JP2016007166A - 細胞培養器具の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞培養表面のコートに必要な量以上のコート液を使用することなく、均一なコートが可能で、且つ余分なコート液をアスピレートして取り除く必要がない、細胞培養器具の製造方法の提供。【解決手段】第１のコート工程は、たんぱく質、ポリペプチド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレンイミン、もしくはこれらの混合物からなる群より選択される１つの溶質を、水又はエタノールを溶媒として用いた溶液、もしくは、水又はエタノールのうちいずれか１つをコート液としてコートし、第２のコート工程は、たんぱく質、ポリペプチド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレンイミン、もしくはこれらの混合物からなる群より選択される１つの溶質を、水又はエタノールを溶媒として用いた溶液をコート液として、スピンコート法によってコートする。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞や組織片などの被培養物を培養する細胞培養器具の製造方法に関する。

生体細胞等の培養は、被培養物が収容された例えばシャーレのように高い光透過性の平板状の底部と筒状の側部を有する容器本体、この本体を上方から施蓋する蓋体とからなる容器が用いられる。このような細胞培養容器としては、その他に、複数の囲繞部が例えばマトリクス状に配置されてなるマイクロプレートや、マルチウェルプレート等と呼称される容器がある。

前記細胞培養容器の全体又は一部に、細胞接着抑制剤を被覆することが提案されている（例えば、特許文献１参照）。細胞接着抑制剤を被覆することで、培養箇所以外に細胞が接着することを抑制できる。

さらに培養容器にコラーゲンをコートすることで接着系細胞に優れた特性が与えられることが提案されている（例えば、特許文献２参照）。コラーゲン溶液を入れて放置した後、コラーゲン溶液を取り除く工程、培養容器を純水で洗浄する工程、室温で乾燥させる工程が記載されている。

また、基材表面の細胞培養に供する部分が、ε−ポリリジン及びその塩から選ばれた少なくとも１種によりコーティングされることが提案されている（例えば、特許文献３参照）。ε−ポリリジン類のコーティング量が目的量となるように、ε−ポリリジン類溶液をスピンコート、バーコート等のコーティング法により塗布することが記載されているが、この場合、基材表面にε−ポリリジン類の溶液に接触させる工程の後に、コーティング量を調整するため、過剰なε−ポリリジン類の溶液をアスピレートして取り除くことが好ましいと記載されている。

国際公開２０１２／０３６０１１号公報 特開平５−２６０９５０ 特開２００６−５５１５７号公報

しかし、除去したコート液はコートする物質が培養容器に付着したことにより溶液の濃度が低くなっていることから、一般的に再利用が不可能である。また、必要量以上のコート液を用いることで、コストも大きくなる。さらに、コート液をアスピレートして取り除く作業に手間もかかる。そのため、少ない液量でコートを行うことが望まれている。

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、コートに必要な量以上のコート液を使用することなく、均一なコートが可能で、且つ余分なコート液をアスピレートして取り除く必要がない、細胞培養器具の製造方法の提供を目的とする。

上記した課題は、以下の（１）から（１０）に記載した本発明により達成される。
（１）細胞を培養する用途に使用される器具の製造方法において、細胞培養表面のコート工程に、
第１のコート工程と、その後に行う第２のコート工程を有し
前記第１のコート工程は、たんぱく質、ポリペプチド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレンイミン、もしくはこれらの混合物からなる群より選択される１つの溶質を、水又はエタノールを溶媒として用いた溶液、もしくは、水又はエタノールのうちいずれか１つをコート液としてコートし、
前記第２のコート工程は、たんぱく質、ポリペプチド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレンイミン、もしくはこれらの混合物からなる群より選択される１つの溶質を、水又はエタノールを溶媒として用いた溶液をコート液として、スピンコート法によってコートすることを特徴とする、細胞培養器具の製造方法。
（２）前記第１のコート工程は、スピンコート法によって行うことを特徴とする、（１）に記載の細胞培養器具の製造方法。
（３）前記第１のコート工程は、回転数１５００〜２５００ｒｐｍでスピンコートすることを特徴とする、（２）に記載の細胞培養器具の製造方法。
（４）前記第１のコート工程は、コート液を培養器具の表面積に対し、７．００×１０^−５〜２．５０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２用いてスピンコートすることを特徴とする（２）又は（３）の細胞培養器具の製造方法。
（５）前記第２のコート工程は、回転数３００〜１５００ｒｐｍでスピンコートすることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかの細胞培養器具の製造方法。
（６）前記第２のコート工程は、コート液を培養器具の表面積に対し、３．５０×１０^−５〜１．８０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２用いてスピンコートすることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの細胞培養器具の製造方法。
（７）前記コート工程において、コート液に用いるたんぱく質は、コラーゲンであることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかの細胞培養器具の製造方法。
（８）前記第１のコート工程において、コラーゲン濃度が０〜０．１２ｍｇ／ｍＬのコート液を用いることを特徴とする、（７）の細胞培養器具の製造方法。
（９）前記第２のコート工程において、コラーゲン濃度が０．１３〜０．５０ｍｇ／ｍＬのコート液を用いることを特徴とする、（７）又は（８）の細胞培養器具の製造方法。
（１０）前記コート工程において、コート液に用いるポリペプチドは、ポリＬリジン又はポリＤリジンであることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかの細胞培養器具の製造方法。
（１１）前記細胞培養器具は内径２０ｍｍ〜２００ｍｍの培養皿であることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかの細胞培養器具の製造方法。

本発明によれば、必要量以上のコート液を使用することなく、且つアスピレートにより余分なコート液を取り除く必要がなく、細胞培養器具を製造することができる。

本発明実施例のフロー図である。 本発明実施例のＣＢＢ染色を行った結果である。 本発明実施例のＨＥＫ２９３細胞（Ｐ＝４４）を４日間培養したときの顕微鏡写真である。 本発明実施例のアラマーブルー測定の結果である 本発明実施例のギムザ染色の結果である。

本発明の細胞培養器具の製造方法は、第１のコート工程と第２のコート工程を有する。第１のコート工程を行ってから、第２のコート工程を行うことで、培養器具表面の濡れ性が増し、培養器具表面がコートされやすくなる。これは、第１のコート工程によって培養器具表面の親水性が向上するためである。コートは少なくとも器具表面の細胞培養に供する部分が均一にコートされていれば良い。なお、本発明におけるコート液で形成される層は、用いるコート液の種類によって、細胞接着抑制又は細胞接着の機能を有するものである。

本発明において、第２のコート工程はスピンコート法によって行う。スピンコート法は、コート液を滴下又は噴射した平滑な器具を高速回転させることにより、遠心力で薄膜を形成することができ、回転速度を調整することでコートの膜厚を所望の厚みに形成することができる。本発明の第２のコート工程においては、培養器具表面に均一な膜を形成する必要があるため、従来のようにコート液を多めに入れてアスピレートする方法では、必要な液量が多くなり、コスト面で好ましくない。スピンコート法によれば、少ない量のコート液でも、遠心力により、培養器具表面に広げて薄膜を形成することができるため、コートに必要な量を超えるコート液を使用することなく、器具表面に均一なコートが可能となる。

本発明において、第１のコート工程のコート方法は特に限定されない。従来法である、コート液を浸して静置する方法でもよく、本発明の第２のコート工程と同様にスピンコートを行ってもよい。スピンコートを行うことにより、用いるコート液の液量を少量にすることができ、余分なコート液を取り除く必要がない。

本発明の第１のコート工程をスピンコートで行う場合、回転数は１５００ｒｐｍ〜２５００ｒｐｍで行うことが好ましい。回転数が１５００ｒｐｍ未満であると、コート液が培養器具表面に濡れ広がらない。好ましくは１８００ｒｐｍ以上、より好ましくは２０００ｒｐｍ以上である。また、２５００ｒｐｍを超えると、培養器具表面に均一なコートができない。好ましくは２４００ｒｐｍ以下、より好ましくは２３００ｒｐｍ以下である。

また、本発明の第１のコート工程をスピンコートで行う場合、コート液の液量は、培養器具の表面積に対し、７．００×１０^−５〜２．５０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２であることが好ましい。７．００×１０^−５ｍＬ／ｍｍ^２未満であると、液量が少ないため培養器具表面が均一に濡れ広がらない。好ましくは６．００×１０^−５ｍＬ／ｍｍ^２以上、より好ましくは５．５０×１０^−５ｍＬ／ｍｍ^２以上である。また、２．５０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２を超えると、液量が多いためコート液を乾燥させる必要がある。好ましくは２．３０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２以下、より好ましくは２．１０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２以下である。

本発明の第１のコート工程では、たんぱく質、ポリペプチド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレンイミン、もしくはこれらの混合物からなる群より選択される１つの溶質を、水又はエタノールを溶媒として用いた溶液、もしくは、水又はエタノールのうちいずれか１つをコート液として用いることができる。ここで、用いることができるたんぱく質は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンのうちいずれか１つであることが好ましい。特に好ましくはコラーゲンである。また、用いることができるポリペプチドはポリＬリジン又はポリＤリジンであることが好ましい。

本発明の第１のコート工程において、用いるコート液の濃度は溶質及び溶媒によって適切な濃度は異なる。例えば溶質としてコラーゲン、溶媒として水を用いる場合、０〜０．１２ｍｇ／ｍＬが好ましい。濃度が０．１２ｍｇ／ｍＬ超であると、コート液の粘度が高くなり、コート液が均一に濡れ広がらない。好ましくは０．１１ｍｇ／ｍＬ以下である。

ここで、本発明で用いられる水は水道水、蒸留水、滅菌水を用いることができる。特に滅菌水を用いることが好ましい。

本発明の第２のコート工程は、スピンコートを回転数３００〜１５００ｒｐｍで行うことが好ましい。３００ｒｐｍ未満では、濡れ広がらない箇所があり、均一にコートを行うことができない。好ましくは４００ｒｐｍ以上、より好ましくは４５０ｒｐｍ以上である。また、１５００ｒｐｍ超で行うとコート液が飛び散り、均一にコートを行うことができない。好ましくは１３００ｒｐｍ以下、より好ましくは１２００ｒｐｍ以下である。

本発明の第２のコート工程は、たんぱく質、ポリペプチド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレンイミン、もしくはこれらの混合物からなる群より選択される１つの溶質を、水又はエタノールを溶媒として用いた溶液をコート液として用いることができる。ここで溶媒は第１のコート工程で用いるコート液と同一であることが好ましい。第１のコート工程と同様に、用いることができるたんぱく質は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンのうちいずれか１つであることが好ましい。特に好ましくはコラーゲンである。また、用いることができるポリペプチドはポリＬリジン又はポリＤリジンであることが好ましい。

本発明の第２のコート工程において、用いるコート液は溶質及び溶媒によって適切な濃度は異なる。例えば溶質としてコラーゲン、溶媒として水を用いる場合、０．１３〜０．５０ｍｇ／ｍＬが好ましい。０．１３ｍｇ／ｍＬ未満では、溶媒の比率が高いため、乾燥に時間がかかる。好ましくは０．１４ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．１５ｍｇ／ｍＬ以上である。０．５０ｍｇ／ｍＬを超えると、コート液の粘度が高く、均一に濡れ広がならない。好ましくは０．４８ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．４６ｍｇ／ｍＬ以下である。

また、本発明の第２のコート工程をスピンコートで行う場合、コート液の液量は、培養器具の表面積に対し、３．５０×１０^−５〜１．８０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２であることが好ましい。３．５０×１０^−５ｍＬ／ｍｍ^２未満であると、液量が少ないため培養器具表面が均一に濡れ広がらない。好ましくは４．００×１０^−５ｍＬ／ｍｍ^２以上、より好ましくは４．５０×１０^−５ｍＬ／ｍｍ^２以上である。また、１．８０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２を超えると、液量が多いためコート液を乾燥させる必要がある。好ましくは１．７０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２以下、より好ましくは１．６０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２以下である。

本発明でコートを行う細胞培養器具は培養皿を用いることが好ましい。また、培養皿は内径２０ｍｍ〜２００ｍｍの大きさを用いることができる。好ましくは３０ｍｍ〜１５０ｍｍである。また、本発明に用いられる細胞培養器具はガラス製であっても樹脂製であっても良い。

本発明の細胞培養器具は、コート工程以前に、コート液をコートする器具表面に対しては、放電処理を行ったものを用いることが好ましい。放電処理を行うことで、親水性が向上し、コート液が付着しやすくなる。また、第１のコート工程の直前に、放電処理済の器具表面に、再度放電処理を行ってもよい。放電処理は、例えば、コロナ放電処理、プラズマ放電処理が好ましい。

本発明の第１のコート工程では、スピンコートに要する時間は１〜５ｓｅｃである。１ｓｅｃ未満では培養容器表面に濡れ広がらない。好ましくは２ｓｅｃ以上である。５ｓｅｃ超では、均一にコートすることができない。好ましくは４ｓｅｃ以下である。

本発明の第２のコート工程では、スピンコートに要する時間は１〜４ｓｅｃである。１ｓｅｃ未満では培養容器表面に濡れ広がらない。好ましくは１．５ｓｅｃ以上である。４ｓｅｃ超では、均一にコートすることができない。好ましくは３ｓｅｃ以下である。

本発明においては、第１のコート工程及び第２のコート工程を室温で行うことができる。第２のコート液の種類によってはコート液を４℃に冷やしておく。

本発明においては、第２のコート工程の後に、リンス工程を設けてもよい。リンス工程は、第１のコート工程及び第２のコート工程で使用した溶媒をリンス液とし、第２のコート工程を終えた後の培養容器にコートすることで行われる。コート方法は特に限定されない。第２のコート工程の後にリンス液でコートすることによって、培養面に完全に接着しなかった遊離のコート剤が減らすことができる。よって、培養時に遊離のコート剤が培地や培養物へ影響を与える可能性を低減することができる。

本発明においては、コート後の細胞培養器具を乾燥させることで使用することができる。乾燥の手段として、送風のあるクリーンベンチ内又はタイベック付きバックに梱包して乾燥させる。クリーンベンチ内ではフタをあけた状態でも閉めた状態でもよいが、フタを開けた状態の方が短時間で乾燥することができるため好ましい。

以下、本発明の特徴をさらに具体的に示すため、本発明の細胞培養器具の製造方法の実施例を示すが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。当業者にあっては、具体的な実施態様において本発明の技術思想および技術範囲から逸脱せずに種々の変形・変更を加えることが可能である。なお、実施例のフロー図を図１に示す。

（実施例）
本実施例では、放電処理済の直径６０ｍｍの樹脂性培養皿（ＡＧＣテクノグラス社製、商品名：ＴＣ Ｔｒｅａｔｅｄ ６０ｍｍ Ｄｉｓｈ）を用いた。第１のコート工程で用いるコート液として、滅菌水、第２のコート工程で用いるコート液としてコラーゲンＩ（新田ゼラチン製、商品名：ｃｏｄｅ ＣＥＬＬＭＡＴＲＩＸ−１Ｐ−２０）（商品名）の滅菌水希釈溶液を使用した。スピンコートマシンはミカサ社製スピンコート装置１Ｈ−ＤＸを用いた。

まず、コラーゲンＩ原液を希釈し、コラーゲンＩ溶液を調整した。あらかじめ４℃に冷やしておいた１００ｍＬメジュームビン（ＡＧＣテクノグラス社製、商品名：広口メジューム瓶）の質量を電子天秤で計測した。次にメジュームビンを氷上に置き、２５ｍＬピペット（ＡＧＣテクノグラス社製、商品名：プラスチックピペット）でコラーゲンＩ原液を加えた。コラーゲンＩ原液の入ったメジュームビンの質量を計測し、加えたコラーゲンＩ原液の量を計算し、そこから加える滅菌水の量を計算した。２５ｍＬピペットで滅菌水を前記メジュームビンに加え、ピペッティングして完全に混合した。

次に、培養皿にコートを行う。第１のコート工程として、スピンコートマシンの回転数、時間をセットし、水をディッシュに滴下して、スピンコートを行った。その後、第２のコート工程として、スピンコートマシンの回転数、時間を再度セットし、コラーゲンＩ溶液をディッシュに滴下してスピンコートを行った。なお、回転数、時間、水及びコラーゲンＩ溶液の量は表１〜表３に記載した。

続いて、従来法によるサンプルを作製した。まず、氷冷した滅菌水２９ｍＬにコラーゲンＩ原液を１ｍＬ加え、ピペッティングにより混ぜ合わせ、０．１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩコート溶液を調整した。コート液を培養皿に入れ、培養皿を傾けてコート液を培養表面にいきわたらせた。５分間静置した後に、アスピレーターでコート液をできるだけ吸引除去した。その後、クリーンベンチ内で一晩乾燥させた。

以上により、作成した本発明のサンプル（例１〜５）と、従来法により作製したサンプル（例２２）を用いて、ＣＢＢ染色を行った。まず、各サンプルにＣＢＢ染色液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、商品名：ＰｈａｓｔＧｅｌ ＢｌｕｅＲ）を１．５ｍＬ加えて一晩放置した。次に、各サンプルのＣＢＢ染色液を取り除いた後、バット内に入れた水につけて洗浄し、染色状態を確認した。染色状態については表１〜３に○（全体に均一に染色された）、△（一部のみ染色された）、×（染色されなかった）で示した。例１〜５、及び例２２のＣＢＢ染色結果を図２に示す。各条件３つずつサンプルを用意し、比較した。ここで、ＣＢＢ染色とは、コラーゲンが染色されるものであり、全体に均一に染色されたものは、全体に均一なコラーゲンコートができていることを示す。一部のみの染色は、全体に均一なコートがされていないことを示す。染色されなかったものは、コラーゲンコートができていないことを示す。

次に、細胞培養による各種測定を行った。ＨＥＫ２９３細胞（Ｐ＝４４）を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播込みした。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ‘ｓ＋２０％ＫＳＲ（無血清培地）を用い３７℃、水蒸気飽和状態で、ＣＯ２インキュベーターで４日間培養した。ここで、コラーゲンを含有するコート液の均一な塗布を評価するために、コラーゲンが付着している場所のみにＨＥＫ２９３細胞が接着するよう、培地として無血清培地を用いた。血清培地を用いた場合、コラーゲンが付着していなくてもＨＥＫ２９３細胞は培養皿の培養表面に付着してしまう。例１〜５、例２２、及びコートなしの場合の培養結果の顕微鏡写真を図３に示す。

培養４日目に、アラマーブルーを用いた蛍光測定を行った。これにより、細胞活性の有無を確認することができる。細胞培養液を吸引後、培地の１／１０量（０．２ｍＬ）を添加し調整したアラマーブルー溶液（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、商品名：ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）を添加した。４時間反応させ、サンプルの培養液の一部（０．２ｍＬ）を９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス社製、商品名：ＴＣ ｔｒｅａｔｅｄ ９６ウェルプレート）に移した。この際、１つのサンプルから２ｗｅｌｌへ移した。続いて、測定器（バイオテックジャパン合同会社製、商品名：Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ Ｆ）を用いてＥｘ５４４ｎｍ、Ｅｍ５９０ｎｍの波長で測定を行った。測定結果を図４と、表１〜３に記載した。蛍光が強いものは細胞活性があり、蛍光が弱いものは細胞活性がないことを示している。細胞活性がない箇所は、コラーゲンがコートされていないため、細胞の培養ができていない。

アラマーブルー測定後のサンプルで、ギムザ染色を行った。これにより、細胞が培養容器に接着しているか否かを確認することができる。アラマーブルー溶液を含む培地をアスピレートし、メタノールを培養面が覆われる程度に添加した。ドラフト内で３０分以上放置した後にメタノールを廃棄して、２〜３％ギムザ染色液入りＰＢＳ（タカラバイオ社製、商品名：ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＢＵＦＦＥＲＴＥＤ ＳＡＬＴＳ）を培養面が覆われる程度に添加した。３０分以上放置後、水洗浄を行い、乾燥させた後に染色の程度を確認した。測定結果を図５に示した。細胞が接着している部分は染色され、接着していない部分は染色されない。染色状態については表１〜３に従来法サンプルを基準として、○（従来法サンプルと同程度）、△（従来法サンプルより染色されていない）、×（全く染色されなかった）で示した。

以上のサンプル作製及び各種測定の結果を表１〜３にまとめた。例１〜２０は２段階のコート工程をそれぞれスピンコート法により行ったサンプルであり例２１は従来法の手コートによりコートしたサンプルである。

以上より、２段階のコート工程を実施した例については、従来法より少ない液量で、従来法と同様の効果を有するコートをすることが可能である。各種測定結果においても、従来法と同等の結果を得ていることが確認された。

本発明によれば、必要量以上のコート液を使用することなく、且つアスピレートにより余分なコート液を取り除く必要がなく、細胞培養器具を製造することができる。液量を少なくすることで、コストダウンが可能であり、且つアスピレートが不要なため作業の手間を省くことも可能である。

Claims (11)

1. 細胞を培養する用途に使用される器具の製造方法において、細胞培養表面のコート工程に、
   第１のコート工程と、その後に行う第２のコート工程を有し、
   前記第１のコート工程は、たんぱく質、ポリペプチド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレンイミン、もしくはこれらの混合物からなる群より選択される１つの溶質を、水又はエタノールを溶媒として用いた溶液、もしくは、水又はエタノールのうちいずれか１つをコート液としてコートし、
   前記第２のコート工程は、たんぱく質、ポリペプチド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレンイミン、もしくはこれらの混合物からなる群より選択される１つの溶質を、水又はエタノールを溶媒として用いた溶液をコート液として、スピンコート法によってコートすることを特徴とする、細胞培養器具の製造方法。
2. 前記第１のコート工程は、スピンコート法によって行うことを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養器具の製造方法。
3. 前記第１のコート工程は、回転数１５００〜２５００ｒｐｍでスピンコートすることを特徴とする、請求項２に記載の細胞培養器具の製造方法。
4. 前記第１のコート工程は、コート液を培養器具の表面積に対し、７．００×１０^−５〜２．５０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２用いてスピンコートすることを特徴とする請求項２又は３に記載の細胞培養器具の製造方法。
5. 前記第２のコート工程は、回転数３００〜１５００ｒｐｍでスピンコートすることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の細胞培養器具の製造方法。
6. 前記第２のコート工程は、コート液を培養器具の表面積に対し、３．５０×１０^−５〜１．８０×１０^−４ｍＬ／ｍｍ^２用いてスピンコートすることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項に記載の細胞培養器具の製造方法。
7. 前記コート工程において、コート液に用いるたんぱく質は、コラーゲンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養器具の製造方法。
8. 前記第１のコート工程において、コラーゲン濃度が０〜０．１２ｍｇ／ｍＬのコート液を用いることを特徴とする、請求項７に記載の細胞培養器具の製造方法。
9. 前記第２のコート工程において、コラーゲン濃度が０．１３〜０．５０ｍｇ／ｍＬのコート液を用いることを特徴とする、請求項７又は８に記載の細胞培養器具の製造方法。
10. 前記コート工程において、コート液に用いるポリペプチドは、ポリＬリジン又はポリＤリジンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞培養器具の製造方法。
11. 前記細胞培養器具は内径２０ｍｍ〜２００ｍｍの培養皿であることを特徴とする請求項１〜１０いずれか１項に記載の細胞培養器具の製造方法。