JP2015529077A

JP2015529077A - フリーラジカルに誘発されるｄｎａ損傷を特徴とする病態に対する被験者の素因を決定する方法及びアッセイ製品

Info

Publication number: JP2015529077A
Application number: JP2015530497A
Authority: JP
Inventors: アンダーソンダイアナ; ナジャフザデーモジガン; クライヴトーマスデンヤーモーガン
Original assignee: University of Bradford
Current assignee: University of Bradford
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2015-10-05
Also published as: CN104755927A; GB201216174D0; EP2895853A1; IN2015DN02685A; US20150219619A1; WO2014041340A1

Abstract

本発明は、COPDやぜんそく等、フリーラジカルに誘発されるDNA損傷を特徴とするがんや他の病態に対する被験者の素因を決定し、未診断のがん患者を特定する方法に関する。当該方法は、被験者からの全血を利用することができ、好ましくは放射源とサンプルとの間の距離を変更することによって、サンプルを異なるレベル又は強度の電磁放射にさらすことに基づく。

Description

本発明は、フリーラジカルに誘発されるDNA損傷を決定する方法に関し、特に、COPDやぜんそく等、フリーラジカルに誘発されるDNA損傷を特徴とするがんや他の病態に対する被験者の素因を決定する方法に関する。

また、本発明は、特定のがんに関連して被験者の現状を決定する方法に関する。

また、本発明は、電磁（EM）放射線に誘発される細胞損傷に対する被験者の感受性を決定する方法に関し、特に、紫外線（UV）放射に誘発される細胞損傷に対する被験者の感受性を決定する方法に関する。

また、本発明は、発明の方法を行う際に使用されるアッセイ製品や関連キットに関する。

細胞の酸化的DNA損傷は、細胞代謝の不可避の結果であるが、発がん性化合物、酸化還元サイクリング薬、電離及び紫外線放射等の外生源との相互作用も酸化的損傷に寄与する。

紫外線は、生体外でDNA損傷を誘発する物理的な汎用の突然変異原として用いることができる。化学的遺伝毒性物質と比べて、UVA光を使用する利点は、露光時間を正確に設定できることである。化学的遺伝毒性物質は、遠心分離及び洗浄処理によって除去する必要がある。

UVAは、可視部分（56%）及び赤外線部分（39%）だけでなく紫外線（UV）光（5%）も含む海面（290〜5000nm）レベルの電磁スペクトルを有する太陽光の一部である。主にUVA（320〜400 nm）と、大気吸収のためより少ない程度ではあるがUVB（290〜320 nm）とは、地表に到達する一方、殺菌作用のあるUVC部分は、完全に遮られる。UVA/B光は、環境中のヒト発がん性物質として一般に知られており、紅斑（日光皮膚炎）、日焼け、光老化、免疫抑制の原因にもなる。しかし、主にUVAを発する人工紫外線源は、日焼けサロンや、乾癬の治療用にも見られる。UVAが組織に吸収されることにより、活性酸素種、窒素種及び不安定鉄が産生され、これらによってDNA等の他の生体分子が損傷する。紫外線照射後のDNA損傷として最も多いタイプは、シクロブタン型ピリミジンダイマー（CPD）であり、主に微量のUVBによってもたらされる一方、8-oxo10グアニン等の、UVAに誘発される酸化的DNA損傷は、細胞に存在する非DNA発色団に依存する。

紫外線吸収によって、さまざまな光分解生成物の生成を介してDNA損傷を誘発する酸素フリーラジカルが発生する。このプロセスは、正常なDNAの塩基対合能力を変え、突然変異を引き起こし得る。これら突然変異が、P53やINK4Aといった腫瘍抑制遺伝子を妨害することから、がんにつながる可能性がある。フリーラジカルは、多くの種類のがんに関与する。ATM（Ataxia-telangiectasia mutated）及びATR（Rad3-related）遺伝子のフリーラジカルに関連する突然変異が、リンパ腫発生の一因であるということが証明されている。

過去20年程にわたって、コメットアッセイ又は単一細胞ゲル電気泳動アッセイは、細胞内のDNA鎖切断を測定することによってDNA損傷を評価する標準方法の一つとなっている。顕微鏡スライド上のアガロースに埋め込まれた細胞を、洗剤及び高塩濃度で溶解して、核マトリックスに結合したDNAのスーパーコイルループを含む核様体を形成する。

高pHでの電気泳動によって、蛍光顕微鏡検査法で観察すると彗星（コメット）に似た構造が得られる。ここで、彗星の頭部に対する尾部の強さが、DNA鎖切断及びアルカリ不安定部位の数を反映している。切断を含むループは、そのスーパーコイル構造を失い、陽極に向かって自由に移動する。このように、コメットアッセイは、ゲノム損傷を決定する手段を提供する。

DNA損傷の程度を決定するための蛍光の計算は、画像ソフトウェアを用いた手動採点によって行うことができる。

がん自体や、恐らくはその前がん状態が、生体全体にストレスを引き起こし得るということが最近明らかになっている。この事実は、がんに無関係の細胞における、外因性遺伝毒性障害への感受性の違いにつながる可能性がある。環境的ストレスや生活要因による障害は、感受性細胞におけるより大きな損傷の原因になり得る。

以前より、本発明者らは、紫外線損傷から細胞を保護するための日焼け止め等の被験物質の能力を決定する肌モデルとして、従来のコメット試験及びその新規の変形（例えば、WO2008/050134参照)を用いてきた。しかし、この方法では、サンプルをリンパ球の形にするべく随時多くの前処理ステップが必要である。さらに、リンパ球サンプル層は、サンプルを内部に保持するサンドイッチ効果を得るべく、１つ（従来のコメットアッセイの場合）またはそれ以上（新規の3Dアッセイの場合）の追加の障壁層と重ね合わせられる。これは、かなり手間のかかるプロセスとなる。

電磁放射への細胞の感受性を決定する改良法を提供することが望ましい。また、被験者が、DNA損傷を特徴とするがんや他の病気の素因を有するかどうかを決定することが望ましい。

本発明の一形態によると、DNA損傷を特徴とする病気の素因について被験者をスクリーニングする方法であって、被験者から全血を採取するステップと、基板上に、前記全血の複数のサンプルを載置するステップと、前記サンプルを異なるレベル又は強度の電磁放射にさらすステップと、各サンプルにおける遺伝子損傷レベルを検出するステップと、前記損傷レベルを、所定値又は所定値パターンと比較するステップと、を含む方法が提供される。

好ましくは、スクリーニング方法は、前記比較から妥当な診断結果を決定する最終ステップを含む。

本発明は、先行技術方法よりも明確なグループ間区別を示す。また、本発明は、より高い結果再現性を可能にする。

好ましくは、各サンプルを異なるレベルの電磁放射にさらすステップは、サンプルごとに正確な強度を得るために放射源とサンプルとの間の距離を変更することによって行われる。

前記複数のサンプルは、検査用に複数のサンプルに分けることができるという条件で、ある被験者から単一サンプルとして採取し得る。

好ましくは、サンプルは、10分間から30分間、電磁放射にさらされる。

最も好ましくは、サンプルは、15分間、電磁放射にさらされる。

随時、前記サンプルを異なるレベルの電磁放射にさらすステップは、高さを調整することで発する電磁放射のレベルを変えることによって行われる。

最も好ましくは、前記サンプルと電磁放射源との間に追加の障壁物質層を配置しない。

最も好ましくは、前記サンプルの上に追加の障壁物質層を直接配置しない。

好ましくは、前記全血は、末梢全血を含む。

多くの前処理ステップを必要とせずに全血を使用することができることは、特に有利である。

好ましくは、前記方法は、サンプルを異なるレベルの電磁放射にさらす前に、基板上に全血を載置するステップを含む。

全血サンプルを基板上に載置するために、通常、40μlの希釈全血が同量の細胞培地（RPMI）及び10%のDMSO（保管冷凍媒体）と混合され、さらに100μlの0.5%低融点アガロース（＜40℃）と混合されて、乾燥アガロース被覆スライドに塗布される。

35μl、40μl、又は45μlの血液が好ましい量であると想定される。この場合における細胞数は、血液量に応じて、それぞれ7〜10、10〜15、20〜25である。細胞密度は、血液量に応じて、それぞれ0.0015、0.0020、0.0030である。

最も好ましくは、封入媒体は、0.5%の低融点アガロース（＜40℃）である。

好ましくは、前記電磁放射は、紫外線放射である。

追加の障壁層を上に載せることなくサンプルが基板上に配されるため、全血細胞を、電磁放射にさらされた後に溶解することが可能である。したがって、手間のかかる前処理ステップは不要となる。

前記方法は、さらに、溶解後に、赤血球と残屑とを含有する溶解溶液を除去するステップを含んでもよい。

前記方法は、がんの素因について被験者をスクリーニングするために使用することができ、前記がんは、皮膚がん、肺がん、乳がん、腸がん、前立腺がん、大腸がんを含むがこれに限定されるものではない。

前記方法は、COPD、ぜんそく、気腫、又は大腸ポリポーシスの素因について被験者をスクリーニングするために使用することもできる。

本発明のより良い理解のために、以下の図面を参照しながら実施形態を説明する。
発明の方法を用いて例から得られるデータのグラフ表示であり、紫外線光のさまざまな高さ（サンプルと紫外光源との間のさまざまな距離によって生じるさまざまな強度）での細胞のオリーブテールモーメントを示すとともに、健常対照群、前がん状態、及びがんの間の特性の違いを示す。紫外線光のさまざまな高さを使用して、文献に記載されている標準的な通常（従来）のコメットアッセイプロトコルを用いて得られるデータのグラフ表示であり、特に、ここでの特性は、新たな方法を用いて得られる特性と異なる。

本発明者らは、物理的な汎用の突然変異原としての紫外線への細胞の反応差が、被験者のがんの素因の正確な指針となることを見出した。本発明は、サンプルにおける細胞の紫外線感受性についてサンプルを検査して、その結果を用いて被験者のがんの素因の正確な指針を表す、簡単で正確な方法を提供する。

最初のステップで、患者から１つ以上のサンプルを採取する。例えば、静脈穿刺によって、患者から末梢全血サンプルを容易に採取することができる。（適切に分割されたある被験者からの単一の血液サンプルに由来し得る）これらサンプルは、（一般にアッセイ製品や関連キットを用いる）以下のアッセイ方法で使用することができる。

［好適なプロトコル（UVA、全血、及び改良された標準コメットアッセイ方法、即ち、新アッセイに基づく）］

使用されるBDH（スーパーフロスト（商標））のスライドガラスには、1%のアガロース（標準融点アガロース）が塗布される。他の全ての化学試薬は、イギリスのVWR インターナショナルラボラトリーサプライヤから得られる。

40μlの希釈全血は同量のRPMI及び10%のDMSO（保管冷凍媒体）と共に、100μlの0.5%低融点アガロース（＜40℃）と混合されて、乾燥アガロース被覆スライドに塗布される。

標準コメットアッセイにおける「サンドイッチ」を形成する三層と異なり、LMPアガロースの第二の層は不要である。スライドは、5分間だけ氷の上に放置されてから、UVA処理に供される。

UVA照射には、２つの15WのPUVAチューブを収納する卓上ランプ（ドイツ、フィリンゲンシュウェニンゲンのWaldmann、イギリスのAthrodax Healthcare International Ltd.から購入）が使用される。PUVAチューブのスペクトルは、320〜410nmの範囲で、351nmに極大を持つ。紫外線処理されるスライドに対して、ランプはスライドから異なる距離に配置されることで、適切な強度を生じる。処理グループにおける第一のスライドは、陽性対照であり、強度が約1.20mW/cm² であるのに対し、残りのスライドは、異なる強度になる。第二のスライドは、約0.80mW/cm²、第三のスライドは、約0.50mW/cm²、第四のスライドは、約0.20mW/cm²の強度となる。

この新アッセイでは、細胞は、スライド上の0.5%のLMPアガロースに埋め込まれて照射される。

ここでは、二組のスライドを用いる。

[グループ1]
スライドNo.1は、UVA処理なしで100μlのLMP0.5%アガロースに覆われる（陰性対照）。

[グループ2]
スライドNo.2は、100μlのLMP0.5% アガロースに覆われ、UVA強度は約1.20mW/cm² （UVAランプからの距離は15cm）である（陽性対照）。
スライドNo.3は、100μlのLMP0.5%アガロースに覆われ、UVA強度は約0.80 mW/cm² （UVAランプからの距離は20cm）である。
スライドNo.4は、100μlのLMP0.5% アガロースに覆われ、UVA強度は約0.50 mW/cm² （UVAランプからの距離は25cm）である。
スライドNo.5は、100μlのLMP0.5% アガロースに覆われ、UVA強度は約0.20 mW/cm²である。

スライドは、処理後、冷溶解溶液（2.5MのNaCl、100mMのEDTA、10mMのTris、10%のDMSO、1%のTriton X-100、pH10)を含む容器に横向きに浸漬される。スライドは、4℃で1時間又は一晩培養される。

溶解後、スライドは、冷電気泳動緩衝液（300mMのNaOH、1mMのEDTA、pH＜13）で満たされた電気泳動槽のトレイに水平方向に置かれる。スライドは、暗闇の中4℃で30分間培養されることで、DNAの巻き戻し、及び、一本鎖切断（SSB）や二本鎖切断（DSB）アルカリ不安定損傷の発現が可能になる。電気泳動は、25V及び調整電流300mAで（緩衝液レベルを上下することにより）、同温度で30分間行われる。

電気泳動後、スライドは槽から取り出されて、それぞれ三回、中和緩衝液（400mMのTris、pH7.5）に5分間浸漬される（Tice, Agurell et al. 2000、Anderson, Schmid et al. 2003)。

細胞は、20μg/mlのエチジウムブロマイド又は適切な代替物（例えば、SYBR Green）で染色され、モノクロCCDカメラを備える蛍光顕微鏡で検査される。

各複製スライドで、50個のセルが採点される（全100個、実験点毎に1000回観察することにより、効果を検出する統計的検出力を十分得ることができる）。

コンピュータ画像解析システムKomet6.0（Andor Ltd、ベルファスト)を使用して、コメットパラメータを測定する。そして、中間オリーブテールモーメント及びパーセントテールDNAを用いて統計解析を行う。

図1に、プロトコルを用いて、前がん状態とされた者、がんとされた者、及び健常対照群を含む被験者30人から採取されたサンプルに行った実験結果を示す。

オリーブテールモーメントはDNA損傷を表すことから、全ての細胞において、紫外線変異原にさらされる強度が増加するにつれて（即ち、紫外線ランプの高さが減少するにつれて）細胞のオリーブテールモーメントが増加することが予期される。発明の方法を使用した図1は、明らかにこのケースに当てはまる。一方、サンプル上部に追加の障壁層を配してランプ高さを変更する標準的な通常（従来）のサンプルコメットアッセイを使用した場合、結果はこの原則と一致しない（図2）。

また、図1には、がんもしくは前がん状態の個人の細胞は類似の特性をたどり、これは、健常な個人の細胞で観察される特性と大きく異なる。健常対照群は、がん細胞や前がん細胞と大きく異なる特性を示す。これにより、がんの素因を表すサンプルの被験者を明確に特定することができる。標準的な通常（従来）のコメットアッセイを使用した図2に示される特性は、明白で正確な結果を与えるほど健常対照群との区別が十分でないため、上記のように利用することは不可能である。

注目すべきは、従来のコメットアッセイ（図2にその結果を示す）を使用する場合、全血からスライドを準備してUVAで処理するのに大きな技術的困難と問題とがあるということである。

１．全血を1% LMPアガロースと混合してスライド上に広げる際、スライド上で容易に広がらない。
２．100μlの0.5%LMPの第二の寒天層が、塗布の際にスライド全体を覆うことができない。
３．溶解溶液を用いた後、寒天ゲルに付着した赤血球全てを洗い流すことができない。

本発明は、これらの問題を緩和することを目的とする。

Claims

DNA損傷を特徴とする１つ以上の病気の素因又は存在について被験者をスクリーニングする方法であって、
被験者から全血を採取するステップと、
1つ以上の基板上に、該全血の１つ以上のサンプルを載置するステップと、
該サンプルを異なるレベル又は強度の電磁放射にさらすステップと、
各サンプルにおける遺伝子損傷レベルを検出するステップと、
該損傷レベルを、所定値又は所定値パターンと比較するステップと、を含む方法。
前記サンプルを異なるレベルの電磁放射にさらすステップは、血液サンプルごとに電磁放射の強度を変更することによって行われる、請求項１に記載の方法。
放射源との間の距離を変更することによって、電磁放射のレベルを変更する、請求項２に記載の方法。
第一のサンプルは約1.20mW/cm²の光強度にさらされ、第二のサンプルは約0.80mW/cm²の光強度にさらされ、第三のサンプルは約0.50mW/cm²の光強度にさらされ、第四のサンプルは約0.20mW/cm²の光強度にさらされる、請求項１又は２に記載の方法。
前記複数のサンプルは、検査用に複数のサンプルに分けることができるという条件で、ある被験者から単一サンプルとして採取し得る、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
サンプルは、10分間から30分間、電磁放射にさらされる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
サンプルは、15分間、電磁放射にさらされる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
前記サンプルを異なるレベルの電磁放射にさらすステップは、発する電磁放射のレベルを変えることによって行われる、請求項１に記載の方法。
前記サンプルと電磁放射源との間に追加の障壁物質層を配置しない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
前記サンプルの上に追加の障壁物質層を直接配置しない、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記全血は、末梢全血を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
サンプルを異なるレベルの電磁放射にさらす前に、基板上に全血を載置するステップを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
前記全血は、0.5%の低融点アガロース（＜40℃）を含む封入媒体中に配置される、請求項１２に記載の方法。
前記電磁放射は、紫外線放射である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
皮膚がん、肺がん、乳がん、腸がん、前立腺がん、又は大腸がんの素因について被験者をスクリーニングするために使用される、請求項１〜１４のいずれか記載の方法。
がんでないこと、前がん細胞を有すること、又はがんであることについて、被験者をスクリーニングするために使用される方法であって、該がんは、皮膚がん、肺がん、乳がん、腸がん、前立腺がん、大腸がんを含むがこれに限定されるものではない、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
COPD、ぜんそく、気腫、又は大腸ポリポーシスの素因について被験者をスクリーニングするために使用される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
アッセイ製品であって、
全血サンプルを載置可能な基板と、
該全血サンプルが載置される基板の表面が電磁放射にさらされるように位置する電磁放射源と、を備え、
該サンプルがさらされる放射の強度が可変であることを特徴とする、アッセイ製品。
前記サンプルと前記電磁放射源との間の距離が可変である、請求項１８に記載のアッセイ製品。
前記サンプルの上に追加の障壁物質層が直接配置されていない、請求項１８又は１９に記載のアッセイ製品。
前記複数のサンプルの上に追加の障壁物質層が直接配置されていない、請求項１８又は１９に記載のアッセイ製品。
前記全血は、末梢全血を含む、請求項１８〜２１のいずれかに記載のアッセイ製品。
前記全血は、0.5%の低融点アガロース（＜40℃）を含む封入媒体中に配置される、請求項１８〜２２のいずれかに記載のアッセイ製品。
前記電磁放射は、紫外線放射である、請求項１８〜２３のいずれかに記載のアッセイ製品。