JP2015523858A - ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現する組換えアデノウィルス - Google Patents
ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現する組換えアデノウィルス Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015523858A JP2015523858A JP2015514906A JP2015514906A JP2015523858A JP 2015523858 A JP2015523858 A JP 2015523858A JP 2015514906 A JP2015514906 A JP 2015514906A JP 2015514906 A JP2015514906 A JP 2015514906A JP 2015523858 A JP2015523858 A JP 2015523858A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- porcine
- foot
- porcine interferon
- mouth disease
- interferon alpha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 36
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 title abstract description 31
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 title abstract description 15
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims abstract description 42
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 27
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 7
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102100034274 Diamine acetyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000703754 Homo sapiens CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000641077 Homo sapiens Diamine acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713305 Homo sapiens Sodium-coupled neutral amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000640813 Homo sapiens Sodium-coupled neutral amino acid transporter 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716973 Homo sapiens Thialysine N-epsilon-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100020926 Thialysine N-epsilon-acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、口蹄疫ウィルスの抑制効果を示す組換えウィルスに係り、さらに詳しくは、口蹄疫２Ａ遺伝子の挿入を通じてブタインターフェロンアルファ及びインターフェロンガンマを同時に発現させてブタインターフェロンアルファ及びガンマを一括処理して口蹄疫ウィルスに対する抑制効果を増強させることのできる組換えアデノウィルスに関する。【選択図】図１
Description
本発明は、口蹄疫ウィルスの抑制効果を示す組換えウィルスに係り、さらに詳しくは、口蹄疫２Ａ遺伝子の挿入を通じてブタインターフェロンアルファ及びインターフェロンガンマを同時に発現させてブタインターフェロンアルファ及びガンマを一括処理して口蹄疫ウィルスに対する抑制効果を増強させることのできる組換えアデノウィルスに関する。
口蹄疫（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ；ＦＭＤ）は、蹄が二つに分かれた動物に感染されるウィルス水疱性疾病であり、速い複製及び速い伝播力が特徴である。この疾病は、その経済的な重要性により、国際獣疫事務局（ＯＩＥ）によりリストＡ（Ｌｉｓｔ Ａ）疾病として分類されており、畜産物の国家間交易において非常に重要な要素として働いている。病原体は一本鎖の両極性ＲＮＡウィルスであり、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）及びアフトウイルス（Ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）属に属し、７つの異なる血清型（Ａ、Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３）に分類されている。
口蹄疫は、突発時に防御対策として用いられている緊急ワクチンを豚に接種した場合（緊急ワクチン接種）、平均７日後に口蹄疫ウィルス感染に対する防御能が形成される（Ｊ．Ｓ．Ｓａｌｔ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｖａｃｃｉｎｅ １６：７４６−７５４）。しかしながら、豚の場合、ワクチンによる抗体形成が遅く、排出するウィルス量が牛よりも遥かに多い。なお、豚は、感染後２４時間以内にウィルスを呼吸器に排出するため、ワクチンの接種後から防御能の形成前までウィルスの伝播の危険性は一層高くなる。
このため、これに対する対備策として、口蹄疫ウィルス抑制剤が提示されている。中でも、組換えアデノウィルスを伝達システムとして用いたインターフェロンアルファを含むタイプＩインターフェロンを適用して口蹄疫ウィルスを効果的に防御した研究結果が報告されて以来（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：５４９８−５５０３）、インターフェロンガンマを発現する組換えアデノウィルスをインターフェロンアルファ発現アデノウィルスと混用して向上した抑制効果を確認した（Ｍａｒａｅｓ ＭＰ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：７１２４−７１３５）。インターフェロンアルファは、最も広く知られている直接的なウィルス抑制物質であり、インターフェロンガンマは、補助Ｔ細胞（Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ）及びナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）においてサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の分泌を誘導する役割を果たしてウィルスに対する直間接的な抑制効果を示す。このようにインターフェロンアルファ及びガンマを併用することから様々な免疫誘導に有利であるメリットがあるにも関わらず、インターフェロンガンマの抗ウィルス効果がアルファよりも相対的に低いため単に混用する場合に抑制効率が下がるという欠点がある。
一方、口蹄疫ウィルス２Ａシーケンスは、口蹄疫ウィルス遺伝子内において自己開裂（ｓｅｌｆ ｃｌｅａｖａｇｅ）が起こる部分であり、遺伝子内に挿入した場合に遺伝子転写後に自己開裂を引き起こして２つのタンパク質の発現を可能にする。２Ａシーケンスは、同じ役割を果たす配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）シーケンスよりも遺伝子が小さいだけではなく、遺伝子が開裂されて２つのタンパク質となる効率が約９倍ほど高いという研究結果が報告されている（ＳＨ Ｈａ ｅｔ ａｌ， ２０１０， Ｐｌａｎｔ ｂｉｏｔｅｃｈ， ８：９２８−９３８）。
そこで、本発明者らは、現在、動物への適用に最適であり、抑制効果に対する可能性が高いインターフェロンを用いてより安価に且つ手軽にウィルスを動物においてより効果的に抑制することのできる抑制剤を開発して提示しようとしており、口蹄疫２Ａシーケンスを挿入することにより、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現すると、これらのインターフェロンを一括で処理する効果があり、より効率よく口蹄疫ウィルス抑制効果が得られるということを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現することのできる組換えウィルスを提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、ブタインターフェロンアルファ、口蹄疫ウィルス２Ａ及びブタインターフェロンガンマ遺伝子の順に配列された、配列番号２の塩基配列を含む組換えアデノウィルスまたはプラスミドを提供する。
本発明の組換えアデノウィルスは、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現することができて、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを一括で処理することができ、且つ、これらのそれぞれのインターフェロンを単独でまたは組み合わせて使用するときよりもさらに経済的であり、簡単に使用することができ、より効率的であり、しかも、高いレベルの口蹄疫ウィルス抑制効果を提供することができる。
本発明は、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマの遺伝子を一つの遺伝子に挿入し、口蹄疫２Ａシーケンスを前記インターフェロン遺伝子の間に挿入して２種類のインターフェロンが同時に発現されるように講じられた組換えウィルスを提供し、特に、ウィルスベクターとしてアデノウィルスベクターが使用可能である。
また、本発明は、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマの遺伝子を一つの遺伝子に挿入し、口蹄疫２Ａシーケンスを前記インターフェロン遺伝子の間に挿入して２種類のインターフェロンが同時に発現されるように講じられたタンパク質発現ベクターを提供し、特に、タンパク質発現ベクターとしてプラスミドが使用可能である。
本発明の組換えウィルスまたはプラスミドは、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現することから、インターフェロンを単独でまたは組み合わせて使用するときよりもさらに経済的であり、簡単に使用することができ、より効率的に口蹄疫ウィルスを抑制することができる。
また、本発明は、上記の組換えウィルスまたはプラスミドを含む口蹄疫ウィルス抑制剤を提供する。本発明の組換えウィルスは、同じ力価を適用するときに、インターフェロンアルファ及びガンマをそれぞれ別々に発現する組換えウィルスを利用する場合と比較して遥かに高い口蹄疫ウィルス抑制効果を示す。この理由から、本発明の組換えウィルスは、一つのウィルスで２種類の効果を出すことが可能であり、小さな力価で同じ効果を提供することができて、効能が増大された新規な口蹄疫抑制剤として利用することができる。また、インターフェロンアルファ及びガンマをそれぞれ別々に発現する組換えウィルスを用いる場合よりも半分の組換えウィルス力価を使用するので、２倍の経済的な費用節減性及び簡便性を図ることができ、しかも、高力価のウィルス接種により起こる副作用を低減することができる。さらに、インターフェロンの広範な抗ウィルス効果を考慮したとき、種々のウィルス疾病に適用可能であると予想される。
以下、本発明を下記の実施例を挙げてより具体的に説明する。これらの実施例は本発明の内容を理解するために提示されるものであり、本発明の権利範囲がこれらの実施例に限定されることはなく、当業界において通常的に知られている変形、置換及び挿入などを行うことができ、これに対するものも本発明の範囲に含まれる。
［実施例１］ 組換えアデノウィルスの製作
ＣＭＶプロモータの後ろにブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンアルファシーケンスを挿入し、両遺伝子の間に口蹄疫ウィルス２Ａ遺伝子を入れて同時に発現させ、これについては、図１に例示されている。
ＣＭＶプロモータの後ろにブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンアルファシーケンスを挿入し、両遺伝子の間に口蹄疫ウィルス２Ａ遺伝子を入れて同時に発現させ、これについては、図１に例示されている。
より具体的に、ブタインターフェロンアルファ遺伝子は、Ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａ １であり、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ｎｏ．ＮＭ＿２１４３９３の遺伝情報を採用し、ブタインターフェロンガンマ遺伝子はＧｅｎｅｂａｎｋ ｎｏ．ＡＹ２９３７３３の遺伝情報を採用した。なお、配列番号１に示す口蹄疫ウィルス２Ａシーケンス（ＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣ：配列番号１）を二つのブタインターフェロン遺伝子の間に配置して配列番号２に示す遺伝子を（株）Ｂｉｏｎｅｅｒにおいて合成した。このとき、合成遺伝子配列の５’末端にはＮｈｅＩ制限酵素部位を、３’末端にはＸｂａＩ制限酵素部位を入れてクローニング可能なようにし、インターフェロンアルファ部分の終止コドンは除去し、インターフェロンガンマの３’末端に終止コドンを配置した。なお、インターフェロン遺伝子部分の豚における効果的なタンパク質の発現のためにコドン出現頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）の評価を行った。
＜ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現するための遺伝子配列（両端にＮｈｅＩ、ＸｂａＩ制限酵素配列を含む；配列番号２）＞
ＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＣＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＣＴＡＡＡＧＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＡＡＣＧＧＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡ
ＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＣＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＣＴＡＡＡＧＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＡＡＣＧＧＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡ
組換えアデノウィルスの製作のために、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（クローンテック社製）にＮｈｅＩ、ＸｂａＩ制限酵素部分を介して遺伝子クローニングを行った後、遺伝子分析（シーケンシング）を通じて確認した。次いで、このクローニングされたｐＳｈｕｔｔｌｅベクタープラスミドを、非常に稀に存在するＰＩ−ＳｃｅＩ及びＩ−Ｃｅｕに対する制限酵素サイトをＰＩ−ＳｃｅＩ及びＩ−Ｃｅｕを用いて切断し、線形化された目的遺伝子断片をＡｄｅｎｏ−Ｘ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ（ＰＩ−ＳｃｅＩ及びＩ−Ｃｅｕ前処理）に結さつ（ライゲーション）した。次いで、制限酵素Ｓｗａ Ｉで処理して未挿入の自己連結（セルフライゲーション）や非組換えアデノウィルスＤＮＡを除去した。次いで、形質転換（トランスフォーメーション）及び遺伝子プレップを行った組み換えられたプラスミド（発現しようとする遺伝子がアデノウィルスＤＮＡと組み換えられる）を選択した。確認された遺伝子をＰａｃ Ｉ酵素で処理して線形化させた後、２９３ Ａ細胞に形質感染（トランスフェクション）させた。細胞において８０％以上の細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ；ＣＰＥ）が見られると、組換えアデノウィルスを収穫した。産生されたアデノウィルスは、Ｖｉｒａｂｉｎｄ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（セルバイオラブス社製）を用いてウィルスのみを精製した後、力価（ＴＣＩＤ50）を測定して保管した。
［実施例２］ ブタインターフェロンアルファまたはガンマの発現確認
組換えアデノウィルスにおけるブタインターフェロンアルファ及びガンマの発現有無を確認するためにウェスターンブロット方法を利用した。ウェスターンブロットを行う前日にＩＢＲＳ−２（豚腎臓細胞）を準備して７５ｃｍ2のフラスコに敷き、翌日に９０％の細胞断層が形成されれば、新たな培地に希釈した約１×１０8ＴＣＩＤのアデノウィルスをそれぞれ接種した。接種４８時間後に培地を回収してＡｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ（ミリポア社製）を用いて濃縮した後にウェスターンブロットに供した。タンパク質発現の比較のために、ブタインターフェロンアルファを発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α）、ブタインターフェロンガンマを発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γ）、ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-αγ）を一緒に実験した。ブタインターフェロンアルファの確認のために抗ＩＦＮアルファ単一クローン抗体Ｋ９（サーモサイエンティフィック社製）を５００倍に希釈して使用し、ブタインターフェロンガンマの確認のためには抗ブタＩＦＮ−ガンマ多重クローン抗体（サーモサイエンティフィック社製）を５００倍に希釈して使用した。ＥＣＬTMプライムウェスターンブロット検出試薬（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製）を用いて発色し、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてイメージを得、これを図２に示す。
組換えアデノウィルスにおけるブタインターフェロンアルファ及びガンマの発現有無を確認するためにウェスターンブロット方法を利用した。ウェスターンブロットを行う前日にＩＢＲＳ−２（豚腎臓細胞）を準備して７５ｃｍ2のフラスコに敷き、翌日に９０％の細胞断層が形成されれば、新たな培地に希釈した約１×１０8ＴＣＩＤのアデノウィルスをそれぞれ接種した。接種４８時間後に培地を回収してＡｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ（ミリポア社製）を用いて濃縮した後にウェスターンブロットに供した。タンパク質発現の比較のために、ブタインターフェロンアルファを発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α）、ブタインターフェロンガンマを発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γ）、ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-αγ）を一緒に実験した。ブタインターフェロンアルファの確認のために抗ＩＦＮアルファ単一クローン抗体Ｋ９（サーモサイエンティフィック社製）を５００倍に希釈して使用し、ブタインターフェロンガンマの確認のためには抗ブタＩＦＮ−ガンマ多重クローン抗体（サーモサイエンティフィック社製）を５００倍に希釈して使用した。ＥＣＬTMプライムウェスターンブロット検出試薬（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製）を用いて発色し、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてイメージを得、これを図２に示す。
［実施例３］ ＥＬＩＳＡを用いたブタインターフェロンアルファまたはガンマの定量及びタンパク質の確認
前記製造した組換えアデノウィルスにおいて発現されるブタインターフェロンアルファ及びガンマをＰｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法） Ｋｉｔ（ユーエスシーエヌライフサイエンス社製）及びＰｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）を用いて定量した。その結果を下記表１に示す。
前記製造した組換えアデノウィルスにおいて発現されるブタインターフェロンアルファ及びガンマをＰｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法） Ｋｉｔ（ユーエスシーエヌライフサイエンス社製）及びＰｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）を用いて定量した。その結果を下記表１に示す。
前記表１に示すように、１×１０4力価のＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγにおいてＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-αまたはＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γにおけるタンパク質量と同等なレベルでタンパク質が発現されることが確認され、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγにおいては意図の通りにインターフェロンアルファ及びガンマが両方とも発現されることが確認された。
［実施例４］ 組換えアデノウィルスの力価別の口蹄疫ウィルスの抑制度の評価（試験管内分析）
組換えアデノウィルスの力価別の口蹄疫ウィルスの抑制度を評価した。このために、ＩＢＲＳ−２（豚腎臓細胞）を準備して７５ｃｍ2のフラスコに敷き、翌日に９０％の細胞断層が形成されたときに、各力価別に１０倍に段階的に希釈して組換えアデノウィルスを接種した。翌日に上澄液を除去した後に６００ ＴＣＩＤ50の口蹄疫ウィルスを接種し、接種１時間後に培地を交換した。口蹄疫ウィルス接種４８時間後に上澄液を回収してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで口蹄疫ウィルスの複製数を測定した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、口蹄疫の３Ｄ部分を目的とするプライマーセンス５’−ＧＧＡＡＣＹＧＧＧＴＴＴＴＡＹＡＡＡＣＣＴＧＴＲＡＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス５’−ＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＡ−３’（配列番号４）と、プローブ５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＡＤＣＧＣＡＧＧＴＡＡＡＧＹＧＡＴＣＴＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号５）及びＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った（Ｓｕ−Ｍｉ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｈＲＮＡｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ Ｕ６ ａｎｄ ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ， ２０１０， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８７：３０７−３１７）。その結果を図３に示す。
組換えアデノウィルスの力価別の口蹄疫ウィルスの抑制度を評価した。このために、ＩＢＲＳ−２（豚腎臓細胞）を準備して７５ｃｍ2のフラスコに敷き、翌日に９０％の細胞断層が形成されたときに、各力価別に１０倍に段階的に希釈して組換えアデノウィルスを接種した。翌日に上澄液を除去した後に６００ ＴＣＩＤ50の口蹄疫ウィルスを接種し、接種１時間後に培地を交換した。口蹄疫ウィルス接種４８時間後に上澄液を回収してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで口蹄疫ウィルスの複製数を測定した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、口蹄疫の３Ｄ部分を目的とするプライマーセンス５’−ＧＧＡＡＣＹＧＧＧＴＴＴＴＡＹＡＡＡＣＣＴＧＴＲＡＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス５’−ＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＡ−３’（配列番号４）と、プローブ５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＡＤＣＧＣＡＧＧＴＡＡＡＧＹＧＡＴＣＴＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号５）及びＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った（Ｓｕ−Ｍｉ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｈＲＮＡｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ Ｕ６ ａｎｄ ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ， ２０１０， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８７：３０７−３１７）。その結果を図３に示す。
図３を参照すると、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγは、力価値とは無関係に、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γよりも優れた口蹄疫ウィルスの抑制効果を示し、１０００ＴＣＩＤ50以下ではＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-αよりも優れた口蹄疫ウィルスの抑制効果を示し、特に、１００ＴＣＩＤ50においては、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α及びＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γと比較して遥かに優れた口蹄疫ウィルスの抑制効果を示すということを確認することができる。
［実施例５］ 組換えアデノウィルスによる口蹄疫ウィルスの抑制効果の評価（生体内分析）
この実験のために、実験群当たりに１５匹または１４匹（Ａｄ−ｎｕｌｌ対照群）にして、合計５９匹のＩＣＲマウス６日齢個体を準備し、個体当たりに２×１０7 ＴＣＩＤ50のアデノウィルスを接種した。接種２４時間後に口蹄疫ウィルスを２５０ＬＤ50接種した後、７日間の生存率を観察し、その結果を図４に示す。
この実験のために、実験群当たりに１５匹または１４匹（Ａｄ−ｎｕｌｌ対照群）にして、合計５９匹のＩＣＲマウス６日齢個体を準備し、個体当たりに２×１０7 ＴＣＩＤ50のアデノウィルスを接種した。接種２４時間後に口蹄疫ウィルスを２５０ＬＤ50接種した後、７日間の生存率を観察し、その結果を図４に示す。
図４から明らかなように、観察したところ、初期である３日目からＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγを接種したマウス群（８０％生存率）の方が、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α（６０％生存率）またはＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γ（３３％生存率）の接種群よりも高い生存率を示し、接種７日目にはＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγが約４０％の生存率を示すのに対し、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α及びＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γの接種群は２０％代の生存率を示した。したがって、本発明の産生物であるＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγの接種時に、同じ力価のインターフェロンを別途に接種したときよりも向上した口蹄疫抗ウィルス効果を示すということがマウス実験においても証明された。
配列番号１：口蹄疫ウィルス２Ａシーケンス
配列番号２：ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現するための遺伝子配列（両端にＮｈｅＩ、ＸｂａＩ制限酵素配列を含む）
配列番号３：ＲＴ−ＰＣＲに用いるセンスプライマーの配列
配列番号４：ＲＴ−ＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーの配列
配列番号５：ＲＴ−ＰＣＲに用いるプローブの配列
配列番号２：ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現するための遺伝子配列（両端にＮｈｅＩ、ＸｂａＩ制限酵素配列を含む）
配列番号３：ＲＴ−ＰＣＲに用いるセンスプライマーの配列
配列番号４：ＲＴ−ＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーの配列
配列番号５：ＲＴ−ＰＣＲに用いるプローブの配列
Claims (6)
- ブタインターフェロンアルファ、口蹄疫ウィルス２Ａ及びブタインターフェロンガンマ遺伝子の順に配列された、配列番号２の塩基配列を含む組換えアデノウィルス。
- 前記ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマ遺伝子を同時に発現することを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウィルス。
- 前記組換えウィルスベクターは、アデノウィルスベクターであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組換えアデノウィルス。
- ブタインターフェロンアルファ、口蹄疫ウィルス２Ａ及びブタインターフェロンガンマ遺伝子の順に配列された、配列番号２の塩基配列を含むプラスミド。
- 前記ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマ遺伝子を同時に発現することを特徴とする請求項４に記載のプラスミド。
- 請求項１、請求項２、請求項４及び請求項５のいずれか一項に記載の組換えアデノウィルスまたはプラスミドを含む口蹄疫ウィルス抑制剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2012-0058410 | 2012-05-31 | ||
| KR20120058410A KR101329348B1 (ko) | 2012-05-31 | 2012-05-31 | 돼지 인터페론 알파-돼지 인터페론 감마를 동시 발현하는 재조합 아데노바이러스 |
| PCT/KR2013/004784 WO2013180501A1 (ko) | 2012-05-31 | 2013-05-31 | 돼지 인터페론 알파-돼지 인터페론 감마를 동시 발현하는 재조합 아데노바이러스 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015523858A true JP2015523858A (ja) | 2015-08-20 |
| JP2015523858A5 JP2015523858A5 (ja) | 2016-07-21 |
| JP6386448B2 JP6386448B2 (ja) | 2018-09-05 |
Family
ID=49673627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015514906A Active JP6386448B2 (ja) | 2012-05-31 | 2013-05-31 | ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現する組換えアデノウィルス |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2871240B1 (ja) |
| JP (1) | JP6386448B2 (ja) |
| KR (1) | KR101329348B1 (ja) |
| CN (1) | CN104583410B (ja) |
| ES (1) | ES2662948T3 (ja) |
| WO (1) | WO2013180501A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107286257A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-10-24 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种重组猪长效干扰素α及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 |
| KR102384683B1 (ko) * | 2020-05-07 | 2022-04-11 | 대한민국 | 구제역 바이러스 억제 활성을 갖는 신규한 돼지 인터페론-알파 융합 단백질 및 이의 용도 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002087336A1 (en) * | 2001-04-26 | 2002-11-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Foot and mouth disease virus vaccine |
| WO2007059461A2 (en) * | 2005-11-10 | 2007-05-24 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine |
| US20090269372A1 (en) * | 2008-04-24 | 2009-10-29 | Grubman Marvin J | Enhanced Antiviral Activity Against Foot and Mouth Disease |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7485291B2 (en) | 2003-06-03 | 2009-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Compositions and methods for generating multiple polypeptides from a single vector using a virus derived peptide cleavage site, and uses thereof |
| US7632509B2 (en) | 2005-07-19 | 2009-12-15 | Biosante Pharmaceuticals, Inc. | Methods to express recombinant proteins from lentiviral vectors |
-
2012
- 2012-05-31 KR KR20120058410A patent/KR101329348B1/ko active IP Right Grant
-
2013
- 2013-05-31 JP JP2015514906A patent/JP6386448B2/ja active Active
- 2013-05-31 ES ES13796479.7T patent/ES2662948T3/es active Active
- 2013-05-31 EP EP13796479.7A patent/EP2871240B1/en active Active
- 2013-05-31 WO PCT/KR2013/004784 patent/WO2013180501A1/ko active Application Filing
- 2013-05-31 CN CN201380029029.6A patent/CN104583410B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002087336A1 (en) * | 2001-04-26 | 2002-11-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Foot and mouth disease virus vaccine |
| WO2007059461A2 (en) * | 2005-11-10 | 2007-05-24 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine |
| US20090269372A1 (en) * | 2008-04-24 | 2009-10-29 | Grubman Marvin J | Enhanced Antiviral Activity Against Foot and Mouth Disease |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOLOGICALS, vol. vol. 38, issue. 5, JPN6017013668, September 2010 (2010-09-01), pages 586 - 593, ISSN: 0003540086 * |
| GENE THERAPY, 2001, VOL.8, P.864-873, JPN6017020098, ISSN: 0003721884 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2871240A1 (en) | 2015-05-13 |
| WO2013180501A1 (ko) | 2013-12-05 |
| KR101329348B1 (ko) | 2013-11-15 |
| JP6386448B2 (ja) | 2018-09-05 |
| CN104583410A (zh) | 2015-04-29 |
| EP2871240A4 (en) | 2016-01-27 |
| ES2662948T3 (es) | 2018-04-10 |
| CN104583410B (zh) | 2017-09-22 |
| EP2871240B1 (en) | 2017-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Adenovirus-mediated RNA interference against foot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in vivo | |
| Tafalla et al. | In vitro and in vivo differential expression of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) Mx isoforms in response to viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) G gene, poly I: C and VHSV | |
| JP2018520997A5 (ja) | ||
| Espín-Palazón et al. | TNFα impairs rhabdoviral clearance by inhibiting the host autophagic antiviral response | |
| JP2019506175A5 (ja) | ||
| JP2015057052A5 (ja) | ||
| JP2016537341A5 (ja) | ||
| JP2012509678A5 (ja) | ||
| WO2011072247A8 (en) | Pathogen restriction factors | |
| ES2375061T3 (es) | Virus de replicación competente capaces de silenciar la expresión de un factor de inhibición de virus. | |
| Zhou et al. | Protective immunity of a Pichia pastoris expressed recombinant iridovirus major capsid protein in the Chinese giant salamander, Andrias davidianus | |
| Steffensen et al. | Pre-existing vector immunity does not prevent replication deficient adenovirus from inducing efficient CD8 T-cell memory and recall responses | |
| Caipang et al. | Induction of antiviral state in fish cells by Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, interferon regulatory factor-1 | |
| Ahanger et al. | Protection of shrimp Penaeus monodon from WSSV infection using antisense constructs | |
| JP2022180463A (ja) | 新規免疫化剤および使用方法 | |
| JP6386448B2 (ja) | ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現する組換えアデノウィルス | |
| US20130058971A1 (en) | Innoculation of recombinant viral vectors for rapid pre-exposure prevention and post-exposure protection against alphavirus-induced encephalitides | |
| Khimmakthong et al. | Stimulating the immune response of Litopenaeus vannamei using the phagocytosis activating protein (PAP) gene | |
| Chang et al. | Role of Penaeus monodon Kruppel-like factor (PmKLF) in infection by white spot syndrome virus | |
| Guimet et al. | Adenovirus replication | |
| Zenke et al. | Development of siRNA expression vector utilizing rock bream β-actin promoter: a potential therapeutic tool against viral infection in fish | |
| Rojas et al. | Adenovirus as tools in animal health | |
| Kim et al. | Generation of recombinant viral hemorrhagic septicemia viruses (VHSVs) harboring G gene of hirame rhabdovirus (HIRRV) and their ability to induce serum neutralization activity in olive flounder (Paralichthys olivaceus) | |
| Rojas et al. | Chapter Adenovirus as Tools in Animal Health | |
| JP6179903B2 (ja) | 海産魚の類結節症に対するｄｎａワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160524 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160530 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170418 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170718 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170919 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180123 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180326 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180717 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180809 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6386448 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |