonucleotides derived from between -10 and +10 positions of the target gene nucleotide sequence, are preferred.

リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。 Ribozymes are enzymatic RNA molecules capable of catalyzing the specific cleavage of RNA. リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。 Ribozymes sequence-specific hybridization to the complementary target RNA, followed act by endonucleolytic cleavage. 潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。 Specific ribozyme cleavage sites within a potential RNA target can be identified by known techniques. 更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びPCT公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日発行)を参照。 Further details are, for example, Rossi, Current Biology 4: see 469-471 (1994) and PCT publication No. WO 97/33551 (the issued Sep. 18, 1997).
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。 Nucleic acid molecules in triple helix formation used to inhibit transcription should be single-stranded and composed of deoxynucleotides. これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。 The base composition of these oligonucleotides is designed such that it promotes triple helix formation via Hoogsteen base-pairing rules, which generally require sizeable stretches of purines or pyrimidines on one strand of a duplex . さらなる詳細は、例えば、PCT公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。 For further details see, eg, PCT publication No. WO 97/33551, supra.
これらの分子は上記のスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組み合わせにより、又は当業者に知られた他のスクリーニング技術により同定できる。 These molecules can be identified by any or any combination of the screening assays described above, or identified by any other screening techniques well known for those skilled in the art.

M. M. 抗-PRO抗体 本発明は、さらに抗-PRO抗体を提供するものである。 Anti -PRO Antibodies The present invention further provides anti -PRO antibody. 抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。 Exemplary antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, bispecific, and heteroconjugate antibodies.

1. 1. ポリクローナル抗体 抗-PRO抗体はポリクローナル抗体を含む。 Polyclonal antibody anti--PRO antibody comprises a polyclonal antibody. ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。 Methods of preparing polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. 哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、一つ又は複数回注射することで発生させることができる。 Polyclonal antibodies in a mammal, for example immunizing agent and adjuvant if desired, it can be generated by injecting one or more times. 典型的には、免疫剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。 Typically, by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections of the immunizing agent and / or adjuvant will be injected in the mammal. 免疫剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。 The immunizing agent may include the PRO polypeptide or a fusion protein. 免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。 It may be useful to conjugate the protein known to be immunogenic in the immunizing agent immunized mammal. このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。 Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. 使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。 Examples of adjuvants which may be employed include Freund's complete adjuvant and MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl Lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate). 免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。 Immunization protocols will be selected by the skilled artisan without undue experimentation.

2. 2. モノクローナル抗体 あるいは、抗-PRO抗体はモノクローナル抗体であってもよい。 Monoclonal Antibodies Alternatively, the anti--PRO antibody may be a monoclonal antibody. モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。 Monoclonal antibodies, Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 can be prepared by using hybridoma methods, such as described in (1975). ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。 In a hybridoma method, a mouse, typically a hamster, or other appropriate host animal by immunizing with an immunizing agent to elicit or can generate lymphocytes producing antibodies that will specifically bind to the immunizing agent . あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。 Alternatively, it may be immunized lymphocytes in vitro.

免疫剤は、典型的には対象とするPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。 The immunizing agent will typically include the PRO polypeptide or a fusion protein thereof. 一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBLs」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。 In general the peripheral blood lymphocytes if cells of human origin are desired ( "PBLs") are used, or if non-human mammalian sources are desired, or spleen cells or lymph node cells are used. 次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。 Then, using a suitable fusing agent, such as polyethylene glycol fusing lymphocytes and immortalized cell lines, to form a hybridoma cell [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp 59-. 103]. 不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。 Immortalized cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly rodent, bovine, and human origin myeloma cells. 通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。 Usually, rat or mouse myeloma cell lines are employed. ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。 Hybridoma cells are preferably cultured in a suitable culture medium that contains one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused, immortalized cells. 例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。 For example, if the parental cells lack the hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase enzyme (HGPRT or HPRT), the culture medium for the hybridomas typically will aminopterin, and thymidine ( "HAT medium") , which substances prevent the growth of HGPRT-deficient cells.

好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。 Preferred immortalized cell lines are those that fuse efficiently, support stable high level expression of antibody by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。 More preferred immortalized cell lines are murine myeloma lines, which can be obtained from the American Type Culture Collection, for example, of San Diego, California Salk Institute Cell Distribution Center and Rockville, Maryland. ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]。 . Human myeloma and mouse to produce a human monoclonal antibody - Human heteromyeloma cell lines also have been disclosed [Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984), Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。 The culture medium in which the hybridoma cells are cultured can then be assayed for the presence of monoclonal antibodies directed against PRO. 好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。 Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is determined by in vitro binding assay, such as immunoprecipitation or radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。 Such techniques and assays are known in the art. モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。 Binding affinity of the monoclonal antibody can, for example, Munson and Pollard, Anal Biochem, 107:.. Can be determined by the Scatchard analysis of 220 (1980).

所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる[Goding, 上掲]。 After the desired hybridoma cells are identified, the clones were subcloned by limiting dilution procedures and can be grown by standard methods [Goding, supra]. この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI−1640倍地が含まれる。 Suitable culture media for this purpose include, for example, Modified Eagle's Medium and RPMI-1640 Dulbecco. あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。 Alternatively, the hybridoma cells may be grown in vivo as ascites in a mammal.
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。 The monoclonal antibodies secreted by the subclones are suitably protein A- Sepharose method, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography conventional immunoglobulin purification method by isolated from the culture medium or ascites fluid, such as It is separated or purified.

また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。 The monoclonal antibodies may also be made by recombinant DNA methods, such as described in U.S. Patent No. 4,816,567. 本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。 DNA encoding the monoclonal antibodies of the present invention, using conventional methods (e.g., by using oligonucleotide probes that are capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies), easily it can be isolated and sequenced. 本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。 The hybridoma cells of the invention serve as a preferred source of such DNA. ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内にトランスフェクションされ、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。 Once the isolated, DNA may be placed into expression vectors, which are host cells such as simian COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or transfected immunoglobulin protein myeloma cells that do not otherwise produce, it is, to obtain the synthesis of monoclonal antibodies in the recombinant host cells. また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより[米国特許第4,816,567号;Morrisonら, 上掲]、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。 Also, DNA, for example by in place of the homologous murine sequences substituting the coding sequence for human heavy and light chain constant domains [US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Supra], or immunoglobulin coding it can be modified by covalently binding a part or all of the non-immunoglobulin polypeptide coding sequence to sequence. このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。 Such a non-immunoglobulin polypeptide can be substituted for the constant domains of an antibody of the invention, or can be substituted for the variable domains of one antigen-combining site of an antibody of the present invention to create a chimeric bivalent antibody.

抗体は一価抗体であってもよい。 The antibodies may be monovalent antibodies. 一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。 Methods for preparing monovalent antibodies are well known in the art. 例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。 For example, one method involves recombinant expression of immunoglobulin light chain and modified heavy chain. 重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。 The heavy chain is truncated generally at any point in the Fc region so as to prevent heavy chain crosslinking. あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。 Alternatively, the relevant cysteine ​​residues or are deleted substituted with other amino acid residues to prevent crosslinking.
一価抗体の調製には、同じくインビトロ法が適している。 For preparing monovalent antibodies In vitro methods are also suitable. 抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成が可能である。 Digestion of antibodies to produce fragments thereof, particularly, Fab fragments, can be accomplished using routine techniques known in the art.

3. 3. ヒト及びヒト化抗体 本発明の抗-PRO抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。 Human and anti -PRO antibodies of humanized antibody The present invention may further comprise humanized antibodies or human antibodies. 非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab') あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。 The non-human (e.g., murine) antibodies Humanized forms, chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (e.g. Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2 or other antigen-binding subsequences of antibodies) there are, which contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。 Residues of a humanized antibody of the recipient complementarity determining region (CDR) is the residue of CDR of mouse, the desired specificity, such as a rat or rabbit, non-human species having affinity and capacity (donor antibody) comprising human immunoglobulin (recipient antibody) which is substituted by. 幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。 In some instances, Fv framework residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。 The humanized antibody, the recipient antibody may comprise residues that are not found in the imported CDR or framework sequences. 一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。 Generally, a humanized antibody, all or almost all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin and all or substantially all of the FR regions are those of a human immunoglobulin consensus sequence, at least one, typically includes substantially all of the two variable domains. ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]。 Humanized antibody, immunoglobulin constant region optimally (Fc), typically comprising at least a portion of an immunoglobulin constant region of a human [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:... 323-329 (1988); and Presta, Curr Op Struct Biol, 2: 593-596 (1992)].

非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。 Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. 一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の1つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。 Generally, a humanized antibody has one or more amino acid residues from a non-human is introduced. これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。 These non-human amino acid residues are often typically referred to as "import" residues derived from an "import" variable domain. ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者[Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。 Humanization Winter by replacing the corresponding sequences of a human antibody CDRs or CDR sequences essentially rodent (Winter) and co-workers [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann al, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], a rodent CDRs or CDR sequences by substituting the corresponding sequences of a human antibody It is carried out. よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。 Accordingly, such "humanized" antibodies, intact human variable domain substantially less than non-human species origin been substituted by the corresponding sequence chimeric antibodies (U.S. Patent No. 4,816,567) is there. 実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。 In practice, humanized antibodies are typically human antibodies which are substituted by residues from analogous sites in some CDR residues and possibly some FR residues rodent antibodies cases in.

また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991);Marksら, J. Mol. Biol., 222:381 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。 Human antibodies include phage display libraries [Hoogenboom and Winter, J. Mol Biol, 227:.... 381 (1991); Marks et al, J. Mol Biol, 222: 381 (1991)] in the art including It can also be made using known various methods. また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1):86-95(1991) ]。 Further, the method of Cole et al. And Boerner et al. Are also available for the preparation of human monoclonal antibodies [Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. P.77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol ., 147 (1): 86-95 (1991)]. 同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。 Similarly, human antibodies can be produced by introducing human immunoglobulin loci into transgenic animals, e.g., the endogenous immunoglobulin genes partially or completely inactivated mouse. 投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。 Upon administration, gene rearrangement, assembly, and the production of human antibodies that are very similar to that seen in humans in all respects, including antibody repertoire is observed. このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marksら, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。 This approach, for example, U.S. Pat. No. 5,545,807; Nos. 5,545,806; Nos 5,569,825; Nos 5,625,126; the 5,633,425 ; the No. 5,661,016, and the following scientific literature: Marks et al, Bio / Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812- 13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); described in Lonberg and Huszar, Intern Rev. Immunol 13 65-93 (1995); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996).. ing.

また、抗体は、上記に記載のような既知の選択及び/又は突然変異誘発法を利用して親和的に成熟している。 Moreover, antibodies, known selection and / or by using a mutagenesis are affinity matured as described above. 好ましい親和性成熟抗体は、5倍、より好ましくは10倍、さらにより好ましくは20又は30倍も成熟抗体の調製の元である出発抗体(一般的には、マウス、ヒト化又はヒト)より高い親和性を有する。 Preferred affinity matured antibodies, 5-fold, more preferably 10-fold, (generally murine, humanized or human) and even more preferably 20 or 30 times the original preparation of the mature antibody starting antibody higher than It has an affinity.

4. 4. 二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。 Bispecific Antibodies Bispecific antibodies are monoclonal antibodies that have binding specificities for at least two different antigens, preferably human or humanized antibody. 本発明の場合においては、結合特異性の一方はPROに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。 In the present case, one of the binding specificities is for the PRO, the other one is for any other antigen, and preferably for a cell-surface protein or receptor or receptor subunit.
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。 Methods for making bispecific antibodies are known in the art. 伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく[Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)]。 Traditionally, the recombinant production of bispecific antibodies is based on the coexpression of two immunoglobulin heavy chain / light chain pairs with specificity the two heavy chains have different [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. 免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。 For assortment of immunoglobulin heavy and light chains randomly these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of 10 different antibody molecules, having one only correct bispecific structure of them. 正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。 Purification of the correct molecule is usually accomplished by affinity chromatography steps. 同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。 Similar procedures are published May 13, 1993, WO93 / 08829, and Traunecker et al., EMBO J., 10: are disclosed in 3655-3656 (1991).

所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。 Desired binding specificities - antibody variable domains with the (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. 融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。 The fusion preferably is at least a hinge portion, of an immunoglobulin heavy chain constant domain containing a portion of the CH2 and CH3 regions. 少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。 At least one of the fusions it is desirable that there is a first heavy chain constant region containing the site necessary for light chain binding (CH1). 免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクションする。 DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusions and the immunoglobulin light chain if desired, are inserted into separate expression vectors, and are co-transfected into a suitable host organism. 二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。 For bispecific produce antibody further for creating, for example Suresh et al, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

WO96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。 According to another approach described in WO96 / 27011, the percentage of heterodimers which are recovered from recombinant cell culture the interface between a pair of antibody molecules can be maximized. 好適な界面は抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。 The preferred interface comprises at least a part of the CH3 region of an antibody constant domain. この方法では、第1抗体分子の界面からの1つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。 In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (e.g. tyrosine or tryptophan). 大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。 Large identical or complementary to that of similar size to the side chain "cavity", by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g. alanine or threonine) are created on the interface of the second antibody molecule. これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。 This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer are provided over other unwanted end-products such as homodimers.

二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab') 二重特異性抗体)として調製できる。 Bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or antibody fragments (e.g., F (ab ') 2 bispecific antibodies). 抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。 Techniques for generating bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature. 例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。 For example, using chemical linkage can be prepared bispecific antibodies. Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab') 断片を産生する手順を記述している。 Brennan et al, Science, 229: 81 (1985 ) describe a procedure to produce F (ab ') 2 fragments by cutting the intact antibodies are proteolytically. これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。 These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. 産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。 The Fab 'fragments generated are then converted to thionitrobenzoate (TNB) derivatives. Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。 Fab'-TNB by reduction of a derivative with followed mercaptoethylamine was reconverted to the Fab'- thiol, to form the bispecific antibody was mixed with an equimolar amount of the other Fab'-TNB derivative. 作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。 The bispecific antibodies produced can be used as agents for the selective immobilization of enzymes.
大腸菌からFab'フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。 The Fab 'fragments can be directly recovered from E. coli, which can form a bispecific antibody chemically coupled. Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab') 分子の製造を記述している。 Shalaby et al., J. Exp Med, 175:. . 217-225 (1992) , describes the production of a fully humanized bispecific antibody F (ab ') 2 molecule. 各Fab'フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。 Each Fab 'fragment was separately secreted from E. coli, in vitro and subjected to directed chemical coupling to form the bispecific antibody. このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトT細胞及びErbB2レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。 Bispecific antibodies thus formed was able to bind to cells overexpressing the ErbB2 receptor and normal human T cells, and trigger the lytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets Become.

また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法が記述されている。 Further, various methods making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture have also been described. 例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。 For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。 Kostelny, et al., J.Immunol 148 (5):. 1547-1553 (1992). Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。 The leucine zipper peptides from the Fos and Jun proteins were linked to the Fab 'portions of two different antibodies by gene fusion. 抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。 The antibody homodimers were reduced at the hinge region to form monomers and then re-oxidized to form the antibody heterodimers. この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。 This method can also be utilized for the production of antibody homodimers. Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。 Hollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA, 90:. "Diabodies" technology described by 6444-6448 (1993) has provided an alternative mechanism for making bispecific antibody fragments. 断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(V )に重鎖可変ドメイン(V )を結合してなる。 The fragments comprise a heavy-chain variable domain (V H) connected to a light-chain variable domain (V L) by a linker which is too short to allow pairing between the two domains on the same chain. 従って、一つの断片のV 及びV ドメインは他の断片の相補的V 及びV ドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。 Therefore, V H and V L domains of one fragment are forced to pair with the complementary V L and V H domains of another fragment, forming two antigen-binding sites. 単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。 Another strategy for making bispecific antibody fragments by the use of single-chain Fv (sFv) dimers has also been reported. Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。 Gruber et al., J. Immunol 152:. 5368 see (1994).
二価より多い抗体も考えられる。 Antibodies with more than two valencies are contemplated. 例えば、三重特異性抗体を調製することができる。 For example, it is possible to prepare trispecific antibody. Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。 Tutt, et al. J.Immunol 147:. 60 (1991).

例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたPROポリペプチドの2つの異なるエピトープに結合しうる。 Exemplary bispecific antibodies may bind to two different epitopes on a given PRO polypeptide herein. あるいは、抗-PROポリペプチドのアームは、特定のPROポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、T細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28、又はB7)等の白血球上のトリガー分子又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプターに結合するアームと結合しうる。 Alternatively, the arms of the anti -PRO polypeptide, so as to focus cellular defense mechanisms to the specific PRO polypeptide expressing cells, T cell receptor molecule (e.g. CD2, CD3, CD28, or B7) triggering molecule on a leukocyte such as or Fc [gamma] RI (CD64), capable of binding to the arm which binds to the Fc receptor for Fc [gamma] RII (CD32) and FcγRIII (CD16) IgG such (Fc [gamma] R). また、二重特異性抗体は特定のPROポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。 Bispecific antibodies may also be used to localize cytotoxic agents to cells which express a particular PRO polypeptide. これらの抗体はPRO結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。 These antibodies PRO-binding arm and cytotoxic agent or a radionuclide chelator, such as EOTUBE, DPTA, DOTA, or an arm that binds to TETA. 興味の対象となる他の二重特異性抗体はPROポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(TF)に結合する。 Another bispecific antibody of interest binds the PRO polypeptide and further binds tissue factor (TF).

5. 5. ヘテロコンジュゲート抗体 ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。 Heteroconjugate Antibodies Heteroconjugate antibodies are also within the scope of the present invention. ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合した抗体からなる。 Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently joined antibodies. このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO91/00360;WO92/200373;EP03089]提案されている。 Such antibodies have, for example, been proposed to target immune system cells to unwanted cells [U.S. Patent 4,676,980 No.], and for treatment of HIV infection [WO91 / 00360; WO92 / 200373; EP03089 ]Proposed. この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。 This antibody, using known methods in synthetic protein chemistry, including those involving crosslinking agents is believed that can be prepared in vitro. 例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。 For example, or by forming a thioether bond using a disulfide exchange reaction, it is possible to create immunotoxins. この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されたものが含まれる。 Examples of suitable reagents for this purpose include those disclosed iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrate Limi date, and for example, in U.S. Pat. No. 4,676,980.

6. 6. エフェクター機能の加工 本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させることが望ましい。 The antibody of the invention with effector function to modify the effector function, it is desirable to improve the effectiveness of the antibody in treating cancer. 例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。 For example, a cysteine ​​residue may be introduced in the Fc region, thereby may be allowing interchain disulfide bond formation in this region. そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を有する可能性がある。 The homodimeric antibody thus generated may have internalization capability and / or increased complement-mediated cell killing and antibody were improved - can have a dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, BJ Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。 Caron et al., J. Exp Med 176:.. 1191-1195 (1992) and Shopes, BJ Immunol 148:. 2918-2922 (1992) reference. また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。 Further, Homodimeric antibodies with enhanced anti-tumor activity, Wolff et al., Cancer research 53: 2560-2565 may be prepared using in has heterobifunctional cross-linking as described in (1993). あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。 Alternatively, an antibody can be engineered that has dual Fc regions and may thereby have enhanced complement lysis and ADCC capabilities. Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。 Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989) reference.

7. 7. 免疫コンジュゲート また、本発明は、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。 The immunoconjugates, the present invention is a chemotherapeutic agent, toxin (e.g., bacteria, fungi, an enzymatically active toxin of plant or animal origin, or fragments thereof) cytotoxic agents, such as, or a radioactive isotope (i.e., a radioconjugate ) relates to an immunoconjugate comprising an antibody that is conjugated with.
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。 Described above Chemotherapeutic agents useful in the generation of such immunoconjugates. 用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。 Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, nonbinding active fragments of diphtheria toxin, (from Pseudomonas aeruginosa) exotoxin A chain, ricin A chain, abrin A chain, modeccin (Modeccin) A chain, alpha - sarcin, & Fodi (Aleurites fordii) proteins, dianthin (dianthin) protein, Fitoraka americana (Phytolaca americana) proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S), momordica tea Lancia (momordica charantia) inhibitors, curcin (curcin), crotin (crotin), sapaonaria officinalis (sapaonaria oficinalis) inhibitor, gelonin (gelonin), mitogellin (mitogellin), restrictocin (restrictocin), phenol mycin (phenomycin), Enomaishin (Enomycin) and trichothecenes ( tricothecene) are included. 放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。 The production of radioconjugated antibodies, a variety of radionuclides are available. 例としては、 212 Bi、 131 I、 131 In、 90 Y及び186 Reが含まれる。 Examples include 212 Bi, 131 I, 131 In , 90 Y and 186 Re.

抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。 Conjugates of the antibody and cytotoxic agent are made using a variety of bifunctional protein coupling agents such as, N- succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), bifunctional imidoesters derivatives (such as dimethyl adipimidate HCL), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis - azido compounds (such as bis (p- azidobenzoyl) hexanediamine), bis - diazonium derivative (bis - (p-diazoniumbenzoyl yl) - ethylenediamine), diisocyanates (triene 2,6 diisocyanate), and bis - active fluorine compounds (1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene, etc.) with It can be created. 例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。 For example, a ricin immunotoxin, Vitetta et al., Science 238: 1098 can be prepared as described in (1987). カーボン-14-標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。 Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyl-diethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for conjugation of radionucleotide to the antibody. WO94/11026参照。 WO94 / 11026 reference.
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。 In another embodiment, for use in pre-targeting of the tumor, the antibody may be conjugated to a "receptor" (such streptavidin), antibody - receptor conjugate is administered to the patient, followed by clarifying agent used by removal of unbound conjugate from the circulation, then the cytotoxic agent (e.g., a radionucleotide) administering conjugated to a "ligand" (avidin, etc.).

8. 8. 免疫リポソーム また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。 Immunoliposomes The antibodies disclosed herein may also be formulated as immunoliposomes. 抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985);Hwangら, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。 Liposomes containing the antibody are, Epstein et al, Proc Natl acad Sci USA, 82:.... 3688 (1985); Hwang et al., Proc natl Acad Sci USA, 77:.... 4030 (1980); and U.S. Patent No. as described in 4,485,045 and EP 4,544,545, are prepared by methods known in the art. 向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。 Liposomes with enhanced circulation time are disclosed in U.S. Patent No. 5,013,556.
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。 Particularly useful liposomes can be generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG- derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。 Liposomes are extruded through filters of defined size, liposomes with the desired diameter are produced. 本発明の抗体のFab'断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。 Fab 'fragments of the antibody of the present invention, Martin et al., J. Biol Chem 257:.. 286-288 as described in (1982), may be conjugated to the liposome through a disulfide exchange reaction. 化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。 A chemotherapeutic agent (such as Doxorubicin) is optionally contained within the liposome. Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。 Gabizon et al, J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989) reference.

9. 9. 抗-PRO抗体の用途 本発明の抗-PRO抗体は様々な有用性を有している。 Anti -PRO antibody applications the present invention the anti -PRO antibodies have various utilities. 例えば、抗-PRO抗体は、PROの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。 For example, the anti -PRO antibodies in diagnostic assays for PRO, e.g., the particular cell, tissue, or used to detect expression in serum. 競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。 Competitive binding assays, direct or indirect sandwich assays and heterogeneous or immunoprecipitation assays conducted in a homogeneous phase [Zola, Monoclonal Antibodies:. A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp 147-158], such as the various diagnostic assay techniques known in the art may be used. 診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。 The antibodies used in the diagnostic assays can be labeled with a detectable moiety. 検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。 Detectable moiety, directly or indirectly, must generate a detectable signal. 例えば、検出可能な部位は、 H、 14 C、 32 P、 35 S又は125 I等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。 For example, the detectable moiety, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S or 125 radioactive isotopes such I, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, or fluorescent or chemiluminescent compound, such as luciferin, or alkaline phosphatase, beta - galactosidase or western may be an enzyme, such as horseradish peroxidase. 抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature 144:945 (1962);Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974);Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981);及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。 Antibodies Any method known in the art for conjugating the detectable moiety is used, Hunter et al thereto, Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et, J. Immunol Meth, 40:.... 219 (1981); and Nygren, J. Histochem and Cytochem, 30: 407 include the method described in (1982).

また、抗-PRO抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのPROのアフィニティー精製にも有用である。 Moreover, anti--PRO antibodies are useful for the affinity purification of PRO from recombinant cell culture or natural sources. この方法においては、PROに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。 In this process, the antibodies against PRO, using methods well known in the art, are immobilized on a suitable support, such a Sephadex resin or filter paper. 次に、固定化された抗体を精製するPROを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したPRO以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。 Then, after contact with a sample containing the PRO to purify the immobilized antibody, the support material in the sample except the bound PRO to the immobilized antibody with a suitable solvent that will remove substantially all cleaning. 最後に、PROを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。 Finally, the support is washed with another suitable solvent that will release the PRO from the antibody.
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。 The following examples are intended to be provided only to illustrate, not intended to limit the scope of the present invention in any way.
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。 All patent and literature references cited herein, incorporated herein by reference.

N. N. 製薬的組成物 本発明の活性PRO分子(例えば、PROポリペプチド、抗-PRO抗体、及び/又は各変異体)並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、免疫関連疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。 Activity PRO molecules of pharmaceutical compositions present invention (e.g., PRO polypeptides, anti -PRO antibody, and / or variants of each) other molecules identified as well in the screening assays disclosed above, the treatment of immune-related diseases for, it can be administered in the form of pharmaceutical compositions. 活性PRO分子の治療製剤、好ましくは本発明のポリペプチド又は抗体は、所望される程度の純度を持つ活性成分を、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。 Therapeutic formulations of the active PRO molecule, the carrier preferably a polypeptide or antibody of the present invention, the active ingredient having a degree of purity that is desired, in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions, which are acceptable optional pharmaceutically, vehicles stored is prepared by mixing with excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]). 許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンズアルコニウムクロライド;ベンズエトニウムクロライド;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、 Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, phosphoric acid, buffers such as citric acid and other organic acids; ascorbic acid and methionine antioxidants including; preservatives (octadecyl dimethyl benzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol; butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclo hexanol; 3-pentanol; and m- cresol, etc.); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; serum albumin, gelatin, or proteins of the immunoglobulin and the like; polyvinyl hydrophilic polymers such as pyrrolidone; glycine, glutamine, スパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)及び/又はトゥイーン(TWEEN)(商品名)、プルロニクス(PLURONICS)(商品名)、及びポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。 Asparagine, histidine, arginine, or amino acids such as lysine; glucose, mannose, or monosaccharides containing dextrin, disaccharides, and other carbohydrates, chelating agents such as EDTA, sucrose, mannitol, sugars such as trehalose or sorbitol; sodium, etc. salt forming counterions; metal complexes (e.g., Zn- protein complexes) and / or tween (tWEEN) (trade name), pluronics (PLURONICS) (trade name), and polyethylene glycol (PEG) nonionic such as including the agent.

本発明のスクリーニングアッセイによって同定された化合物は、当該分野において良く知られた技術を用いて、類似の方法で製剤化することができる。 Compounds identified by the screening assays of the present invention, using standard techniques well known in the art, can be formulated in an analogous manner.
また、リポフェクション又はリポソームをPRO分子を細胞に導入するために利用することができる。 Also be utilized to introduce the lipofection or liposome PRO molecule into cells. 抗体断片が用いられる場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。 Where antibody fragments are used, the smallest inhibitory fragment which specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. 例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。 For example, based upon the variable-region sequences of an antibody, it is possible to design peptide molecules which retain the ability to bind the target protein sequence. このようなペプチドは、化学的に合成でき及び/又は組換えDNA技術によって生成できる。 Such peptides can be generated by synthesized chemically and / or recombinant DNA techniques. 例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。 For example, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993) reference.

ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に一つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。 The formulation herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。 Alternatively, or in addition, the composition is cytotoxic agent may comprise a cytokine or growth inhibitory agent. これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。 Such molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。 The active ingredient, for example, microcapsules prepared by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin - microcapsules and poly (methylmethacrylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (e.g. , liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules), or may be in macroemulsions. これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。 These techniques, Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, are disclosed in A. Ed. (1980).
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。 The formulations to be used for in vivo administration must be sterile. これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。 This is readily accomplished by filtration through sterile filtration membranes.

徐放性製剤を調製してもよい。 Sustained-release preparations may be prepared. 徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。 Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are shaped articles, e.g., films, or in the form of microcapsules. 除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(D)-(-)-3-ヒドロキシブチル酸を含む。 Examples of sustained-release matrices include polyesters, hydrogels (e.g., poly (2-hydroxyethyl - methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactides (U.S. Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and γ- ethyl -L- glutamate, non-degradable ethylene - vinyl acetate, LUPRON DEPOT (trade name) - degradable lactic such as (lactic acid-glycolic acid copolymer and injectable globules leuprolide acetate) - glycolic acid copolymer, poly - (D) - (-) - 3-hydroxybutyric acid. エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。 Ethylene - vinyl acetate and lactic acid - polymer such as glycolic acid enable release of molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins for shorter time periods. カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。 When encapsulated antibodies remain in the body for a long time, they may denature or aggregate by exposure to 37 ° C. moisture, resulting deterioration and possible changes in immunogenicity in biological activity . 合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。 Rational strategies can be devised for stabilization depending on the mechanism involved. 例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S-S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。 For example, if the aggregation mechanism is thio - when is discovered to be intermolecular S-S bond formation through disulfide interchange, stabilization may be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilizing from acidic solutions, controlling moisture content, appropriate addition of Do additives, and may be achieved by developing specific polymer matrix compositions.

O. O. 治療方法 本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性化合物は、例えば、組織への炎症性細胞の浸潤、T細胞増殖の刺激、T細胞増殖の阻害、増加又は減少した血管透過性又はその阻害によって特徴付けられるものを含む、T細胞媒介疾患のような種々の免疫関連疾患及び症状を治療するのに利用することが可能であると考えられている。 Polypeptides, antibodies and other active compounds of the therapeutic method of the present invention, for example, infiltration of inflammatory cells into tissues, stimulation of T cell proliferation, inhibition of T cell proliferation, by increased or decreased vascular permeability or the inhibition thereof including those characterized, it is believed to be be utilized to treat various immune related diseases and conditions, such as T cell mediated diseases.

本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物によって治療される例示的症状又は疾患には、限定されないが、全身性エリテマトーデス、慢性関節リュウマチ、若年性慢性関節炎、変形性関節症、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症誘発性筋疾患(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少症(特発的血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症)、甲状腺炎(グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患(糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎)、特発性脱髄性多発神経障害、Guillain-Barre症候群、及び慢性炎症誘発性脱髄性多発神 Polypeptide, Exemplary conditions or disorders to be treated by the antibodies and other compounds of the present invention include, but are not limited to, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, juvenile chronic arthritis, osteoarthritis, spondyloarthropathies, systemic sclerosis (scleroderma), idiopathic inflammatory induced myopathies (dermatomyositis, polymyositis), Sjogren's syndrome, systemic vasculitis, sarcoidosis, autoimmune hemolytic anemia (immune pancytopenia, paroxysmal sex nocturnal hemoglobinuria), autoimmune thrombocytopenia (idiopathic thrombocytopenic purpura, immune-mediated thrombocytopenia), thyroiditis (grave's disease, Hashimoto's thyroiditis, juvenile lymphocytic thyroiditis, atrophic thyroiditis) , diabetes mellitus, immune renal disease (glomerulonephritis, tubulointerstitial nephritis), idiopathic demyelinating polyneuropathy, Guillain-Barre syndrome, and chronic inflammatory induced demyelinating God 障害のような中枢及び抹消神経系の脱髄性疾患、感染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎及び他の非肝炎性ウィルス)のような肝胆道疾患、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症誘発性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン疾患)のような炎症誘発性及び線維性肺疾患、グルテン感受性腸疾患、及びフィップル疾患、水泡性皮膚疾患を含む自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎、乾癬、喘息のようなアレルギー性疾患、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びジンマシン、好酸球性肺炎のような肺の免疫学的疾患、特発性肺線維症及び高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主の疾患を含む、移植関連疾患が含まれる。 Central and peripheral nervous system demyelinating diseases, such as disorders, infectious hepatitis (A, B, C, D, E hepatitis and other non hepatitis viral) hepatobiliary diseases such as, autoimmune chronic active hepatitis, primary biliary cirrhosis, granulomatous hepatitis, and sclerosing cholangitis, inflammatory-induced bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease) proinflammatory and fibrotic lung diseases such as, gluten sensitive enteropathy, and autoimmune or immune-mediated skin diseases including Whipple's disease, vesicular dermatosis, erythema multiforme and contact dermatitis, psoriasis, allergic diseases such as asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, food hypersensitivity diseases and urticaria, immunologic diseases of the lung such as eosinophilic pneumonia, including idiopathic pulmonary fibrosis and hypersensitivity pneumonia, a disease of graft rejection and graft versus host, include transplantation associated diseases It is.

全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質/組織に対する自己反応性抗体の生成、及び引き続き起こる免疫媒介炎症である。 In systemic lupus erythematosus, the central mediator of disease is the generation of auto-reactive antibodies to self proteins / tissues and the subsequent generation of immune-mediated inflammation. 抗体は、直接又は間接的のいずれかによって組織傷害を媒介する。 Antibodies mediate tissue injury by either directly or indirectly. Tリンパ球が直接に組織傷害へ関与していることは示されていないが、Tリンパ球は自己反応性抗体の発生において必須である。 T lymphocytes have not been shown to be involved directly in tissue injury, T lymphocytes are essential in the development of auto-reactive antibodies. 従って、疾患の発生はTリンパ球へ依存する。 Therefore, occurrence of the disease is dependent on T lymphocytes. 腎臓、肺、筋骨格系、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む多臓器及び系が、臨床的に病気で冒される。 Kidney, lung, musculoskeletal system, mucocutaneous, eye, central nervous system, cardiovascular system, the multi-organ and systems including gastrointestinal tract, bone marrow and blood, are affected clinically ill.

慢性関節リュウマチ(RA)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。 Rheumatoid arthritis (RA) is mainly a chronic systemic autoimmune disease that involves the synovial membrane of multiple joints with resultant injury to the articular cartilage. 病原はTリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己IgGに指向する自己抗体の生成を付随し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。 The pathogenesis is T lymphocyte dependent, rheumatoid factors, accompanied the production of autoantibodies directed against self IgG, immune complexes that attain high levels in joint fluid and blood is formed as a result. 関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる;多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間/体液でもである。 These complexes in the joint, the marked infiltrate of lymphocytes and monocytes into the synovium, followed can induce marked synovial changes; infiltrated by similar cells with the addition of numerous neutrophils if that is also in the joint space / body fluids. 影響を受けている組織は、多くの場合対称的なパターンで主に関節である。 Tissues affected are primarily the joints, often in symmetrical pattern. しかしながら、2つの主な形態の関節外疾患も生じる。 However, extra-articular disease also occurs in two major forms. 一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。 One form localized disorders, vasculitis progressive joint disease and pulmonary fibrosis in progress, and the development of extra-articular disorders involving skin ulcers. 関節外疾患の第2の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、RA疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。 The second form of extra-articular disease is the so called Felty's syndrome, late in the RA disease pathway, sometimes occurs after joint disease has become quiescent, neutropenia, involved in the presence of thrombocytopenia and 脾肥 Univ. これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。 This infarction, associated with a number of organs and vasculitis with formation of skin ulcers and gangrene. 多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し;小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。 Often, the patient sick and have also develop rheumatoid nodules in the subcutis tissue overlying affected joints; nodules have been necrotic centers surrounded by a mixed inflammatory cell infiltrate. RAで生じる可能性のある他の徴候には:心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。 The Other possible symptoms occur in RA: pericarditis, pleuritis, coronary arteritis, interstitial pneumonitis with pulmonary fibrosis, keratoconjunctivitis sicca, and rheumatoid nodules.

若年性慢性関節炎は、多くの場合16才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。 Juvenile chronic arthritis is a chronic idiopathic inflammatory disease which begins below 16 years in many cases. その表現型はRAといくつかの類似点があり;リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。 Its phenotype has RA some similarities; rheumatoid factor are also those which are classified as juvenile rheumatoid arthritis in patients who are positive. この疾患は主な3つのカテゴリー:小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性ものに亜分類される。 The disease is three main categories: small joints (pauciarticular), is a multi-joint (polyarticular) and sub-classified as systemic. 関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。 Arthritis is severe in the cause local destruction, there you it may lead to joint ankylosis and retarded growth. 他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。 Other manifestations can include chronic anterior uveitis and systemic amyloidosis.

脊椎関節症は、一般的にHLA-B27遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。 Spondyloarthropathies, generally associated with the expression of HLA-B27 gene product, a group of diseases with some common clinical features. 疾患には:強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。 Diseases: ankylosis, spondylitis (Sponylitis), Reiter's syndrome (reactive arthritis), arthritis associated with inflammatory bowel disease, spondylitis associated with psoriasis, juvenile onset spondyloarthropathy and undifferentiated spondyloarthropathy It is. 区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎;HLA-B27(血清学的には、クラスI MHCのHLA-B座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎;眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。 Distinguishing features include sacroileitis with or without spondylitis; HLA-B27 (a serologically is defined allele of the HLA-B locus of class I MHC) inflammatory asymmetric arthritis with; ocular inflammation, and absence of autoantibodies associated with other rheumatoid disease. 疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はCD 8+ Tリンパ球であり、クラスI MHC分子により付与される抗原を標的としている細胞である。 The cell most implicated as key to induction of the disease is CD 8+ T lymphocytes, which antigens conferred by class I MHC molecules in cells targeted. CD 8+ T細胞は、MHCクラスI分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスI MHC対立遺伝子HLA-B27と反応する。 CD 8+ T cells, as if it were a foreign peptide expressed by MHC class I molecules, react against the class I MHC allele HLA-B27. HLA-27のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってCD 8+細胞の反応が誘発されると仮定されている。 Epitope of HLA-27 is to mimic the antigenic epitope of a bacterial or other microbial, therefore it is assumed that the reaction of CD 8+ cells is induced.

全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。 Systemic sclerosis (scleroderma) is not known etiology. 疾患の特徴は皮膚の硬化であり;これは活性化炎症プロセスにより誘発される。 Feature of the disease is induration of the skin; this is induced by an active inflammatory process. 強皮症は局部的又は全身的であり:血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり;血管傷害は免疫媒介されうる。 Scleroderma can be localized or systemic: vascular disorder is common and endothelial cell injury in the microvasculature is an early and important event in the development of systemic sclerosis; vascular injury may be immune mediated. 免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。 An immunologic basis is the presence of mononuclear cell infiltrates in the cutaneous disorder, it refers to the presence of anti-nuclear antibodies in many patients. 多くの場合、ICAM-1は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するT細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。 Often, ICAM-1 is a cell surface of fibroblasts upregulated in skin disorders, suggesting that T cells interact with these cells may have a role in the pathogenesis of the disease. 関連する他の器官には:胃腸管:萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動/運動性となっている平滑筋:腎臓:小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖:骨格筋:萎縮、間質性線維症:炎症:肺:間質性肺炎及び間質性線維症:及び心臓:収縮バンド壊死、瘢痕/線維症が含まれる。 Other organs involved include: the gastrointestinal tract: there is atrophy and fibrosis, smooth muscle has resulted as an abnormal peristalsis / properties: Kidney: affecting small arcuate and interlobular arteries, resulting in kidney blood flow cortex is reduced, proteinuria, high nitrogen hematuria and concentricity subcutaneous intimal proliferation affecting hypertension: skeletal muscle: atrophy, interstitial fibrosis: inflammation: lung: interstitial pneumonia and interstitial fibrosis disease: and heart: contraction band necrosis, include scarring / fibrosis.

皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。 Dermatomyositis, idiopathic inflammatory myopathies including polymyositis and others are disorders of chronic muscle inflammation of unknown etiology resulting in muscle weakness. 筋肉損傷/炎症は多くの場合対称的で進行性である。 Muscle injury / inflammation is often symmetric and progressive. 自己抗体は多くの形態と関連している。 Autoantibody is associated with many forms. これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びRNAに対して産生されてその機能を阻害する。 These myositis-specific autoantibodies, components of the protein synthesis, have been produced against the protein and RNA and inhibit its function.
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。 Sjogren's syndrome is due to functional disruption of immune-mediated inflammation, followed by the tear glands and salivary glands. この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。 The disease with or without inflammation connective tissue disease. この疾患は、双方ともが小RNA-タンパク質複合体であるRo及びLa抗原に対する抗体産出に関連している。 The disease, both are associated with autoantibody production against Ro and La antigens are small RNA- protein complexes. 障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。 Lesions result leading to keratoconjunctivitis sicca, xerostomia, with other manifestations or associations including bilary cirrhosis, peripheral or sensory neuropathy, and palpable purpura.

全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血/壊死/変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。 Systemic vascular inflammation disease by main obstacle is inflammation and subsequent damage to blood vessels and, on the tissue supplied by the vessel affected as a result cause ischemia / necrosis / degeneration, in the final end-organ is a disease that it becomes dysfunction in some cases. また、第2の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。 Vasculitides can also occur as a secondary disorder (sequelae to), or other immune-inflammatory mediated diseases such as rheumatoid arthritis, systemic sclerosis, etc., may in particular sequelae such as diseases related to immune complex formation occurs is there. 主な全身性血管炎症症グループの疾患には:全身壊死性血管炎:多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎:ヴェゲナー肉芽腫症;リンパ腫様肉芽腫症:及び巨細胞動脈炎が含まれる。 Diseases of principal systemic vascular inflammation diseases Group: systemic necrotizing vasculitis: multi arteritis nodules (polyarteritis nodosa), allergic vasculitis, and granulomatous disease, multi vasculitis: Wegener's granulomatosis; lymphoma like granulomatous disease: and it includes giant cell arteritis. 種々の血管炎には:粘膜皮膚リンパ節症候群(MLNS又は川崎病)、単離したCNS血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。 The Miscellaneous vasculitides include: mucocutaneous lymph node syndrome (MLNS or Kawasaki's disease), isolated CNS vasculitis, Behetto (Behet's) disease, thromboangiitis obliterans (Buerger's disease) and cutaneous necrotizing fine phlebitis ( venulitis) are included. 列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてADCC、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。 Most types of pathogenic mechanisms of the listed vasculitis is believed to primarily immunoglobulin complexes attached to the vessel wall, followed by ADCC, due to the inflammatory response is induced through complement activation, or both ing.

サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。 Sarcoidosis, there are epithelioid granulomas in nearly any tissue in the body, characterized by being almost universally included in the lung, a condition in which the etiology is not known. 病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。 The pathogenesis is related to the activity macrophages and lymphocytes remaining in the disease site, followed by chronic sequelae as a result of the release of local or systemic active substances are released from these cell types occurs .
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいては、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び/又はADCC/Fc-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。 Autoimmune hemolytic anemia, immune aplastic anemia, autoimmune hemolytic anemia including paroxysmal nocturnal hemoglobinuria is (in some cases, other blood cells including platelets) red blood cells expressed on the surface is due to the result of antibody reactive with the antigen are produced, complement mediated lysis and / or ADCC / Fc-receptor - through the intermediary mechanism, it is a reflection of the removal of those antibody coated cells.
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ADCC又はFc-レセプター-媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。 In autoimmune thrombocytopenia including thrombocytopenic purpura, and immune-mediated thrombocytopenia platelets in other clinical settings (setting), the antibody or complement attaching to platelets and subsequent complement lysis, ADCC or Fc- receptor - It occurs as a result of the removal-mediated mechanism.

グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。 Grave's disease, Hashimoto's thyroiditis, juvenile lymphocytic thyroiditis, and thyroiditis, including atrophic thyroiditis, with production of antibodies that react with most cases specifically the protein present in the thyroid gland, self against thyroid antigens it is due to the result of the immune response. 実験用モデルには:内在的モデルラット(BUF及びBBラット)及びチキン(肥満チキン種);誘導性モデル:チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。 The experimental model: intrinsic model rats (BUF and BB rats) and chicken chickens (obese chicken strain); inducible models: thyroglobulin include immunization of animals with thyroid microsomal antigen (thyroid peroxidase).
I型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり;この破壊は自己抗体及び自己反応性T細胞により媒介される。 Type I diabetes mellitus or insulin-dependent diabetes is the autoimmune destruction of pancreatic islet β cells; this destruction is mediated by auto-antibodies and autoreactive T cells. また、インシュリン又はインシュリン様レセプターに対する抗体は、インシュリン-非-反応性の表現型を産出することができる。 Antibodies to insulin or insulin-like receptor, insulin - non - can yield a reactive phenotype.

糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はT細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び/又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はT細胞媒介傷害が生じることによるものである。 Immune mediated renal diseases, including glomerulonephritis and tubulointerstitial nephritis, directly or respond to other non-renal antigens by the results autoreactive antibodies or T cells are produced against renal antigens, indirectly as a result of the deposition of antibodies and / or immune complexes in the kidney, it is by antibody or T cell mediated cytotoxicity occurs renal tissue. よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。 Thus other immune-mediated diseases that result in the formation of immune complexes, immune-mediated renal disease as an indirect sequelae is induced. 直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出/誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。 Both direct and indirect immune mechanisms result as an inflammatory reaction occurs such fault development in renal tissues is produced / induced organ function is impaired, in some cases renal dysfunction progresses. 体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。 Both the humoral and cellular immune mechanisms can be involved in the pathogenesis of the disorder.

多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群;及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。 Demyelinating diseases of the central and peripheral nervous systems such as multiple sclerosis, idiopathic demyelinating polyneuropathy or Guillain - Barre syndrome; and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, an autoimmune basis, nerve and demyelination occurs, it is believed that due to the result of damage caused to oligodendrocytes or to myelin directly. MSにおいて、疾患の誘発及び進行はTリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。 In MS, disease induction and progression there is evidence to suggest to depend on T lymphocytes. 多発性硬化症は、Tリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。 Multiple sclerosis is a T lymphocyte-dependent, a demyelinating disease that has either a relapsing-remitting course or a chronic progressive course. 病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。 The etiology is not well known, virus infection, all of the genetic predisposition, environmental and autoimmune contributes. 障害はT細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマクロファージの浸潤を含み;CD 4+ Tリンパ球は障害において優先的な細胞型であった。 Disorders preferential wetting of T cell-mediated microglial cells, and include macrophage infiltration; CD 4+ T lymphocytes was predominant cell type in the fault. オリゴデンドロサイトの細胞死及び続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Tリンパ球の駆動によると思われる。 Although cell death and subsequent mechanisms demyelination oligodendrocytes is not well known, probably due to the driving of the T lymphocytes.

好球性肺炎;特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。 Eosinophilic pneumonia; The Inflammatory and Fibrotic Lung Disease, such as idiopathic pulmonary fibrosis and hypersensitivity pneumonitis, a disregulated immune-inflammatory response is associated. 反応を阻害することは治療的に有益なことである。 Inhibiting reactions are therapeutically be beneficial.
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、Tリンパ球に依存して発生する。 Bullous skin diseases, autoimmune or immune-mediated skin diseases including erythema multiforme and contact dermatitis are mediated by autoantibodies, generated depending on T lymphocytes.
乾癬はTリンパ球媒介炎症疾患である。 Psoriasis is a T lymphocyte-mediated inflammatory disease. 障害はTリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。 Disorders T lymphocytes include infiltration of macrophages and antigen processing cells, and some neutrophils.
喘息;アレルギー性鼻炎;アトピー性皮膚炎;食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はT細胞依存性である。 Asthma; allergic rhinitis; atopic dermatitis; allergic diseases, including food hypersensitivity and urticaria are T cell dependent. この疾患は炎症により誘発されるTリンパ球、及びIgE媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。 The disease is primarily mediated T lymphocytes induced by inflammation, and IgE-mediated inflammation, or by a combination of both.
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(GVHD)を含む移植関連疾患は、Tリンパ球依存性であり;Tリンパ球の機能を阻害することで改善される。 Transplantation associated diseases including graft rejection and graft-versus-host disease (GVHD) is, T lymphocyte-dependent; be improved by inhibiting the function of T lymphocytes.

免疫及び/又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがAIDS、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎、ヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(MLRを刺激する分子(又は誘導体/アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)、MLRを刺激する(分子/誘導体/アゴニスト)を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された(例えばHIV感染)又は医原性(例えば化学療法)免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応を増強することができる免疫欠損疾患、及び異常増殖が含まれる。 Immune and / or other diseases mediated is beneficial to the inflammatory response, but not limited to not intended to viral infection (limitation AIDS, A-type, B, C, D type and E-type hepatitis, herpes), bacterial infection, fungal infection, using protozoal infections and parasitic infections (the molecules that stimulate MLR (or derivatives / agonists) in therapy, it is possible to enhance the immune response against infectious agents), stimulate MLR (molecular / derivatives / agonists) were used to treat, inherited, acquired, enhance the immune response to medical conditions infection induced (as in HIV infection), or iatrogenic (e.g., chemotherapy) immunodeficiency diseases immunodeficiency diseases can be, and neoplasia include.

幾つかのヒト癌患者において、腫瘍性細胞上の抗原に対する抗体及び/又はTリンパ球が発生することが示されている。 In some human cancer patients, antibodies and / or T lymphocytes to antigens on neoplastic cells has been shown to occur. また、免疫応答の増加によって、その特定の腫瘍の拒絶又は退行を引き起こすことができることが、腫瘍形成の動物モデルにおいて示されている。 Further, by increasing the immune response, that can cause rejection or regression of that particular tumor, it has been shown in animal models of tumor formation. MLRにおけるTリンパ球の応答を高める分子(又はアゴニストの方法で同じレセプターへ影響を与える小分子アゴニスト又は抗体)を、癌治療へ治療的に用いることができる。 The molecule (or small molecule agonists or antibodies provide a method in effect to the same receptor agonist) which enhances the response of T lymphocytes in MLR, it can be used therapeutically to cancer therapy. また、MLRにおいてリンパ球の応答を阻害する分子は、腫瘍形成の間に、インビボにおいて腫瘍に対する免疫応答を抑制する;このような分子は、腫瘍性細胞そのものによって発現されるか、或いは他の細胞の腫瘍がその発現を誘導できる。 Molecules that inhibit the response of lymphocytes in MLR, during tumor formation, inhibiting the immune response to the tumor in vivo; Such a molecule is expressed by the neoplastic cells themselves, or other cells tumor can induce its expression. このような分子の拮抗効果(抗体、小分子又は他の手段の何れかとともに)は、免疫性腫瘍拒絶反応を高める。 Such molecules antagonistic effect of (antibody, with either a small molecule or other means) enhances immune tumor rejection.

その上に、炎症誘発性特性を有する分子の阻害作用は、再潅流傷害;発作;心筋梗塞;アテローム性動脈硬化症;急性肺障害;出血性ショック;火傷;敗血症/敗血性ショック;急性腎尿細管壊死;子宮内膜症;変形性関節疾患及び膵炎にとって治療的に有益である。 Thereon, inhibition of molecules with proinflammatory properties, reperfusion injury; stroke; myocardial infarction; atherosclerosis; acute lung injury; hemorrhagic shock; burns; sepsis / septic shock; acute renal tubular necrosis; endometriosis; a therapeutically beneficial for degenerative joint disease and pancreatitis. 本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入(鼻腔内、肺内の)経路などにより投与される。 The compounds of the present invention, for example, polypeptides or antibodies, a mammal, preferably a human, with known methods, such as intravenous administration by continuous infusion over a as a bolus or a predetermined time, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral spinal, subcutaneous, joints, intrasynovial, intrathecal, oral, is administered topically, or by inhalation (intranasal, intrapulmonary) routes and the like. ポリペプチド及び抗体の静脈内又は吸入投与が好ましい。 Intravenous or inhaled administration of polypeptides and antibodies is preferred. 免疫アジュバンド療法では、抗癌剤の投与のような他の治療的養生法を本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わせてもよい。 In immunoadjuvant therapy, the protein of the present invention to other therapeutic regimens, such administration of an anti-cancer agent, may be combined with the administration of the antibody or compound. また、本発明の免疫アジュバンドで治療される患者は、抗癌剤(化学療法剤)又は放射線治療を受けてもよい。 Further, the patient to be treated with a the immunoadjuvant of the invention may also receive an anti-cancer agent (chemotherapeutic agent) or radiation therapy. このような化学治療剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。 Such chemotherapeutic agents Preparation and dosing schedules may be used according to manufacturers' instructions or as determined empirically by the skilled practitioner. そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service MC Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。 Such preparation to chemotherapy and dosing schedules are also described in Chemotherapy Service MC Perry ed., Williams & Wilkins, Baltimore, are also described in MD (1992). 化学治療剤は、免疫アジュバンドの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。 Chemotherapeutic agents, prior to administration of the immunoadjuvant or subsequently may be administered, or may be given simultaneously therewith. その上に、抗-エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗-プロゲステロン(EP 616812参照)を、これらの分子について知られた用量で与えてもよい。 Moreover, the anti - estrogen compounds, such as anti-such as an anti-estrogen compound or onapristone tamoxifen such - progesterone (see EP 616812), may be given in dosages known for such molecules. また、他の免疫疾患関連又は腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばCD20、CD11a、CD18、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、又は血管内皮因子(VEGF)に結合する抗体を投与することも好ましい。 Also, antibodies to other immune disease associated or tumor associated antigens, for example CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, or it is also preferable to administer antibodies which bind to vascular endothelial factor (VEGF). あるいは、又はその上に、ここで開示される同じ又は二つ以上の異なる抗原と結合する二つ以上の抗体を、患者へ同時投与してもよい。 Alternatively, or thereon, two or more antibodies binding the same or two or more different antigens disclosed herein may be coadministered to the patient. 時折、患者にサイトカインを投与することも有利である。 Occasionally, it is also advantageous to administer one or more cytokines to the patient. 好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドを、成長阻害剤と同時投与する。 In a preferred embodiment, the polypeptide of the present invention are coadministered with a growth inhibitory agent. 例えば、まず最初に成長阻害剤を投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与する。 For example, first administering the growth inhibitory agent is first, followed by administering a polypeptide of the present invention. しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。 However, it is also conceivable to simultaneous administration or administration first. 成長阻害剤についての適切な用量は、現在用いられている量であり、成長阻害剤と本発明のポリペプチドとの組み合わせ(相乗)効果により減少させてもよい。 Suitable dosages for the growth inhibitory agent is an amount that is currently used, in combination with a polypeptide of the growth inhibitory agent and the present invention (synergist) may be reduced by the effect. 免疫関連疾患の治療又は感度の縮小のためには、本発明の化合物の適切な用量は、上記に定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。 For the reduction of the treatment or the sensitivity of immune related disease, the appropriate dosage of the compounds of the present invention, the type of disease to be treated, as defined above, the severity and course of the disease, in the prevention or therapeutic purposes whether the agent is administered, previous therapy, depending on the clinical history and response to the agent of the patient, and the discretion of the attending physician. 薬剤は、患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。 Agent is suitably administered at one time or over a series of treatments to the patient.

例えば、1又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のどちらでも、例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約1μg/kgから15mg/kg(例えば、0.1−20mg/kg)のポリペプチド又は抗体が、患者に投与するための最初の候補用量である。 For example, either one or more separate administrations, or by continuous infusion, for example, depending on the type and severity of the disease, about 1 [mu] g / kg from 15 mg / kg (e.g., 0.1-20 mg / kg) polypeptide or antibody is an initial candidate dosage for administration to the patient. 典型的な1日の用量は、上記の要因に応じて、約1μg/kgから100mg/kg又はそれ以上であろう。 A typical daily dosage, depending on the factors mentioned above, might range from about 1μg / kg 100mg / kg or more. 数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。 For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is sustained until a desired suppression of disease symptoms. しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。 However, other dosage regimens may be useful. 従来の技術及びアッセイによって、この治療の進行は容易にモニターされる。 By conventional techniques and assays, progress of this therapy is easily monitored.

P. P. 製造品 本発明のその他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。 In another embodiment of the invention, an article of manufacture containing materials useful for the diagnosis or treatment of the disorders described above is provided. この製造品は容器とラベルとを含んでなる。 The article of manufacture comprises a container and a label. 好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。 Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, and test tubes. 容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。 The containers may be formed from a material such as glass or plastic. 容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。 The container holds a composition which is effective for diagnosing or treating the condition and may have a sterile access port (for example the container was an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle that may be). 組成物中の活性剤は本発明のポリペプチド又は抗体である。 The active agent in the composition is a polypeptide or antibody of the present invention. 容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。 Label on, or associated with, the container indicates that it is used for diagnosing or treating the condition of the composition is selected. 製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容される緩衝液を含む第2の容器を具備してもよい。 The article of manufacture further phosphate-buffered saline, may comprise a second container comprising a pharmaceutically-acceptable buffer, such as Ringer's solution and dextrose solution. さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。 Furthermore, other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and package inserts may also include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including with instructions for use.

Q. Q. 免疫関連疾患の診断及び予後 細胞表層タンパク質、例えばある免疫関連疾患において過剰発現するタンパク質は、候補薬や疾患療法にとって優れた標的である。 Diagnosis and Prognosis cell surface proteins of immune-related diseases, such as proteins which are overexpressed in certain immune related diseases, are excellent targets for drug candidates or disease treatment. 免疫関連疾患で増幅した遺伝子によってコードされている分泌タンパク質に加えて、これと同じタンパク質には、これら疾患の診断及び予後において更なる用途があることが見出されている。 In addition to the secreted proteins encoded by the genes amplified in immune related disease, the same protein as this has been found that additional use in the diagnosis and prognosis of these diseases. 例えば、多発性硬化症、リュウマチ関節炎、又はその他の免疫関連疾患において増幅した遺伝子のタンパク質生産物に対する抗体は、診断上に又は予後兆候として利用できる。 For example, antibodies can be used as diagnostics or prognostics to protein products of genes amplified in multiple sclerosis, rheumatoid arthritis or other immune-related diseases.
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現した遺伝子(「マーカー遺伝子産物」)によってコードされたタンパク質の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。 For example, antibodies, including antibody fragments, can be used to qualitatively or quantitatively detect the amplified or overexpressed genes of the protein encoded by the ( "marker gene products") expression. 抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又はこの分野で知られた他の技術によってモニターできる。 The antibody preferably is equipped with a detectable, eg, fluorescent label, and binding can be monitored by light microscopy, flow cytometry, fluorimetry, or other techniques known in the art. 過剰発現している遺伝子が細胞表層タンパク質をコードする場合には、これらの技術は特に適している。 If the genes that are overexpressed encodes a cell surface protein, these techniques are particularly suitable. このような結合アッセイは、上記に記載のように原則的に実施される。 Such binding assays are essentially carried out as described above.

マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。 In situ detection of antibody binding to the marker gene products can be performed, for example, by immunofluorescence or immunoelectron microscopy. この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。 For this purpose, a histological specimen is removed from the patient, preferably by overlaying the antibody on a biological sample, and a labeled antibody is applied to it. また、この手法によって、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布の決定を可能にする。 Furthermore, this technique allows the determination of the distribution of the marker gene product in the tissue examined. 当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。 Those skilled in the art that the readily available a wide variety of histological methods for in situ detection will be apparent.

以下の実施例は例示目的のためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。 The following examples are intended to be provided only for illustrative purposes and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献は、その全体を出典明示によりここに取り入れる。 All patent and literature references cited herein are incorporated in their entirety herein by reference.

(実施例) (Example)
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。 All other commercially available reagents referred to in the examples were used according to manufacturer's instructions unless otherwise indicated. ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。 The source of those cells have been identified the following examples, and throughout the specification, by ATCC accession numbers is the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.

実施例1:ヒトPRO1031をコードするcDNAクローンの単離 Example 1: Isolation of cDNA clones Encoding Human PRO1031
Swiss-Prot公的データベースの約950の公知の分泌タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列(存在すれば、分泌シグナル配列を含む)を、発現配列タグ(EST)データベースの検索に使用した。 (If present, it comprises a secretion signal sequence) extracellular domain (ECD) sequence of about 950 known secreted proteins Swiss-Prot public database were used to search expressed sequence tag (EST) databases. ESTデータベースは、公的データベース(例えば、GenBank、Merck/Wash U.)及び独自に開発したESTデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含んだ。 EST databases, public databases (eg, GenBank, Merck / Wash U.) including and own EST database was developed (LIFESEQ (registered trademark), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) a. 検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、EST配列の6フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として実施した。 The search was performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) with as a comparison of the ECD protein sequences for a 6 frame translation of the EST sequences. 公知のタンパク質をコードせず、70のBlastスコア(90の場合もある)又はそれ以上となった比較を、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)でクラスター化し、コンセンサスDNA配列へ組み立てた。 Not encode known proteins, the comparison becomes (also some cases 90) or greater Blast score of 70, clustered in the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington), consensus DNA It was assembled into an array.
phrapを用いて、他の同定されたEST配列に関連する初期仮想配列断片(コンセンサスアセンブリ)を構築した。 Using phrap, it was constructed initial virtual sequence fragment (consensus assembly) associated with the other identified EST sequences. 上記にて検討したEST配列のソースを用いて、可能な限りこのコンセンサス配列を伸張するために、初期コンセンサスDNA配列をBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長した。 Using the source of EST sequences discussed in the above, in order to stretch the consensus sequence as far as possible, to extend the initial consensus DNA sequence using repeated cycles of BLAST and phrap. このコンセンサスアセンブリの結果をDNA47332と称する。 The results of this consensus assembly is referred to as DNA47332.

コンセンサスアセンブリを含有する一つの配列である、W74558(クローン344649)をさらに調査した。 An array of one containing consensus assembly was further investigated W74558 (clone 344649). 配列はIMAGEconsortiumから得られたもので、これを分析した。 Sequence was derived from IMAGEconsortium, were analyzed. Lennonら, Genomics 33:151(1996)。 Lennon et al., Genomics 33: 151 (1996). DNA配列は、PRO1031の全長DNA配列[ここで、DNA59294-1381と命名される](配列番号:1)及びPRO1031の誘導タンパク質配列(UNQ516)(配列番号:2)を与えた。 DNA sequences, full-length DNA sequence for PRO1031 [herein designated as DNA59294-1381] (SEQ ID NO: 1) and the derived protein sequence for PRO1031 (UNQ516) (SEQ ID NO: 2) gave.
DNA59294-1381の全核酸配列を図1(配列番号:1)に示す。 The entire nucleic acid sequence of DNA59294-1381 Figure 1 (SEQ ID NO: 1). クローンDNA59294-1381は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置42-44に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置582-584の停止コドンで終端する(図1)(配列番号:1)。 Clone DNA59294-1381 contains a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 42-44 and ending at the stop codon at nucleotide positions 582-584 (Figure 1) (SEQ ID NO: 1 ). 予測されるポリペプチド前駆体は180アミノ酸長である(図2)(配列番号:2)。 The predicted polypeptide precursor is 180 amino acids long (Figure 2) (SEQ ID NO: 2). 図2(配列番号:2)に示した全長PRO1031(UNQ516)タンパク質は、約20,437の見かけ分子量及び約9.58のpIを有する。 Figure 2 (SEQ ID NO: 2) full-length PRO1031 (UNQ516) protein shown in, has about 20,437 apparent molecular weight and about 9.58 to pI of. クローンDNA59249-1381はATCCに寄託され、寄託番号209866が付与されている。 Clone DNA59249-1381 has been deposited with ATCC, accession number 209866 has been granted. ここで提供された配列にいくつかの配列化における不規則性又は誤りがある場合、寄託されたクローンはDNA59624−1381(配列番号:1)として正しい配列を含むと理解される。 If there are irregularities or errors in some sequences into sequences provided herein, deposited clone DNA59624-1381 (SEQ ID NO: 1) is understood to include the correct sequence as. 更に、ここで提供された配列は既知の配列決定法の結果である。 Furthermore, sequences provided herein are the result of known sequencing methods.
全長PRO1031ポリペプチドのアミノ酸配列(UNQ516)(配列番号:2)の分析は、それがここでIL-17Bと命名された、新規なインターロイキン-17相同体であることを示唆している。 Full-length PRO1031 polypeptide amino acid sequence (UNQ516) (SEQ ID NO: 2) Analysis of it was named IL-17B herein suggest that it is a novel interleukin-17 homolog.
配列番号:2のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:2のおよそアミノ酸1-20であることが明らかである。 SEQ ID NO: by further analysis of the amino acid sequence, the putative signal peptide is SEQ ID NO: it is clear that approximately amino acids 1-20 of 2. N-グリコシル化部位は配列番号:2のおよそアミノ酸75-78である。 N- glycosylation site of SEQ ID NO: 2 is approximately amino acids 75-78. IL-17と配列同一性を有する領域はおよそアミノ酸96-180である。 Region having sequence identity with IL-17 is approximately amino acids 96-180. 対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。 Corresponding nucleotides can be routinely determined from the sequences provided herein.

実施例2:ヒトPRO1122をコードするcDNAクローンの単離 発現配列タグ(ECD)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、ESTを同定した。 Example 2: Isolation expressed sequence tag cDNA Clones Encoding Human PRO1122 (ECD) DNA database searches (LIFESEQ (R), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) were identified EST. ESTはDNA49665とも称されるIncyte1347523であった。 EST was both DNA49665 referred Incyte1347523. DNA49665に基づいて、1)PCRにより興味ある配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1122の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。 Based on DNA49665, 1) to identify a cDNA library containing sequences of interest by PCR, and 2) PRO1122 a clone of the full-length coding sequence for use as probes to isolate, oligonucleotides were synthesized. [例えば、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989);Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。 [E.g., Sambrook, etc., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Dieffenbach like, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
正方向及び逆方向PCRプライマーは一般に20から30ヌクレオチドの範囲であり、約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計されることが多い。 Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000bp length. プローブ配列は典型的には40−55bp長である。 The probe sequences are typically 40-55bp long. 或る場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きいとき付加的オリゴヌクレオチドが合成される。 In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is about 1-1.5kbp greater. 全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAをAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyのように、PCRプライマー対でのPCR増幅によってスクリーニングした。 In order to screen several libraries for a full-length clone, Ausubel like DNA from the libraries, as Current Protocols in Molecular Biology, it was screened by PCR amplification with the PCR primer pair. ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。 A positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.

PCRプライマー(正方向、逆方向及びハイブリダイゼーション)を合成した: PCR primers (forward, reverse and hybridization) were synthesized:
正方向PCRプライマー 5'-ATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCG-3'(配列番号:19) Forward PCR primer 5'-ATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCG-3 '(SEQ ID NO: 19)
逆方向PCRプライマー 5'-GGGACGTGGATGAACTCGGTGTGG-3'(配列番号:20) Reverse PCR primer 5'-GGGACGTGGATGAACTCGGTGTGG-3 '(SEQ ID NO: 20)
ハイブリダイゼーションプローブ: Hybridization probe:
5'-TATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCGAGTGCCTGTGCAGAG-3'(配列番号:21) 5'-TATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCGAGTGCCTGTGCAGAG-3 '(SEQ ID NO: 21)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅してスクリーニングした。 In order to screen several libraries for a source of a full-length clones were screened by PCR amplification with the PCR primer pair identified above DNA from the libraries. 次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1122遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。 A positive library was then used to isolate clones encoding the PRO1122 gene using the probe oligonucleotide and one of the PCR primers.

cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織から単離した。 RNA for construction of the cDNA libraries was isolated from human fetal lung tissue. cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。 cDNA libraries used to isolate the cDNA clones were constructed by standard methods using Invitrogen, San Diego, commercially available reagents such as those from CA. cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端(blunt)でSalIヘミリン酸化アダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。 The cDNA was primed with oligo dT containing a NotI site, linked to the SalI Hemirin oxide adapters blunt (blunt), cleaved with NotI, and approximate size classification by gel electrophoresis, a suitable cloning vector (pRKB or pRKD etc. ; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain the SfiI site; Holmes etc., Science, 253: a 1278-1280 (1991)), in the unique XhoI and NotI sites, was cloned in a predetermined direction.
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、PRO1122の全長DNA配列[ここで、DNA62377-1381-1)と命名される](配列番号:3)及び誘導タンパク質PRO1122配列(UNQ516)(配列番号:4)が得られた。 DNA sequencing of the clones isolated as described above, [wherein, DNA62377-1381-1) and are named 'full length DNA sequence of the PRO1122 (SEQ ID NO: 3) and derived protein PRO1122 sequence (UNQ516) (SEQ ID NO: 4) was obtained.

DNA62377-1381-1(配列番号:3)の全ヌクレオチド配列を図3(配列番号:3)に示す。 DNA62377-1381-1 (SEQ ID NO: 3) All 3 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of the show. クローンDNA62377-1381-1(配列番号:3)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号:3(図3)のヌクレオチド位置50−52に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置641−643の停止コドンで終端する。 Clone DNA62377-1381-1 (SEQ ID NO: 3) contains a single open reading frame, SEQ ID NO: 3 with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 50-52 (Fig. 3), and nucleotide positions 641 terminating at -643 of the stop codon. 予測されるポリペプチド前駆体は197アミノ酸長である(図4)(配列番号:4)。 The predicted polypeptide precursor is 197 amino acids long (Fig. 4) (SEQ ID NO: 4). 図4に示した全長PRO1122タンパク質(UNQ561)(配列番号:4)は、約21765の見積もり分子量及び約8.53のpIを有する。 4 full length shown in PRO1122 protein (UNQ561) (SEQ ID NO: 4) has about 21,765 estimated molecular weight and about 8.53 to pI of. クローンDNA62377-1381-1は1998年12月22日にATCCに寄託され、寄託番号203552が付与されている。 Clone DNA62377-1381-1 has been deposited with the ATCC on December 22, 1998, deposit number 203552 has been granted. ここで提供された配列にいくつかの配列化における不規則性又は誤りがある場合、正しい配列は寄託された配列である。 If there are irregularities or errors in some sequences into sequences provided herein, it is a sequence correct sequence was deposited. さらにここで提供された全ての配列は公知の配列化技術の結果によるものである。 Furthermore all sequences provided herein are those that result from the known sequence technique.
単離された全長PRO1122(UNQ561)のアミノ酸配列の分析は、それがIL-17と類似性を有することを示唆し、よってPRO1122(UNQ561)が新規なサイトカインとなりうるし、ここでIL-17Cと命名されることが示されている。 Analysis of the amino acid sequence of the isolated full-length PRO1122 (UNQ561) may nomenclature suggests that it possesses similarity with IL-17, thus to PRO1122 (UNQ561) may be a novel cytokine, wherein the IL-17C is it has been shown that the. また図4(配列番号:4)には、IL-17と配列同一性を有する領域、ロイシンジッパーパターン、シグナルペプチドのおよその位置が示されている。 The 4 (SEQ ID NO: 4), the region having sequence identity with IL-17, leucine zipper pattern, the approximate location of the signal peptide is shown.

実施例3:ヒトPRO10272をコードするcDNAクローンの単離 Example 3: Isolation of cDNA clones Encoding Human PRO10272
Swiss-Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列(存在すれば、分泌シグナル配列を含む)を、GenBankのゲノムDNA配列を検索するために使用した。 (If present, comprises a secretion signal sequence) to about 950 known extracellular domain (ECD) sequences of secreted proteins from Swiss-Prot public database were used to search the GenBank genomic DNA sequence. 検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、EST配列の6フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として実施した。 The search was performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) with as a comparison of the ECD protein sequences for a 6 frame translation of the EST sequences. 公知のタンパク質をコードせず、70のBlastスコア(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)でクラスター化し、コンセンサスDNA配列へ組み立てた。 Did not encode known proteins were compared with (also cases 90) or greater Blast score of 70, the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) were clustered, consensus DNA sequence It was assembled to.
コンセンサスDNA配列を、上記に記載したようにphrapを用いて他のEST配列に関連して組み立てた。 A consensus DNA sequence was assembled relative to other EST sequences using phrap as described above. このコンセンサス配列を、ここでDNA146646と命名する。 This consensus sequence is designated herein as DNA146646. 幾つかのケースでは、このコンセンサス配列は中間コンセンサスDNA配列から誘導され、それは、上記において検討したEST配列のソースを用いて中間コンセンサス配列が可能な限り伸張するように、BLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させたものである。 In some cases, the consensus sequence is derived from the intermediate consensus DNA sequence, which, as an intermediate consensus sequence is extended as far as possible using the sources of EST sequences discussed above, the repeated cycles of BLAST and phrap it is obtained by extended using.

DNA146646コンセンサス配列に基づいて、1)PCRによって対象である配列を含むcDNAライブラリを同定するため、並びに2)PRO10272の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。 DNA146646 Based on consensus sequences, 1) to identify a cDNA library containing a sequence that is subject by PCR, and 2) PRO10272 a clone of the full-length coding sequence of for use as probes to isolate, synthetic oligonucleotides did. 正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20〜30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。 Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000bp length. プローブ配列は、典型的には40−55bp長である。 Probe sequences are typically 40-55bp long. 幾つかの場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きな場合には更なるオリゴヌクレオチドを合成した。 In some cases, it was synthesized additional oligonucleotides when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. 全長クローンに関して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular BiologyのようにPCRプライマー対でのPCR増幅によってスクリーニングした。 In order to screen several libraries relative to the full-length clone, DNA from the libraries, Ausubel et al., Supra, was screened by PCR amplification with the PCR primer pair as Current Protocols in Molecular Biology. 次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて興味ある遺伝子をコードするクローンを単離することに使用した。 A positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.

PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した: A pair of PCR primers (forward and reverse) were synthesized:
正方向PCRプライマー: Forward PCR primer:
5'-GTTGCATTCTTGGCAATGGTCATGGGA-3'(配列番号:22) 5'-GTTGCATTCTTGGCAATGGTCATGGGA-3 '(SEQ ID NO: 22)
逆方向PCRプライマー: Reverse PCR primer:
5'-GGTCCATGTGGGAGCCTGTCTGTA-3'(配列番号:23) 5'-GGTCCATGTGGGAGCCTGTCTGTA-3 '(SEQ ID NO: 23)
さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブをコンセンサスDNA146646配列から構築した: Furthermore, to construct a synthetic oligonucleotide hybridization probe having the following nucleotide sequence from the consensus DNA146646 sequence:
ハイブリダイゼーションプローブ: Hybridization probe:
5'-CAGCAGCTCCTCAGAGGTGTCCTGCCCTTTGCTGGGGCAGCAGCT-3' 5'-CAGCAGCTCCTCAGAGGTGTCCTGCCCTTTGCTGGGGCAGCAGCT-3 '
(配列番号:24) (SEQ ID NO: 24)

cDNAライブラリーの構築のためのRNAをヒト精巣組織から単離した。 The RNA for construction of the cDNA libraries was isolated from human testis tissue. cDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。 cDNA libraries used to isolate the cDNA clones were constructed by standard methods using Invitrogen, San Diego, commercially available reagents such as those from CA. cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミリン酸化アダプターへ平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991))に独特のXhol及びNotI部位においてクローン化した。 The cDNA was primed with oligo dT containing a NotI site, the SalI Hemirin oxide adapters linked with blunt, cleaved with NotI, and the approximate size divided by gel electrophoresis, in a predetermined direction a suitable cloning vector ( pRKB or pRKD; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain the SfiI site; Holmes etc., Science, 253: 1278-1280 (1991)) to cloned in the unique Xhol and NotI sites.
上記のように単離されたクローンのDNA配列は、全長PRO10272ポリペプチドについての全長DNA配列(DNA147531-2821と命名する[図5、配列番号:5])、並びにそのPRO10272ポリペプチドの誘導タンパク質配列を与えた。 Isolated clones of DNA sequences as described above, (designated as DNA147531-2821 [Figure 5, SEQ ID NO: 5]) the full-length DNA sequence for the full-length PRO10272 polypeptide, and the derived protein sequence for that PRO10272 polypeptide I was given.

上記で同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置259−261に見かけの翻訳開始部位、並びにヌクレオチド位置790−792の停止シグナルを有していた(図5;配列番号:5)。 The full length clone identified above contained a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 259-261, and had a stop signal at nucleotide positions 790-792 (Figure 5; SEQ ID NO: 5). 予測されるポリペプチド前駆体は177アミノ酸長であり、約20,330ダルトンの計算上の分子量と約8.78の見積もりpIを有する。 The predicted polypeptide precursor is 177 amino acids long, has a molecular weight of about 8.78 estimates pI computational about 20,330 daltons. 図6(配列番号:6)に示した全長PRO10272配列の分析は、図6に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。 6 (SEQ ID NO: 6) Analysis of the full-length PRO10272 sequence shown in revealed the presence of a variety of important polypeptide domains as shown in Figure 6, the locations given for those important polypeptide domains described above are those approximate as. クローンDNA147531−2821は2000年1月11日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号PTA−1185が付与されている。 Clone DNA147531-2821 has been deposited with the ATCC on January 11, 2000, ATCC Accession No. PTA-1185 has been granted.

単離された全長PRO10272のアミノ酸配列の分析は、それがIL-17及びその種々の相同体との類似性を有していることを示唆し、それ故にPRO10272が新規サイトカインである可能性があり、ここでIL-17Eと命名されることを示す。 Analysis of the amino acid sequence of the isolated full-length PRO10272 suggests that it has a similarity to the IL-17 and various homologs thereof, thus PRO10272 can may also be new cytokine indicates that it is designated herein as IL-17E. 具体的には、図6(配列番号:6)に示した全長配列のALIGN-2配列アライメント分析を用いた、Dayhoffデーターベース(version 35.45 SwissProt35)の分析は、PRO10272アミノ酸配列と次のDayhoff配列の間の配列同一性を明らかにした:P_Y22197, P_W85620, AF18469_1, P_Y41762, P_Y28235, P_W97350, P_Y22198, P_Y28236, P_W28514, P_W13651。 Specifically, FIG. 6 (SEQ ID NO: 6) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in the analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt) are the PRO10272 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences during revealed sequence identity: P_Y22197, P_W85620, AF18469_1, P_Y41762, P_Y28235, P_W97350, P_Y22198, P_Y28236, P_W28514, P_W13651.

実施例4:ヒトPRO21175をコードするcDNAクローンの単離 Example 4: Isolation of cDNA clones Encoding Human PRO21175
Merk/Washington Universityの発現配列タッグ(EST)DNAデーターベースを検索し、インターロイキン-17に対して相同性を示したESTを同定した。 Searching Merk / Washington expressed sequence tag (EST) DNA database of University, it was identified EST showing homology to interleukin-17.
種々の組織の50の異なるヒトcDNAライブラリのプールをクローニングに用いた。 50 different pools of human cDNA libraries of various tissues was used in cloning. ヒトPRO21175をコードするcDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリを、Invitrogen, San Diego, CAのもの等の市販試薬を用いる標準的な方法によって構築した。 The cDNA libraries used to isolate the cDNA clones encoding human PRO21175, was constructed Invitrogen, San Diego, by standard methods using commercially available reagents such as those CA. cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端(blunt)でSalIヘミリン酸化アダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)の独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向にクローニングした。 The cDNA was primed with oligo dT containing a NotI site, linked to the SalI Hemirin oxide adapters blunt (blunt), cleaved with NotI, and approximate size classification by gel electrophoresis, a suitable cloning vector (pRKB or pRKD etc. ; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain the SfiI site; Holmes etc., Science, 253: 1278-1280 in the unique XhoI and NotI sites of (1991)), was cloned in a predetermined direction.

次いで、1)PCRによって対象である配列を含むcDNAライブラリを同定するため、並びに2)PRO21175の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、上記に記載のEST配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを合成した。 Then, 1) to identify a cDNA library containing a sequence that is subject by PCR, and 2) PRO21175 a clone of the full-length coding sequence of for use as probes to isolate, based on the EST sequences as described in the above oligo the nucleotide probes were synthesized. 正方向及び逆方向PCRプライマーは、一般的に20〜30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。 Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000bp length. プローブ配列は、典型的には40−55bp長である。 Probe sequences are typically 40-55bp long. 全長クローンに関して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular BiologyのようにPCRプライマー対によるPCR増幅によってスクリーニングした。 In order to screen several libraries relative to the full-length clone, DNA from the libraries, Ausubel et al., Supra, was screened by PCR amplification with the PCR primer pair as Current Protocols in Molecular Biology. 次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて興味ある遺伝子をコードするクローンを単離することに使用した。 Then, the positive library clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs were used in isolating.

用いたオリゴヌクレオチドプローブは次の通りである: Oligonucleotide probes used are as follows:
正方向プライマー 5'-GCTCAGTGCCTTCCACCACACGC-3'(配列番号:25) Forward primer 5'-GCTCAGTGCCTTCCACCACACGC-3 '(SEQ ID NO: 25)
逆方向プライマー 5'-CTGCGTCCTTCTCCGGCTCGG-3'(配列番号:26) Reverse primer 5'-CTGCGTCCTTCTCCGGCTCGG-3 '(SEQ ID NO: 26)
ハイブリダイゼーションプローブ Hybridization probe
5'-CGTTCCGTCTACACCGAGGCCTACGTCACCATCCCCGTGGGCTGC-3' 5'-CGTTCCGTCTACACCGAGGCCTACGTCACCATCCCCGTGGGCTGC-3 '
(配列番号:27) (SEQ ID NO: 27)

上記で同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置1−3に見かけの翻訳開始部位、並びにヌクレオチド位置607−609の停止シグナルを有していた(図7;配列番号:7)。 The full length clone identified above contained a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 1-3, and had a stop signal at nucleotide positions 607-609 (Figure 7; SEQ ID NO: 7). 予測されるポリペプチド前駆体は202アミノ酸長であり、約21,879ダルトンの計算上の分子量と約9.3の見積もりpIを有する。 The predicted polypeptide precursor is 202 amino acids long, has a molecular weight of about 9.3 estimates pI computational about 21,879 daltons. 図8(配列番号:8)に示した全長PRO21175配列の分析は、図8に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。 Figure 8 (SEQ ID NO: 8) Analysis of the full-length PRO21175 sequence shown in revealed the presence of a variety of important polypeptide domains as shown in Figure 8, the locations given for those important polypeptide domains described above are those approximate as. クロモソームマッピングによって、PRO21175コード化核酸がヒトの13q11に位置することが明らかになった。 By chromosome mapping, PRO21175 encoding nucleic acid was found to be located in 13q11 in humans. クローンDNA173894−2947は2000年6月20日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号PTA−2108が付与されている。 Clone DNA173894-2947 has been deposited with the ATCC on June 20, 2000, ATCC Accession No. PTA-2108 has been granted.

単離された全長PRO21175のアミノ酸配列の分析は、それがIL-17との類似性を有していることを示唆し、それ故にPRO21175が新規サイトカインである可能性があり、ここでIL-17Dと命名されることを示す。 Analysis of the amino acid sequence of the isolated full-length PRO21175 suggests that it has a similarity to the IL-17, thus PRO21175 can may be a novel cytokine, wherein IL-17D indicating that it is designated. 具体的には、図8(配列番号:8)に示した全長配列のALIGN-2配列アライメント分析を用いた、Dayhoffデーターベース(version 35.45 SwissProt35)の分析は、PRO21175アミノ酸配列と次のDayhoff配列の間の配列同一性を明らかにした:AF152099_1。 Specifically, FIG. 8 (SEQ ID NO: 8) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in the analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt) are the PRO21175 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences the sequence identity between revealed: AF152099_1.

実施例5:ヒトPRO5801をコードするcDNAクローンの単離 Example 5: Isolation of cDNA clones Encoding Human PRO5801
Swiss-Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列(存在すれば、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデーターベースを検索するために使用した。 (If present, it comprises a secretion signal sequence) to about 950 of the extracellular domain (ECD) sequences of known secreted proteins from Swiss-Prot public database were used to search the EST database. このESTデーターベースには、(1)公的ESTデーターベース(例えば、GenBank)並びに(2)独自開発のESTデーターベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharamaceuticals, Palo Alto, CA)が含まれた。 The EST databases included the (1) public EST databases (e. G., GenBank) and (2) proprietary EST database (LIFESEQ (R), Incyte Pharamaceuticals, Palo Alto, CA). 検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、EST配列の6フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として実施した。 The search was performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) with as a comparison of the ECD protein sequences for a 6 frame translation of the EST sequences. 公知のタンパク質をコードせず、70のBlastスコア(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)でクラスター化し、コンセンサスDNA配列へ組み立てた。 Did not encode known proteins were compared with (also cases 90) or greater Blast score of 70, the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) were clustered, consensus DNA sequence It was assembled to.
コンセンサスDNA配列を、上記に記載したようにphrapを用いて他のEST配列に関連して組み立てた。 A consensus DNA sequence was assembled relative to other EST sequences using phrap as described above. このコンセンサス配列を、ここでDNA105850と命名する。 This consensus sequence is designated herein as DNA105850. 幾つかのケースでは、このコンセンサス配列は中間コンセンサスDNA配列から誘導され、それは、上記において検討したEST配列のソースを用いて中間コンセンサス配列が可能な限り伸張するように、BLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させたものである。 In some cases, the consensus sequence is derived from the intermediate consensus DNA sequence, which, as an intermediate consensus sequence is extended as far as possible using the sources of EST sequences discussed above, the repeated cycles of BLAST and phrap it is obtained by extended using.

DNA105850コンセンサス配列に基づいて、1)PCRによって対象である配列を含むcDNAライブラリを同定するため、並びに2)PRO5801の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。 DNA105850 Based on consensus sequences, 1) to identify a cDNA library containing a sequence that is subject by PCR, and 2) PRO5801 a clone of the full-length coding sequence for use as probes to isolate, synthetic oligonucleotides did. 正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20〜30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。 Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000bp length. プローブ配列は、典型的には40−55bp長である。 Probe sequences are typically 40-55bp long. 幾つかの場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きな場合には更なるオリゴヌクレオチドを合成した。 In some cases, it was synthesized additional oligonucleotides when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. 全長クローンに関して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular BiologyのようにPCRプライマー対でのPCR増幅によってスクリーニングした。 In order to screen several libraries relative to the full-length clone, DNA from the libraries, Ausubel et al., Supra, was screened by PCR amplification with the PCR primer pair as Current Protocols in Molecular Biology. 次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて興味ある遺伝子をコードするクローンを単離することに使用した。 A positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.

PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した: A pair of PCR primers (forward and reverse) were synthesized:
正方向PCRプライマー1: Forward PCR primer 1:
5'-ACTCCATATTTTCCTACTTGTGGCA-3' (配列番号:28) 5'-ACTCCATATTTTCCTACTTGTGGCA-3 '(SEQ ID NO: 28)
正方向PCRプライマー2: Forward PCR primer 2:
5'-CCCAAAGTGACCTAAGAAC-3'(配列番号:29) 5'-CCCAAAGTGACCTAAGAAC-3 '(SEQ ID NO: 29)
逆方向PCRプライマー: Reverse PCR primer:
5'-TCACTGAATTTCTTCAAAACCATTGCA-3' (配列番号:30) 5'-TCACTGAATTTCTTCAAAACCATTGCA-3 '(SEQ ID NO: 30)
さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブをコンセンサスDNA105850配列から構築した: Furthermore, to construct a synthetic oligonucleotide hybridization probe having the following nucleotide sequence from the consensus DNA105850 sequence:
ハイブリダイゼーションプローブ: Hybridization probe:
5'-TGTGGCAGCGACTGCATCCGACATAAAGGAACAGTTGTGCTCTGCCCACA-3' 5'-TGTGGCAGCGACTGCATCCGACATAAAGGAACAGTTGTGCTCTGCCCACA-3 '
(配列番号:31) (SEQ ID NO: 31)

cDNAライブラリーの構築のためのRNAをヒト胎児肝臓組織から単離した。 The RNA for construction of the cDNA libraries was isolated from human fetal liver tissue. cDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。 cDNA libraries used to isolate the cDNA clones were constructed by standard methods using Invitrogen, San Diego, commercially available reagents such as those from CA. cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミリン酸化アダプターへ平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991))に独特のXhol及びNotI部位においてクローン化した。 The cDNA was primed with oligo dT containing a NotI site, the SalI Hemirin oxide adapters linked with blunt, cleaved with NotI, and the approximate size divided by gel electrophoresis, in a predetermined direction a suitable cloning vector ( pRKB or pRKD; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain the SfiI site; Holmes etc., Science, 253: 1278-1280 (1991)) to cloned in the unique Xhol and NotI sites.
上記のように単離されたクローンのDNA配列は、全長PRO5801ポリペプチドについての全長DNA配列(DNA115291-2681と命名する[図11、配列番号:11])、並びにそのPRO5801ポリペプチドの誘導タンパク質配列を与えた。 DNA sequences of the above-described isolated clones (designated as DNA115291-2681 [Figure 11, SEQ ID NO: 11]) the full-length DNA sequence for the full-length PRO5801 polypeptide, and the derived protein sequence for that PRO5801 polypeptide I was given.

上記で同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置7−9に見かけの翻訳開始部位、並びにヌクレオチド位置1513−1515の停止シグナルを有していた(図12;配列番号:12)。 The full length clone identified above contained a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 7-9, and had a stop signal at nucleotide positions 1513-1515 (Figure 12; SEQ ID NO: 12). 予測されるポリペプチド前駆体は502アミノ酸長であり、約55,884ダルトンの計算上の分子量と約8.52の見積もりpIを有する。 The predicted polypeptide precursor is 502 amino acids long, has a molecular weight of about 8.52 estimates pI computational about 55,884 daltons. 図12(配列番号:12)に示した全長PRO5801配列の分析は、図12に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。 Figure 12 (SEQ ID NO: 12) Analysis of the full-length PRO5801 sequence shown revealed the presence of a variety of important polypeptide domains as shown in Figure 12, the locations given for those important polypeptide domains described above are those approximate as. クローンDNA115291−2681は1999年6月8日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号PTA−202が付与されている。 Clone DNA115291-2681 has been deposited with the ATCC on June 8, 1999, ATCC Accession No. PTA-202 has been granted.

Dayhoff データーベースの分析は、PRO5801がIL-17レセプターと配列同一性を有し、そして更にPRO5801は、本出願の実施例22に記載されているように、ここでIL-17RH1と命名されていることを示ている。 Dayhoff database analysis, PRO5801 has sequence identity with IL-17 receptor and further PRO5801, as described in Example 22 of the present application, it has been named herein as IL-17RHl which indicates that. 具体的には、図12(配列番号:12)に示した全長配列のALIGN-2配列アライメント分析を用いた、Dayhoffデーターベース(version 35.45 SwissProt35)の分析は、PRO5801アミノ酸配列と次のDayhoff配列の間の配列同一性を明らかにした:HSU58917_1, P_W92409, P_W61271, P_W04184, P_W92408, GEN13979, MMU31993_1及びYSO2_CAEEL。 Specifically, FIG. 12 (SEQ ID NO: 12) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in the analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt) are the PRO5801 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences revealed sequence identity between: HSU58917_1, P_W92409, P_W61271, P_W04184, P_W92408, GEN13979, MMU31993_1 and YSO2_CAEEL.

実施例6:ヒトPRO20040をコードするcDNAクローンの単離 発現配列タッグ(EST)DNAデーターベース(Merk/Washington University)を検索し、インターロイキン-17に対して相同性を示したESTを同定した。 Example 6: Find the isolated expressed sequence tag of cDNA clones Encoding Human PRO20040 (EST) DNA database (Merk / Washington University), were identified EST showing homology to interleukin-17.
種々の組織の50の異なるヒトcDNAライブラリのプールをクローニングに用いた。 50 different pools of human cDNA libraries of various tissues was used in cloning. ヒトPRO20040をコードするcDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリを、Invitrogen, San Diego, CAのもの等の市販試薬を用いる標準的な方法によって構築した。 The cDNA libraries used to isolate the cDNA clones encoding human PRO20040, was constructed Invitrogen, San Diego, by standard methods using commercially available reagents such as those CA. cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端(blunt)でSalIヘミリン酸化アダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)の独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向にクローニングした。 The cDNA was primed with oligo dT containing a NotI site, linked to the SalI Hemirin oxide adapters blunt (blunt), cleaved with NotI, and approximate size classification by gel electrophoresis, a suitable cloning vector (pRKB or pRKD etc. ; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain the SfiI site; Holmes etc., Science, 253: 1278-1280 in the unique XhoI and NotI sites of (1991)), was cloned in a predetermined direction.

次いで、1)PCRによって対象である配列を含むcDNAライブラリを同定するため、並びに2)PRO20040の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、上記に記載のEST配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを合成した。 Then, 1) to identify a cDNA library containing a sequence that is subject by PCR, and 2) PRO20040 a clone of the full-length coding sequence of for use as probes to isolate, based on the EST sequences as described in the above oligo the nucleotide probes were synthesized. 正方向及び逆方向PCRプライマーは、一般的に20〜30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。 Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000bp length. プローブ配列は、典型的には40−55bp長である。 Probe sequences are typically 40-55bp long. 全長クローンに関して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular BiologyのようにPCRプライマー対によるPCR増幅によってスクリーニングした。 In order to screen several libraries relative to the full-length clone, DNA from the libraries, Ausubel et al., Supra, was screened by PCR amplification with the PCR primer pair as Current Protocols in Molecular Biology. 次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて興味ある遺伝子をコードするクローンを単離することに使用した。 Then, the positive library clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs were used in isolating.

用いたオリゴヌクレオチドプローブは次の通りである: Oligonucleotide probes used are as follows:
正方向プライマー 5'-CCGACTTCTTGCAGGGCCGG-3'(配列番号:32) Forward primer 5'-CCGACTTCTTGCAGGGCCGG-3 '(SEQ ID NO: 32)
逆方向プライマー 5'-GCAGCACGCAGCTGAGCGAG-3'(配列番号:33) Reverse primer 5'-GCAGCACGCAGCTGAGCGAG-3 '(SEQ ID NO: 33)
ハイブリダイゼーションプローブ Hybridization probe
5'-AGCGAGTGGCTACAGGATGGGGTGTCCGGGCCC-3'(配列番号:34) 5'-AGCGAGTGGCTACAGGATGGGGTGTCCGGGCCC-3 '(SEQ ID NO: 34)
上記で同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置233−235に見かけの翻訳開始部位、並びにヌクレオチド位置2348−2350の停止シグナルを有していた(図13;配列番号:13)。 The full length clone identified above contained a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 233-235, and had a stop signal at nucleotide positions 2348-2350 (Figure 13; SEQ ID NO: 13). 予測されるポリペプチド前駆体は705アミノ酸長であり、約76,898ダルトンの計算上の分子量と約6.08の見積もりpIを有する。 The predicted polypeptide precursor is 705 amino acids long, has a molecular weight of about 6.08 estimates pI computational about 76,898 daltons. 図14(配列番号:14)に示した全長PRO20040配列の分析は、図14に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。 Figure 14 (SEQ ID NO: 14) Analysis of the full-length PRO20040 sequence shown revealed the presence of a variety of important polypeptide domains as shown in Figure 14, the locations given for those important polypeptide domains described above are those approximate as. クローンDNA164625−2890は2000年3月21日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号PTA−1535が付与されている。 Clone DNA164625-2890 has been deposited with the ATCC on March 21, 2000, ATCC Accession No. PTA-1535 has been granted.

Dayhoff データーベースの分析は、PRO20040がIL-17レセプターと配列同一性を有し、そして更にPRO20040は、本出願の実施例20に記載されているように、ここでIL-17RH2と命名されていることを示ている。 Dayhoff database analysis, PRO20040 has sequence identity with IL-17 receptor and further PRO20040, as described in Example 20 of the present application, it has been named herein as IL-17RH2 which indicates that. 具体的には、図14(配列番号:14)に示した全長配列のALIGN-2配列アライメント分析を用いた、Dayhoffデーターベース(version 35.45 SwissProt35)の分析は、PRO20040アミノ酸配列と次のDayhoff配列の間の配列同一性を明らかにした:HSU58917_1。 Specifically, FIG. 14 (SEQ ID NO: 14) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in the analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt) are the PRO20040 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences the sequence identity between revealed: HSU58917_1.

実施例7:ヒトPRO9877をコードするcDNAクローンの単離 DNA119502−2789を、公的(例えば、GenBank)及び/又は私的(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA)データベースからのESTs並びにクラスター化及び組み立てられたEST断片へジェネンテク,インク(South San Francisco, CA)によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを適用することによって同定した。 Example 7: Isolation DNA119502-2789 of cDNA Clones Encoding Human PRO9877, public (e. G., GenBank) and / or private (LIFESEQ (R), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) databases Genentech to ESTs as well as clustered and assembled EST fragments from the ink (South San Francisco, CA) was identified by applying the developed proprietary sequence finding algorithm was by. シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の5'-末端の第1の、場合によっては第2のメチオニンコドン(ATG)を取り囲むDNAヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。 The signal sequence algorithm first the 5'-end of the sequence or sequence fragment under consideration in some cases computes a secretion signal score based on the character of the DNA nucleotides surrounding the second methionine codon (ATG). 第1のATGに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも35の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。 The nucleotides following the first ATG must code for at least 35 unambiguous amino acids without any stop codons. 第1のATGが必要なアミノ酸を有する場合、第2のものは試験しない。 If has the required amino acids are first ATG, the second is not examined. 何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。 If neither meets the requirement, the candidate sequence is not scored. EST配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ATGコドンを取り囲むDNA及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた7つのセンサー(評価パラメータ)の組を用いてスコアをつけた。 For EST sequences to determine whether contains an authentic signal sequence, the DNA and corresponding amino acid sequences surrounding the ATG codon, a set of seven sensors known to be associated to a secretion signal (evaluation parameters) It scored using.

上記に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用は、ここでCLU42993と命名されたLIFESEQ(登録商標)(Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)データーベースからのEST配列の同定を可能にした。 Use of the signal sequence algorithm described above allowed the identification of where CLU42993 and named LIFESEQ (R) (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) EST sequence from database. 次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び独自に開発したEST DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。 This EST cluster sequence was then public databases (e. G., GenBank) and my own EST DNA database (LIFESEQ (R), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) and various expression sequence tag (EST) database containing in comparison, it was to identify existing homologies. 相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。 The homology search was performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul and Gish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) was performed using. 公知のタンパク質をコードせず、70のBLASTスコア(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。 Did not encode known proteins were compared product with (also cases 90) or greater BLAST score of 70, the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) consensus DNA was populated with It was constructed array. そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNAFROMと命名する。 The consensus sequence obtained therefrom is designated herein as DNAFROM.
DNAFROMコンセンサス配列とLIFESEQ(登録商標)データーベースIncyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAのESTクローン番号700536に含まれるEST配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、クローン番号700536を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。 DNAFROM consensus sequence LIFESEQ (R) database Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, in view of the observed sequence homology between the EST sequence contained in EST clone no 700536 of CA, purchased clone number 700536, cDNA insert was obtained and sequenced. この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。 The insert was found to encode a full-length protein. このcDNA挿入物の配列を図15に示し、ここでDNA119502−2789と命名する。 The sequence of this cDNA insert is shown in Figure 15, designated herein as DNA119502-2789.

クローンDNA119502−2789は単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置106−108に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2107−2109の停止コドンで終端する(図15;配列番号:15)。 Clone DNA119502-2789 contains a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 106-108 and ending at the stop codon at nucleotide positions 2107-2109 (Figure 15; SEQ ID NO: 15 ). 予測されるポリペプチド前駆体は667アミノ酸長である(図16)。 The predicted polypeptide precursor is 667 amino acids long (Figure 16). 図16に示す全長PRO9877タンパク質は、約74,810ダルトンの見積もられた分子量及び約9.55のpIを有する。 Full-length PRO9877 protein shown in Figure 16 has a molecular weight estimated of about 74,810 daltons and about 9.55 to pI. 図16(配列番号:16)に示した全長PRO9877配列の分析は、図16に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。 Figure 16 (SEQ ID NO: 16) Analysis of the full-length PRO9877 sequence shown revealed the presence of a variety of important polypeptide domains as shown in Figure 16, the locations given for those important polypeptide domains described above are those approximate as. クローンDNA119502−2789は1999年12月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号PTA−1082が付与されている。 Clone DNA119502-2789 has been deposited with the ATCC on December 22, 1999, ATCC Accession No. PTA-1082 has been granted.

Dayhoff データーベースの分析は、PRO9877がIL-17レセプターと配列同一性を有し、そして更にPRO9877はがここでIL-17RH3と命名されていることを示ている。 Dayhoff database analysis, PRO9877 has a sequence identity with IL-17 receptor and further PRO9877 is shown that is designated herein as IL-17RH3. 具体的には、図16(配列番号:16)に示した全長配列のALIGN-2配列アライメント分析を用いたDayhoffデーターベース(version 35.45 SwissProt35)の分析は、PRO9877アミノ酸配列と次のDayhoff配列の間の配列同一性を明らかにした:P_W61272, HSU58917, P_W04185, P_W92409, GEN13979, P_W04184, P_W92408, MMU31993_1, P_W61271, 及びAF090114_1。 Specifically, FIG. 16 (SEQ ID NO: 16) An analysis of the Dayhoff database using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in (version 35.45 SwissProt) during the PRO9877 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences revealed sequence identity: P_W61272, HSU58917, P_W04185, P_W92409, GEN13979, P_W04184, P_W92408, MMU31993_1, P_W61271, and AF090114_1.

実施例8:ヒトPRO20026をコードするcDNAクローンの単離 Example 8: Isolation of cDNA clones Encoding Human PRO20026
Swiss-Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列(存在すれば、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデーターベースを検索するために使用した。 (If present, it comprises a secretion signal sequence) to about 950 of the extracellular domain (ECD) sequences of known secreted proteins from Swiss-Prot public database were used to search the EST database. このESTデーターベースには、独自開発のESTデーターベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharamaceuticals, Palo Alto, CA)が含まれた。 The EST database, EST database of their own development (LIFESEQ (registered trademark), Incyte Pharamaceuticals, Palo Alto, CA) were included. 検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、EST配列の6フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として実施した。 The search was performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) with as a comparison of the ECD protein sequences for a 6 frame translation of the EST sequences. 公知のタンパク質をコードせず、70のBlastスコア(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)でクラスター化し、コンセンサスDNA配列へ組み立てた。 Did not encode known proteins were compared with (also cases 90) or greater Blast score of 70, the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) were clustered, consensus DNA sequence It was assembled to.
コンセンサスDNA配列を、上記に記載したようにphrapを用いて他のEST配列に関連して組み立てた。 A consensus DNA sequence was assembled relative to other EST sequences using phrap as described above. このコンセンサス配列を、ここでDNA149870と命名する。 This consensus sequence is designated herein as DNA149870. 幾つかのケースでは、このコンセンサス配列は中間コンセンサスDNA配列から誘導され、それは、上記において検討したEST配列のソースを用いて中間コンセンサス配列が可能な限り伸張するように、BLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させたものである。 In some cases, the consensus sequence is derived from the intermediate consensus DNA sequence, which, as an intermediate consensus sequence is extended as far as possible using the sources of EST sequences discussed above, the repeated cycles of BLAST and phrap it is obtained by extended using.

DNA149870コンセンサス配列に基づいて、フリップクローニングを実施した。 DNA149870 Based on consensus sequences was performed flip cloning. 1)PCRによって対象である配列を含むcDNAライブラリを同定するため、並びに2)PRO5801の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。 To identify a cDNA library comprising a sequence that is subject by 1) PCR, and 2) PRO5801 a clone of the full-length coding sequence for use as probes to isolate, oligonucleotides were synthesized. 正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20〜30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。 Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000bp length. プローブ配列は、典型的には40−55bp長である。 Probe sequences are typically 40-55bp long. 幾つかの場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きな場合には更なるオリゴヌクレオチドを合成した。 In some cases, it was synthesized additional oligonucleotides when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. 全長クローンに関して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、per Schankeら., Bio Techniques, 16: 414-416(1994)のように、PCRプライマー対でプリップPCR増幅によってスクリーニングした。 In order to screen several libraries relative to the full-length clone, DNA from the libraries, per Schanke et al, Bio Techniques, 16:. 414-416 (1994) as in were screened by Purippu PCR amplification with the PCR primer pair. 次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一つを用いて対象である遺伝子をコードするクローンを単離するために用いた。 Then, positive library was used clones encoding the gene which is the target for isolated using a probe oligonucleotide and primer pairs.

PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した: A pair of PCR primers (forward and reverse) were synthesized:
正方向PCRプライマー: Forward PCR primer:
5'-CGTTGTTTGTCAGTGGAGAGCAGGG-3' (配列番号:35) 5'-CGTTGTTTGTCAGTGGAGAGCAGGG-3 '(SEQ ID NO: 35)
逆方向PCRプライマー: Reverse PCR primer:
5'-CAGGAACACCTGAGGCAGAAGCG-3' (配列番号:36) 5'-CAGGAACACCTGAGGCAGAAGCG-3 '(SEQ ID NO: 36)
さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブをコンセンサスDNA149870配列から構築した: Furthermore, to construct a synthetic oligonucleotide hybridization probe having the following nucleotide sequence from the consensus DNA149870 sequence:
ハイブリダイゼーションプローブ: Hybridization probe:
5'-CTATCTCCCTGCCAGGAGGCCGGAGTGGGGGAGGTCAGAC-3' 5'-CTATCTCCCTGCCAGGAGGCCGGAGTGGGGGAGGTCAGAC-3 '
(配列番号:37) (SEQ ID NO: 37)

cDNAライブラリーの構築のためのRNAをヒト組織から単離した。 The RNA for construction of the cDNA libraries was isolated from human tissue. cDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。 cDNA libraries used to isolate the cDNA clones were constructed by standard methods using Invitrogen, San Diego, commercially available reagents such as those from CA. cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミリン酸化アダプターへ平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991))に独特のXhol及びNotI部位においてクローン化した。 The cDNA was primed with oligo dT containing a NotI site, the SalI Hemirin oxide adapters linked with blunt, cleaved with NotI, and the approximate size divided by gel electrophoresis, in a predetermined direction a suitable cloning vector ( pRKB or pRKD; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain the SfiI site; Holmes etc., Science, 253: 1278-1280 (1991)) to cloned in the unique Xhol and NotI sites.
上記のように単離されたクローンのDNA配列は、全長PRO20026ポリペプチドについての全長DNA配列(DNA154095−2998と命名する[図17、配列番号:17])、並びにそのPRO20026ポリペプチドの誘導タンパク質配列を与えた。 Isolated clones of DNA sequences as described above, (designated as DNA154095-2998 [Figure 17, SEQ ID NO: 17]) the full-length DNA sequence for the full-length PRO20026 polypeptide, and the derived protein sequence for that PRO20026 polypeptide I was given.

上記で同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置70−72に見かけの翻訳開始部位、並びにヌクレオチド位置2254−2256の停止シグナルを有していた(図17;配列番号:17)。 The full length clone identified above contained a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 70-72, and had a stop signal at nucleotide positions 2254-2256 (Figure 17; SEQ ID NO: 17). 予測されるポリペプチド前駆体は728アミノ酸長であり、約81,310ダルトンの計算上の分子量と約6.84の見積もりpIを有する。 The predicted polypeptide precursor is 728 amino acids long, has a molecular weight of about 6.84 estimates pI computational about 81,310 daltons. 図18(配列番号:18)に示した全長PRO20026配列の分析は、図18に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。 Figure 18 (SEQ ID NO: 18) Analysis of the full-length PRO20026 sequence shown revealed the presence of a variety of important polypeptide domains as shown in Figure 18, the locations given for those important polypeptide domains described above are those approximate as. クローンDNA154095−2998は2000年10月10日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号PTA−2591が付与されている。 Clone DNA154095-2998 has been deposited with the ATCC on October 10, 2000, ATCC Accession No. PTA-2591 has been granted.

Dayhoff データーベースの分析は、PRO20026がIL-17レセプターと配列同一性を有し、そして更にPRO20026がここでIL-17RH4と命名されていることを示ている。 Dayhoff database analysis, PRO20026 has sequence identity with IL-17 receptor, and have it shows with a being further designated PRO20026 is to herein as IL-17RH4. 具体的には、図18(配列番号:18)に示した全長配列のALIGN-2配列アライメント分析を用いた、Dayhoffデーターベース(version 35.45 SwissProt35)の分析は、PRO20026アミノ酸配列と次のDayhoff配列の間の配列同一性を明らかにした:T42695, P_W04185, P_W92409, P_W61272, NM_014339_1, HSU58917_1, MMU31993_1, GEN13979, P_W04184, P_W61271。 Specifically, FIG. 18 (SEQ ID NO: 18) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in the analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt) are the PRO20026 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences during revealed sequence identity: T42695, P_W04185, P_W92409, P_W61272, NM_014339_1, HSU58917_1, MMU31993_1, GEN13979, P_W04184, P_W61271.

実施例9:ハイブリダイゼーションプローブとしてのPROの利用 以下の方法は、PROをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての利用を示している。 Example 9: The following method of use of PRO as a hybridization probe indicates use as hybridization probes of the nucleotide sequence encoding a PRO.
ここに開示されている全長又は成熟PROをコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの相同的なDNA(PROの天然発生変異体をコードするもの等)のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。 DNA comprising the coding sequence full-length or mature PRO as disclosed herein, for the screening of homologous DNA of human tissue cDNA libraries or human tissue genomic libraries (those encoding naturally-occurring variants of PRO or the like) used as a probe.
ハイブリダイゼーション及びいずれかのライブラリDNAを含有するフィルターの洗浄を、次の高緊縮性条件下において実施する。 Washing of filters containing hybridization and any library DNA, carried out in the following high stringency conditions. 放射標識PRO誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションを、50%ホルムアミド、5xSSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中において42℃で20時間に渡って実施する。 Hybridization to filter radiolabeled PRO-derived probe, 50% formamide, 5xSSC, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate, 50mM sodium phosphate, PH6.8,2X Denhardt's solution, and 10% dextran It carried over 20 hours at 42 ° C. in a solution of sulfuric acid. フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.1%SDS水溶液中において42℃で実施する。 Washing of the filters is carried out at 42 ° C. in 0.1xSSC and 0.1% SDS in aqueous solutions.
次いで、全長天然配列をコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られている標準的技術を用いて同定することができる。 Then, DNA having a desired sequence identity with the DNA encoding full-length native sequence can be identified using standard techniques known in the art.

実施例10:インサイツハイブリダイゼーション インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。 Example 10: In situ Hybridization In situ hybridization is a powerful and versatile technique for the detection and localization of nucleic acid sequences within cell or tissue preparations. それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定mRNA合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。 It may, for example, to identify sites of gene expression, analyze the tissue distribution of transcription, identify and localize viral infection, it is useful for tracking in specific mRNA synthesis and chromosomal mapping.
インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適な変形に従って、PCR生成33 P-標識リボプローブを用いて実施される。 In situ hybridization, Lu and Gillett, Cell Vision 1: according to the optimal deformation of the protocol 169-176 (1994), using PCR-generated 33 P- labeled riboprobes. 簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20g/ml)で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。 Briefly, formalin-fixed, paraffin-embedded human tissues were sectioned, deparaffinized, as deproteinized for 15 minutes 37 ° C. with proteinase K (20g / ml), described further supra Lu and Gillett in situ hybridization. 33 P]UTP-標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から生成し、55℃で終夜ハイブリダイゼーションする。 [33 P] UTP-labeled antisense riboprobe was generated from a PCR product and hybridized overnight at 55 ° C.. スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して4週間に渡って露出する。 The slides were dipped in Kodak NTB2 nuclear track emulsion and exposed for four weeks.

33 P-リボプローブ合成 6.0μl(125mCi)の33 P−UTP(Amersham BF 1002, SA,2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。 33 P- riboprobe synthesis 6.0μl of (125mCi) 33 P-UTP ( Amersham BF 1002, SA, 2000 Ci / mmol) were speed vacuum dried. 乾燥33 P−UTPを含む管に以下の成分を添加した: Into tubes containing dried 33 P-UTP, the following ingredients were added:
2.0μlの5x転写バッファー 1.0μlのDTT(100mM) 2.0μl of 5x transcription buffer 1.0μl of DTT (100 mM)
2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 10μl; 各々10mM GTP, CTP & ATP +10μl H 2 O) NTP mixture 2.0μl (2.5mM: 10μl; each 10mM GTP, CTP & ATP + 10μl H 2 O)
1.0μlのUTP(50μM) 1.0μl of UTP (50μM)
1.0μlのRnasin Rnasin of 1.0μl
1.0μlのDNAテンプレート(1μg) 1.0μl of DNA template (1μg)
1.0μlのH 1.0μl of H 2 O
1.0μlのRNAポメラーゼ(PCR産物についてT3=AS, T7=S,通常) 1.0μl of RNA Pomeraze (for PCR products T3 = AS, T7 = S, usually)
管を37℃で1時間インキュベートし、1.0μlのRQ1 DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。 The tubes were incubated for 1 hour at 37 ° C., was added RQ1 DNase of 1.0 [mu] l, followed by incubation for 15 minutes at 37 ° C.. 90μlのTE(10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0)を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。 Was added TE (EDTA pH 8.0 in 10mM Tris pH 7.6 / 1 mM) of 90 [mu] l, were pipetted mixture DE81 paper. 残りの溶液をMicrocon-50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム10を用いてスピンさせた(6分間)。 The remaining solution was loaded in a Microcon-50 ultrafiltration unit, and spun using program 10 (6 minutes). 濾過ユニットを第2の管に変換し、プログラム2を用いてスピンさせた(3分間)。 The filtration unit was inverted over a second tube and spun using program 2 (3 minutes). 最終回収スピンの後、100μlのTEを添加した。 After the final recovery spin, TE were added 100μl. 1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBiofluor IIで数えた。 Pipetted 1μl of the final product to DE81 paper and counted in Biofluor II of 6 ml.
プローブをTBE/尿素ゲル上で走らせた。 The probe was run on a TBE / urea gel. 1−3μlのプローブ又は5μlのRNA MrkIIIを3μlの負荷バッファーに添加した。 The probe or 5μl of RNA MrkIII of 1-3μl were added to 3μl of loading buffer. 加熱ブロック上で95℃に3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。 After heating 95 ° C. for three minutes on a heated block, the gel was immediately placed on ice. ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180−250ボルトで45分間走らせた。 The wells of gel were flushed, the sample loaded, and run at 180-250 volts for 45 minutes. ゲルをサランラップでラップし、−17℃冷凍機内で補強スクリーンを持つXARフィルムに1時間から終夜に渡って露出した。 The gel was wrapped in saran wrap and exposed over one hour to overnight to XAR film with an intensifying screen at -17 ° C. freezer.

33 P-ハイブリダイゼーション A. 33 P- Hybridization A. 凍結切片の前処理 スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。 Pretreatment of frozen sections The slides were removed from the freezer, and thawed at room temperature for 5 minutes and placed on an aluminum tray. トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。 Trays were reduce condensation arranged incubator for five minutes to 55 ° C.. スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で5分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC + 975ml SQ H 2 O)。 The slides were fixed for 5 min in 4% paraformaldehyde in the fume hood, and washed at room temperature for 5 minutes with 0.5xSSC (25ml 20xSSC + 975ml SQ H 2 O). 0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250mlの予備加熱RNase無しRNaseバッファー中の10mg/mlストック12.5μl)、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。 During 0.5 [mu] g / ml of proteinase, after deproteination in 10 minutes at 37 ℃ (10mg / ml stock 12.5μl preheating RNase free in RNase buffer 250 ml), and washed at room temperature slice 10 minutes in 0.5xSSC . 切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。 Sections 70%, 95%, 100% ethanol, and dried 2 minutes each.
B. B. パラフィン包埋切片の前処理 スライドを脱パラフィンし、SQ H O中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。 The pre-treated slides of paraffin-embedded sections were deparaffinized, placed in SQ H 2 O, and rinsed twice for 5 minutes each at room temperature 2 × SSC. 切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μl;37℃、15分間)−ヒト胚又は8xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μl、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。 Sections 20 [mu] g / ml proteinase K (500 [mu] l of 10mg / ml in RNase free RNase buffer 250ml; 37 ℃, 15 minutes) - human embryo, or 8x proteinase K (250 ml RNase-buffer in 100μl, 37 ℃, 30 minutes) - It was deproteinized with formalin organization. 続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。 Rinsing and dewatering followed by in 0.5xSSC was performed as described above.

C. C. プレハイブリダイゼーション スライドをBoxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。 Box buffer Prehybridization slide (4 x SSC, 50% formamide) - was laid out in a plastic box lined with lining up in saturated filter paper. 組織を50μlのハイブリダイゼーションバッファー(3.75gデキストラン硫酸+6mlSQ H O)で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。 The tissue was covered with 50μl hybridization buffer (3.75 g dextran sulfate + 6mlSQ H 2 O), vortexed and heated in the microwave for 2 minutes with the cap loosened. 氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75mlの20xSSC及び9mlのSQ H Oを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1−4時間インキュベートした。 After cooling on ice, was added formamide 18.75 ml, the SQ H 2 O of 20xSSC and 9ml of 3.75 ml, tissue was vortexed well, and 1-4 hour incubation at 42 ° C..
D. D. ハイブリダイゼーション スライド当たり1.0x10 cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。 Hybridization per slide 1.0x10 6 cpm probe and 1.0μl of tRNA to (50 mg / ml stock) was heated for 3 minutes at 95 ° C.. スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。 The slides were cooled on ice, and hybridization buffer were added 48μl per slide. ボルテックスの後、50μlの33 P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。 After vortexing, was added 33 P mixture 50μl prehybridization 50μl on the slide. スライドを55℃で終夜インキュベートした。 Overnight slides 55 ° C. and incubated.

E. E. 洗浄: Washing:
洗浄は、2xSSC、EDTAで2x10分間、室温で実施し(400mlの20xSSC+16mlの0.25M EDTA、V =4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250mlRNaseバッファー中10mg/mlを500μl=20μg/ml)。 Washing, 2 × SSC, 2x10 min EDTA, at room temperature was performed (400ml of 20 x SSC + 16 ml of 0.25M EDTA, V f = 4L) , followed RNaseA treatment was performed for 30 minutes at 37 ° C. The (250MlRNase buffer at 10mg / ml to 500 [mu] l = 20μg / ml). スライドを2x10分間、EDTAで室温において洗浄した。 Slides 2x10 minutes and then washed at room temperature with EDTA. 緊縮性洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20mlの20xSSC+16mlのEDTA、V =4L)。 Stringency wash conditions follows as: 2 hours at 55 ℃, 0.1xSSC, EDTA (20ml of 20 x SSC + 16 ml of EDTA, V f = 4L).
F. F. オリゴヌクレオチド ここに開示したDNA59294−1381についてインサイツ分析を実施した。 Situ analysis was performed on oligonucleotide DNA59294-1381 disclosed herein. これらの分析にために用いたオリゴヌクレオチドは、ここで開示したヌクレオチド配列から誘導され、概して約40から50ヌクレオチド長である。 These oligonucleotides used for the analysis is derived from the nucleotide sequences disclosed herein, is generally about 40 to 50 nucleotides in length.
G. G. 結果 ここに開示されているように、インサイツ分析をDNA59294−1381に関して実施した。 Results As disclosed herein, were performed on DNA59294-1381 situ analysis. この分析の結果は、以下の通りである。 The results of this analysis are as follows.

DNA59294−1381(PRO1031) DNA59294-1381 (PRO1031)
このIL17相同体の発現は、正常成人及び胎児組織及び炎症、主に慢性リンパ球炎症を持つ組織からなるパネルで評価した。 Expression of this IL17 homologue was evaluated in the panel consisting of normal adult and fetal tissues and inflammation, mainly with chronic lymphocytic inflammation tissues. このパネルは、Tリンパ球作用を媒介(刺激性又は阻害性)する新規なタンパク質の免疫媒介疾患における発現パターンを特異的に評価するために設計した。 This panel was designed to specifically evaluate the expression pattern in immune mediated diseases of novel proteins that mediate T-lymphocyte activity (stimulatory or inhibitory). このタンパク質は、Ig-融合タンパク質として発現された場合は、ヒト混合リンパ球反応(MLR)において用量依存的に免疫刺激性であり;2つの異なる濃度(1.0%及び0.1%の560nMストック)で用いられたとき、ベースライン刺激指数より285%及び147%という増加を生じる(下記の実施例25を参照)。 This protein, when expressed as a Ig- fusion protein, human mixed lymphocyte reaction be dose dependent manner immunostimulatory in (MLR); used at two different concentrations (1.0% and 0.1% of 560nM stock) when it is, resulting in an increase of 285% and 147% from the baseline stimulation index (see example 25 below). 要旨:発現は、筋肉、成人の或る種の型の平滑筋及びヒト胎児の平滑筋に制限された。 Abstract: Expression muscle was limited to smooth muscle of certain types of smooth muscle and human fetal adult. ヒト成人における発現は、結腸及び胆嚢を含む管器官の平滑筋において評価された。 Expression in adult human was evaluated in smooth muscle of tubular organs including colon and gall bladder. 血管及び気管支の平滑筋では発現されなかった。 It was not expressed in the smooth muscle of blood vessels and bronchi. ヒト成人骨格筋は評価しなかった。 Adult human skeletal muscle was not evaluated. 胎児組織において、骨格筋、体幹骨格及び肢における中程度から高度の拡散発現があった。 In fetal tissue, skeletal muscle, there was a high degree of diffuse expression moderate in trunk skeletal and limb. 腸壁の平滑筋では弱い発現があったが、心筋では発現されなかった。 There was weak expression in the smooth muscle of the intestinal wall, but was not expressed in the myocardium. 発現したヒト成人組織:結腸:慢性炎症性腸疾患を持つ5検体において平滑筋(筋層)で低レベルの拡散発現があった。 Expressed human adult tissues: colon: there was low level diffuse expression in the smooth muscle in 5 specimens (muscle layer) with chronic inflammatory bowel disease. 胆嚢:胆嚢の平滑筋で弱から低レベルの発現があった。 Gall bladder: there was a low level of expression from the weakness in the smooth muscle of the gall bladder. 発現したヒト胎児組織:骨格筋において中程度の拡散発現及び平滑筋において弱から低レベル発現があった;胎児心臓又は肝臓、脾臓、CNS、腎臓、腸、肺を含む他の任意の器官では発現は無かった。 Expressed human fetal tissues: there is a low level expression from the weak at moderate diffuse expression and smooth muscle in skeletal muscle; fetal heart or liver, spleen, CNS, kidney, intestine, expressed in any other organs including lung It was not. 発現の無いヒト組織:慢性肉芽腫炎症及び慢性気管支炎(5患者)の肺、末梢神経、心臓、胎盤、肝臓(疾患多重ブロック)、脳(大脳及び小脳)、扁桃(反応性過形成)、末梢リンパ節、胸腺。 Expression without human tissues: chronic granulomatous inflammation and chronic bronchitis lung (5 patients), peripheral nerve, heart, placenta, liver (disease multiblock), brain (cerebrum and cerebellum), tonsil (reactive hyperplasia), peripheral lymph nodes, thymus.

実施例11:大腸菌におけるPROの発現 この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるPROの非グリコシル化型の調製を例証する。 Example 11: Expression of PRO in E. coli This example illustrates preparation of an unglycosylated form of PRO by recombinant expression in E. coli.
DNA配列コード化は選択されたPCRプライマーを利用して最初に増幅される。 DNA sequences encoding is initially amplified using selected PCR primers. このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。 The primers should contain restriction enzyme sites which correspond to the restriction enzyme sites on the selected expression vector. 様々な発現ベクターを使用することができる。 You may use a variety of expression vectors. 適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来;Bolivarら, Gene, 2:95 (1997)を参照のこと)がある。 Suitable examples of the vector, pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance; is (E. coli Bolivar et al, Gene, see two ninety-five (1997)). ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。 The vector is digested with restriction enzyme and dephosphorylated. 次いで、PCR増幅配列をベクターにライゲーションする。 Then ligating PCR amplified sequences into the vector. ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリHisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリHisリーダー、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PROコード領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。 Vector preferably encodes antibiotic resistance gene, trp promoter, a poly-His leader (including the first six STII codons, poly-His leader, and enterokinase cleavage site), PRO coding region, lambda transcriptional gathered factors and argU gene including the array.

次いで、Sambrookら, 上記に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。 Then, Sambrook et al., A selected E. coli strain using the methods described above to transform, using the ligation mixture. 形質転換体をLB部レート上でのその成長能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。 Transformants are identified by their ability to grow on LB plates antibiotic resistant colonies are then selected. プラスミドDNAを単離し、それを制限分析及びDNA配列決定によって確認することができる。 Plasmid DNA can be isolated and confirmed by restriction analysis and DNA sequencing.
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたLBブロスのような液体培地で一晩かけて成長させることができる。 Selected clones can be grown overnight in liquid culture medium such as LB broth supplemented with antibiotics. この一晩の培養を、次により大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。 The overnight culture may be used to inoculate a larger scale culture. そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作用し始める。 The cells are then grown to a desired optical density, during which the expression promoter is turned on.
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。 Several more hours, after culturing the cells, it is possible to collect the cells by centrifugation. 遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したPROタンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。 The cell pellet obtained by the centrifugation can be solubilized using various agents known in the art, then, metal chelating under conditions that the PRO protein this dissolution, allow tight binding of the protein it is possible to purified using column.

以下の手法を用いて、ポリ−Hisタグ形態でPROを大腸菌で発現させてもよい。 , Using the following procedure PRO poly -His tagged form may be expressed in E. coli. PROをコードするDNAを、選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。 DNA encoding PRO, is initially amplified using selected PCR primers. このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。 The primers will contain restriction enzyme sites which correspond to the restriction enzyme sites on the selected expression vector, and efficient and reliable translation initiation, rapid purification on a metal chelation column, and proteolytic removal with enterokinase It gives other useful sequences. 次いで、PCR増幅されたポリ-Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。 Then, to bind the PCR amplified poly -His tag sequence into an expression vector, which was used to transform an E. coli host based on strain 52 (W3110 fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq)). 形質転換体を、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中で、30℃で振盪しながら3−5のO. Transformants in LB containing initially 50 mg / ml carbenicillin with shaking 3-5 O. at 30 ° C. D. D. 600に達するまで成長させた。 It was grown until it reaches the 600. ついで培養液をCRAP培地(3.57gの(NH SO 、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO の混合で調製)中にて50−100倍希釈し、30℃で振盪によって約20−30時間成長させた。 Then the culture solution CRAP media (of 3.57g (NH 4) 2 SO 4 , sodium citrate · 2H 2 O in 0.71 g, KCl of 1.07 g, Difco yeast extract 5.36 g, of 500mL water 5 .36g of Sheffield hycase SF, and 110mM of MPOS, diluted 50-100 fold with pH7.3,0.55% (w / v) glucose and prepared with mixing of MgSO 4 in the 7 mM) in, at 30 ° C. It is grown about 20-30 hours by shaking. SDS-PAGEにより発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。 Samples are removed to verify expression by SDS-PAGE, cells and the bulk culture is centrifuged to pellet the. 精製及びリフォールディング(再折りたたみ)まで、細胞ペレットを凍結させた。 Until purification and refolding, Cell pellets are frozen.

0.5から1Lの発酵(6−10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させた。 E. coli paste from the fermentation of 0.5 to 1L (6-10 g pellets), 7M guanidine, 20 mM Tris and resuspended in 10 volumes pH8 buffer (w / v). 固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。 Was added solid sodium sulfite and sodium tetrathionate to a final concentration of each 0.1M and 0.02 M, the solution was stirred overnight at 4 ° C. The. この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。 This step denatured protein with all cysteine ​​residues blocked by sulfitolization. 溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。 The solution was concentrated for 30 minutes at 40,000rpm in a Beckman Ultracentrifuge. 上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3−5容量で希釈し、透明にするために0.22ミクロンフィルターを通して濾過する。 Supernatants metal chelate column buffer (guanidine 6M, 20 mM Tris, pH 7.4) was diluted with 3-5 volumes of filtered through 0.22 micron filters to clarify. 透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに負荷した。 The clarified extract is loaded onto Qiagen Ni-NTA metal chelate column 5ml equilibrated in the metal chelate column buffer. カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。 The column of 50mM imidazole (Calbiochem, Utrol grade) additional buffer containing washed with pH 7.4. タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。 The protein was eluted with buffer containing 250mM imidazole. 所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。 Fractions containing the desired protein are pooled and stored at 4 ° C.. タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。 Protein concentration is estimated by its absorbance at 280nm using the calculated extinction coefficient based on its amino acid sequence.

試料を20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。 Samples 20mM Tris, NaCl of PH8.6,0.3M, urea 2.5M, cysteine ​​5 mM, and gradually by dilution in refolding buffer was freshly prepared consisting of 20mM glycine and 1mM of EDTA, protein was allowed to play. リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択した。 Refolding volumes are final protein concentration was chosen to be 50 to 100 micrograms / ml. リフォールディング溶液を4℃で12−36時間ゆっくりと撹拌した。 The refolding solution is stirred gently for 12-36 hours at 4 ° C. The. リフォールディング反応はTFAを採取濃度0.4%(約3のpH)で添加することにより停止させた。 The refolding reaction is quenched by the addition of TFA to a final concentration of 0.4% (about 3 pH). タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2−10%で添加した。 Before further purification of the protein, the solution was filtered through a 0.22 micron filter and acetonitrile is added to 2-10% final concentration. 再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。 The refolded protein, a Poros R1 / H reversed phase column was chromatographed using elution with mobile buffer gradient of acetonitrile from 10 to 80% of 0.1% TFA. A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。 Aliquots of fractions with A280 absorbance are analyzed on SDS polyacrylamide gels and fractions containing homogeneous refolded protein were pooled. 一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。 Generally, the properly refolded species of most proteins are those species are the most compact, since their hydrophobic interiors shielded from interaction with the reversed phase resin are eluted at the lowest concentrations of acetonitrile. 凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。 Aggregated species are usually eluted at higher acetonitrile concentrations. 誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。 Accidentally reproduced proteins in addition to excluding from the desired form, the reversed phase step also removes endotoxin from the samples.
所望の再生したPROポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。 Fractions containing the desired folded PRO polypeptide are pooled and the gentle stream of nitrogen directed at the solution acetonitrile removed using. タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に調製した。 Proteins, by gel filtration and sterile filtration equilibrated with G25 Superfine (Pharmacia) resins by dialysis or formulation buffer, 20 mM Hepes, containing sodium chloride and 4% mannitol 0.14 M, were prepared in pH 6.8.
ここで開示された多くのPROポリペプチドは、上記の方法によって成功裏に発現した。 Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed by the above methods.

実施例12:哺乳動物細胞におけるPROの発現 この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のPROの調製を例証する。 EXAMPLE 12 This example expression of PRO in mammalian cells, illustrates preparation of a potentially glycosylated form of PRO by recombinant expression in mammalian cells.
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP307,247参照)を用いた。 Using the vector pRK5 (see EP307,247 published March 15, 1989) as an expression vector. 場合によっては、PRO DNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上記のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてPRODNAを挿入させる。 Sometimes, is ligated into pRK5 with selected restriction enzymes to PRO DNA, inserting the PRODNA using ligation methods such as described in the aforementioned Sambrook et al. 得られたベクターは、pRK5-PROと呼ばれる。 The resulting vector is called pRK5-PRO.

一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞とすることができる。 In one embodiment, the selected host cells may be 293 cells. ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。 Human 293 cells (ATCC CCL 1573) are with fetal calf serum and optionally, to confluence grown in tissue culture plates in medium such as DMEM supplemented nutrient components and / or antibiotics. 約10μgのpRK5-PRODNAを約1μgのVA RNA遺伝子コード化DNA[Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))]と混合し、500μlの1mM トリス-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl に溶解させた。 DNA encoding the VA RNA gene of the pRK5-PRO-DNA of about 10μg to about 1 [mu] g [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982))] was mixed, 500 [mu] l of 1mM Tris -HCl, 0.1mM EDTA, 0.227M CaCl It was dissolved in 2. この混合物に、滴状の500μlの50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。 To this mixture is added, dropwise, 500μl of 50 mM HEPES (pH 7.35), was added 280 mM NaCl, the 1.5 mM NaPO 4, to form a 10 min precipitates at 25 ° C.. 析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。 The precipitate is suspended and added to the 293 cells and allowed to settle at 37 ° C. for about 4 hours. 培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加した。 The medium was aspirated, and 20% glycerol in PBS 2ml was added for 30 seconds. 293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。 293 cells are then washed with serum free medium, fresh medium is added and cells are incubated for about 5 days.
トランスフェクションの約24時間後、培地を除去し、培地(のみ)又は200μCi/ml 35 S−システイン及び200μCi/ml 35 S−メチオニンを含む培地で置換した。 Approximately 24 hours after transfection, the medium was removed and replaced with medium containing culture medium (alone) or 200 uCi / ml 35 S- cysteine and 200 uCi / ml 35 S- methionine. 12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。 After a 12 hour incubation, the conditioned medium is collected, concentrated on a spin filter, and loaded onto a 15% SDS gel. 処理したゲルを乾燥させ、PROポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。 The processed gel may be dried and exposed to film for a selected period of time to reveal the presence of PRO polypeptide. 形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。 To cultures containing transfected cells may undergo further incubation (in serum free medium) were tested in selected bioassays medium.

これに換わる技術において、PROは、Somparyacら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。 In the technical alternative to this, PRO is, Somparyac et, Proc Natl Acad Sci, 12:.... 7575 (1981) transiently introduced into 293 cells using the dextran sulfate method described by. 293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのpRK5-PRODNAを添加する。 293 cells are grown to maximal density in a spinner flask and adding pRK5-PRO-DNA of 700 [mu] g. 細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄した。 Cells were first concentrated from the spinner flask by centrifugation and washed with PBS. DNA-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。 The DNA- dextran precipitate is incubated on the cell pellet for four hours. 細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。 The cells are treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue culture medium, tissue culture medium, and re-introduced into the spinner flask containing 5 [mu] g / ml bovine insulin and 0.1 [mu] g / ml bovine transferrin. 約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。 After about four days, the conditioned media is centrifuged and filtered to remove cells and debris. 次いで発現PROポリペプチドを含む試料を、透析及び/又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって濃縮し精製することが可能である。 The sample containing expressed PRO polypeptide is then possible to concentrated and purified by any selected method, such as dialysis and / or column chromatography.
他の実施態様では、PROをCHO細胞で発現させることができる。 In another embodiment, it is possible to express the PRO in CHO cells. pRK5-PROは、CaPO 又はDEAE−デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞にトランスフェクションすることができる。 The pRK5-PRO can be transfected into CHO cells using known reagents such as CaPO 4 or DEAE- dextran. 上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(のみ)又は35 S-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。 As described above, the cell cultures can be incubated, and the medium replaced with culture medium containing a radiolabel such as culture medium (alone) or 35 S- methionine. PROポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。 After determining the presence of PRO polypeptide, the culture medium may be replaced with serum free medium. 好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。 Preferably, the cultures are incubated for about 6 days, and then the conditioned medium is harvested. 次いで、発現PROポリペプチドを含む培地を、任意の選択した方法によって濃縮し精製することができる。 The medium containing the expressed PRO polypeptide can be concentrated and purified by any selected method.

また、エピトープタグPROは、宿主CHO細胞において発現させてもよい。 Epitope-tagged PRO may also be expressed in host CHO cells. PROはpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。 PRO may be subcloned out of the pRK5 vector. サブクローン挿入物は、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。 The subclone insert can undergo PCR to fuse in frame with a selected epitope tag poly -his tag or the like into a Baculovirus expression vector. ポリ-hisタグPRO挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。 Poly -his tagged PRO insert can then be subcloned into a SV40 driven vector containing a selection marker such as DHFR for selection of stable clones. 最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで(上記のように)トランスフェクションした。 Finally, the CHO cells (as described above) with the SV40 driven vector was transfected. 発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。 To verify expression, the labeling may be performed as described above. 発現されたポリ-hisタグPROを含む培地は、次いで濃縮し、Ni 2+ -キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。 The culture medium containing the expressed poly -his tagged PRO can then be concentrated, Ni 2+ - can be purified by any selected method, such as chelate affinity chromatography.
またPROは、一過性発現法によりCHO及び/又はCOS細胞で、他の安定な発現方法によりCHO細胞で発現させてもよい。 The PRO is in CHO and / or COS cells by a transient expression procedure may also be expressed in CHO cells by another stable expression procedure.
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。 Stable expression in CHO cells is performed using the following method. タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列(例えば、細胞外ドメイン)がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含む定常領域配列に融合したIgG作成物(イムノアドヘシン)、又はポリ-Hisタグ形態として発現された。 Protein the coding sequences for the soluble forms of the respective proteins (e.g., extracellular domains) IgG1 hinge, IgG construct fused to the constant region sequence containing the CH2 and CH2 domains (immunoadhesin), or poly -His It was expressed as a tagged form.

PCR増幅に続いて、対応するDNAを、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.26, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。 Following PCR amplification, the corresponding DNA, Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.26, was subcloned into the CHO expression vector using standard techniques as described in John Wiley and Sons (1997). CHO発現ベクターは、対象とするDNAの5'及び3'に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように作成される。 CHO expression vectors are constructed to have compatible restriction sites 5 'and 3' of the DNA of interest to allow the convenient shuttling of cDNA. ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)の発現の制御にSV40初期プロモーター/エンハンサーを用いる。 Vector, Lucas et al, Nucl Acids Res 24:.. 9, 1774-1779 using the expression in CHO cells as described in (1996), cDNA and dihydrofolate reductase as a target of expression (DHFR) It uses the SV40 early promoter / enhancer to control. DHFR発現は、トランスフェクションに続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。 DHFR expression permits selection for stable maintenance of the plasmid following transfection.
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販のトランスフェクション試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)約1千万のCHO細胞に導入する。 Twelve micrograms of the desired plasmid DNA, commercially available transfection reagents Superfect (R) (Quiagen), is introduced into Dosper (R) and Fugene (R) (Boehringer Mannheim) about 10 million CHO cells. 細胞は、上記のLucas等に記載されているように成長させた。 Cells were grown as described above Lucas et. 約3x10 細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。 About 3x10 7 cells are frozen in an ampule for further growth and production as described below.

プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。 The ampules containing the plasmid DNA are thawed by placement into water bath and mixed by vortexing. 内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。 The contents are pipetted into a centrifuge tube containing medium 10 mL, and centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. 上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加)中に懸濁させた。 Cells were suspended in selective media 10 mL (addition of 0.2μm filtered PS20 with 5% of 0.2μm diafiltered fetal bovine serum) was aspirated supernatant. 次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mLスピナーに分ける。 The cells are then aliquoted into 100mL spinner containing selective media 90 mL. 1−2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。 After 1-2 days, the cells are transferred into a 250mL spinner filled with selective medium of 150 mL, and incubated at 37 ° C.. さらに2−3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x10 細胞/mLで播種した。 After another 2-3 days, were inoculated 250 mL, spinners 500mL and 2000mL at 3x10 5 cells / mL. 細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。 The cell media is exchanged with fresh media by centrifugation and resuspension in production medium. 任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。 It may be used any suitable CHO media but actually using a production medium described in U.S. Patent No. 5,122,469, issued June 16, 1992. 3Lの生産スピナーを1.2x10 細胞/mLで播種した。 A 3L production spinner is seeded at 1.2x10 6 cells / mL. 0日目に、細胞数とpHを測定した。 On day 0, it was measured the number of cells and pH. 1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。 On day 1, the spinner is sampled and sparging with filtered air. 2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、30mLの500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤(例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)をとった。 On day 2, the spinner is sampled, the temperature shifted to 33 ° C., 10% antifoam glucose and 0.6mL of 30mL of 500 g / L (e.g. 35% polydimethylsiloxane emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) It was taken. 生産を通して、pHは7.2近傍に調節し維持した。 Throughout the production, pH was adjusted as necessary to keep it at around 7.2. 10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。 After 10 days, or until viability dropped below 70%, the cell culture was filtered through a 0.22μm filter is harvested by centrifugation. 濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。 The filtrate was either stored at 4 ° C., it was immediately loaded onto columns for purification.

ポリ-Hisタグ作成物に関して、タンパク質をNi-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。 Regard poly -His tagged constructs, the proteins are purified using a Ni-NTA column (Qiagen). 精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。 Before purification, it was added to a concentration of 5mM imidazole conditioned media. 条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes,pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムへ4−5ml/分の流速によって4℃でポンプ供給した。 The conditioned media, 20 mM Hepes, containing NaCl and 5mM imidazole 0.3 M, was pumped at 4 ° C. by equilibrated with a flow rate of 4-5 ml / min to Ni-NTA column 6ml at pH7.4 buffer. 充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。 After loading, the column is washed with additional equilibration buffer and the protein eluted with equilibration buffer containing 0.25M imidazole. 高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトール,pH6.8を含む貯蔵バッファー中で25mlのG25Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵した。 The highly purified protein is subsequently 10mM of Hepes, NaCl and 4% mannitol 0.14 M, desalted using G25 Superfine (Pharmacia) in 25ml into a storage buffer containing pH 6.8, -80 ° C. in and stored.

イムノアドヘシン(Fc含有)作成物を、以下通りに条件培地から精製した。 Immunoadhesin (Fc-containing) constructs are purified from the conditioned media as follows. 条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー,pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)へポンプ注入した。 The conditioned media, 20 mM sodium phosphate buffer, was pumped into the Protein A column equilibrated with 5 ml (Pharmacia) at pH 6.8. 充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸,pH3.5で溶離した。 After loading, the column is washed extensively with equilibration buffer, 100 mM citric acid, and eluted with pH 3.5. 溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μLの1Mトリスバッファー,pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。 The eluted protein is immediately neutralized by collecting fractions 1 ml 1M Tris buffer 275MyuL, into tubes containing pH 9. 高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。 The highly purified protein is subsequently for the poly -His tagged proteins were desalted into storage buffer as described above. 均一性はSDSポリアクリルアミドゲルとエドマン(Edman)分解によるN−末端アミノ酸配列決定により評価した。 Homogeneity was assessed by N- terminal amino acid sequencing by Edman (Edman) decomposition SDS polyacrylamide gels.
ここに開示したPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。 Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.

実施例13:酵母菌でのPROの発現 以下の方法は、酵母菌中でのPROポリペプチドの組換え発現を記載する。 Example 13: The following method describes recombinant expression of PRO in Yeast describes recombinant expression of PRO polypeptides in yeast.
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。 First, yeast expression vectors are constructed for PRO intracellular production or secretion from the ADH2 / GAPDH promoter. PROポリペプチドをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROポリペプチドの細胞内発現を指示する。 It is inserted into suitable restriction enzyme sites in the selected plasmid DNA and the promoter encoding a PRO polypeptide to direct intracellular expression of the PRO polypeptide. 分泌のために、PROをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然PROシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)PROの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。 For secretion, the selected plasmid DNA encoding the PRO, DNA encoding the ADH2 / GAPDH promoter, a native PRO signal peptide or other mammalian signal peptide, or, for example, a yeast α-factor or invertase secretory signal / leader sequence, and it may be cloned with linker sequences for the expression of (if needed) PRO.

酵母菌株AB110等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。 Yeast cells, such as yeast strain AB110, can then be transformed with the expression plasmids described above and cultured in selected fermentation media. 形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS−PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。 The transformed yeast supernatants can be analyzed by precipitation and separation by SDS-PAGE on 10% trichloroacetic acid, followed by staining of the gels with Coomassie Blue stain.
続いて組換えPROポリペプチドは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。 Subsequently recombinant PRO polypeptide, removing the yeast cells from the fermentation medium by centrifugation and then be isolated and purified by concentrating the medium using selected cartridge filters. PROポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。 Concentrate containing PRO polypeptide may further be purified using selected column chromatography resins.
ここに開示したPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。 Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.

実施例14:バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPROの発現 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPROの組換え発現を記載する。 Example 14: The following method describes recombinant expression of PRO in Baculovirus-infected insect cells describes recombinant expression of PRO in Baculovirus-infected insect cells.
PROコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。 The sequence coding for PRO is fused upstream of an epitope tag contained within a baculovirus expression vector. このようなエピトープタグは、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。 Such epitope tags include poly -his tags and immunoglobulin tags (like Fc regions of IgG). pVL1393(Navagen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。 It is possible to use various plasmid containing pVL1393 (Novagen) plasmids derived from commercially available plasmids such as. 簡単には、PRO又はPROコード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、5'及び3'領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。 Briefly, a predetermined portion of the PRO or PRO coding sequence, such as a film sequence or protein encoding the extracellular domain of a transmembrane protein encodes a mature protein if the protein is extracellular sequence, 5 'and 3' regions It is amplified by PCR with primers complementary. 5'プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。 5 'primer may incorporate flanking (selected) restriction enzyme sites. 生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。 The product is then digested with those selected restriction enzymes and subcloned into the expression vector.

組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて同時トランスフェクションすることにより作成される。 The recombinant baculovirus, concurrent with the above plasmid and BaculoGold (trade name) virus DNA (Pharmingen), a Spodoptera frugiperda ( "Sf9") cells (ATCC CRL 1711) using lipofectin (commercially available from GIBCO-BRL) Toransufu It is created by Ekushon. 28℃で4−5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。 After 4-5 days of incubation at 28 ° C., the released viruses are harvested and used for further amplifications. ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。 Viral infection and protein expression, O'Reilley et al, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: was performed as described in Oxford University Press (1994).

次に、発現されたポリ-hisタグPROは、例えばNi 2+ -キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。 Next, expressed poly -his tagged PRO, for example, Ni 2+ - are purified as follows chelate affinity chromatography. 抽出は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。 Extraction, Rupert et al., Nature, 362: 175-179, as described in (1993), was prepared from recombinant Sf9 cells infected. 簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(25mLのHepes,pH7.9;12.5mMのMgCl ;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP−40;0.4MのKCl)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。 Briefly, Sf9 cells are washed, Hepes sonication buffer (25 mL, pH 7.9; 12.5 mM of MgCl 2; 0.1mM EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0 resuspended KCl) in .4M, was 20 seconds twice sonicated on ice. 超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー(50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。 The sonicates are cleared by centrifugation, loading buffer supernatants (50 mM phosphate, 300 mM of NaCl, 10% glycerol, pH 7.8) was diluted 50-fold with, and filtered through a 0.45μm filter. Ni 2+ -NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させた。 Ni 2+ -NTA agarose column (commercially available from Qiagen) is prepared with a bed volume of 5 mL, washed with water 25 mL, and equilibrated with loading buffer 25 mL. 濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷した。 The filtered cell extract is loaded onto the column per minute 0.5 mL. カラムを、分画回収が始まる点であるA 280のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。 The column was washed with loading buffer to baseline A 280, at which point fraction collection is started. 次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩;300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄した。 Next, the column is washed with a secondary wash buffer which elutes nonspecifically bound protein (50 mM phosphate; 300 mM of NaCl, 10% glycerol, pH 6.0) and washed with. 280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。 After reaching baseline again A 280, the column is developed with a 0 to in the secondary wash buffer 500mM Imidazole gradient. 1mLの分画を回収し、SDS-PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に複合したNi 2+ -NTAでのウェスタンブロットで分析した。 Fractions are collected in 1 mL, and analyzed by Western blot with Ni 2+ -NTA-conjugated to SDS-PAGE and silver staining or alkaline phosphatase (Qiagen). 溶離したHis 10 -タグPROを含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。 Eluted His 10 - was dialyzed fractions containing the tagged PRO in loading buffer pool.
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。 Alternatively, purification of the IgG tagged (or Fc tagged) PRO, for example, can be performed using known chromatography techniques, including Protein A or protein G column chromatography.
ここに開示したPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。 Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.

実施例15:PROに結合する抗体の調製 この実施例は、PROに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。 EXAMPLE 15 This example Preparation of Antibodies that Bind PRO illustrates the preparation of monoclonal antibodies which can specifically bind PRO.
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGodingに記載されている。 Techniques for producing the monoclonal antibodies are known in the art, for example, are described in the above Goding. 用いられ得る免疫原は、精製PROポリペプチド、PROポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えPROポリペプチドを発現する細胞を含む。 Immunogens that may be employed include purified PRO polypeptide, fusion proteins containing PRO polypeptides, and cells expressing recombinant PRO polypeptide on the cell surface. 免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。 Selection of the immunogen can be made by the skilled artisan without undue experimentation.
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1−100マイクログラムで注入したPRO免疫原で免疫化する。 Mice, such as Balb / c, emulsified in complete Freund's adjuvant are immunized with the PRO immunogen was injected at 1-100 micrograms subcutaneously or intraperitoneally. あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, ハミルトン, モンタナ)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。 Alternatively, the immunogen MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT) emulsified in, and injected into the animal's hind foot pads. 免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。 Mice immunization and then 10 to 12 days later with additional immunogen emulsified in the selected adjuvant. その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。 Thereafter, for several weeks, boosted the mice with additional immunization injections. 抗PRO抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。 For testing in ELISA assays to detect anti-PRO antibodies, serum samples from retro-orbital bleeding may be periodically obtained from the mice.

適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ(陽性)」な動物に、PRO静脈内注射の最後の注入をすることができる。 After a suitable antibody titer has been detected, the "positive" animals for antibodies can be the last injection of PRO intravenous injection. 3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。 Three to four days later, the mice are sacrificed and the spleen cells are harvested. 次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ACTTから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU. The spleen cells are then fused (using 35% polyethylene glycol), P3X63AgU available under No. CRL1597 from ACTT. 1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。 Fused to a selected murine myeloma cell line of 1, and the like. 融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。 The fusions generate hybridoma cells which can then, HAT (hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) were plated in 96-well tissue culture plates containing non-fused cells, it was inhibited myeloma hybrids, and the proliferation of spleen cell hybrids.
ハイブリドーマ細胞は、PROに対する反応性についてのELISAでスクリーニングされる。 The hybridoma cells will be screened in an ELISA for reactivity against PRO. PROに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。 Determination of "positive" hybridoma cells secreting the desired monoclonal antibodies against PRO is within the skill in the art.
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗PROモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。 The positive hybridoma cells can be injected intraperitoneally into syngeneic Balb / c mice to produce ascites containing the anti-PRO monoclonal antibodies. あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。 Alternatively, the hybridoma cells can be grown in tissue culture flasks or roller bottles. 腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。 Purification of the monoclonal antibodies produced in the ascites, ammonium sulfate precipitation, followed by gel exclusion chromatography - can be carried out using. あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。 Alternatively, it is also possible to use affinity chromatography based upon binding of antibody to protein A or protein G.

実施例16:特異的抗体を用いたPROポリペプチドの精製 天然又は組換えPROポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。 Example 16: Purification of natural or recombinant PRO polypeptide of PRO Polypeptides Using Specific Antibodies may be purified by a variety of standard techniques in the art of protein purification. 例えば、プロ-PROポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-PROポリペプチドは、対象とするPROポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。 For example, pro--PRO polypeptide, mature polypeptide, or pre -PRO polypeptide is purified by immunoaffinity chromatography using antibodies specific for the PRO polypeptide of interest. 一般に、免疫親和性カラムは抗PROポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。 In general, an immunoaffinity column is constructed by covalently coupling the anti-PRO polypeptide antibody to an activated chromatographic resin.
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインA(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。 Polyclonal immunoglobulins are precipitated or immobilized protein A with ammonium sulfate (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) are prepared from immune sera either by purification on. 同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインAでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。 Likewise, monoclonal antibodies are prepared from mouse ascites fluid by ammonium sulfate precipitation or chromatography on immobilized Protein A. 部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化セファロース(商品名)(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。 Partially purified immunoglobulin is covalently attached to CnBr- activated Sepharose (trade name) (Pharmacia LKB Biotechnology) chromatography resin such. 抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。 The antibody is coupled to the resin, the resin is blocked, and the derivative resin is washed according to the manufacturer's instructions.

このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のPROポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるPROポリペプチドの精製において利用される。 Such an immunoaffinity column is utilized in the purification of PRO polypeptide by preparing a fraction from cells containing PRO polypeptide in a soluble form. この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。 The preparation by methods known in addition or the art of detergent-induced solubilization of the whole cell or of a subcellular fraction obtained via differential centrifugation. あるいは、シグナル配列を含む可溶化PROポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。 Alternatively, soluble PRO polypeptide containing a signal sequence may be secreted in useful quantity into the medium in which the cells are grown.
可溶化PROポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはPROポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。 Soluble PRO polypeptide-containing preparation is passed over the immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow the preferential absorbance of PRO polypeptide (e.g., high ionic strength buffers detergents presence). 次いで、カラムは、抗体/PROポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2−3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、PROポリペプチドが回収される。 Then, the column is eluted under conditions that disrupt antibody / PRO polypeptide binding (e.g., low pH, high concentrations of urea or chaotrope such as thiocyanate ion, such as about 2-3) eluted with, PRO polypeptide is collected .

実施例17:薬物スクリーニング 本発明は、PROポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングとって特に有用である。 EXAMPLE 17: Drug Screening This invention is particularly useful for screening compounds by using PRO polypeptides or a variety of drug screening techniques binding fragment thereof. そのような試験に用いられるPROポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。 PRO polypeptide or fragment employed in such a test may either be free in solution, affixed to a solid support, borne on a cell surface, or may be located intracellularly. 薬剤スクリーニングの1つの方法では、PROポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定にトランスフェクションされる真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。 In one method of drug screening utilizes eukaryotic or prokaryotic host cells which are stably transformed with recombinant nucleic acids expressing the PRO polypeptide or fragment. 薬剤は、そのようなトランスフェクション細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。 Agents, for such transfected cells are screened by a competitive binding assays. 生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。 Either in viable or fixed form, such cells can be used for standard binding assays. 例えば、PROポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。 One may measure, for example, the formation of complexes between the agent being tested with PRO polypeptide or fragment. あるいは、試験する試薬によって生ずるPROポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験することもできる。 Alternatively, one can examine the diminution in complex formation between the PRO polypeptide caused by the agent being tested and the target cells.

従って、本発明は、PROポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。 Accordingly, the present invention provides methods of screening for drugs or any other agents which can affect a PRO polypeptide-associated disease or disorder. これらの方法は、その試薬をPROポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とPROポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)PROポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、検定することを含む。 These methods comprise contacting such an agent with an PRO polypeptide or fragment, (i) for the presence of a complex between the agent and the PRO polypeptide or fragment, or (ii) the PRO polypeptide or fragment and the cell for the presence of a complex between involves assay. これらの競合結合アッセイでは、PROポリペプチド又は断片が典型的には標識される。 In such competitive binding assays, PRO polypeptide or fragment is typically labeled. 適切なインキュベーションの後、自由なPROポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPROポリペプチドに結合する又はPROポリペプチド/細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。 After suitable incubation, free PRO polypeptide or fragment is separated from that present in bound form, and the amount of free or uncomplexed label is, the particular agent to bind to PRO polypeptide or PRO polypeptide / cell complex a measure of the ability to inhibit.

薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。 Another technique for drug screening provides high throughput screening for compounds having suitable binding affinity to a polypeptide, is described in detail in WO84 / 03564, published Sep. 13, 1984 ing. 簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。 Briefly, large numbers of different small peptide test compounds are synthesized on a solid support or some other surface such as plastic pins. PROポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はPROポリペプチドと反応して洗浄される。 When applied to a PRO polypeptide, the peptide test compounds are reacted with PRO polypeptide and washed. 結合したPROポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。 Bound PRO polypeptide is detected by methods well known in the art. 精製したPROポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。 Purified PRO polypeptide can also be coated directly onto plates for use in the aforementioned drug screening techniques. さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。 In addition, non-neutralizing antibodies to capture the peptide, it can be used to immobilize on a solid support.
また、本発明は、PROポリペプチドに結合可能な中和抗体がPROポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。 This invention also contemplates the use of competitive drug screening assays in which neutralizing antibodies capable of binding to PRO polypeptide is PRO test compound for a polypeptide or fragment thereof specifically compete. この方法において、抗体は、PROポリペプチドで、1つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。 In this method, the antibody is a PRO polypeptide can be used to detect the presence of any peptide which shares one or more antigenic determinants.

実施例18:合理的薬物設計 合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド(例えば、PROポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。 Example 18: The purpose of rational drug design rational drug design is biologically active polypeptide of interest (e.g., PRO polypeptide) or of small molecules with which they interact, eg, agonists, antagonists, or inhibitors structure it is to produce the analogue thereof. これらの例の任意のものが、PROポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでPROポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991))。 Any of these examples can be used to fashion drugs which promote or inhibit more features PRO polypeptide in a stable form or in vivo activity of the PRO polypeptide (reference, Hodgson, Bio / Technology, 9: 19 -21 (1991)).

1つの方法において、PROポリペプチド、又はPROポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、x線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には2つの方法の組み合わせにより決定される。 In one method, the PRO polypeptide or PRO polypeptides - the three-dimensional structure of the inhibitor complex, by x-ray crystallography, by computer modeling or, most typically, is determined by a combination of the two approaches. 分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、PROポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。 To determine elucidate the active site structure of the molecule, both the shape and charges of the PRO polypeptide must be ascertained. 数は少ないが、PROポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。 Less often, sometimes useful information regarding the structure of the PRO polypeptide may be gained by modeling based on the structure of homologous proteins. 両方の場合において、関連する構造情報は、類似PROポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。 In both cases, relevant structural information is used to identify the design or effective inhibitors analogous PRO polypeptide-like molecules. 合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthaudaら,J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。 Useful examples of rational drug design, Braxton and Wells, Biochemistry, 31:. 7796-7801 molecules which have improved activity or stability as shown in (1992), or Athauda et al, J Biochem. , 113: 742-746 (1993) at the indicated natural peptide inhibitors, such as, agonists, or molecules that act as antagonists.

また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。 Further to isolate a target-specific antibody, selected by functional assay, as described above, it is also possible to solve its crystal structure. この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。 This approach, in principle, drug design subsequent to generate pharmacore capable of basing (pharmacore). 機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ids)を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。 Anti to a functional, pharmacologically active antibody - by generating idiotypic antibodies (anti -ids), it is possible to bypass protein crystallography. 鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。 As a mirror image of a mirror image, it can be predicted that the binding site of the anti -ids is an analog of the original receptor. 抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。 Anti -id can then be used to identify and isolate peptides from chemically or biologically produced peptides bank. 単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。 The isolated peptides would then act as the pharmacore.
本発明によって、X線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のPROポリペプチドが入手可能である。 The present invention, sufficient amounts of the PRO polypeptide to perform such analytical studies as X-ray crystallography are available. さらに、ここに提供したPROポリペプチドアミノ酸配列の知識は、X線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。 Furthermore, knowledge of the PRO polypeptide amino acid sequence provided herein will provide guidance to those used in the place of X-ray crystallography or computer modeling techniques applied thereto.

実施例19:差次的組織発現分布 オリゴヌクレオチドプローブを、定量PCR増幅反応での利用のために、添付図面に示すPRO1031、PRO1122、PRO21175、PRO10272、PRO20110、PRO5801、PRO20040、PRO9877、及びPRO20026ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列から構築した。 Example 19: a differential tissue expression distribution oligonucleotide probes, for use in quantitative PCR amplification reactions, shown in the accompanying drawings PRO1031, PRO1122, PRO21175, PRO10272, PRO20110, PRO5801, PRO20040, PRO9877, and PRO20026 polypeptide It was constructed from the coding nucleotide sequence. オリゴヌクレオチドプローブを、標準的PCR反応において、その結合テンプレートの3' 末端から、約200−600塩基対の増幅断片が生じるように選択した。 The oligonucleotide probes in a standard PCR reaction, from 3 'end of the binding template were chosen to amplify a fragment of approximately 200-600 base pairs occurs. このオリゴヌクレオチドプローブを、異なるヒト成人及び/又は胎児の組織源から単離されたcDNAライブラリーを用いた標準的な定量PCR増幅反応に使用し、試験した種々の組織におけるPROポリペプチドコード化核酸の発現レベルの定量を得るためにアガロースゲル電気泳動によって分析した。 The oligonucleotide probes, different human adult and / or used in standard quantitative PCR amplification reactions with cDNA libraries from tissue sources isolated fetal, PRO polypeptide-encoding nucleic acid in various tissues tested It was analyzed by agarose gel electrophoresis to obtain a quantification of expression levels. 種々の異なるヒト組織型におけるPROポリペプチドコード化核酸の発現パターンの知識は、転移腫瘍等の一次組織源を決定するために、他の組織特異的マーカーを用いて又は用いない組織分類分けに有用な診断用マーカーが提供される。 Knowledge of the expression pattern of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid in various different human tissue types, to determine the primary tissue source such as metastatic tumors, useful tissue classification without it or with reference to other tissue specific markers diagnostic marker is provided Do not. これらのアッセイは、以下の結果を提供する。 These assays provide the following results.

実施例20:レセプター/リガンド相互作用の同定−レセプター/リガンド相互作用の同定に関するPROポリペプチドのスクリーニングアッセイの概要 このアッセイでは、レセプター/リガンド相互作用を同定することを目的として、潜在的レセプター又はリガンド分子の一群(パネル)へ結合する能力に関して種々のPROポリペプチドを試験する。 Example 20: Receptor / Identification of ligand interactions - receptor / Overview This assay of screening assays for PRO polypeptide for the identification of ligand interactions, for the purpose of identifying receptor / ligand interactions, potentially receptor or ligand to test the various PRO polypeptides for the ability to bind to a class of molecules (panel). 既知のレセプターに対するリガンド、既知のリガンドに対するレセプター或いは新規のレセプター/リガンド対の同定は種々の指示にとって有用であり、それらには例えば、レセプター又はリガンドを発現することが知られている細胞へ生物活性分子(リガンド又はレセプターへ結合)を標的とすること、組成物がリガンド又はレセプターを発現すると思われる細胞を含む可能性がある場合に、レセプター又はリガンドを含むと思われる組成物中でのそれらの存在を検出する試薬としてレセプター又はリガンドを利用すること、レセプター又はリガンドを発現すること又はこれらへ反応することが知られている細胞の成長、或いはその他の生物学的又は免疫学的活性を調節すること、細胞の免疫応答又はレセプター又はリガンドを発現する細 Ligands for known receptors, the identification of the receptor or novel receptor / ligand pair for known ligands are useful for a variety of instructions, it is to them for example, biological activity into cells are known to express the receptor or ligand molecules to the (binding to a ligand or receptor) to target when the composition may contain a cell suspected of expressing the ligand or receptor, thereof in the compositions suspected of containing the receptor or ligand utilizing receptor or ligand as a reagent to detect the presence, to regulate the growth of cells known to react to it, or they express the receptor or ligand, or other biological or immunological activity it, fine expressing immune response or receptor or ligand for a cell に対する免疫応答を調節すること、レセプター又はリガンドを発現する細胞の成長又は生物学的或いは免疫学的活性を調節するレセプター又はリガンドに対するアゴニスト、アンタゴニスト及び/又は抗体の調製を可能にすること、並びに普通の熟練技術者にとって難なく理解できる種々の他の指示が含まれる。 For modulating the immune response, allowing the preparation of agonists, antagonists and / or antibodies to the receptor or ligand regulate the growth or biological or immunological activity of a cell expressing the receptor or ligand, as well as ordinary without difficulty includes various other instructions that can be understood by those skilled technician.

一般的には、このアッセイは、次のようにしておこなわれる。 In general, this assay is performed as follows. レセプターのリガンドと思われる本発明のPROポリペプチドを、ヒトIgG(イムノアドヘシン)のFcドメインを含む融合タンパク質として発現する。 The PRO polypeptides of the present invention think that the ligand of the receptor, is expressed as a fusion protein comprising the Fc domain of human IgG (immunoadhesins). イムノアドヘシンポリペプチドと候補PROポリペプチドレセプターを発現する細胞(例えばCos細胞)との相互作用、結合したイムノアドヘシンのFc融合ドメインを対象とする蛍光試薬での視覚化、及び顕微鏡で検査することで、レセプター−リガンド結合を検出する。 Visualization with fluorescent reagent that interacts with the cells (e.g. Cos cells) expressing immunoadhesin polypeptide with a candidate PRO polypeptide receptors, the Fc fusion domain of bound immunoadhesin interest and examined microscopically it is, receptor - detecting ligand binding. 同時に、レセプター分子として機能する可能性があるPROポリペプチドをコードするcDNA発現ベクターのライブラリの明確な一部分の一過性トランスフェクションによって、候補レセプターを発現する細胞は生産される。 At the same time, by transient transfection of distinct portion of the library of cDNA expression vectors encoding PRO polypeptides that may function as receptor molecules, cells expressing the candidate receptor is produced. 次いで、レセプター結合の可能性を試験されるPROポリペプチドイムノアドヘシンの存在下において、細胞を1時間に渡ってインキュベーションする。 Then, in the presence of the PRO polypeptide immunoadhesin being tested for possible receptor binding, incubated over cells in 1 hour. この細胞を、次にパラホルムアルデヒドで洗浄して固定化する。 The cells are then immobilized by washing with paraformaldehyde. 次に、この細胞をPROポリペプチドイムノアドヘシンのFc部分に対する蛍光コンジュゲート抗体とインキュベートする(例えば、FITCコンジュゲートヤギ抗-ヒト-Fc抗体)。 Next, the cells are incubated with fluorescent conjugated antibody directed against the Fc part of the PRO polypeptide immunoadhesin (eg, FITC-conjugated goat anti - human -Fc antibody). 次に、この細胞を再び顕微鏡によって調べる。 Then, again examined by microscopy the cells. 特定のPROポリペプチドレセプター又はレセプタープールをコードするcDNAでトランスフェクションされた細胞に蛍光ラベルが在ること、並びに他のcDNA又はcDNAプールでトランスフェクションされた同様に調製された細胞に同様な蛍光ラベルが無いことによって、ポジティブ(陽性)相互作用は判断される。 The fluorescent label is in the cells transfected with cDNA encoding a particular PRO polypeptide receptor or receptor pool, as well as other cDNA or transfected similarly prepared similar fluorescent labels to cells in cDNA pools by that there is no, positive (positive) interaction is determined. PROポリペプチドイムノアドヘシンとの相互作用について、cDNA発現ベクターの明白なプールがポジティブ(陽性)であると判断された場合は、PROポリペプチドイムノアドヘシンと相互作用することができるレセプターをコードする特定のcDNAを確定するために、プールを構成する個々のcDNA種を個別に検定する(このプールは「崩壊される」)。 For interaction with a PRO polypeptide immunoadhesin, obvious pool of cDNA expression vectors is if it is judged as positive (positive), which encodes a receptor that can interact with the PRO polypeptide immunoadhesin to determine the specific cDNA, individually assayed individual cDNA species that constitute the pool (this pool "are collapsed").

このアッセイのその他の実施態様では、潜在的なエピトープタッグリガンドPROポリペプチド(例えば、8ヒスチジン「His」タッグ)は、ヒトIgGのFcドメイン(イムノアドヘシン)との融合として発現されている潜在的レセプターPROポリペプチドの一群(パネル)と相互作用する。 In another embodiment of this assay, potential epitopes tag ligand PRO polypeptide (e.g., 8 histidine "His" tag) it is potentially being expressed as a fusion with the Fc domain of human IgG (immunoadhesins) It interacts with group (panel) of the receptor PRO polypeptide. エピトープタッグPROポリペプチドとの1時間に渡る同時インキュベーションの後、個々の候補レセプターをプロテインAビーズで免疫沈降し、ビーズを洗浄した。 After the co-incubation over 1 hour to an epitope tag PRO polypeptide, immunoprecipitated the individual candidate receptors with protein A beads, the beads were washed. 潜在的なリガンド相互作用は、エピトープタッグを標的とする抗体による免疫沈降複合体のウェスタンブロット分析によって測定する。 Potential ligand interaction is determined by Western blot analysis of immunoprecipitated complexes with an antibody to the epitope tag target. エピトープタッグタンパク質の予想分子量のバンドが、候補レセプターとのウェスタンブロット分析において観察されるものの、潜在的レセプターの一群(パネル)の他のメンバーとのウェスタンブロットで観察されない場合には、、相互作用が起こっていると判断する。 Band of the expected molecular weight of the epitope tag proteins, of that observed in the western blot analysis with a candidate receptor, is ,, interaction if not observed in Western blots of other members of a group (panel) of potential receptors it is determined that is happening.

これらのアッセイを利用し、ここで、次のレセプター/リガンド相互作用が同定されている: Using these assays, where the following receptor / ligand interactions have been identified:
(1)PRO1031(ここで、ヒトIL-17Bリガンドと命名)がPRO5801(ここで、ヒトIL-17RH1レセプターと命名)と結合する。 (1) PRO1031 (where named human IL-17B ligand) is PRO5801 (here, the human IL-17RHl receptor nomenclature) binds.
(2)PRO10272(ここで、ヒトIL-17Eリガンドと命名)がPRO5801(ここで、ヒトIL-17RH1レセプターと命名)と結合する。 (2) PRO10272 (where named human IL-17E ligand) is PRO5801 (here, the human IL-17RHl receptor nomenclature) binds.
(3)PRO201110(ここで、ヒトIL-17Eリガンドと命名)がヒトIL−17レセプター(IL-17R)(Yaoら, Cytokine 9(11):794-800(1997);またここでPRO1と命名された)及びPRO20040(ここで、ヒトIL-17RH2レセプターと命名)へ結合する。 (3) PRO201110 (where named human IL-17E ligand) human IL-17 receptor (IL-17R) (Yao et al, Cytokine 9 (11): 794-800 (1997); also designated herein as PRO1 has been) and PRO20040 (here, binding to named human IL-17RH2 receptor).
(4)PRO1031(IL-17Bリガンド)及びPRO1122(IL-17Cリガンド)は、ヒトIL-17レセプターと結合しない(Li ら., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 97(2):773-778(2000))。 ..... (4) PRO1031 (IL-17B ligand) and PRO1122 (IL-17C ligand) do not bind to human IL-17 receptor (Li et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 97 (2): 773-778 (2000)).

実施例21:ヒトIL-17レセプター(IL-17R;PRO1と命名)の新規リガンドIL-17B(PRO1031と命名)及びIL-17C(PRO1122と命名)との結合 A. Example 21: Human IL-17 receptor (IL-17R; PRO1 named) (designated PRO1031) novel ligands IL-17B and of IL-17C (PRO1122 named) binding to A. ヒトIL-17レセプター(IL-17Rと命名;ここでPRO1として命名)のECDのクローニング: Cloning of the ECD of; (where named as PRO1 IL-17R named) human IL-17 receptor:
新規IL-17相同性ポリペプチドIL-17B及びIL-17Cのリガンド/レセプター相互作用を研究するために、ヒトIL-17レセプター(Yaoら, Cytokine 9(11):794-800(1997)のECDをクローンした。公表されている配列に基づき、2つのオリゴヌクレオチドプライマーをIL-17R ECDの5'及び3'末端に設計した〔Yanoら., Cytokine, 9:794(1997)〕。2つのプローブは次の配列を有する: In order to study the ligand / receptor interactions of the novel IL-17 homology polypeptides IL-17B and IL-17C, human IL-17 receptor (Yao et al, Cytokine 9 (11): ECD of 794-800 (1997) . the cloned based on the published sequence, two oligonucleotide primers were designed at the 5 'and 3' ends of IL-17R ECD. [Yano et al, Cytokine, 9:. 794 (1997)] two probes It has the following sequence:
プライマー1:5'-CTG TAC CTC GAG GGT GCA GAG-3' (配列番号:38) Primer 1: 5'-CTG TAC CTC GAG GGT GCA GAG-3 '(SEQ ID NO: 38)
プライマー2:5'-CCC AAG CTT GGG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG CCA CAG GGG CAT GTA GTC C-3' (配列番号:39) Primer 2: 5'-CCC AAG CTT GGG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG CCA CAG GGG CAT GTA GTC C-3 '(SEQ ID NO: 39)
上述したプライマーをPCR反応に使用し、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ(Promrga)を用いて、ヒト精巣cDNAライブラリから全長cDNAを増幅させる。 The primers described above were used in a PCR reaction, using Pfu Turbo DNA polymerase (Promrga), to amplify the full-length cDNA from a human testis cDNA library. C-末端hisタグを、8つのヒスチジンをコードするヌクレオチドの添加を通し、PCRにより3'末端プライマーに導入した。 The C- terminal his tag, through the addition of nucleotides encoding eight histidines, were introduced into 3 'end primer by PCR. ついで、PCR生成物を発現プラスミドベクターpRK5B中でサブクローンした。 Was then subcloned PCR product in the expression plasmid vector pRK5B in. 配列分析により、挿入物が、公表されているhIL-17レセプターの細胞外ドメイン(1-320アミノ酸)をコードするDNAフラグメントを含有していることが確認された。 Sequence analysis, insert, it was confirmed to contain a DNA fragment encoding the extracellular domain of hIL-17 receptor has been published (1-320 amino acids).

B. B. IL-17R ECDの免疫沈降 IL-17B(PRO1031;配列番号:2)及びIL-17C(PRO1122;配列番号:4)と比較した場合のIL-17の差異のある活性は(本出願の実施例28から30を参照)、それらが異なる細胞表面に結合し活性化していることを示唆している。 IL-17R ECD immunoprecipitation IL-17B (PRO1031; SEQ ID NO: 2) and IL-17C (PRO1122; SEQ ID NO: 4) Example of activity (this application with IL-17 differences when compared to 28 see 30), suggesting that they are attached activate different cell surface. IL-17B(PRO1031)又はIL-17C(PRO1122)が直接にレセプターと結合してるか否かテストするために、IL-17R(PRO1)(C-末端hisタグ)を含有する発現プラスミドを、SuperFectトランスフェクション試薬(Quiagen)を使用して293細胞へトランスフェクトした。 For IL-17B (PRO1031) or IL-17C (PRO1122) to test whether or not it is attached directly to the receptor, the IL-17R (PRO1) (C- terminal his tag) expression plasmid containing, SuperFect use transfection reagent (Quiagen) into 293 cells were transfected. 50μCi/ml[ 35 S]-Cys/Met混合物を6時間使用したトランスフェクションの後に、293細胞の代謝ラベリングを16時間行った。 50μCi / ml [35 S] to -Cys / Met mixture after transfection using 6 hours for metabolic labeling of 293 cells 16 h. 培養上清を収集して濃縮した(Centricon-10, Amicon)。 And concentrated to collect the culture supernatant (Centricon-10, Amicon). IL-17R ECDの発現を検査するために、Ni-NTAビーズ(Quiagen)を使用して、培養上清からhis-タグIL-17R ECDを親和沈降させた。 To test the expression of IL-17R ECD, using Ni-NTA beads (Quiagen), and the culture supernatant his- tagged IL-17R ECD by affinity precipitation.

培養上清をRIPAバッファー(1%のNP40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のPBSに入ったSDS)で希釈し、IL-17及びFc融合タンパク質とともに4℃で一晩インキュベートした。 Culture supernatants RIPA buffer diluted with (NP40, 0.5% of the sodium deoxycholate 1%, SDS entering the 0.1% PBS), overnight at 4 ° C. with IL-17 and Fc fusion proteins and incubated. Fc融合タンパク質を沈殿させるために、プロテインA-アガロースビーズ(Pierce)を添加した。 To precipitate the Fc fusion proteins were added protein A- agarose beads (Pierce). この沈殿物をRIPAバッファー中で3回洗浄し、SDSサンプルバッファーで変性させ、NuPAGE 4-12% Bis-Trisゲル(Novex)上で電気泳動にかけた。 The precipitate was washed three times in RIPA buffer, denatured in SDS sample buffer and subjected to electrophoresis on NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (Novex). IL-17免疫沈降のために、抗IL-17抗体(R & Dシステム)を添加した。 For IL-17 immunoprecipitation, it was added anti-IL-17 antibody (R & D Systems). 競合結合実験において、IL-17(配列番号:11)によるIL-17R ECDの免疫沈降を、5倍モル過度のIL-17B. In competitive binding experiments, IL-17 (SEQ ID NO: 11) immunoprecipitation of IL-17R ECD by 5-fold molar excess of IL-17B. His、IL-17C. His, IL-17C. His及び対照hisタグタンパク質の存在下で行った。 It was carried out in the presence of His and control his tagged protein.
IL-17R ECDは、そのヒスチジンタグを介して精製する際に、60kDaのバンドとして移動した(図29A)。 IL-17R ECD, when purified via its histidine tag, migrated as a band of 60 kDa (Figure 29A). さらにIL-17R ECDはまた、IL-17(レーン3)と組み合わされて沈殿した。 Furthermore IL-17R ECD also precipitated in combination IL-17 and (lane 3). しかしながら、IL-17BとIL-17Cの両方ともに、ラベルされたIL-17レセプターECDに対するIL-17の結合と競合することができなかった(図29B、レーン15及び16)。 However, both both IL-17B and IL-17C, was not able to compete with the binding of IL-17 for labeled IL-17 receptor ECD (Figure 29B, lanes 15 and 16).

実施例22:新規ヒトIL-17レセプター(IL-17RH1)(PRO5801と命名)のヒトIL-17及び新規リガンドIL-17B(PRO1031と命名)、IL-17C(PRO1122と命名)、及びIL-17E(PRO10272と命名)との結合;IL-17EによるNF-κB活性及びIL-8生成の誘導 A. Example 22: The new human IL-17 receptor (IL-17RHl) human IL-17 and (designated PRO1031) novel ligands IL-17B of (PRO5801 named) (designated PRO1122) IL-17C, and IL-17E (PRO10272 named) binding to; induction of NF-[kappa] B activity and IL-8 produced by IL-17E A. IL-17E(PRO10272)の単離、並びに発現ベクターの構築 IL-17E(DNA147531−2821;配列番号:5)及びIL-17RH1(DNA115291−2681;配列番号:11)cDNAクローンをヒトcDNAライブラリから単離し、各々実施例3及び実施例5に示されているように、それらの全部の配列を決定した。 Isolation of IL-17E (PRO10272), and construction of an expression vector IL-17E (DNA147531-2821; SEQ ID NO: 5) and IL-17RH1 (DNA115291-2681; SEQ ID NO: 11) single a cDNA clone from a human cDNA library apart, as shown in each example 3 and example 5 were sequenced in their entirety. Fc融合タンパク質(イムノアドヘシン)を、真核生物発現ベクターpRK5tkNEO及びバキュロウイルスベクターpHIF、Pharmingenから購入したpVL1393の誘導体で、IL-17、IL-17B(PRO1031)、IL-17C(PRO1122)、及びIL-17E(PRO10272)の全オープンリーディーングフレームのフレーム単位でのヒトIgG1のFc領域との融合によって調製した。 The Fc fusion protein (immunoadhesin), a derivative of pVL1393 purchased from eukaryotic expression vector pRK5tkNEO and baculovirus vectors pHIF, Pharmingen, IL-17, IL-17B (PRO1031), IL-17C (PRO1122), and were prepared by fusion with the Fc region of human IgG1 in frame units of the total open reading Dee ring frames IL-17E (PRO10272). 融合タンパク質を、ヒト293細胞又はSf9昆虫細胞で過度的に発現させ、プロテインAカラムを通して精製した。 The fusion protein transiently was expressed in human 293 cells or Sf9 insect cells and purified over a protein A column. また、IL-17RH1レセプター(PRO5801)の細胞外ドメインを、C-末端8xHis-tag融合としてバキュロウイルスで発現させ、ニッケルアフィニティーカラムによって精製した。 Further, the extracellular domain of IL-17RHl receptor (PRO5801), was expressed in baculovirus as a C- terminal 8xHis-tag fusion and purified by nickel affinity column. 更に、IL-17E(PRO10272)を8xHis-tag融合としてバキュロウイルスで発現させ、精製してリフォールデング(再折りたたみ)した。 Furthermore, IL-17E and (PRO10272) was expressed in baculovirus as a 8xHis-tag fusion and re fall Dengue (refolding) was purified. この精製タンパク質の同一性は、N-末端分析によって確かめられた。 The identity of the purified protein was confirmed by N- terminal analysis.

B. B. ウェスタンブロット、ノーザンブロット及びTaqman分析: Western blot, Northern blot and Taqman analysis:
IL-17E(PRO10272)のIL-17RH1(PRO5801)との結合のウェスタンブロット分析を、Xieら., Cytokine, 11(10): 729-735(1999)及びXieら., J. Biol. Chem., 275(40): 31335-31339(2000)によって記載の通りにおこなった。 IL-17E (PRO10272) of IL-17RHl Western blot analysis of binding of (PRO5801), Xie et al, Cytokine, 11 (10):... 729-735 (1999) and Xie et al., J. Biol Chem. , 275 (40): was carried out as described by 31335-31339 (2000). ノーザンブロット分析では、製造者の推奨の通りに、多組織ノーザンブロット(multiple tissue Northern blots)(Clontech)を、ランダムプライムIL-17RH1 cDNAの32 P-ラベルプローブでプローブし、72時間に渡ってX-omat(Kodak)に曝露した。 In Northern blot analysis, as recommended as the manufacturer, the multiple tissue Northern blot (multiple tissue Northern blots) (Clontech ), and probed with random primed IL-17RHl cDNA of 32 P- labeled probes, over 72 hours X They were exposed to -omat (Kodak). 定量PCR分析(Taqman(商品名))では、推奨の通りに(Perkin Elmer)、IL-17RH1のコード化配列に基づいて、プライマーでヒト組織からの全mRNA(50ng)を分析した。 In quantitative PCR analysis (Taqman (trade name)), as recommended (Perkin Elmer), based on the coding sequence of IL-17RHl, were analyzed for total mRNA (50 ng) from human tissues a primer.

C. C. FACS分析 ヒト293細胞を、表示の通りに、緑色蛍光タンパク質(GFP)、及びIL-17RH1(PRO5801)又はIL-17R(PRO1と命名)に関する発現ベクターで過度的に同時トランスフェクションした。 FACS analysis Human 293 cells, as a display, green fluorescent protein (GFP), and was transiently co-transfected with an expression vector relates IL-17RH1 (PRO5801) or IL-17R (PRO1 named). 24時間後に、細胞を表示の通りに細胞をFcタッグリガンドでインキュベートし、結合をPEコンジュゲート抗-ヒトFc抗体で明らかにした。 After 24 hours, the cells as display cells were incubated in Fc tag ligand, binding a PE-conjugated anti - revealed a human Fc antibody. FACS曲線は、同時トランスフェクションされたGFPポジティブの細胞集団中のPE染色を示す(図32A)。 FACS curves show PE staining in GFP-positive cell population cotransfected (Fig. 32A).

D. D. NF-κB、及びIL-8アッセイそしてウェスタンブロット分析 ルシェフェラーゼレポーターアッセイを、Gurneyら., Curr Biol., 9(4): 215-218(1999)に記載の通りにおこなった。 NF-[kappa] B, and IL-8 Assays and Western Blot Analysis Ruscha Feller luciferase reporter assay, Gurney et al, Curr Biol, 9 (4):.. Was performed as described in 215-218 (1999). 要約すると、293又はTK-10細胞(2x10 )を、トランスフェクションの間のDNA量を一定に保つためのキャリアープラスミドpRK5D及びIL-17E発現プラスミド(0.1μg)に加えて、0.5μgのホタルルシェフェラーゼレポータープラスミドpGL3-ELAM. To summarize, 293 or TK-10 cells (2x10 5), in addition to the carrier plasmid pRK5D and IL-17E expression plasmid (0.1 [mu] g) for keeping the amount of DNA between transfections constant, the 0.5μg firefly Ruscha Feller luciferase reporter plasmid pGL3-ELAM. tk、及び内部トランスフェクションコントロールとして0.05μgのウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドによるEffectine(Quiagen)トランスフェクションによってトランスフェクションした。 tk, and it was transfected by Effectine (Quiagen) transfection with 0.05μg of Renilla luciferase reporter plasmid as internal transfection control. 24時間後、細胞を収集し、推奨の通りにルシェフェラーゼ活性をアッセイした(Pharmacia)。 After 24 h, cells were harvested and assayed for Ruscha Feller peptidase activity as recommended (Pharmacia). IL-8 ELISAを、製造者の指示書の通りにおこなった(R & D Systems)(図33)。 The IL-8 ELISA, was performed as described manufacturer's instructions (R & D Systems) (Figure 33).

E. E. 結果及び議論: Results and Discussion:
上に記述したように、IL-17ファミリーの新規メンバーは同定されてキャラクタリゼーションされ、ここでIL-17B(PRO1031)、IL-17C(PRO1122)、IL-17D(PRO21175)、及びIL-17E(PRO10272)と命名された。 As described above, a new member of the IL-17 family is characterized is identified, wherein the IL-17B (PRO1031), IL-17C (PRO1122), IL-17D (PRO21175), and IL-17E ( PRO10272) and was named. IL-17ファミリーの4ファミリー、IL-17、IL-17B、IL-17C及びIL-17Eは、C-末端部分に最も高い類似性を共有し、その部分には20−30%のアミノ酸配列同一性、並びに4個のシステインの厳格な保存がある。 IL-17 family of 4 families, IL-17, IL-17B, IL-17C and IL-17E is, C-share highest similarity to the distal portion, the amino acid sequence identity of 20-30% to that portion sex, and there is strict conservation of four cysteines. 機能的に保存され得る付加的なシステインは、異なる位置に存在する。 Additional cysteines that may be functionally conserved are present in different positions. 対照的に、N-末端の80残基には、保存部が殆ど無いことが明らかである。 In contrast, the 80 residues of N- terminal, it is apparent that storage unit is little. IL-17ファミリーメンバー[IL-17(配列番号:40)、IL-17B(PRO1031;配列番号:2);IL-17C(PRO1122、配列番号:4);及びIL-17E(PRO10272、配列番号:6)]のアライメントが図30に示されている。 IL-17 family members [IL-17 (SEQ ID NO: 40), IL-17B (PRO1031; SEQ ID NO: 2); IL-17C (PRO1122, SEQ ID NO: 4); and IL-17E (PRO10272, SEQ ID NO: alignment 6)] is shown in Figure 30. 保存システインは小丸で示され、潜在的なN-結合グリコシル化部位は囲いで示されている。 Conserved cysteines are indicated by small circles, potential N- linked glycosylation sites are indicated by enclosure.
IL-17E mRNAは、ノーザンブロット分析では検出されなかった。 IL-17E mRNA was not detected by Northern blot analysis. しかしながら、スプライシングされたmRNAをゲノムDNAから識別できるように設計されたプライマーを用いるRT-PCRによって、IL-17Eは、脳、腎臓、肺、前立腺、精巣、脊髄、副腎及び気管を含む種々の組織において低レベルで検出されている。 However, by RT-PCR using primers designed to the spliced ​​mRNA can be identified from genomic DNA, IL-17E are various tissues including brain, kidney, lung, prostate, testis, spinal cord, adrenal and trachea It has been detected at low levels in. IL-17E(PRO10272)発現のRT-PCR分析の結果は、図23に示されている。 IL-17E (PRO10272) results of RT-PCR analysis of the expression is shown in Figure 23. 上に記述のように、表示の組織のRNAを、IL-17Eのコード化配列のすべてを増幅するように設計したプライマーによるRT-PCRへ供した。 As above description, the structure of the RNA of the display was subjected by primers designed to amplify all of the coding sequence of IL-17E to RT-PCR. このPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、ナイロン膜へ移し、 32 PでラベルしたIL-17E cDNAプローブでプローブした。 The PCR products were separated by agarose gel electrophoresis, transferred to a nylon membrane, and probed with IL-17E cDNA probe labeled with 32 P.

出願人は、IL-17B(PRO1031)及びIL-17C(PRO1122)がヒトIL-17レセプター(ここでPRO1と命名)と結合しないことを示している(実施例21を参照)。 Applicants, IL-17B (PRO1031) and IL-17C (PRO1122) indicates that no binding to human IL-17 receptor (designated herein as PRO1) (see Example 21). 新規IL-17レセプター(ここでIL-17RH1と命名;PRO5801)が、ここで同定されてキャラクタリゼーションされている。 New IL-17 receptor (designated herein as IL-17RH1; PRO5801) has been characterized are identified herein. IL-17RH1(DNA115291−2681;配列番号:11)cDNAは、ヒトcDNAライブラリから単離され、実施例5に記述したようにその全体が配列決定された。 IL-17RH1 (DNA115291-2681; SEQ ID NO: 11) cDNA was isolated from a human cDNA library, its entirety was sequenced as described in Example 5. IL-17RH1 mRNA発現は、図31Aに示すようにノーザンブロット分析、並びに図31Bに示すように定量PCR法で調べられた。 IL-17RHl mRNA expression Northern blot analysis as shown in FIG. 31A, and were examined by quantitative PCR method as shown in FIG. 31B. 最も高いレベルのIL-17RH1(PRO5801)の発現は、腎臓、並びに他の抹消器官、例えば結腸、小腸、前立腺、精巣、膵臓及び子宮で観察され、肝臓でも有意な発現が観察された。 Expression of the highest levels of IL-17RH1 (PRO5801) is kidney, and other peripheral organs, such as colon, small intestine, prostate, testis, observed in the pancreas and uterus, significant expression in the liver was observed.
結合研究は、この新規分子(IL-17RH1と命名;PRO5801)がIL-17ファミリーの他のメンバーに対するレセプターとして機能を果たすか否かを確定するためにおこなわれた。 Binding studies, this novel molecule (designated IL-17RH1; PRO5801) was performed to determine whether functions as a receptor for other members of the IL-17 family. IL-17RH1のための発現ベクターでトランスフェクションしたヒト293細胞がIL-17E-Fc融合タンパク質(イムノアドヘシン)と結合することが示されたが、ヒトIL-17の有意な結合は示さなかった(図32Aに示す)。 Human 293 cells transfected with expression vectors for IL-17RHl was shown to bind to IL-17E-Fc fusion protein (immunoadhesin), but did not show significant binding of human IL-17 (shown in FIG. 32A). IL-17RH1発現細胞へのIL-17Eイムノアドヘシン結合は、HisエピトープタッグIL-17Eとの競合によって完全に阻害されることもあり得る。 IL-17E immunoadhesin binding to IL-17RHl expressing cell may also be completely inhibited by competition with His epitope tag IL-17E. 相対的に、IL-17Rのための発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は、IL-17イムノアドヘシンと結合するが、IL-17Eとは結合しない。 In comparison, cells transfected with expression vectors for IL-17R binds with IL-17 immunoadhesin, it does not bind to IL-17E. IL-17ファミリーのメンバーとの直接相互作用があるか否かを調べるために、リガンド結合研究を、IL-17RH1レセプターのエピトープタッグ細胞外ドメインでおこなった。 To investigate whether there is a direct interaction of IL-17 family members, the ligand binding studies were conducted in an epitope tag the extracellular domain of IL-17RHl receptor. 図32Bに示しあるように、この新規レセプターは、IL-17E-Fcの強い結合を示し、そしてIL-17B-Fcへの弱い結合示すが、IL-17-Fc又はIL-17C-Fcと結合しない。 As is shown in Figure 32B, this novel receptor exhibits strong binding of IL-17E-Fc, and show weak binding to IL-17B-Fc, binds to IL-17-Fc or IL-17C-Fc do not do.

IL-17がNF-κB活性を誘導することが観察されている(Jovanovicら., 上掲)。 That IL-17 induces NF-[kappa] B activity has been observed (Jovanovic et al., Supra). また、IL-17E(PRO10272)が二つのヒト癌細胞株、293及びTK細胞(これら双方の細胞株が内在性IL-17RH1 mRNAを発現することが見出された)において、NF-κB応答性ルシェフェラーゼレポーター遺伝子を誘導するか否かを確定するために研究がおこなわれた。 Moreover, IL-17E (PRO10272) are two human cancer cell lines, 293 and TK cells in (both of these cell lines were found to express endogenous IL-17RH1 mRNA), NF-κB responsive study was conducted to determine whether to induce Ruscha Feller luciferase reporter gene. これらの研究の結果は、図33Aに示されている。 The results of these studies are shown in Figure 33A. IL-17Eの発現ベクターのトランスフェクションによって、ルシェフェラーゼ活性が著しく誘導された。 By transfection of the expression vector of IL-17E, Ruscha Feller Ze activity was significantly induced. このルシェフェラーゼ活性は用量依存的に誘導され、以前にNF-κB活性の潜在的なインデューサーであることが示されたTNFレセプタースーパーファミリーメンバーGITR(図33B)の過剰発現によって観察されたのと同程度である(Gurneyら., 上掲)。 The Ruscha Feller peptidase activity is induced in a dose-dependent manner, as was observed by the previous over-expression of NF-[kappa] B activity potential inducers and it is indicated TNF receptor superfamily member GITR (Fig. 33B) it is at the same level (Gurney et al., supra). NF-κBは炎症誘発性シグナルを媒介すると考えられており、このことはIL-17Eが炎症誘発性活性を有し得ることを示している。 NF-[kappa] B is thought to mediate a proinflammatory signal, indicating that IL-17E may have proinflammatory activity. この可能性を検討するために、IL-8の生成、IL-17によって誘導される炎症誘発性ケモカインを調べた。 To investigate this possibility was examined proinflammatory chemokine induced production of IL-8, by IL-17. 図34に示すように、IL-17E(PRO10272)は、TK-10細胞でIL-8の活性を誘導した。 As shown in FIG. 34, IL-17E (PRO10272) induced activation of IL-8 in TK-10 cells.
要約すると、IL-17RH1(PRO5801)は、IL-17ファミリーのメンバーと結合する同定されたセカンドレセプターである。 In summary, IL-17RH1 (PRO5801) is the identified second receptor binds IL-17 family members. IL-17レセプターファミリーは、他のタンパク質とは全く関連がない。 IL-17 receptor family is not at all associated with other proteins. しかしながら、二つのレセプターの比較によって細胞外ドメインでの多くのシステインの保存が明らかとなり、このことは、それらが類似の構造を保持していることを示唆している。 However, it is apparent conservation of many cysteines in the extracellular domain by comparison of the two receptors, this they suggest that it retains the similar structure. 同じように、細胞内ドメインに保存エレメントがあり、これらレセプターが同じような細胞内機構に関わっていると思われる。 Similarly, there is a storage element to the intracellular domain is believed that these receptors are involved in similar intracellular mechanism. このことは、IL-17のように、IL-17EがNF-κBの活性化をシグナル伝達するという観察によって支持されている。 This, like the IL-17, is supported by the observation that IL-17E is signaling an activation of NF-[kappa] B. 細胞内ドメイン内の保存領域は、NF-κBを活性化することが知られている他のレセプターファミリー、IL1/Toll及びTNFレセプターファミリーとの明確な類似性を有しない。 Storage area within the intracellular domain do not have a clear similarity to other receptor families, IL1 / Toll and TNF receptor families are known to activate NF-[kappa] B.

IL-17Eは、更にIL-17によって誘導されることが観察されている炎症誘発性分子、IL-8の生成を誘導し、このことは、これら二つの生物活性が類似していることを示唆している。 IL-17E may further induce proinflammatory molecule that is induced is observed by IL-17, the production of IL-8, This suggests that these two biological activities are similar are doing. IL-17RH1(PRO5801)の若干より制限されたmRNA発現パターンとは対照的に、IL-17レセプターはかなり広範な発現パターンを有する(図31参照)。 IL-17RHl contrast to the somewhat more restricted mRNA expression pattern of (PRO5801), IL-17 receptor has a fairly broad expression pattern (see Figure 31). これらの分子