JP2016027854A - Surgical sanitary material - Google Patents
Surgical sanitary material Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016027854A JP2016027854A JP2015162024A JP2015162024A JP2016027854A JP 2016027854 A JP2016027854 A JP 2016027854A JP 2015162024 A JP2015162024 A JP 2015162024A JP 2015162024 A JP2015162024 A JP 2015162024A JP 2016027854 A JP2016027854 A JP 2016027854A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- silk fibroin
- porous body
- porous
- test
- surgical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
本発明は、手術用衛生材料に関し、詳しくは、取扱性に優れ、細胞接着抑制効果及び強度に優れる手術用衛生材料に関する。 The present invention relates to a surgical hygiene material, and particularly relates to a surgical hygiene material that is excellent in handleability and excellent in cell adhesion suppression effect and strength.
心臓外科、脳神経外科、整形外科、腹部外科等の臨床分野における外科手術において、切開により臓器を含む組織が空気に露出するが、この際、これらの組織が乾燥、酸化され、その結果損傷を受けることがある。該損傷は、手術後に組織の癒着、治癒の遅延等の問題が発生する原因と考えられる。臓器組織の癒着は手術後に発生する合併症の典型である。組織間の癒着が起こると、本来臓器が持つ機能低下が発生する場合や、強い痛みに患者が悩まされることになる。
また、腹腔内手術後の臓器癒着は、イレウスや疼痛、不妊などの合併症の原因となり、時には次回手術が非常に困難になるなどの問題を起こす可能性がある。その発生頻度も腹部手術では非常に高く、患者にとって慢性的な腹部痛、腸閉塞、不妊症など深刻な病状が持続することになる。
したがって、手術中の臓器を含む組織の乾燥及び酸化を抑制し、また手術時に手術の目的外臓器を圧排し、標的臓器の視野確保を容易にするためにガーゼやスポンジ等が実用化されている。
In surgical operations in clinical fields such as cardiac surgery, neurosurgery, orthopedic surgery, abdominal surgery, etc., tissues including organs are exposed to air by incision, and at this time, these tissues are dried, oxidized and consequently damaged Sometimes. The damage is considered to be a cause of problems such as tissue adhesion and delayed healing after surgery. Organ tissue adhesions are typical of complications that occur after surgery. When adhesions between tissues occur, functional deterioration of organs occurs, and patients suffer from intense pain.
In addition, organ adhesion after intraperitoneal surgery may cause complications such as ileus, pain, and infertility, and sometimes cause problems such as the next surgery becoming very difficult. The frequency of occurrence is very high in abdominal surgery, and serious medical conditions such as chronic abdominal pain, bowel obstruction, and infertility will persist for the patient.
Therefore, gauze, sponge, etc. have been put to practical use in order to suppress drying and oxidation of tissues including organs during surgery, to exclude organs other than the target of surgery during surgery, and to easily secure the visual field of the target organ. .
現在、手術後の組織癒着，治癒の遅延を避けるための処置の例として、外科手術中に、生理食塩液に浸漬したガーゼで臓器等の組織を被覆する処置が行われている。そして、術後体内に残される可能性があるため、Ｘ線で検出できるように、Ｘ線造影糸などの放射線不透化要素が組み込まれたガーゼやスポンジが使用されている。このようなものとして硫酸バリウムを含有したレーヨンなどの親水性繊維からなる不織布（特許文献１参照）やＸ線造影無機物と天然系植物繊維よりなるＸ線造影繊維が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、依然として、ガーゼの使用では糸くずやほこりが出る場合があり、これらが体内に残されるのは好ましくない。また、天然系植物繊維は強度が弱いという問題点もある。
さらに、生体組織を物理的に分離するために、シリコン、テフロン（登録商標）、ポリウレタン、酸化セルロース等を防止膜として用いる方法が行われているが、これらの材料は非吸収性材料であるために、血液などの液の吸収ができないという問題がある。
Currently, as an example of treatment for avoiding tissue adhesion and healing delay after surgery, treatment of covering tissues such as organs with gauze soaked in physiological saline is performed during surgery. And since it may remain in the body after surgery, a gauze or sponge in which a radiopaque element such as an X-ray contrast thread is incorporated is used so that it can be detected by X-rays. As such, non-woven fabrics made of hydrophilic fibers such as rayon containing barium sulfate (see Patent Document 1) and X-ray contrast fibers made of X-ray contrast inorganic substances and natural plant fibers have been proposed (Patent Document 2). reference). However, the use of gauze may still result in lint and dust, and it is not preferable that these remain in the body. Another problem is that natural plant fibers have low strength.
Furthermore, in order to physically separate living tissue, methods using silicon, Teflon (registered trademark), polyurethane, cellulose oxide, etc. as a protective film have been carried out, but these materials are non-absorbable materials. In addition, there is a problem that liquid such as blood cannot be absorbed.
このような問題を解決するため、ゼラチンやコラーゲンを用いた材料が報告されているが（特許文献３及び４参照）、ゼラチンやコラーゲンを用いた場合には、抗原性を有するテロペプチド部分の除去が困難であるという問題があり、また、プリオンの混入など動物由来の感染症の危険性があるため、生体に使用することは避けたほうがよい。
さらに、強度を得るためや分解性を制御するための架橋剤が、生体内での使用に好ましくない場合が多い。
一方、天然高分子では皮膚への親和性が高いが、強度が低い等の問題があった。そのため、天然高分子では、架橋剤による架橋体や、強度補強材の使用やガーゼ等で包むことで、強度を確保する必要があった。強度補強材を使用した場合には、構造が複雑になることが多く実用的でない。
In order to solve such problems, materials using gelatin or collagen have been reported (see Patent Documents 3 and 4), but when gelatin or collagen is used, removal of the antigenic telopeptide portion is removed. In addition, there is a problem that it is difficult, and there is a risk of infectious diseases derived from animals such as prion contamination.
Furthermore, cross-linking agents for obtaining strength and controlling degradability are often not preferred for use in vivo.
On the other hand, natural polymers have high affinity for the skin, but have problems such as low strength. For this reason, it has been necessary to ensure the strength of natural polymers by wrapping them with a cross-linked product of a cross-linking agent, use of a strength reinforcing material, gauze, or the like. When a strength reinforcing material is used, the structure is often complicated and is not practical.
このように、外科手術時に用いられる衛生材料がいくつか実用化されているが、安全性、操作性、吸液性、強度などを満足する手術用衛生材料はまだ得られていないため、これら特性を満足する材料が求められている。 In this way, several hygiene materials used during surgery have been put into practical use, but no surgical hygiene materials that satisfy safety, operability, liquid absorbency, strength, etc. have yet been obtained. There is a demand for materials that satisfy the requirements.
本発明の目的は、取扱性に優れ、細胞接着抑制効果及び縫合に対する強度に優れる手術用衛生材料を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a sanitary material for surgery that is excellent in handleability, excellent in cell adhesion suppression effect and excellent in strength against suturing.
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、シルクフィブロイン多孔質体がその材料として好適であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、
（１）シルクフィブロイン多孔質体を用いた手術用衛生材料、
（２）前記多孔質体が、多孔質層のみからなる上記（１）に記載の手術用衛生材料、
（３）前記多孔質体が、多孔質層と該多孔質層の一方の面のみに細孔を有しないフィルム層を有する上記（１）に記載の手術用衛生材料、
（４）前記多孔質体の引張り強度が１〜４００ｋＰａである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の手術用衛生材料、
を提供するものである。
As a result of intensive studies, the present inventors have found that a silk fibroin porous material is suitable as the material, and have completed the present invention.
That is, the present invention
(1) Sanitary material for surgery using a silk fibroin porous material,
(2) The surgical hygiene material according to (1), wherein the porous body is composed of only a porous layer,
(3) The surgical hygiene material according to (1), wherein the porous body has a porous layer and a film layer having no pores on only one surface of the porous layer,
(4) The surgical hygiene material according to any one of (1) to (3), wherein the porous body has a tensile strength of 1 to 400 kPa,
Is to provide.
本発明の手術用衛生材料を用いることで、術中の安全性を確保し、術後の生体組織間の癒着を防止することができる。また、本手術用衛生材料は、強度に優れるために縫合できること、必要な部位に固定化できることができ、かつ熱安定性に優れるためにオートクレーブ滅菌が使用できる。 By using the surgical hygiene material of the present invention, safety during surgery can be ensured and adhesion between living tissues after surgery can be prevented. In addition, the surgical hygiene material can be sutured because of its excellent strength, can be fixed to a necessary site, and can be used for autoclave sterilization because of its excellent thermal stability.
本発明の手術用衛生材料は、シルクフィブロイン多孔質体を用いることを特徴とする。ここで、シルクフィブロイン多孔質体とは、シルクフィブロインを含む、好ましくは、１０〜３００μｍの平均細孔径を有する多孔質体をいう。 The surgical hygiene material of the present invention is characterized by using a silk fibroin porous material. Here, the silk fibroin porous body means a porous body containing silk fibroin, preferably having an average pore diameter of 10 to 300 μm.
該シルクフィブロイン多孔質体の引張り強度は、１ｋＰａ〜４００ｋＰａであることが好ましい。１ｋＰａ以上であれば、十分な強度があり、手術用衛生材料として取扱いが容易である。一方、４００ｋＰａ以下であれば、臓器への密着性が保たれる。以上の観点から、引張り強度は４０ｋＰａ〜３００ｋＰａであることがより好ましく、８０ｋＰａ〜２００ｋＰａであることがさらに好ましい。 The tensile strength of the silk fibroin porous body is preferably 1 kPa to 400 kPa. If it is 1 kPa or more, it has sufficient strength and is easy to handle as a surgical hygiene material. On the other hand, if it is 400 kPa or less, the adhesiveness to an organ is maintained. From the above viewpoint, the tensile strength is more preferably 40 kPa to 300 kPa, and further preferably 80 kPa to 200 kPa.
また、本発明の手術用衛生材料は、吸水した水分を保持する保水率が高いことが好ましい。保水率が高いことで、吸収した滲出液が流出することが無い。より具体的には、保水率が８５〜１００％であることが好ましい。保水率が８５％以上であれば、滲出液を保持するして、漏出液が流れ出すことが少ない。以上の点から、シルクフィブロイン多孔質体の保水率は、８７〜１００％がより好ましく、９０〜１００％がさらに好ましい。
（保水率の算出方法）
なお、保水率は次のように測定した。多孔質体を６０×３０×２０ｍｍに成形し、測定試料とし、純水中に十分浸漬した試料の重さを測定する（Ｗｃ）。これを再度純水中に十分浸漬し、表面を純水で濡らしたガラス製の平板（松浪ガラス製ＭＳＡコートマイクロスライドガラス、７６×５２ｍｍ）を４５度傾けて設置し、その上に一番広い面（６０×３０ｍｍ面）を下にして長尺方向を上下になるように載せ、１０分間静置する。その後、試料の重さを測定する（Ｗｄ）。
保水率（％）＝１００−（Ｗｃ−Ｗｄ）×１００／（Ｗｃ）
Moreover, it is preferable that the surgical hygiene material of the present invention has a high water retention rate for retaining absorbed water. Since the water retention rate is high, the absorbed exudate does not flow out. More specifically, the water retention rate is preferably 85 to 100%. If the water retention rate is 85% or more, the exudate is retained and the leaked liquid hardly flows out. From the above points, the water retention of the silk fibroin porous material is more preferably 87 to 100%, and still more preferably 90 to 100%.
(Calculation method of water retention rate)
The water retention rate was measured as follows. The porous body is molded to 60 × 30 × 20 mm, used as a measurement sample, and the weight of the sample sufficiently immersed in pure water is measured (Wc). The glass plate (MSA coated micro slide glass made by Matsunami Glass, 76 × 52 mm) whose surface was sufficiently dipped in pure water and wetted with pure water was tilted at 45 degrees and placed on top of it. The surface (60 × 30 mm surface) is placed face down, and the lengthwise direction is placed up and down, and allowed to stand for 10 minutes. Thereafter, the weight of the sample is measured (Wd).
Water retention rate (%) = 100− (Wc−Wd) × 100 / (Wc)
多孔質層の吸水速度は０．１〜１０００μｌ／ｓであることが好ましく、１〜１００μｌ／ｓであることがより好ましく、さらに好ましくは２０〜３０μｌ／ｓである。吸水速度が０．１μｌ／ｓ以上であれば、滲出液を速やかに吸収して、手術用衛生材料の外に漏らすことが少ない。吸水速度が１０００μｌ／ｓ以下であれば、滲出液を過剰に手術用衛生材料に吸収するの防ぎ、患部の湿潤状態を保てる。また、蒸発速度は０．０１〜０．２ｇ／ｍ２・ｓであることが好ましく、０．０３〜０．１５ｇ／ｍ２・ｓであることがより好ましく、さらに好ましくは０．０６〜０．１ｇ／ｍ２・ｓである。蒸発速度が０．０１以上であれば、漏出液を継続的に手術用衛生材料が吸収できる状態に保てる。蒸発速度が０．２ｇ／ｍ２・ｓ以下であれば、患部を効率的に湿潤状態に保てる。ここで、吸水速度及び蒸発速度は以下のようにして得られる値である。多孔質層の吸水速度及び蒸発速度が上記範囲内であると、本発明の効果が良好となる。 The water absorption rate of the porous layer is preferably 0.1 to 1000 μl / s, more preferably 1 to 100 μl / s, and still more preferably 20 to 30 μl / s. When the water absorption rate is 0.1 μl / s or more, the exudate is quickly absorbed and rarely leaks out of the surgical hygiene material. If the water absorption rate is 1000 μl / s or less, the exudate is prevented from being excessively absorbed by the sanitary material for surgery, and the affected area can be kept wet. It is preferable that the evaporation rate is 0.01~0.2g / m 2 · s, more preferably from 0.03~0.15g / m 2 · s, more preferably 0.06 to 0 .1 g / m 2 · s. If the evaporation rate is 0.01 or more, the leakage liquid can be continuously maintained in a state that can be absorbed by the surgical hygiene material. If the evaporation rate is 0.2 g / m 2 · s or less, the affected part can be efficiently kept wet. Here, the water absorption speed and the evaporation speed are values obtained as follows. When the water absorption rate and evaporation rate of the porous layer are within the above ranges, the effect of the present invention is good.
（吸水速度の算出方法）
シルクフィブロイン多孔質体（多孔質層）に純水を１００μｌ滴下し、吸収されるまでの時間を測定した。吸水速度は、測定した時間を用いて、下記の式より算出した値である。測定は５回行い、その平均値を吸水速度とした。
吸水速度（μｌ／ｓ）＝純水滴下量／吸水に要した時間
（蒸発速度の算出方法）
シルクフィブロイン多孔質体（多孔質層）を４８時間純水中に浸漬し、完全に吸水させた後、温度：４０℃、湿度：５０％の条件に設定した恒温恒湿槽中で金網上に静置し、１０分経過までは１分ごとに、１０分以降は２分ごとにその重量を測定し、その変化を水の蒸発量の変化とした。蒸発速度は、静置して１分後から３０分までの蒸発量の変化から下記の式より算出した値である。
蒸発速度（ｇ／ｍ２・ｓ）＝（蒸発量の変化）／多孔質体表面積
(Calculation method of water absorption rate)
100 μl of pure water was dropped on the silk fibroin porous material (porous layer), and the time until absorption was measured. The water absorption rate is a value calculated from the following equation using the measured time. The measurement was performed 5 times, and the average value was taken as the water absorption rate.
Water absorption rate (μl / s) = pure amount of pure water / time required for water absorption (evaporation rate calculation method)
The silk fibroin porous material (porous layer) is immersed in pure water for 48 hours and completely absorbed, and then placed on a wire mesh in a constant temperature and humidity chamber set at a temperature of 40 ° C. and a humidity of 50%. The weight was measured every 1 minute until 10 minutes passed and every 2 minutes after 10 minutes, and the change was regarded as a change in the evaporation amount of water. The evaporation rate is a value calculated from the following equation from the change in the evaporation amount from 1 minute to 30 minutes after standing.
Evaporation rate (g / m 2 · s) = (change in evaporation) / porous body surface area
本発明の手術用衛生材料はシート状であることが好ましく、シートの形状は、患部に合わせて、その大きさ、形を任意に設定することができる。また、シートの厚さについても、傷面の深さや滲出液の量に応じて、任意の厚さを設定することができる。
また、本発明におけるシルクフィブロイン多孔質体は、多孔質層と、その一方の面又は両面に細孔を有しないフィルム層を有していてもよく、一方、シルクフィブロイン多孔質体が多孔質層のみからなっていてもよい。
The surgical hygiene material of the present invention is preferably in the form of a sheet, and the size and shape of the sheet can be arbitrarily set according to the affected area. Also, the thickness of the sheet can be set to any thickness depending on the depth of the scratched surface and the amount of exudate.
Further, the silk fibroin porous body in the present invention may have a porous layer and a film layer having no pores on one or both sides thereof, while the silk fibroin porous body is a porous layer. It may consist only of.
上記細孔を有しないフィルム層は、実質的に細孔を有しない層であって、細孔を有しない、又は多孔質層と比較して極めて細孔の少ない層である。このようなフィルム層を有することにより、細孔を経由して滲出液等の液体が移動する速度、及び拡散する速度が遅くなるため、液透過性が低くなる。この滲出液中に含まれる活性物質が癒着原因であることが多いため、これらの物質の移動拡散を抑えるフィルム層は重要である。
フィルム層は表面が面積比で１０％以下の細孔を有し、多孔質層は表面が面積比で５０〜９８％の細孔を有するものであると好ましい。また、フィルム層は、その細孔直径が０．５μｍ以上の細孔が２０個／ｍｍ２以下（より好ましくは、１０個／ｍｍ２以下）であると好ましい。ここで、表面の細孔の面積比、細孔の個数及び細孔直径は、走査型電子顕微鏡写真を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所製）を用いて画像処理することで測定したものである。
また、フィルム層の吸水速度は、０．１〜３．５μｌ／ｓであることが好ましく、１．５〜３．５μｌ／ｓであることがより好ましく、さらに好ましくは２〜３．５μｌ／ｓである。
さらに、フィルム層の蒸発速度は、０．０３〜０．０７ｇ／ｍ２・ｓであることが好ましく、０．０３〜０．０６ｇ／ｍ２・ｓであることがより好ましく、さらに好ましくは０．０３〜０．０５ｇ／ｍ２・ｓである。吸水速度及び蒸発速度が上記範囲内であると、本発明の効果が良好となる。
The film layer having no pores is a layer having substantially no pores, and is a layer having no pores or having very few pores as compared with the porous layer. By having such a film layer, the speed at which a liquid such as exudate moves through the pores and the speed at which it diffuses become slow, so that the liquid permeability becomes low. Since the active substances contained in the exudate are often the cause of adhesion, a film layer that suppresses migration and diffusion of these substances is important.
The film layer preferably has pores with an area ratio of 10% or less on the surface, and the porous layer preferably has a surface with pores with an area ratio of 50 to 98%. The film layer preferably has 20 pores / mm 2 or less (more preferably 10 / mm 2 or less) pores having a pore diameter of 0.5 μm or more. Here, the area ratio of pores on the surface, the number of pores and the pore diameter were measured by subjecting a scanning electron micrograph to image processing using image analysis software ImageJ (manufactured by National Institutes of Health). It is.
The water absorption rate of the film layer is preferably 0.1 to 3.5 μl / s, more preferably 1.5 to 3.5 μl / s, and still more preferably 2 to 3.5 μl / s. It is.
Furthermore, the evaporation rate of the film layer is preferably 0.03~0.07g / m 2 · s, more preferably from 0.03~0.06g / m 2 · s, more preferably 0 0.03 to 0.05 g / m 2 · s. When the water absorption rate and the evaporation rate are within the above ranges, the effect of the present invention is good.
本発明の手術用衛生材料としては、多孔質層と、その一方の面のみに細孔を有しないフィルム層を有するシルクフィブロイン多孔質体が好ましい。その使用方法としては、患部側に多孔質層が接し、患部とは反対側の対向面にフィルム層を有することが好ましい。また、フィルム層の細孔の数は制御することができ、必要に応じて少量の細孔を有するフィルム層とすることもできる。
さらに、本発明の手術用衛生材料は、患部に接する側に多孔質層を有するため、該多孔質層の細孔中に滲出液を保持し、目的外臓器を傷つけることがないように保護することができる。また、該細孔中には、目的によっては、薬剤を含ませることができる。
また、フィルム層は、細孔が極めて少ないために、表面が平滑であり、細胞接着性等が低く、他の生体組織との癒着を抑えることや、フィルム層の液透過性を制御することで薬剤の放出速度を制御することが可能である。
As the surgical hygiene material of the present invention, a silk fibroin porous body having a porous layer and a film layer having no pores on only one side thereof is preferable. As the usage method, it is preferable that the porous layer is in contact with the affected part side and the film layer is provided on the opposite surface opposite to the affected part. Moreover, the number of pores of the film layer can be controlled, and a film layer having a small amount of pores can be formed as necessary.
Furthermore, since the surgical hygiene material of the present invention has a porous layer on the side in contact with the affected area, the exudate is retained in the pores of the porous layer to protect it from damaging non-target organs. be able to. The pores can contain a drug depending on the purpose.
In addition, since the film layer has very few pores, it has a smooth surface, low cell adhesion, etc., suppressing adhesion to other living tissues, and controlling the liquid permeability of the film layer. It is possible to control the release rate of the drug.
一方、本発明の手術用衛生材料が、多孔質層とその両面に細孔を有しないフィルム層を有する多孔質体で構成される場合には、上述のような患部からの滲出液を吸収する機能及び薬剤を含ませる機能を付与することはできないが、他の臓器等との癒着防止効果は十分にあるため、手術中に目的外臓器を傷つけないように保護する効果は十分に奏し得るものである。
一方、本発明の手術用衛生材料は多孔質層自体でも、十分な強度を有するので、やはり手術中に目的外臓器を傷つけないように保護する効果は十分に奏し得るものである。
On the other hand, when the surgical hygiene material of the present invention is composed of a porous layer and a porous body having a film layer that does not have pores on both sides, the exudate from the affected area as described above is absorbed. Can not give the function and the function to contain the drug, but there is enough anti-adhesion effect with other organs, etc., so that it can sufficiently protect the target organ from being damaged during surgery It is.
On the other hand, since the surgical hygiene material of the present invention has sufficient strength even in the porous layer itself, the effect of protecting the organs other than the target from being damaged during the surgery can be sufficiently achieved.
本発明の手術用衛生材料は外科手術に好適に用いられるが、使用されるに際して、従来のガーゼやスポンジと同様に、体内に残されることのないように、その管理には細心の注意が払うことが必要である。しかし、血液を含んだ本発明の手術用衛生材料は見分けにくいため、そのまま体内に残される懸念もあることから、万一体内に残された場合でもＸ線で探知できるように、Ｘ線造影糸等が予め組み込まれているものが好ましい。本発明の手術用衛生材料を構成するシルクフィブロイン多孔質体は、製造時にＸ線造影糸を組み込むことが可能であるため、体内遺残防止が可能である。 The surgical hygiene material of the present invention is suitably used for surgery, but when used, as with conventional gauze and sponge, careful attention is paid to its management so that it is not left in the body. It is necessary. However, since the surgical hygiene material of the present invention containing blood is difficult to distinguish, there is also a concern that it may remain in the body as it is. Are preferably incorporated in advance. Since the silk fibroin porous material constituting the surgical hygiene material of the present invention can be incorporated with an X-ray contrast yarn at the time of production, it can be prevented from remaining in the body.
本発明の手術用衛生材料は、粘着テープ等で固定することもできるが、シルクフィブロイン多孔質体自身に十分な強度があるので、縫合糸を用いて固定することが可能である。
また、シルクフィブロイン多孔質体は、乾燥することで、硬く、脆くなるが、体内で使用した場合には体液が存在し乾燥することがないので、この点については問題が発生しない。
The surgical hygiene material of the present invention can be fixed with an adhesive tape or the like, but since the silk fibroin porous body itself has sufficient strength, it can be fixed with a suture.
Further, the silk fibroin porous body becomes hard and brittle by drying, but when used in the body, there is no problem in this respect because the body fluid is present and does not dry.
次に、シルクフィブロイン多孔質体の製造方法について説明する。
本発明で用いられるシルクフィブロイン多孔質体は、シルクフィブロイン水溶液に特定の添加剤を加えて、該水溶液を凍結させ、次いで融解させることにより製造することができる。
ここで用いられるシルクフィブロインは、家蚕、野蚕、天蚕等の蚕から産生されるものであればいずれでもよく、その製造方法も問わない。本発明におけるシルクフィブロイン多孔質体の製造においては、シルクフィブロイン水溶液として用いるが、シルクフィブロインは溶解性が悪く、直接水に溶解することが困難である。シルクフィブロイン水溶液を得る方法としては、公知のいかなる手法を用いてもよいが、高濃度の臭化リチウム水溶液にシルクフィブロインを溶解後、透析による脱塩、風乾による濃縮を経る手法が簡便である。
シルクフィブロイン多孔質体の製造方法において、シルクフィブロインの濃度は、脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液中で０．１〜４０質量％であることが好ましく、０．５〜２０質量％であることがより好ましく、１〜１２質量％であることがさらに好ましい。この範囲内に設定することで、十分な強度を持った多孔質体を効率的に製造することができる。
Next, the manufacturing method of a silk fibroin porous body is demonstrated.
The silk fibroin porous material used in the present invention can be produced by adding a specific additive to a silk fibroin aqueous solution, freezing the aqueous solution, and then thawing it.
The silk fibroin used here may be any silk fibroin as long as it is produced from silkworms such as rabbits, wild silkworms, and tengu. In the production of the silk fibroin porous material in the present invention, it is used as a silk fibroin aqueous solution. However, silk fibroin has poor solubility and is difficult to dissolve directly in water. As a method for obtaining a silk fibroin aqueous solution, any known method may be used, but a method in which silk fibroin is dissolved in a high concentration lithium bromide aqueous solution, followed by desalting by dialysis and concentration by air drying is simple.
In the method for producing a silk fibroin porous body, the concentration of silk fibroin is preferably 0.1 to 40% by mass and preferably 0.5 to 20% by mass in a silk fibroin solution to which an aliphatic carboxylic acid is added. It is more preferable, and it is still more preferable that it is 1-12 mass%. By setting it within this range, a porous body having sufficient strength can be efficiently produced.
前記添加剤としては、水溶性有機溶媒や、脂肪族カルボン酸、アミノ酸が挙げられる。添加剤としては、特に制限はないが、水溶性のものが好ましい。また、シルクフィブロイン多孔質体の製造において用いられる脂肪族カルボン酸としては、ｐＫａが、５．０以下のものが好ましく、３．０〜５．０のものがより好ましく、３．５〜５．０のものがさらに好ましい。 Examples of the additive include water-soluble organic solvents, aliphatic carboxylic acids, and amino acids. The additive is not particularly limited but is preferably water-soluble. Moreover, as an aliphatic carboxylic acid used in manufacture of a silk fibroin porous body, that whose pKa is 5.0 or less is preferable, the thing of 3.0-5.0 is more preferable, and 3.5-5. Even more preferred is zero.
水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、グリセロール、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジン、アセトン、アセトニトリル等が挙げられる。 Examples of the water-soluble organic solvent include methanol, ethanol, isopropanol, butanol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), pyridine, acetone, acetonitrile, and the like.
脂肪族カルボン酸としては、たとえば、炭素数１〜６の飽和または不飽和のモノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸を好ましく用いることができ、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、乳酸、アクリル酸、２−ブテン酸、３−ブテン酸等が挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、単独あるいは２種以上組み合わせて使用することができる。 As the aliphatic carboxylic acid, for example, a saturated or unsaturated monocarboxylic acid having 1 to 6 carbon atoms, dicarboxylic acid, or tricarboxylic acid can be preferably used. For example, formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, succinic acid, Examples include lactic acid, acrylic acid, 2-butenoic acid, and 3-butenoic acid. These aliphatic carboxylic acids can be used alone or in combination of two or more.
アミノ酸としては、特に制限はないが、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン等のモノアミノカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等のモノアミノジカルボン酸（酸性アミノ酸）などの脂肪族アミノ酸、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸、ヒドロキシプロリン等の複素環を有するアミノ酸などがあげられ、中でも形状の調整が容易な観点から酸性アミノ酸や、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン等のオキシアミノ酸が好ましい。同様な観点で、酸性アミノ酸の中でもモノアミノカルボン酸がより好ましく、アスパラギン酸やグルタミン酸が特に好ましく、オキシアミノ酸の中でもヒドロキシプロリンがより好ましい。これらのアミノ酸は、いずれか１種を単独で、あるいは２種以上組み合わせて使用することができる。
なお、アミノ酸には、Ｌ型とＤ型の光学異性体があるが、Ｌ型とＤ型を用いた場合に、得られる多孔質体に違いが見られないため、どちらのアミン酸を用いてもよい。
The amino acid is not particularly limited, and examples thereof include monoaminocarboxylic acids such as valine, leucine, isoleucine, glycine, alanine, serine, threonine, and methionine, and monoaminodicarboxylic acids (acidic amino acids) such as aspartic acid and glutamic acid. Examples include aliphatic amino acids, aromatic amino acids such as phenylalanine, and amino acids having a heterocyclic ring such as hydroxyproline. Among these, acidic amino acids and oxyamino acids such as hydroxyproline, serine, and threonine are preferable from the viewpoint of easy shape adjustment. . From the same viewpoint, monoaminocarboxylic acid is more preferable among acidic amino acids, aspartic acid and glutamic acid are particularly preferable, and hydroxyproline is more preferable among oxyamino acids. These amino acids can be used alone or in combination of two or more.
In addition, there are L-type and D-type optical isomers of amino acids, but when L-type and D-type are used, there is no difference in the resulting porous material, so which amino acid is used. Also good.
シルクフィブロイン水溶液に添加する水溶性添加剤の量は、０．０１〜１８．０質量％であることが好ましく、より好ましくは０．１〜５．０質量％であり、さらに好ましくは０．５〜４．０質量％である。この範囲内に設定することで、十分な強度を持った多孔質体を製造することができる。また、１８．０質量％以下であれば、シルクフィブロイン水溶液に添加剤を添加したシルクフィブロイン溶液を静置する際、該溶液がゲル化しにくく、安定して均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体が得られる。また、アミノ酸の配合量は、フィブロインに対して、１〜５００質量％であることが好ましく、５〜５０質量％であることがより好ましく、１０〜３０質量％であることがさらに好ましい。 The amount of the water-soluble additive added to the silk fibroin aqueous solution is preferably 0.01 to 18.0% by mass, more preferably 0.1 to 5.0% by mass, and still more preferably 0.5. It is -4.0 mass%. By setting within this range, a porous body having sufficient strength can be produced. Further, if the silk fibroin solution having an additive added to the silk fibroin aqueous solution is 18.0% by mass or less, the silk fibroin porous body having a stable and uniform structure is difficult to gel when the solution is allowed to stand. can get. Moreover, it is preferable that it is 1-500 mass% with respect to fibroin, as for the compounding quantity of an amino acid, it is more preferable that it is 5-50 mass%, and it is further more preferable that it is 10-30 mass%.
次に、上記添加剤が加えられたシルクフィブロイン水溶液を型あるいは容器に流し込み、低温恒温槽中に入れて凍結させ、次いで融解することによって、シルクフィブロイン多孔質体を製造する。凍結温度は、添加剤を含有させたシルクフィブロイン溶液が凍結する温度であれば特に制限されないが、−１０〜−３０℃程度が好ましい。また、凍結時間は、十分に凍結し、かつ凍結状態を一定時間保持できるよう、所定の凍結温度で４時間以上であることが好ましい。なお、凍結の方法としては、シルクフィブロイン溶液を一気に凍結温度まで下げて凍結してもよいが、一旦、−５℃程度に２時間程度保持して過冷却状態とし、その後、凍結温度まで下げて凍結することが、力学的強度の高い多孔質体を得る上で好ましい。−５℃から凍結温度までにかける時間を調整することで、多孔質体の構造や強度をある程度制御することが可能である。
その後に、凍結したシルクフィブロイン溶液を、融解することによってシルクフィブロイン多孔質体が得られる。融解の方法は特に制限はないが、自然融解のほか、恒温槽内に保持する方法などが挙げられる。
Next, the silk fibroin porous body is manufactured by pouring the silk fibroin aqueous solution to which the above additives are added into a mold or a container, freezing it in a low-temperature thermostatic bath, and then thawing it. The freezing temperature is not particularly limited as long as the silk fibroin solution containing the additive is frozen, but is preferably about −10 to −30 ° C. Further, the freezing time is preferably 4 hours or more at a predetermined freezing temperature so that it can be sufficiently frozen and kept in a frozen state for a certain time. As a method of freezing, the silk fibroin solution may be frozen to a freezing temperature all at once, but once it is kept at about −5 ° C. for about 2 hours to be in a supercooled state and then lowered to the freezing temperature. Freezing is preferable for obtaining a porous body having high mechanical strength. The structure and strength of the porous body can be controlled to some extent by adjusting the time taken from −5 ° C. to the freezing temperature.
Thereafter, the silk fibroin porous material is obtained by thawing the frozen silk fibroin solution. The melting method is not particularly limited, and examples include natural melting and a method of holding in a thermostatic bath.
得られた多孔質体には添加剤が含まれるが、用途に応じて、添加剤を除去する必要がある場合には、適当な方法で多孔質体から添加剤を除去して用いることができる。たとえば、多孔質体を、純水中に浸漬して、添加剤を除去することが最も簡便な方法として挙げられる。あるいは、多孔質体を凍結乾燥することによって、添加剤と水分を同時に除去することが可能である。 The obtained porous body contains additives, but depending on the application, if it is necessary to remove the additives, the additives can be removed from the porous body by an appropriate method. . For example, the simplest method is to remove the additive by immersing the porous body in pure water. Or it is possible to remove an additive and a water | moisture content simultaneously by freeze-drying a porous body.
シルクフィブロイン多孔質体は、スポンジ状の多孔質構造を有しており、通常この多孔質体には凍結乾燥等により水除去を行わなければ水が含まれ、含水状態で堅い構造物である。また、多孔質体を凍結乾燥することにより、シルクフィブロイン多孔質体の乾燥品を得ることができる。 The silk fibroin porous body has a sponge-like porous structure. Normally, this porous body contains water unless it is removed by lyophilization or the like, and is a rigid structure in a water-containing state. In addition, a dried silk fibroin porous material can be obtained by freeze-drying the porous material.
このシルクフィブロイン多孔質体は、多孔質体作製時の型や容器を適宜選択することにより、フィルム状、ブロック状、管状、球状等、目的に応じた形状とすることができる。型や容器としては、シルクフィブロイン溶液が流出しない形状・形態のものであれば制限はなく、その素材としては、鉄、ステンレス、アルミニウム、金、銀、銅などの熱伝導率が高い素材を用いることが、均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得る観点から好ましい。また、型や容器の壁の厚さは、その機能と凍結の際の膨張などによる変形などを防止する観点から、０．５ｍｍ以上であることが好ましく、取り扱いが容易で、冷却効率的な観点から、より好ましくは１〜３ｍｍである。 The silk fibroin porous material can be formed into a shape suitable for the purpose, such as a film shape, a block shape, a tubular shape, a spherical shape, and the like by appropriately selecting a mold and a container for producing the porous material. There are no restrictions on the shape or container of the silk fibroin solution as long as it does not flow out. The material used is a material with high thermal conductivity such as iron, stainless steel, aluminum, gold, silver, or copper. It is preferable from the viewpoint of obtaining a silk fibroin porous body having a uniform structure. In addition, the thickness of the mold or the wall of the container is preferably 0.5 mm or more from the viewpoint of its function and deformation due to expansion during freezing, etc., and is easy to handle and efficient in cooling. More preferably, the thickness is 1 to 3 mm.
また、ここで用いられる型や容器は、前記フィルム層の構造や厚さを制御することを目的として、その内側のシルクフィブロイン溶液と接する内壁面に、シートを設けることができる。
該シートとしては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）やテトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）などのフッ素樹脂からなるシート、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリプロピレン（ＰＰ）などからなる離型処理されたシートなどが好ましく挙げられる。これらのシートを用いた場合、細孔が少なく平滑なフィルム層を得ることができる。これらのシートの採用については、多孔質体の用途に応じて、適宜選択すればよい。
また、シートは、熱伝導を阻害しにくい厚さ１ｍｍ以下のものを用いることが好ましい。
Moreover, the mold | type and container used here can provide a sheet | seat in the inner wall surface which contact | connects the silk fibroin solution inside for the purpose of controlling the structure and thickness of the said film layer.
As the sheet, a sheet made of a fluororesin such as polytetrafluoroethylene (PTFE), tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer (FEP) or tetrafluoroethylene / perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA), or Preferable examples include release-treated sheets made of polyethylene terephthalate (PET) or polypropylene (PP). When these sheets are used, a smooth film layer with few pores can be obtained. About adoption of these sheets, what is necessary is just to select suitably according to the use of a porous body.
In addition, it is preferable to use a sheet having a thickness of 1 mm or less that hardly inhibits heat conduction.
このシルクフィブロイン多孔質体は、上記した融解する工程に次いで、切削工程を経て得られる。また、本発明の癒着防止材として好適なシート形状において、一面のみにテフロン（登録商標）シートなどのシートをその内壁面に設け、その他の面の内壁面にろ紙を設けた型あるいは容器を用い、一面のみにフィルム層を有する多孔質体を得ることもできる。 This silk fibroin porous body is obtained through a cutting process subsequent to the melting step described above. Further, in a sheet shape suitable as an adhesion preventing material of the present invention, a mold or a container in which a sheet such as a Teflon (registered trademark) sheet is provided on one inner surface and a filter paper is provided on the other inner wall is used. A porous body having a film layer only on one surface can also be obtained.
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
実施例１
シルクフィブロイン水溶液は、フィブロイン粉末（ＫＢセーレン社製、商品名：「フィブロインＩＭ」）を９Ｍ臭化リチウム水溶液に溶解し、遠心分離で不溶物を除去したのち、超純水に対して透析を繰り返すことによって得た。得られたシルクフィブロイン水溶液を透析チューブ中で風乾し濃縮した。この濃縮液に蟻酸水溶液を添加し、シルクフィブロイン濃度が５質量％、蟻酸濃度が２質量％であるシルクフィブロイン溶液を調製した。
このシルクフィブロイン溶液をアルミ板で作製した型（内側サイズ；８０ｍｍ×４０ｍｍ×４ｍｍ）に流し込み、低温恒温槽（ＥＹＥＬＡ社製ＮＣＢ−３３００）に入れて凍結保存した。
凍結は、予め低温恒温槽を−５℃に冷却しておいて低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して２時間保持し、その後−２０℃に冷却後５時間保持した。凍結した試料を自然解凍で室温に戻してから、型から取り出し、超純水に浸漬し、超純水を１日２回、３日間交換することによって、使用した蟻酸を除去した。さらに、型の側面に接していた４面のフィルム層を切削して取り除き、多孔質層の部分で切断して、多孔質層の一方の面のみにフィルム層を有するシルクフィブロイン多孔質体を得た。
EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
Example 1
For silk fibroin aqueous solution, fibroin powder (KB Selen, trade name: “Fibroin IM”) is dissolved in 9M lithium bromide aqueous solution, insoluble matter is removed by centrifugation, and dialysis is repeated against ultrapure water. Was obtained by The obtained silk fibroin aqueous solution was air-dried in a dialysis tube and concentrated. An aqueous formic acid solution was added to the concentrated solution to prepare a silk fibroin solution having a silk fibroin concentration of 5% by mass and a formic acid concentration of 2% by mass.
This silk fibroin solution was poured into a mold (inside size; 80 mm × 40 mm × 4 mm) made of an aluminum plate, and was frozen and stored in a low-temperature thermostatic bath (NCB-3300 manufactured by EYELA).
For freezing, the low-temperature thermostat was cooled to -5 ° C in advance, and a mold containing the silk fibroin solution was put into the low-temperature thermostat and held for 2 hours, and then cooled to -20 ° C and held for 5 hours. The frozen sample was returned to room temperature by natural thawing, then removed from the mold, immersed in ultrapure water, and the used formic acid was removed by exchanging the ultrapure water twice a day for 3 days. Further, the four film layers that were in contact with the side surfaces of the mold were removed by cutting, and cut at the porous layer portion to obtain a silk fibroin porous body having a film layer only on one surface of the porous layer. It was.
（力学特性の測定方法）
得られたシルクフィブロイン多孔質体の力学的特性を、ＩＮＳＴＲＯＮ社マイクロテスター５５４８型を用いて評価した。作製したシルクフィブロイン多孔質体から４０ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍの試験片を切り出し、この試験片を２ｍｍ／ｍｉｎの条件で引っ張った際の最大破断強度（引っ張り強度）と最大ひずみ（伸び）を測定した。また、強度とひずみをグラフ化した時の傾きから弾性率を求めた。その結果を表１に示す。なお、測定結果は、作製した多孔質体から５点の試験片を作製し、さらに異なる日に作製した多孔質体から５点の試験片を切り出し、それら１０点について測定を行った平均値を示している。
(Measuring method of mechanical properties)
The mechanical properties of the obtained silk fibroin porous material were evaluated using INSTRON Micro Tester Model 5548. A test piece of 40 mm × 4 mm × 4 mm was cut out from the produced silk fibroin porous material, and the maximum breaking strength (tensile strength) and the maximum strain (elongation) when the test piece was pulled at 2 mm / min were measured. In addition, the elastic modulus was obtained from the slope when the strength and strain were graphed. The results are shown in Table 1. In addition, the measurement result produced the test piece of 5 points | pieces from the produced porous body, and also cut out the test piece of 5 points | pieces from the porous body produced on a different day, and measured the average value which measured about those 10 points | pieces. Show.
また、得られたシルクフィブロイン多孔質体の構造を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した。走査型電子顕微鏡は、Ｐｈｉｌｉｐｓ社製ＸＬ３０−ＦＥＧを使用して、低真空無蒸着モード、加速電圧１０ｋＶで測定を行った。なお、シルクフィブロイン多孔質体の構造は、多孔質体の表面ではなく、多孔質体を切断して露出させた内部を観察した。得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１に示す。 Moreover, the structure of the obtained silk fibroin porous body was observed using a scanning electron microscope. The scanning electron microscope was measured using a Philips XL30-FEG in a low vacuum non-deposition mode and an acceleration voltage of 10 kV. The structure of the silk fibroin porous body was not the surface of the porous body, but the inside exposed by cutting the porous body. A scanning electron micrograph of the cross section of the obtained porous body is shown in FIG.
実施例２〜１８
実施例１において、蟻酸に代えて、それぞれ表１〜３に記載する添加剤を用いたこと以外は実施例１同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性、保水率、吸水速度及び蒸発速度の評価結果を表１〜３に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を、それぞれ図２〜１８に示す。
尚、保水率、吸水速度及び蒸発速度は、前述のようにして測定した。
Examples 2-18
In Example 1, a silk fibroin porous material was obtained in the same manner as in Example 1 except that the additives described in Tables 1 to 3 were used in place of formic acid. The evaluation results of the mechanical properties, water retention, water absorption rate and evaporation rate are shown in Tables 1-3. Moreover, the scanning electron micrographs of the cross section of the obtained porous body are shown in FIGS.
The water retention rate, water absorption rate and evaporation rate were measured as described above.
実施例１９〜２０
実施例１において、それぞれ表２に記載する材質の型を用いたこと以外は実施例１同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その吸水速度の測定結果を表２に示す。
Examples 19-20
In Example 1, a silk fibroin porous material was obtained in the same manner as in Example 1 except that the types of materials described in Table 2 were used. The measurement results of the water absorption rate are shown in Table 2.
比較例１
市販のポリウレタンスポンジ（住友スリーエム社製）を用い、測定用サンプル（６０ｍｍ×３０ｍｍ×２０ｍｍ）に切り出し、保水率を測定し、その結果を表１に示す。
Comparative Example 1
Using a commercially available polyurethane sponge (manufactured by Sumitomo 3M), the sample was cut into measurement samples (60 mm × 30 mm × 20 mm), the water retention was measured, and the results are shown in Table 1.
［型の材質］
Ａ：アルミニウム板（テフロン（登録商標）シートあり）
Ｂ：鏡面仕上げアクリル板（テフロン（登録商標）シートなし）
Ｃ：鏡面仕上げポリスチレン板（テフロン（登録商標）シートなし）
[Material of mold]
A: Aluminum plate (with Teflon (registered trademark) sheet)
B: Mirror finish acrylic board (without Teflon (registered trademark) sheet)
C: Mirror-finished polystyrene plate (without Teflon (registered trademark) sheet)
図１から、実施例１で作製したシルクフィブロイン多孔質体を構成する多孔質層は、比較的薄い壁と数十μｍの空孔を有することがわかる。実施例２〜１８で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面（図２〜１８）についても、ほぼ同様の走査型電子顕微鏡写真が得られた。
また、実施例２、５、６及び１１で作製したシルクフィブロイン多孔質体の保水率は、９８％〜９９％の範囲にあることが分かった。
1 that the porous layer constituting the silk fibroin porous material produced in Example 1 has relatively thin walls and pores of several tens of μm. About the cross section (FIGS. 2-18) of the silk fibroin porous body produced in Examples 2-18, the substantially same scanning electron micrograph was obtained.
Moreover, it turned out that the water retention of the silk fibroin porous body produced in Examples 2, 5, 6 and 11 is in the range of 98% to 99%.
実施例２１〜２３
シルクフィブロイン多孔質体の安全性に関する非臨床試験の一環として、ヒトパッチ試験（皮膚感作性パッチ試験）を行った。皮膚感作性パッチ試験は、シルクフィブロイン多孔質体の人体皮膚に対する、刺激性、あるいはアレルギー性の接触皮膚炎を誘起するかどうかを判断するものである。
用いたシートは、実施例１において、アルミ板で作製した型の内側サイズを、２６４ｍｍ×２０５ｍｍ×１ｍｍ厚にし、それぞれ添加剤を蟻酸からＬ−アスパラギン酸（実施例２１）、乳酸（実施例２２）、及びコハク酸（実施例２３）に代えたこと以外は、実施例１と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体シートを得た。これらのシルクフィブロイン多孔質体シートをそれぞれ、試験に供するために、１０ｍｍ×１０ｍｍ×１ｍｍ厚に切断し、パッチとした。
試験は、試験開始時において、健康な１８歳から６５歳の日本人女性５０名で行った。試験に用いた１０ｍｍ×１０ｍｍのサイズのパッチを、２０ｍｍ×２０ｍｍの低刺激性テープで背中に固定した。また、各々のパッチは、最低１５ｍｍ離して固定した。また、比較のために、１０ｍｍ×１０ｍｍの綿の不織布を、２０ｍｍ×２０ｍｍの低刺激性テープで固定した。試験は、パッチを添付後４８時間後にパッチを取り除き、皮膚反応を観察した。さらに、同じ場所にパッチを貼付し、４８時間後の観察を行った。合計９回の貼付と観察を繰り返した。また、その２週間後に、同じ場所にパッチを貼って観察することを４８時間置きに４回繰り返した。
その結果、試験途中で、実施例２１及び２２において、二人の被験者が一度ずつ非常に軽度な紅斑を示したが、試験中に紅斑も消失するという結果となり、結果としてシート状のシルクフィブロイン多孔質体は、非常に低刺激性であり、アレルギー感作性もないことが分かった。
また、実施例２３においては、試験途中で、一人の被験者が一度非常に軽度な紅斑を示したが、試験中に紅斑も消失するという結果となり、結果としてシート状のシルクフィブロイン多孔質体は、非常に低刺激性であり、アレルギー感作性もないことが分かった。
Examples 21-23
A human patch test (skin sensitization patch test) was conducted as part of a non-clinical test on the safety of silk fibroin porous materials. The skin sensitization patch test is to determine whether silk fibroin porous body induces irritation or allergic contact dermatitis on human skin.
The sheet used was the same as in Example 1 except that the inner size of the mold made of the aluminum plate was 264 mm × 205 mm × 1 mm thick. ) And succinic acid (Example 23), except that a silk fibroin porous sheet was obtained in the same manner as in Example 1. Each of these silk fibroin porous material sheets was cut into 10 mm × 10 mm × 1 mm thicknesses for use in the test, thereby preparing patches.
The test was conducted with 50 healthy Japanese women aged 18 to 65 at the start of the test. A 10 mm × 10 mm size patch used for the test was fixed to the back with a 20 mm × 20 mm hypoallergenic tape. Moreover, each patch was fixed at least 15 mm apart. For comparison, a 10 mm × 10 mm non-woven cotton fabric was fixed with a 20 mm × 20 mm hypoallergenic tape. In the test, the patch was removed 48 hours after attaching the patch, and the skin reaction was observed. Furthermore, a patch was attached to the same place, and observation was performed after 48 hours. A total of 9 times of pasting and observation were repeated. Also, two weeks later, patching at the same place and observation were repeated 4 times every 48 hours.
As a result, during the test, in Examples 21 and 22, the two subjects showed very mild erythema once, but the erythema also disappeared during the test, resulting in a sheet-like silk fibroin porous material. The mass was found to be very hypoallergenic and not allergic.
Further, in Example 23, one test subject showed very mild erythema once during the test, but erythema also disappeared during the test. As a result, the sheet-like silk fibroin porous material was It was found to be very hypoallergenic and not allergic.
実施例２４
アルミ板で作製した型のサイズを１３０ｍｍ×８０ｍｍ×１２ｍｍ（内側サイズ）としたこと以外、実施例６と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を製造した。
シルクフィブロイン多孔質体の安全性に関する非臨床試験の一環として、皮内反応試験、皮膚一次刺激性試験及び皮膚感作性試験を行った。なお、本試験は、「申請資料の信頼性の基準」（薬事法施行規則第４３号）を基準として、「医療用具の製造（輸入）承認申請に必要な生物学的安全性試験の基本的考え方について」（２００３年２月１３日付医薬審発第０２１３００１号）と、「生物学的安全性試験の基本的考え方に関する参考資料について」（２００３年３月１９日付医療機器審査Ｎｏ．３６）に従い行った。
Example 24
A silk fibroin porous material was produced in the same manner as in Example 6 except that the size of the mold made of the aluminum plate was 130 mm × 80 mm × 12 mm (inside size).
As part of a non-clinical study on the safety of silk fibroin porous material, an intradermal reaction test, a primary skin irritation test and a skin sensitization test were conducted. This study is based on the “Standards for the Reliability of Application Materials” (Regulation No. 43 of the Pharmaceutical Affairs Law). Regarding the “Concept” (Pharmaceutical Proposal No. 0213001 dated February 13, 2003) and “Reference Materials on the Basic Concept of Biological Safety Testing” (Medical Device Examination No. 36, March 19, 2003) went.
（皮内反応試験）
実施例２４により製造されたシルクフィブロイン多孔質体を５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍのサイズに切り出して試験片とした（多孔質層のみからなるフィブロイン多孔質体）。
次に、シルクフィブロイン多孔質体シートの生理食塩液抽出液及びゴマ油抽出物をウサギ３匹の背部に皮内投与し、局所刺激性（組織障害性および炎症誘起性）の有無について検討した。具体的には、実施例２４により製造されたシルクフィブロイン多孔質体から切り出された上記試験片に生理食塩液又はゴマ抽を加え、オートクレーブ内で１２０℃、１時間の条件で抽出し、各試験液とした。また、抽出溶媒（生理食塩液又はゴマ油液）のみを同様な条件で処理し、対象液とした。ウサギ１匹につき、試験液及び対照液をそれぞれ０．２ｍＬずつ背部の５ヶ所に皮内投与した。生理食塩液抽出による試験液では、全例で皮内反応は認められず、「刺激性無し」と判断された。一方、ゴマ油抽出による試験液では、３例中２例に投与後２４時間からごく軽微な紅斑が認められた。この紅斑は対照液であるゴマ油でも見られ、対照液と同等であった。一次刺激係数は０．０以下を示し、「無視できる程度の刺激性」と判断された。
(Intradermal reaction test)
The silk fibroin porous material produced according to Example 24 was cut into a size of 5 mm × 5 mm × 5 mm to obtain a test piece (fibroin porous material comprising only a porous layer).
Next, the physiological saline solution of the silk fibroin porous material sheet and the sesame oil extract were intradermally administered to the back of three rabbits, and the presence or absence of local irritation (tissue damage and inflammation-inducing properties) was examined. Specifically, physiological saline or sesame extract is added to the test piece cut out from the silk fibroin porous material produced in Example 24, and extracted in an autoclave at 120 ° C. for 1 hour. Liquid. Moreover, only the extraction solvent (physiological saline solution or sesame oil solution) was processed under the same conditions to obtain a target solution. For each rabbit, 0.2 mL each of the test solution and the control solution was intradermally administered to five sites on the back. In the test solution by physiological saline extraction, no intradermal reaction was observed in all cases, and it was judged as “no irritation”. On the other hand, in the test solution by sesame oil extraction, very slight erythema was observed in 2 of 3 cases from 24 hours after administration. This erythema was also found in sesame oil as a control solution, which was equivalent to the control solution. The primary stimulation coefficient was 0.0 or less, and was judged as “ignorable stimulation”.
（皮膚一次刺激性試験）
上記皮内反応試験で用いられた試験片、各試験液及び対象液を用いて、局所刺激性（組織障害及び炎症誘起性）の有無について検討した。投与は、１溶媒あたり雄ウサギ６匹を用い、１匹につき、試験液及び対象液をそれぞれ背部の無傷皮膚、擦過傷皮膚に０．５ｍＬずつ投与した。
生理食塩液抽出による試験液では、６例中３例で投与後１時間からごく軽度または軽微な紅斑が認められた。この紅斑は対象液である生理食塩液でもみられ、対象液と同等であった。なお、一次刺激性指数は０．３であり、「無視できる程度の刺激性」と判断された。
ゴマ油液による抽出液では、６例中４例で投与後１時間からごく軽度な紅斑が認められた。この紅斑は対象液であるゴマ油液でもみられ、対象液と同等であった。なお、一次刺激性指数は０．１であり、「無視できる程度の刺激性」と判断された。
(Skin primary irritation test)
The presence or absence of local irritation (tissue damage and inflammation induction) was examined using the test piece, each test solution, and the target solution used in the intradermal reaction test. For administration, 6 male rabbits were used per solvent, and 0.5 mL each of the test solution and the target solution was applied to the intact skin and scratched skin on the back, respectively.
In the test solution obtained by physiological saline extraction, very slight or slight erythema was observed in 3 of 6 cases from 1 hour after administration. This erythema was also found in the physiological saline solution, which was the target solution, and was equivalent to the target solution. The primary irritancy index was 0.3, and was judged to be “negligible irritation”.
In the sesame oil extract, 4 out of 6 cases showed very mild erythema from 1 hour after administration. This erythema was also found in the sesame oil solution, which was the target solution, and was equivalent to the target solution. The primary irritation index was 0.1, which was determined to be “ignorable irritation”.
（皮膚感作性試験）
Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ法により、実施例２４により製造されたシルクフィブロイン多孔質体のメタノール抽出液について、雄性モルモット１０匹を用いて、モルモット皮膚に対する感作性の有無を検討した。
皮膚感作性試験前に、適切な抽出溶媒を決めるために、アセトンとメタノールを用いて抽出率を算出した。その結果、アセトンよりもメタノールの方が高い抽出率を示したために、皮膚感作性試験に用いる抽出溶媒をメタノールとした。
実施例２４により製造されたシルクフィブロイン多孔質体から切り出された上記試験片に、メタノール１０ｍＬを加え、室温で恒温浸とう培養機を用いて抽出した。抽出は２４時間以上行った。対照群として、オリーブ油で感作する陰性対照群、及び１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンで感作する陽性対照群を設けた。各対照群の動物数はそれぞれ５匹とした。
試験液投与群及び陰性対照群とも、抽出液の６．２５、１２．５、２５、５０、１００％液並びにアセトンで惹起した結果、惹起後２４、４８及び７２時間のいずれの観察時期においても皮膚反応は見られなかった。
一方、陽性対照群では、０．１％１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンの惹起により、５例全例で惹起後、２４，４８及び７２時間後に明らかな陽性反応が認められた。
この試験結果から、実施例２４により製造されたシルクフィブロイン多孔質体には、皮膚感作性を示す物質は存在しないと判断された。
このように、実施例２４により製造されたシルクフィブロイン多孔質体は、「無視できる程度の皮膚刺激性」と「皮膚感作性を示す物質は存在しない」ことにより、安全性が高く、本発明の手術用衛生材料として好適に使用できることが確認された。
(Skin sensitization test)
With respect to the methanol extract of silk fibroin porous material produced in Example 24 by the Maximization Test method, the presence or absence of sensitization to guinea pig skin was examined using 10 male guinea pigs.
Before the skin sensitization test, the extraction rate was calculated using acetone and methanol in order to determine an appropriate extraction solvent. As a result, since methanol showed a higher extraction rate than acetone, the extraction solvent used for the skin sensitization test was methanol.
Methanol 10mL was added to the said test piece cut out from the silk fibroin porous body manufactured by Example 24, and it extracted using the constant temperature immersion culture machine at room temperature. The extraction was performed for 24 hours or more. As a control group, a negative control group sensitized with olive oil and a positive control group sensitized with 1-chloro-2,4-dinitrobenzene were provided. Each control group had 5 animals.
In both the test solution administration group and the negative control group, as a result of inducing with 6.25, 12.5, 25, 50, 100% solution of the extract and acetone, at any observation period of 24, 48 and 72 hours after induction No skin reaction was seen.
On the other hand, in the positive control group, an obvious positive reaction was observed 24, 48 and 72 hours after the induction in all 5 cases due to the induction of 0.1% 1-chloro-2,4-dinitrobenzene.
From this test result, it was determined that the silk fibroin porous material produced according to Example 24 did not contain a substance showing skin sensitization.
As described above, the silk fibroin porous material produced in Example 24 has high safety due to “a negligible skin irritation” and “no substance exhibiting skin sensitization”. It was confirmed that it can be suitably used as a surgical hygiene material.
次に、シルクフィブロイン多孔質体の細胞に対する有害性の無いことを確認するために、あらかじめ平面培養していた線維芽細胞培養ディッシュにシルクフィブロイン多孔質体を静置した。シルクフィブロイン多孔質体自身またはシルクフィブロイン多孔質体から溶出する成分が細胞に対して毒性がある場合、シルクフィブロイン多孔質体を中心とした線維芽細胞の脱離、もしくは培養された細胞全体の脱落が生じるはずである。
しかしながら、図１９に示したように、シルクフィブロイン多孔質体の表面自身に細胞毒性を持つことが無く、静置されたシルクフィブロイン多孔質体の周囲にまで細胞が遊走・接近し、阻止円を作る様な現象は認められなかった。なお、図中上部（濃色部分）がシルクフィブロイン多孔質体側である。
Next, in order to confirm that the silk fibroin porous material was not harmful to the cells, the silk fibroin porous material was allowed to stand in a fibroblast culture dish that had been cultured in advance. When the fibroin porous material itself or the components eluted from the silk fibroin porous material are toxic to the cells, the fibroblasts are detached mainly from the silk fibroin porous material, or the whole cultured cells are detached. Should occur.
However, as shown in FIG. 19, there is no cytotoxicity on the surface of the silk fibroin porous body itself, and the cells migrate and approach to the periphery of the stationary silk fibroin porous body, thereby forming a blocking circle. There was no phenomenon to make. In addition, the upper part (dark color part) in a figure is a silk fibroin porous body side.
毒性の無いことを確認した上で、次にシルクフィブロイン多孔質体表面に線維芽細胞を播種し、常法に従って細胞を２週間培養した。シルク表面に播種された細胞は、一定期間後にディッシュまで遊走し、ディッシュ表面が線維芽細胞で培養されたことを確認の上で、シルクフィブロイン多孔質体を取り出し組織染色を行った。先の検討の様に毒性を持たないこのような本素材は、細胞親和性に優れ、本素材の多孔質体の孔中やシルクフィブロイン多孔質体の表面に細胞が遊走・伸展・増殖することが予想されたが、図２０に示す様に、シルクフィブロイン多孔質体表面には線維芽細胞の接着とそれに伴う増殖、多孔質体の孔中への遊走と増殖は認められなかった。なお、図中色の濃い部分が線維芽細胞である。 After confirming the absence of toxicity, fibroblasts were then seeded on the surface of the silk fibroin porous material, and the cells were cultured for 2 weeks according to a conventional method. The cells seeded on the silk surface migrated to the dish after a certain period, and after confirming that the dish surface was cultured with fibroblasts, the silk fibroin porous material was taken out and tissue-stained. This material, which is not toxic as in the previous study, has excellent cell affinity, and cells migrate, spread, and proliferate in the pores of the porous material and on the surface of the silk fibroin porous material. However, as shown in FIG. 20, no fibroblast adhesion and accompanying proliferation, migration into the pores of the porous body, and proliferation were observed on the surface of the silk fibroin porous body. In the figure, the dark colored portion is fibroblast.
そこで、シルクフィブロイン多孔質体と同等の空隙率を持つブタコラーゲンから精製して得た止血材料であるゼラチンスポンジ（アステラス製薬、スポンゼル）に対しても同様の比較実験を行った。図２１に示したように、その細胞親和性は極めて高く、空隙内に細胞が遊走伸展して、増殖していた。この場合、ゼラチンスポンジは創傷面の止血、欠損部位への充填には用いることは出来るが、その細胞接着性から創傷部周囲との癒着は避けることができない。
一方、シルクフィブロイン多孔質体は細胞毒性が無く、同時に組織親和性に富んでいるにも拘らず細胞接着性に乏しいために、周囲組織との相互作用を持つこと無く損傷部位の組織修復に伴った周囲健常組織との相互作用（癒着）を防止できる。このことは、シルクフィブロイン多孔質体が優れた手術用衛生材料としての機能を果たすメカニズムである。なお、ゼラチンフィルムと称される癒着防止フィルムが市販されているが、該ゼラチンフィルムも細胞接着性が高く、ゼラチンフィルム自身が介在して両側組織を癒着に導く。
Therefore, a similar comparative experiment was performed on gelatin sponge (Astellas Pharma, Sponzel), a hemostatic material obtained by purifying from porcine collagen having a porosity equivalent to that of the silk fibroin porous material. As shown in FIG. 21, the cell affinity was extremely high, and the cells migrated and proliferated in the voids. In this case, the gelatin sponge can be used for hemostasis of the wound surface and filling of the defect site, but due to its cell adhesiveness, adhesion with the wound area cannot be avoided.
On the other hand, the silk fibroin porous material has no cytotoxicity, and at the same time has poor tissue adhesion even though it is rich in tissue affinity. It is possible to prevent interaction (adhesion) with surrounding healthy tissues. This is a mechanism by which the silk fibroin porous material functions as an excellent surgical hygiene material. In addition, although an adhesion preventing film called a gelatin film is commercially available, the gelatin film also has high cell adhesiveness, and the gelatin film itself leads to adhesion between both tissues.
これらの結果を踏まえ、マウス皮下に本発明の手術用衛生材料を植埋し、異物ならびに癒着性試験について検討した。図２２に示したように、本発明の手術用衛生材料は、動物実験に於いて、植埋部位の片側への接着を認めるが、両側粘膜への接着（癒着）を認めず、優れた癒着防止効果を示した。 Based on these results, the surgical hygiene material of the present invention was implanted under the skin of a mouse and examined for foreign matter and adhesion test. As shown in FIG. 22, the surgical hygiene material of the present invention shows adhesion to one side of the implantation site in animal experiments, but does not show adhesion (adhesion) to both mucous membranes and is excellent adhesion. The prevention effect was shown.
本発明の手術用衛生材料は、取扱性に優れ、細胞接着抑制効果及び強度に優れる手術用衛生材料を提供することができる。外科手術時などにおける体内の臓器の保護及び出血した血液の吸収や除去することを目的に手術用として好適に用いることができる。 The sanitary material for surgery of the present invention can provide a sanitary material for surgery that is excellent in handleability and excellent in cell adhesion suppression effect and strength. It can be suitably used for surgery for the purpose of protecting organs in the body at the time of surgery, etc., and absorbing or removing bleeding blood.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015162024A JP6069434B2 (en) | 2015-08-19 | 2015-08-19 | Surgical hygiene materials |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015162024A JP6069434B2 (en) | 2015-08-19 | 2015-08-19 | Surgical hygiene materials |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010227044A Division JP5838026B2 (en) | 2010-10-06 | 2010-10-06 | Surgical hygiene materials |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016027854A true JP2016027854A (en) | 2016-02-25 |
| JP6069434B2 JP6069434B2 (en) | 2017-02-01 |
Family
ID=55360566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015162024A Expired - Fee Related JP6069434B2 (en) | 2015-08-19 | 2015-08-19 | Surgical hygiene materials |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6069434B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020054487A (en) * | 2018-09-28 | 2020-04-09 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | Acid release body |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1397355A (en) * | 2002-08-14 | 2003-02-19 | 苏州大学 | Material for repairing defective tissue of body and its preparing process |
| CN1736352A (en) * | 2005-09-07 | 2006-02-22 | 浙江大学 | Biological dressing and its preparing method |
| JP2007283096A (en) * | 2006-03-20 | 2007-11-01 | Jms Co Ltd | Porous bio-absorptive material and manufacturing method thereof |
| JP2008173312A (en) * | 2007-01-19 | 2008-07-31 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Production method of protein film and protein film obtained thereby |
| JP2008255298A (en) * | 2007-04-09 | 2008-10-23 | Kashiro Sangyo Kk | Fibroin sponge substance and its preparation |
| JP2010194303A (en) * | 2009-01-27 | 2010-09-09 | Jms Co Ltd | Wetting method for porous member, and wetting container and wetting device used therefor |
-
2015
- 2015-08-19 JP JP2015162024A patent/JP6069434B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1397355A (en) * | 2002-08-14 | 2003-02-19 | 苏州大学 | Material for repairing defective tissue of body and its preparing process |
| CN1736352A (en) * | 2005-09-07 | 2006-02-22 | 浙江大学 | Biological dressing and its preparing method |
| JP2007283096A (en) * | 2006-03-20 | 2007-11-01 | Jms Co Ltd | Porous bio-absorptive material and manufacturing method thereof |
| JP2008173312A (en) * | 2007-01-19 | 2008-07-31 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Production method of protein film and protein film obtained thereby |
| JP2008255298A (en) * | 2007-04-09 | 2008-10-23 | Kashiro Sangyo Kk | Fibroin sponge substance and its preparation |
| JP2010194303A (en) * | 2009-01-27 | 2010-09-09 | Jms Co Ltd | Wetting method for porous member, and wetting container and wetting device used therefor |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020054487A (en) * | 2018-09-28 | 2020-04-09 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | Acid release body |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6069434B2 (en) | 2017-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6399705B2 (en) | Drug sustained release carrier | |
| JP2009506875A (en) | Implant for transplantation containing drug crystals | |
| JP2010213984A (en) | In-vivo implanting medical material containing softener and/or moisturizer, method of adjusting content of softener and/or moisturizer in in-vivo implanting medical material, and method for producing in-vivo implanting medical material | |
| JP5754612B2 (en) | Wound dressing | |
| JP5838026B2 (en) | Surgical hygiene materials | |
| AU2015397501B2 (en) | Method for manufacturing collagen film using ultraviolet light, collagen film manufactured by using same, and biomaterial prepared using collagen film | |
| JP6069434B2 (en) | Surgical hygiene materials | |
| Caldiroli et al. | Hybrid fibroin/polyurethane small-diameter vascular grafts: from fabrication to in vivo preliminary assessment | |
| BR112015021146A2 (en) | COMPOSITION OF COLLAGEN SOLUBLE IN INJECTION ACID AND NON-THERAPEUTIC METHOD TO INCREASE SOFT TISSUES | |
| JP6069433B2 (en) | Anti-adhesive material | |
| JP5838025B2 (en) | Anti-adhesive material | |
| JP5551712B2 (en) | Formation method and obtained membrane composition for surgical site preservation | |
| CN109276745A (en) | A kind of cellulose combine dressing of high wet strength and preparation method thereof | |
| JP6842101B2 (en) | Medical parts | |
| JP6226433B2 (en) | Wound dressing | |
| WO2015163294A1 (en) | Porous material and porous sheet | |
| TWI334878B (en) | Degradable dressing for wound healing appilcation | |
| JP2013236592A (en) | Experimental device for evaluating regenerative epithelium after animal skin tissue damage, and model animal with animal skin tissue damage using experimental device | |
| JP2012080916A (en) | Wound dressing | |
| CN219896547U (en) | Anti-inflammatory anti-calculus acellular matrix composite membrane | |
| Wang et al. | Fabrication and Evaluation of Tissue-Engineered Vascular Grafts with Hybrid Fibrous Structure | |
| JP2000262610A (en) | Artificial corium for private extraction hair foliculus transplantation designed for epidermis regeneration | |
| WO2020090536A1 (en) | In vivo non-degradable anti-adhesive material | |
| CN118161672A (en) | Anti-deformation acellular matrix composite membrane and application thereof | |
| JP6613548B2 (en) | Skin care material and skin care method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160621 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160810 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161019 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161206 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161226 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6069434 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |