JP2015532834A5 - - Google Patents

Claims (36)

1. (ａ)ポリメラーゼ反応混合物を含む水性相と油性混合物とを含む混合物を準備することと、
   (ｂ)２mmから50μmの間の直径を有するオリフィスに40μl/秒から220μl/秒の速度で混合物を通過させることにより、混合物を乳化することと、
   (ｃ)エマルジョンを、核酸増幅のために充分な条件に供することと
   を含む、エマルジョンポリメラーゼ増幅の方法。
2. 混合物が、オリフィスを少なくとも５、10、15、20、25、30、35又は40回通過する請求項１に記載の方法。
3. 混合物が、オリフィスを40回以下通過する請求項１又は２に記載の方法。
4. 混合物が、60μl/秒 から180μl/秒、80μl/秒から160μl/秒、又は80μl/秒から120μl/秒の速度でオリフィスを通過する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. オリフィスが、１mmから100μmの間、800μmから200μmの間、又は800μmから400μmの間の直径を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. オリフィスに混合物を通過させることが、混合物をピペット操作することを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 油性混合物が、ミネラルオイル、炭酸ジエチルヘキシル、イソステアリン酸ポリグリセリル-４、セチルPEG/PPG-10/1-ジメチコン、ラウリン酸ヘキシル又はオレイン酸ポリグリセリル-３を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 油性混合物が、ミネラルオイル、炭酸ジエチルヘキシル、イソステアリン酸ポリグリセリル-４、セチルPEG/PPG-10/1-ジメチコン及びラウリン酸ヘキシルを含む請求項７に記載の方法。
9. 油性混合物が、
   (ａ) 10〜30%(w/v)のミネラルオイルと、
   (ｂ) 55〜75%(w/v)の炭酸ジエチルヘキシルと、
   (ｃ)５〜15% (w/v)の、イソステアリン酸ポリグリセリル-４とセチルPEG/PPG-10/1-ジメチコンとラウリン酸ヘキシルとからなる組成物と、
   (ｄ)５〜15% (w/v)のオレイン酸ポリグリセリル-３又はイソステアリン酸ポリグリセリル-４と
   を含む請求項８に記載の方法。
10. (ａ) 10〜30%(w/v)のミネラルオイルと、
    (ｂ) 55〜75%(w/v)の炭酸ジエチルヘキシルと、
    (ｃ)５〜15% (w/v)の、イソステアリン酸ポリグリセリル-４とセチルPEG/PPG-10/1-ジメチコンとラウリン酸ヘキシルとからなる組成物と、
    (ｄ)５〜15% (w/v)のオレイン酸ポリグリセリル-３又はイソステアリン酸ポリグリセリル-４と
    を含む油性組成物。
11. ５〜15% (w/v)のオレイン酸ポリグリセリル-３を含む請求項10に記載の油性組成物。
12. ５〜15% (w/v)のイソステアリン酸ポリグリセリル-４を含む請求項10に記載の油性組成物。
13. (ａ) 15〜25% (w/v)のミネラルオイルと、
    (ｂ) 60〜70% (w/v)の炭酸ジエチルヘキシルと、
    (ｃ)５〜10% (w/v)の、イソステアリン酸ポリグリセリル-４とセチルPEG/PPG-10/1 -ジメチコンとラウリン酸ヘキシルとからなる組成物と、
    (ｄ)５〜10% (w/v)のオレイン酸ポリグリセリル-３又はイソステアリン酸ポリグリセリル-４と
    を含む請求項10に記載の油性組成物。
14. (ａ) 18〜22% (w/v)のミネラルオイルと、
    (ｂ) 62〜66% (w/v)の炭酸ジエチルヘキシルと、
    (ｃ)５〜10% (w/v)の、イソステアリン酸ポリグリセリル-４とセチルPEG/PPG-10/1 -ジメチコンとラウリン酸ヘキシルとからなる組成物と、
    (ｄ)５〜10% (w/v)のオレイン酸ポリグリセリル-３又はイソステアリン酸ポリグリセリル-４と
    を含む請求項13に記載の油性組成物。
15. (ａ) 20〜50%の２-ブタノールと、
    (ｂ) 20〜50%の１-プロパノールと、
    (ｃ)10〜40%の水と
    を含み、
    少なくとも１種の洗浄剤と少なくとも１種の塩とを含むエマルジョン破壊溶液。
16. 0.1%から2.0%のSDSを含む請求項15に記載のエマルジョン破壊溶液。
17. アルカリ性変性剤を含む請求項15又は16に記載のエマルジョン破壊溶液。
18. (ａ) 30〜50%の２-ブタノールと、
    (ｂ) 30〜50%の１-プロパノールと、
    (ｃ) 10〜30%の水と
    を含む請求項15〜17のいずれか１項に記載のエマルジョン破壊溶液。
19. pH緩衝剤、NaCl、Triton X-100、キレート化剤又はSDSをさらに含む請求項15〜18のいずれか１項に記載のエマルジョン破壊溶液。
20. (ａ)５〜20%の２-ブタノールと、
    (ｂ)５〜20%の１-プロパノールと、
    (ｃ) 70〜90%の水と
    を含み、
    少なくとも１種の洗浄剤と少なくとも１種の塩とを含むエマルジョン浄化溶液。
21. pH緩衝剤、NaCl、Triton X-100、キレート化剤、NaOH又はSDSをさらに含む請求項20に記載のエマルジョン浄化溶液。
22. (ａ) (ｉ)ポリメラーゼ反応混合物を含む水性相と、(ii)請求項10〜14のいずれか１項に従う油性組成物とを含む混合物を準備することと、
    (ｂ)混合物を乳化することと
    を含むエマルジョンポリメラーゼ増幅の方法。
23. エマルジョンポリメラーゼ増幅の方法としてさらに定義され、
    (ｃ)エマルジョンを、核酸増幅のために充分な条件に供すること
    をさらに含む請求項22に記載の方法。
24. 混合物を乳化することが、１mmから50μmの間の直径を有するオリフィスに40μl/秒から220μl/秒の速度で混合物を通過させることを含む請求項22又は23に記載の方法。
25. 混合物が、オリフィスを少なくとも５、10、15、20、25、30、35又は40回通過する請求項24に記載の方法。
26. オリフィスが、約800μmから200μmの間の直径を有する請求項24又は25に記載の方法。
27. オリフィスに混合物を通過させることが、混合物をピペット操作することを含む請求項24〜26のいずれか１項に記載の方法。
28. 乳化ステップが、自動化されている請求項22〜27のいずれか１項に記載の方法。
29. 複数の反応容器中でのエマルジョンポリメラーゼ増幅の方法としてさらに定義される請求項23〜28のいずれか１項に記載の方法。
30. 複数の反応容器が、プレート上のウェルとして整列されている請求項29に記載の方法。
31. 水性相が、複数の核酸鋳型とコンジュゲートした複数のビーズを含む請求項22〜30のいずれか１項に記載の方法。
32. ビーズが、磁性である請求項31に記載の方法。
33. (ｄ)破壊溶液を混合物に加えてエマルジョンを破壊すること
    をさらに含む請求項22〜32のいずれか１項に記載の方法。
34. 破壊溶液が、請求項15〜19のいずれか１項に従う破壊溶液である請求項33に記載の方法。
35. (ｅ)油性相又は水性相を除去すること
    をさらに含む請求項33又は34に記載の方法。
36. 破壊溶液が、アルカリ性変性剤をさらに含む請求項33〜35のいずれか１項に記載の方法。