JP2015519923A5

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Publication number: JP2015519923A5
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Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2016-07-28

Description

ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮによる遺伝子改変の図である。It is a figure of the gene modification by TALEN and TALEN. 複数のＤＮＡ遺伝子座で作用するＴＡＬＥＮの図である。FIG. 2 is a diagram of TALENs acting at multiple DNA loci. ウシ胚におけるＴＡＬＥＮ活性を示す図である。図（ａ）に実験の概要を示す。ＴＡＬＥＮを、ＦｏｋＩヌクレアーゼホモ２量体の単量体が２量体を形成し、２つの単量体の間のＤＮＡを切断できるように、ＤＮＡ標的の対向する鎖に合わせて設計する。１日目（Ｄ１）に、インビトロで作製されたウシ接合体にＴＡＬＥＮｍＲＮＡをインジェクトし、胚盤胞が形成されるまでインビトロで培養する。８日目に各胚盤胞（ｂｌａｓｔ：胚盤胞）を集め、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に供し、ＰＣＲ増幅およびＣｅｌ−Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）処理によりインデルについて解析する。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ＡＣＡＮ１２ＴＡＬＥＮにより媒介されたウシ胚のインデルを解析した図である。単位複製配列の長さ、およびインデルを示唆する、予想されるＳＵＲＶＥＹＯＲ切断産物を上に示す。図ｃ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ｐ６５ＴＡＬＥＮにより媒介されたブタ接合体のインデルを解析した図である。It is a figure which shows TALEN activity in a bovine embryo. The outline of the experiment is shown in FIG. TALEN is designed for the opposite strand of the DNA target so that the monomer of the FokI nuclease homodimer can form a dimer and cleave the DNA between the two monomers. On day 1 (D1), TALEN mRNA is injected into bovine zygotes generated in vitro and cultured in vitro until blastocysts are formed. On day 8, each blastocyst (blast) is collected, subjected to whole genome amplification (WGA), and analyzed for indel by PCR amplification and Cel-I (SURVEYOR nuclease, Transgenics) treatment. FIG. B) Analysis of bovine embryo indels mediated by SURVEYOR nuclease and mediated by ACAN12 TALEN. The length of the amplicon and the expected SURVEYOR cleavage product suggesting indels are shown above. FIG. C) Analysis of indel of porcine zygote mediated by SURVEYOR nuclease and mediated by p65 TALEN. ＡＣＡＮ１２ＴＡＬＥＮで処理したウシ胚から配列決定された欠失および挿入を示す図である。ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示した野生型配列を示す。欠失および挿入の両方の現象が同定された。 FIG. 5 shows deletions and insertions sequenced from bovine embryos treated with ACAN12 TALEN. The wild-type sequence with the TALEN binding site underlined is shown. Both deletion and insertion phenomena have been identified . 家畜線維芽細胞において遺伝子編集するためのＴＡＬＥＮスキャフォールドを比較する図である。図ａ）この実験で試験したＴＡＬＥＮスキャフォールドの図である。各スキャフォールド（＋２３１、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅｔ．ａｌ．２０１０，およびＣａｒｌｓｏｎ＋６３、（Ｍｉｌｌｅｒｅｔ．ａｌ．２０１１に比較して））は、ＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）を含有し、ＦｏｋＩホモ２量体ドメインがＣ末端に融合している。番号はＤＮＡ結合ドメインに対するものである。第１の反復可変２残基反復（ＲＶＤ）の前のアミノ酸を「−１」と標記し、最後のＲＶＤ反復の後のアミノ酸を「＋１」と標記する。図ｂ）ＤＭＤＥ７．１ＴＡＬＥＮペアまたはＡＣＡＮ１２ＴＡＬＥＮペアのいずれかをトランスフェクトした線維芽細胞について、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行った。スキャフォールドおよび処理温度をゲルの上に示し、ＮＨＥＪの割合を下に示す。略語ＮＴ＝無処理。図ｃ）＋２３１またはＣａｒｌｓｏｎ＋６３スキャフォールドのいずれかを有する４つのさらなるＴＡＬＥＮペアの活性を示す図である。FIG. 6 compares TALEN scaffolds for gene editing in livestock fibroblasts. FIG. A) Diagram of TALEN scaffolds tested in this experiment. Each scaffold (+231, Christian et. Al. 2010, and Carlson +63, (compared to Miller et. Al. 2011)) contains the SV40 nuclear translocation signal (NLS), and the FokI homodimer domain is Fused to the C-terminus. Numbers are for DNA binding domains. The amino acid before the first repeat variable two residue repeat (RVD) is labeled “−1” and the amino acid after the last RVD repeat is labeled “+1”. FIG. B) SURVEYOR assay was performed on fibroblasts transfected with either DMDE7.1 TALEN pair or ACAN12 TALEN pair. The scaffold and processing temperature are shown above the gel and the percentage of NHEJ is shown below. Abbreviation NT = no treatment. FIG. C) Activity of four additional TALEN pairs with either +231 or Carlson +63 scaffolds. ＡＣＡＮ１２ＴＡＬＥＮで処理した細胞から配列決定された欠失および挿入を示す図である。野生型ＡＣＡＮ１２配列をイタリック体で示し、ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（相補）ＴＡＬＥＮ認識配列を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを灰色でハイライトし、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。FIG. 5 shows deletions and insertions sequenced from cells treated with ACAN12 TALEN. The wild type ACAN12 sequence is shown in italics and the left and right (complementary) TALEN recognition sequences are underlined. Inserted nucleotides are highlighted in gray and mismatched nucleotides are displayed in lower case. インデル濃縮のためのトランスポゾン共選択を示す図である。実験スケジュールを図（ａ）に示す。０日目（Ｄ０）に、各ＴＡＬＥＮの発現カセット、選択マーカーをコードするトランスポゾン、およびトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。ＴＡＬＥＮのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である（４倍過剰量）。トランスフェクト細胞を分割前に３０℃または３７℃で３日間培養し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのためのサンプルを採取し、拡大培養してトランスポゾン組み込みを＋／−選択するために再播種する。３日目以降、全細胞を３７℃で培養する。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのために１４日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、単一細胞核移植のために凍結保存する。図ｂ）カチオン性脂質を使用して線維芽細胞にトランスフェクトした。３日目では活性が観察されなかったため（低トランスフェクション効率のため）、１４日目以降の集団のデータのみを示す。処理温度、選択、およびＴＡＬＥＮｉｄ（図（ｃ）に示したＡ〜Ｃの文字により識別）をゲルの上に示す。図ｃ）線維芽細胞にヌクレオフェクションによりトランスフェクトし、３日目、および１４日目以降の非選択（ＮＳ）および選択（Ｓ）集団におけるＮＨＥＪの割合を測定した。処理温度を各マトリックスの上に示す。略語：ｎｄ＝検出されず；ｗｔ＝野生型単位複製配列、ＳＵＲＶＥＹＯＲ処理済み。FIG. 5 shows transposon co-selection for indel enrichment. The experimental schedule is shown in FIG. On day 0 (D0), cells are transfected with a mixture of plasmids containing each TALEN expression cassette, a transposon encoding a selectable marker, and a transposase expression cassette. The TALEN plasmid is the major component of each transfection (4-fold excess). Transfected cells are cultured for 3 days at 30 ° C. or 37 ° C. prior to splitting, samples for SURVEYOR assay are taken, expanded and reseeded for +/− selection for transposon integration. After day 3, all cells are cultured at 37 ° C. Cells cultured for 14 days or more for the SURVEYOR assay are collected and stored frozen for downstream use, ie, single cell nuclear transfer. FIG. B) Fibroblasts were transfected using cationic lipids. Since no activity was observed on day 3 (due to low transfection efficiency), only data for the population after day 14 are shown. The processing temperature, selection, and TALEN id (identified by the letters AC shown in Figure (c)) are shown on the gel. FIG. C) Fibroblasts were transfected by nucleofection and the percentage of NHEJ in the non-selected (NS) and selected (S) populations on day 3 and day 14 and later was measured. The processing temperature is indicated above each matrix. Abbreviations: nd = not detected; wt = wild type amplicon, SURVEYOR treated. インデルを同定するための直接ＰＣＲシーケンシングの図である。各線維芽細胞コロニー由来のＰＣＲ単位複製配列を精製し、配列決定し、野生型配列と比較した。１つのアレルの突然変異、または両方のアレルの非重複突然変異が起こると、ＴＡＬＥＮ認識部位近傍が２重の配列になる（上部）。突然変異部位の両側にある２重のピークにより各アレル間の相違が同定できる場合、重複両アレル突然変異を同定することができる。ホモ接合型突然変異を有するコロニーは、インデル部位近傍に２重ピークを示さない。FIG. 5 is a diagram of direct PCR sequencing to identify indels. PCR amplicons from each fibroblast colony were purified, sequenced and compared to the wild type sequence. When a mutation in one allele or a non-overlapping mutation in both alleles occurs, the vicinity of the TALEN recognition site becomes a double sequence (top). Duplicate both allelic mutations can be identified if the difference between each allele can be identified by double peaks on either side of the mutation site. Colonies with homozygous mutations do not show a double peak near the indel site. 野生型クローンおよび図８Ａに示したようなホモ接合型インデルを有する両アレルクローンの配列比較を示す図である。It is a figure which shows the arrangement | sequence comparison of both allele clones which have a homozygous indel as shown to a wild type clone and FIG. 8A. ＤＭＤの両アレル性改変アレルを示す図である。ホモ接合型改変アレル（すなわち、両方のアレルが同じ突然変異を包含する）または各アレルに異なる突然変異を有する両アレル突然変異を有するコロニーを示す。２つのインデルを有するコロニーでは、各アレルの配列決定の回数を右側に示す。一部の場合では、第３の突然変異または単一の野生型アレルが配列決定され、すべてのコロニーが１００％クローンであるとは限らないことが示された。フレームシフトアレルを示し、またミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。It is a figure which shows the allelic modification allele of DMD. Denote colonies with homozygous modified alleles (ie, both alleles contain the same mutation) or both allelic mutations with different mutations in each allele. For colonies with two indels, the number of sequencing of each allele is shown on the right. In some cases, a third mutation or a single wild type allele was sequenced, indicating that not all colonies were 100% clones. The frameshift allele is shown and mismatched nucleotides are shown in lower case. ＬＤＬＲの両アレル性改変アレルを示す図であり、図９Ａと同様の表記法を用いる。It is a figure which shows the biallelic modification allele of LDLR, and uses the notation similar to FIG. 9A. ＴＡＬＥＮにより誘導された欠失および逆位を示す図である。ＤＭＤ遺伝子座の模式図を図（ａ）に示す。ＤＮＡの配向を黒い山形模様で示す。雄ブタ線維芽細胞にコトランスフェクトされた、エクソン６および７（黒の矢頭）を標的とするＴＡＬＥＮにより、エクソン６とエクソン７との間でＮＨＥＪによる融合現象が起こり得る。これは、プライマー（黒い矢印）を用いて約５００ｂｐの単位複製配列を得ることにより確認することができる。図ｂ）エクソン６および７を標的とするＴＡＬＥＮを同時にトランスフェクトした細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、両部位でのＮＨＥＪによるインデルが明らかにされる。ＮＨＥＪの割合を下に示す。図ｃ）エクソン６ＴＡＬＥＮおよびエクソン７ＴＡＬＥＮを同時に導入すると、推定される欠失部位を挟むプライマーを用いたＰＣＲにより、約５００塩基対の産物が得られるのに対し、単独でトランスフェクトすると、得られない。図ｄ）ＴＡＬＥＮ標的部位間の配列の逆位現象の予想される結果を示す。ＤＮＡの配向を黒い山形模様で示す。逆位遺伝子座の５’および３’末端の推定されるフランキング部位の外側のプライマー（黒い矢印）を、予想される産物の大きさと共に示す。エクソン６ＴＡＬＥＮおよびエクソン７ＴＡＬＥＮの両方を同時に導入したときのみ、５’および３’接合部の両方でＰＣＲ産物が観察された。FIG. 6 shows deletions and inversions induced by TALEN. A schematic diagram of the DMD locus is shown in FIG. The orientation of DNA is indicated by a black chevron pattern. With TALEN targeting exons 6 and 7 (black arrowheads) co-transfected into bovine fibroblasts, a fusion phenomenon by NHEJ can occur between exon 6 and exon 7. This can be confirmed by obtaining an amplicon of about 500 bp using a primer (black arrow). FIG. B) SURVEYOR assay of cells co-transfected with TALEN targeting exons 6 and 7 reveals NHDEL indels at both sites. The ratio of NHEJ is shown below. Figure c) Simultaneous introduction of exon 6 TALEN and exon 7 TALEN yields a product of approximately 500 base pairs by PCR with primers flanking the predicted deletion site, whereas when transfected alone, I can't. FIG. D) shows the expected result of sequence inversion between TALEN target sites. The orientation of DNA is indicated by a black chevron pattern. Primers outside the putative flanking sites at the 5 'and 3' ends of the inversion locus (black arrows) are shown along with the expected product size. PCR products were observed at both the 5 'and 3' junctions only when both exon 6 TALEN and exon 7 TALEN were introduced simultaneously. ＤＭＤの欠失配列を示す図である。複製トランスフェクションで得られたＤＭＤ欠失接合部を示す。上方のエクソン６および７配列に陰影を付け、ＴＡＬＥＮ認識部位に下線を付す。挿入されたヌクレオチドに陰影を付す。It is a figure which shows the deletion sequence of DMD. The DMD deletion junction obtained by replication transfection is shown. The upper exon 6 and 7 sequences are shaded and the TALEN recognition site is underlined. The inserted nucleotide is shaded. ＤＭＤの逆位配列を示す図である。ＤＭＤの逆位アレルの模式図を、シーケンシングにより解析した５’および３’接合部（枠で囲む）と共に示す。下方に、各融合の予想される配列を示し、対応する融合は、ＴＡＬＥＮペアの各スペーサーの中央にある。ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。トランスフェクトされた集団に由来する、配列決定された逆位アレルを示す。各アレルの配列決定の回数を右側に示し、挿入されたヌクレオチドを下線で示す。ミスマッチヌクレオチドを小文字で示す。It is a figure which shows the inversion arrangement | sequence of DMD. A schematic of the DMD inversion allele is shown with 5 'and 3' junctions (enclosed in a frame) analyzed by sequencing. Below, the expected sequence of each fusion is shown, and the corresponding fusion is in the middle of each spacer of the TALEN pair. The TALEN recognition site is underlined. The sequenced inverted allele from the transfected population is shown. The number of sequencing of each allele is shown on the right and the inserted nucleotides are underlined. Mismatch nucleotides are shown in lower case. ウシ線維芽細胞におけるＨＤＲの誘導を示す図である。図ａ）二本鎖切断誘導性相同組換えにより、ウシＧＤＦ８のエクソン３に１１塩基対の欠失（ＢｅｌｇｉｕｍＢｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）およびｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型ではｌｅｆｔＴＡＬＥＮの結合部位の半分が欠損しているため、ＴＡＬＥＮ切断に対して抵抗性を示すはずである。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃および３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１ＴＡＬＥＮの活性が実証される。このアッセイで使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂおよびｂ’を使用して生成させた（図ａに示す）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型は、ｂｔＧＤＦ８３．１活性の評価を混乱させると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。図ｃ）アレル特異的ＰＣＲにより、ＨＤＲの誘導は、ＴＡＬＥＮとＢＢ−ＨＤＲ鋳型とのコトランスフェクションに依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１塩基対の欠失にまたがり、野生型アレル（ｗｔ）を増幅することができない。陽性対照「Ｃ」を含む各ＰＣＲ反応に５００細胞相当量を加えた。ＨＤＲ率は、実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーにより判定した。It is a figure which shows the induction | guidance | derivation of HDR in a bovine fibroblast. Figure a) TALEN (btGDF83.1, arrow) and dsDNA template (d) to introduce an 11 base pair deletion (Belgium Blue mutation) into exon 3 of bovine GDF8 by double-strand break inducible homologous recombination. BB-HDR) was designed. The BB-HDR template should be resistant to TALEN cleavage because half of the binding site for left TALEN is missing. FIG. B) SURVEYOR assay demonstrates the activity of btGDF83.1 TALEN at both 37 ° C. and 30 ° C. The PCR product used in this assay was generated using primers b and b '(shown in Figure a). The BB-HDR template was not included in these replicates because it appears to disrupt the assessment of btGDF83.1 activity. FIG. C) Allele-specific PCR demonstrates that the induction of HDR is dependent on co-transfection of TALEN and BB-HDR template. A PCR assay was developed to specifically detect HDR modified GDF8 alleles using primers c and c '(shown in Figure a). The 3 'end of primer c' spans an 11 base pair deletion and cannot amplify the wild type allele (wt). An equivalent amount of 500 cells was added to each PCR reaction including the positive control “C”. The HDR rate was determined by comparative densitometry between experimental and control reactions. シーケンシングによる、ＢｅｌｇｉａｎＢｌｕｅ遺伝子移入の確認を示す図である。Ｗａｇｙｕ野生型ＧＤＦ８およびＢｅｌｇｉａｎＢｌｕｅ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）の模式図を示す。５つのＰＣＲ陽性コロニーについて、ホモロジーアームの外側に位置するプライマー（ｃおよびｄ）を使用してＰＣＲを行った後、プライマーｂ’を用いてクローニングおよびシーケンシングを行った。野生型配列との比較から、５つのコロニーのうち４つのコロニーでＢｅｌｇｉａｎＢｌｕｅアレル（ヘテロ接合型）に特徴的な予想された１１塩基対の欠失が明らかにされる。It is a figure which shows the confirmation of Belgian Blue gene transfer by sequencing. Schematic representation of Wagyu wild type GDF8 and Belgian Blue template (BB-HDR) is shown. Five PCR-positive colonies were subjected to PCR using primers (c and d) located outside the homology arm, and then cloned and sequenced using primer b '. Comparison with the wild-type sequence reveals the predicted 11 base pair deletion characteristic of the Belgian Blue allele (heterozygous) in 4 out of 5 colonies. ＴＡＬＥＮを介したＨＤＲの模式図およびゲルを示す図である。ブタ低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む。It is a figure which shows the schematic diagram and gel of HDR through TALEN. A TALEN pair (LDLR2.1) targeting the fourth exon of the porcine low density lipoprotein receptor (LDLR) gene was cotransfected with the supercoiled plasmid Ldlr-E4N-stop. Ldlr-E4N-stop contains a homology arm corresponding to the porcine LDLR gene and a gene trap that allows expression of neomycin phosphotransferase during HDR. 図５のＣａｒｌｓｏｎ＋６３スキャフォールドに関する詳細な配列情報およびＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより使用される別のスキャフォールドとの比較を示す図である。FIG. 6 shows detailed sequence information for the Carlson +63 scaffold of FIG. 5 and a comparison with another scaffold used by Sangamo Biosciences. 非翻訳部分を含む、図５のＣａｒｌｓｏｎ＋６３スキャフォールドを作製するために使用したベクターに関する詳細な核酸配列を示す図である。FIG. 6 shows the detailed nucleic acid sequence for the vector used to make the Carlson +63 scaffold of FIG. 5, including untranslated portions. ウシＧＤＦ８遺伝子座での相同組換えのためのＡＡＶ送達一本鎖ＤＮＡ鋳型の使用について示す図である。ａ）相同組換えにより、ウシＧＤＦ８遺伝子のエクソン３に１１ｂｐの欠失（ＢｅｌｇｉｕｍＢｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、青の矢印）およびｒＡＡＶ相同組換え鋳型（ＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ｂ）アレル特異的ＰＣＲから、ＨＲ誘導がトランスフェクションｂｔＧＤＦ８３．１ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲ鋳型を含有する欠陥ＡＡＶによる感染に依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐの欠失にまたがり、野生型アレル「ＷＴ」を増幅することができない。１，０００細胞相当量を各ＰＣＲ反応に含み、表示コピー数の対照鋳型による陽性対照反応を、相同組換えの比較定量に使用した。FIG. 5 shows the use of AAV delivery single stranded DNA template for homologous recombination at the bovine GDF8 locus. a) TALEN (btGDF83.1, blue arrow) and rAAV homologous recombination template (AAV-BB) so as to introduce an 11 bp deletion (Belgium Blue mutation) into exon 3 of the bovine GDF8 gene by homologous recombination. -HDR) was designed. b) Allele-specific PCR demonstrates that HR induction is dependent on infection with defective AAV containing the transfected btGDF83.1 TALEN and AAV-BB-HDR templates. A PCR assay was developed to specifically detect HDR modified GDF8 alleles using primers c and c '(shown in Figure a). The 3 'end of primer c' spans an 11 bp deletion and cannot amplify the wild type allele "WT". A 1,000 cell equivalent was included in each PCR reaction and a positive control reaction with the indicated copy number of the control template was used for comparative quantification of homologous recombination. ウシＧＤＦ８遺伝子座での相同組換えのための鋳型としての一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯｌｉｇｏ）の使用について示す図である。相同組換えにより、ウシＧＤＦ８遺伝子のエクソン３に１１ｂｐの欠失（ＢｅｌｇｉｕｍＢｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）および２つのｓｓＯＤＮを設計した。各ｓｓＯＤＮは、長さが７６塩基対であり、同じ標的部位のセンス鎖およびアンチセンス鎖であった。アレル特異的ＰＣＲから、ＨＤＲ誘導がトランスフェクションｂｔＧＤＦ８３．１ＴＡＬＥＮ、およびその２４時間後のリポフェクタミンＬＴＸを使用するｓｓＯＤＮのトランスフェクションに依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐの欠失にまたがり、野生型アレル「ＷＴ」を増幅することができない。１，０００細胞相当量を各ＰＣＲ反応に含み、表示コピー数の対照鋳型による陽性対照反応を、相同組換えの比較定量に使用した。ＢＢ−ＨＤＲセンス（Ｓ）は配列番号１３３を有し、ＢＢ−ＨＤＲアンチ（ＡＳ）は配列番号１３４を有する。FIG. 3 shows the use of a single stranded oligonucleotide (ssOligo) as a template for homologous recombination at the bovine GDF8 locus. TALEN (btGDF83.1, arrow) and two ssODNs were designed to introduce an 11 bp deletion (Belgium Blue mutation) into exon 3 of the bovine GDF8 gene by homologous recombination. Each ssODN was 76 base pairs in length and was the sense strand and antisense strand of the same target site. Allele-specific PCR demonstrates that HDR induction is dependent on transfection of ssODN using transfection btGDF83.1 TALEN and Lipofectamine LTX 24 hours later. A PCR assay was developed to specifically detect HDR modified GDF8 alleles using primers c and c '(shown in Figure a). The 3 'end of primer c' spans an 11 bp deletion and cannot amplify the wild type allele "WT". A 1,000 cell equivalent was included in each PCR reaction and a positive control reaction with the indicated copy number of the control template was used for comparative quantification of homologous recombination. BB-HDR Sense (S) has SEQ ID NO: 133 and BB-HDR Anti (AS) has SEQ ID NO: 134. 家畜細胞にＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトすると、効率的な標的切断が生じることを示す図である。図ａ：表示量のｍＲＮＡをブタ線維芽細胞にトランスフェクトし、３０℃または３７℃のいずれかで３日間、トランスフェクト細胞を培養した後、インデル解析を行った。図ｂ：ＮＨＥＪの割合を決定した。ＤＭＤ７．１ＴＡＬＥＮをコードする４マイクログラムのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションによる平均のＮＨＥＪの割合を、３０℃または３７℃で培養した細胞について点線で示した。FIG. 4 shows that efficient target cleavage occurs when live cells are transfected with mRNA encoding TALEN. Figure a: Porcine fibroblasts were transfected with the indicated amount of mRNA, and the transfected cells were cultured at either 30 ° C or 37 ° C for 3 days before indel analysis. Figure b: NHEJ ratio determined. Average NHEJ fractions from transfection of 4 micrograms of plasmid DNA encoding DMD7.1 TALEN are shown as dotted lines for cells cultured at 30 ° C or 37 ° C. ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮのトランスフェクションは、ｓｓＯＤＮＨＤＲを増強することを示す図である。ｂｔＧＤＦ８３．１ＴＡＬＥＮｍＲＮＡおよびＢＢ−ＨＤＲセンスｓｓＯＤＮ（配列番号１３３）を、指定の機序によりＷａｇｙｕ細胞に導入し、上記のＰＣＲアッセイによりＨＤＲを測定した。ＴＡＬＥＮｍＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの両方がヌクレオフェクションにより同時に送達された細胞集団から、コロニーを単離した。FIG. 3 shows that transfection of TALEN encoded by mRNA enhances ssODN HDR. btGDF83.1 TALEN mRNA and BB-HDR sense ssODN (SEQ ID NO: 133) were introduced into Wagyu cells by the specified mechanism, and HDR was measured by the PCR assay described above. Colonies were isolated from cell populations in which both TALEN mRNA and ssODN were delivered simultaneously by nucleofection. ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用する、種内天然アレルの移入を示す図である。ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅミオスタチンアレルＣ３１３Ｙを、図２１の方法によりＷａｙｇｕ線維芽細胞に移入した。「ｏｌｉｇｏ」と標記した配列は、配列番号１３５を有する。FIG. 5 shows the transfer of an intraspecific natural allele using TALEN and ssODN encoded by mRNA. Piedmontese myostatin allele C313Y was transferred to Waygu fibroblasts by the method of FIG. The sequence labeled “oligo” has SEQ ID NO: 135. 図２２のプロセスを、異なる温度（３７℃）で繰り返した。The process of FIG. 22 was repeated at a different temperature (37 ° C.). ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用して、ある種に由来する天然アレルを他の種に移入することを示す図である。ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅミオスタチンアレルＣ３１３Ｙを、図２５の方法によりＯｓｓａｂａｗ線維芽細胞に移入した。次のｓｓＯＤＮを使用した：ｇｇｃｃａａｔｔａｃｔｇｃｔｃｔｇｇａｇａｇｔａｔｇａａｔｔｃｇｔａｔｔｔｔｔａｃａａａａａｔａｃｃｃｔｃａｃａｃｔｃａｔｃｔｔｇ（配列番号１４６）。FIG. 3 shows the transfer of a natural allele from one species to another using TALEN and ssODN encoded in mRNA. Piedmontese myostatin allele C313Y was transferred to Ossabaw fibroblasts by the method of FIG. The following ssODN was used: gggcaattactgctctgggagagtatgaattcgttttttacaaaaaaaccccactactctttg (SEQ ID NO: 146). ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用して、特定のフレームシフトアレルをブタＬＤＬＲに導入することを示す図である。ブタＬＤＬＲ遺伝子のエクソン２に４塩基対の挿入を導入するために、９０ｂｐのｏｌｉｇｏを作製した。この挿入により、新規ＢａｍＨ１部位が生成し、フレームシフトアレルが誘発されることが予想される。ｓｓＬＤＬＲ２．１ＴＡＬＥＮｍＲＮＡ（マイクログラム単位の表示用量で）および０．３ｎＭｏｌのｓｓＯＤＮのコトランスフェクションの後、細胞を３０℃で３日間培養し、次いで３７℃でさらに１日培養した。４および２０日目に、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによりＮＨＥＪを測定した。ブタＬＤＬＲのエクソン２を含むＰＣＲ産物のＢａｍＨ１消化、ならびにデンシトメトリーによる、制限フラグメント（ＨＤＲを示す）の定量および野生型産物（上段産物、ＨＤＲなし）との比較により、ＨＤＲの割合を決定した。各処理からのコロニーを単離し、ＰＣＲおよびＢａｍＨ１消化により解析した。「Ｗｔ」と標記した配列は配列番号１３６を有し、「センス」と標記した配列は配列番号１３７を有する。FIG. 3 shows the introduction of specific frameshift alleles into porcine LDLR using TALEN and ssODN encoded in mRNA. In order to introduce a 4 base pair insertion into exon 2 of the porcine LDLR gene, a 90 bp oligo was made. This insertion is expected to generate a new BamH1 site and induce a frameshift allele. After cotransfection of ssLDLR2.1 TALEN mRNA (at the indicated dose in micrograms) and 0.3 nMol of ssODN, the cells were cultured at 30 ° C. for 3 days and then at 37 ° C. for an additional day. NHEJ was measured by SURVEYOR assay on days 4 and 20. The percentage of HDR was determined by BamH1 digestion of the PCR product containing exon 2 of porcine LDLR and quantification of the restriction fragment (indicating HDR) and comparison with the wild-type product (upper product, no HDR) by densitometry. . Colonies from each treatment were isolated and analyzed by PCR and BamH1 digestion. The sequence labeled “Wt” has SEQ ID NO: 136 and the sequence labeled “sense” has SEQ ID NO: 137. ＤＮＡおよびｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮが、幹細胞で活性であることを示す図である。上段の図は、ブタ雄性生殖細胞系幹細胞（ＧＳＣ）にプラスミドＤＮＡとしてトランスフェクトしたＤＭＤ７．１ＴＡＬＥＮのＮＨＥＪの割合を示す。ヌクレオフェクション溶液Ｌ、Ｖ、またはＢを評価した。下段の図は、ＤＭＤ７．１ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたブタＧＳＣのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。ｍＲＮＡの量（マイクログラム）を示す。It is a figure which shows that TALEN encoded by DNA and mRNA is active in stem cells. The upper figure shows the ratio of DMEJ7.1 TALEN NHEJ transfected as porcine male germline stem cells (GSC) as plasmid DNA. Nucleofection solution L, V, or B was evaluated. The lower panel shows the results of a SURVEYOR assay of porcine GSC transfected with mRNA encoding DMD7.1 TALEN. The amount of mRNA (microgram) is shown. ＴＡＬＥＮは、ニワトリ細胞においてＤＳＢを媒介し、ニワトリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）における相同組換えを促進することができる。図ａ）ＴＡＬＥＮ活性は、ＤＦ１不死化ニワトリ細胞株トランスフェクションおよびＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイで最初に測定した。図ｂ）ニワトリｄｄｘ４遺伝子座のターゲティング戦略の模式図である。ＧＦＰ／ピューロマイシンレポーター遺伝子を、標的化細胞の第２エクソンにおける内因性コード配列と置き換える。図ｃ）相同組換えコンストラクト、ＴＡＬＥＮ（Ｔａｌ１．１またはＴａｌ７．１のいずれか、空ベクター）、およびピューロマイシン選択トランスポゾンで、ＰＧＣにトランスフェクトした。ピューロマイシンで選択した後、Ｔａｌ７．１トランスフェクションでも空ベクタートランスフェクションでもなく、Ｔａｌ１．１ＴＡＬＥＮを使用した場合（右写真、左は明視野である）に、ＧＦＰ＋細胞を単離することができた。TALEN can mediate DSB in chicken cells and promote homologous recombination in chicken primordial germ cells (PGC). Figure a) TALEN activity was first measured in DF1 immortalized chicken cell line transfection and SURVEYOR assay. FIG. B) Schematic of targeting strategy for chicken ddx4 locus. The GFP / puromycin reporter gene is replaced with the endogenous coding sequence in the second exon of the targeted cell. FIG. C) PGCs were transfected with homologous recombination constructs, TALEN (either Tal 1.1 or Tal 7.1, empty vector), and a puromycin selection transposon. Isolation of GFP + cells after selection with puromycin when using Tal 1.1 TALEN (right photo, left is bright field), not Tal 7.1 or empty vector transfection I was able to.

家畜の胚におけるＴＡＬＥＮの機能については、インビトロで調製した（ＩＶＰ）ウシおよびブタの胚を使用して検討した。実施例１および実施例２は、ＴＡＬＥＮ（ｌｅｆｔＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔＴＡＬＥＮ）をウシ胚に直接インジェクトして、ＴＡＬＥＮが特異的に結合した部位に改変を含む遺伝子改変動物を作製したことについて記載する。改変には、ホモ接合型およびヘテロ接合型（両アレル）の改変が含まれた。ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡを胚に直接インジェクトしたところ、遺伝子改変の成功が観察された。したがって、ＴＡＬＥＮを使用した直接的な胚改変は、家畜ゲノム改変の実行可能なアプローチであることが示された。このようにして、周知のプロセスを使用して、動物ファウンダー系統の妊娠および出産のための胚を調製し、代理雌に移植することができる。さらに、その後クローニングまたは他のプロセスに使用するために、レポーターを用いて細胞（たとえば、初代細胞、接合体、卵母細胞、胚盤胞）を選択することも可能である。 The function of TALEN in livestock embryos was examined using (IVP) bovine and porcine embryos prepared in vitro. Examples 1 and 2 describe that TALENs (left TALEN and right TALEN) were directly injected into bovine embryos to produce genetically modified animals containing modifications at the site where TALEN specifically bound. The modifications included homozygous and heterozygous (both alleles) modifications. Successful genetic modification was observed when TALEN mRNA was directly injected into the embryo . Therefore, the direct embryos modified using Talen, was shown to be a viable approach of livestock genome modification. In this way, well-known processes can be used to prepare embryos for animal founder strain pregnancy and delivery and transfer to surrogate females. In addition, cells (eg, primary cells, zygotes, oocytes, blastocysts) can be selected using a reporter for subsequent use in cloning or other processes.

Claims

A method for producing a genetically modified animal, comprising:
Exposing the embryo or cell to mRNA encoding TALEN that specifically binds to a target chromosomal site of the embryo or cell;
Cloning the cells in a surrogate mother or transferring the embryo to the surrogate mother,
And wherein the surrogate mother conceives an animal thereby not containing a reporter gene and genetically modified only at the TALEN targeted chromosomal site.

Comprising the steps of exposing the embryo or cell to that D N A containing a foreign sequence, wherein the genetic modification further comprises the step of including the foreign sequence, The method of claim 1.

3. The method of claim 2 , wherein the exogenous sequence comprises an alternative allele of the TALEN targeted chromosomal site.

4. The method of claim 3 , wherein the alternative allele comprises a myostatin allele present in Belgian Blue cattle.

The method according to any one of claims 3 to 4 , wherein the cells or embryos belong to a first breed and the allele belongs to a second breed of animals.

The genetic modification is insertion, deletion, change to foreign nucleic acid sequence, inversion, translocation, gene conversion to natural allele, gene conversion to synthetic allele, allele transfer between different species, allele transfer of the same species, And the method according to any one of claims 1 to 5 , wherein the method is selected from the group consisting of gene conversion into a novel allele.

The method according to any one of claims 1 to 6 , wherein the TALEN mRNA is directly introduced into the cell as mRNA or as a plasmid encoding the mRNA .

8. The pregnant animal of claim 1-7, wherein the pregnant animal is selected from the group consisting of pigs, cows, sheep, goats, chickens, rabbits, fish, zebrafish, dogs, mice, cats, mice, rats, and laboratory animals . The method according to any one of the above.

The cells are selected from the group consisting of livestock cells, artiodactyl cells, cultured cells, primary cells, primary somatic cells, zygotes, primordial germ cells, stem cells, and zygotes, or the embryo is a blastocyst The method according to any one of claims 1 to 8 , wherein

The method according to any one of claims 1 to 9 , wherein the cells are cloned by somatic cell nuclear transfer or chromatin transfer.

A genetically modified animal prepared according to the method according to any one of claims 1 to 10 .

A method for producing a genetically modified non-human animal cell or embryo comprising:
Exposing the embryo or cell of the animal in vitro to mRNA encoding TALEN that specifically binds to a targeted chromosomal site of the embryo or cell, wherein the cell or embryo is gene only at the targeted chromosomal site A method comprising a step of being modified and wherein the method is performed without a reporter gene.

13. The method of claim 12 , wherein the allele is selected from the group consisting of insertions, deletions, polymorphisms, and single nucleotide polymorphisms.

Comprising a foreign nucleic acid sequence into the target site, and not including any other genetic modification, genetically modified animals.

15. The animal according to claim 14 , wherein the exogenous nucleic acid sequence is an allele and the target site is a homologue of the allele.

The cell produced or used by the method as described in any one of Claims 1-15 .

Claim 1-10 or 12 to the animal prepared according to any one of 13, the cells or embryo.

Preparation cells or use of embryos according to the method of any one of claims 12-13.